KR20180051926A

KR20180051926A - 노란색 종피를 갖는 종자를 생산할 수 있는 돌연변이 벼 식물체 및 그의 용도

Info

Publication number: KR20180051926A
Application number: KR1020160148881A
Authority: KR
Inventors: 고희종; 김백기; 성상현
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2016-11-09
Filing date: 2016-11-09
Publication date: 2018-05-17
Also published as: KR101863954B1

Abstract

노란색 종피를 갖는 종자를 생산할 수 있는 돌연변이 벼 식물체, 상기 돌연변이 벼 식물체로부터 플라보노이드 화합물을 분리하는 방법, 황색 배 치사(yellow embryo lethal: YEL) 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 유전자 및 증가된 플라보노이드 화합물 함량을 갖는 돌연변이 벼 식물체를 제조하는 방법을 제공한다.

Description

노란색 종피를 갖는 종자를 생산할 수 있는 돌연변이 벼 식물체 및 그의 용도{Mutant rice plant capable of producing seed having yellow pericarp and use thereof}

노란색 종피를 갖는 종자를 생산할 수 있는 돌연변이 벼 식물체, 상기 돌연변이 벼 식물체로부터 플라보노이드 화합물을 분리하는 방법, 황색 배 치사(yellow embryo lethal: YEL) 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 유전자 및 증가된 플라보노이드 화합물 함량을 갖는 돌연변이 벼 식물체를 제조하는 방법에 관한 것이다.

벼 (Oryza sativa L.)는 아시아를 포함한 전 세계에서 경작되고 있다. 아시아에서 경작된 벼는 두-아종 즉, 인디카 타입(Oryza sativa. indica)과 자포니카 타입(Oryza sativa. japonica)으로 분류될 수 있다.

일반적으로 쌀의 구성성분은 90%가 전분이고 단백질이 7∼9%를 차지하며 약간의 지방이 들어있다. 쌀의 전분은 아밀로스와 아밀로펙틴 두 가지로 나뉜다. 자포니카는 아밀로스 함량이 17∼20%인데 비해 인디카는 아밀로스 함량이 25%나 된다. 예로부터 흑색, 자색, 갈색, 녹색 등의 종피를 가지고 있는 벼들을 음식의 색이나 풍미를 위해 사용해왔다.

이러한 종래 기술에 의하더라도, 노란색 종피를 갖는 종자를 생산하는 돌연변이 벼 식물체는 알려진 바 없다.

일 양상은 돌연변이 벼 식물체를 제공한다.

다른 양상은 상기 돌연변이 벼 식물체로부터 플라보노이드 화합물을 분리하는 방법을 제공한다.

다른 양상은 황색 배 치사(yellow embryo lethal: YEL) 단백질을 제공한다.

다른 양상은 상기 산물을 코딩하는 유전자를 제공한다.

다른 양상은 증가된 플라보노이드 화합물 함량을 갖는 돌연변이 벼 식물체를 제조하는 방법을 제공한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "단백질의 기능을 감소시키는 유전적 변형"은 모세포 (예, 유전적으로 조작되지 않은 세포) 중에서 측정된 것보다 더 낮은 단백질의 기능을 갖는 세포를 나타낸다. 상기 감소는 예를 들면, 모세포 또는 "야생형 (wild-type)" 세포의 상기 단백질의 기능에 비하여 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 약 100% 감소된 것일 수 있다. 상기 단백질의 기능은 종피색에 관련되는 물질을 합성하는데 관련될 기능일 수 있다. 상기 효소인 경우, 상기 기능은 효소 활성일 수 있다. "단백질의 기능을 감소시키는 유전적 변형"은 모세포 또는 야생형에 비하여 종피색을 더 노란색으로 변하게 하거나, 배의 색을 더 검은색으로 변하게 하는 것, 또는 그 조합일 수 있다. 또한, 상기 유전적 변형은 배를 치사시켜 생존성을 상실하게 하는 것일 수 있다. 상기 유전적 변형은 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 확인될 수 있다.

상기 유전적 변형은 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 결실(deletion) 또는 파괴(disruption)에 의하여 그 기능이 불활성화 또는 감소될 수 있다. 유전자의 "결실 (deletion)" 또는 "파괴 (disruption)"는 상기 유전자의 일부 또는 전체의 돌연변이, 또는 프로모터 또는 터미네이터와 같은 상기 유전자의 조절 서열의 일부 또는 전체의 돌연변이로서, 자연적 유전자 산물에 비하여 상기 유전자가 발현되지 않거나 감소된 수준으로 발현되거나, 또는 활성이 없거나 감소된 활성을 갖는 유전자 산물 (예, 효소)을 발현하도록 하는 것일 수 있다. 상기 돌연변이는 상기 유전자의 하나 이상의 뉴클레오티드의 부가, 치환, 삽입, 결실 또는 전환을 포함할 수 있다. 상기 유전자의 결실 또는 파괴는 상동 재조합, 지향된 돌연변이유발 (directed mutagenesis), 또는 분자 진화 (molecular evolution)와 같은 유전적 조작법에 의해 달성될 수 있다. 세포가 복수 개의 동일 유전자, 또는 유전자의 2 이상의 파라로그 (paralogs)를 포함한 경우, 하나 이상의 유전자는 제거 또는 파괴될 수 있다. 예를 들면, 상기 유전자의 불활성화 또는 파괴는 상동 재조합에 의하여 야기될 수 있으며, 또는 상기 유전자의 일부 서열을 포함하는 벡터를 세포에 형질전환하고, 세포를 배양하여 상기 서열이 세포의 내인성 유전자와 상동 재조합이 일어나도록 하여 상기 유전자를 결실 또는 파괴되도록 한 후, 상동 재조합이 일어난 세포를 선별 마커에 의해 선별함으로써 이루어질 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 유전자의 조작은 당업계에 공지된 분자생물학적 방법에 의할 수 있다.

용어 "모세포 (parent cell)"는 본래 세포 (original cell), 예를 들면, 조작된 식물세포에 대하여 동일 타입의 유전적으로 조작되지 않은 세포를 나타낸다. 특정한 유전적 변형에 대하여, 상기 "모세포"는 상기 특정 유전적 변형을 갖지 않은 세포이지만, 다른 상황에 대하여는 동일한 것일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "유전자"는 특정 단백질을 발현하는 핵산 단편을 의미하며, 5'-비코딩 서열(5'-non coding sequence) 및/또는 3'-비코딩 서열(3'-non coding sequence)의 조절 서열(regulatory sequence)을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.

본 명세서에 있어서 핵산 또는 폴리펩티드의 "서열 동일성 (sequence identity)"은 특정 비교 영역에서 양 서열을 최대한 일치되도록 얼라인시킨 후 서열간의 염기 또는 아미노산 잔기의 동일한 정도를 의미한다. 서열 동일성은 특정 비교 영역에서 2개의 서열을 최적으로 얼라인하여 비교함으로써 측정되는 값으로서, 비교 영역 내에서 서열의 일부는 대조 서열 (reference sequence)과 비교하여 부가 또는 삭제되어 있을 수 있다. 서열 동일성 백분율은 예를 들면, 비교 영역 전체에서 두 개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하는 단계, 두 서열 모두에서 동일한 아미노산 또는 뉴클레오티드가 나타나는 위치의 갯수를 결정하여 일치된 (matched) 위치의 갯수를 수득하는 단계, 상기 일치된 위치의 갯수를 비교 범위 내의 위치의 총 갯수 (즉, 범위 크기)로 나누는 단계, 및 상기 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 수득하는 단계에 의해 계산될 수 있다. 상기 서열 동일성의 퍼센트는 공지의 서열 비교 프로그램을 사용하여 결정될 수 있으며, 상기 프로그램의 일례로 BLASTN(NCBI), BLASTP(NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlign^TM (DNASTAR Inc) 등을 들 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "유전적 변형 (genetic modification)"이란 세포의 유전물질의 구성 또는 구조를 인위적으로 변경시키는 것을 포함한다.

일 양상은 모세포 또는 야생형에 비하여, 종피색을 더 노란색으로 변하게 하는 것, 배의 색을 더 검은색으로 변하게 하는 것, 배를 치사시켜 생존성을 상실하게 하는 것, 또는 이들의 조합을 유발시키는 유전적 변형을 포함하는 돌연변이 벼 식물체를 제공한다.

상기 조합은 종피색을 더 노란색으로 변하게 하는 것 및 배의 색을 더 검은색으로 변하게 하는 것, 또는 종피색을 더 노란색으로 변하게 하는 것 및 배의 색을 더 검은색으로 변하게 하는 것, 및 배를 치사시켜 생존성을 상실하게 하는 것일 수 있다. 상기 노란 색 또는 검은 색은 모세포 또는 야생형에 비하여, 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 100% 이상, 약 200% 이상, 약 500% 이상, 약 1000% 이상, 약 10000% 이상 더 노란 색 또는 검은 색일 수 있다.

상기 유전적 변형은 서열번호 1의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 황색 배 치사(yellow embryo lethal: YEL) 단백질의 기능을 감소시키는 유전적 변형, 또는 LOC_OsO2g53140 유전자가 결실 또는 파괴된 것일 수 있다.

상기 식물체에 있어서, LOC_OsO2g53140 유전자가 결실 또는 파괴된 것은 LOC_OsO2g53140 유전자 전체 또는 일부의 결실 또는 파괴를 포함한다. 상기 일부는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열 중 246번부터 951번까지의 706 뉴클레오티드 영역일 수 있다. 상기 영역은 5'-UTR 즉 개시코돈으로부터 -19 bp, 개시코돈을 포함한 첫번째 엑손 342bp, 및 첫번째 인트론 345bp를 포함한다.

상기 식물체에 있어서, 상기 유전적 변형은 서열번호 1의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 YEL 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 감소시키는 것일 수 있다. 상기 유전적 변형은 서열번호 1의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 YEL 단백질을 코딩하는 유전자를 불활성화 또는 파괴시키는 것일 수 있다. 상기 유전적 변형은 서열번호 1의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 YEL 단백질에서 1번부터 114번까지의 아미노산 서열에 해당하는 RING-finger 도메인을 코딩하는 영역을 불활성화 또는 파괴시키는 것일 수 있다. 상기 유전적 변형은 LOC_OsO2g53140 유전자인 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열 중 246번부터 951번까지의 706 뉴클레오티드 영역의 결실일 수 있다.

상기 식물체에 있어서, 상기 유전적 변형은 이형접합성(heterozygous) 또는 동형접합성(homozygous)인 것일 수 있다. 상기 유전적 변형은 종자에서 노란색 종피색 및 배 치사에 대하여 열성 표현형질(recessive phenotype)을 보이는 것일 수 있다. 상기 식물체는 한국생물자원센터에 2016년 9월 13일자로 기탁된 기탁번호 KCTC 18500P의 벼 식물체 또는 그로부터 유래된 식물체 또는 그 일부인 것일 수 있다.

