JP6195306B2 - Elの酵素活性を阻害するelに対するモノクローナル抗体 - Google Patents

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Description

本発明は、血管内皮リパーゼ(Endothelial Lipase。以下、ELとする)の活性を阻害するモノクローナル抗体およびこれを含有する医薬組成物に関する。具体的には、本発明はELの酵素活性を選択的に阻害するモノクローナル抗体もしくはその一部またはこれを含有する医薬組成物に関する。
ELは、Triglyceride lipase(以下、TGとする。)ファミリーに属するPhospholipaseである(非特許文献1)。ヒトELは500残基(NCBI Accession No. NP_006024.1、配列番号:1)のアミノ酸からなり、ウサギELも500残基(NP_001182567.1、配列番号:2)のアミノ酸からなる。TGファミリーには、Lipoprotein lipase(以下、LPLとする。)やHepatic lipase(以下、HLとする。)が含まれる。
ELは、その強いPhospholipase活性によりHDLコレステロール(以下、HDL−cとする。)の代謝に関与することがそのノックアウトマウスやトランスジェニックマウスの解析から明らかとなり、血中HDL−c量を規定する因子として注目されている(非特許文献2)。冠動脈疾患(以下、CADとする。)と血中HDL−c量に負の相関関係が成立することは古くから知られている。HDL−cは抗酸化作用・抗炎症作用・コレステロール逆転送作用などを介して抗動脈硬化作用を示すとされ、低HDL−c血症はCADのリスクファクターの一つと認識されている。したがって、EL阻害剤はHDL−cの上昇を介してCAD治療薬となり、実際にELをノックアウトした病態マウスではHDL−c上昇と動脈硬化病変部位の減少が報告されている(非特許文献3)。
これらの知見は、ELの選択的阻害剤は脂質代謝異常症や動脈硬化症における治療薬としての有用性を示している。
ELを選択的に阻害することが、脂質代謝異常症や動脈硬化症における治療薬として有用であるため、ELの酵素活性を阻害するELに対する抗体の作製は重要なアプローチの1つとなる。これまでに、ウサギから得たELの酵素活性を阻害するポリクローナルの抗体を作製し、マウスにこの抗体を投与することで、血中HDL−c濃度が上昇したことが報告されている(非特許文献4)。
しかし、ELの多様な部位を認識するポリクローナル抗体では、ELに対する阻害の選択性は高くない。また、ELが関与する脂質代謝異常症や動脈硬化症のような慢性疾患の治療薬は、長期間に渡って投薬する必要があるので、ヒトに対して抗原性の高いウサギポリクローナル抗体を医薬品として使用することは不可能である。しかも、抗原性を改善しようにも、ポリクローナル抗体ではそのようなことは困難である。
これらの事情により、ELの酵素活性を選択的に阻害するモノクローナル抗体の作製が求められていた。
Nature Genetics、1999年、第21巻、424ページ TCM、第14巻、第5号、2004年、p.202−206 The Journal of Biological Chemistry Vol.279, No.43, 22, 45085−45092, 2004 J Clin Invest、2003年、第111巻第3号、357ページ
本発明が解決しようとする課題は、ELの酵素活性を選択的に阻害するモノクローナル抗体もしくはその抗体断片またはこれを含有する医薬組成物を提供することである。
本発明者らは、鋭意研究の結果、ELの酵素活性を選択的に阻害するモノクローナル抗体を見出すことによって本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、
(1)配列番号1で示されるアミノ酸配列の331位から459位の領域に結合する、モノクローナル抗体またはその抗体断片、
(2)配列番号1で示されるアミノ酸配列の411位から459位の領域に結合する、前記(1)に記載のモノクローナル抗体またはその抗体断片、
(3)ELの酵素活性を阻害する、前記(1)または(2)に記載のモノクローナル抗体またはその抗体断片、
(4)1)配列番号7、配列番号8および配列番号9のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号11、配列番号12および配列番号13のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含む軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
2)配列番号7、配列番号8および配列番号9のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号11、配列番号12および配列番号13のアミノ酸配列を有する3つのCDRのうち1つ以上のCDRにおいて1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる3つのCDRを含む軽鎖可変領域を有し、ELの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
3)配列番号7、配列番号8および配列番号9のアミノ酸配列を有する3つのCDRのうち1つ以上のCDRにおいて1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる3つのCDRを含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号11、配列番号12および配列番号13のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有し、ELの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
4)配列番号7、配列番号8および配列番号9のアミノ酸配列を有する3つのCDRのうち1つ以上のCDRにおいて1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる3つのCDRを含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号11、配列番号12および配列番号13のアミノ酸配列を有する3つのCDRのうち1つ以上のCDRにおいて1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる3つのCDRを含む軽鎖可変領域を有し、ELの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
5)配列番号19、配列番号20および配列番号21のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号23、配列番号24および配列番号25のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含む軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
6)配列番号19、配列番号20および配列番号21のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号23、配列番号24および配列番号25のアミノ酸配列を有する3つのCDRのうち1つ以上のCDRにおいて1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる3つのCDRを含む軽鎖可変領域を有し、ELの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
7)配列番号19、配列番号20および配列番号21のアミノ酸配列を有する3つのCDRのうち1つ以上のCDRにおいて1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる3つのCDRを含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号23、配列番号24および配列番号25のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有し、ELの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
8)配列番号19、配列番号20および配列番号21のアミノ酸配列を有する3つのCDRのうち1つ以上のCDRにおいて1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる3つのCDRを含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号23、配列番号24および配列番号25のアミノ酸配列を有する3つのCDRのうち1つ以上のCDRにおいて1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる3つのCDRを含む軽鎖可変領域を有し、ELの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
9)配列番号27、配列番号28および配列番号29のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号31、配列番号32および配列番号33のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含む軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
10)配列番号27、配列番号28および配列番号29のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号31、配列番号32および配列番号33のアミノ酸配列を有する3つのCDRのうち1つ以上のCDRにおいて1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる3つのCDRを含む軽鎖可変領域を有し、ELの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
11)配列番号27、配列番号28および配列番号29のアミノ酸配列を有する3つのCDRのうち1つ以上のCDRにおいて1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる3つのCDRを含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号31、配列番号32および配列番号33のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有し、ELの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
12)配列番号27、配列番号28および配列番号29のアミノ酸配列を有する3つのCDRのうち1つ以上のCDRにおいて1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる3つのCDRを含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号31、配列番号32および配列番号33のアミノ酸配列を有する3つのCDRのうち1つ以上のCDRにおいて1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる3つのCDRを含む軽鎖可変領域を有し、ELの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
13)配列番号35、配列番号36および配列番号37のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号39、配列番号40および配列番号41のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含む軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
14)配列番号35、配列番号36および配列番号37のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号39、配列番号40および配列番号41のアミノ酸配列を有する3つのCDRのうち1つ以上のCDRにおいて1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる3つのCDRを含む軽鎖可変領域を有し、ELの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
