CN106536737B - 非生物胁迫下具有改良的农学性状的植物以及涉及非生物胁迫耐性基因的相关构建体和方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了分离的多核苷酸和多肽，和赋予植物提高的氮利用效率和/或耐旱性的重组DNA构建体，包含这些重组DNA构建体的组合物如植物或种子，以及利用这些重组DNA构建体的方法。这些重组DNA构建体包含一个多核苷酸和与其可操作连接的一个植物中有功能的启动子，其中所述多核苷酸编码非生物胁迫耐性多肽。

Description

非生物胁迫下具有改良的农学性状的植物以及涉及非生物胁 迫耐性基因的相关构建体和方法

技术领域

本发明涉及植物育种和遗传学，特别是，涉及用于提高植物氮素利用效率和/或低氮耐性的，和/或耐旱性的重组DNA构建体。

背景技术

生物和非生物原因可以对植物产生胁迫，例如造成生物胁迫的原因包括病原菌感染、昆虫取食、一种植物对另一种植物的寄生，例如槲寄生；非生物胁迫包括诸如有效水分的过量或者不足、有效氮素的过量或不足、极限温度和诸如除草剂的合成化学药品。

干旱、高盐和营养元素缺乏等非生物胁迫严重影响植物的生长和生产力，包括作物，这大大限制了世界范围内作物的产量。总之，这些因素预计将导致农业生产平均减产70％。植物固着于地面，必须调整以适应周围的环境条件，这就导致了植物发育中基因调控、形态建成和新陈代谢的巨大可塑性。植物的适应和防御策略包括激活编码重要蛋白的基因，这些蛋白可以使植物适应或防御不同胁迫条件。

氮素的吸收在植物生长发育的过程中发挥着重要的作用(Gallais等(2004)，J.Exp.Bot. 55(396)：295-306)，植物吸收环境中的无机氮合成氨基酸，因此施用氮肥成为提高栽培作物(如玉米、水稻和大豆)产量强有力的方法。在植物最佳生长发育阶段，植物可利用氮素的缺失就成为了非生物胁迫。现在，为了避免硝酸盐对环境的污染，同时保持足够的利润，农民希望减少氮肥的使用。如果一个植物品种增加了氮的同化能力，它也将有望增加生长和产量。因此，具有较好氮利用效率的植物新品种是可取的。

激活标签可以用于鉴定影响植物性状的基因，这一方法已经用于模式植物拟南芥的研究中(Weigel，D.等(2000)Plant Physiol.122：1003-1013)。转录增强子元件的插入主要激活和/或提高邻近内源基因的表达，因此该方法可以用于鉴定特定性状如植物氮素利用效率的基因，当将基因转入植物中，可以改变该性状。

发明概述

本发明包括以下具体实施方案：

一个实施方案中，包括一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸过量表达时能够提高植物的氮胁迫耐性，包括(a)一种多核苷酸，基于Clustal V法比对，其核苷酸序列与SEQ IDNO： 4、7、10或13的序列一致性至少为85％；(b)一种多核苷酸，基于Clustal V法比对，其核苷酸序列与SEQ ID NO：5、8、11或14的序列一致性至少为85％；(c)一种多核苷酸，基于Clustal V法比对，其编码多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：6、9、12或15的序列一致性至少为90％；或(d)核苷酸序列(a)、(b)或(c)的全长互补序列，其中过量表达所述多核苷酸能够提高植物的氮胁迫耐性。所述核苷酸序列包括SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14。所述多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO： 15。

另一个实施方案中，包括一种重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包括一个分离的多核苷酸和与其可操作的连接至少一个调控序列，其中所述多核苷酸包括(a)一种多核苷酸，基于Clustal V法比对，其核苷酸序列与SEQ ID NO：4、5、7、8、10、11、13或14的序列一致性至少为85％；(b)一种多核苷酸，基于Clustal V法比对，其编码多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：6、9、12或15的序列一致性至少为90％；或者(c)核苷酸序列(a)或(b) 的全长互补序列，所述至少一个调控序列是植物中有功能的启动子。

第三个实施方案中，包括一种转基因的植物或种子，所述植物或种子包括一个重组DNA 构建体，所述重组DNA构建体包括一个多核苷酸和与其可操作的连接至少一个调控序列，其中所述多核苷酸包括(a)一种多核苷酸，基于Clustal V法比对，其核苷酸序列与SEQ ID NO： 4、5、7、8、10、11、13或14的序列一致性至少为85％；(b)一种多核苷酸序列，基于Clustal V法比对，其编码的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：6、9、12或15的序列一致性至少为90％；或(c)核苷酸序列(a)或(b)的全长互补序列，所述至少一个调控序列是植物中有功能的启动子。

另一个实施例中，包括一种转基因植物，所述转基因植物在其基因组中包括一个重组DNA 构建体，所述重组DNA构建体包括一个多核苷酸和与其可操作的连接至少一个调控序列，其中所述多核苷酸序列包括(a)一种多核苷酸，基于Clustal V法比对，其核苷酸序列与SEQ ID NO：4、5、7、8、10、11、13或14的序列一致性至少为85％；(b)一种多核苷酸，基于Clustal V法比对，其编码的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：6、9、12或15的序列一致性至少为90％；或(c)核苷酸序列(a)或(b)的全长互补序列，其中，与对照植物相比，所述转基因植物显示提高的氮素利用效率(NUE)。

另一个实施方案中，包括一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸过量表达时能够提高植物的耐旱性，包括(a)一种多核苷酸，基于Clustal V法比对，其核苷酸序列与SEQ IDNO： 10的序列一致性至少为85％；(b)一种多核苷酸，基于Clustal V法比对，其核苷酸序列与SEQ ID NO：11的序列一致性至少为85％；(c)一种多核苷酸，基于Clustal V法比对，其编码多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：12的序列一致性至少为90％；或(d)核苷酸序列(a)、(b)或(c)的全长互补序列，其中过量表达所述多核苷酸能够提高植物的耐旱性。所述核苷酸序列包括SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11；所述多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO：12。

另一个实施方案中，包括一种重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包括一个分离的多核苷酸和与其可操作的连接至少一个调控序列，其中所述多核苷酸包括(a)一种多核苷酸，基于Clustal V法比对，其核苷酸序列与SEQ ID NO：10或11的序列一致性至少为85％；(b) 一种多核苷酸，基于Clustal V法比对，其编码多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：12的序列一致性至少为90％；或者(c)核苷酸序列(a)或(b)的全长互补序列，所述至少一个调控序列是植物中有功能的启动子。

另一实施方案中，包括一种转基因的植物或种子，所述植物或种子包括一个重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包括一个多核苷酸和与其可操作的连接至少一个调控序列，其中所述多核苷酸包括(a)一种多核苷酸，基于Clustal V法比对，其核苷酸序列与SEQID NO： 10或11的序列一致性至少为85％；(b)一种多核苷酸序列，基于Clustal V法比对，其编码的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：12的序列一致性至少为90％；或(c)核苷酸序列(a) 或(b)的全长互补序列，所述至少一个调控序列是植物中有功能的启动子。

另一个实施例中，包括一种转基因植物，所述转基因植物在其基因组中包括一个重组DNA 构建体，所述重组DNA构建体包括一个多核苷酸和与其可操作的连接至少一个调控序列，其中所述多核苷酸序列包括(a)一种多核苷酸，基于Clustal V法比对，其核苷酸序列与SEQ ID NO：10或11的序列一致性至少为85％；(b)一种多核苷酸，基于Clustal V法比对，其编码的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：12的序列一致性至少为90％；或(c)核苷酸序列(a) 或(b)的全长互补序列，其中，与对照植物相比，所述转基因植物显示提高的耐旱性。

进一步的实施方案，包括任一公开的植物，所述植物选自水稻、玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、小麦、苜蓿、棉花、大麦、粟、甘蔗或柳枝稷。

另一实施方案中，公开了提高植物氮素胁迫耐性或NUE的方法，所述方法包括：(a)将重组DNA构建体转入可再生植物细胞，所述重组DNA构建体包括一个多核苷酸和与其可操作连接的至少一个调控序列，其中所述多核苷酸编码的多肽的氨基酸能序列与SEQ ID NO：6、 9、12或15相比，基于Clustal V法比对，具有至少50％的序列一致性；(b)步骤(a)后由可再生植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因在其基因组中含有重组DNA构建体；和(c)获得步骤(b)转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中含有重组DNA构建体；与不含有重组DNA构建体的对照植物相比，所述子代植物显示出提高的氮素胁迫耐性或NUE。

另一实施方案中，公开了评估植物氮素胁迫耐性或NUE的方法，所述方法包括：(a)将重组DNA构建体转入可再生植物细胞，所述重组DNA构建体包括一个多核苷酸和与其可操作连接的至少一个调控序列，其中所述多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：6、9、 12或15相比，基于Clustal V法比对，具有至少50％的序列一致性；(b)步骤(a)后由可再生植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中含有重组DNA构建体；(c)获得转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中含有重组DNA构建体；和(d)与不含有重组DNA构建体的对照植物相比，评估所述子代植物的氮素胁迫耐性或NUE。

另一实施方案中，公开了确定植物农艺性状改变的方法，包括：(a)将重组DNA构建体转入可再生植物细胞，所述重组DNA构建体包括一个多核苷酸和与其可操作连接的至少一个调控序列，其中所述多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：6、9、12或15相比，基于Clustal V法比对，具有至少50％的序列一致性；(b)步骤(a)后由可再生植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中含有重组DNA构建体；(c)获得转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中含有重组DNA构建体；和(d)与不含有重组DNA构建体的对照植物相比，确定所述子代植物是否表现出至少一种农艺性状的变化，其中所述步骤(d)包括在氮素限制条件下，与不含有重组DNA构建体的对照植物相比，确定转基因植物是否表现出至少一个农艺性状的变化。

在另一实施方案中，公开了提高植物耐旱性的方法，所述方法包括：(a)将重组DNA构建体转入可再生植物细胞，所述重组DNA构建体包括一个多核苷酸和与其可操作连接的至少一个调控序列，其中所述多核苷酸编码的多肽的氨基酸能序列与SEQ ID NO：12相比，基于 Clustal V法比对，具有至少50％的序列一致性；(b)步骤(a)后由可再生植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中含有重组DNA构建体；和(c)获得步骤(b)转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中含有重组DNA构建体；与不含有重组DNA构建体的对照植物相比，所述子代植物显示出提高的耐旱性能。

在另一实施方案中，公开了评估植物耐旱性的方法，所述方法包括的步骤为：(a)将重组DNA构建体转入可再生植物细胞，所述重组DNA构建体包括一个多核苷酸和与其可操作连接的至少一个调控序列，其中所述多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：12相比，基于Clustal V法比对，具有至少50％的序列一致性；(b)步骤(a)后由可再生植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中含有重组DNA构建体；(c)获得转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中含有重组DNA构建体；和(d)与不含有重组DNA构建体的对照植物相比，评估所述子代植物的耐旱性能。

在另一个实施方案中，本发明涉及重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含本发明任一分离的多核苷酸和与其可操作连接至少一个调控序列；以及含有所述重组DNA构建体的细胞、植物或种子。所述细胞可以是真核细胞，如酵母、昆虫或植物细胞；也可以是原核细胞，诸如细菌细胞。

附图说明

根据以下发明详述和附图，可以更全面的理解本发明，以下发明详述和附图形成本发明的一部分。

图1.为实时PCR分析不同转基因水稻株系叶片中OsLRP1基因相对表达量。DP0044.29中OsLRP1基因表达量设置为1.00，图中表达量柱上的数值为与DP0044.29水稻相比的倍数变化， DP0005为转化空载体的中花11水稻植株。

图2.为实时PCR分析不同转基因水稻株系叶片中OsDN-LTP1基因的相对表达量。ZH11-TC 植株中OsDN-LTP1基因的相对表达量设置为1.00，图中表达量柱上的数值为与ZH11-TC水稻相比的倍数变化。

图3.OsDN-LTP1转基因水稻干旱测试不同发育阶段的土壤体积含水量变化。OsDN-LTP1 转基因水稻在断水后37天开始抽穗。

表格说明

表1.序列表中核苷酸和氨基酸序列的编号

表2.水稻基因名称、基因ID(TIGR)和构建体的ID

表3.克隆水稻非生物胁迫耐性基因的引物

表4.克隆非生物胁迫耐性基因的PCR反应混合液

表5.非生物胁迫耐性基因PCR循环状况

表6.水稻培养的改良Hoagland营养液

表7.温室低氮条件下OsLRP1转基因水稻的低氮试验(第一次试验)

表8.温室低氮条件下OsLRP1转基因水稻的低氮试验(第二次试验，ZH11-TC作为对照)

表9.温室低氮条件下OsLRP1转基因水稻的低氮试验(第二次试验，DP0158作为对照)

表10.温室低氮条件下OsDN-LTP1转基因水稻的低氮试验(第一次试验)

表11.温室低氮条件下OsDN-LTP1转基因水稻的低氮试验(第二次试验，ZH11-TC作为对照)

表12.温室低氮条件下OsDN-LTP1转基因水稻的低氮试验(第二次试验，DP0158作为对照)

表13.温室低氮条件下OsDN-LTP1转基因水稻的低氮试验(第三次试验，ZH11-TC作为对照)

表14.温室低氮条件下OsDN-LTP1转基因水稻的低氮试验(第二次试验，DP0158作为对照)

表15.OsDN-PPR1转基因水稻幼苗的氯酸盐敏感性试验(第一次试验，转基因株系水平)

表16.OsDN-PPR1转基因水稻幼苗的氯酸盐敏感性试验(第二次试验，转基因株系水平)

表17.OsDN-LTP1转基因水稻幼苗的氯酸盐敏感性试验(第一次试验，转基因株系水平)

表18.OsDN-LTP1转基因水稻幼苗的氯酸盐敏感性试验(第二次试验，转基因株系水平)

表19.OsRRM1转基因水稻幼苗的氯酸盐敏感性试验(第一次试验，转基因株系水平)

表20.OsRRM1转基因水稻幼苗的氯酸盐敏感性试验(第二次试验，转基因株系水平)

表21.OsLRP1转基因水稻在田间低氮条件下的籽粒产量分析

表22.OsLRP1转基因水稻在田间正常氮条件下的籽粒产量分析

表23.OsLRP1转基因水稻在田间低氮条件下的生物量分析

表24.OsLRP1转基因水稻在田间低氮条件下的植株高度分析

表25.OsLRP1转基因水稻在田间正常氮条件下的植株高度分析

表26.OsRRM1转基因水稻在田间低氮条件下的籽粒产量分析

表27.OsRRM1转基因水稻在田间正常氮条件下的籽粒产量分析

表28.OsRRM1转基因水稻在田间低氮条件下旗叶SPAD值分析

表29.OsRRM1转基因水稻在田间低氮条件下倒二叶SPAD值分析

表30.OsDN-LTP1转基因水稻的百草枯耐性试验(第一次试验，转基因株系水平)

表31.OsDN-LTP1转基因水稻的百草枯耐性试验(第二次试验，转基因株系水平)

表32.OsDN-LTP1转基因水稻在田间干旱条件下籽粒产量分析

表33.拟南芥培养用的改良的Hoagland营养液

表34.过量表达OsDN-PPR1基因的转基因拟南芥在低氮条件下连续4天的叶面积和叶色的P值

表35.过量表达OsRRM1基因的转基因拟南芥在低氮条件下连续4天的叶面积和叶色的P 值

表1.序列表中核苷酸和氨基酸序列的编号

此处的序列描述和序列表遵守37C.F.R.§1.821-1.825中列出的专利申请的核苷酸和 /或氨基酸序列披露管理规则，序列表包含核苷酸序列字符的单字母码以及氨基酸的三字母码，如遵照IUPAC-IUBMB标准所定义的，该标准在Nucleic Acids Res.13：3021-3030(1985) 以及在Biochemical J.219(No.2)：345-373(1984)中有所描述，这两篇文献以引用的方式并入本发明。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循37C.F.R.§1.822中列出的规则。

SEQ ID NO：1为DP0005载体的核苷酸序列。

SEQ ID NO：2.为pBC-yellow载体的核苷酸序列。

SEQ ID NO：3.为DsRed表达盒的核苷酸序列。

SEQ ID NO:4.为OsDN-PPR1基因cDNA的核苷酸序列。

SEQ ID NO：5.为OsDN-PPR1基因CDS的核苷酸序列。

SEQ ID NO：6.为OsDN-PPR1的氨基酸序列。

SEQ ID NO：7.为OsLRP1基因cDNA的核苷酸序列。

SEQ ID NO：8.为OsLRP1基因CDS的核苷酸序列。

SEQ ID NO：9.为OsLRP1的氨基酸序列。

SEQ ID NO：10.为OsDN-LTP1基因gDNA的核苷酸序列。

SEQ ID NO：11.为OsDN-LTP1基因CDS的核苷酸序列。

SEQ ID NO：12.为OsDN-LTP1的氨基酸序列。

SEQ ID NO：13.为OsRRM1基因cDNA的核苷酸序列。

SEQ ID NO：14.为OsRRM1基因CDS的核苷酸序列。

SEQ ID NO：15.为OsRRM1的氨基酸序列。

SEQ ID NO：16.为克隆OsDN-PPR1基因cDNA的正向引物。

SEQ ID NO：17.为克隆OsDN-PPR1基因cDNA的反向引物。

SEQ ID NO：18.为克隆OsLRP1基因cDNA的正向引物。

SEQ ID NO：19.为克隆OsLRP1基因cDNA的反向引物。

SEQ ID NO：20.为克隆OsDN-LTP1基因gDNA的正向引物。

SEQ ID NO：21.为克隆OsDN-LTP1基因gDNA的反向引物。

SEQ ID NO：22.为克隆OsRRM1基因cDNA的正向引物。

SEQ ID NO：23.为克隆OsRRM1基因cDNA的反向引物。

SEQ ID NO：24.为OsLRP1基因实时PCR分析的正向引物。

SEQ ID NO：25.为OsLRP1基因实时PCR分析的反向引物。

SEQ ID NO：26.为OsDN-LTP1基因实时PCR分析的正向引物。

SEQ ID NO：27.为OsDN-LTP1基因实时PCR分析的反向引物。

详细描述

本发明中所列出的每篇参考文献的公开内容的全文均以引用的方式并入本发明。

如本发明所用的并在所附权利要求书中的单数形式“一个”和“所述”包括复数涵义，除非上下文中清楚地另有指明。因此，例如，“一株植物”的涵义包括多株该类植物。“一个细胞”的涵义包括一个或多个细胞及其本领域的技术人员已知的等同物，等等。

如本发明所述：

术语“OsDN-PPR1”是三角状五肽重复蛋白(Pentatricopeptide Repeat)，指水稻基因位点LOC_Os11g10740.1编码的，赋予植物低氮耐性表型的水稻多肽。“DN-PPR1多肽”此处指OsDN-PPR1多肽和其它植物中的同源物。

OsDN-PPR1多肽(SEQ ID NO：6)是水稻基因位点LOC_Os11g10740.1的编码序列(CDS) (SEQ ID NO：5)或核苷酸序列(SEQ ID NO：4)编码的氨基酸序列。该多肽具有四个三角状五肽重复(PPR重复)结构域，在TIGR(rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)中注释为“三角状四肽-类似螺旋，推测”，在NCBI(ncbi.nlm.nih.gov/)中注释为“含有三角状四肽-类似螺旋结构域的蛋白/三角状五肽，推测”，但是没有在先的功能注释。