상기 식물체는 종자, 미강(rice bran), 배(embryo) 또는 배유(endosperm)일 수 있다. 상기 식물체는 플라보노이드 화합물을 포함하는 것일 수 있다. 상기 플라보노이드 화합물는 전체 종자, 미강(rice bran), 배 또는 배유에 포함하는 것일 수 있다. 상기 플라보노이드 화합물은 1: luteolin 6,8-di-C-hexoside, 2: luteolin 6-C-pentosyl-8-C-hexoside (이소머 1), 3: Apigenin 6,8-di-C-hexoside, 4: luteolin 6-C-pentosyl-8-C-hexoside (이소머 2), 5: luteolin 6-C-pentosyl-8-C-hexoside (이소머 3), 6: Chrysoeriol 6,8-di-C-hexoside, 7: isoorientin-2''-O-glucoside, 8: luteolin 6-C-glucoside('isoorientin'이라고도 함), 9: Apigenin 6-C-hexosyl-8-C-pentoside, 10: luteolin 8-C-glucoside('orientin'이라고도 함), 11: Apigenin 6-C-pentosyl-8-C-hexoside (이소머 1), 12: Apigenin 6-C-pentosyl-8-C-hexoside (이소머 2), 13: Apigenin 2''-O-glucosyl-8-C-glucoside, 14: Apigenin 8-C-glucoside('vitexin'이라고도 함), 15: Apigenin 6-C-glucoside('isovitexin'이라고도 함), 16: Chrysoeriol 2''-O-glucosyl-6-C-glucoside, 17: Chrysoeriol 6''-O-hexosyl-6-C-hexoside, 18: Chrysoeriol 6-C-glucooside('isoscoparin'이라고도 함), 및 19: Chrysoeriol 8-C-glucoside('scoparin'이라고도 함)의 19개 화합물을 포함할 수 있다. 상기 플라보노이드 화합물은 Isoorientin-2"-O-glucoside, Isoorientin, Apigenin　2"-O-glucosyl-8-C-glucoside, Isovitexin, Chrysoeriol　2"-O-glucosyl-6-C-glucoside, Isoscoparin, 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있다. 상기 식물체는 상기 플라보노이드 화합물을 야생형에 비하여 증가된 양으로 포함하는 것일 수 있다. 상기 증가는 0.5(w/w)% 이상, 1(w/w)% 이상, 5(w/w)% 이상, 10(w/w)% 이상, 50(w/w)% 이상, 100(w/w)% 이상, 200(w/w)% 이상, 500(w/w)% 이상, 1000(w/w)% 이상일 수 있다. 또한, 상기 증가 함량은 야생형 대비 0.5 내지 1500(w/w)%, 1 내지 1500(w/w)%, 5 내지 1500(w/w)%, 10 내지 1500(w/w)%, 50 내지 1500(w/w)%, 100 내지 1500(w/w)%, 200 내지 1500(w/w)%, 500 내지 1500(w/w)%, 1000 내지 1500(w/w)%, 1000 내지 1100(w/w)%, 0.5 내지 1000(w/w)%, 1 내지 800(w/w)%, 5 내지 700(w/w)%, 또는 10 내지 500(w/w)%일 수 있다.

상기 식물체는 야생형 식물체에 화학적 돌연변이를 유발한 후 선발하거나, 돌연변이 yel 유전자를 야생형 식물체에 도입하는 것에 의하여 제조된 것일 수 있다.

다른 양상은 상기한 돌연변이 벼 식물체로부터 플라보노이드 화합물을 분리하는 단계;를 포함하는, 돌연변이 벼 식물체로부터 플라보노이드 화합물을 분리하는 방법을 제공한다.

상기 방법은 상기한 돌연변이 벼 식물체로부터 플라보노이드 화합물을 분리하는 단계;를 포함한다. 상기 식물체 및 플라보노이드 화합물에 대하여는 상기한 바와 같다.

상기 분리하는 예를 들면, 상기 돌연변이 벼 식물체 또는 그 부분을 용매와 접촉시켜 플라보노이드 화합물을 상기 용매에 중에 추출하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 추출 방법은 여과법, 열수 추출, 침지 추출, 환류냉각 추출, 가압추출, 아임계추출, 초임계추출 및 초음파추출 등 당업계의 통상적인 방법을 이용할 수 있다. 예를 들면, 열수 추출 방법일 수 있다. 열수 추출은 1회 내지 5회 추출하는 것일 수 있다. 상기 부분은 지상부, 또는 지하부일 수 있다. 상기 지상부는 전체 종자, 미강, 배, 배유, 줄기, 잎, 꽃 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 지하부는 뿌리일 수 있다.

상기 용매는 물, C1 내지 C12의 알코올 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 상기 알코올은 C1 내지 C3의 알코올, C1 내지 C4, C1 내지 C5 또는 C1 내지 C6의 알코올일 수 있다. 상기 알코올은 일차 알콜일 수 있다. 상기 C1 내지 C6의 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올 또는 이들의 혼합물인 것일 수 있다. 상기 용매는 예를 들면 물과 메탄올의 혼합물일 수 있다.

상기 추출은 상기 식물체를 용매 중에 일정 시간 동안 담가 두는 것을 포함할 수 있다. 상기 추출은 교반 또는 가열하는 것을 포함할 수 있다. 상기 가열은 50℃, 60℃, 70℃, 80℃, 또는 환류 온도까지 가열하는 것을 포함할 수 있다. 상기 가열은 50℃ 내지 환류 온도, 60℃ 내지 환류 온도, 70℃ 내지 환류 온도, 80℃ 내지 환류 온도, 또는 환류 온도까지 가열하는 것일 수 있다. 상기 추출 시간은 선택된 온도에 따라 달라질 수 있는데 1 시간 내지 2개월, 예를 들면, 1 시간 내지 1개월, 1 시간 내지 15일, 1 시간 내지 10일, 1 시간 내지 5일, 1 시간 내지 3일, 1 시간 내지 2일, 1 시간 내지 1일, 5 시간 내지 1개월, 5 시간 내지 15일, 5 시간 내지 10일, 5 시간 내지 5일, 5 시간 내지 3일, 5 시간 내지 2일, 5 시간 내지 1일, 10 시간 내지 1개월, 10 시간 내지 15일, 10 시간 내지 10일, 10 시간 내지 5일, 10 시간 내지 3일, 또는 10 시간 내지 2일일 수 있다. 상기 추출은 상기 식물체를 용매 중에서 환류 추출하는 것일 수 있다. 상기 용매는 상기 식물체 중량에 대하여 1 배, 2 배, 5 배, 10 배 또는 15배 이상의 부피를 갖는 것일 수 있다. 상기 용매는 상기 식물체 중량에 대하여 1배 내지 15배, 2배 내지 15배, 5배 내지 15배, 10배 내지 15배 또는 약 15배의 부피를 갖는 것일 수 있다. 상기 식물체는 건조된 것일 수 있다.

상기 추출은 또한 얻어진 추출액으로부터 감압 농축과 같은 알려진 방법에 의하여 용매를 제거하는 것을 포함할 수 있다. 상기 추출은 또한 얻어진 추출물을 동결건조와 같은 건조에 의하여 건조 추출물을 제조하는 것을 포함할 수 있다.

구체적으로, 상기 추출은 식물체의 전체 종자, 미강, 배, 또는 배유와 같은 식물체를 용매와 혼합하고 인큐베이션하여 용매 중에 추출하여 추출물을 얻는 단계; 용매 중 추출물을 여과하는 단계; 및 여과된 추출물을 감압 농축한 후 건조하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 방법에 있어서, 상기 플라보노이드 화합물은 Isoorientin-2"-O-glucoside, Isoorientin, Apigenin　2"-O-glucosyl-8-C-glucoside, Isovitexin, Chrysoeriol　2"-O-glucosyl-6-C-glucoside, Isoscoparin, 또는 이들의 조합인 것일 수 있다.

상기 방법에 있어서, 상기 돌연변이 벼 식물체는 전체 종자, 미강, 배, 또는 배유일 수 있다. 상기 돌연변이 벼 식물체는 상기 유전적 변형에 대하여 이형접합성(heterozygous) 또는 동형접합성(homozygous)인 것일 수 있다.

상기 방법은 상기 분리하는 단계 전에 이형접합성 돌연변이 벼 식물체를 성장시켜 종자를 생산하는 단계; 및 생산된 종자로부터 상기 유전적 변형에 대하여 동형접합성(homozygous)인 것을 분리하는 단계;를 더 포함할 수 있다.

상기 식물체를 성장시켜 종자를 생산하는 단계는 통상적으로 벼를 생육시키는 것을 포함한다. 상기 생육은 하우스 내 또는 노지 재배일 수 있다.

상기 생산된 종자로부터 상기 유전적 변형에 대하여 동형접합성(homozygous)인 것을 분리하는 단계는 식물체의 색, 모양, 및 크기와 같은 특성에 근거하여 분리하는 것일 수 있다. 상기 단계는 예를 들면, 종자의 종피의 노란색과 배의 검은 색에 근거하여 종자를 분리하는 것일 수 있다. 상기 분리하는 단계는 또한, 동형접합성 종자, 미강, 배, 또는 배유를 분리하는 것일 수 있다. 동형접합성 종자에서 배를 먼저 분리하고, 분리하고 남은 배유를 사용하거나 이 배유를 백미기로 도정할 때 부산물로 생성되는 미강을 사용한다. 상기 방법에 있어서, 플라보노이드 화합물을 분리하는 단계는 동형접합성 종자, 미강, 배, 배유, 또는 이들의 조합으로부터 분리하는 것일 수 있다.

다른 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 황색 배 치사(yellow embryo lethal: YEL) 단백질을 제공한다.

다른 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 황색 배 치사(yellow embryo lethal: YEL) 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

다른 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 황색 배 치사(yellow embryo lethal: YEL) 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.

다른 양상은 벼 세포에 대하여 모세포 또는 야생형에 비하여, 종피색을 더 노란색으로 변하게 하는 것, 배의 색을 더 검은색으로 변하게 하는 것, 배를 치사시켜 생존성을 상실하게 하는 것, 또는 이들의 조합을 유발시키는 유전적 변형을 도입시키는 단계를 포함하 는 증가된 플라보노이드 화합물 함량을 갖는 돌연변이 벼 식물체를 제조하는 방법을 제공한다.

상기 방법은 벼 세포에 대하여 서열번호 1의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 황색 배 치사(yellow embryo lethal: YEL) 단백질의 기능을 감소시키는 유전적 변형을 도입시키는 단계; 또는 LOC_OsO2g53140 유전자를 결실 또는 파괴시키는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

상기 유전적 변형을 도입시키는 단계는 알려진 방법 예를 들면, agrobacterium-매개된 공동배양(co-culture) 방법일 수 있다.

상기 방법은 상기 유전적 변형이 도입된 벼 식물체로부터 상기 유전적 변형에 대하여 동형접합성인 것을 분리하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 분리하는 단계는 노란색 종피를 갖고 검은색 배를 가진 종자를 분리하는 것일 수 있다.

일 양상에 따른 돌연변이 벼 식물체는 플라보노이드 화합물을 분리하는데 사용될 수 있다.

다른 양상에 따른 상기 돌연변이 벼 식물체로부터 플라보노이드 화합물을 분리하는 방법에 의하면, 플라보노이드 화합물을 효율적으로 분리할 수 있다.

다른 양상에 따른 황색 배 치사(yellow embryo lethal: YEL) 단백질 및 그를 코딩하는 유전자에 의하면, 증가된 플라보노이드 화합물 함량을 갖는 돌연변이 벼 식물체를 제조하는데 사용될 수 있다.

다른 양상에 따른 증가된 플라보노이드 화합물 함량을 갖는 돌연변이 벼 식물체를 제조하는 방법에 의하면, 증가된 플라보노이드 화합물 함량을 갖는 돌연변이 벼 식물체를 효율적으로 제조할 수 있다.

도 1은 야생형과 yel 돌연변이 벼 사이의 현미(brown rice)를 비교한 것이다.
도 2는 yel 유전자의 지도(map)-기반 클로닝을 나타낸다.
도 3은 F₂ 자손들에서 돌연변이 개체와 야생형 개체에 의한 공동-분리(co-segregation) 분석을 수행한 결과를 나타낸다.
도 4는 YEL-OE 형질전환 식물체와 yel 이형접합성 식물체 사이의 교배로부터 분리된 자손을 나타낸 도면이다.
도 5는 YEL 유전자의 발현 패턴을 나타낸 도면이다.
도 6은 상기 노란색 배 치사 돌연변이 벼의 종자 전체로부터 추출된 추출물 중에 존재하는 플라보노이드 화합물을 나타내는 HPLC 크로마토그램이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 노란색 배 치사 돌연변이(yellow embryo lethal) 벼의 선발 및 플라보노이드 함량 확인

1. 재료 및 방법

달리 언급이 없으면, 이하의 실시예에서 다음의 재료 및 방법을 사용하였다.