15)配列番号35、配列番号36および配列番号37のアミノ酸配列を有する3つのCDRのうち1つ以上のCDRにおいて1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる3つのCDRを含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号39、配列番号40および配列番号41のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有し、ELの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
16)配列番号35、配列番号36および配列番号37のアミノ酸配列を有する3つのCDRのうち1つ以上のCDRにおいて1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる3つのCDRを含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号39、配列番号40および配列番号41のアミノ酸配列を有する3つのCDRのうち1つ以上のCDRにおいて1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる3つのCDRを含む軽鎖可変領域を有し、ELの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
17)配列番号43、配列番号44および配列番号45のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号47、配列番号48および配列番号49のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含む軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
18)配列番号43、配列番号44および配列番号45のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号47、配列番号48および配列番号49のアミノ酸配列を有する3つのCDRのうち1つ以上のCDRにおいて1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる3つのCDRを含む軽鎖可変領域を有し、ELの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
19)配列番号43、配列番号44および配列番号45のアミノ酸配列を有する3つのCDRのうち1つ以上のCDRにおいて1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる3つのCDRを含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号47、配列番号48および配列番号49のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有し、ELの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
20)配列番号43、配列番号44および配列番号45のアミノ酸配列を有する3つのCDRのうち1つ以上のCDRにおいて1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる3つのCDRを含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号47、配列番号48および配列番号49のアミノ酸配列を有する3つのCDRのうち1つ以上のCDRにおいて1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる3つのCDRを含む軽鎖可変領域を有し、ELの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
21)配列番号51、配列番号52および配列番号53のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号55、配列番号56および配列番号57のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含む軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
22)配列番号51、配列番号52および配列番号53のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号55、配列番号56および配列番号57のアミノ酸配列を有する3つのCDRのうち1つ以上のCDRにおいて1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる3つのCDRを含む軽鎖可変領域を有し、ELの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
23)配列番号51、配列番号52および配列番号53のアミノ酸配列を有する3つのCDRのうち1つ以上のCDRにおいて1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる3つのCDRを含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号55、配列番号56および配列番号57のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有し、ELの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
24)配列番号51、配列番号52および配列番号53のアミノ酸配列を有する3つのCDRのうち1つ以上のCDRにおいて1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる3つのCDRを含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号55、配列番号56および配列番号57のアミノ酸配列を有する3つのCDRのうち1つ以上のCDRにおいて1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる3つのCDRを含む軽鎖可変領域を有し、ELの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
25)配列番号59、配列番号60および配列番号61のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号63、配列番号64および配列番号65のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含む軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
26)配列番号59、配列番号60および配列番号61のアミノ酸配列を有する3つのCDRを含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号63、配列番号64および配列番号65のアミノ酸配列を有する3つのCDRのうち1つ以上のCDRにおいて1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる3つのCDRを含む軽鎖可変領域を有し、ELの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
27)配列番号59、配列番号60および配列番号61のアミノ酸配列を有する3つのCDRのうち1つ以上のCDRにおいて1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる3つのCDRを含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号63、配列番号64および配列番号65のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有し、ELの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、および、
28)配列番号59、配列番号60および配列番号61のアミノ酸配列を有する3つのCDRのうち1つ以上のCDRにおいて1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる3つのCDRを含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号63、配列番号64および配列番号65のアミノ酸配列を有する3つのCDRのうち1つ以上のCDRにおいて1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる3つのCDRを含む軽鎖可変領域を有し、ELの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
からなる群より選ばれる抗体またはその抗体断片、
(5)1)配列番号6のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および、
配列番号10のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
2)配列番号6のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および
配列番号10のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸を有する軽鎖可変領域を有し、ELの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
3)配列番号6のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸を有する重鎖可変領域、および
配列番号10のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有し、ELの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
4)配列番号6のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸を有する重鎖可変領域、および
配列番号10のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸を有する軽鎖可変領域を有し、ELの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
5)配列番号18のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および、
配列番号22のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
6)配列番号18のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および
配列番号22のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸を有する軽鎖可変領域を有し、ELの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
7)配列番号18のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸を有する重鎖可変領域、および
配列番号22のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有し、ELの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
8)配列番号18のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸を有する重鎖可変領域、および
配列番号22のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸を有する軽鎖可変領域を有し、ELの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
9)配列番号26のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および、
配列番号30のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
10)配列番号26のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および
配列番号30のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸を有する軽鎖可変領域を有し、ELの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
11)配列番号26のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸を有する重鎖可変領域、および