术语“OsLRP1”是富含亮氨酸重复(Leucine Rich Repeat)”，指水稻基因位点LOC_Os11g10720.1编码的，赋予植物低氮耐性表型的水稻多肽。“LRP1多肽”此处指OsLRP1多肽和其它植物的同源物。

OsLRP1多肽(SEQ ID NO：9)是水稻基因位点LOC_Os11g10720.1的编码序列(CDS)(SEQ ID NO：8)或核苷酸序列(SEQ ID NO：7)编码的氨基酸序列。该多肽在TIGR中注释为“Cf2/Cf5 抗病性蛋白，推测”，在NCBI中注释为“富含亮氨酸重复的家族蛋白”，但没有在先的功能介绍。

术语“OsDN-LTP1”是低氮耐性蛋白(Low nitrogen Tolerance Protein)，指赋予植物低氮耐性表型的水稻多肽，“DN-LTP1多肽”此处指OsDN-LTP1多肽和其它植物中的同源物。 OsDN-LTP1多肽(SEQ ID NO：12)是编码序列(CDS)(SEQ ID NO：11)或核苷酸序列(SEQID NO：10)编码的氨基酸序列。

术语“OsRRM1”是RNA识别基序(RNA Recognition Motif)，指水稻基因位点 LOC_Os06g50890.1编码的，赋予植物低氮耐性表型的水稻多肽。“RRM1多肽”此处指OsRRM1 多肽和其它植物的同源物。

OsRRM1多肽(SEQ ID NO：15)是水稻基因位点LOC_Os06g50890.1的编码序列(CDS)(SEQ ID NO：14)或核苷酸序列(SEQ ID NO：13)编码的氨基酸序列。该多肽在TIGR中注释为“含有RNA识别基序的蛋白，表达”，在NCBI中“假定变压器-SR核蛋白”，但没有在先的功能介绍。

本发明中的单子叶植物包括禾本科的植物；双子叶植物包括十字花科、豆科和茄科的植物。

“全长互补序列”是指给定核苷酸序列的互补序列，互补序列和核苷酸序列含有相同的核苷酸数，并且100％的互补。

“表达序列标签”(EST)是从cDNA文库中获得的DNA序列，代表已经转录的序列。EST通常通过cDNA插入序列单程测序获取。将完整的cDNA插入序列称为“全长插入序列”(“FIS”)。“重叠群”序列是由选自但不限于EST、FIS和PCR序列的两个或更多个序列装配成的序列。将编码完整或功能性蛋白的序列称为“完全基因序列”(“CGS”)，该序列可得自FIS或重叠群。

“性状”指植物或特定植物材料或细胞的生理的、形态的、生化的或物理的特征。在一些实施例中，这些特征可以是肉眼可见的，比如种子、植株的大小等；可用生物化学技术测定的指标，如种子或叶片中蛋白、淀粉或油份的含量等；可观察的代谢或生理过程，如测定对水分胁迫、特定盐、糖或氮浓度的耐性；可检测的基因表达水平；或可观察渗透胁迫的耐性或产量等农艺性状。

“农艺性状”是可测量的指标参数，包括但不限于：叶片绿色、籽粒产量、生长速率、总生物量或积累速率、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、植物总氮含量、果实氮含量、种子氮含量、植物营养组织氮含量、植物总游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、植物营养组织游离氨基酸含量、植物总蛋白含量、果实蛋白含量、种子蛋白含量、植物营养组织蛋白质含量、耐旱性、氮的吸收、根的倒伏、收获指数、茎的倒伏、株高、穗高、穗长、耐盐性、分蘖数、圆锥花序的大小、早期苗的活力和低温胁迫下的出苗状况。

“收获指数”指籽粒重量除以总植株重量。

可以测量增加的生物量，例如与对照植物相比，增加的植物高度、植物总叶面积、植物鲜重、植物干重或植物种子产量等。

增加植株生物量或大小的能力具有多种重要商业应用，作物栽培品种可用于产生较高植物营养组织部分，用于食品、饲料、纤维和/或生物燃料。

人们对叶片大小的增加特别有兴趣。增加的叶片的生物量可用于增加植物源药或工业产品的生产。

增加的分蘖数可以增加产量，增加植物叶片面积可提高植物总的光合作用，增加的光合合成能力可以增加特定植物组织的产量，并使植物在低光强或高光强下生长，所述特定植物组织包括叶片、根、果实或种子。

其它组织如根的生物量的改变有利于提高植物在严酷条件下生长的能力，所述严酷条件包括营养贫瘠、水分缺失，因为大量的根系可以更好地吸收水分和营养。

“环境条件”指植物生长的条件，诸如可利用水分、可利用营养物(例如氮素)、或存在的昆虫或病害。

“氮素限制条件”指可利用总氮量(例如，硝酸盐、氨或其它可知氮源)不足以维持植物的最佳生长发育的条件，本领域的技术人员应当知道维持植物最佳生长发育的可利用总氮量的条件，本领域的技术人员应当知道什么组成了足够的可利用总氮量，什么组成了土壤、介质和施入的肥料为植物提供氮素。氮素限制条件取决于多种因素，包括但不限于特定的植物和环境条件。

术语“氮素胁迫耐性”、“低氮耐性”和“氮素缺乏耐性”此处可互换使用，指植物的一种性状，即植物在氮素限制条件或低氮条件下存活的能力。

一个多肽“增加的氮胁迫耐性”是指与参照或对照相比，在转基因植物中过表达该多肽能增加转基因植物的氮胁迫耐受性。

植物“增加的氮胁迫耐性”是与参照或对照相比后衡量的，反映了植物在氮限制条件下存活和/或生长更好的能力；与参照或对照植物相比，氮胁迫耐性的植物增加的数量可以是任何数量。

“植物氮胁迫耐性”是植物表现为氮素胁迫耐受性。一个氮胁迫耐性的植物可能表现为与对照植物相比在氮素限制条件下提高至少一种农艺性状。

“NUE”是氮素利用效率，具体指植物在低肥料或高肥料水平下利用氮素的能力。它反映了植物吸收、同化和/或其它氮素利用的能力。

土壤植物分析发展(SPAD)值是SPAD-502plus叶绿素仪(KONICA MINOLTA生产)测定的SPAD读数。SPAD值是叶片叶绿素相对含量，是植物健康的一个重要指标。许多研究表明，叶片氮素含量与SPAD值成正相关性(Swain D.K.和Sandip S.J.(2010)Journal ofAgronomy 9(2)：38-44)，叶片SPAD值可用于作物中氮素状况的分析指标(Cai H.-G.et al.(2010) Acta metallurgica sinica 16(4)：866-873)。

水稻对于低氮胁迫响应和耐受是一个综合和全面的生理生化过程。植物的耐受性将在植物发育的不同阶段和不同胁迫条件下以不同的方式反映。环境因子，例如光照和温度是影响水稻生长的关键因素，环境因子的变化将影响水稻的生长发育。研究证明对水稻植株低氮处理可观察到叶片中叶绿素含量降低，分蘖数减少，或生物量减少。我们在试验中测量了叶片颜色(反映叶绿素含量，SPAD值)、植物鲜重和分蘖数，通过这三个参数综合选择耐低氮植物。

“氯酸盐”指含有氯酸根阴离子的化合物，是一种氯酸盐化合物。它是一种硝酸盐类似物，植物通过与硝酸盐同一个转运系统吸收，通过硝酸盐还原酶将氯酸盐还原成亚氯酸盐，亚氯酸盐是有毒的，能够导致植物损伤、枯萎或死亡。本发明中将氯酸钾用于试验。

“氯酸盐敏感性”是一种植物性状，反映了氯酸盐溶液处理后，与参照或对照植物相比，植物吸收、转运或还原氯酸盐后造成的损伤甚至死亡情况。

植物“增加的氯酸盐敏感性”是相对于参照或对照植物测定的，反映了氯酸盐或硝酸盐溶液中，与参照或对照植物相比，较高的吸收、转运或同化氯酸盐或硝酸盐的能力。通常，氯酸盐的敏感性可用作NUE的指标，植物对氯酸盐越敏感，氮素利用效率越高。

“氯酸盐敏感幼苗”指整株表型萎蔫，没有绿色叶片的损伤的植株，可认为是氯酸盐溶液处理后死亡的植株。

“干旱”指植物可用水分的减少，特别是较长时间的缺水或者在植物重要的生长阶段发生，会造成植物损伤，或阻止植物的生长(限制植物的生长，降低籽粒的产量)。

“耐旱性”指干旱胁迫下能够存活并且没有实质性的生理或物理改变的能力，和/或一段时间干旱后复水能够恢复的能力。

多肽的“耐旱能力”表示与参照或对照植物相比，过表达该多肽可以提高转基因植物的耐旱性能。

植物“增强的耐旱性”是与参照或对照植物相比测定的，反映了植物在干旱胁迫下存活的能力，并且与参照或对照相比，具有较小的生理或物理损伤，或者干旱胁迫后复水时，恢复较快的能力。

“百草枯”(1,1-二甲基-4,4-联吡啶二氯化物)是一类叶面喷施的非选择性的吡啶除草剂，能够引起光氧化胁迫，并进一步造成植物的损害或者阻止植物的正常生长。

“百草枯耐性”是植物的一种性状，反映了百草枯溶液处理后，与参照或对照植物相比，植物的存活或生长良好的能力。

植物“增加的百草枯耐性”是相对于参照或对照植物测定的，反映了植物在百草枯溶液处理后，与参照或对照植物相比，能够存活并具有较小的生理或物理伤害的能力。通常，针对较低浓度的百草枯溶液的耐性用作诸如干旱胁迫的非生物胁迫耐性的一种指标。

“氧化胁迫”反映了活性氧分子的生成和生物系统清除活性氧中间体或修复损伤的能力之间的不平衡。扰乱细胞正常的氧化还原状态会导致产生过氧化氢和自由基的毒性效应，过氧化氢和自由基能够损害包括蛋白、脂质和DNA在内的细胞组成部件。

“转基因的”指其基因组因异源核酸(如重组DNA构建体)的存在而发生改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，包括那些最初的转基因事件以及从最初的转基因事件通过有性杂交或无性生殖而产生的那些。如本发明所用的术语“转基因”不涵盖通过常规植物育种方法或通过诸如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变之类的自然发生事件导致的基因组(染色体基因组或染色体外基因组)改变。

“对照”、“对照植物”或“对照植物细胞”为测定受测试植物或植物细胞的表型变化提供参考，由于转化，受测植物或植物细胞的基因组改变影响到目的基因，测试的植物或植物细胞可以是上述改变并含有上述改变的植物或植物细胞的子代。

对照植物或对照植物细胞包括，例如：(a)用于基因改变产生受测植物或细胞的相同基因型并用作起始材料的野生型植物或细胞；(b)相同基因组作为起始材料但是转入空载体(如带有标记基因的并对目标的性状没有影响的载体)的植物或植物细胞；(c)转基因植物或植物细胞性状分离，获得的非转基因的子代植物或植物细胞；(d)没有暴露于可以诱导基因表达的条件或刺激下的，与转基因植物或植物细胞基因组相同的植物或植物细胞；(e)特定的目标基因不表达情况下的，转基因植物或者植物细胞本身。

本发明中，ZH11-TC、株系空白(line null)和空载体植株指对照植物。ZH11-TC表示通过组织培养中花11获得的水稻植株，line null代表分离的阴性空白植株，空载体植株表示转化空载体DP0005或DP0158获得水稻植株。

“基因组”在用于植物细胞时不仅涵盖存在于细胞核中的染色体DNA，而且还包括存在于细胞的亚细胞组分(如线粒体、质粒)中的细胞器DNA。

“植物”包括整个植株、植物器官、植物组织、种子和植物细胞以及同一植株的子代。植物细胞包括但不限于得自下列物质的细胞：种子、悬浮培养物、胚、分生区域、愈伤组织、叶、根、芽、配子体、孢子体、花粉和小孢子。

“转基因的植物”包括在其基因组内包含异源多核苷酸的植物。例如异源多核苷酸能够稳定地整合进基因组中，且多聚核苷酸能够遗传到后续世代。异源多核苷酸可单独地或作为重组DNA构建体的部分整合进基因组中。T₀植物直接源于转化和再生过程，T₀植物的子代为 T₁代(第一个子代)，T₂代(第二个子代)等。

针对序列而言的“异源”意指来自外来物种的序列，或者如果来自相同物种，则指通过蓄意的人为干预而从其天然形式发生了组成和/或基因座的显著改变的序列。

“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸片段”可互换使用并且是任选含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基的单链或双链RNA或DNA聚合物。核苷酸(通常以它们的5′-单磷酸形式存在)通过如下它们的单个字母名称来指代：“A”为腺苷酸或脱氧腺苷酸(分别对应RNA或DNA)，“C”表示胞苷酸或脱氧胞苷酸，“G”表示鸟苷酸或脱氧鸟苷酸，“U”表示尿苷酸，“T”表示脱氧胸苷酸，“R”表示嘌呤(A或G)，“Y”表示嘧啶(C或T)，“K”表示G或T，“H”表示A或C或T，“I”表示肌苷，并且“N”表示任何核苷酸。

“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”在本发明中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。术语“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”还可包括修饰形式，包括但不限于糖基化、脂质连接、硫酸盐化、谷氨酸残基的γ羧化、羟化和ADP-核糖基化。

“信使RNA(mRNA)”指无内含子并且可通过细胞翻译成蛋白质的RNA。

“cDNA”指与mRNA模板互补并且利用逆转录酶从mRNA模板合成的DNA。cDNA可为单链的或者可用DNA聚合成酶I的Klenow片段合成双链形式。

“成熟”蛋白质指经翻译后加工的多肽；即已经去除了存在于初级翻译产物中的任何前肽或原肽的多肽。

“前体”蛋白质指mRNA的翻译初级产物；即带有前肽和原肽的蛋白质。前肽和原肽可为并且不限于细胞内定位信号。

“分离的”指物质，例如核酸分子和/或蛋白质，该物质基本上不含在天然存在的环境中通常伴随该物质或与其反应的组分，或者说是该物质被从所述组分移出。分离的多核苷酸可从它们天然存在的宿主细胞中纯化。技术人员已知的常规核酸纯化方法可用于获得分离的多核苷酸。该术语也涵盖重组多核苷酸和化学合成的多核苷酸。

“重组体”指(例如)通过化学合成或者通过用基因工程技术操纵分离的核酸片段来实现的两个原本分离的序列片段的人工组合。“重组体”也包括指已经通过引入异源核酸而进行了修饰的细胞或载体，或源于经这样修饰的细胞的细胞，但不涵盖由天然发生的事件(如自发突变、自然转化/转导/转座)对细胞或载体的改变，例如没有蓄意人为干扰而发生的那些。

“重组DNA构建体”指在自然界中通常不会一起存在的核酸片段的组合。因此，重组DNA 构建体可包含源于不同来源的调控序列和编码序列，或源于相同来源但以不同于通常天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。

术语“入门克隆”和“入门载体”本发明可互换使用。

“调控序列”和“调控元件”可互换使用，指位于编码序列的上游(5'非编码序列)、中间或下游(3'非编码序列)，并且影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或者翻译的核苷酸序列。调控序列可包括但不限于启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。

“启动子”指能够控制另一核酸片段转录的核酸片段。

“植物中有功能启动子”是能够控制植物细胞中基因转录的启动子，无论其是否来源于植物细胞。

“组织特异性启动子”和“组织优选启动子”可互换使用，并且指主要但非必须专一地在一种组织或器官中表达，而且也可在一种特定细胞或细胞型中表达的启动子。

“发育调控启动子”指其活性由发育事件决定的启动子。

术语“可操作地连接”指核酸片段连接成单一片段，使得其中一个核酸片段的功能受到另一个核酸片段的调控。例如，在启动子能够调节核酸片段的转录时，该启动子与该核酸片段进行了可操作地连接。

“表达”指功能产物的产生。例如，核酸片段的表达可指核酸片段的转录(如转录生成 mRNA或功能RNA)和/或RNA翻译成前体或成熟蛋白质。

“表型”意指细胞或生物体的可检测的特征。

有关将核酸片段(例如重组DNA构建体)插入细胞内的“导入”是指“转染”或“转化”或“转导”，并且包括指将核酸片段整合进真核或原核细胞中，在该细胞中核酸片段可整合进细胞的基因组(如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)内，转变成自主的复制子或瞬时表达(如转染的mRNA)。

“转化细胞”是将核酸片段(如重组DNA构建体)导入其中的任何细胞。

本发明所用的“转化”指稳定转化和瞬时转化两者。

“稳定转化”指将核酸片段导入宿主生物体的基因组中，导致基因稳定遗传。一旦稳定转化，核酸片段稳定地整合进宿主生物体和任何连续世代的基因组中。

“瞬时转化”指将核酸片段导入宿主生物体的核中或包含DNA的细胞器中，引起基因表达而没有基因稳定遗传。

“等位基因”是占据染色体上给定位点的基因的几种供选择形式的其中一种。当二倍体植物中一对同源染色体上给定基因座上存在的等位基因相同时，该植物在该基因座处是纯合的。如果二倍体植物中一对同源染色体上给定基因座上存在的等位基因不同，则该植物在该基因座处是杂合的。如果转基因存在于二倍体植物中一对同源染色体中的其中之一上，则该植物在该基因座处是半合子的。

“叶绿体转运肽”是与蛋白协同翻译并将蛋白导向叶绿体或翻译蛋白的细胞中存在的其它质体类型的氨基酸序列。“叶绿体转运序列”指编码叶绿体转运肽的核苷酸序列。“信号肽”是一种与蛋白协同翻译并将蛋白导向分泌器官的氨基酸序列(Chrispeels， M.(1991)Ann.Rev.PlantPhys.Plant Mol.Biol.42：21-53)。如果将所述蛋白导向液泡，可另外加上液泡靶向信号，或者如果将所述蛋白导向内质网，可加上内质网驻留信号。如果将蛋白导向细胞核，将移除任何存在的信号肽并用以核定位信号替代(Raikhel(1992)PlantPhys.100：1627-1632)。“线粒体信号肽”是引导前体蛋白进入线粒体的氨基酸序列(Zhang和Glaser(2002)Trends Plant Sci 7：14-21)。

序列比对和身份百分比计算通过用于确定同源序列的各种比较方法确定，这些方法包括但不限于，

生物信息计算组件(

Inc.,Madison,WI)中的

程序。除另有说明，本发明中多序列比对均使用Clustal V比对方法(Higginsand Sharp，CABIOS.5：151-153(1989))，并设置为默认参数(间隙罚分＝10,间隙长度罚分＝10)。利用 Clustal V方法进行蛋白质双序列比对和身份百分比计算的默认参数为KTUPLE＝1，间隙罚分＝3，窗口＝5和对角线拯救＝5。若为核苷酸，则参数为KTUPLE＝2，间隙罚分＝5，窗口＝4和对角线拯救＝4。序列比对后，在Clustal V程序中查看“序列距离”表也可获得“一致性百分比”和“散值”；除另有说明，本发明中所用“相似度”和“分歧度”均由此方法获得。

本发明中使用的标准重组DNA和分子克隆技术为本领域技术人员熟知，并且在如下文献中有更全面的描述：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，MolecularCloning： ALaboratory Manual；Cold Spring HarborLaboratory Press：Cold SpringHarbor，1989 (下文称为“Sambrook”)。

现在转向实施方案：

实施方案包括分离的多核苷酸和多肽，提高氮素利用效率和/或增加耐旱性的重组DNA构建体，包含这些重组DNA构建的成分(如植物或种子)，及利用这些重组DNA构建体的方法。