(1) 식물 재료

상기 노란색 배 치사 돌연변이 벼는 서울대학교 식물자원학과의 식물분자육종 실험실로부터 제공된 자포니카 품종인 화청벼 식물체의 미개화된 영에 1M 농도의 N-methyl-N-nitrosourea (MNU) 용액을 25℃, 암 조건에서 45분간 담가 처리하였다. 이후 식물체를 즉시 세척용 물에 넣어 24시간 동안 처리하고 이후 건조시키고 종자의 등숙이 완료된 후 수확하였다. 이렇게 얻어진 종자(M0)를 발아시켜 심고, M2 세대부터 선발하여 돌연변이체가 유도되었다. 상기 식물재료는 M14 계통(M14 line), 75094, 화청 M-6-17N-1-3-2-1-1-1-2-1-1-2-2로부터 사용되었다. 이 돌연변이체는 억제된 발아로 인한 배 치사성(embryo lethality) 때문에 이형접합체(heterozygote)로서 유지되었다. 이렇게 얻어진 노란색 배 치사 돌연변이 유전자를 갖고 있는 이형접합체 돌연변이 벼의 종자는 한국생물자원센터에 2016년 9월 13일자로 기탁번호 KCTC 18500P로 기탁되었다.

(2) 후보 유전자의 서열 분석

후보 유전자의 전장 게놈 DNA 서열은 게놈을 여러 중복되는 세그멘트로 나누어 시퀀싱하였다. 각 세그멘트에 대한 특이적 PCR 프라이머를 화청 및 노란색 배 치사 돌연변이 벼로부터 게놈 DNA를 증폭하기 위하여 사용하였다. TA 클로닝을 위하여 PCR 산물을 PCR purification kit (iNtRON Biotechnology, Korea)를 사용하여 정제하였다. 정제된 PCR 산물은 pGEM-T Easy Vector (Promega, USA)에 도입한 후 대장균 균주 DH5α에 형질전환시켰다. 얻어진 서열은 CodonCode Aligner software (version 1.6.3; CodonCode Coporation)에 의하여 비교되었다. 서열 정렬( Sequence alignment)은 Blast network service in National Center for Biotechnology Information (NCBI), Gramene 및 The Rice Annotation Project Database (RAP DB)와 함께 수행되었다.

(3) Gus 어세이

조직화학적 GUS-염색은 Jeon 등 (Plant J. 2000 Jun;22(6):561-70)에 기재된 방법에 따라 수행하였다.

일차적 형질전환체(primary transformant)의 성숙한 꽃, 잎, 종자, 줄기, 뿌리 등을 채취하고 각 조직을 Gus 용액에 처리하여 37℃에서 2일 동안 인큐베이션한 다음, 엽록소를 제거하기 위하여 95% 및 70% (w/v) 에탄올로 연속으로 치환하였다. 그 후, 상기 조직을 절단하는 현미경(dissecting microscope)하에서 검사하고, 그 염색 패턴을 분석하였다.

(4) 벡터 구조체 및 벼 형질전환

과발현 벡터를 생성하기 위하여, PCR-증폭된 야생형(서열번호 3) cDNA를 35S 프로모터 및 nos 터미네이터를 포함한 pMDC32 vector(서열번호 4)의 attR1 및 attR2 사이에 삽입하였다. 그 결과 얻어진 야생형 cDNA 과발현 구조체를 35S::COP1(YEL-OE)로 명명하였다. 프로모터-GUS 어세이를 위하여, COP1의 잠정적 프로모터 영역을 포함하는 게놈 서열(서열번호 5)을 게놈 DNA로부터 PCR에 의하여 증폭하였다. 상기 COP1 프로모터 단편은 바이너리 벡터 pHGWFS7의 attR1과 attR2 사이에 클로닝되었다. 상기 구조체를 갖는 형질도입 식물체(transgenic plants)는 agrobacterium-매개된 공동배양(co-culture) 방법(Hiei 등, Plant Mol Biol 35, 205-218, 1997)을 통하여 자포니카 품종인 야생형 동진 종자를 사용하여 생성되었다.

(5) 물질분석 관련 실험 방법

(5.1) 재료

(1) 식물재료'에서 기재된 노란색 배 치사 돌연변이 벼는 서울대학교 식물 과학과의 작물 분자 육종 실험실에서 20세대 동안 고정하였다. 본 실시예에 사용된 상기 노란색 배 치사 돌연변이 벼와 그 모 품종은 수원에서 소재하는 서울대학교 실험 농장에서 통상적 재배 관행에 따라 성장시켰다. 수확된 쌀알(rice grain)은 공기-건조시키고 수분 함량이 약 13%로 감소되도록 하였다. 시료를 11℃로 유지된 방에서 2개월 동안 저장한 후, 도정하고 갈라지거나(cracked) 명확하게 발색되지 않은 종자(unclearly colored seed)는 손으로 선발하여 제거하였다. 전체 종자(whole grain)는 배와 배유로 나눈 후, 상기 배유로부터 배와 배유의 경계의 일부분을 제거하였다. 각 시료는 밀(mill)(IKA^® A11 B, 독일)를 사용하여 갈고 기공 크기 300μm를 통과시킴으로써 채질하고, 이들을 추후 실험에 사용하였다.

(5.2) UPLC -DAD- ESI -Q- TOF -MS 분석을 위한 시료 준비

야생형 즉, 모 품종과 상기 노란색 배 치사 돌연변이 벼의 전체 종자, 배, 및 배유 부분 500mg을 메틸알콜과 물을 7:3으로 섞은 용매 1ml와 섞어 상온에서 20분간 소니케이션한 후, 15분간 4℃에서 원심분리하고, 0.5mL 상등액을 취하여 추출하였다. 이 과정을 한 번 더 반복하였다. 수집된 상등액을 5mL 유리 바이알에 모으고, 40℃에서 질소가스 하에서 증발시켜 농축시켰다. 이 추출물을 메틸알콜과 물을 1:1의 부피 비로 섞은 용매에 녹여 10 μg/ml의 내부 표준(internal standard) 아카세틴을 포함한 최종 농도가 2mg/mL가 되게 한다. 상기 시료는 UPLC-DAD-ESI-Q-TOF-MS 분석을 위하여 PVDF 필터(기공크기 0.2 μm)(현대마이크로 사, 한국)를 통하여 여과하였다.

(5.3) UPLC -DAD- ESI -Q- TOF -MS 시스템 및 조건

HR-ESI-MS 스펙트럼은 Waters XEVO G2 Q-TOF MS 상에서 측정되었다. UPLC 분석은 binary pump, degasser, autosampler 및 PDA detector가 구비된 UPLC 장치를 사용하여 BEH C₁₈ column (100 x 2.1 mm, 1.7　μm; Waters, Milford, MA, USA) 상에서 수행되었다.

UV-vis 흡광도 스펙트럼은 UPLC 분석 동안 200 nm 내지 500 nm으로부터 온라인으로 기록되었다. 이동상은 A (0.1% v/v formic acid aqueous solution) 및 B (0.1% v/v formic acid in acetonitrile)로 구성되었다. 구배 용출 조건은 다음과 같다: 0분에서 10% B, 5분에서 11% B, 8분에서 12% B, 12분에서 16% B, 13분에서 40% B, 15분에서 50% B, 18분에서 90% B, 및 21분에서 100%. 칼럼 및 autosampler 온도는 각각 40℃ 및 15℃로 맞추었다. 시료 주입 부피는 1 μl이었다.

MS ^E 검출을 위하여, 전자스프레이 이온화(electrospray ionization:ESI) 소스는 음이온 모드에서 작동되었고 최적 변수는 다음과 같다: capillary voltage of 3.2 kV; sampling cone voltage of 30 V; extraction cone voltage of 4 V; source temperature of 120℃; desolvation temperature of 350℃; cone gas flow of 50 L /hr; desolvation gas flow of 800 L/hr. 질량 범위는 m/z 50 내지 2000이었다. 아르곤이 충돌 기체로서 사용되었고 질소를 네불라이저 및 탈용매화 기체(desolvation gas)로 사용하였다. 낮은 에너지 함수에 대하여, 6 eV의 충돌 에너지가 적용되었고, 20 내지 40V의 충돌 에너지 랩프가 사용되었다. 질량 정확도를 보증하기 위하여 데이터는 Lockspray^TM (leucine-enkephalin at m/z 554.2615 in negative-ion detection mode)를 사용하여 보정하였다. 모든 조작, 데이터 획득 및 처리는 Masslynx 4.1 software를 사용하여 수행되었다.

노란색 돌연변이의 전체 낟알(whole grain)에 대한 19개 플라보노이드의 상대적 정량화가 내부 표준 acacetin을 병렬적으로 사용하여 확립되었다.

(5.4) 노란색 돌연변이체로부터 C- 글리코시딕 플라보노이드의 분리

노란색 돌연변이체 종자의 분말화된 배유 부분(288.4 g)을 실온에서 24 시간 동안 담가 두어 (maceration) 70% 메탄올(1.5L x 3)에 의하여 추출하였다. 상기 추출물을 여과하고 로터리 진공 증발기에서 농축하여 노란색 잔류물(7.0 g)을 얻었다. 상기 잔류물을 물 500 mL에 현탁하고 DCM (500 mLx4)으로 분배하여, DCM (2.0 g), 및 H2O (4.6 g)의 농축된 추출물을 얻었다. 이 플라보노이드-풍부 수성 잔류물을 수성 메탄올의 계단식 구배(15% MeOH -> 100% MeOH -> 100% Acetone)와 함께 Diaion HP-20 column chromatography (4.0 x 30 cm)(Mitsubishi Chemical Industry, 일본)에 적용하였다. 100% MeOH 분획물은 수성 MeOH로 용출된 (10% MeOH -> 100% MeOH), 중간압력 액체 크로마토그래패(Medium-pressure liquid chromatography:MPLC)에 대하여 수행되어 15 개 분획물 (OSAM-1 내지 OSAM0-15)을 얻었다. 상기 MPLC 분리는 Grace 사로부터 구입된 MPLC 시스템을 가진 Reveleris C18 reverse phase catridge 상에서 수행되었다. OSAM-6, OSAM-7, OSAM-8, OSAM-9 및 OSAM-10은 ACN/H₂O (containing 0.1% v/v formic acid) (각각 83:17, 84:16, 78:22, 81:19 및 77:23, v/v)로 용출된 YMC Hydrosphere C₁₈ column (250 x 10.0 mm, 5　μm)을 사용한 semi-preparative HPLC에 의하여 더 분리되었다. 상기 HPLC 분리는 Gilson UV/Vis-151 detector (Gilson, 미국)가 구비된 Gilson 321 HPLC system을 사용하여 수행되었다.

하기 화합물을 얻었다: 1 (25.1 mg) (from OSAM-6), 2 (16.7 mg) (from OSAM-7), 3 (43.8 mg) (from OSAM-8), 4 (19.3 mg) (from OSAM-8), 5 (0.8 mg) (from OSAM-9) and 6 (11.1 mg) (from OSAM-10). 상기 분리된 화합물은 1차원 (1D) ¹H-NMR, 1D ¹³C-NMR, 2차원 (2D) NMR(¹H-¹H COSY, HSQC, HMBC) 분광법, 및 음 이온 모드 전자 스프레이 이온화 질량 분석을 사용하여 확인하였다.