配列番号30のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有し、ELの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
12)配列番号26のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸を有する重鎖可変領域、および
配列番号30のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸を有する軽鎖可変領域を有し、ELの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
13)配列番号34のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および、
配列番号38のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
14)配列番号34のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および
配列番号38のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸を有する軽鎖可変領域を有し、ELの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
15)配列番号34のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸を有する重鎖可変領域、および
配列番号38のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有し、ELの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
16)配列番号34のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸を有する重鎖可変領域、および
配列番号38のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸を有する軽鎖可変領域を有し、ELの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
17)配列番号42のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および、
配列番号46のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
18)配列番号42のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および
配列番号46のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸を有する軽鎖可変領域を有し、ELの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
19)配列番号42のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸を有する重鎖可変領域、および
配列番号46のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有し、ELの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
20)配列番号42のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸を有する重鎖可変領域、および
配列番号46のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸を有する軽鎖可変領域を有し、ELの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
21)配列番号50のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および、
配列番号54のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
22)配列番号50のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および
配列番号54のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸を有する軽鎖可変領域を有し、ELの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
23)配列番号50のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸を有する重鎖可変領域、および
配列番号54のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有し、ELの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
24)配列番号50のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸を有する重鎖可変領域、および
配列番号54のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸を有する軽鎖可変領域を有し、ELの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
25)配列番号58のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および、
配列番号62のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
26)配列番号58のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および
配列番号62のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸を有する軽鎖可変領域を有し、ELの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
27)配列番号58のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸を有する重鎖可変領域、および
配列番号62のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有し、ELの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、および
28)配列番号58のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸を有する重鎖可変領域、および
配列番号62のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸を有する軽鎖可変領域を有し、ELの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
からなる群より選ばれる抗体またはその抗体断片、
(6)前記(3)〜(5)のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗体断片を含有する、ELが関連する疾患の治療または予防のための医薬組成物、
(7)ELが関連する疾患が動脈硬化症である(6)記載の医薬組成物、
(8)ELが関連する疾患の治療または予防のための、前記(3)〜(5)のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗体断片、
(9)ELが関連する疾患が動脈硬化症である(8)記載のモノクローナル抗体またはその抗体断片、
(10)前記(3)〜(5)のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗体断片を投与することを特徴とする、ELが関連する疾患の予防または治療方法、
(11)ELが関連する疾患が動脈硬化症である(10)記載の方法、
(12)配列番号1で示されるアミノ酸配列の331位から459位を含有してなるペプチド、または、該ペプチドにおいて1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたペプチド、を用いることを特徴とする、ELの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、もしくは該モノクローナル抗体またはその抗体断片を産生するハイブリドーマクローンのスクリーニング方法、
(13)配列番号1で示されるアミノ酸配列の411位から459位を含有してなるペプチド、または、該ペプチドにおいて1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたペプチド、を用いることを特徴とする、ELの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、もしくは該モノクローナル抗体またはその抗体断片を産生するハイブリドーマクローンのスクリーニング方法、
(14)前記(12)または(13)のスクリーニング方法をその工程に含む、ELの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片の製造方法、
(15)前記(14)の製造方法により作製されたモノクローナル抗体またはその抗体断片、
に関する。
本発明のモノクローナル抗体は、ELの酵素活性を選択的に阻害する活性を有するので、本発明のモノクローナル抗体を含む医薬組成物は、医薬品、特に、脂質代謝異常症、高脂血症、動脈硬化、アテローム性動脈硬化、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、糖尿病、肥満および/またはシンドロームXの治療および/または予防のための医薬として非常に有用である。
図1は、ヒトおよびウサギELを抗原としたELISAにおける、12B10抗体とヒトELおよびウサギELの結合活性を測定した結果を示す。12B10抗体は、ヒトELおよびウサギELと結合することが確認された。グラフの縦軸は450nmにおける吸光度を示す。 図2は、12B10抗体のヒトELおよびウサギELに対する酵素活性阻害能を測定した結果を示す。12B10抗体の濃度依存的に、ヒトおよびウサギのEL活性が阻害されることが確認された。グラフの縦軸は12B10抗体を添加しない時の酵素活性に対する比活性(%)を示し、横軸は12B10抗体の濃度(μg/ml)を示す。 図3は、12B10抗体の、ヒトおよびウサギHL、ならびにヒトおよびウサギLPLに対する酵素活性阻害能を測定した結果を示す。12B10抗体がヒトおよびウサギHL、ならびにヒトおよびウサギLPLの酵素活性を阻害しないことが確認された。グラフの縦軸は12B10抗体を添加しない時の酵素活性に対する比活性(%)を示す。 図4は、ヒトEL断片(ヒトEL_411−500およびヒトEL_411−459)を抗原としたELISAにおいて、12B10抗体と2種類のヒトEL断片との結合活性を測定した結果を示す。12B10抗体は、ヒトEL_411−500およびヒトEL_411−459いずれにも結合することが確認された。グラフの縦軸は吸光度を示し、横軸は各Lysateを希釈した倍率を示す。 図5Aは、ヒトEL、ヒトLPL及びヒトHLのアミノ酸配列のアラインメントを示す。2種以上で共通するアミノ酸を実線の枠で囲んでいる。★印のアミノ酸はcatalytic triad を示し、12B10抗体の結合領域のアミノ酸配列を破線の枠で囲んでいる。 図5Bは、ヒトEL、ヒトLPL及びヒトHLのアミノ酸配列のアラインメントを示す。2種以上で共通するアミノ酸を実線の枠で囲んでいる。★印のアミノ酸はcatalytic triad を示し、本発明の抗体の結合領域のアミノ酸配列を破線の枠で囲んでいる。 図6Aは、12B10抗体の可変領域のアミノ酸配列を示す。 図6Bは、47B2抗体の可変領域のアミノ酸配列を示す。 図6Cは、25E4抗体の可変領域のアミノ酸配列を示す。 図6Dは、16A11抗体の可変領域のアミノ酸配列を示す。 図6Eは、8F5抗体の可変領域のアミノ酸配列を示す。 図6Fは、3B1抗体の可変領域のアミノ酸配列を示す。 図6Gは、41H8抗体の可変領域のアミノ酸配列を示す。 図7Aは、12B10抗体のカニクイザルEL、ヒヒELおよびヒトーマウスキメラELに対する酵素活性阻害能を測定した結果を示す。12B10抗体の濃度依存的に、これらのEL活性が阻害されることが確認された。グラフの縦軸は12B10抗体を添加しない時の酵素活性に対する比活性(%)を示し、横軸は12B10抗体の濃度(nM)を示す。 