分离的多核苷酸和多肽：

本发明包括如下分离的多核苷酸和多肽：

一种分离的多核苷酸，包括(i)一种核酸序列，其编码的多肽的氨基酸序列与SEQID NO： 6、9、12或15相比，基于Clustal V法比对，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、 69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、 83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％、99％或100％的序列一致性；或(ii)核酸序列(i)的全长互补序列，其中核酸序列(i)与全长互补序列具有相同数目的核苷酸，并且100％的互补。前述任一分离的多核苷酸可用于构建本发明的任一重组DNA构建体。所述多肽优选为DN-PPR1、LRP1、DN-LTP1 或RRM1。过量表达所述多肽可更好的提高植物的低氮耐性和/或耐旱性。

一种分离的多肽，所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：6、9、12或15相比，基于Clustal V法比对，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、 61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、 89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性。所述多肽优选为OsDN-PPR1、OsLRP1、OsDN-LTP1或OsRRM1多肽。

一种分离的多核苷酸，包括(i)一种核酸序列，其核苷酸序列与SEQ ID NO：4、5、7、8、10、11、13或14相比，基于Clustal V法比对，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、 69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、 83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％、99％或100％的序列一致性；或(ii)核酸序列(i)的全长互补序列。前述任一分离的多核苷酸可用于构建本发明任一重组DNA构建体。所述分离的多核苷酸优选编码 DN-PPR1、LRP1、DN-LTP1或RRM1多肽。过量表达所述多肽可更好的提高植物的低氮耐性和/ 或耐旱性。

重组DNA构建体：

一方面，本发明包括重组DNA构建体。

在一个实施方案中，一个重组DNA构建体包含一个多核苷酸和与其可操作连接的至少一个调控序列(如植物中有功能的启动子)，其中所述多核苷酸包括(i)一个核酸序列，其编码的氨基酸序列与SEQ ID NO：6、9、12或15相比，基于Clustal V法比对，具有至少50％、 51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、 79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性；或(ii)核酸序列(i) 的全长互补序列。

在另一个实施方案中，一个重组DNA构建体包含一个多核苷酸和与其可操作连接的至少一个调控序列(如植物中有功能的启动子)，其中，所述多核苷酸包括(i)一个核酸序列，其核苷酸序列与SEQ ID NO：4、5、7、8、10、11、13或14相比，基于Clustal V法比对，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、 62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、 76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、 90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性；或(ii)核苷酸序列(i)的全长互补序列。

在另一个实施方案中，一种重组DNA构建体包含一个多核苷酸和与其可操作连接的至少一个调控序列(如植物中用功能的启动子)，其中所述多核苷酸编码DN-PPR1、LRP1、DN-LTP1 或RRM1多肽，所述多肽优选为具有低氮耐性和/或耐旱性，并可来自，例如水稻(Oryza sativa)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、玉米(Zea mays)、大豆(Glycine max)、烟豆 (Glycine tabacina)、野大豆(Glycine soja)和短绒野大豆(Glycine tomentella)。

应当理解(正如本领域技术人员将会理解的)，本发明不仅仅涵盖这些具体的示例性序列。导致给定位点处产生化学上等价的氨基酸但不影响所编码多肽的功能特性的核酸片段中的改变是本领域众所周知的。例如，丙氨酸(一种疏水性氨基酸)的密码子可被编码另一个疏水性较弱的残基(例如甘氨酸)或疏水性较强的残基(例如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)的密码子取代。类似地，导致一个带负电荷的残基替换为另一个带负电荷的残基(例如，天冬氨酸替代谷氨酸)或者一个带正电荷的残基替换为另一个带正电荷的残基(例如，赖氨酸替换精氨酸)的改变也可预期产生功能上等价的产物。导致多肽分子的N-末端和C-末端部分改变的核苷酸变化也将预计不会改变多肽的活性。所提出的修饰中的每一种均完全在本领域常规技术内，如测定所编码的产物的生物活性的保留。

“抑制DNA构建体”是在转化或稳定整合进植物基因组时，导致该植物中的靶基因“沉默”的重组DNA构建体。对该植物来说，该靶基因可为内源性的基因或是转入的基因。如本文针对靶基因所使用的，“沉默”通常指在由靶基因表达的mRNA或蛋白质/酶的水平上的抑制，和/或在酶活性或蛋白质功能性的水平上的抑制。本文中可交换使用的术语“抑制”、“抑制性”以及“沉默”包括降低、减少、减退、减小、抑制、消除或防止。“沉默”或“基因沉默”不特指机理并且包括但不限于反义、共抑制、病毒-抑制、发夹抑制、茎-环抑制、基于RNAi的方法以及基于小RNAi的方法。

抑制DNA构建体可包含源自所关注的靶基因的区域并且可包含所关注的靶基因的有义链 (或反义链)的核酸序列的全部或部分。取决于所要利用的方法，所述区域可与所关注基因的有义链(或反义链)的全部或部分100％相同或者具有少于100％序列的一致性(如，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、 65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、 81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％或99％的一致性)。

抑制DNA构建体是本领域所熟知的，一旦选定所关注的靶基因就很容易构建，并且包括但不限于共抑制构建体、反义构建体、病毒-抑制构建体、发夹抑制构建体、茎-环抑制构建体、产生双链RNA的构建体，以及更通常的是，RNAi(RNA干扰)构建体和小RNA构建体，例如siRNA(短干扰RNA)构建体和miRNA(微RNA)构建体。

“反义抑制”指产生反义RNA转录物可以抑制靶基因或基因产物的表达。“反义RNA”指与靶初级转录物或mRNA的全部或部分互补，并阻断分离的靶核酸片段表达的RNA转录物(美国专利号5,107,065)。反义RNA可与特定基因转录物的任何部分，即5′非编码序列、3′非编码序列、内含子或编码序列互补。

“共抑制”指产生正义RNA转录物可以抑制目的基因或基因产物的表达；“正义”RNA涉及RNA转录物，包括在细胞内或者生物体外翻译成蛋白质的mRNA，过去，植物中的共抑制载体用于在正义方向过表达与天然mRNA同源的核酸序列，因此减少所有与过表达序列同源的所有RNA(Vaucheret等(1998)Plant J.16：651-659；和Gura.(2000)Nature 404：804-808)。

这也是使用植物病毒序列直接抑制近端mRNA编码序列的另一种描述方法(PCTPublication No.WO 98/36083发布于1998年8月20日)。

RNA干扰(RNAi)是指由短干扰性RNA(siRNA)介导的动物中序列特异性转录后基因沉默的过程(Fire等人，(1998)Nature 391：806)。在植物中的对应过程通常称为转录后基因沉默(PTGS)或RNA沉默，并且在真菌中也称为阻抑作用(quelling)。PTGS转录后基因沉默过程是用于防止外来基因表达的进化保守性细胞防御机制，并且通常由不同植物区系和门所共有(Fire等人，(1999)Trends Genet.15：358)。

小RNA在控制基因表达中起重要作用。很多发育过程(包括开花)的调节是由小RNA控制的。现在有可能通过使用在植物中产生小RNA的转基因构建体来以基因工程手段改变植物基因的表达。

小RNA是通过与互补RNA或DNA靶序列碱基配对来行使功能的。当与RNA结合时，小RNA 或者引发靶序列的RNA裂解或者引发翻译抑制。当与DNA靶序列结合时，小RNA可介导靶序列的DNA甲基化。无论具体机制是什么，这些事件的后果是基因表达受到抑制。

微RNA(miRNA)是长度为约19至约24个核苷酸(nt)的已经在动物和植物中鉴定出的非编码RNA(Lagos-Quintana等人，(2001)Science294：853-858；Lagos-Quintana等人，(2002)Curr.Biol.12：735-739；Lau等人，(2001)Science 294：858-862；Lee和Ambros，Science294：(2001)862-864；Llave等人，(2002)Plant Cell 14：1605-1619；Mourelatos等人，(2002)Genes.Dev.16：720-728；Park等人，(2002)Curr.Biol.12：1484-1495；Reinhart 等人，(2002)Genes.Dev.16：1616-1626)。它们是由大小为大约70至200nt较长的前体转录物加工生成的，并且这些前体转录物能够形成稳定的发夹结构。

微RNA(miRNA)通过与位于由这些基因产生的转录物中的互补序列结合来调节靶基因。 miRNA可进入至少两条靶基因调控途径：(1)翻译抑制；和(2)RNA裂解。进入RNA裂解途径的微RNA类似于在动物中的RNA干涉作用(RNAi)和植物中的转录后基因沉默(PTGS)期间生成的21-25nt的短干涉RNA(siRNA)，并且可能掺入了RNA诱导沉默复合物(RISC)，该复合物与RNAi相似或相同。

调控序列：

本发明的重组DNA构建体(包括抑制DNA构建体)包含至少一个调控序列。

调控序列可以是启动子。

多种启动子可用于本发明的重组DNA构建体，启动子根据期望的结果选择，可包括宿主生物体中表达的组成型、组织特异型、诱导型、或其它启动子。

一般将引起基因在多数细胞类型中在多数情况下表达的启动子称为“组成型启动子”。

当组成型启动子驱动候选基因表达时能够评估候选基因的效应，但候选基因在35S或UBI 启动子控制下的高水平、组成型表达可具有多重效应。使用组织特异和/或胁迫特异启动子可消除不需要的效应但保留提高植物耐旱性的能力。在拟南芥属中已经观察到了该效应(Kasuga 等人(1999)Nature Biotechnol.17：287-91)。

适用于植物宿主细胞的组成型启动子包括(例如)Rsyn7启动子的核心启动子和在WO 99/43838和美国专利6,072,050中公开的其它组成型启动子；CaMV 35S核心启动子(Odell 等人，(1985)Nature 313：810-812)；稻肌动蛋白(McElroy等人，(1990)Plant Cell2： 163-171)；泛素启动子(Christensen等人，(1989)Plant Mol.Biol.12：619-632和Christensen 等人，(1992)Plant Mol.Biol.18：675-689)；pEMU(Last等人，(1991)Theor.Appl.Genet.81： 581-588)；MAS(Velten等人，(1984)EMBO J.3：2723-2730)；ALS启动子(美国专利5,659,026) 等。其它组成型启动子包括例如在美国专利5,608,149、5,608,144、5,604,121、5,569,597、 5,466,785、5,399,680、5,268,463、5,608,142和6,177,611中公开的那些启动子。

在选择启动子用于本发明方法时，期望使用组织特异性启动子或发育调节启动子。

组织特异性启动子或发育调节启动子是这样的DNA序列，其调节DNA序列选择性地在对雄穗发育、结籽或两者重要的植物细胞/组织中表达，并限制这种DNA序列只在植物的雄穗发育或种子成熟期间表达。任何引起所需时空表达的可鉴定启动子均可用于本发明的方法中。

可用于本发明的种子或胚特异性启动子包括大豆Kunitz胰蛋白酶抑制剂(Kti3，Jofuku 和Goldberg，(1989)Plant Cell 1：1079-1093)，伴豌豆球蛋白、豌豆球蛋白和豆球蛋白 (豌豆子叶)(Rerie，W.G.等，(1991)Mol.Gen.Genet.259：149-157；Newbigin，E.J.等，(1990)Planta 180：461-470；Higgins，T.J.V.等，(1988)Plant.Mol.Biol.11：683-695)，玉米蛋白(玉米胚乳)(Schemthaner，J.P.等，(1988)EMBO J.7：1249-1255)，菜豆蛋白(菜豆子叶)(Segupta-Gopalan，C.等，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82：3320-3324)，植物血球凝集素(菜豆子叶)(Voelker，T.等，(1987)EMBO J.6：3571-3577)，B-伴球蛋白和大豆球蛋白(大豆子叶)(Chen，Z-L等，(1988)EMBOJ.7：297-302)，谷蛋白(稻胚乳)，大麦醇溶蛋白(大麦胚乳)(Marris，C.等，(1988)Plant Mol.Biol.10：359-366)，麦谷蛋白和麦醇溶蛋白(小麦胚乳)(Colot，V.等，(1987)EMBO J.6：3559-3564)。可操作地连接至嵌合基因构建体异源编码区的种子特异性基因的启动子在转基因植物中保持它们的时空表达模式。这样的实施例包括在拟南芥和甘蓝型油菜(Brassica napus)种子中表达脑啡肽的拟南芥属2S种子储藏蛋白基因启动子(Vanderkerckhove等，(1989)Bio/Technology 7： L929-932)，表达荧光素酶的菜豆凝集素和β-菜豆蛋白启动子(Riggs等，(1989)PlantSci.63： 47-57)，以及表达氯霉素乙酰转移酶的小麦谷蛋白启动子(Colot等，(1987)EMBOJ6： 3559-3564)。

诱导启动子响应内源性或外源性刺激的存在，例如，通过化合物(化学诱导剂)，或响应环境、激素、化学信号和/或发育信号而选择性表达可操纵连接的DNA序列。诱导启动子或受调控的启动子包括(例如)受光、热、胁迫、水涝或干旱、植物激素、创伤或诸如乙醇、茉莉酮酸酯、水杨酸或安全剂之类的化学品调控的启动子。

用于本发明的启动子包括以下启动子：1)胁迫诱导型RD29A启动子(Kasuga等，(1999) Nature Biotechnol.17：287-91)；2)大麦启动子B22E；B22E是发育中玉米籽粒中的柄所特异表达的启动子(“Primary Structure of a Novel Barley Gene DifferentiallyExpressed inImmature Aleurone Layers”(在未成熟糊粉层中差异表达的新大麦基因的一级结构) Klemsdal,S.S.等，(1991)Mol.Gen.Genet.228(1/2)：9-16)；和3)玉米启动子Zag2 (“Identification and molecularcharacterization of ZAG1，the maize homologof the Arabidopsis floralhomeotic gene AGAMOUS”，Schmidt，R.J.等(1993)PlantCell 5(7)： 729-737；“Structural characterization，chromosomal localizationandphylogenetic evaluation of two pairs of AGAMOUS-like MADS-boxgenes frommaize”，Theissen等(1995) Gene 156(2)：155-166；NCBI GenBank登录号X80206))。Zag2转录物可在授粉前5天至授粉后(DAP)7至8天被检测到，并且引导Ciml在发育中的雌花序的心皮中表达，Ciml是发育玉米籽粒的籽仁特异的启动子。Ciml转录物在授粉前4至5天至授粉后6至8天被检测到。其它可用的启动子包括可源自其表达与发育中的雌小花母系相关的基因的任何启动子。

对于在发育种子组织中表达的多聚核苷酸，特定的启动子包括种子优选的启动子，尤其是早期籽粒/胚启动子和晚期籽粒/胚启动子，授粉后籽粒的发育大致可以分为三个基本阶段，籽粒生长的停滞期起始于授粉后0天到10-12天，在此期间，籽粒不再明显的生长，但是决定籽粒活力的重要事件将在此期间发生(如细胞建成数目)。线性籽粒灌浆期起始于授粉后的 10-12天并延续到授粉后的40天左右，在此籽粒发育期间，籽粒达到最终的质量，并产生多种储藏物质如淀粉、蛋白质和油等；成熟期起始于授粉后大约40天到收获，在这一过程中，籽粒开始休眠，变干并为萌芽前的种子休眠做准备。本发明中的“早期籽粒/胚启动子”指主要在种子发育的停滞期(也就是授粉第0天到授粉后第12天期间)驱动基因表达的启动子；“后期籽粒/胚启动子”主要驱动基因在授粉后12天到成熟过程中的种子中基因表达；表达窗口可能会有一些重叠，将根据使用的ABA偶联的序列和期望的表型选择启动子。

早期籽粒/胚启动子包括，例如，Cim1，其在授粉后第5天活跃在特定组织中(WO00/11177)；其它的早期籽粒/胚启动子包括种子偏爱启动子end1，其在授粉后7-10天表达，和end2，其在授粉后9-14天在整个籽粒中表达，在授粉后10天在胚乳和果皮中表达(WO 00/12733)，此处以全文引用方式并入本文。本发明中的特定方法使用的其它早期籽粒/胚启动子包括种子偏爱启动子ltp2(美国专利号5,525,716)；玉米Zm40启动子(美国专利号 6,403,862)；玉米nuc1c(美国专利号6,407,315)；玉米ckx1-2启动子(美国专利号6,921,815和美国专利申请公开号2006/0037103)；玉米lec1启动子(美国专利号7,122,658)；玉米ESR启动子(美国专利号7,276,596)；玉米ZAP启动子(美国专利申请公开号20040025206和20070136891)；玉米启动子eep1(美国专利申请公开号20070169226)和玉米启动子ADF4(美国专利申请号60/963,878，2007年8月7日申请)。本发明中调控核酸序列在植物中表达的其它启动子是茎特异启动子，包括苜蓿S2A启动子(GenBank登录号EF030816；Abrahams等(1995)Plant Mol.Biol.27：513-528)和S2B启动子(GenBank登录号EF030817)和类似的启动子。

启动子可以整个源于天然基因，或者由源于不同的天然存在的启动子的不同元件组成，或者甚至包括合成的DNA片段。

用于本发明的启动子包括：RIP2、mLIP15、ZmCOR1、Rab17、CaMV 35S、RD29A、B22E、Zag2、SAM合成酶、泛素、CaMV19S、nos、Adh、蔗糖合成酶、R-等位基因、维管组织偏爱启动子S2A(Genbank登录号EF030816)和S2B(Genbank登录号EF030817)及来自玉米的组成型启动子GOS2。其它启动子还包括根偏爱启动子，例如玉米NAS2启动子、玉米Cyclo启动子(US2006/0156439，公开于2006年7月13日)、玉米ROOTMET2启动子(WO05063998，公开于2005年7月14日)、CRlBIO启动子(WO2006/055487，公开于2006年5月26日)、CRWAQ81 (WO2005/035770，公开于2005年4月21日)和玉米ZRP2.47启动子(NCBI登录号：U38790； NCBI GINo.1063664)。

本发明的重组DNA构建体(和抑制DNA构建体)也可包括其它调控序列，包括但不限于翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。在本发明的另一实施方案中，重组DNA构建体还包括增强子或沉默子。

内含子序列可加至5’非翻译区、蛋白编码区或3’非翻译区以增加积聚在胞浆中的成熟信息的量。已经显示，在植物和动物两者的表达构建体的转录单位中包含可剪接内含子可使基因表达在mRNA和蛋白质水平上均增强高达1000倍。参见Buchman和Berg，(1988)Mol.Cell Biol.8：4395-4405；Callis等，(1987)Genes Dev.1：1183-1200。

任何植物都可以选择用来鉴定用于本发明重组DNA构建体的调控序列和基因。适用于分离基因和调控序列的靶植物的实例应该包括但不限于苜蓿、苹果、杏、拟南芥、洋蓟、芝麻菜、芦笋、鳄梨、香蕉、大麦、豆类、甜菜、黑莓、蓝莓、西兰花、抱子甘蓝、卷心菜、加拿大油菜、香瓜、胡萝卜、木薯、蓖麻子、菜花、芹菜、樱桃、菊苣、芫荽、柑桔、克莱门氏小柑橘、三叶草、椰子、咖啡、玉米、棉、蔓越莓、黄瓜、花旗松、茄子、菊苣、茅菜、桉树、茴香、无花果、大蒜、葫芦、葡萄、柚子树、白兰瓜、豆薯、猕猴桃、生菜、韭葱、柠檬、酸橙、火炬松、亚麻子、芒果、甜瓜、蘑菇、油桃、坚果、燕麦、油棕、油菜、秋葵、橄榄树、洋葱、橙、观赏植物、棕榈、木瓜树、欧芹、欧洲防风草、豌豆、桃树、花生、梨树、胡椒、柿树、松树、菠萝、车前草、李树、石榴树、白杨、马铃薯、南瓜、温柏、辐射松、红菊苣、萝卜、油菜、树莓、稻、黑麦、高粱、南方松、大豆、菠菜、南瓜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甘薯、枫香树、柑橘、茶、烟草、蕃茄、黑小麦、草皮草、芜菁、葡萄树、西瓜、小麦、薯蓣和西葫芦。