(5.5) HPLC -DAD 분석을 위한 시료 준비

3반복으로 HPLC 분석을 위한 노란색 돌연변이체 (YM) 및 야생형(WT)의 전 낟알, 노란색 돌연변이체(YEM) 및 야생형(WEM)의 배 부분, 노란색 돌연변이체(YEN) 및 야생형(WEN)의 배유 부분을 분말화하였다. 각 시료를 (350 mg)를 실온에서 20 분 동안 소니케이션을 사용하여 1.0 mL 70% MeOH로 두 번 추출하였다.

각 추출 단계에 대하여 500ml 상등액을 수집하였다. 수집된 상등액을 40℃에서 질소 기체 하에서 증발에 의하여 농축하였다. 상기 추출물은 MeOH/H₂O (1:1, v/v)에 녹여 각각 최종 농도 0.5 mg/mL (YEM), 4 mg/mL (YT) 16 mg/mL (YEN) 및 32 mg/mL (WT, WEM, WEN)가 되게 하고, HPLC-DAD 분석을 위하여 PVDF 필터로 여과하였다. 정량 분석을 위하여, 화합물 1-6을 포함한 혼합된 표준 용액을 준비하였다. 각 표준물은 50% MeOH에 녹였다.

(5.6) HPLC 분석을 사용한 플라보노이드 함량 결정

HPLC 분석은 autosampler, gradient system 및 diode array detector (DAD)가 구비된 Ultimate® 3000 UHPLC system (Thermo Fisher Scientific Inc.)를 사용하여 XBridge C₁₈ column (250 x4.6 mm, 5　μm; Waters, Milford, MA, USA) 상에서 수행되었다. Chromatogram은 365 nm에서 얻었고 photodiode array 스펙트럼은 190 내지 800 μm에서 기록되었다. 용출액 A는 0.1% formic acid aqueous solution이고 용출액 B는 0.1% formic acid in acetonitrile이다. 다음과 같은 구배 용출 프로토콜을 사용하였다: 0분에서 10% B, 10분에서 15.5% B, 22분에서 15.9% B, 23분에서 60% B, 30분에서 80% B, 및 32분에서 100% B.

유속은 1.0 mL/min이고 칼럼 및 autosampler 온도는 각각 30℃ 및 15℃로 유지되었다. 시료의 주입 부피는 5 μl이었다.

2. 결과

(1) yel 유전자의 분자 클로닝

노란색 배 치사 돌연변이 벼를 MNU를 이용한 화학적 돌연변이유발(chemical mutagenesis)에 의하여 얻었으며, 이는 쌀알(grain)에서 노란색 종피(yellow pericarp) 및 배 치사(embryo lethality)의 열성 표현형질(recessive phenotype)을 보였다. 그에 따라 yel로 명명하였다. 도 1은 야생형과 yel 돌연변이 벼 사이의 현미(brown rice)를 비교한 것이다. 도 1에서, A는 야생형 즉 화청의 갈색 쌀이고, B는 yel 돌연변이 벼의 갈색 쌀이고, C는 야생형 종자의 배이고, D는 yel 돌연변이 벼 종자의 배이다. 도 1에 나타낸 바와 같이, yel 돌연변이 벼의 종자는 야생형에 비교하여 노란색 종피색과 검은색 배를 나타내었다.

Yel 돌연변이 벼와 인디카 타입 벼인 밀양 23호 사이의 교배로부터 파생된 집단(population)을 사용하여 yel 좌(locus)를 세밀하게 지도(mapping)를 작성하였다. yel 유전자는 AP004058의 BAC 클론으로부터 기원되고 물리적 거리가 55kb인, 두 인접하는 마커(flanking marker), S02k-1과 S02k 사이의 2번 염색체의 긴 팔(long arm) 상에 위치하였다. 총 7개 후보 유전자가 이 영역 중에 위치하였다. 표 1은 이들 7개 후보 유전자를 나타낸다. yel 유전자를 확인하기 위하여, 7개 후보 유전자를 시퀀싱하였고 yel 돌연변이 벼와 그의 야생형, 화청 사이의 서열을 비교하여 변이를 확인하였다. 서열 분석 결과, 706-bp 결실이 Loc_Os02g53140 상의 5'-UTR로부터 개시 코돈을 포함한 제1 엑손과 제1 인트론에서 발견되었다.

번호	좌 이름	유전자 기술
1	Loc_Os02g53130	니트레이트 레덕타제
2	Loc_Os02g53140	COP1 (constitutive photomorphogenesis 1)
3	Loc_Os02g53150	발현된 단백질
4	Loc_Os02g53160	티로신 포스파타제 패밀리 단백질
5	Loc_Os02g53169	발현된 단백질
6	Loc_Os02g53180	1-아미노시클로프로판-1-카르복실레이트 옥시다제 단백질
7	Loc_Os02g53200	글루칸 엔도-1,3-베타-글루코시다제 전구체

도 2는 yel 유전자의 지도(map)-기반 클로닝을 나타낸다. 도 2에서, A는 STS 마커들에 의한 yel 좌의 유전적 지도를 작성한 것이고, B는 추가적인 STS 마커들에 의한 상기 yel 좌를 세밀하게 지도를 작성한 것이다. 상기 yel 좌는 S02K-1과 S02K 사이의 약 55kb 게놈 DNA 영역에 위치하고 있다. C는 세밀한 지도 작성에 의하여 확인된 상기 55kb 게놈 DNA 영역 중 7개 후보 유전자를 나타낸 것이다. D는 게놈 서열에서 상기 yel 유전자 구조를 나타낸다. 13개 엑손과 11개 인트론이 각각 검은색 사각형과 검색 선을 사용하여 표시되어 있다. 상기 706-bp 결실이 5'-UTR로부터 전체 제1 엑손을 포함한 제1 인트론까지에서 확인되었다.

상기 706-bp 결실이 돌연변이 표현형과 연관되어 있는지를 결정하기 위하여, 공동-우성(co-dominant) 마커를 사용하여 F₂ 자손들에서 돌연변이 개체와 야생형 개체에 의한 공동-분리(co-segregation) 분석을 수행하였다. 도 3은 F₂ 자손들에서 돌연변이 개체와 야생형 개체에 의한 공동-분리(co-segregation) 분석을 수행한 결과를 나타낸다. 상기 706-bp 결실 다형을 공동-우성 마커를 사용한 공동-분리에 대하여 시험하였다. 도 3에서, Y는 yel 돌연변이체를 나타내고, W는 야생형 표현형질을 타나내고, M은 돌연변이 표현형질을 나타내고, H는 F₂ 자손들에서 이형접합성 표현형질을 나타낸다. 이 결과는 Loc_Os02g53140 유전자에서 확인된 상기 706-bp 결실은 노란색 종피색 및 배 치사 표현형질에 대한 원인이라는 것을 나타낸다. YEL은 RING-finger, coiled-coil, 및 WD40 도메인을 포함한 단백질을 코딩한다. 상기 706-bp 결실의 결과로서 모든 RING-핑거 도메인은 YEL 유전자에서 결실되었다.

(2) 형질전환 식물에서 yel 유전자에 의하여 주어진 노란색 종피색 표현형질의 입증

야생형 YEL(35S::YEL (이하 'YEL-OE'라고도 함)를 과발현하는 형질전환 동진 식물체(YEL)를 제작한 후 돌연변이형 종자의 치사성으로 인하여 돌연변이를 분리하기 위하여 유지되고 있는 이형접합성 식물체(heterozygous plant)와 교배하였다. 본 발명자들은 F1 식물체 중에서 YEL-OE 삽입된 식물체를 선발하였으며, 이후 식물체에서 F₂ 종자를 확보하였고, F₂ 종자의 분리를 관찰하였다.

도 4는 YEL-OE 형질전환 식물체와 yel 이형접합성 식물체 사이의 교배로부터 분리된 자손을 나타낸 도면이다. 도 4에서, A는 야생형 종자이고, B는 yel 동형접합성 종자(돌연변이형)이고, C는 YEL-OE에 의하여 회복된 종자를 나타낸다.

상기 모든 흰색 치사성 종자가 YEL-OE 및 yel 동형접합성 대립인자를 동시에 가지고 있는지를 확인하기 위하여, F2 종자의 유전형을 분석하였다(genotype). 그 결과는 상기 모든 흰색 치사성 종자가 YEL-OE 삽입체와 동시에 yel 대립인자를 가졌다. 노란색 치사성 종자, 흰색 치사성 종자, 및 정상 종자의 분리 비율은 카이-검정 테스트(chi-square test)에 의하여 예측된 비율 1:3:13에 부합되었다. 표 2는 YEL-OE 삽입된 식물체 중 F₂ 종자의 분리 비율을 나타낸다. 상기 노란색 종피색 표현형질은 쌀 yel 유전자의 기능 상실(loss of function)의 결과일 수 있다는 것을 나타낸다.

이삭	노란색 치사성	흰색 치사성	정상	합계
1	8	22	60	90
2	5	16	59	80
3	8	15	55	78
4	4	3	44	51
5	4	13	44	61
6	4	6	33	43
7	3	7	35	45
8	3	13	64	80
합계	39	95	394	528

X²-1.26, p-0.53

(3) 벼 식물체의 다른 기관 및 조직에서 yel 유전자의 발현 패턴

벼 발생에서 상기 yel 유전자의 역할을 더 잘 이해하기 위하여, 다른 기관 및 조직에서 YEL 유전자의 발현 패턴을 YEL 프로모터의 조절 하의 베타-글루쿠로니다제 리포터 유전자를 사용하여 시험하였다. GUS 염색은 화분, 배, 종피, 및 절(node)에서 주로 검출되었다 (도 5의 C, E, G 및 H 참조). 상대적으로 강한 GUS 염색 신호가 분화영역(differentiation zone) 및 줄기의 분열영역(meristematic region)에서 검출된 반면 GUS 발현은 영(spikelet), 잎, 암술(stigma) 및 배유(endosperm)에서는 검출되지 않았다 (도 5의 A, C 및 D 참조).

도 5는 YEL 유전자의 발현 패턴을 나타낸 도면이다. 도 5에서, A 내지 H는 YEL 프로모터::GUS 형질전환된 식물체에서 검출된 GUS 활성을 나타낸 것으로서, A는 영, B는 꽃 기관(floral organ), C는 화분, D는 잎, E는 절, F는 종자, G는 배, H는 종피를 나타낸다.

(4) 종자, 배 및 배유 중 플라보노이드 화합물의 분석

"1. 재료 및 방법"에서, (5) 물질분석 관련 실험 방법의 "(5.1) 내지 (5.6)"에 기재된 방법에 따라 추출물 중에 존재하는 물질의 분석 결과는 다음과 같다.

도 6은 상기 노란색 배 치사 돌연변이 벼의 종자 전체로부터 추출된 추출물 중에 존재하는 화합물을 나타내는 HPLC 크로마토그램이다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 상기 노란색 배 치사 돌연변이 벼의 종자 전체에는 19개 화합물이 존재하는 것으로 확인되었다. 도 6에서 각 피크에 해당하는 화합물을 다음과 같다. 도 6에서, y축은 %를 나타낸다. 상기 19개 화합물이 노란색 배 치사 돌연변이 벼 종자에서 검출되었다.