図7Bは、47B2抗体のカニクイザルEL、ヒヒEL、ウサギELおよびヒトーマウスキメラELに対する酵素活性阻害能を測定した結果を示す。47B2抗体の濃度依存的に、これらのEL活性が阻害されることが確認された。グラフの縦軸は47B2抗体を添加しない時の酵素活性に対する比活性(%)を示し、横軸は47B2抗体の濃度(nM)を示す。 図7Cは、25E4抗体のカニクイザルEL、ヒヒEL、ウサギELおよびヒトーマウスキメラELに対する酵素活性阻害能を測定した結果を示す。25E4抗体の濃度依存的に、これらのEL活性が阻害されることが確認された。グラフの縦軸は25E4抗体を添加しない時の酵素活性に対する比活性(%)を示し、横軸は25E4抗体の濃度(nM)を示す。 図7Dは、16A11抗体のカニクイザルEL、ヒヒEL、ウサギELおよびヒトーマウスキメラELに対する酵素活性阻害能を測定した結果を示す。16A11抗体の濃度依存的に、これらのEL活性が阻害されることが確認された。グラフの縦軸は16A11抗体を添加しない時の酵素活性に対する比活性(%)を示し、横軸は16A11抗体の濃度(nM)を示す。 図7Eは、8F5抗体のカニクイザルEL、ヒヒEL、ウサギELおよびヒトーマウスキメラELに対する酵素活性阻害能を測定した結果を示す。8F5抗体の濃度依存的に、これらのEL活性が阻害されることが確認された。グラフの縦軸は8F5抗体を添加しない時の酵素活性に対する比活性(%)を示し、横軸は8F5抗体の濃度(nM)を示す。 図7Fは、3B1抗体のカニクイザルEL、ヒヒEL、ウサギELおよびヒトーマウスキメラELに対する酵素活性阻害能を測定した結果を示す。3B1抗体の濃度依存的に、これらのEL活性が阻害されることが確認された。グラフの縦軸は3B1抗体を添加しない時の酵素活性に対する比活性(%)を示し、横軸は3B1抗体の濃度(nM)を示す。 図7Gは、41H8抗体のカニクイザルEL、ヒヒEL、ウサギELおよびヒトーマウスキメラELに対する酵素活性阻害能を測定した結果を示す。41H8抗体の濃度依存的に、これらのEL活性が阻害されることが確認された。グラフの縦軸は41H8抗体を添加しない時の酵素活性に対する比活性(%)を示し、横軸は41H8抗体の濃度(nM)を示す。 図8Aは、12B10抗体の、ヒトHLおよびヒトLPLに対する酵素活性阻害能を測定した結果を示す。12B10抗体がヒトHLおよびヒトLPLの酵素活性を阻害せず、カニクイザルELを阻害することが確認された。グラフの縦軸は12B10抗体を添加しない時の酵素活性に対する比活性(%)を示す。 図8Bは、47B2抗体の、ヒトHLおよびヒトLPLに対する酵素活性阻害能を測定した結果を示す。47B2抗体がヒトHLおよびヒトLPLの酵素活性を阻害せず、カニクイザルELを阻害することが確認された。グラフの縦軸は47B2抗体を添加しない時の酵素活性に対する比活性(%)を示す。 図8Cは、25E4抗体の、ヒトHLおよびヒトLPLに対する酵素活性阻害能を測定した結果を示す。25E4抗体がヒトHLおよびヒトLPLの酵素活性を阻害せず、カニクイザルELを阻害することが確認された。グラフの縦軸は25E4抗体を添加しない時の酵素活性に対する比活性(%)を示す。 図8Dは、16A11抗体の、ヒトHLおよびヒトLPLに対する酵素活性阻害能を測定した結果を示す。16A11抗体がヒトHLおよびヒトLPLの酵素活性を阻害せず、カニクイザルELを阻害することが確認された。グラフの縦軸は16A11抗体を添加しない時の酵素活性に対する比活性(%)を示す。 図8Eは、8F5抗体の、ヒトHLおよびヒトLPLに対する酵素活性阻害能を測定した結果を示す。8F5抗体がヒトHLおよびヒトLPLの酵素活性を阻害せず、カニクイザルELを阻害することが確認された。グラフの縦軸は8F5抗体を添加しない時の酵素活性に対する比活性(%)を示す。 図8Fは、3B1抗体の、ヒトHLおよびヒトLPLに対する酵素活性阻害能を測定した結果を示す。3B1抗体がヒトHLおよびヒトLPLの酵素活性を阻害せず、カニクイザルELを阻害することが確認された。グラフの縦軸は3B1抗体を添加しない時の酵素活性に対する比活性(%)を示す。 図8Gは、41H8抗体の、ヒトHLおよびヒトLPLに対する酵素活性阻害能を測定した結果を示す。41H8抗体がヒトHLおよびヒトLPLの酵素活性を阻害せず、カニクイザルELを阻害することが確認された。グラフの縦軸は41H8抗体を添加しない時の酵素活性に対する比活性(%)を示す。 図8Hは、8F5抗体の、ウサギHLおよびウサギLPLに対する酵素活性阻害能を測定した結果を示す。8F5抗体がウサギHLおよびウサギLPLの酵素活性を阻害せず、ウサギELを阻害することが確認された。グラフの縦軸は8F5抗体を添加しない時の酵素活性に対する比活性(%)を示す。 図8Iは、47B2抗体の、ウサギHLおよびウサギLPLに対する酵素活性阻害能を測定した結果を示す。47B2抗体がウサギHLおよびウサギLPLの酵素活性を阻害せず、ウサギELを阻害することが確認された。グラフの縦軸は47B2抗体を添加しない時の酵素活性に対する比活性(%)を示す。 図9Aは、12B10抗体の、カニクイザルEL、ヒヒEL、マウスELおよびヒトーマウスキメラELに対する結合性を測定した結果を示す。12B10抗体がカニクイザルEL、ヒヒELおよびヒトーマウスキメラELに結合することが示された。グラフの縦軸は吸光度を示し、横軸は抗体濃度(ng/mL)を示す。 図9Bは、47B2抗体の、カニクイザルEL、ヒヒEL、ウサギEL、マウスELおよびヒトーマウスキメラELに対する結合性を測定した結果を示す。47B2抗体がカニクイザルEL、ヒヒEL、ウサギELおよびヒトーマウスキメラELに結合することが示された。グラフの縦軸は吸光度を示し、横軸は抗体濃度(ng/mL)を示す。 図9Cは、25E4抗体の、カニクイザルEL、ヒヒEL、ウサギEL、マウスELおよびヒトーマウスキメラELに対する結合性を測定した結果を示す。25E4抗体がカニクイザルEL、ヒヒEL、ウサギELおよびヒトーマウスキメラELに結合することが示された。グラフの縦軸は吸光度を示し、横軸は抗体濃度(ng/mL)を示す。 図9Dは、16A11抗体の、カニクイザルEL、ヒヒEL、ウサギEL、マウスELおよびヒトーマウスキメラELに対する結合性を測定した結果を示す。16A11抗体がカニクイザルEL、ヒヒEL、ウサギELおよびヒトーマウスキメラELに結合することが示された。グラフの縦軸は吸光度を示し、横軸は抗体濃度(ng/mL)を示す。 図9Eは、8F5抗体の、カニクイザルEL、ヒヒEL、ウサギEL、マウスELおよびヒトーマウスキメラELに対する結合性を測定した結果を示す。8F5抗体がカニクイザルEL、ヒヒEL、ウサギELおよびヒトーマウスキメラELに結合することが示された。グラフの縦軸は吸光度を示し、横軸は抗体濃度(ng/mL)を示す。 図9Fは、3B1抗体の、カニクイザルEL、ヒヒEL、ウサギEL、マウスELおよびヒトーマウスキメラELに対する結合性を測定した結果を示す。3B1抗体がカニクイザルEL、ヒヒEL、ウサギELおよびヒトーマウスキメラELに結合することが示された。グラフの縦軸は吸光度を示し、横軸は抗体濃度(ng/mL)を示す。 図9Gは、41H8抗体の、カニクイザルEL、ヒヒEL、ウサギEL、マウスELおよびヒトーマウスキメラELに対する結合性を測定した結果を示す。41H8抗体がカニクイザルEL、ヒヒEL、ウサギELおよびヒトーマウスキメラELに結合することが示された。グラフの縦軸は吸光度を示し、横軸は抗体濃度(ng/mL)を示す。 図10Aは、ウサギに47B2および8F5抗体を投与し、血中のHDL−c濃度を測定した結果を示す。グラフの縦軸はHDL−c濃度を示し、横軸は抗体投与後の日数を示す。 図10Bは、ウサギに47B2および8F5抗体を投与し、血中のHDL−c濃度を測定した結果を示す。グラフの縦軸は初日の血中HDL−c濃度に対する血中HDL−c濃度を示し、横軸は抗体投与後の日数を示す。 図11Aは、7つの抗体の重鎖のアミノ酸配列のアライメントを示す。 図11Bは、7つの抗体の軽鎖のアミノ酸配列のアライメントを示す。
本発明は、ELの酵素活性を選択的に阻害することを特徴とするモノクローナル抗体を提供する。本発明の抗体は、ELの酵素活性を選択的に阻害する活性を有するので、動脈硬化やメタボリックシンドロームの予防・治療薬として有用である。
本発明のモノクローナル抗体を調製するために使用される抗原としては、配列番号1の331位から459位のアミノ酸配列を含む連続したアミノ酸残基を有するものであることが重要である。長さは特に限定されないが、免疫原性を有する長さである6残基以上であることが望ましい。このような抗原の具体例として、天然に、あるいは人工的に高発現する細胞株、その膜画分、あるいはその精製物、その他のタンパク質またはペプチド(例えば、FLAG−tag、HIS−tag、GST−tag、C2タグなどのタグタンパク質、GFP、EGFPなどの蛍光タンパク質など)との融合タンパク質、または化学的に合成されたペプチドなど何れのものも使用することができる(以下、これらを単に本発明の抗原と称することもある。)。なお、これら免疫原の調製法はいずれも当業者にとって公知である。
本発明のモノクローナル抗体は、既知の一般的な製造方法によって調製することができる。具体的には、本発明の抗原を、必要に応じてフロイントアジュバントとともに、哺乳動物、好ましくは、マウス、ラット、ハムスター、モルモットまたはウサギの皮下内、筋肉内、静脈内、フッドパッド内あるいは腹腔内に1乃至数回注射することにより免疫感作を施す。通常、初回免疫から約1〜21日毎に1〜4回免疫を行って、最終免疫より約1〜10日後に免疫感作された哺乳動物から抗体産生細胞を取得することができる。免疫を施す回数及び時間的インターバルは、使用する免疫原の性質などにより、適宜変更することができる。
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマの調製は、ケーラー及びミルシュタインらの方法(Nature、1975、vol.256、p495〜497)及びそれに準じた方法に従って行うことができる。即ち、前述の如く免疫感作された哺乳動物から取得される脾臓、リンパ節、骨髄あるいは扁桃等、好ましくは脾臓に含まれる抗体産生細胞と、好ましくはマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギまたはヒト等の哺乳動物、より好ましくはマウス、ラットまたはヒト由来の自己抗体産生能のないミエローマ細胞を細胞融合させることによってハイブリドーマを調製することができる。
細胞融合に用いられるミエローマ細胞としては、一般的にはマウスから得られた株化細胞、例えばP3−U1、NS−1、SP−2、653、X63、AP−1などを使用することができる。
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンのスクリーニングは、ハイブリドーマを、例えばマイクロタイタープレート中で培養し、増殖の見られたウェルの培養上清の、前述のマウス免疫感作で用いた本発明の抗原に対する反応性を、RIA、ELISA、FACS等の測定法によって測定し、当該抗原あるいはハプテンに対して特異的結合を示すモノクローナル抗体を産生するクローンを選択することによって行う。そして、通常は抗原を固相化しそこに結合する培養上清中の抗体を、放射性物質、蛍光物質、酵素などで標識した二次抗体で検出する方法が用いられる。また、抗原の発現細胞を用いる場合には、該細胞にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に蛍光で標識した二次抗体を反応させた後、フローサイトメーター等の蛍光検出装置で該細胞の蛍光強度を測定することにより、該細胞膜上の本発明の抗原に結合できるモノクローナル抗体を検出することができる。
選択したハイブリドーマからのモノクローナル抗体の製造は、ハイブリドーマをインビトロで培養するか、またはマウス、ラット、モルモット、ハムスターまたはウサギ等、好ましくはマウスまたはラット、より好ましくはマウスの腹水中等で培養し、得られた培養上清、または哺乳動物の腹水から単離することにより行うことができる。インビトロで培養する場合には、培養する細胞種の特性、試験研究の目的及び培養方法等の種々条件に合わせて、ハイブリドーマを増殖、維持及び保存させ、培養上清中にモノクローナル抗体を産生させるために用いられるような既知栄養培地あるいは既知の基本培地から誘導調製されるあらゆる栄養培地を用いて実施することが可能である。
基本培地としては、例えば、Ham’F12培地、MCDB153培地あるいは低カルシウムMEM培地等の低カルシウム培地及びMCDB104培地、MEM培地、D−MEM培地、RPMI1640培地、ASF104培地あるいはRD培地等の高カルシウム培地等が挙げられ、該基本培地は、目的に応じて、例えば血清、ホルモン、サイトカイン及び/または種々無機あるいは有機物質等を含有することができる。
モノクローナル抗体の単離、精製は、上述の培養上清あるいは腹水を、飽和硫酸アンモニウム、イオン交換クロマトグラフィー(DEAEまたはDE52等)、抗イムノグロブリンカラムあるいはプロテインAカラム等のアフィニティカラムクロマトグラフィーに供すること等により行うことができる。