组合物：

本发明的组合物是其基因组中包含本发明的任何重组DNA构建体(包括抑制DNA构建体，例如上面所讨论的任何一种构建体)的植物。组合物还包括所述植物的任何子代，以及获取自所述植物或其子代的任何种子，其中所述子代或种子在其基因组中包含重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)。所述子代包括植物通过自花授粉或异型杂交而获得的连续世代。子代也包括杂交种和自交系。

在杂交种子繁殖的农作物中，成熟的转基因植物可自花授粉而产生纯合的自交系植物。该自交系植物产生的种子含有新导入的重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)。这些种子可生长成植物，所述植物表现出改变的农学特性(如氮素限制条件下增加农业特性)，或者可用于育种方案以产生杂交种子，这些杂交种子可生长成植物，所述植物将会表现出上述改变的农学特性。所述种子可为玉米种子或水稻种子。

植物可为单子叶植物或双子叶植物，例如玉米或大豆植物，如玉米杂种植物或玉米自交系植物。植物还可为向日葵、高梁、油菜、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、粟。

重组DNA构建体可稳定地整合进植物的基因组中。

特定实施方案包括但不限于以下实施方案：

1.在其基因组中包含重组DNA构建体的植物，如水稻、玉米或大豆，所述重组DNA构建体包含一个多核苷酸和与其可操作连接至少一个调控序列，其中所述多核苷酸编码多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：6、9、12或15相比，基于Clastal V法比对，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、 66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、 80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性；与不包含重组DNA构建体的对照植物相比，所述植物表现出增加的氮素胁迫耐性和/或提高的耐旱性，且所述植物进一步表现出至少一个农艺性状的改变。

2.在其基因组中包含重组DNA构建体的植物，如水稻、玉米或大豆，所述重组DNA构建体包含一个多核苷酸和与其可操作连接至少一个调控序列，其中所述多核苷酸编码DN-PPR1、 LRP1、DN-LTP1或RRM1多肽，与不包含重组DNA构建体的对照植物相比，所述植物表现出增加的氮素胁迫耐性和/或提高的耐旱性，且所述植物进一步表现出至少一个农艺性状的改变。所述DN-PPR1、LRP1、DN-LTP1或RRM1多肽可能来自于拟南芥、玉米、大豆、烟豆、野大豆或短绒野大豆。

3.在其基因组中包含重组DNA构建体的植物，例如水稻、玉米或大豆，所述重组DNA构建体包含一个多核苷酸和与其可操作连接的至少一个调控序列，其中所述多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：6、9、12或15相比，基于Clastal V法比对，具有至少50％、 51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、 79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性；与不包含重组DNA构建体的对照植物相比，所述植物在氮素限制条件下表现出至少一个农艺性状的变化。

4.实施方案1-3所述的植物的任何子代植物，实施方案1-3所述的植物的任何种子，实施方案1-3所述的植物的任何子代植物的种子，和源于实施方案1-3的植物和其子代植物的细胞。

前述实施方案1-4或其它实施方案中，重组DNA构建体包含至少一个植物中有功能的启动子作为调控序列。

前述实施方案1-4或其它实施方案中，至少一种农艺性状的变化可以是增加也可以是减少。

前述实施方案1-4或其它实施方案中，至少一种农艺性状选自叶片绿色、籽粒产量、生长速率、生物量、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、植物总氮含量、果实氮含量、种子氮含量、植物营养组织氮含量、植物总游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、植物营养组织游离氨基酸含量、植物总蛋白含量、果实蛋白含量、种子蛋白含量、植物营养组织蛋白含量、耐旱性、氮吸收能力、根倒伏、收获指数、茎倒伏、株高、穗高、穗长、幼苗活力和低温胁迫下的出苗情况。例如，至少一个农艺性状的改变可以是籽粒产量、叶色、植株高度或生物量的增加。

前述实施方案1-4或其它实施方案中，与不包含重组DNA构建体的对照植物相比，所述植物在氮素限制条件下表现出至少一个农艺性状的变化。

前述实施方案1-4或其它实施方案中，与不包含重组DNA构建体的对照植物相比，所述植物在干旱胁迫条件下表现出至少一个农艺性状的变化。

本领域的技术人员熟悉模拟限制或者不限制氮素条件的方案，用于评价在模拟的或天然发生的限制或不限制氮素条件下测试的植物。例如可以通过一段时间内给植物提供比正常需要较少的氮素或不提供氮素来模拟低氮素条件，并通过寻找农艺性状的差别(例如生理和/ 或物理状的变化)评价这些植物，所述农艺性状包括但不限于活力、生长、大小或根的长度，尤其是叶色或叶面积的大小。评价这些植物的其它技术包括测定叶绿素荧光、光合速率、根生长或气体交换速率。

下述实施例描述了模拟氮限制条件和/或在此条件下评价植物的代表性技术方法，还描述了模拟干旱条件和/或评价植物耐旱性的代表性技术方法；以及模拟的氧化条件。

本领域的技术人员也可以测试模拟或者自然发生的低氮或高氮条件下的植物保持足够产量(至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、 90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或者100％的产量)的能力评估氮胁迫耐性，例如，低氮或高氮条件下产生与正常条件下相比实质相当的产量；与对照或参照植物相比，低氮或高氮条件下产量减少较少。

田间和温室条件下，可通过叶绿素仪测量低氮或高氮条件下的SPAD值。SPAD值是植株健康状态的一个参数，通过预测叶绿素含量反映植株氮素含量。与对照或参照植物相比，具有较高的低氮耐受性的植株的SPAD值更高。

本领域的技术人员也可以测试模拟或者自然发生的干旱条件下的植物保持足够产量(至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或者100％的产量)的能力评估耐旱性，例如，干旱条件下产生与非干旱条件下相比实质相当的产量；与对照或参照植物相比，干旱条件下产量减少较少。

本发明中涉及的参数包括与对照细胞或对照植物相比的恢复度、存活率、百草枯耐性率、基因表达水平、水分利用效率、编码蛋白的水平或活性和其它参数。“对照”、“对照植物”或“对照植物细胞”为测定受测试植物或植物细胞的表型变化提供参考，由于转化，受测植物或植物细胞的基因组改变影响到关注的基因，测试的植物或植物细胞可以是转基因植物或转基因植物细胞的子代，并含有上述的基因的改变。

本领域技术人员很容易找到适当的对照或参照植物，当采用本发明描述的组合物或方法评估或测定转基因植物一个农艺性状或表型时。例如，但不限于下述举例：

1.转化植物的子代，所述转化植物对于重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)来说是半合子的，所述子代分离成包含或不包含该DNA构建体(或抑制DNA构建体)植株：包含该重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)的子代将通常相对于不包含该重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)的子代来进行测量(即，不包含该重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)的子代是对照或参照植物)。

2.重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)基因渗入至近交系中，例如在玉米中，或基因渗入进变种中，例如在大豆中：基因渗入品系将通常相对于亲本近交系或变种品系进行测量 (即，亲本近交系或品种品系是对照或参照植物)。

3.双杂交系，其中第一杂交系由两个亲本近交系产生，而第二杂交系由相同的两个亲本近交系产生，不同的是其中一个亲本近交系含有重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)：第二杂交系通常将相对于第一杂交系进行测量(即第一杂交系为对照植物或参照植物)。

4.包含重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)的植物：该植株可以相对于这样的对照植物进行评价或测量，该对照植物不包含重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)，但具有与该植株相当的遗传背景(例如，与包含重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)的植株相比较，该核遗传物质具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性)。存在许多可用于分析、比较和表征植物遗传背景的实验室的技术；其中这些技术是同工酶电泳、限制性片段长度多态性(RFLPs)、随机扩增多态性DNA(RAPDs)、任何引物聚合成酶链式反应(AP-PCR)、DNA扩增指纹(DAF)、序列特异扩增区域(SCARs)、扩增片段长度多态性

和也称为微卫星的简单序列重复(SSRs)。

另，本领域技术人员很容易想到，通过诱变或转换，选用一个不包含先前选定的植物的适合的对照或参照植物，用于评估或测量转基因植物的农艺性状或表型，得到期望的农艺性状或表型。

方法：

方法包括但不限于：提高植物氮素胁迫耐性的方法，评价植物氮素胁迫耐性的方法，提高植物氯酸盐敏感性的方法，提高植物耐旱性的方法，评估植物耐旱性的方法，提高植物百草枯耐受性的方法，改变植物农艺性状的方法，确定植物农艺性状变化的方法，和生产种子的方法。植物可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，例如水稻、玉米、拟南芥或大豆，植物也可以是向日葵、高粱、油菜、小麦、苜蓿、棉花、大麦或粟；种子是水稻、玉米、拟南芥或大豆种子，例如玉米杂交种子或玉米自交种子。

方法包括但不限于：

转化细胞的方法包括用本发明的任何分离的多核苷酸转化细胞。也包括通过这种方法转化的细胞。在具体实施方案中，所述细胞是真核细胞，例如酵母、昆虫或植物细胞，或原核细胞例如细菌细胞。

产生转基因植物的方法包括转化将本发明公开的任意分离的核苷酸或重组DNA构建体转化植物细胞和由转化的植物细胞再生转基因植物，其中本方法获得转基因植物和转基因种子可用于本发明的其它方法。

用于从细胞或细胞培养基中分离本发明多肽的方法，其中所述细胞包含具有本发明多核苷酸的重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含本发明的多核苷酸可操作地连接到至少一种调控序列，并且其中转化的宿主细胞在适于重组DNA构建体表达的条件下生长。

改变宿主细胞中本发明多肽表达水平的方法，包括：(a)用本发明的重组DNA构建体转化宿主细胞；以及(b)在适于表达所述重组DNA构建体的条件下使转化的细胞生长，其中重组DNA构建体的表达导致转化的宿主细胞中的本发明多肽含量改变。

增强植物氮胁迫耐受性和/或氯酸盐敏感性的方法，包括(a)将重组DNA构建体导入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含一个多核苷酸和与其可操作地连接至少一种调控序列(例如在植物中有功能的启动子)，其中所述多核苷酸编码多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：6、9、12或15进行比较时，基于Clustal V法比对，具有至少50％、51％、52％、 53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、 81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性；和(b)在步骤(a)之后，由所述可再生的植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体，并且与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时，表现出增强的氮胁迫耐受性和/或氯酸盐敏感性。所述方法还可包括(c)获得来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含重组DNA构建体，并且与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出增强的氮胁迫耐受性和/或氯酸盐敏感性。

评价植物氮胁迫耐受性和/或氯酸盐敏感性的方法，包括(a)将重组DNA构建体导入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含一个多核苷酸和与其可操作地连接的至少一种调控序列(例如在植物中有功能的启动子)，其中所述多核苷酸编码多肽的氨基酸序列在与SEQ ID NO：6、9、12或15进行比较时，基于Clustal V法比对，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、 66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、 80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性；和(b)在步骤(a)之后，由所述可再生的植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组 DNA构建体；和(c)与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时，评价转基因植物的氮胁迫耐受性和/或氯酸盐敏感性。所述方法还包括(d)获得来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含重组DNA构建体；(e)与不包含所述重组DNA 构建体的对照植物进行比较时，评价所述转基因植物的子代植物的氮胁迫耐受性和/或氯酸盐敏感性。

增强植物耐旱性和/或百草枯耐受性的方法，包括(a)将重组DNA构建体导入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含一个多核苷酸和与其可操作地连接的至少一种调控序列(例如在植物中有功能的启动子)，其中所述多核苷酸编码多肽的氨基酸序列在与SEQ ID NO：12进行比较时，基于Clustal V法比对，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、 56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、 70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％、99％或100％的序列一致性；和(b)在步骤(a)之后，由所述可再生的植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体，并且与不包含重组DNA构建体的对照植物进行比较时，表现出增强的耐旱性和/或百草枯耐受性。所述方法还包括(c)获得来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含重组DNA构建体，并且与不含有重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出增强的耐旱性和/ 百草枯耐受性。

评价植物耐旱性和/或百草枯耐受性的方法，包括(a)将重组DNA构建体导入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含一个多核苷酸和与其可操作地连接至少一种调控序列(例如在植物中有功能的启动子)，其中所述多核苷酸编码多肽的氨基酸序列在与SEQ ID NO：12进行比较时，基于Clustal V法比对，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、 56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、 84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％、99％或100％的序列一致性；和(b)在步骤(a)之后，由所述可再生的植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；和(c)与不包含重组DNA构建体的对照植物进行比较时，评价所述子代植物的耐旱性和/或百草枯耐受性。所述方法还包括(d)获得所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含重组DNA构建体；(e)与不含有重组DNA构建体的对照植物相比，评估所述子代植物的耐旱性和/或百草枯耐性。

确定植物一种农艺性状变化的方法，包括(a)将重组DNA构建体导入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含一个多核苷酸和与其可操作地连接的至少一种调控序列(例如在植物中有功能的启动子)，其中所述多核苷酸编码多肽的氨基酸序列与SEQ IDNO：6、 9、12或15进行比较时，基于Clustal V法比对，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、 55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、 83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％、99％或100％的序列一致性；和(b)在步骤(a)之后，由所述可再生的植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；和(c) 与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时，在氮素限制和/或干旱胁迫条件下，确定转基因植物是否表现出至少一个农艺性状的变化。所述方法可能还包括(d)获得来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含重组DNA构建体；(e)与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时，在氮素限制条件下，确定所述子代植物是否表现出至少一个农艺性状的变化。

生产种子(例如耐氮素胁迫的，用于销售的种子)的方法包括前述的任一方法，还包括获得所述子代植物的种子，其中所述种子在其基因组中包含重组DNA构建体。

在前述任一的方法或本发明其它实施方案披露的任意方法中，所述确定转基因植物农艺性状的改变的步骤，如果适用，还可包括在各种环境条件下与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时，确定转基因植物是否表现出至少一个农艺性状的改变。

在前述任一的方法或本发明其它实施方案披露的任意方法中，所述确定子代植物农艺性状的改变的步骤，如果适用，还可包括在各种环境条件下与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时，确定子代植物是否表现出至少一个农艺性状的改变。

在前述任一的方法或本发明其它实施方案披露的任意方法中，所述引入步骤中所述再生植物细胞可包括愈伤细胞、胚胎愈伤细胞、配子细胞、分生细胞、或不成熟的胚胎细胞。可再生植物细胞可源于自交玉米植株。

在前述任一方法或本发明披露的其它实施方案中的任一方法中，所述再生步骤可包括： (i)在含有胚促激素培养基上培养所述转化的植物细胞直至长出愈伤组织；(ii)将步骤(i) 所述的转化植物细胞转移至含有组织促激素的第一培养基上；和(iii)将步骤(ii)所述转化植物细胞接种到第二培养基上，使其茎伸长、根发育或两者均发育。

在前述任一方法或本发明的其它实施方案的方法中，所述至少一个农艺性状的变化可包括叶片绿色、籽粒产量、生长速率、生物量、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、植物总氮含量、果实氮含量、种子氮含量、植物营养组织氮含量、植物总游离氨基酸含量、植物营养组织游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、植物总蛋白含量、果实蛋白含量、种子蛋白含量、植物营养组织蛋白质含量、耐旱性、氮的吸收、根的倒伏、收获指数、茎的倒伏、株高、穗高、穗长、早期苗的活力和低温胁迫下的出苗状况。所述至少一个农艺性状的变化可能增加产量、加深叶片绿色或提高生物量。

在前述任一方法或本发明的其它实施方案的方法中，在氮素胁迫条件和/或干旱条件下，与不包含重组DNA构建体的对照植物相比，所述植物表现为至少一个农艺性状的改变。

在前述任一方法或者本发明其它实施方案的任一方法中，存在将重组DNA构建体导入可再生植物的供选方案，所述重组DNA构建体包含一个多核苷酸和与其可操作连接的至少一个调控序列，例如可以将一个调控序列(如一个或多个增强子、任选的转座子元件的一部分) 导入可再生植物细胞，接着筛选带有调控序列和与其可操作连接的编码本发明多肽的内源基因的转基因事件。

可以通过任何适当的技术将本发明的重组DNA构建体导入植物中，所述技术包括但不限于直接DNA吸收、化学药品处理、电穿孔、显微注射、细胞融合、感染、载体介导的DNA转移、基因枪轰击或农杆菌的转化。植物转化和再生的技术在国际专利公开号WO 2009/006276 中描述，其全部内容并入作为参考。

本领域的技术人员熟悉将编码所关注多肽的外源基因转化植物和培育再生植物的方法。再生植物可以自花授粉产生纯合转基因植物，或者将再生植物的花粉与种子长出的农艺重要的植物杂交，或者农艺重要的植物的花粉与再生的转基因植物杂交。本领域的技术人员熟知培育本文披露的含有期望多肽的转基因植物的方法。

另外，也有修饰或改变宿主内源基因组DNA的方法，包括改变宿主天然DNA序列或包括调控元件、编码或非编码序列等前体转基因序列。这些方法也可以用于将核酸序列靶向到基因组中改造目标识别序列。例如本文中转基因修饰的细胞或植物使用传统的基因工程核酸酶如产生修饰植物基因组的归位核酸内切酶产生(例如WO 2009/114321；Gao等(2010)Plant Journal 1：176-187)。其它的位点定向工程是通过使用锌指结构域识别偶联的限制性内切酶的限制性特点修饰内源基因(例如Urnov等(2010)Nat Rev Genet.11(9)：636-46；Shukla 等(2009)Nature 459(7245)：437-41)。转录激活样(TAL)效应因子-DNA修饰酶(transcription activator-likeeffector-DNA modifying enzyme，TALE或TALEN)可用于基因工程修饰植物基因组，参见例如US20110145940,Cermak等(2011)Nucleic AcidsRes.39(12)和Boch 等(2009)，Science 326(5959)：1509-12。植物基因组定点修饰也可以使用细菌II型CRISPR (成簇的规律的间隔的短回文的重复序列，clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats)/Cas(CRISPR关联蛋白，CRISPR-associated)系统，参考例如Belhaj 等(2013)，Plant Methods 9:39.CRISPR/Cas系统可以允许可定制的小的非编码RNA引导的基因组DNA靶向切割。

实施例

本文的具体实施进一步在下列实例中示明。在这些实例中，除非特别说明，采用摄氏/ 公制。在这些实例中，仅用举例说明具体的实施过程。通过上述讨论和具体事例，本领域的专业人员可以查明本发明的基本特征，经过各种改变和修改将本发明应用于各种用途和条件，并不偏离本发明主体和范围。因此，除了本专利表述和讨论的各种修改外，本领域内的专业人员所做的不偏离本发明主题的修改也将落入本专利的权力要求范围内。

实施例1.非生物胁迫耐性基因的克隆和过量表达构建体的构建

根据水稻激活标签突变体库初步的筛选结果和表2的基因ID序列信息，设计引物，克隆了水稻基因OsDN-PPR1、OsLRP1、OsDN-LTP1和OsRRM1。引物序列和扩增基因片段的长度如表3所示。