1: luteolin 6,8-di-C-hexoside, 2: luteolin 6-C-pentosyl-8-C-hexoside (이소머 1), 3: Apigenin 6,8-di-C-hexoside, 4: luteolin 6-C-pentosyl-8-C-hexoside (이소머 2), 5: luteolin 6-C-pentosyl-8-C-hexoside (이소머 3), 6: Chrysoeriol 6,8-di-C-hexoside, 7: isoorientin-2''-O-glucoside, 8: luteolin 6-C-glucoside('isoorientin'이라고도 함), 9: Apigenin 6-C-hexosyl-8-C-pentoside, 10: luteolin 8-C-glucoside('orientin'이라고도 함), 11: Apigenin 6-C-pentosyl-8-C-hexoside (이소머 1), 12: Apigenin 6-C-pentosyl-8-C-hexoside (이소머 2), 13: Apigenin 2''-O-glucosyl-8-C-glucoside, 14: Apigenin 8-C-glucoside('vitexin'이라고도 함), 15: Apigenin 6-C-glucoside('isovitexin'이라고도 함), 16: Chrysoeriol 2''-O-glucosyl-6-C-glucoside, 17: Chrysoeriol 6''-O-hexosyl-6-C-hexoside, 18: Chrysoeriol 6-C-glucoside('isoscoparin'이라고도 함), 및 19: Chrysoeriol 8-C-glucoside('scoparin'이라고도 함)

이들 19개 화합물은 UPLC-DAD-ESI-Q-TOF-MS 분석으로부터 얻어진 데이터에 의하여 확인되고 잠정적으로 규명되었다. 상가 확인은 그 m/z 비율, 체류 시간(t_R), UV 스펙트럼, 및 단편화 패턴을 표준 물질과 비교하여 확증되었다. 분리하거나, 상업적으로 구입할 수 있는 표준품이 없는 경우, 상기 노란색 배 치사 돌연변이 벼의 전체 종자의 TIC의 피크를, 과학 문헌 또는 데이터베이스(Massbank, KNApSAcK, MoTo DB, METLIN, HMDB and ReSpect)로부터 얻어진 병렬 질량분석 데이터(tandem mass spectral data)와 비교하였다.

표 3은 HPLC-DAD를 이용하여 얻은 종자 전체, 배, 및 배유에서 추출된 추출물 중에 존재하는 주요 6개 플라보노이드 화합물의 정량 결과를 나타낸다. 표 3에서, WM은 야생형 종자 전체, WEM은 야생형 배, WEN은 야생형 배유, YM은 yel 돌연변이체 종자 전체, YEM은 yel 돌연변이체 배, 및 YEN은 yel 돌연변이체 배유, nd는 검출되지 않음(not detectable)을 각각 나타낸다.

위치	화합물((w/w)%)
위치	Isoorientin-2"-O-glucoside	Isoorientin	Apigenin 2"-O-glucosyl-8-C-glucoside	isovitexin	Chrysoeriol 2"-O-glucosyl-6-C-glucoside	Isoscoparin
WM	nd	nd	nd	nd	nd	nd
WEM	nd	nd	Nd	nd	nd	nd
WEN	nd	nd	nd	nd	nd	nd
YM	2.75±0.12	6.25±0.24	1.97±0.10	1.32±0.08	2.24±0.12	1.37±0.07
YEM	12.51±0.69	50.05±1.74	4.11±0.21	3.63±0.18	8.47±0.39	4.91±0.22
YEN	1.25±0.14	2.39±0.25	1.82±0.19	1.33±0.13	1.86±0.20	1.69±0.18

표 3에 나타낸 바와 같이, 상기 6개 화합물은 야생형 대비 yel 돌연변이체의 전체 종자, 배 또는 배유에서 현저하게 높은 함량을 보였다. 이들 중 6개 화합물 즉, Isoorientin-2"-O-glucoside, Isoorientin, Apigenin　2"-O-glucosyl-8-C-glucoside, Isovitexin, Chrysoeriol　2"-O-glucosyl-6-C-glucoside, 및 Isoscoparin의 함량이 특히 높았다.

상기한 바와 같이, yel 돌연변이체는 전체 종자, 배 또는 배유에 야생형에 대하여 19개 페놀성 화합물 특히 6개 화합물 즉, Isoorientin-2"-O-glucoside, Isoorientin, Apigenin　2"-O-glucosyl-8-C-glucoside, Isovitexin, Chrysoeriol　2"-O-glucosyl-6-C-glucoside, 및 Isoscoparin의 함량이 높아서, 이들 화합물을 분리하는데 사용할 수 있다.