また、本発明のモノクローナル抗体として、抗体遺伝子を抗体産生細胞、例えばハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗体を用いることができる(例えば、Carlら、THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES、1990年発行)。
具体的には、目的とする抗体を産生するハイブリドーマや抗体を産生する免疫細胞、例えば感作リンパ球等を癌遺伝子等により不死化させた細胞から、抗体の可変領域(V領域)をコードするmRNAを単離する。mRNAの単離は、公知の方法、例えばグアニジン超遠心法(Chirgwin、J.M.ら、Biochemistry(1979) 18、5294-5299)等により全RNAを調製し、mRNA Purification Kit(ファルマシア製)等を使用してmRNAを調製する。
得られたmRNAから逆転写酵素を用いて抗体V領域のcDNAを合成する。cDNAの合成は、AMV Reverse Transcriptase First−strand cDNA Synthesis Kit等を用いて行うことができる。また、cDNAの合成および増幅を行うには5’−Ampli FINDER RACEKit (クローンテック製)およびPCRを用いた5’−RACE法(Frohman,M.A.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1988年、第85巻、 8998ページなど)を使用することができる。得られたPCR産物から目的とするDNA断片を精製し、ベクターDNAと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。目的とするDNAの塩基配列を公知の方法、例えば、デオキシ法により確認する。
目的とする抗体のV領域をコードするDNAが得られれば、これを所望の抗体定常領域(C領域)をコードするDNAと連結し、これを発現ベクターへ組み込む。または、抗体のV領域をコードするDNAを、抗体C領域のDNAを含む発現ベクターへ組み込んでもよい。本発明で使用される抗体を製造するには、抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、エンハンサー/プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させることができる。
抗体遺伝子の発現は、抗体の重鎖(H鎖)または軽鎖(L鎖)を別々に発現ベクターに組み込んで宿主を同時形質転換させてもよいし、あるいはH鎖およびL鎖をコードするDNAを単一の発現ベクターに組み込んで宿主を形質転換させてもよい(WO94/11523参照)。
上記以外の本発明のモノクローナル抗体の作製方法には、いわゆるファージディスプレイ技術(Nature Biotechnology 23,1105(2005))も用いることができる。具体的には、例えばヒトや動物(例えば、ウサギ、マウス、ラット、ハムスターなど)のBリンパ球を材料として公知の方法により作製された抗体遺伝子ライブラリー、もしくはヒトや動物のGerm Line配列から選別、および改変して完全合成した抗体遺伝子ライブラリーを、バクテリオファージ、大腸菌、酵母、動物細胞等の細胞表面やリボソーム上等に提示させる。このとき、細胞表面に提示させる抗体の形態としてはIgG分子、IgM分子、Fabフラグメント、一本鎖Fv(scFv)フラグメント等が挙げられる。
こうして得たモノクローナル抗体フラグメント遺伝子は公知の方法によりIgG抗体遺伝子の対応領域と組替えることにより、抗体遺伝子を得ることができる。そして、このようにして得られた遺伝子を適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて抗体を産生することができる(例えば、Carlら、THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES、1990年発行)。
本発明のモノクローナル抗体は、ELの酵素活性を阻害することが特徴である。以下、ELの酵素活性阻害能の測定手順の一例を記す。
ELをコードするDNAをクローニングしたpcDNA3.1(インビトロジェン社製)をFreeStyle HEK293F細胞にトランスフェクションし、37℃、8% CO2で2日間培養する。培養液を遠心し、細胞を回収して、20U/mLのヘパリンを含むPBSにて
懸濁し、37℃で45分間インキュベーションし、その後、遠心により細胞を除去して得た上清をEL酵素溶液として、阻害活性測定に使用する。20mM トリス塩酸緩衝液(pH7.5)、0.5%ウシ血清アルブミン、4mM 塩化カルシウム、150mM 塩化ナトリウム、2mg/mLヒトHDL(Athens Research&Technology社製)で構成される反応溶液にモノクローナル抗体を添加した後に、EL酵素溶液を添加する。37℃で2時間反応後、EL酵素によってHDLから生成される遊離脂肪酸(NEFA)をNEFA C−テストワコー(和光純薬工業社製)で測定し、そのNEFA量を酵素活性指標とする。抗体を添加しない時の酵素活性をコントロール値とし、抗体の各濃度でのコントロール値に対する比活性を算出、その阻害曲線より抗体の50%阻害濃度(IC50値)を求めることができる。
EL酵素の阻害活性の阻害率が50%を示す抗体の有効濃度(IC50)は、しばしばEL阻害活性を示す指標の一つとして用いられている。
また、本発明のモノクローナル抗体は、EL酵素を選択的に阻害することが特徴である。以下、EL酵素を選択的に阻害すること、言い換えれば、LPLおよびHLの酵素活性を阻害しないことの確認手順の一例を示す。
HLをコードするDNAをクローニングしたpcDNA3.1(インビトロジェン社製)をFreeStale HEK293F細胞にトランスフェクションし、37℃、8%CO2で2日間培養する。培養液を遠心し、細胞を回収して、20U/mLのヘパリンを含むPBSにて
懸濁し、37℃で45分間インキュベーションし、その後、遠心により細胞を除去して得た上清をHL酵素溶液とする。同様の操作により、LPL酵素溶液を調製する。20mM トリス塩酸緩衝液(pH7.5)、0.5%ウシ血清アルブミン、4mM 塩化カルシウム、150mM 塩化ナトリウム、0.5mg/mLヒトVLDL(INTRACEL社製)で構成される反応溶液に、モノクローナル抗体を添加した後に、HLまたはLPL酵素溶液を添加する。37℃で2時間反応後、HLまたはLPL酵素によって、VLDLから生成される遊離脂肪酸(NEFA)をNEFA C−テストワコー(和光純薬工業社製)で測定し、そのNEFA量を酵素活性指標として、モノクローナル抗体を添加しない時の酵素活性をコントロール値とし、コントロール値に対する比活性を算出する。
EL酵素に対して選択的な阻害活性を有するとは、ELに対するIC50に相当する量のモノクローナル抗体を入れた際において、LPLおよびHLの酵素活性を3パーセント以上阻害しない場合を意味する。本発明のモノクローナル抗体は、LPLおよびHLの酵素活性を阻害せず、EL酵素を選択的に阻害することが特徴なので、エピトープ部位は、ELがLPLやHLと相同性を有しない領域であることが好ましい。
本発明のモノクローナル抗体には、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型モノクローナル抗体、例えば、キメラモノクローナル抗体、ヒト型化モノクローナル抗体や、ヒトモノクローナル抗体が含まれる。
本発明のモノクローナル抗体は、ポリエチレングリコール(PEG)、放射性物質、トキシン等の各種分子と結合したコンジュゲート抗体でもよい。このようなコンジュゲート抗体は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。本発明におけるモノクローナル抗体にはこれらのコンジュゲート抗体も包含される。
また本発明のモノクローナル抗体は、そのN末端あるいはC末端に他のタンパク質を融合してもよい(Clinical Cancer Research, 2004, 10, 1274−1281)。融合するタンパク質は当業者が適宜選択することができる。
本発明において「モノクローナル抗体断片」とは、前述する本発明のモノクローナル抗体の一部であって、当該モノクローナル抗体と同様にELに特異的な結合性を有する断片、または当該モノクローナル抗体と同様にELに特異的な結合性を有し、かつELの酵素活性を阻害する作用を有する断片を意味する。ELに対して特異的結合性を有する断片とは、具体的には、Fab、F(ab')、Fab'、一本鎖抗体 (scFv)、ジスルフィド安定化抗体(dsFv)、2量化体V領域断片 (Diabody)、CDRを含むペプチド等を挙げることができる(エキスパート・オピニオン・オン・テラピューティック・パテンツ、第6巻、第5号、第441〜456頁、1996年)。
本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片は、医薬組成物として有用である。したがって本発明のモノクローナル抗体およびその抗体断片を含む医薬組成物は、経口的または非経口的に全身あるいは局所的に投与することができる。非経口的投与としては、例えば、点滴などの静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、鼻腔内投与、吸入などを選択することができる。
また、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片は、ELに対して特異的結合性を有するので、脂質代謝異常症、高脂血症、動脈硬化、アテローム性動脈硬化、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、糖尿病、肥満および/またはシンドロームXの診断にも応用可能である。
本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片は、配列番号1で示されるアミノ酸配列の331位から459位の領域に結合することを特徴とする。配列番号1で示されるアミノ酸配列の331位から459位の領域に結合するとは、当該領域内の任意のアミノ酸配列に結合することを意味し、モノクローナル抗体またはその抗体断片が当該領域全てのアミノ酸配列に結合していることを意味はしない。
本発明の医薬組成物の対象患者は動脈硬化やメタボリックシンドロームであることが想定される。有効投与量は、一回につき体重1kgあたり0.01mgから100mgの範囲から選ばれる。あるいは、患者あたり5〜5000mg、好ましくは10〜500mgの投与量を選ぶことができる。しかしながら、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片を含む医薬組成物はこれらの投与量に制限されるものではない。また、投与期間は、患者の年齢、症状により適宜選択することができる。本発明の医薬組成物は、投与経路次第で医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。このような担体および添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶媒、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、カゼイン、ジグリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、ヒト血清アルブミン(HSA)、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤などが挙げられる。使用される添加物は、剤型に応じて上記の中から適宜あるいは組合せて選択されるが、これらに限定されるものではない。
以下、実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は下記実施例に制限されるものではない。なお、抗体作製手法として、特に断らない限り、Immunochemistry in Practice (Blackwell Scientific Publiations)に記載されている方法を用いた。また、遺伝子操作的手法として、特に断らない限り、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd Edition(Cold Spring Harbor Laboratory)に記載されている方法を用いた。
ヒトEL発現アデノウイルス調製