以中花11号水稻叶、茎和根混合的cDNA库为模板克隆OsDN-PPR1、OsLRP1和OsRRM1的 cDNA；以ZH11基因组DNA为模板克隆OsDN-LTP1的gDNA。PCR反应混合液和PCR程序如表4和5所示。

表2.水稻基因名称、基因ID(TIGR)和构建体的ID

表3.克隆水稻非生物胁迫耐性基因的引物

表4.克隆非生物胁迫耐性基因的PCR反应混合液

表5.非生物胁迫耐性基因PCR循环状况

PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳分离后采用柱式试剂盒回收，并与TA克隆载体连接。通过测序确定PCR产物的核酸序列和在构建体中的方向，然后将基因克隆到植物双元载体 DP0005(pCAMBIA1300-AsRed，SEQ ID NO：1)中，产生的过表达构建体列在表2中。DP0039构建体中克隆的核苷酸序列和OsDN-PPR1的编码序列如SEQ ID NO：4和5所示，OsDN-PPR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示；DP0044构建体中克隆的核苷酸序列和OsLRP1的编码序列如SEQ ID NO：7和8所示，OsLRP1的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示；DP0047构建体中克隆的核苷酸序列和OsDN-LTP1的编码序列如SEQ ID NO：10和11所示，OsDN-LTP1的氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示；和DP0049构建体中克隆的核苷酸序列和OsRRM1的编码序列如SEQ IDNO：13和14所示，OsRRM1的氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示。

DsRed基因表达盒(SEQ ID NO：3)转移到植物双元载体DP0005产生另一个空载体DP0158。

实施例2.转化获得转基因水稻

本研究中，所有过表达构建体和空载体(DP0005和DP0158)采用林拥军和张启发((2005) Plant Cell Rep.23：540-547)描述的农杆菌介导的方法转化入中花11号水稻。中花11号水稻为中国农业科学院作物研究所培育的品种，第一批种子由北京未名凯拓农业生物公司提供。将载体转化胚诱导产生的愈伤组织，转化实验室获得的T₀代转基因幼苗移栽至田间水田中获得T₁种子，T₁和T₂代种子储藏在4℃冷库中。T₂代种子用于下列性状验证试验。

T₁代转基因植株使用潮霉素筛选，将生长到1-2cm高的水稻植株在50mg/L的潮霉素溶液中培养，存活的植株即潮霉素抗性植株种植到田间收获T₂代种子，只有潮霉素抗性的T₂代转基因种子用于性状筛选。

实施例3.基因表达分析

采用标准的RT-PCR或者实时定量PCR程序诸如源于

的

反转录试剂盒和实时定量PCR(SYBR^RPremix Ex Taq^TM,宝生物)分析转基因水稻植株中基因的表达水平。 EF1α基因用作内参显示转基因水稻和对照植物的扩增和上样量相等。以EF1αmRNA水平为参照确定基因表达水平。

如图1所示，OsLRP1基因在DP0044.29水稻植株中的表达量设置为1.00，OsLRP1基因在所有测试的10个转基因株系中过量表达，而在空载体DP0005转化植株叶中未检测到OsLRP1 基因表达。

DP0044-1：5'-CTCCCATCATTTCTCCGCAACTC-3'(SEQ ID NO：24)

DP0044-2：5'-CCAAGAGACCCATCCACAACGTC-3'(SEQ ID NO：25)

如图2所示，OsLTP1在所有测试的转基因株系中过量表达，而在ZH11-TC和DP0158幼苗的两个对照中的表达量很低。

DP0047-F1：5'-GTGCGCATTAAAGAAATTCA-3'(SEQ ID NO：26)

DP0047-R1：5'-TCACGCTGACAACACTTTC-3'(SEQ ID NO：27)

实施例4.转基因水稻的温室NUE试验

为了调查这些基因是否能增加水稻植株的低氮耐受性或氮素利用效率(NUE)，进行了转基因水稻植株的温室低氮试验。温室中设置比例为1:1的钠灯和金属卤化物灯作为光源，光照/黑暗时间为16h/8h，光源设置在苗床上部大约1.5m处，晴天时，高于苗床30cm处的光强度为10,000-20,000lx，阴天时为6,000-10,000lx；温室相对湿度为30％-90％，温度为20-35℃。

NUE试验方法：

T₂代转基因种子首先采用800ppm的多菌灵在32℃消毒8h，然后使用蒸馏水冲洗3～5 次，然后32℃浸种16h，在35-37℃培养箱中萌发18h。发芽后的种子种植在装有蛭石的小盆中。本试验采用随机区组设计。每个筛选单元分为4个区块，其中包括2个对照(ZH11-TC和空载体，或分离阴性株系line null)和4个转基因株系。每个转基因株系的8株幼苗每2株种在1个小盆中，共种植在4个小盆中，这4个小盆分别位于4个区块的不同位置。每个基因筛选9-12个转基因株系。

培养7-10天后，用表6所示含有0.75mM的氮素(KNO₃)的改良的Hoagland营养液代替蒸馏水浇灌植株。为了提供有氧条件，每周一、三和五排出营养液，静置2-3小时后加入新的提供低氮条件的改良的Hoagland营养液。当在低氮溶液中培养35-40天后，测量分蘖数(包括主茎和所有的分蘖)，使用SPAD仪(SPAD 502plus，KONICA MINOLTA公司制造)测定倒二片叶三个不同位置的SPAD值，取其平均值作为SPAD值；并以百分之一的天平测量幼苗鲜重(从根和茎的连接处剪断)。将所有数据(分蘖数、SPAD值和鲜重)统计分析后选取 P<0.05的植株为阳性植株。

表6.水稻培养的改良Hoagland营养液

NUE试验结果：

1)OsLRP1转基因水稻(DP0044)的验证结果

第一次试验中，对12个OsLRP1转基因水稻株系进行试验，其分离阴性株系(linenull) 为对照。如表7所示，5个OsLRP1转基因水稻株系的平均分蘖数、SPAD值和鲜重高于其相应的对照，其中2个OsLRP1转基因株系DP0044.26和DP0044.30的三个指标表现较好，10个OsLRP1转基因水稻株系的鲜重高于其相应的分离阴性对照，3个株系达到显著水平。2个OsDN-LTP4转基因株系分蘖数高于对照。这些结果显示，在低氮条件下，OsLRP1转基因水稻可以提高低氮耐性或提高NUE。

表7.温室低氮条件下OsLRP1转基因水稻的低氮试验(第一次试验)

第二次试验测试了10个OsLRP1转基因株系，ZH11-TC和DP0158为对照。本试验采用随机区组设计。每个转基因株系、ZH11-TC和DP0158分别种植12株于同一个容器中，重复两次。当水稻植株生长至三叶期，用含有0.75mM的氮素(KNO₃)的改良的Hoagland营养液培养植株。经过低氮胁迫处理34天后，测定分蘖数、SPAD值和鲜重。构建体水平上，OsLRP1 转基因水稻的平均分蘖数显著高于ZH11-TC对照(P值＝0.0408)并高于DP0158对照(P值＝0.1009)，OsLRP1转基因水稻的平均SPAD值和鲜重均高于ZH11-TC和DP0158两个对照。

如表8所示，9个OsLRP1转基因株系的分蘖数和6个株系的SPAD值高于ZH11-TC对照；如表9所示，9个株系的分蘖数，8个株系的SPAD值和10个株系的鲜重高于DP0158对照。这些结果表明OsLRP1转基因水稻获得了低氮耐性或提高的NUE，过量表达OsLRP1基因增强了转基因植物的NUE。

表8.温室低氮条件下OsLRP1转基因水稻的低氮试验(第二次试验，ZH11-TC作为对照)

表9.温室低氮条件下OsLRP1转基因水稻的低氮试验(第二次试验，DP0158作为对照)

2)OsDN-LTP1转基因水稻(DP0047)的验证结果

第一次试验对12个OsDN-LTP1转基因水稻株系进行测试，ZH11-TC和DP0005幼苗用作对照。当幼苗生长到三叶期时，采用含有0.75mM的氮素(KNO₃)的改良的Hoagland营养液培养植物37天。OsDN-LTP1转基因水稻的平均分蘖数和鲜重高于DP0005对照。如表10所示，3个转基因株系的鲜重显著高于DP0005对照，和2个转基因株系的分蘖数显著高于DP0005对照。10个转基因株系的分蘖数优于ZH11-TC对照。这些结果显示OsDN-LTP1转基因水稻植株增强了低氮耐性或提高NUE。

表10.温室低氮条件下OsDN-LTP1转基因水稻的低氮试验(第一次试验)

第二次试验测试了10个OsDN-LTP1转基因株系，ZH11-TC和DP0158为对照。本试验采用随机区组设计，每个转基因株系、ZH11-TC和DP0158分别种植12株于同一个容器中。当水稻植株生长至三叶期，用含有0.75mM的氮素(KNO₃)的改良的Hoagland营养液培养植株。经过低氮胁迫处理35天后，测定分蘖数、SPAD值和鲜重。OsDN-LTP1转基因水稻的平均分蘖数、SPAD值和鲜重分别为1.6、34.23和3.484，平均SPAD值著高于ZH11-TC对照。所测试的10个转基因株系的分蘖数、SPAD值和鲜重高于ZH11-TC或者DP0158对照(表11和表12)。这些结果表明OsDN-LTP1转基因水稻获得了低氮耐性或提高的NUE，过量表达OsDN-LTP1基因在增强NUE中发挥作用。

表11.温室低氮条件下OsDN-LTP1转基因水稻的低氮试验(第二次试验，ZH11-TC作为对照)

表12.温室低氮条件下OsDN-LTP1转基因水稻的低氮试验(第二次试验，DP0158作为对照)

第三次试验测试了同样的10个OsDN-LTP1转基因株系，实验设计和处理方法与第二次试验相同。经过低氮胁迫处理35天后，测定分蘖数、SPAD值和鲜重。构建体水平，OsDN-LTP1 转基因水稻的平均分蘖数、SPAD值和鲜重高于ZH11-TC和DP0158对照，OsDN-LTP1转基因水稻的SPAD值显著高于ZH11-TC和DP0158对照，分蘖数和鲜重显著高于DP0158对照。如表13或14所示，所有测试的OsDN-LTP1转基因株系的分蘖数、SPAD值和鲜重高于ZH11-TC或DP0158对照。这些结果表明OsDN-LTP1转基因水稻获得了增强的低氮耐性或提高的NUE，OsDN-LTP1基因在增强转基因植物的NUE中发挥作用。

表13.温室低氮条件下OsDN-LTP1转基因水稻的低氮试验(第三次试验，ZH11-TC作为对照)

表14.温室低氮条件下OsDN-LTP1转基因水稻的低氮试验(第二次试验，DP0158作为对照)

实施例5.转基因水稻的实验室氯酸盐试验

硝酸盐是高等植物可利用无机氮的主要来源。氯酸盐是硝酸盐类似物，植物通过氮素的吸收、转运系统吸收和转运氯酸盐，并通过硝酸还原酶(NR)还原为有毒化合物(亚硝酸盐)。为了进一步证明转基因水稻植物的氮素利用效率，用氯酸盐溶液处理水稻幼苗，对氯酸盐敏感的幼苗被认为具有增加的氮素利用效率或低氮耐受性。

实验室氯酸盐试验方法：

本试验中，每个构建体选择大约10个株系进行氯酸盐试验。ZH11-TC和空载体(DP0158) 转基因植株为对照。

如实施例4所述方法进行T₂代转基因种子的消毒和萌发，本试验在温度为28-30℃、相对湿度约30％的培养室中进行。种子萌发后置于底部有孔的管中，30℃水培6天至一叶一心期。选取高度为5.5cm的一致性幼苗用于氯酸盐筛选。本试验选用随机区组设计。每个容器包括5个区组，每个区组中随机将每个转基因株系放1行(每列12株)，ZH11-TC和DP0158 幼苗放3行(3×12棵植株)。幼苗置于0.4mM的氯酸盐溶液中培养3-5天，光照/黑暗时间为10h/14h。处理幼苗首先进入黑暗时期进行氯酸盐吸收，并在第三天更换氯酸盐溶液。处理5天后，幼苗转入1/10Hoagland营养液(表6)中恢复培养4天。整株叶片枯萎和叶片全部失绿的幼苗被视为敏感幼苗。仅叶片或茎部坏死的幼苗，或叶片褪色的幼苗视为非敏感幼苗。

敏感率是氯酸盐试验的一个参数，为敏感植株数除以总植株数的百分比。

试验数据在构建体水平(所有的转基因幼苗与对照幼苗相比)和转基因株系水平(不同的转基因株系与对照相比)进行分析，采用的统计模型为“Y～seg+line(seg)+rep+error”，随机效应为“rep”，统计方法是“

PROC GLIMMIX”。

氯酸盐试验结果：

1)OsDN-PPR1转基因水稻(DP0039)的验证结果

第一次试验中，用0.4mM的氯酸盐溶液进行处理2天后置于1/10的Hoagland营养液中恢复培养4天，600株OsDN-PPR1转基因幼苗中227株死亡，而180株ZH11-TC幼苗死亡32株，180株DP0158幼苗死亡14株。OsDN-PPR1转基因幼苗的死亡率为38％，ZH11-TC幼苗的死亡率为18％，和DP0158幼苗的死亡率为8％。OsDN-PPR1转基因幼苗的敏感率显著高于ZH11-TC对照(P值＝0.0000)和DP0158对照(P值＝0.0000)。这些结果显示，构建体水平，与ZH11-TC和DP0158幼苗相比，OsDN-PPR1转基因幼苗增强了氯酸盐敏感性。表15为转基因株系水平的分析，8个株系的氯酸盐敏感率高于ZH11-TC和DP0158对照，其中5个株系的敏感率显著高于ZH11-TC对照，8个株系的敏感率显著高于DP0158幼苗。

表15.OsDN-PPR1转基因水稻幼苗的氯酸盐敏感性试验(第一次试验，转基因株系水平)

第二次试验测试同样的10个转基因株系。氯酸盐处理后，600株OsDN-PPR1转基因水稻中，356株死亡；而180株ZH11-TC幼苗中，65株死亡；180株DP0158幼苗中，91株死亡。OsDN-PPR1转基因幼苗的死亡率为59％，ZH11-TC幼苗的死亡率为36％，和DP0158幼苗的死亡率为51％。OsDN-PPR1转基因幼苗的敏感率显著高于ZH11-TC对照和DP0158对照。转基因株系水平的进一步分析证明，两次试验中，4个转基因株系DP0039.07、DP0039.18、DP0039.19 和DP0039.22的氯酸盐敏感率高于DP0158幼苗，4个转基因株系DP0039.18、DP0039.19、 DP0039.22和DP0039.25的氯酸盐敏感率高于ZH11-TC幼苗(表16)。这些结果清楚并一致的表明，构建体水平和转基因株系水平，与ZH11-TC和DP0158幼苗相比，OsDN-PPR1转基因水稻植株增加了苗期氯酸盐敏感性；CaMV 35S启动子驱动过表达OsDN-PPR1基因提高了转基因植株的氯酸盐敏感性。

表16.OsDN-PPR1转基因水稻幼苗的氯酸盐敏感性试验(第二次试验，转基因株系水平)

2)OsDN-LTP1转基因水稻(DP0047)的验证结果

第一次试验中，576株OsDN-LTP1转基因幼苗中，266株死亡，而192株ZH11-TC幼苗，67株死亡。OsDN-LTP1转基因幼苗的死亡率为46％，ZH11-TC幼苗的死亡率为35％。OsDN-LTP1 转基因幼苗的敏感率显著高于ZH11-TC对照(P值＝0.0112)。这些结果显示，构建体水平，与ZH11-TC幼苗相比，OsDN-LTP1转基因幼苗增强了氯酸盐敏感性。转基因株系水平的分析显示，7个OsDN-LTP1转基因株系的氯酸盐敏感率高于ZH11-TC幼苗，其中4个株系的敏感率显著高于ZH11-TC对照。这些结果表明OsDN-LT1转基因水稻植株在构建体水平和转基因株系水平增强了苗期氯酸盐敏感性，OsDN-LTP1提高了转基因植物的氯酸盐敏感性。

表17.OsDN-LTP1转基因水稻幼苗的氯酸盐敏感性试验(第一次试验，转基因株系水平)

第二次试验中，600株OsDN-PPR1转基因幼苗中，273株死亡；而180株ZH11-TC幼苗中， 59株死亡。OsDN-PPR1转基因幼苗的死亡率为46％，和ZH11-TC幼苗的死亡率为33％。OsDN-PPR1 转基因幼苗的敏感率显著高于ZH11-TC对照(P值＝0.0052)。转基因株系水平的分析证明，8 个OsDN-PPR1转基因株系的氯酸盐敏感性高于ZH11-TC幼苗，其中4个转基因株系的氯酸盐敏感率显著高于ZH11-TC幼苗(表18)。这些结果进一步的表明，构建体水平和转基因株系水平，与ZH11-TC幼苗相比，OsDN-PPR1转基因水稻植株增加了苗期氯酸盐敏感性；OsDN-PPR1 基因提高了转基因植物的氯酸盐敏感性。

如实施例4所示，过量表达OsDN-LTP1基因提高了转基因水稻的氮素利用效率，这些交叉验证表明提高了OsDN-LTP1转基因水稻的低氮耐性或NUE。

表18.OsDN-LTP1转基因水稻幼苗的氯酸盐敏感性试验(第二次试验，转基因株系水平)

3)OsRRM1转基因水稻(DP0049)的验证结果

第一次试验中，氯酸盐溶液处理后，600株OsRRM1转基因幼苗中，259株死亡；而180株ZH11-TC幼苗中，57株死亡；180株DP0158幼苗中，39株死亡。OsRRM1转基因幼苗的死亡率为43％，ZH11-TC幼苗的死亡率为32％，和DP0158幼苗的死亡率为22％。OsRRM1转基因幼苗的敏感率显著高于ZH11-TC对照(P值＝0.0192)和DP0158对照(P值＝0.0000)。这些结果显示，OsRRM1转基因幼苗增强了氯酸盐敏感性。转基因株系水平的分析显示，7个OsRRM1 转基因株系的氯酸盐敏感率高于ZH11-TC和DP0158对照。这些结果表明，在构建体和转基因株系水平，与ZH11-TC和DP0158幼苗相比，OsRRM1转基因水稻植株增强了苗期氯酸盐敏感性，CaMV 35S启动子驱动过量表达OsRRM1基因提高了转基因植物的氯酸盐敏感性。

表19.OsRRM1转基因水稻幼苗的氯酸盐敏感性试验(第一次试验，转基因株系水平)

第二次试验中，氯酸盐溶液处理后，600株OsRRM1转基因幼苗中，476株死亡；而180株ZH11-TC和DP0158幼苗中，各有83株死亡。OsRRM1转基因幼苗的死亡率为79％，和ZH11-TC和DP0158幼苗的死亡率均为46％。OsRRM1转基因幼苗的敏感率显著高于ZH11-TC和DP0158对照(P值＝0.0000)。这些结果表明OsRRM1转基因幼苗增强了氯酸盐的敏感性。转基因株系水平的分析证明，10个OsRRM1转基因株系的氯酸盐敏感性高于ZH11-TC和DP0158对照(表20)。两次试验中，多个转基因株系显示较好的氯酸盐敏感性。这些结果表明，构建体水平和转基因株系水平，与ZH11-TC和DP0158幼苗相比，OsRRM1转基因水稻植株增加了苗期氯酸盐敏感性；CaMV 35S启动子驱动过量表达OsRRM1基因提高了转基因植物的氯酸盐敏感性。