<110> Seoul National University Industry Foundation <120> Mutant rice plant capable of producing seed having yellow pericarp and use thereof <130> PN115572KR <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 625 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 1 Met Gly Asp Ser Thr Val Ala Gly Ala Leu Val Pro Ser Val Pro Lys 1 5 10 15 Gln Glu Gln Ala Pro Ser Gly Asp Ala Ser Thr Ala Ala Leu Ala Val 20 25 30 Ala Gly Glu Gly Glu Glu Asp Ala Gly Ala Arg Ala Ser Ala Gly Gly 35 40 45 Asn Gly Glu Ala Ala Ala Asp Arg Asp Leu Leu Cys Pro Ile Cys Met 50 55 60 Ala Val Ile Lys Asp Ala Phe Leu Thr Ala Cys Gly His Ser Phe Cys 65 70 75 80 Tyr Met Cys Ile Val Thr His Leu Ser His Lys Ser Asp Cys Pro Cys 85 90 95 Cys Gly Asn Tyr Leu Thr Lys Ala Gln Leu Tyr Pro Asn Phe Leu Leu 100 105 110 Asp Lys Val Leu Lys Lys Met Ser Ala Arg Gln Ile Ala Lys Thr Ala 115 120 125 Ser Pro Ile Asp Gln Phe Arg Tyr Ala Leu Gln Gln Gly Asn Asp Met 130 135 140 Ala Val Lys Glu Leu Asp Ser Leu Met Thr Leu Ile Ala Glu Lys Lys 145 150 155 160 Arg His Met Glu Gln Gln Glu Ser Glu Thr Asn Met Gln Ile Leu Leu 165 170 175 Val Phe Leu His Cys Leu Arg Lys Gln Lys Leu Glu Glu Leu Asn Glu 180 185 190 Ile Gln Thr Asp Leu Gln Tyr Ile Lys Glu Asp Ile Ser Ala Val Glu 195 200 205 Arg His Arg Leu Glu Leu Tyr Arg Thr Lys Glu Arg Tyr Ser Met Lys 210 215 220 Leu Arg Met Leu Leu Asp Glu Pro Pro Ser Ala Pro Ile Gln Ser Gly 225 230 235 240 Asn Val Ile Ala Arg Lys Arg Arg Val Gln Ala Gln Phe Asn Glu Leu 245 250 255 Gln Glu Tyr Tyr Leu Gln Arg Arg Arg Thr Gly Ala Gln Ser Arg Arg 260 265 270 Leu Glu Glu Arg Asp Ile Val Thr Ile Asn Lys Glu Gly Tyr His Ala 275 280 285 Gly Leu Glu Asp Phe Gln Ser Val Leu Thr Thr Phe Thr Arg Tyr Ser 290 295 300 Arg Leu Arg Val Ile Ala Glu Leu Arg His Gly Asp Leu Phe His Ser 305 310 315 320 Ala Asn Ile Val Ser Ser Ile Glu Phe Asp Arg Asp Asp Glu Leu Phe 325 330 335 Ala Thr Ala Gly Val Ser Lys Arg Ile Lys Val Phe Glu Phe Ser Thr 340 345 350 Val Val Asn Glu Pro Ser Asp Val His Cys Pro Val Val Glu Met Ala 355 360 365 Thr Arg Ser Lys Leu Ser Cys Leu Ser Trp Asn Lys Tyr Ser Lys Asn 370 375 380 Val Ile Ala Ser Ser Asp Tyr Glu Gly Ile Val Thr Val Trp Asp Val 385 390 395 400 Gln Thr Arg Gln Ser Val Met Glu Tyr Glu Glu His Glu Lys Arg Ala 405 410 415 Trp Ser Val Asp Phe Ser Arg Thr Glu Pro Ser Met Leu Val Ser Gly 420 425 430 Ser Asp Asp Cys Lys Val Lys Val Trp Cys Thr Lys Gln Glu Ala Ser 435 440 445 Ala Ile Asn Ile Asp Met Lys Ala Asn Ile Cys Ser Val Lys Tyr Asn 450 455 460 Pro Gly Ser Ser His Tyr Val Ala Val Gly Ser Ala Asp His His Ile 465 470 475 480 His Tyr Phe Asp Leu Arg Asn Pro Ser Ala Pro Val His Val Phe Gly 485 490 495 Gly His Lys Lys Ala Val Ser Tyr Val Lys Phe Leu Ser Thr Asn Glu 500 505 510 Leu Ala Ser Ala Ser Thr Asp Ser Thr Leu Arg Leu Trp Asp Val Lys 515 520 525 Glu Asn Cys Pro Val Arg Thr Phe Arg Gly His Lys Asn Glu Lys Asn 530 535 540 Phe Val Gly Leu Ser Val Asn Asn Glu Tyr Ile Ala Cys Gly Ser Glu 545 550 555 560 Thr Asn Glu Val Phe Val Tyr His Lys Ala Ile Ser Lys Pro Ala Ala 565 570 575 Asn His Arg Phe Val Ser Ser Asp Leu Asp Asp Ala Asp Asp Asp Pro 580 585 590 Gly Ser Tyr Phe Ile Ser Ala Val Cys Trp Lys Ser Asp Ser Pro Thr 595 600 605 Met Leu Thr Ala Asn Ser Gln Gly Thr Ile Lys Val Leu Val Leu Ala 610 615 620 Pro 625 <210> 2 <211> 5547 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Oryza sativa <400> 2 acgcacattt gcccgcagcg ccgcggcgcg cgaggctacc ccgaccccga cgtggtctcc 60 tcccacccat acacccttcc gcttccacgc ccacacacag aacccaattc ccctccctcc 120 tcctccaccc gcccctccct cccacacaca ccacaccacc accaccacca cccacccctc 180 gtatgcaatt attcacgccc agtcgccgcc tccaccgccg ccgcctgctc gactcaccac 240 cgcagggcgg cctcctcctg ccgcatgggt gactcgacgg tggccggcgc gctggtgcca 300 tcggtgccga agcaggagca ggcgccgtcg ggggacgcgt ccacggcggc gttggcggtg 360 gcgggggagg gggaggagga tgcgggggcg cgcgcctccg cggggggcaa cggggaggcc 420 gcggccgaca gggacctcct ctgcccgatc tgcatggcgg tcatcaagga cgccttcctc 480 accgcctgcg gccacagctt ctgctacatg tgcatcgtca cgcatctcag ccacaagagc 540 gactgcccct gctgcggcaa ctacctcacc aaggcgcagc tctaccccaa cttcctcctc 600 gacaaggttt gcttgctcgt tctgcttaca cagccgagat ggataatgga ttggccgtgg 660 cttccatatt ccgccgatcg attgggaatt ttggatgcct atcctaattt caaacgcagg 720 gctttgtaat tgaaatgtca ctgccccgca aaaaaaaaaa attgaaatgt cactgaatgt 780 acctttggat gtggcttggg ataggtatcc ggtataacca attttaacaa atgtagcaac 840 tattcaacag tatgcctttc gattcgtttg tagcaactat tcaacagtat tcagcgcttg 900 agctgcgatt tattgtacta ctgtttgtgg tagcttctga agtagtagca ggtgttctga 960 ttggatagct cagttttatt tgacttgcac ggtacattac agtttgttgt taatgtaagt 1020 tttgtttaga atcaccagca gtggacagta ttagttctat gtctgctctg gttatcagta 1080 cctattatat aatttgttca tcactagagt tcttctctag ttctgttaaa acttaaaaca 1140 agctgtaatt actggttact tgatactggg attgtataaa tgtatctcta agcatgttta 1200 tcacatttat gtctgcatag gtcttgaaga aaatgtcagc tcgccaaatt gcgaagacag 1260 catcaccgat agaccaattt cgatatgcac tgcaacaggt cagtcacttc acatgtttta 1320 cttttgaaaa tgtctacttt caatagctcc ttaaacatag tggtatgttc ctaaatggtt 1380 ttatgtactg tgaaaatttt gcttccgtac cttagctgtg cttgtgatct tcagttcaga 1440 actaagtagt acagagtagt aattaagttc tacactgaac atgcttatct cttgcatcaa 1500 ttgtagaatc taagctactg tgaccgatat caaagtatct tttgttcctt cgctcttaca 1560 gccacatgat ctctatcgtc ctcttaactg ttacaaggat tgtccatatg ataaaccaag 1620 tataccacag aagatagatt tgcactacct tgctgacttt atatctgttt caaaattcaa 1680 acataaaact gacgttctct aaataagtaa tagatgaatg atgaccaaac actatcatat 1740 gttttagttt aattcttctt tctttttcta gggaaacgat atggcggtta aagaactaga 1800 tagtcttatg actttgatcg cggagaagaa gcggcatatg gaacagcaag agtcagaaac 1860 aaatatgcaa atattgctgg tcttcttgca ttgcctcaga aagcaaaagt tggaagagct 1920 gaatgaggtt tgtctatatg tatttttcag tatgcaggtt ttttttcttg ctacctacaa 1980 caataaataa tcttttactg atgtctattg ttgttaatca tgttaacctc ttttttacac 2040 agattcaaac tgacctacag tacatcaaag aagatataag tgctgtggag agacataggt 2100 tagaattata tcgaacaaaa gaaaggtact caatgaagct ccgcatgctt ttggatgaac 2160 ctgctgcatc aaagatgtgg ccctcaccta tggataaacc tagtggtctc tttcctccca 2220 actctcgggg accacttagt acatcaaatc cagggggttt acagaataag aagcttgact 2280 tgaaaggtca aattagtcat caaggatttc aaaggagaga tgttctcact tgctcggatc 2340 ctcctagtgc ccctattcaa tcaggcaacg ttattgctcg gaagaggcga gttcaagctc 2400 aggtttgttt ctcccattgc gcgcttgata gtttggtact atcatattgc aagcatgtag 2460 acagcttaga ttaggaactt atatgtttat tttgttttga tgtaagatga aatgctaatg 2520 tgctatgggg catattgcag tttaacgagc ttcaagaata ctatcttcaa agacggcgta 2580 ccggagcaca atcacgtagg ctggaggaaa gagacatagt aacaataaat aaagaaggtt 2640 atcatgcagg acttgaggat ttccagtctg tgctaacaac attcacacga tataggtccg 2700 ctgattattt gtccttttta gcacattatg atcatggtag tggttatgcc tattcatttg 2760 gcttatcatt cttttgttct ctgtcattta tgcttcagtc gcttgcgtgt aattgcggag 2820 ctaagacatg gagatctgtt tcactctgca aatatcgtat caaggttagt gcttttacaa 2880 aatatgtgcc ttatttcatg tgcatcaaca tgctattggc aatgtggatg ttgtcatagc 2940 tgaatcctca agccagcagt gagctgagga gaggttttgg ttggaggggg gatggtctat 3000 tgctcctatg agtcaaactt caactatgtt caattagcaa acaaatccac taatcttgaa 3060 tgctgatgtt tatcatgtat tataaggaac aaaatatgac tataagtttg tgcctgtttt 3120 tttggtgcat aattttcatt tccatgtcta tctgtaatct catatgtttt tcagtcgcct 3180 accttacatg agaataggga atcacattga tatttcttaa atgcagtatc gaatttgacc 3240 gtgatgatga gctatttgct actgctggag tctcaaagcg catcaaagtc ttcgagtttt 3300 ctacagtaag ttttttttca ggaatcttat gttggccata gctatatgcc tgtatagtat 3360 ttgaaaatac tcaaatttgg cctatcttat gtcgtaggtt gttaatgaac catcagatgt 3420 gcattgtcca gttgttgaaa tggctactag atctaaactc agctgcctta gctggaacaa 3480 gtactcaaaa aatgttatag caagcagcga ctatgagggt atagtaactg tttgggatgt 3540 ccaaacccgc caggtatttc ttgctctgtt ccacagttca ttttgcacac ttgtgttatt 3600 ttctgaactt ggattcatga tatttatgta ttcaatcttc tttagagtgt gatggagtat 3660 gaagaacatg aaaagagagc atggagtgtt gatttttctc gaacagaacc ctcgatgcta 3720 gtatctggga gtgatgattg caaggtattt gcaaatttca atggtacaac tacttttgtt 3780 attcccgaaa gcaagaaaac tttgcgtagt tctcaaaata cagtaaaaca taacttggat 3840 atatcgcatg ttatgcaaca tactaggatt ttattttatt tatcagtttt tcatgtccct 3900 ttttctataa tggtgcattt ttctacctag gctatcccaa cctcattgaa tgcatagatg 3960 gaagtatctg tattgcagta taccttatgg aacctactgc tgtttgtgct aggtcaaagt 4020 gtggtgcaca aagcaagaag caagtgccat caatattgat atgaaggcca atatttgctc 4080 tgtcaaatat aatcctgggt cgagccacta tgttgcagta tgttcctttg attttcttgg 4140 ctcatatcaa atataagttt ttttttcctt accagatgtt acattattgc aggtgggttc 4200 tgctgatcac catattcatt attttgattt gcgaaatcca agtgcgcctg tccatgtttt 4260 tggtgggcac aagaaagctg tttcttatgt gaagttcctg tccaccaatg agcttgcgtc 4320 tgcatcaact gatagcacat tacggttatg ggatgtcaaa gaaaattgcc ctgtatgtgt 4380 cattgagatt tttcttgcac tgcaattatg aaattatgtt tttgcctttt aagcagctat 4440 gacttattag taaaaagtga tgttttagga tatactctat ttcatatcga taaaaattgg 4500 agctatagtg tttctttatt tcctgggaaa aaactatttg agaagcttcg cttttttttc 4560 gaagaattct ggtccttgaa aaacctttgg ttaggtccga aattcttgga taagcatttg 4620 ttttcacctt tgtttctttt ttagctcatc tattagtctg gcttggttta gtagttacgt 4680 catgctaggc ttctcagaaa acagattgtt gaccttttgt ttaaaatggt tacctttttc 4740 aggtaaggac attcagaggg cacaagaatg aaaagaactt tgttgggctg tctgtaaata 4800 acgagtacat tgcctgcggg agtgaaacga atgaggtttt tgtttaccac aaggtaattg 4860 caagcttatt gcctgctctt gtttccgtat ctgtgattca gcattatgtg ccatgcttaa 4920 ctgtacaggt tggtctcctg tggcaccata taccattcta acttcaagta actctgtacc 4980 aattgcaggc tatctcaaaa cctgctgcca accacagatt tgtatcatct gatctcgatg 5040 atgcagatga tgatcctggc tcttatttta ttagcgcagt ctgctggaag agcgatagcc 5100 ctaccatgtt aactgctaac agtcagggca ccattaaagt tcttgtactt gctccttgat 5160 gaaatcagtg gttttcatga gatccctaga tagcttgtat atttgatgta tacagttgtt 5220 tccttttcgt gccattatac cccaaatggg agtggaggta ttactgatct ccaacatagg 5280 gcgcaaagtt ttgaaggtaa tcagctgaca tagggtttcg agggctcgaa atgtgcatag 5340 tccagaattc tcatgtatag gtttaaagca gtcaagtaat tgattataca tatgtaacgt 5400 gagaattgag aaatgaacat caaataagct tgtttggttg catatattgg attggatttt 5460 gggaactggg aagacaagct gtactgggct gatttcagca acacaagcca gtttgtcaca 5520 catctgctac ctaacagaaa tagttaa 5547 <210> 3 <211> 2400 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> amplified wild type yel gene <400> 3 gcaattattc 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gtttacagaa taagaagctt gacttgaaag 900 gtcaaattag tcatcaagga tttcaaagga gagatgttct cacttgctcg gatcctccta 960 gtgcccctat tcaatcaggc aacgttattg ctcggaagag gcgagttcaa gctcagttta 1020 acgagcttca agaatactat cttcaaagac ggcgtaccgg agcacaatca cgtaggctgg 1080 aggaaagaga catagtaaca ataaataaag aaggttatca tgcaggactt gaggatttcc 1140 agtctgtgct aacaacattc acacgatata gtcgcttgcg tgtaattgcg gagctaagac 1200 atggagatct gtttcactct gcaaatatcg tatcaagtat cgaatttgac cgtgatgatg 1260 agctatttgc tactgctgga gtctcaaagc gcatcaaagt cttcgagttt tctacagttg 1320 ttaatgaacc atcagatgtg cattgtccag ttgttgaaat ggctactaga tctaaactca 1380 gctgccttag ctggaacaag tactcaaaaa atgttatagc aagcagcgac tatgagggta 1440 tagtaactgt ttgggatgtc caaacccgcc agagtgtgat ggagtatgaa gaacatgaaa 1500 agagagcatg gagtgttgat ttttctcgaa cagaaccctc gatgctagta tctgggagtg 1560 atgattgcaa ggtcaaagtg tggtgcacaa agcaagaagc aagtgccatc aatattgata 1620 tgaaggccaa tatttgctct gtcaaatata atcctgggtc gagccactat gttgcagtgg 1680 gttctgctga tcaccatatt cattattttg atttgcgaaa tccaagtgcg cctgtccatg 1740 tttttggtgg gcacaagaaa gctgtttctt atgtgaagtt cctgtccacc aatgagcttg 1800 cgtctgcatc aactgatagc acattacggt tatgggatgt caaagaaaat tgccctgtaa 1860 ggacattcag agggcacaag aatgaaaaga actttgttgg gctgtctgta aataacgagt 1920 acattgcctg cgggagtgaa acgaatgagg tttttgttta ccacaaggct atctcaaaac 1980 ctgctgccaa ccacagattt gtatcatctg atctcgatga tgcagatgat gatcctggct 2040 cttattttat tagcgcagtc tgctggaaga gcgatagccc taccatgtta actgctaaca 2100 gtcagggcac cattaaagtt cttgtacttg ctccttgatg aaatcagtgg ttttcatgag 2160 atccctagat agcttgtata tttgatgtat acagttgttt ccttttcgtg ccattatacc 2220 ccaaatggga gtggaggtat tactgatctc caacataggg cgcaaagttt tgaaggtaat 2280 cagctgacat agggtttcga gggctcgaaa tgtgcatagt ccagaattct catgtatagg 2340 tttaaagcag tcaagtaatt gattatacat atgtaacgtg agaattgaga aatgaacatc 2400 2400 <210> 4 <211> 11752 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PMDC32 vector <400> 4 aattcagtaa catagatgac accgcgcgcg ataatttatc ctagtttgcg cgctatattt 60 tgttttctat cgcgtattaa atgtataatt gcgggactct aatcataaaa acccatctca 120 taaataacgt catgcattac atgttaatta ttacatgctt aacgtaattc aacagaaatt 180 atatgataat catcgcaaga ccggcaacag gattcaatct taagaaactt tattgccaaa 240 tgtttgaacg atcggggaaa ttcgagctcc accgcggtgg gcggccgctc tagaactagt 300 taattaagga attatcgaac cactttgtac aagaaagctg aacgagaaac gtaaaatgat 360 ataaatatca atatattaaa ttagattttg cataaaaaac agactacata atactgtaaa 420 acacaacata tccagtcact atggtcgacc tgcagactgg ctgtgtataa gggagcctga 480 catttatatt ccccagaaca tcaggttaat