pShuttleベクター(クロンテック社製)に、PCR法、制限酵素を用いた手法により、C2タグ(配列番号3)を付加したヒトELcDNA配列をクローニングした。このサブクローンベクターと、アデノウイルス骨格遺伝子を有するベクターを、PI−SceIおよびI−CeuI酵素により消化した(Adeno−x Accessory Kit, クロンテック社製)。消化断片のライゲーション反応を16℃、3時間行い(ligation high, 東洋紡社製)、ライゲーション産物を大腸菌株(ワンショットStbl3ケミカルコンピテントセル, インビトロジェン社製)にトランスフォームした。アンピシリン選択後、得られたクローンよりプラスミドを精製し(QIAprep spin Miniprep Kit, QIAGEN社製)、次いでPacI酵素(New England Biolabs社製)処理による大腸菌生育領域の切り出しを行った。以上により、アデノウイルスベクター作製のためのプラスミドDNAを得た。得られたプラスミドDNAをHEK293細胞(ヒューマンサイエンス振興財団より分与)にLipofectamine2000(インビトロジェン社製)を用いてトランスフェクションし、10%ウシ血清含有DMEM培地中、37℃、5% CO2下で培養した。トランスフェクション後は5日おきに培地交換を行い、細胞変性効果(CPE)が確認されるまで培養を継続した。CPEの確認後、培養上清および細胞を回収した。回収した細胞は、ドライアイス・メタノール浴と温水浴を用い凍結融解を5回程度繰り返した後、3000rpmにて15分遠心して得られた上清を、細胞抽出液として回収した。この細胞抽出液と、培養上清を混合し、ウイルスベクター含有液とした。このウイルスベクター含有液をHEK293細胞に添加し、同様の操作を繰り返すことにより、ウイルスベクターの増幅を行った。増幅後、最終的に得られた細胞抽出液を、Benzonase(Merck−Novagen社製)で37℃、30分間処理後遠心し、得られた上清を、以下の密度勾配遠心によるウイルスベクター精製に用いた。1.5、1.35、1.25g/cmの塩化セシウムを含むPBS(Phosphate buffered saline)を遠心管内に重層し、次いで上記上清を重層した。これを35000rpm, 16℃で1時間遠心し、目視によって得られたウイルスベクターを回収した。回収したウイルスベクターは、10%グリセロール含有PBSに対して透析を行い、精製アデノウイルスベクターとした。ウイルスベクターは一部をタイター測定(Adeno−X rapid titer kit, クロンテック社製)および自己増殖能獲得型出現判定に用い、異常のないもののみを以下の免疫に使用した。
ヒトEL過剰発現細胞とヒトEL Lysateの調製
ヒトEL−C2タグを得るために、ヒトELをコードするDNA断片の3'側にC2タグをコードするDNA断片を付加し、制限酵素サイトHindIIIとXbaIを介して発現ベクターpcDNA3.1(インビトロジェン社製)に挿入し、ヒトEL発現プラスミドを構築した。ヒトEL発現ベクターとLipofectamine2000(インビトロジェン社製)を用いて、HEK293細胞(ATCC社より購入)をトランスフェクションし、48時間培養後に、細胞を回収し、ヒトEL過剰発現細胞とした。この細胞を、Lysis buffer(1% TritonX−100、100mM Naclを含む25mMトリス緩衝液pH8.0)にて溶解し、遠心にて可溶化画分を回収し、ヒトEL Lysateとした。同様の方法で、ウサギEL Lysateを調製した。
ヒトEL−C2タグのアミノ酸配列は配列番号1に、ウサギEL−C2タグのアミノ酸配列は配列番号2に記載した。
ヒトEL_411−500断片Lysate(配列番号4)とヒトEL_411−459断片Lysate(配列番号5)の調製
配列番号1の411位から500位のアミノ酸を含む断片をコードするcDNAの5'側にHisタグと3'側にC2タグをコードするcDNAを付加し、pcDNA3.3(インビトロジェン社製)にクローニングして、ヒトEL_411−500断片発現ベクターとした。同様の方法で、ヒトEL_411−459断片発現ベクターを調製した。
それぞれのヒトEL断片発現ベクターとLipofectamine2000(インビトロジェン社製)を用いて、HEK293細胞(ATCC社製)をトランスフェクションし、48時間培養後に、細胞をLysis buffer(1% TritonX−100、100mM NaClを含む25mM トリス緩衝液pH8.0)にて溶解し、遠心にて可溶化画分を回収し、それぞれヒトEL_411−500断片Lysate、ヒトEL_411−459断片Lysateとした。
ヒトEL発現アデノウイルスベクター免疫
精製したヒトEL発現アデノウイルスベクター2×10i.f.u.相当を、8週齢の雌マウス(BALB/cAnNCrlCrlj種、日本エスエルシーより入手)の静脈内、皮下または後肢筋肉内に投与した。投与後は、7日毎に尾静脈より血液を採取し、これより調製した血清を用いて抗体価の測定を行った。また、初回のアデノウイルスベクター投与に加えて、追加免疫として同量のアデノウイルスベクターを静脈内、皮下または後肢筋肉内に投与した。抗体価の上昇を認めたマウスについて、最終免疫として、尾静脈よりブースター免疫を実施した。
抗体産出ハイブリドーマの作製
最終免疫の3日後に、ヒトELに対する抗体価の上昇が認められた個体について開腹し、脾臓を摘出し、脾臓細胞を回収した。脾臓細胞とマウスミエローマ細胞(p3×63−Ag8.U1、東京腫瘤研究所)を50%のポリエチレングリコール4000を用いて融合させ、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含む培地で選択した。
ヒトELに結合する抗体を産出するハイブリドーマの選定
細胞融合10日後に特異抗体産生細胞のスクリーニングを行った。スクリーニングに用いたELSIAは以下の通りである。384穴マイクロタイタープレート(ヌンク社製)の各ウェルに0.35μgの抗マウスIgG−Fc抗体(Jackson Immuno Research社製)を含むトリス緩衝液(50mM Tris−HCl、pH7.5)を35μl加えて4℃、16時間固定した。これらのウェルを90μlの洗浄液(0.01% Tween20を含む生理食塩水)で1回洗浄した後、ブロックエース(大日本製薬社製)を100μl加えて室温で2時間放置して、ブロッキングを行った(抗マウスIgG−Fc抗体固相化プレート)。各ウェルを90μlの洗浄液で1回洗浄した後、15μlのハイブリドーマ培養上清を加えて2時間放置した。これらのウェルを90μlの洗浄液で3回洗浄した後、15μlのヒトEL lysateを含むアッセイバッファー(4%ブロックエース、0.05% Tween20、150mM NaClを含む50mMトリス緩衝液pH7.4)を加えて、4℃で16時間放置した。これらのウェルを90μlの洗浄液で3回洗浄した後、15μlのビオチン標識抗C2タグ抗体(Fab)とHRP標識ストレプトアビジン(Thermo scientific社製)を含むアッセイバッファーを加え、室温で1時間放置した。これらのウェルを90μlの洗浄液で3回洗浄した後に、15μlのTMB+−Substrate−Chromogen(DAKO社製)を添加して室温で30分間発色させた後に、15μlの0.05Mの硫酸を添加し反応を停止し、450nmにおける吸光度を測定した。スクリーニングの結果から、リコンビナントヒトELと結合したハイブリドーマのクローン(12B10)を得た。12B10のクローンが産出する抗体を12B10抗体と命名した。マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット(BD Bioscience)を用いて、12B10の抗体のサブクラスを決定した結果、12B10抗体のサブクラスは、IgG2aであった。
12B10抗体とヒトおよびウサギELとの結合能測定
抗マウスIgG−Fc抗体固相化プレートに、15μlの12B10抗体(1μg/mL)を含むアッセイバッファー加えて2時間放置した。これらのウェルを90μlの洗浄液で3回洗浄した後、15μlのヒトEL lysate、ウサギEL lysate、またはMock lysate(ネガティブコントロール)を含むアッセイバッファーを加えて、4℃で16時間放置した。これらのウェルを90μlの洗浄液で3回洗浄した後、15μlのビオチン標識抗C2タグ抗体(Fab)とHRP標識ストレプトアビジンを含むアッセイバッファーを加え、室温で1時間放置した。これらのウェルを90μlの洗浄液で3回洗浄した後に、15μlのTMB+−Substrate−Chromogen(DAKO社製)を添加して室温で30分間発色させた後に、15μlの0.05Mの硫酸を添加し反応を停止し、450nmにおける吸光度を測定した。その結果、12B10抗体は、ヒトELおよびウサギELに結合することが示された(図1)。
12B10抗体のEL酵素活性阻害能の測定
ヒトELおよびウサギELをコードするDNAをそれぞれクローニングしたpcDNA3.1(インビトロジェン社製)をFreeStyle HEK293F細胞にトランスフェクションし、37℃、8% CO2で2日間培養した。培養液を遠心し、細胞を回収して、20U/mLのヘパリンを含むPBSにて懸濁し、37℃で45分間インキュベーションした。その後、遠心により細胞を除去して得た上清をヒトEL酵素溶液とした。20mM トリス塩酸緩衝液(pH7.5)、0.5%ウシ血清アルブミン、4mM 塩化カルシウム、150mM 塩化ナトリウム、2mg/mLヒトHDL(Athens Research&Technology社製)で構成される反応溶液に12B10抗体を添加した後に、ヒトEL酵素溶液またはウサギEL酵素溶液を添加した(全量で10μl )。37℃で2時間反応後、EL酵素によってHDLから生成される遊離脂肪酸(NEFA)をNEFA C−テストワコー(和光純薬工業社製)で測定し、そのNEFA量を酵素活性指標とした。12B10抗体を添加しない時の酵素活性をコントロール値とし、抗体の各濃度でのコントロール値に対する比活性を算出、その阻害曲線より12B10抗体の50%阻害濃度(IC50値)を求めた(図2)。その結果、12B10抗体はヒトELおよびウサギELの酵素活性を阻害し、そのIC50は、それぞれ、47nM (ヒトEL)および201nM (ウサギEL)であった。
12B10抗体のHLおよびLPL酵素活性阻害能の測定
ヒトHLをコードするDNAをクローニングしたpcDNA3.1(インビトロジェン社製)をFreeStale HEK293F細胞にトランスフェクションし、37℃、8%CO2で2日間培養した。培養液を遠心し、細胞を回収して、20U/mLのヘパリンを含むPBSにて懸濁し、37℃で45分間インキュベーションした。その後、遠心により細胞を除去して得た上清をヒトHL酵素溶液とした。同様の操作によりウサギHL、ならびにヒトLPLおよびウサギLPL酵素溶液を調製した。20mM トリス塩酸緩衝液(pH7.5)、0.5%ウシ血清アルブミン、4mM 塩化カルシウム、150mM 塩化ナトリウム、0.5mg/mLヒトVLDL(INTRACEL社製)で構成される反応溶液に12B10抗体溶液(終濃度 32μg/ml)を添加した後、ヒトもしくはウサギHL、またはヒトもしくはウサギLPL酵素溶液を添加した(全量で10μl)。37℃で2時間反応後、HLもしくはLPL酵素によって、VLDLから生成される遊離脂肪酸(NEFA)をNEFA C−テストワコー(和光純薬工業社製)で測定し、そのNEFA量を酵素活性指標とした。12B10抗体を添加しない時の酵素活性をコントロール値とし、コントロール値に対する比活性を算出した(図3)。その結果、12B10抗体は、HLとLPLの酵素活性を阻害しないことがわかった。
12B10抗体のエピトープマッピング
抗マウスIgG−Fc抗体固相化プレートに、15μlの12B10抗体(5μg/mL)を含むアッセイバッファー加えて加えて2時間放置した。これらのウェルを90μlの洗浄液(0.01% Tween20を含む生理食塩水)で3回洗浄した後、15μlのヒトEL_411−500断片LysateまたはヒトEL_411−459断片Lysateを含むアッセイバッファー(4%ブロックエース、0.05%Tween20、150mM NaClを含む50mM トリス緩衝液pH7.4)加えて、4℃で一晩放置した。これらのウェルを90μlの洗浄液で3回洗浄した後、15μlのビオチン標識抗C2タグ抗体(Fab)とHPR標識ストレプトアビジン(Thermo scientific社製)を含むアッセイバッファーを加え、室温で1時間放置した。これらのウェルを90μlの洗浄液で3回洗浄した後に、15μlのTMB+−Substrate−Chromogen(DAKO社製)を添加して室温で30分間発色させた後に、15μlの0.05Mの硫酸を添加し反応を停止し、450nmにおける吸光度を測定した。その結果、12B10抗体は、ヒトEL_411−500断片、ヒトEL_411−459断片とも結合することが確認できた(図4)。
ヒトEL、ヒトLPL及びヒトHLのアミノ酸配列のアライメントを図5Aに示している。2種以上で共通するアミノ酸配列を実線の枠で囲い、catalytic triadのアミノ酸残基を★印で示しているが、当該アミノ酸残基付近は上記の3種のタンパク質間でアミノ酸配列の相同性が高かった。
一方、12B10抗体が結合する領域のアミノ酸を破線の枠で囲んでいるが、当該領域のアミノ酸配列は、ヒトEL、ヒトLPL及びヒトHL間で相同性が高くないため、実施例6で検討したように、12B10抗体がEL選択的な阻害能を有していると考えられた。
12B10の可変領域のアミノ酸配列決定
12B10抗体について、常法を用いて可変領域の配列を決定した(図6A)。