表20.OsRRM1转基因水稻幼苗的氯酸盐敏感性试验(第二次试验，转基因株系水平)

实施例6.成熟转基因水稻植株的田间低氮试验

田间耐低氮试验在北京进行。设置两个氮素水平：N-0(不含氮的化肥)和N-1(每亩正常施用180kg氮)。种子萌发和幼苗培养如实施例4所述。萌发种子被种于田间苗床中。三叶期将幼苗移栽入两个试验田中，重复4次，每个转基因株系每个重复种植10株，4个重复种于同一个田块中。在同一田块中临近转基因株系的ZH11-TC和DP0158植株作为对照被用于统计分析。

水稻植株正常管理，并使用相应的杀虫剂，N-0处理施用磷肥和钾肥，N-1处理正常化肥。

抽穗10天后，用SPAD-502叶绿素仪测量完全展开的旗叶和倒二叶的SPAD值。每个转基因株系的SPAD值为每行中间的三株水稻植株的SPAD值的算数平均数。

株高为抽穗后20天后水稻茎基部到穗顶端或最高叶顶部的长度。测量每行中间的六株水稻植株的株高，其算数平均值视为转基因株系的株高。

生长季节结束时，从每个转基因株系中间收获六株代表植株。有五粒种子的穗被视为有效穗，且有效穗数是每棵植株的有效穗数之和。单株生物量是根和穗以外的水稻植株的干重。利用ASReml软件的混合线性模型统计分析植株的SPAD值、株高、有效穗数、生物量和粒重数据。基于分析选择阳性转基因株系(P≤0.1)。

1)OsLRP1转基因水稻(DP0039)的田间NUE验证结果

如表21所示，构建体水平，低氮条件下，OsLRP1转基因水稻的单株籽粒产量为31.47g，低于ZH11-TC对照，但高于DP0158对照；正常氮条件下OsLRP1转基因水稻获得相似的结果 (表22)。这些结果表明OsLRP1转基因水稻与对照的籽粒产量、生物量和有效穗数无差别，但是OsLRP1转基因水稻在低氮条件下显示出高于ZH11-TC和DP0158对照的株高。

表24表明，低氮条件下，两个株系的株高显著高于ZH11-TC对照，6个转基因株系的株高显著高于DP0158对照；表25表明，正常氮条件下，1个转基因株系的株高显著高于ZH11-TC 对照，4个株系的株高显著DP0158对照。构建体水平上，OsLRP1转基因水稻在低氮条件下株高高于ZH11-TC和DP0158对照，正常氮条件下株高低于ZH11-TC和DP0158对照。这些结果表明OsLRP1转基因水稻植株在田间低氮条件下显示出株高反映的增强的低氮耐性和/或NUE； OsLRP1基因可用于提高低氮耐性和/或NUE。

表21.OsLRP1转基因水稻在田间低氮条件下的籽粒产量分析

表22.OsLRP1转基因水稻在田间正常氮条件下的籽粒产量分析

表23.OsLRP1转基因水稻在田间低氮条件下的生物量分析

表24.OsLRP1转基因水稻在田间低氮条件下的植株高度分析

表25.OsLRP1转基因水稻在田间正常氮条件下的植株高度分析

2)OsRRM1转基因水稻(DP0049)的田间NUE验证结果

测定OsRRM1转基因水稻植株的籽粒产量、生物量、有效穗数和植株高度。表26 表明构建体水平上，OsRRM1转基因水稻在低氮条件下的籽粒产量低于ZH11-TC和DP0158对照，但无显著差异；表27 为田间正常氮条件下籽粒产量结果，OsRRM1转基因水稻的籽粒产量在构建体水平上高于ZH11-TC和DP0158对照，8个株系的籽粒产量高于ZH11-TC对照，所有测试的12个株系的籽粒产量高于DP0158对照。针对生物量、有效穗数和植株高度这三个指标，OsRRM1转基因水稻与对照的差别不显著。这些结果表明OsRRM1转基因水稻植株在正常氮条件下获得了较高的籽粒产量，在低氮条件下产量稍有减少。

测定了低氮条件下植株的SPAD值，如表28所示，OsRRM1转基因水稻旗叶SPAD值为40.58，构建体水平上显著高于ZH11-TC和DP0158植株；转基因株系水平上，10个株系的旗叶SPAD值显著高于ZH11-TC对照，8个株系旗叶SPAD值显著高于DP0158对照。如表29所示，OsRRM1转基因水稻植株倒二叶SPAD值为39.57，在构建体水平上显著高于ZH11-TC和DP0158对照，转基因株系水平上，11个株系倒二叶SPAD值显著高于ZH11-TC对照，10个株系倒二叶SPAD值显著高于DP0158对照。这些结果表明OsRRM1转基因水稻植株在田间低氮条件下显示出较好的生长状态，OsRRM1基因在提高低氮耐性和/或NUE中起作用。

表26.OsRRM1转基因水稻在田间低氮条件下的籽粒产量分析

表27.OsRRM1转基因水稻在田间正常氮条件下的籽粒产量分析

表28.OsRRM1转基因水稻在田间低氮条件下旗叶SPAD值分析

表29.OsRRM1转基因水稻在田间低氮条件下倒二叶SPAD值分析

实施例7.转基因水稻植株的实验室百草枯试验

百草枯(1,1-二甲基-4,4-联吡啶二氯化物)是一类叶面喷施的非选择性的吡啶除草剂，是世界范围内广泛应用的一种除草剂，能够控制大量作物如玉米、水稻、大豆等中生长的杂草。在植物细胞中，百草枯主要靶向叶绿体，百草枯通过接受光系统I的电子，然后与氧气发生化学反应生成过氧化物和过氧化氢，而过氧化物和过氧化氢可以导致产生光氧化胁迫。干旱胁迫通常导致植物中产生活性氧(ROS)，有时，植物的耐旱性与增强的抗活性氧能力相关。百草枯是强有力的氧化胁迫诱导剂，能够大大的增加活性氧(ROS)的产生，同时抑制抗氧化系统活性所需的还原物和化合物的再生。非生物胁迫增加了ROS的产生，而植物响应耐性到死亡的范围取决于胁迫力度和与其相关的ROS水平。相对较低水平的百草枯能够模拟胁迫相关的ROS产生，并用作植物胁迫生物学中胁迫耐性的标记(Hasaneen M.N.A.(2012) Herbicide-Properties,Synthesis and Control of Weeds book)。因此，进一步采用百草枯验证耐旱性和耐冷性的转基因水稻。

百草枯试验方法：

每个构建体的水稻选择8-10个转基因株系用于百草枯试验，组培中花11(ZH11-TC)和空载体转化植株DP0158用作对照。T₂代种子参照实施例4描述的方法消毒和萌发。百草枯试验在温度28-30℃，湿度30％的生长室中进行。萌发的种子放置在底部有孔的离心管中，采用水稻水培方法，培养5天，至一叶一心期；然后选择高度大约3.5～4cm的一致的幼苗用于百草枯试验。本实验采用随机区组设计，在同一个筛选水槽内设置5个区组；区组内包含所有测试的8-10个转基因株系、ZH11-TC和DP0158；区组的行列为16*12，每一行为一份测试材料，故每个转基因株系在区组内各12株，对照ZH11-TC和DP0158在区组内各3行；区组内的所有转基因株系和对照均随机排布。幼苗用终浓度为0.8μM的百草枯溶液进行处理 7天，光周期为10h黑暗/14h光照，每两天更换一次溶液，在处理和更换溶液后，保证幼苗首先进入光周期的黑暗时期。处理7天后，计算绿色的幼苗。绿色没有损伤的幼苗为百草枯耐性幼苗；叶片、茎部变白褪色的幼苗为非百草枯耐性的幼苗。

耐性率是百草枯试验的一个指标，指保持绿色并显示百草枯耐性表型的幼苗数除以总幼苗数的百分数。

试验数据在构建体水平(所有的转基因幼苗与对照幼苗相比)和转基因株系水平(不同的转基因株系与对照相比)进行分析，采用的统计模型为“Y～seg+line(seg)+rep+error”，随机效应为“rep”，统计方法是“

PROC GLIMMIX”。

百草枯试验结果：

1)OsDN-LTP1转基因水稻(DP0047)的百草枯验证结果

第一次试验中，百草枯溶液处理后，600株OsDN-LTP1转基因幼苗中，259株保持绿色并显示出百草枯耐性表型；而180株ZH11-TC幼苗中，34株具有百草枯耐性表型。OsDN-LTP1 转基因幼苗的百草枯耐性率为43％，ZH11-TC幼苗的百草枯耐性率分别为19％。所测试的 OsDN-LTP1转基因幼苗的耐性率显著高于ZH11-TC(P值＝0.0000)对照。这些结果表明OsDN-LTP1转基因幼苗在构建体水平显示出高于ZH11-TC幼苗的百草枯耐性。

转基因株系水平的分析表明所测试的10个OsDN-LTP1转基因株系的百草枯耐性率高于 ZH11-TC对照，其中9个株系的百草枯耐性率显著高于ZH11-TC对照(表30)。这些结果表明， OsDN-LTP1转基因水稻在构建体水平和转基因株系水平均提高了幼苗的百草枯耐性， OsDN-LTP1在提高转基因植物百草枯耐性或抗氧化能力中起作用。

表30.OsDN-LTP1转基因水稻的百草枯耐性试验(第一次试验，转基因株系水平)

第二次试验测试了同样的10个转基因株系，百草枯溶液处理后，600株OsDN-LTP1转基因水稻中，381株保持绿色并显示出百草枯耐性表型；而180株ZH11-TC幼苗中，100株具有百草枯耐性表型。OsDN-LTP1转基因幼苗的百草枯耐性率为64％，ZH11-TC幼苗的百草枯耐性率分别为56％。OsDN-LTP1转基因幼苗的耐性率显著高于ZH11-TC(P值＝0.0000)幼苗。

表31为转基因株系水平的分析，6个OsDN-LTP1转基因株系的百草枯耐性率高于ZH11-TC 对照，其中4个株系的百草枯耐性率显著高于ZH11-TC幼苗。两次试验中，多个转基因株系表现出较好的百草枯耐性。这些结果清楚地表明OsDN-LTP1基因增强了转基因植物百草枯耐性或抗氧化能力。

表31.OsDN-LTP1转基因水稻的百草枯耐性试验(第二次试验，转基因株系水平)

实施例8.转基因水稻的田间干旱试验

开花期干旱胁迫是农业生产中严重的问题。转基因水稻进一步在田间干旱条件下进行验证。田间干旱试验中，每个基因构建体选择12个转基因株系。T₂代种子首先参照实施例4描述的方法消毒，萌发的种子种植在田间苗床上，三叶期时，将水稻幼苗移栽到田间试验地，设置四个重复，每个重复每转基因株系10株苗，并将四个重复种植在同一地块。同一地块中，ZH11-TC和DP0158邻近转基因株系种植，并用作统计分析中的对照。

水稻植株正常管理，并使用相应的杀虫剂和化肥，分蘖期停止浇水，因此开花期时产生干旱胁迫，干旱时间长短取决于温度和湿度等天气条件。干旱期间，使用TDR30(Spectrum Technologies，Inc.)在每块地的10个位点每四天测定土壤相对含水量。

试验过程中，观察并记录植株表型，植株的表型主要包括抽穗期、卷叶程度、敏旱性和/ 或抗旱性，尤其关注中午时植株的卷叶程度。生长季结束时，每行的每个株系取中间约6株具有代表性的植株收获，并称量每株水稻籽粒的重量，利用混合线性模型(mixedlinear model)对籽粒重量进行统计分析。基于分析选择阳性转基因株系(P≤0.1)。

田间干旱试验结果：

第一次试验中，12个OsDN-LTP2转基因株系在海南省进行验证，邻近种植的ZH11-TC和 DP0158水稻植株用作对照。幼穗分化II-III期断水直至种子成熟，产生较严重的干旱胁迫，抽穗和成熟过程中土壤体积含水量从35％降到5％(图3)。断水后20天出现干旱胁迫，水稻叶片出现卷曲。干旱胁迫过程中，与ZH11-TC和DP0158对照相比较，DP0047.19水稻植株在营养生长期的叶片颜色较深，且卷叶程度较轻。断水后37天，50％的转基因水稻、ZH11-TC和DP0158水稻植株抽穗，且卷叶程度增加。成熟期，DP0047.12、DP0047.19、DP0047.20、DP0047.25和DP0047.26水稻植株表现出较好的结实率。

生长季结束时，每行的每个株系取中间约6株具有代表性的植株收获，并称量每株水稻籽粒的重量。如表32所示，构建体水平上，OsDN-LTP1转基因水稻的单株籽粒产量为7.13g，高于DP0158对照但低于ZH11-TC对照；4个OsDN-LTP1转基因水稻株系的单株籽粒产量高于 ZH11-TC和DP1058对照。这些结果表明，干旱胁迫后，OsDN-LTP2水稻植株在干旱胁迫后表现出较好的营养生长期耐旱性和较好的单株籽粒产量；OsDN-LTP1基因在增强营养生长期耐旱性和提高成熟期籽粒产量中发挥作用。

表32.OsDN-LTP1转基因水稻在田间干旱条件下籽粒产量分析

实施例9.水稻低氮耐性基因转化玉米并评估在玉米中功能

将水稻低氮耐性基因或者玉米、拟南芥或其它物种中的相应的同源基因转化玉米植株，并使基因过量表达，以组成型的启动子如玉米泛素启动子(Christensen等(1989)Plant Mol. Biol.12：619-632和Christensen等(1992)Plant Mol.Biol.18：675-689)或诸如胁迫响应启动子或组织偏爱启动子的其它启动子驱动玉米转化载体中基因的表达，采用微粒轰击法(国际专利公布WO 2009/006276)将构建的重组DNA载体转化玉米细胞，也可以以采用农杆菌介导法(Zhao等，Meth.Mol.Biol.318：315-323(2006)和Zhao等，Mol.Breed.8： 323-333(2001)和美国专利号5,981,840，1999年11月9日公布)转化玉米植株。农杆菌介导转化的过程包括细菌的接种、共培养、静止、筛选和植株的再生。

再生植株的子代如T₁代植株可以种在土壤中进行低氮胁迫，采用图像分析，测量低氮胁迫前和低氮胁迫过程中多个时期点植株面积、体积、生长速率和叶片颜色。与对照相比，明显延迟胁迫期间叶片面积减小，黄色素积累的减少，和/或促进生长速率的增加被认为基因在提高玉米NUE中发挥作用。

实施例10.转化玉米株系衍生的Gaspe Flint并评价其在玉米中的功能

如实施例9所述，可以转化玉米使其过表达水稻低氮耐性基因或者其它物种的同源基因。在某些情况下，具有短生活周期(快速循环)、小株型和高转化潜力的玉米株系(Tomes等，美国专利7,928,287)也可以成为植物受体细胞。

以玉米胚作为受体，转化获得的转基因玉米(T₀)群体，然后将转基因玉米按照优化的随机分组设计种植在条件可控的温室中减小或消除环境误差，比如每个重复30株包括24株转化获得植株和6株对照植株种植在盆中排成一排摆放在温室中的苗床上，每个对照或试验植株随机摆在不同设计的位置，一个实验的多个重复组种植在同一温室中，根据最小化空间需求量和环境效应来确定温室中重复组的排列，这样的排列可以被认为是压缩的温室排列。

在研究过程中，转基因库中每一个植株都会被识别和追踪调查，植物上采集的数据自动与植株相关连，因此采集的数据可以与转化植株中基因相关联，比如每一个植物容器有可机读的标签(如通用产品码(UPC)条形码)包括植物身份信息，并与温室的位置相互关联，因此采集的数据自动与植物相关联。

本研究中可以利用任何有效，机器可读的植物识别系统如二维矩阵码或射频识别标签 (RFID)收到的数据，并用无线电频率接收器/数据处理器(美国专利7,403,855和 7,702,462)翻译。

对照和T₀代温室植株用于目标农艺性状的分析，每个植株农艺数据会被记录或以一定的方式保存，并因此与植物的识别信息相关联。T₁代植株采用前述类似的实验设计确认植株的表型(基因效应)。

实施例11.水稻低氮耐受性基因转化拟南芥的实验室NUE筛选

为了验证水稻低氮耐性基因是否提高双子叶植物的低氮耐性或其它性状，采用农杆菌介导的花浸转化法将水稻低氮耐性基因过表达载体转化拟南芥(Cloumbia)，并鉴定转基因拟南芥(Clough,S.T.和Bent,A.F.(1998)The Plant Journal 16，735–743；Zhang,X.等 (2006)Nature Protocols 1：641-646)。

一个称为pBC-yellow的16.8-kb T-DNA双元载体用于本试验。该载体包含一个RD29a启动子驱动ZS-Yellow基因表达，ZS-Yellow基因赋予转化种子黄色荧光。参照实施例1描述的方法克隆OsDN-PPR1和OsRRM1基因，并构建gateway载体；随后采用INVITROGEN^TM的

技术，一个LR重组反应在含有定向克隆的PCR产物的进入克隆和pBC-yellow载体之间进行，获得GWD0039和GWD0049载体，组成型CaMV 35S启动子驱动OsDN-PPR1和OsRRM1基因表达。

生长室NUE筛选方法：

选择T₁代荧光的种子，表面消毒后，4℃黑暗层积放置3天。32株T₁代植株与32株空载体(pBCyellow-空载体)对照植株相邻播种于低氮培养基中，所述低氮培养基包含如表33的0.5倍不含氮的Hoagland营养液，0.4mM硝酸钾，0.1％蔗糖，1mM MES和0.25％肌醇六磷酸^TM，设置两次重复。将培养平板水平放于生长室培养10天，生长室温度为22℃，相对湿度为60％，光照/黑暗时间为16h/8h。层积处理10-13天，成像整个培养平板以评价植株幼苗状态。

屏蔽平板成像以移除背景后，收集每个植株的两个不同测量参数：莲座叶总面积和落入绿色色调的颜色百分比。使用色彩，饱和度和亮度数据(HSI)，绿颜色色调由50-66的色彩组成；莲座叶总面积用作植物生物量的指标，剂量-效应研究表明绿色色调为氮吸收的指示(专利公开US20110209245)。

成像采用Nitrosight软件分析，将32/64中每个转基因植株的像素数(植株大小)和色调2(Bin2)的强度(叶片绿色)与32/64的空载体对照植株进行比较。与空载体对照幼苗相比，绿色更深和生长更好的幼苗意味着提高NUE。统计分析获得的数据，当一个重复或多个重复中在多天(试验的10-13天)的Bin2和叶面积的P值＜10^-4时，认为基因具有较弱的功能，当P值＜10^-5时，认为基因具有较强的功能。本试验中，P值＜10^-3认为基因具有阳性效应。

表33.拟南芥培养用的改良的Hoagland营养液

分子式	分子量	浓度(mM)
			KNO<sub>3</sub>	101.1	0.4
MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O	246.49	1.0
			CaCl<sub>2</sub>	110.98	2.5
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>	141.96	1.0
			K<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>	174.26	1.3
Fe-EDTA	367.1	4.6x10<sup>-3</sup>
			MES	195.2	1.0
H<sub>3</sub>BO<sub>3</sub>	61.84	12.5x10<sup>-3</sup>
			MnSO<sub>4</sub>·H<sub>2</sub>O	169.01	1.0x10<sup>-3</sup>
ZnSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O	287.5	1.0x10<sup>-3</sup>
			CuSO<sub>4</sub>·5H<sub>2</sub>O	249.71	0.25x10<sup>-3</sup>
Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O	241.95	0.25x10<sup>-3</sup>