ggcgtttttg atgtcatttt cgcggtggct 540 gagatcagcc acttcttccc cgataacgga gaccggcaca ctggccatat cggtggtcat 600 catgcgccag ctttcatccc cgatatgcac caccgggtaa agttcacggg agactttatc 660 tgacagcaga cgtgcactgg ccagggggat caccatccgt cgcccgggcg tgtcaataat 720 atcactctgt acatccacaa acagacgata acggctctct cttttatagg tgtaaacctt 780 aaactgcatt tcaccagtcc ctgttctcgt cagcaaaaga gccgttcatt tcaataaacc 840 gggcgacctc agccatccct tcctgatttt ccgctttcca gcgttcggca cgcagacgac 900 gggcttcatt ctgcatggtt gtgcttacca gaccggagat attgacatca tatatgcctt 960 gagcaactga tagctgtcgc tgtcaactgt cactgtaata cgctgcttca tagcacacct 1020 ctttttgaca tacttcgggt atacatatca gtatatattc ttataccgca aaaatcagcg 1080 cgcaaatacg catactgtta tctggctttt agtaagccgg atcctctaga ttacgccccg 1140 ccctgccact catcgcagta ctgttgtaat tcattaagca ttctgccgac atggaagcca 1200 tcacagacgg catgatgaac ctgaatcgcc agcggcatca gcaccttgtc gccttgcgta 1260 taatatttgc ccatggtgaa aacgggggcg aagaagttgt ccatattggc cacgtttaaa 1320 tcaaaactgg tgaaactcac ccagggattg gctgagacga aaaacatatt ctcaataaac 1380 cctttaggga aataggccag gttttcaccg taacacgcca catcttgcga atatatgtgt 1440 agaaactgcc ggaaatcgtc gtggtattca ctccagagcg atgaaaacgt ttcagtttgc 1500 tcatggaaaa cggtgtaaca agggtgaaca ctatcccata tcaccagctc accgtctttc 1560 attgccatac ggaattccgg atgagcattc atcaggcggg caagaatgtg aataaaggcc 1620 ggataaaact tgtgcttatt tttctttacg gtctttaaaa aggccgtaat atccagctga 1680 acggtctggt tataggtaca ttgagcaact gactgaaatg cctcaaaatg ttctttacga 1740 tgccattggg atatatcaac ggtggtatat ccagtgattt ttttctccat tttagcttcc 1800 ttagctcctg aaaatctcgc cggatcctaa ctcaaaatcc acacattata cgagccggaa 1860 gcataaagtg taaagcctgg ggtgcctaat gcggccgcca tagtgactgg atatgttgtg 1920 ttttacagta ttatgtagtc tgttttttat gcaaaatcta atttaatata ttgatattta 1980 tatcatttta cgtttctcgt tcagcttttt tgtacaaact tgtttgatag cttggcgcgc 2040 ctcgaggggg ggcccggtac ccggggatcc tctagagtcg aggtcctctc caaatgaaat 2100 gaacttcctt atatagagga agggtcttgc gaaggatagt gggattgtgc gtcatccctt 2160 acgtcagtgg agatatcaca tcaatccact tgctttgaag acgtggttgg aacgtcttct 2220 ttttccacga tgctcctcgt gggtgggggt ccatctttgg gaccactgtc ggcagaggca 2280 tcttcaacga tggcctttcc tttatcgcaa tgatggcatt tgtaggagcc accttccttt 2340 tccactatct tcacaataaa gtgacagata gctgggcaat ggaatccgag gaggtttccg 2400 gatattaccc tttgttgaaa agtctcaatt gccctttggt cttctgagac tgtatctttg 2460 atatttttgg agtagacaag tgtgtcgtgc tccaccatgt tatcacatca atccacttgc 2520 tttgaagacg tggttggaac gtcttctttt tccacgatgc tcctcgtggg tgggggtcca 2580 tctttgggac cactgtcggc agaggcatct tcaacgatgg cctttccttt atcgcaatga 2640 tggcatttgt aggagccacc ttccttttcc actatcttca caataaagtg acagatagct 2700 gggcaatgga atccgaggag gtttccggat attacccttt gttgaaaagt ctcaattgcc 2760 ctttggtctt ctgagactgt atctttgata tttttggagt agacaagtgt gtcgtgctcc 2820 accatgttga cctgcaggca cgccaagctt ggcactggcc gtcgttttac aacgtcgtga 2880 ctgggaaaac cctggcgtta cccaacttaa tcgccttgca gcacatcccc ctttcgccag 2940 ctggcgtaat agcgaagagg cccgcaccga tcgcccttcc caacagttgc gcagcctgaa 3000 tggcgaatgc tagagcagct tgagcttgga tcagattgtc gtttcccgcc ttcagtttaa 3060 actatcagtg tttgacagga tatattggcg ggtaaaccta agagaaaaga gcgtttatta 3120 gaataacgga tatttaaaag ggcgtgaaaa ggtttatccg ttcgtccatt tgtatgtgca 3180 tgccaaccac agggttcccc tcgggatcaa agtactttga tccaacccct ccgctgctat 3240 agtgcagtcg gcttctgacg ttcagtgcag ccgtcttctg aaaacgacat gtcgcacaag 3300 tcctaagtta cgcgacaggc tgccgccctg cccttttcct ggcgttttct tgtcgcgtgt 3360 tttagtcgca taaagtagaa tacttgcgac tagaaccgga gacattacgc catgaacaag 3420 agcgccgccg ctggcctgct gggctatgcc cgcgtcagca ccgacgacca ggacttgacc 3480 aaccaacggg ccgaactgca cgcggccggc tgcaccaagc tgttttccga gaagatcacc 3540 ggcaccaggc gcgaccgccc ggagctggcc aggatgcttg accacctacg ccctggcgac 3600 gttgtgacag tgaccaggct agaccgcctg gcccgcagca cccgcgacct actggacatt 3660 gccgagcgca tccaggaggc cggcgcgggc ctgcgtagcc tggcagagcc gtgggccgac 3720 accaccacgc cggccggccg catggtgttg accgtgttcg ccggcattgc cgagttcgag 3780 cgttccctaa tcatcgaccg cacccggagc gggcgcgagg ccgccaaggc ccgaggcgtg 3840 aagtttggcc cccgccctac cctcaccccg gcacagatcg cgcacgcccg cgagctgatc 3900 gaccaggaag gccgcaccgt gaaagaggcg gctgcactgc ttggcgtgca tcgctcgacc 3960 ctgtaccgcg cacttgagcg cagcgaggaa gtgacgccca ccgaggccag gcggcgcggt 4020 gccttccgtg aggacgcatt gaccgaggcc gacgccctgg cggccgccga gaatgaacgc 4080 caagaggaac aagcatgaaa ccgcaccagg acggccagga cgaaccgttt ttcattaccg 4140 aagagatcga ggcggagatg atcgcggccg ggtacgtgtt cgagccgccc gcgcacgtct 4200 caaccgtgcg gctgcatgaa atcctggccg gtttgtctga tgccaagctg gcggcctggc 4260 cggccagctt ggccgctgaa 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cctggcagac acgccagcca tgaagcgggt caactttcag 5160 ttgccggcgg aggatcacac caagctgaag atgtacgcgg tacgccaagg caagaccatt 5220 accgagctgc tatctgaata catcgcgcag ctaccagagt aaatgagcaa atgaataaat 5280 gagtagatga attttagcgg ctaaaggagg cggcatggaa aatcaagaac aaccaggcac 5340 cgacgccgtg gaatgcccca tgtgtggagg aacgggcggt tggccaggcg taagcggctg 5400 ggttgtctgc cggccctgca atggcactgg aacccccaag cccgaggaat cggcgtgacg 5460 gtcgcaaacc atccggcccg gtacaaatcg gcgcggcgct gggtgatgac ctggtggaga 5520 agttgaaggc cgcgcaggcc gcccagcggc aacgcatcga ggcagaagca cgccccggtg 5580 aatcgtggca agcggccgct gatcgaatcc gcaaagaatc ccggcaaccg ccggcagccg 5640 gtgcgccgtc gattaggaag ccgcccaagg gcgacgagca accagatttt ttcgttccga 5700 tgctctatga cgtgggcacc cgcgatagtc gcagcatcat ggacgtggcc gttttccgtc 5760 tgtcgaagcg tgaccgacga gctggcgagg tgatccgcta cgagcttcca gacgggcacg 5820 tagaggtttc cgcagggccg gccggcatgg ccagtgtgtg ggattacgac ctggtactga 5880 tggcggtttc ccatctaacc gaatccatga accgataccg ggaagggaag ggagacaagc 5940 ccggccgcgt gttccgtcca cacgttgcgg acgtactcaa gttctgccgg cgagccgatg 6000 gcggaaagca gaaagacgac ctggtagaaa cctgcattcg gttaaacacc acgcacgttg 6060 ccatgcagcg tacgaagaag gccaagaacg gccgcctggt gacggtatcc gagggtgaag 6120 ccttgattag ccgctacaag atcgtaaaga gcgaaaccgg gcggccggag tacatcgaga 6180 tcgagctagc tgattggatg taccgcgaga tcacagaagg caagaacccg gacgtgctga 6240 cggttcaccc cgattacttt ttgatcgatc ccggcatcgg ccgttttctc taccgcctgg 6300 cacgccgcgc cgcaggcaag gcagaagcca gatggttgtt caagacgatc tacgaacgca 6360 gtggcagcgc cggagagttc aagaagttct gtttcaccgt gcgcaagctg atcgggtcaa 6420 atgacctgcc ggagtacgat ttgaaggagg aggcggggca ggctggcccg atcctagtca 6480 tgcgctaccg caacctgatc gagggcgaag catccgccgg ttcctaatgt acggagcaga 6540 tgctagggca aattgcccta gcaggggaaa aaggtcgaaa aggtctcttt cctgtggata 6600 gcacgtacat tgggaaccca aagccgtaca ttgggaaccg gaacccgtac attgggaacc 6660 caaagccgta cattgggaac cggtcacaca tgtaagtgac tgatataaaa gagaaaaaag 6720 gcgatttttc cgcctaaaac tctttaaaac ttattaaaac tcttaaaacc cgcctggcct 6780 gtgcataact gtctggccag 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gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg 7680 tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct 7740 gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac 7800 tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt 7860 tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc 7920 tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca 7980 ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat 8040 ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac 8100 gttaagggat tttggtcatg cattctaggt actaaaacaa ttcatccagt aaaatataat 8160 attttatttt ctcccaatca ggcttgatcc ccagtaagtc aaaaaatagc tcgacatact 8220 gttcttcccc gatatcctcc ctgatcgacc ggacgcagaa ggcaatgtca taccacttgt 8280 ccgccctgcc gcttctccca agatcaataa agccacttac tttgccatct ttcacaaaga 8340 tgttgctgtc tcccaggtcg ccgtgggaaa agacaagttc ctcttcgggc ttttccgtct 8400 ttaaaaaatc atacagctcg cgcggatctt taaatggagt gtcttcttcc cagttttcgc 8460 aatccacatc ggccagatcg ttattcagta agtaatccaa ttcggctaag cggctgtcta 8520 agctattcgt atagggacaa tccgatatgt cgatggagtg aaagagcctg atgcactccg 8580 catacagctc gataatcttt tcagggcttt gttcatcttc atactcttcc gagcaaagga 8640 cgccatcggc ctcactcatg agcagattgc tccagccatc atgccgttca aagtgcagga 8700 cctttggaac aggcagcttt ccttccagcc atagcatcat gtccttttcc cgttccacat 8760 cataggtggt ccctttatac cggctgtccg tcatttttaa atataggttt tcattttctc 8820 ccaccagctt atatacctta gcaggagaca ttccttccgt atcttttacg cagcggtatt 8880 tttcgatcag ttttttcaat tccggtgata ttctcatttt agccatttat tatttccttc 8940 ctcttttcta cagtatttaa agatacccca agaagctaat tataacaaga cgaactccaa 9000 ttcactgttc cttgcattct aaaaccttaa ataccagaaa acagcttttt caaagttgtt 9060 ttcaaagttg gcgtataaca tagtatcgac ggagccgatt ttgaaaccgc ggtgatcaca 9120 ggcagcaacg ctctgtcatc gttacaatca acatgctacc ctccgcgaga tcatccgtgt 9180 ttcaaacccg gcagcttagt tgccgttctt ccgaatagca tcggtaacat gagcaaagtc 9240 tgccgcctta caacggctct cccgctgacg ccgtcccgga ctgatgggct gcctgtatcg 9300 agtggtgatt ttgtgccgag ctgccggtcg gggagctgtt ggctggctgg tggcaggata 9360 tattgtggtg taaacaaatt gacgcttaga caacttaata acacattgcg gacgttttta 9420 atgtactgaa ttaacgccga attaattcgg gggatctgga ttttagtact ggattttggt 9480 tttaggaatt agaaatttta ttgatagaag tattttacaa atacaaatac atactaaggg 9540 tttcttatat gctcaacaca tgagcgaaac cctataggaa ccctaattcc cttatctggg 9600 aactactcac acattattat ggagaaactc gagcttgtcg atcgacagat ccggtcggca 9660 tctactctat ttctttgccc tcggacgagt gctggggcgt cggtttccac tatcggcgag 9720 tacttctaca cagccatcgg tccagacggc cgcgcttctg cgggcgattt gtgtacgccc 9780 gacagtcccg gctccggatc ggacgattgc gtcgcatcga ccctgcgccc aagctgcatc 9840 atcgaaattg ccgtcaacca agctctgata gagttggtca agaccaatgc ggagcatata 9900 cgcccggagt cgtggcgatc ctgcaagctc cggatgcctc cgctcgaagt agcgcgtctg 9960 ctgctccata caagccaacc acggcctcca gaagaagatg ttggcgacct cgtattggga 10020 atccccgaac atcgcctcgc tccagtcaat gaccgctgtt atgcggccat tgtccgtcag 10080 gacattgttg gagccgaaat ccgcgtgcac gaggtgccgg acttcggggc agtcctcggc 10140 ccaaagcatc agctcatcga gagcctgcgc gacggacgca ctgacggtgt cgtccatcac 10200 agtttgccag tgatacacat ggggatcagc aatcgcgcat atgaaatcac gccatgtagt 10260 gtattgaccg attccttgcg gtccgaatgg gccgaacccg ctcgtctggc taagatcggc 10320 cgcagcgatc gcatccatag cctccgcgac cggttgtaga acagcgggca gttcggtttc 10380 aggcaggtct tgcaacgtga caccctgtgc acggcgggag atgcaatagg tcaggctctc 10440 gctaaactcc ccaatgtcaa gcacttccgg aatcgggagc gcggccgatg caaagtgccg 10500 ataaacataa cgatctttgt agaaaccatc ggcgcagcta tttacccgca ggacatatcc 10560 acgccctcct acatcgaagc tgaaagcacg agattcttcg ccctccgaga gctgcatcag 10620 gtcggagacg ctgtcgaact tttcgatcag aaacttctcg acagacgtcg cggtgagttc 10680 aggctttttc atatctcatt gccccccggg atctgcgaaa gctcgagaga gatagatttg 10740 tagagagaga ctggtgattt cagcgtgtcc tctccaaatg aaatgaactt ccttatatag 10800 aggaaggtct tgcgaaggat agtgggattg tgcgtcatcc cttacgtcag tggagatatc 10860 acatcaatcc acttgctttg aagacgtggt tggaacgtct tctttttcca cgatgctcct 10920 cgtgggtggg ggtccatctt tgggaccact gtcggcagag gcatcttgaa cgatagcctt 10980 tcctttatcg 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promoter sequence <400> 5 ctgaacccca gtcctcgtta agtatgggtt agtgctggca gtgtgttgcc ctagcctgag 60 gtctctgata tggcaacttg tcgcgtgatc agtgatcgtc tctgtctagc tgacatctct 120 cctggatgaa atcaatccaa aaaaaaagaa ggctttgatc agatagatta gggttcacac 180 ttcacaactc tgacgtttca acgcagcgcg aaagcaaatt ctgttggaat ttttgaatcg 240 tttcagaatt tttcaaattt gaattgaaaa tttatgaaga atattttaaa aataacttgt 300 aaatagtcct acatttgtag taaatacatg catatgaaat gtcaaaaaat ataggcgtag 360 aatgaaaatg ctctttggac aacaactgaa ttggtaaatt gaaaaaagac atctagaagg 420 gtttacaata tgtgttgatt gtgtatgcac tttatattat ggactttgta ttgttgttat 480 actatgttgt ttatgcactt tacagtatgt attgattgtg ggtgtacttt gtattgtgtt 540 gatgtacttt atattatgcg tgttgatgtt aatggcgtaa catatatttg gttatgcata 600 tttaattgtc aatgatatgg acttcaaatt atcttgtatt tgtgttcatg aatatacatt 660 gcgcttattc tcaatgtgag gttgtcaaat tgtaggaaag gtcatgctga atttctttat 720 taatttctta cattttccca cgtttccacg gtttccccat tttgatatcc ttttagtttg 780 caatgttcct atcatctcca tgaattttct catatttcaa acattttccc ctattatcca 840 aatattcaga aaacacaatt aattcccacg ctactctttg gcttttcagc aaatccaatg 900 agttttagat gcttttgttt ggtttccaaa acactggaac ggtggtttcc tgttcgaatc 960 aactgaaatc ctggtagttc cggttggaat tcggtgattt tgatcatttt tcattgacgg 1020 gcaaatggaa cttgagaatt tggcttctta attttgtttg aaatttgacg gttttcgtga 1080 aaaccgttat actgacaggg tcaggagcgg gacctcgatt ggaaatataa acccttgcct 1140 gtaatacggt acagccgtac agaattcgtg tggtggccac gggctcacgc accgggtcag 1200 tgatagcatc cagtggccaa tttggccatg gagatgatgc attttttaca cggagaatga 1260 tcccagaaac acgcatgatc ttctcttaca agaattttct aacagaacat ccatttcacc 1320 acacccactt gttcaatgca gcgctgtttt gtaacccaca taacaaccgg acccagcacg 1380 tctgaaacta aggttactca tcggttacct aaattaaagt actccctccg tattgtattt 1440 taatgtatgg tgccgttgac tttttttatc aatatttgac tattcgtttt attcaaattt 1500 tttgtgataa tgtgaaaata tttatgtcat gcttaaaaaa catttgatga tggatcaagt 1560 cacaataaaa taaacgataa ttacataaac tttgtgaata agacgaatga tcaaacgtta 1620 gataaaaagt caacagcgtc atatattaaa atatgaaggt agtagtaatt tacagagatg 1680 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Claims