12B10抗体の重鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列番号6で、可変領域のCDR1のアミノ酸配列は配列番号7で、可変領域のCDR2のアミノ酸配列の配列番号は8で、可変領域のCDR3のアミノ酸配列は配列番号9であった。12B10抗体の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列番号10で、可変領域のCDR1のアミノ酸配列は配列番号11で、可変領域のCDR2のアミノ酸配列の配列番号は12で、可変領域のCDR3のアミノ酸配列は配列番号13であった。
ヒヒEL発現アデノウイルス調製
pShuttleベクター(クロンテック社製)に、PCR法、制限酵素を用いた手法により、C2タグ(配列番号3)を付加したヒヒELcDNA配列をクローニングした。このサブクローンベクターと、アデノウイルス骨格遺伝子を有するベクターを、PI−SceIおよびI−CeuI酵素により消化した(Adeno−x Accessory Kit, クロンテック社製)。消化断片のライゲーション反応を16℃、3時間行い(ligation high, 東洋紡社製)、ライゲーション産物を大腸菌株(ワンショットStbl3ケミカルコンピテントセル, インビトロジェン社製)にトランスフォームした。アンピシリン選択後、得られたクローンよりプラスミドを精製し(QIAprep spin Miniprep Kit, QIAGEN社製)、次いでPacI酵素(New England Biolabs社製)処理による大腸菌生育領域の切り出しを行った。以上により、アデノウイルスベクター作製のためのプラスミドDNAを得た。得られたプラスミドDNAをHEK293細胞(ヒューマンサイエンス振興財団より分与)にLipofectamine2000(インビトロジェン社製)を用いてトランスフェクションし、10%ウシ血清含有DMEM培地中、37℃、5% CO2下で培養した。トランスフェクション後は5日おきに培地交換を行い、細胞変性効果(CPE)が確認されるまで培養を継続した。CPEの確認後、培養上清および細胞を回収した。回収した細胞は、ドライアイス・メタノール浴と温水浴を用い凍結融解を5回程度繰り返した後、3000rpmにて15分遠心して得られた上清を、細胞抽出液として回収した。この細胞抽出液と、培養上清を混合し、ウイルスベクター含有液とした。このウイルスベクター含有液をHEK293細胞に添加し、同様の操作を繰り返すことにより、ウイルスベクターの増幅を行った。増幅後、最終的に得られた細胞抽出液を、Benzonase(Merck−Novagen社製)で37℃、30分間処理後遠心し、得られた上清を、以下の密度勾配遠心によるウイルスベクター精製に用いた。1.5、1.35、1.25g/cmの塩化セシウムを含むPBS(Phosphate buffered saline)を遠心管内に重層し、次いで上記上清を重層した。これを35000rpm, 16℃で1時間遠心し、目視によって得られたウイルスベクターを回収した。回収したウイルスベクターは、10%グリセロール含有PBSに対して透析を行い、精製アデノウイルスベクターとした。ウイルスベクターは一部をタイター測定(Adeno−X rapid titer kit, クロンテック社製)および自己増殖能獲得型出現判定に用い、異常のないもののみを以下の免疫に使用した。
ヒヒEL−C2タグのアミノ酸配列は、配列番号14に記載した。
ヒヒEL発現アデノウイルスベクター免疫
精製したヒヒEL発現アデノウイルスベクター2×10i.f.u.相当を、8週齢の雌マウス(BALB/cAnNCrlCrlj種、日本エスエルシーより入手)の静脈内、皮下または後肢筋肉内に投与した。投与後は、7日毎に尾静脈より血液を採取し、これより調製した血清を用いて抗体価の測定を行った。また、初回のアデノウイルスベクター投与に加えて、追加免疫として同量のアデノウイルスベクターを静脈内、皮下または後肢筋肉内に投与した。抗体価の上昇を認めたマウスについて、最終免疫として、尾静脈よりブースター免疫を実施した。
抗体産出ハイブリドーマの作製
最終免疫の3日後に、ヒヒELに対する抗体価の上昇が認められた個体について開腹し、脾臓を摘出し、脾臓細胞を回収した。脾臓細胞とマウスミエローマ細胞(p3×63−Ag8.U1、東京腫瘤研究所)を50%のポリエチレングリコール4000を用いて融合させ、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含む培地で選択した。
ELヘパリン抽出液の調製
ヒヒELをコードするDNAをそれぞれクローニングしたpcDNA3.1(インビトロジェン社製)をFreeStyle HEK293F細胞にトランスフェクションし、37℃、8% CO2で3日間培養した。培養液を遠心し、細胞を回収して、20U/mLのヘパリンを含むPBSにて懸濁し、37℃で45分間インキュベーションした。その後、遠心により細胞を除去して得た上清をヒヒELヘパリン抽出液とした。同様の方法で、カニクイザルEL、ウサギEL、マウスEL−C2タグ、およびヒト[331-459]-マウスELのヘパリン抽出液を調製した。
カニクイザルEL−C2タグのアミノ酸配列は配列番号15に、マウスEL−C2タグのアミノ酸配列は配列番号16に、ヒト[331-459]-マウスEL−C2タグのアミノ酸配列は配列番号17に記載した。
ヒヒELに結合する抗体を産出するハイブリドーマの選定
細胞融合10日後に特異抗体産生細胞のスクリーニングを行った。スクリーニングに用いたELSIAは以下の通りである。384穴マイクロタイタープレート(ヌンク社製)の各ウェルに0.35μgの抗マウスIgG−Fc抗体(Jackson Immuno Research社製)を含むトリス緩衝液(50mM Tris−HCl、pH7.5)を35μl加えて4℃、16時間固定した。これらのウェルを90μlの洗浄液(0.01% Tween20を含む生理食塩水)で1回洗浄した後、ブロックエース(大日本製薬社製)を100μl加えて室温で2時間放置して、ブロッキングを行った(抗マウスIgG−Fc抗体固相化プレート)。各ウェルを90μlの洗浄液で1回洗浄した後、15μlのハイブリドーマ培養上清を加えて2時間放置した。これらのウェルを90μlの洗浄液で3回洗浄した後、15μlのヒトEL lysateを含むアッセイバッファー(4%ブロックエース、0.05% Tween20、150mM NaClを含む50mMトリス緩衝液pH7.4)を加えて、4℃で16時間放置した。これらのウェルを90μlの洗浄液で3回洗浄した後、15μlのビオチン標識抗C2タグ抗体(Fab)とHRP標識ストレプトアビジン(Thermo scientific社製)を含むアッセイバッファーを加え、室温で1時間放置した。これらのウェルを90μlの洗浄液で3回洗浄した後に、15μlのTMB+−Substrate−Chromogen(DAKO社製)を添加して室温で30分間発色させた後に、15μlの0.05Mの硫酸を添加し反応を停止し、450nmにおける吸光度を測定した。スクリーニングの結果から、リコンビナントヒヒELと結合したハイブリドーマのクローン(47B2、25E4、8F5、3B1、41H8)を得た。47B2、25E4、8F5、3B1および41H8のクローンが産出する抗体を、それぞれ47B2、25E4、8F5、3B1および41H8抗体と命名した。マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット(BD Bioscience)を用いて、抗体のサブクラスを決定した結果、47B2抗体はIgG2a、25E4抗体はIgG2b、8F5抗体はIgG2a、3B1抗体はIgG1、41H8抗体はIgG1であった。
ELのC末断片の免疫
ヒトELのC末領域をコードするcDNAをpGEX6P−1(GEヘルスケア社製)にクローニングし、大腸菌BL21Star株(ライフテクノロジーズ社製)に形質転換した。この大腸菌の培養液にIPTGを添加し、ELのC末断片タンパク質の発現を誘導した。一晩培養した後に菌体を回収し、GSTrapカラムにてELのC末断片を精製し、これを免疫原とした。調製したELのC末断片タンパク質100μgをフロイント完全アジュバントと共に4週齢A/J Jms Slc雌マウスに腹腔内投与し、初回免疫とした。その後、21日後、42日後、63日後にELのC末断片タンパク質100μgをフロイント不完全アジュバントと共に投与し、追加免疫とした。さらに84日後にELのC末断片タンパク質100μgを生理食塩水0.1mlに縣濁した溶液を腹腔内投与し、最終免疫とした。実施例17と同様の方法でスクリーニングした結果から、リコンビナントヒヒELと結合したハイブリドーマのクローン(16A11)を得た。16A11のクローンが産出する抗体を16A11抗体と命名した。マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット(BD Bioscience)を用いて、抗体のサブクラスを決定した結果、16A11抗体はIgG1であった。
EL抗体のEL酵素活性阻害能の測定
12B10抗体について、実施例15で調製したカニクイザル、ヒヒおよびヒト[331-459]-マウスELに対するEL活性阻害能を、実施例8と同様の手法を用いて測定した。抗体を添加しない時の酵素活性をコントロール値とし、抗体の各濃度でのコントロール値に対する比活性を算出した(図7A)。
また、47B2、25E4、16A11、8F5、3B1および41H8の各抗体について、実施例15で調製したカニクイザル、ヒヒ、ウサギおよびヒト[331-459]-マウスELに対するEL活性阻害能を、実施例8と同様の手法を用いて測定した。抗体を添加しない時の酵素活性をコントロール値とし、抗体の各濃度でのコントロール値に対する比活性を算出した(図7B〜G)。
図2および図7A〜図7Gの阻害曲線より、各抗体の50%阻害濃度(IC50値)を求め、結果を後述の表1にまとめた。
各EL抗体のHLおよびLPL酵素活性阻害能の測定
ヒトHLをコードするDNAをクローニングしたpcDNA3.1(インビトロジェン社製)をFreeStyle HEK293F細胞にトランスフェクションし、37℃、8%CO2で2日間培養した。培養液を遠心し、細胞を回収して、20U/mLのヘパリンを含むPBSにて懸濁し、37℃で45分間インキュベーションした。その後、遠心により細胞を除去して得た上清をヒトHL酵素溶液とした。同様の操作により、ヒトLPL酵素溶液を調製した。20mM トリス塩酸緩衝液(pH7.5)、0.5%ウシ血清アルブミン、4mM 塩化カルシウム、150mM 塩化ナトリウム、0.5mg/mLヒトVLDL(INTRACEL社製)で構成される反応溶液にEL抗体溶液を添加した後、ヒトHL、またはヒトLPL酵素溶液を添加した(全量で10μl)。37℃で2時間反応後、HLもしくはLPL酵素によって、VLDLから生成される遊離脂肪酸(NEFA)をNEFA C−テストワコー(和光純薬工業社製)で測定し、そのNEFA量を酵素活性指標とした。EL抗体を添加しない時の酵素活性をコントロール値とし、コントロール値に対する比活性を算出した。比較のため、結果をカニクイザルELの阻害曲線と並べて記載した(図8A〜G)。
その結果、12B10、47B2、25E4、16A11、8F5、3B1および41H8のEL抗体全てが、HLとLPLの酵素活性を阻害しないことがわかった。
同様の操作によりウサギHLおよびウサギLPL酵素溶液を調製し、EL抗体を添加しない時の酵素活性をコントロール値とし、コントロール値に対する比活性を算出した。比較のため、結果をウサギELの阻害曲線と並べて記載した(図8H〜I)。
その結果、8F5および47B2抗体はHLとLPLの酵素活性を阻害しないことがわかった。
各EL抗体のエピトープマッピング
47B2、25E4、16A11、8F5、3B1および41H8抗体のエピトープマッピングを実施例10と同様の手法で行った。
47B2、16A11、8F5および3B1抗体は、12B10抗体と同様に、ヒトEL_411−459断片に結合することが確認できたので、これらの抗体のエピトープは、12B10抗体と同様だと結論付けた。
一方、25E4および41H8抗体は、ヒトEL_411−459断片には結合せず、ヒトEL[331-459]−マウスELにのみ結合するので、これらの抗体のエピトープは、ELのアミノ酸配列331−459であると結論付けた。
以上のことから、本発明の抗体は、ヒトELのアミノ酸配列331−459位の領域に結合することを特徴としていることが結論付けられたので、本発明の抗体が結合するヒトELの領域を図5Bに示した。
図5B中に、本発明の抗体が結合する領域のアミノ酸を破線の枠で囲んでいるが、この領域のアミノ酸配列は、ヒトEL、ヒトLPL及びヒトHL間で相同性が高くないため、実施例19で検討したように、本発明の抗体がEL選択的な阻害能を有していると考えられた。
実施例で得た抗体の特徴を表1にまとめた。

表1
Figure 0006195306
EL抗体の結合親和性