生长室NUE试验结果：

1)如表34所示，OsDN-PPR1转基因拟南芥层积后第10天时在两个平板上和第11天时在一个平板上植株面积的P值＜10^-3，在层积后12天时一个平板上叶色P值＜10^-3。OsDN-PPR1转基因拟南芥的生长状态优于空载体转化的拟南芥。这些结果表明OsDN-PPR1转基因拟南芥在低氮培养基中的生长较对照好，CaMV 35S启动子驱动过量表达OsDN-PPR1提高了双子叶植物的低氮耐性或NUE。

如实施例5和6所示，过量表达OsDN-PPR1基因提高了转基因水稻的低氮耐性或NUE，也提高了氯酸盐敏感性，这些交叉验证试验进一步证明单子叶植物的基因(水稻OsDN-PPR1) 能够在双子叶植物拟南芥中起作用。

表34.过量表达OsDN-PPR1基因的转基因拟南芥在低氮条件下连续4天的叶面积和叶色的P 值

2)如表35所示，OsRRM1转基因拟南芥层积后第11天时在一个平板上植株面积的P值＜10^-3，层积后10天和11天时在两个平板上和12和13天时在一个平板上的叶色P值＜10^-3，表明 OsRRM1转基因拟南芥在低氮培养基上的生长优于空载体转化的拟南芥对照。这些结果表明 OsRRM1转基因拟南芥在低氮培养基中的生长较对照好，CaMV 35S启动子驱动过量表达OsRRM1 提高了双子叶植物的低氮耐性或NUE。

如实施例5和6所示，过量表达OsRRM1基因提高了转基因水稻的低氮耐性或NUE，也提高了氯酸盐敏感性，这些交叉验证试验进一步证明单子叶植物的基因(水稻OsRRM1)能够在双子叶植物拟南芥中起作用。

表35.过量表达OsRRM1基因的转基因拟南芥在低氮条件下连续4天的叶面积和叶色的P值

序列表

<110> 先锋海外公司

<120> 非生物胁迫下具有改良的农学性状的植物以及涉及非生物胁迫耐性基因的

相关构建体和方法

<130> RTS14370G

<150> PCT/CN2014/081606

<151> 2014-07-03

<160> 27

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 10952

<212> DNA

<213> 合成序列

<220>

<223> DP0005载体的核苷酸序列

<400> 1

gaattctcta gtcccgatct agtaacatag atgacaccgc gcgcgataat ttatcctagt 60

ttgcgcgcta tattttgttt tctatcgcgt attaaatgta taattgcggg actctaatca 120

taaaaaccca tctcataaat aacgtcatgc attacatgtt aattattaca tgcttaacgt 180

aattcaacag aaattatatg ataatcatcg caagaccggc aacaggattc aatcttaaga 240

aacgcggccg cttcagttgt ggcccagctt ggaggtcgac tcgcgaggat cctctagtcc 300

cgatctagta acatagatga caccgcgcgc gataatttat cctagtttgc gcgctatatt 360

ttgttttcta tcgcgtatta aatgtataat tgcgggactc taatcataaa aacccatctc 420

ataaataacg tcatgcatta catgttaatt attacatgct taacgtaatt caacagaaat 480

tatatgataa tcatcgcaag accggcaaca ggattcaatc ttaagaaacg cggccgcttc 540

agttgtggcc cagcttggag ggggcggcgt cgcagtagcg gcccacggcg gcctcgtact 600

gcttgtagca cttgcccttc tccacctcct ccaggatctc gatgcggtgg tcctcgaagt 660

ggaagccggg catcttcagg gcggaggcgg gcttcttgga gcggtaggtg gtgtgcaggt 720

ggcaggtcag gtggcgaccg ccggggcact ccagggccat cagggactgg ccgcgcagca 780

cgccgtccac ctcgtacacg atctcggtgg agggctccca gcggccggcc ttgttctgca 840

tcacggggcc gtcggcgggg aagttgttgc ccaggatctt caccttgtac accaggcagt 900

cgccgtccag ggaggtgtcc tggtgggcgg tcaggaagcc gccgtcctcg taggtggtgg 960

tgcgctccca ggtgaagccc tcggggaggg actgcttgaa gtagtcgggg atgccggaca 1020

cgtacttgat gaaggccttg gagccgtaca tgcaggaggt ggacaggatg tggaaggcga 1080

agggcagggg gccgccctcg atcacctcga tcttcatctc ctgggtgccc tccagggggt 1140

tgccctcgcc cttgccggtg cacttgaagt agtggccgtt cacggtgccc tcgatggtgg 1200

tcctgaaggg catggtcttc ttcagcaaag aggccatggt ggcgaccggt accagatctc 1260

tgcagagaga tagatttgta gagagagact ggtgatttca gcgtgtcctc tccaaatgaa 1320

atgaacttcc ttatatagag gaagggtctt gcgaaggata gtgggattgt gcgtcatccc 1380

ttacgtcagt ggagatatca catcaatcca cttgctttga agacgtggtt ggaacgtctt 1440

ctttttccac gatgctcctc gtgggtgggg gtccatcttt gggaccactg tcggcagagg 1500

catcttgaac gatagccttt cctttatcgc aatgatggca tttgtaggtg ccaccttcct 1560

tttctactgt ccttttgatg aagtgacaga tagctgggca atggaatccg aggaggtttc 1620

ccgatattac cctttgttga aaagtctcaa tagccctttg gtcttctgag actgtatctt 1680

tgatattctt ggagtagacg agagtgtcgt gctccaccat gttcacatca atccacttgc 1740

tttgaagacg tggttggaac gtcttctttt tccacgatgc tcctcgtggg tgggggtcca 1800

tctttgggac cactgtcggc agaggcatct tgaacgatag cctttccttt atcgcaatga 1860

tggcatttgt aggtgccacc ttccttttct actgtccttt tgatgaagtg acagatagct 1920

gggcaatgga atccgaggag gtttcccgat attacccttt gttgaaaagt ctcaatagcc 1980

ctttggtctt ctgagactgt atctttgata ttcttggagt agacgagagt gtcgtgctcc 2040

accatgttgc caagctgctc taagcttggc actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg 2100

ggaaaaccct ggcgttaccc aacttaatcg ccttgcagca catccccctt tcgccagctg 2160

gcgtaatagc gaagaggccc gcaccgatcg cccttcccaa cagttgcgca gcctgaatgg 2220

cgaatgctag agcagcttga gcttggatca gattgtcgtt actatcagtg tttgacagga 2280

tatattggcg ggtaaaccta agagaaaaga gcgtttatta gaataacgga tatttaaaag 2340

ggcgtgaaaa ggtttatccg ttcgtccatt tgtatgtgca tgccaaccac agggttcccc 2400

tcgggatcaa agtactttga tccaacccct ccgctgctat agtgcagtcg gcttctgacg 2460

ttcagtgcag ccgtcttctg aaaacgacat gtcgcacaag tcctaagtta cgcgacaggc 2520

tgccgccctg cccttttcct ggcgttttct tgtcgcgtgt tttagtcgca taaagtagaa 2580

tacttgcgac tagaaccgga gacattacgc catgaacaag agcgccgccg ctggcctgct 2640

gggctatgcc cgcgtcagca ccgacgacca ggacttgacc aaccaacggg ccgaactgca 2700

cgcggccggc tgcaccaagc tgttttccga gaagatcacc ggcaccaggc gcgaccgccc 2760

ggagctggcc aggatgcttg accacctacg ccctggcgac gttgtgacag tgaccaggct 2820

agaccgcctg gcccgcagca cccgcgacct actggacatt gccgagcgca tccaggaggc 2880

cggcgcgggc ctgcgtagcc tggcagagcc gtgggccgac accaccacgc cggccggccg 2940

catggtgttg accgtgttcg ccggcattgc cgagttcgag cgttccctaa tcatcgaccg 3000

cacccggagc gggcgcgagg ccgccaaggc ccgaggcgtg aagtttggcc cccgccctac 3060

cctcaccccg gcacagatcg cgcacgcccg cgagctgatc gaccaggaag gccgcaccgt 3120

gaaagaggcg gctgcactgc ttggcgtgca tcgctcgacc ctgtaccgcg cacttgagcg 3180

cagcgaggaa gtgacgccca ccgaggccag gcggcgcggt gccttccgtg aggacgcatt 3240

gaccgaggcc gacgccctgg cggccgccga gaatgaacgc caagaggaac aagcatgaaa 3300

ccgcaccagg acggccagga cgaaccgttt ttcattaccg aagagatcga ggcggagatg 3360

atcgcggccg ggtacgtgtt cgagccgccc gcgcacgtct caaccgtgcg gctgcatgaa 3420

atcctggccg gtttgtctga tgccaagctg gcggcctggc cggccagctt ggccgctgaa 3480

gaaaccgagc gccgccgtct aaaaaggtga tgtgtatttg agtaaaacag cttgcgtcat 3540

gcggtcgctg cgtatatgat gcgatgagta aataaacaaa tacgcaaggg gaacgcatga 3600

aggttatcgc tgtacttaac cagaaaggcg ggtcaggcaa gacgaccatc gcaacccatc 3660

tagcccgcgc cctgcaactc gccggggccg atgttctgtt agtcgattcc gatccccagg 3720

gcagtgcccg cgattgggcg gccgtgcggg aagatcaacc gctaaccgtt gtcggcatcg 3780

accgcccgac gattgaccgc gacgtgaagg ccatcggccg gcgcgacttc gtagtgatcg 3840

acggagcgcc ccaggcggcg gacttggctg tgtccgcgat caaggcagcc gacttcgtgc 3900

tgattccggt gcagccaagc ccttacgaca tatgggccac cgccgacctg gtggagctgg 3960

ttaagcagcg cattgaggtc acggatggaa ggctacaagc ggcctttgtc gtgtcgcggg 4020

cgatcaaagg cacgcgcatc ggcggtgagg ttgccgaggc gctggccggg tacgagctgc 4080

ccattcttga gtcccgtatc acgcagcgcg tgagctaccc aggcactgcc gccgccggca 4140

caaccgttct tgaatcagaa cccgagggcg acgctgcccg cgaggtccag gcgctggccg 4200

ctgaaattaa atcaaaactc atttgagtta atgaggtaaa gagaaaatga gcaaaagcac 4260

aaacacgcta agtgccggcc gtccgagcgc acgcagcagc aaggctgcaa cgttggccag 4320

cctggcagac acgccagcca tgaagcgggt caactttcag ttgccggcgg aggatcacac 4380

caagctgaag atgtacgcgg tacgccaagg caagaccatt accgagctgc tatctgaata 4440

catcgcgcag ctaccagagt aaatgagcaa atgaataaat gagtagatga attttagcgg 4500

ctaaaggagg cggcatggaa aatcaagaac aaccaggcac cgacgccgtg gaatgcccca 4560

tgtgtggagg aacgggcggt tggccaggcg taagcggctg ggttgtctgc cggccctgca 4620

atggcactgg aacccccaag cccgaggaat cggcgtgacg gtcgcaaacc atccggcccg 4680

gtacaaatcg gcgcggcgct gggtgatgac ctggtggaga agttgaaggc cgcgcaggcc 4740

gcccagcggc aacgcatcga ggcagaagca cgccccggtg aatcgtggca agcggccgct 4800

gatcgaatcc gcaaagaatc ccggcaaccg ccggcagccg gtgcgccgtc gattaggaag 4860

ccgcccaagg gcgacgagca accagatttt ttcgttccga tgctctatga cgtgggcacc 4920

cgcgatagtc gcagcatcat ggacgtggcc gttttccgtc tgtcgaagcg tgaccgacga 4980

gctggcgagg tgatccgcta cgagcttcca gacgggcacg tagaggtttc cgcagggccg 5040

gccggcatgg ccagtgtgtg ggattacgac ctggtactga tggcggtttc ccatctaacc 5100

gaatccatga accgataccg ggaagggaag ggagacaagc ccggccgcgt gttccgtcca 5160

cacgttgcgg acgtactcaa gttctgccgg cgagccgatg gcggaaagca gaaagacgac 5220

ctggtagaaa cctgcattcg gttaaacacc acgcacgttg ccatgcagcg tacgaagaag 5280

gccaagaacg gccgcctggt gacggtatcc gagggtgaag ccttgattag ccgctacaag 5340

atcgtaaaga gcgaaaccgg gcggccggag tacatcgaga tcgagctagc tgattggatg 5400

taccgcgaga tcacagaagg caagaacccg gacgtgctga cggttcaccc cgattacttt 5460

ttgatcgatc ccggcatcgg ccgttttctc taccgcctgg cacgccgcgc cgcaggcaag 5520

gcagaagcca gatggttgtt caagacgatc tacgaacgca gtggcagcgc cggagagttc 5580

aagaagttct gtttcaccgt gcgcaagctg atcgggtcaa atgacctgcc ggagtacgat 5640

ttgaaggagg aggcggggca ggctggcccg atcctagtca tgcgctaccg caacctgatc 5700

gagggcgaag catccgccgg ttcctaatgt acggagcaga tgctagggca aattgcccta 5760

gcaggggaaa aaggtcgaaa aggtctcttt cctgtggata gcacgtacat tgggaaccca 5820

aagccgtaca ttgggaaccg gaacccgtac attgggaacc caaagccgta cattgggaac 5880

cggtcacaca tgtaagtgac tgatataaaa gagaaaaaag gcgatttttc cgcctaaaac 5940

tctttaaaac ttattaaaac tcttaaaacc cgcctggcct gtgcataact gtctggccag 6000

cgcacagccg aagagctgca aaaagcgcct acccttcggt cgctgcgctc cctacgcccc 6060

gccgcttcgc gtcggcctat cgcggccgct ggccgctcaa aaatggctgg cctacggcca 6120

ggcaatctac cagggcgcgg acaagccgcg ccgtcgccac tcgaccgccg gcgcccacat 6180

caaggcaccc tgcctcgcgc gtttcggtga tgacggtgaa aacctctgac acatgcagct 6240

cccggagacg gtcacagctt gtctgtaagc ggatgccggg agcagacaag cccgtcaggg 6300

cgcgtcagcg ggtgttggcg ggtgtcgggg cgcagccatg acccagtcac gtagcgatag 6360

cggagtgtat actggcttaa ctatgcggca tcagagcaga ttgtactgag agtgcaccat 6420

atgcggtgtg aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag gcgctcttcc 6480

gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct 6540

cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg 6600

tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc 6660

cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga 6720

aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct 6780

cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg 6840

gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag 6900

ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat 6960

cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac 7020

aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac 7080

tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc 7140

ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt 7200

tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc 7260

ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg 7320

cattctaggt actaaaacaa ttcatccagt aaaatataat attttatttt ctcccaatca 7380

ggcttgatcc ccagtaagtc aaaaaatagc tcgacatact gttcttcccc gatatcctcc 7440

ctgatcgacc ggacgcagaa ggcaatgtca taccacttgt ccgccctgcc gcttctccca 7500

agatcaataa agccacttac tttgccatct ttcacaaaga tgttgctgtc tcccaggtcg 7560

ccgtgggaaa agacaagttc ctcttcgggc ttttccgtct ttaaaaaatc atacagctcg 7620

cgcggatctt taaatggagt gtcttcttcc cagttttcgc aatccacatc ggccagatcg 7680

ttattcagta agtaatccaa ttcggctaag cggctgtcta agctattcgt atagggacaa 7740

tccgatatgt cgatggagtg aaagagcctg atgcactccg catacagctc gataatcttt 7800

tcagggcttt gttcatcttc atactcttcc gagcaaagga cgccatcggc ctcactcatg 7860

agcagattgc tccagccatc atgccgttca aagtgcagga cctttggaac aggcagcttt 7920

ccttccagcc atagcatcat gtccttttcc cgttccacat cataggtggt ccctttatac 7980

cggctgtccg tcatttttaa atataggttt tcattttctc ccaccagctt atatacctta 8040

gcaggagaca ttccttccgt atcttttacg cagcggtatt tttcgatcag ttttttcaat 8100

tccggtgata ttctcatttt agccatttat tatttccttc ctcttttcta cagtatttaa 8160

agatacccca agaagctaat tataacaaga cgaactccaa ttcactgttc cttgcattct 8220

aaaaccttaa ataccagaaa acagcttttt caaagttgtt ttcaaagttg gcgtataaca 8280

tagtatcgac ggagccgatt ttgaaaccgc ggtgatcaca ggcagcaacg ctctgtcatc 8340

gttacaatca acatgctacc ctccgcgaga tcatccgtgt ttcaaacccg gcagcttagt 8400

tgccgttctt ccgaatagca tcggtaacat gagcaaagtc tgccgcctta caacggctct 8460

cccgctgacg ccgtcccgga ctgatgggct gcctgtatcg agtggtgatt ttgtgccgag 8520

ctgccggtcg gggagctgtt ggctggctgg tggcaggata tattgtggtg taaacaaatt 8580

gacgcttaga caacttaata acacattgcg gacgttttta atgtactgaa ttaacgccga 8640

attaattcgg gggatctgga ttttagtact ggattttggt tttaggaatt agaaatttta 8700

ttgatagaag tattttacaa atacaaatac atactaaggg tttcttatat gctcaacaca 8760

tgagcgaaac cctataggaa ccctaattcc cttatctggg aactactcac acattattat 8820

ggagaaactc gagcttgtcg atcgacagat ccggtcggca tctactctat ttctttgccc 8880

tcggacgagt gctggggcgt cggtttccac tatcggcgag tacttctaca cagccatcgg 8940

tccagacggc cgcgcttctg cgggcgattt gtgtacgccc gacagtcccg gctccggatc 9000

ggacgattgc gtcgcatcga ccctgcgccc aagctgcatc atcgaaattg ccgtcaacca 9060

agctctgata gagttggtca agaccaatgc ggagcatata cgcccggagt cgtggcgatc 9120

ctgcaagctc cggatgcctc cgctcgaagt agcgcgtctg ctgctccata caagccaacc 9180

acggcctcca gaagaagatg ttggcgacct cgtattggga atccccgaac atcgcctcgc 9240

tccagtcaat gaccgctgtt atgcggccat tgtccgtcag gacattgttg gagccgaaat 9300

ccgcgtgcac gaggtgccgg acttcggggc agtcctcggc ccaaagcatc agctcatcga 9360

gagcctgcgc gacggacgca ctgacggtgt cgtccatcac agtttgccag tgatacacat 9420

ggggatcagc aatcgcgcat atgaaatcac gccatgtagt gtattgaccg attccttgcg 9480

gtccgaatgg gccgaacccg ctcgtctggc taagatcggc cgcagcgatc gcatccatag 9540

cctccgcgac cggttgtaga acagcgggca gttcggtttc aggcaggtct tgcaacgtga 9600

caccctgtgc acggcgggag atgcaatagg tcaggctctc gctaaactcc ccaatgtcaa 9660

gcacttccgg aatcgggagc gcggccgatg caaagtgccg ataaacataa cgatctttgt 9720

agaaaccatc ggcgcagcta tttacccgca ggacatatcc acgccctcct acatcgaagc 9780

tgaaagcacg agattcttcg ccctccgaga gctgcatcag gtcggagacg ctgtcgaact 9840

tttcgatcag aaacttctcg acagacgtcg cggtgagttc aggctttttc atatctcatt 9900

gccccccggg atctgcgaaa gctcgagaga gatagatttg tagagagaga ctggtgattt 9960

cagcgtgtcc tctccaaatg aaatgaactt ccttatatag aggaaggtct tgcgaaggat 10020

agtgggattg tgcgtcatcc cttacgtcag tggagatatc acatcaatcc acttgctttg 10080

aagacgtggt tggaacgtct tctttttcca cgatgctcct cgtgggtggg ggtccatctt 10140

tgggaccact gtcggcagag gcatcttgaa cgatagcctt tcctttatcg caatgatggc 10200

atttgtaggt gccaccttcc ttttctactg tccttttgat gaagtgacag atagctgggc 10260

aatggaatcc gaggaggttt cccgatatta ccctttgttg aaaagtctca atagcccttt 10320

ggtcttctga gactgtatct ttgatattct tggagtagac gagagtgtcg tgctccacca 10380

tgttatcaca tcaatccact tgctttgaag acgtggttgg aacgtcttct ttttccacga 10440

tgctcctcgt gggtgggggt ccatctttgg gaccactgtc ggcagaggca tcttgaacga 10500

tagcctttcc tttatcgcaa tgatggcatt tgtaggtgcc accttccttt tctactgtcc 10560

ttttgatgaa gtgacagata gctgggcaat ggaatccgag gaggtttccc gatattaccc 10620

tttgttgaaa agtctcaata gccctttggt cttctgagac tgtatctttg atattcttgg 10680

agtagacgag agtgtcgtgc tccaccatgt tggcaagctg ctctagccaa tacgcaaacc 10740

gcctctcccc gcgcgttggc cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg 10800