모세포 또는 야생형에 비하여, 종피색을 더 노란색으로 변하게 하는 것, 배의 색을 더 검은색으로 변하게 하는 것, 배를 치사시켜 생존성을 상실하게 하는 것, 또는 이들의 조합을 유발시키는 유전적 변형을 포함하는 돌연변이 벼 식물체.
청구항 1에 있어서, 상기 유전적 변형은 서열번호 1의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 황색 배 치사(yellow embryo lethal: YEL) 단백질의 기능을 감소시키는 유전적 변형, 또는 LOC_OsO2g53140 유전자가 결실 또는 파괴된 것인 돌연변이 벼 식물체.
청구항 2에 있어서, 상기 유전적 변형은 서열번호 1의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 YEL 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 감소시키는 것인 돌연변이 벼 식물체.
청구항 2에 있어서, 상기 유전적 변형은 서열번호 1의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 YEL 단백질을 코딩하는 유전자를 불활성화 또는 파괴시키는 것인 돌연변이 벼 식물체.
청구항 2에 있어서, 상기 유전적 변형은 서열번호 1의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 YEL 단백질에서 1번 내지 114번까지의 아미노산 서열에 해당하는 RING-finger 도메인을 코딩하는 영역을 불활성화 또는 파괴시키는 것인 돌연변이 벼 식물체.
청구항 1에 있어서, 상기 유전적 변형은 LOC_OsO2g53140 유전자인 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열 중 246번부터 951번까지의 706 뉴클레오티드 영역이 결실된 것인 돌연변이 벼 식물체.
청구항 1에 있어서, 상기 유전적 변형은 이형접합성(heterozygous) 또는 동형접합성(homozygous)인 것인 돌연변이 벼 식물체.
청구항 1에 있어서, 상기 유전적 변형은 종자에서 노란색 종피색 및 배 치사에 대하여 열성 표현형질(recessive phenotype)을 보이는 것인 돌연변이 벼 식물체.
청구항 1에 있어서, 기탁번호 KCTC 18500P로 기탁된 것인 돌연변이 벼 식물체.
청구항 1에 있어서, 종자, 미강(rice bran), 배(embryo) 또는 배유(endosperm)인 것인 돌연변이 벼 식물체.
청구항 1에 있어서, 상기 유전적 변형을 포함하지 않는 야생형 식물체에 비하여 Isoorientin-2"-O-glucoside, Isoorientin, Apigenin　2"-O-glucosyl-8-C-glucoside, Isovitexin, Chrysoeriol　2"-O-glucosyl-C-glucoside, Isoscoparin, 또는 이들의 조합을 증가된 양으로 포함하는 것인 돌연변이 벼 식물체.
청구항 1 내지 11 중 어느 한 항의 돌연변이 벼 식물체로부터 플라보노이드 화합물을 분리하는 단계;를 포함하는, 돌연변이 벼 식물체로부터 플라보노이드 화합물을 분리하는 방법으로서, 상기 플라보노이드 화합물은 Isoorientin-2"-O-glucoside, Isoorientin, Apigenin　2"-O-glucosyl-8-C-glucoside, Isovitexin, Chrysoeriol　2"-O-glucosyl-C-glucoside, Isoscoparin, 또는 이들의 조합인 것인 방법.
청구항 12에 있어서, 상기 돌연변이 벼 식물체는 전체 종자, 미강, 배, 또는 배유인 것인 방법.
청구항 12에 있어서, 상기 돌연변이 벼 식물체는 상기 유전적 변형에 대하여 이형접합성(heterozygous) 또는 동형접합성(homozygous)인 것인 방법.
청구항 12에 있어서, 상기 분리하는 단계 전에 이형접합성 돌연변이 벼 식물체를 성장시켜 종자를 생산하는 단계; 및 생산된 종자로부터 상기 유전적 변형에 대하여 동형접합성(homozygous)인 것을 분리하는 단계;를 더 포함하는 것인 방법.
청구항 12에 있어서, 플라보노이드 화합물을 분리하는 단계는 동형접합성 종자, 미강, 배, 배유, 또는 이들의 조합으로부터 분리하는 단계인 것인 방법.
청구항 15에 있어서, 동형접합성(homozygous)인 것을 분리하는 단계는 종자의 종피의 노란색과 배의 검은 색에 근거하여 종자를 분리하는 것인 방법.
서열번호 1의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 황색 배 치사(yellow embryo lethal: YEL) 단백질.
서열번호 1의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 황색 배 치사(yellow embryo lethal: YEL) 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
벼 세포에 대하여 모세포 또는 야생형에 비하여, 종피색을 더 노란색으로 변하게 하는 것, 배의 색을 더 검은색으로 변하게 하는 것, 배를 치사시켜 생존성을 상실하게 하는 것, 또는 이들의 조합을 유발시키는 유전적 변형을 도입시키는 단계를 포함하는 증가된 플라보노이드 화합물 함량을 갖는 돌연변이 벼 식물체를 제조하는 방법.