EL抗体の結合親和性をBiacoreを用いて測定した。抗C2タグ抗体をSensor chip CM5(GE HealthCare社製)にアミンカップリング法により固定化し、HBS−P(GE HealthCare社製)で希釈したヒヒEL‐C2ヘパリン抽出液、もしくはカニクイザルEL−C2ヘパリン抽出液を添加し、Sensor ChipにELをトラップした。その後、HBS−Pで希釈したEL抗体を添加し、BIAevaluation softwareを用いて、Bivalent fittingにより結合親和性を算出した(図9A〜G)。各抗体の結合親和性についての結果を、表2および表3にまとめた。

表2 カニクイザルELに対する結合親和性

Figure 0006195306


表3 ヒヒELに対する結合親和性

Figure 0006195306
ウサギでのHDL−c上昇作用
ウサギ(ニュージーランドホワイト種、北山ラベスより購入)にPBSで希釈した47B2および8F5抗体を10mg/kgの用量で耳介周囲静脈より投与した。群構成は、EL中和抗体投与群を抗体毎に3羽、コントロール抗体投与群を2羽とした。抗体投与後、1日、2日、5日、7日および9日後に採血し、コレステストNHDL(積水メディカル社製にて血中のHDL−c濃度を測定し、その結果を図10Aおよび図10Bに記載した。
EL抗体の可変領域のアミノ酸配列決定
47B2、25E4、16A11、8F5、3B1および41H8抗体について、実施例11と同様の手法を用いて、可変領域の配列を決定した。
47B2抗体の重鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列番号18で、可変領域のCDR1のアミノ酸配列は配列番号19で、可変領域のCDR2のアミノ酸配列の配列番号は20で、可変領域のCDR3のアミノ酸配列は配列番号21であった。47B2抗体の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列番号22で、可変領域のCDR1のアミノ酸配列は配列番号23で、可変領域のCDR2のアミノ酸配列の配列番号は24で、可変領域のCDR3のアミノ酸配列は配列番号25であった(図6B)。
25E4抗体の重鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列番号26で、可変領域のCDR1のアミノ酸配列は配列番号27で、可変領域のCDR2のアミノ酸配列の配列番号は28で、可変領域のCDR3のアミノ酸配列は配列番号29であった。25E4抗体の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列番号30で、可変領域のCDR1のアミノ酸配列は配列番号31で、可変領域のCDR2のアミノ酸配列の配列番号は32で、可変領域のCDR3のアミノ酸配列は配列番号33であった(図6C)。
16A11抗体の重鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列番号34で、可変領域のCDR1のアミノ酸配列は配列番号35で、可変領域のCDR2のアミノ酸配列の配列番号は36で、可変領域のCDR3のアミノ酸配列は配列番号37であった。16A11抗体の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列番号38で、可変領域のCDR1のアミノ酸配列は配列番号39で、可変領域のCDR2のアミノ酸配列の配列番号は40で、可変領域のCDR3のアミノ酸配列は配列番号41であった(図6D)。
8F5抗体の重鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列番号42で、可変領域のCDR1のアミノ酸配列は配列番号43で、可変領域のCDR2のアミノ酸配列の配列番号は44で、可変領域のCDR3のアミノ酸配列は配列番号45であった。8F5抗体の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列番号46で、可変領域のCDR1のアミノ酸配列は配列番号47で、可変領域のCDR2のアミノ酸配列の配列番号は48で、可変領域のCDR3のアミノ酸配列は配列番号49であった(図6E)。
3B1抗体の重鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列番号50で、可変領域のCDR1のアミノ酸配列は配列番号51、可変領域のCDR2のアミノ酸配列の配列番号は52で、可変領域のCDR3のアミノ酸配列は配列番号53であった。3B1抗体の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列番号54で、可変領域のCDR1のアミノ酸配列は配列番号55で、可変領域のCDR2のアミノ酸配列の配列番号は56で、可変領域のCDR3のアミノ酸配列は配列番号57であった(図6F)。
41H8抗体の重鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列番号58で、可変領域のCDR1のアミノ酸配列は配列番号59、可変領域のCDR2のアミノ酸配列の配列番号は60で、可変領域のCDR3のアミノ酸配列は配列番号61であった。3B1抗体の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列番号62で、可変領域のCDR1のアミノ酸配列は配列番号63で、可変領域のCDR2のアミノ酸配列の配列番号は64で、可変領域のCDR3のアミノ酸配列は配列番号65であった(図6G)。
EL抗体の可変領域のアミノ酸配列のアライメント
実施例11および23より得られた12B10、47B2、25E4、16A11、8F5、3B1および41H8抗体の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列をアライメントした(図11A、図11B)。
重鎖、軽鎖のCDRの配列を解析すると、以下の点が明らかになった。
重鎖のCDR1のアミノ酸配列は、T(SorY)(GorN)(MorV)GVGの7つのアミノ酸配列からなっていた。
重鎖のCDR2のアミノ酸配列は、HIWW(NorH)(DorEorG)(EorNorY)(KorY)YY(KorNorS)(PorT)(AorDorGorS)LKSの16アミノ酸配列からなっていた。
重鎖のCDR3のアミノ酸配列は、(SorM)(AorY)(DorP)G(SorT)PFPSまたは(IorS)(GorSorY)(AorDorGorP)G(TorVorY)P(ForL)DYの9アミノ酸配列からなっていた。
軽鎖のCDR1のアミノ酸配列は、KASQDI(HorN)(KorRorT)(ForY)I(AorV)の11アミノ酸配列からなっていた。
軽鎖のCDR2のアミノ酸配列は、(HorY)(PorT)(ForS)TLQPの7アミノ酸配列からなっていた。
軽鎖のCDR3のアミノ酸配列は、LQYD(DorIorNorT)L(LorT)WTの9アミノ酸配列からなっていた。
以上の事実から、7つの抗体の重鎖および軽鎖のCDRには共通性があることが見出された。
本発明のEL抗体は、ELに対して選択的な阻害活性を有しているので、脂質代謝異常症、高脂血症、動脈硬化、アテローム性動脈硬化、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、糖尿病、肥満および/またはシンドロームXの治療および/または予防のための医薬として有用である。

Claims (4)

  1. 1)CDR1として配列番号7、CDR2として配列番号8およびCDR3として配列番号9のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに、
    CDR1として配列番号11、CDR2として配列番号12およびCDR3として配列番号13のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
    2)CDR1として配列番号19、CDR2として配列番号20およびCDR3として配列番号21のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに、
    CDR1として配列番号23、CDR2として配列番号24およびCDR3として配列番号25のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
    3)CDR1として配列番号27、CDR2として配列番号28およびCDR3として配列番号29のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに、
    CDR1として配列番号31、CDR2として配列番号32およびCDR3として配列番号33のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
    4)CDR1として配列番号35、CDR2として配列番号36およびCDR3として配列番号37のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに、
    CDR1として配列番号39、CDR2として配列番号40およびCDR3として配列番号41のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
    5)CDR1として配列番号43、CDR2として配列番号44およびCDR3として配列番号45のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに、
    CDR1として配列番号47、CDR2として配列番号48およびCDR3として配列番号49のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
    6)CDR1として配列番号51、CDR2として配列番号52およびCDR3として配列番号53のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに、
    CDR1として配列番号55、CDR2として配列番号56およびCDR3として配列番号57のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
    7)CDR1として配列番号59、CDR2として配列番号60およびCDR3として配列番号61のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに、
    CDR1として配列番号63、CDR2として配列番号64およびCDR3として配列番号65のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
    からなる群より選ばれるELに対するモノクローナル抗体またはその抗体断片。
  2. 1)配列番号6のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および、
    配列番号10のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
    2)配列番号18のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および、
    配列番号22のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
    3)配列番号26のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および、
    配列番号30のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
    4)配列番号34のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および、
    配列番号38のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
    5)配列番号42のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および、
    配列番号46のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
    6)配列番号50のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および、
    配列番号54のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
    7)配列番号58のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および、
    配列番号62のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
    からなる群より選ばれるモノクローナル抗体またはその抗体断片。
  3. 請求項1または2に記載のモノクローナル抗体またはその抗体断片を含有する、ELが関連する疾患の治療または予防のための医薬組成物。
  4. ELが関連する疾患が動脈硬化症である請求項3記載の医薬組成物。
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