gaaagcgggc agtgagcgca acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca 10860

ggctttacac tttatgcttc cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt 10920

tcacacagga aacagctatg accatgatta cg 10952

<210> 2

<211> 16843

<212> DNA

<213> 合成序列

<220>

<223> pBC-yellow载体的核苷酸序列

<400> 2

ccgggctggt tgccctcgcc gctgggctgg cggccgtcta tggccctgca aacgcgccag 60

aaacgccgtc gaagccgtgt gcgagacacc gcggccgccg gcgttgtgga tacctcgcgg 120

aaaacttggc cctcactgac agatgagggg cggacgttga cacttgaggg gccgactcac 180

ccggcgcggc gttgacagat gaggggcagg ctcgatttcg gccggcgacg tggagctggc 240

cagcctcgca aatcggcgaa aacgcctgat tttacgcgag tttcccacag atgatgtgga 300

caagcctggg gataagtgcc ctgcggtatt gacacttgag gggcgcgact actgacagat 360

gaggggcgcg atccttgaca cttgaggggc agagtgctga cagatgaggg gcgcacctat 420

tgacatttga ggggctgtcc acaggcagaa aatccagcat ttgcaagggt ttccgcccgt 480

ttttcggcca ccgctaacct gtcttttaac ctgcttttaa accaatattt ataaaccttg 540

tttttaacca gggctgcgcc ctgtgcgcgt gaccgcgcac gccgaagggg ggtgcccccc 600

cttctcgaac cctcccggcc cgctaacgcg ggcctcccat ccccccaggg gctgcgcccc 660

tcggccgcga acggcctcac cccaaaaatg gcagcgctgg cagtccttgc cattgccggg 720

atcggggcag taacgggatg ggcgatcagc ccgagcgcga cgcccggaag cattgacgtg 780

ccgcaggtgc tggcatcgac attcagcgac caggtgccgg gcagtgaggg cggcggcctg 840

ggtggcggcc tgcccttcac ttcggccgtc ggggcattca cggacttcat ggcggggccg 900

gcaattttta ccttgggcat tcttggcata gtggtcgcgg gtgccgtgct cgtgttcggg 960

ggtgcgataa acccagcgaa ccatttgagg tgataggtaa gattataccg aggtatgaaa 1020

acgagaattg gacctttaca gaattactct atgaagcgcc atatttaaaa agctaccaag 1080

acgaagagga tgaagaggat gaggaggcag attgccttga atatattgac aatactgata 1140

agataatata tcttttatat agaagatatc gccgtatgta aggatttcag ggggcaaggc 1200

ataggcagcg cgcttatcaa tatatctata gaatgggcaa agcataaaaa cttgcatgga 1260

ctaatgcttg aaacccagga caataacctt atagcttgta aattctatca taattgggta 1320

atgactccaa cttattgata gtgttttatg ttcagataat gcccgatgac tttgtcatgc 1380

agctccaccg attttgagaa cgacagcgac ttccgtccca gccgtgccag gtgctgcctc 1440

agattcaggt tatgccgctc aattcgctgc gtatatcgct tgctgattac gtgcagcttt 1500

cccttcaggc gggattcata cagcggccag ccatccgtca tccatatcac cacgtcaaag 1560

ggtgacagca ggctcataag acgccccagc gtcgccatag tgcgttcacc gaatacgtgc 1620

gcaacaaccg tcttccggag actgtcatac gcgtaaaaca gccagcgctg gcgcgattta 1680

gccccgacat agccccactg ttcgtccatt tccgcgcaga cgatgacgtc actgcccggc 1740

tgtatgcgcg aggttaccga ctgcggcctg agttttttaa gtgacgtaaa atcgtgttga 1800

ggccaacgcc cataatgcgg gctgttgccc ggcatccaac gccattcatg gccatatcaa 1860

tgattttctg gtgcgtaccg ggttgagaag cggtgtaagt gaactgcagt tgccatgttt 1920

tacggcagtg agagcagaga tagcgctgat gtccggcggt gcttttgccg ttacgcacca 1980

ccccgtcagt agctgaacag gagggacagc tgatagacac agaagccact ggagcacctc 2040

aaaaacacca tcatacacta aatcagtaag ttggcagcat cacccataat tgtggtttca 2100

aaatcggctc cgtcgatact atgttatacg ccaactttga aaacaacttt gaaaaagctg 2160

ttttctggta tttaaggttt tagaatgcaa ggaacagtga attggagttc gtcttgttat 2220

aattagcttc ttggggtatc tttaaatact gtagaaaaga ggaaggaaat aataaatggc 2280

taaaatgaga atatcaccgg aattgaaaaa actgatcgaa aaataccgct gcgtaaaaga 2340

tacggaagga atgtctcctg ctaaggtata taagctggtg ggagaaaatg aaaacctata 2400

tttaaaaatg acggacagcc ggtataaagg gaccacctat gatgtggaac gggaaaagga 2460

catgatgcta tggctggaag gaaagctgcc tgttccaaag gtcctgcact ttgaacggca 2520

tgatggctgg agcaatctgc tcatgagtga ggccgatggc gtcctttgct cggaagagta 2580

tgaagatgaa caaagccctg aaaagattat cgagctgtat gcggagtgca tcaggctctt 2640

tcactccatc gacatatcgg attgtcccta tacgaatagc ttagacagcc gcttagccga 2700

attggattac ttactgaata acgatctggc cgatgtggat tgcgaaaact gggaagaaga 2760

cactccattt aaagatccgc gcgagctgta tgatttttta aagacggaaa agcccgaaga 2820

ggaacttgtc ttttcccacg gcgacctggg agacagcaac atctttgtga aagatggcaa 2880

agtaagtggc tttattgatc ttgggagaag cggcagggcg gacaagtggt atgacattgc 2940

cttctgcgtc cggtcgatca gggaggatat cggggaagaa cagtatgtcg agctattttt 3000

tgacttactg gggatcaagc ctgattggga gaaaataaaa tattatattt tactggatga 3060

attgttttag tacctagatg tggcgcaacg atgccggcga caagcaggag cgcaccgact 3120

tcttccgcat caagtgtttt ggctctcagg ccgaggccca cggcaagtat ttgggcaagg 3180

ggtcgctggt attcgtgcag ggcaagattc ggaataccaa gtacgagaag gacggccaga 3240

cggtctacgg gaccgacttc attgccgata aggtggatta tctggacacc aaggcaccag 3300

gcgggtcaaa tcaggaataa gggcacattg ccccggcgtg agtcggggca atcccgcaag 3360

gagggtgaat gaatcggacg tttgaccgga aggcatacag gcaagaactg atcgacgcgg 3420

ggttttccgc cgaggatgcc gaaaccatcg caagccgcac cgtcatgcgt gcgccccgcg 3480

aaaccttcca gtccgtcggc tcgatggtcc agcaagctac ggccaagatc gagcgcgaca 3540

gcgtgcaact ggctccccct gccctgcccg cgccatcggc cgccgtggag cgttcgcgtc 3600

gtctcgaaca ggaggcggca ggtttggcga agtcgatgac catcgacacg cgaggaacta 3660

tgacgaccaa gaagcgaaaa accgccggcg aggacctggc aaaacaggtc agcgaggcca 3720

agcaggccgc gttgctgaaa cacacgaagc agcagatcaa ggaaatgcag ctttccttgt 3780

tcgatattgc gccgtggccg gacacgatgc gagcgatgcc aaacgacacg gcccgctctg 3840

ccctgttcac cacgcgcaac aagaaaatcc cgcgcgaggc gctgcaaaac aaggtcattt 3900

tccacgtcaa caaggacgtg aagatcacct acaccggcgt cgagctgcgg gccgacgatg 3960

acgaactggt gtggcagcag gtgttggagt acgcgaagcg cacccctatc ggcgagccga 4020

tcaccttcac gttctacgag ctttgccagg acctgggctg gtcgatcaat ggccggtatt 4080

acacgaaggc cgaggaatgc ctgtcgcgcc tacaggcgac ggcgatgggc ttcacgtccg 4140

accgcgttgg gcacctggaa tcggtgtcgc tgctgcaccg cttccgcgtc ctggaccgtg 4200

gcaagaaaac gtcccgttgc caggtcctga tcgacgagga aatcgtcgtg ctgtttgctg 4260

gcgaccacta cacgaaattc atatgggaga agtaccgcaa gctgtcgccg acggcccgac 4320

ggatgttcga ctatttcagc tcgcaccggg agccgtaccc gctcaagctg gaaaccttcc 4380

gcctcatgtg cggatcggat tccacccgcg tgaagaagtg gcgcgagcag gtcggcgaag 4440

cctgcgaaga gttgcgaggc agcggcctgg tggaacacgc ctgggtcaat gatgacctgg 4500

tgcattgcaa acgctagggc cttgtggggt cagttccggc tgggggttca gcagccagcg 4560

ctttactggc atttcaggaa caagcgggca ctgctcgacg cacttgcttc gctcagtatc 4620

gctcgggacg cacggcgcgc tctacgaact gccgataaac agaggattaa aattgacaat 4680

tgtgattaag gctcagattc gacggcttgg agcggccgac gtgcaggatt tccgcgagat 4740

ccgattgtcg gccctgaaga aagctccaga gatgttcggg tccgtttacg agcacgagga 4800

gaaaaagccc atggaggcgt tcgctgaacg gttgcgagat gccgtggcat tcggcgccta 4860

catcgacggc gagatcattg ggctgtcggt cttcaaacag gaggacggcc ccaaggacgc 4920

tcacaaggcg catctgtccg gcgttttcgt ggagcccgaa cagcgaggcc gaggggtcgc 4980

cggtatgctg ctgcgggcgt tgccggcggg tttattgctc gtgatgatcg tccgacagat 5040

tccaacggga atctggtgga tgcgcatctt catcctcggc gcacttaata tttcgctatt 5100

ctggagcttg ttgtttattt cggtctaccg cctgccgggc ggggtcgcgg cgacggtagg 5160

cgctgtgcag ccgctgatgg tcgtgttcat ctctgccgct ctgctaggta gcccgatacg 5220

attgatggcg gtcctggggg ctatttgcgg aactgcgggc gtggcgctgt tggtgttgac 5280

accaaacgca gcgctagatc ctgtcggcgt cgcagcgggc ctggcggggg cggtttccat 5340

ggcgttcgga accgtgctga cccgcaagtg gcaacctccc gtgcctctgc tcacctttac 5400

cgcctggcaa ctggcggccg gaggacttct gctcgttcca gtagctttag tgtttgatcc 5460

gccaatcccg atgcctacag gaaccaatgt tctcggcctg gcgtggctcg gcctgatcgg 5520

agcgggttta acctacttcc tttggttccg ggggatctcg cgactcgaac ctacagttgt 5580

ttccttactg ggctttctca gccccagatc tggggtcgat cagccgggga tgcatcaggc 5640

cgacagtcgg aacttcgggt ccccgacctg taccattcgg tgagcaatgg ataggggagt 5700

tgatatcgtc aacgttcact tctaaagaaa tagcgccact cagcttcctc agcggcttta 5760

tccagcgatt tcctattatg tcggcatagt tctcaagatc gacagcctgt cacggttaag 5820

cgagaaatga ataagaaggc tgataattcg gatctctgcg agggagatga tatttgatca 5880

caggcagcaa cgctctgtca tcgttacaat caacatgcta ccctccgcga gatcatccgt 5940

gtttcaaacc cggcagctta gttgccgttc ttccgaatag catcggtaac atgagcaaag 6000

tctgccgcct tacaacggct ctcccgctga cgccgtcccg gactgatggg ctgcctgtat 6060

cgagtggtga ttttgtgccg agctgccggt cggggagctg ttggctggct ggtggcagga 6120

tatattgtgg tgtaaacaaa ttgacgctta gacaacttaa taacacattg cggacgtttt 6180

taatgtactg gggtggtttt tcttttcacc agtgagacgg gcaacagctg attgcccttc 6240

accgcctggc cctgagagag ttgcagcaag cggtccacgc tggtttgccc cagcaggcga 6300

aaatcctgtt tgatggtggt tccgaaatcg gcaaaatccc ttataaatca aaagaatagc 6360

ccgagatagg gttgagtgtt gttccagttt ggaacaagag tccactatta aagaacgtgg 6420

actccaacgt caaagggcga aaaaccgtct atcagggcga tggcccacta cctgtatggc 6480

cgcattcgca aaacacacct agactagatt tgttttgcta acccaattga tattaattat 6540

atatgattaa tatttatatg tatatggatt tggttaatga aatgcatctg gttcatcaaa 6600

gaattataaa gacacgtgac attcatttag gataagaaat atggatgatc tctttctctt 6660

ttattcagat aactagtaat tacacataac acacaacttt gatgcccaca ttatagtgat 6720

tagcatgtca ctatgtgtgc atccttttat ttcatacatt aattaagttg gccaatccag 6780

aagatggaca agtctaggtt aaccatgtgg tacctacgcg ttcgaatatc catgggccgc 6840

ttcaggccag ggcgctgggg aaggcgatgg cgtgctcggt cagctgccac ttctggttct 6900

tggcgtcgct ccggtcctcc cgcagcagct tgtgctggat gaagtgccac tcgggcatct 6960

tgctgggcac gctcttggcc ttgtacacgg tgtcgaactg gcaccggtac cggccgccgt 7020

ccttcagcag caggtacatg ctcacgtcgc ccttcaggat gccctgctta ggcacgggca 7080

tgatcttctc gcagctggcc tcccagttgg tggtcatctt cttcatcacg gggccgtcgg 7140

cggggaagtt cacgccgttg aagatgctct tgtggtagat gcagttctcc ttcacgctca 7200

cggtgatgtc cacgttacag atgcacacgg cgccgtcctc gaacaggaag ctccggcccc 7260

aggtgtagcc ggcggggcag ctgttcttga agtagtccac gatgtcctgg gggtactcgg 7320

tgaagatccg gtcgccgtac ttgaagccgg cgctcaggat gtcctcgctg aagggcaggg 7380

ggccgccctc gatcacgcac aggttgatgg tctgcttgcc cttgaagggg tagccgatgc 7440

cctcgccggt gatcacgaac ttgtggccgt tcacgcagcc ctccatgtgg tacttcatgg 7500

tcatctcctc cttcaggccg tgcttgctgt gggccatggt ggcgaccggt gaattcgagc 7560

tcggtacccg gggatcctga gtaaaacaga ggagggtctc actaagttta tagagagact 7620

gagagagata aagggacacg tatgaagcgt ctgttttcgt ggtgtgacgt caaagtcatt 7680

ttgctctcta cgcgtgtctg tgtcggcttg atcttttttt ttgctttttg gaactcatgt 7740

cggtagtata tcttttattt attttttctt tttttccctt ttctttcaaa ctgatgtcgg 7800

tatgatattt attccatcct aaaatgtaac ttactattat tagtagtcgg tccatgtcta 7860

ttggcccatc atgtggtcat tttacgttta cgtcgtgtgg ctgtttatta taacaaacgg 7920

cacatccttc tcattcgaat tgtatttctc cttaatcgtt ctaataggta tgatctttta 7980

ttttatacgt aaaattaaaa ttgaatgatg tcaagaacga aaattaattt gtatttacaa 8040

aggagctaaa tattgtttat tcctctactg gtagaagata aaagaagtag atgaaataat 8100

gatcttacta gagaatattc ctcatttaca ctagtcaaat ggaaatcttg taaactttta 8160

caataattta tcctgaaaat atgaaaaaat agaagaaaat gtttacctcc tctctcctct 8220

taattcacct acgatcggtg cgggcctctt cgctattacg ccagctggcg aaagggggat 8280

gtgctgcaag gcgattaagt tgggtaacgc cagggttttc ccagtcacga cgttgtaaaa 8340

cgacggccag tgaattcgag ctcggtaccc ggggatcctc tagagtcgac ctgcaggcat 8400

gcaagcttgt tgaaacatcc ctgaagtgtc tcattttatt ttatttattc tttgctgata 8460

aaaaaataaa ataaaagaag ctaagcacac ggtcaaccat tgctctactg ctaaaagggt 8520

tatgtgtagt gttttactgc ataaattatg cagcaaacaa gacaactcaa attaaaaaat 8580

ttcctttgct tgtttttttg ttgtctctga cttgactttc ttgtggaagt tggttgtata 8640

aggattggga cacaccattg tccttcttaa tttaatttta tttctttgct gataaaaaaa 8700

aaaaatttca tatagtgtta aataataatt tgttaaataa ccaaaaagtc aaatatgttt 8760

actctcgttt aaataattga gagtcgtcca gcaaggctaa acgattgtat agatttatga 8820

caatatttac ttttttatag ataaatgtta tattataata aatttatata catatattat 8880

atgttattta ttatttatta ttattttaaa tccttcaata ttttatcaaa ccaactcata 8940

attttttttt tatctgtaag aagcaataaa attaaataga cccactttaa ggatgatcca 9000

acctttatac agagtaagag agttcaaata gtaccctttc atatacatat caactaaaat 9060

attagaaata tcatggatca aaccttataa agacattaaa taagtggata agtataatat 9120

ataaatgggt agtatataat atataaatgg atacaaactt ctctctttat aattgttatg 9180

tctccttaac atcctaatat aatacataag tgggtaatat ataatatata aatggagaca 9240

aacttcttcc attataattg ttatgtcttc ttaacactta tgtctcgttc acaatgctaa 9300

agttagaatt gtttagaaag tcttatagta cacatttgtt tttgtactat ttgaagcatt 9360

ccataagccg tcacgattca gatgatttat aataataaga ggaaatttat catagaacaa 9420

taaggtgcat agatagagtg ttaatatatc ataacatcct ttgtttattc atagaagaag 9480

tgagatggag ctcagttatt atactgttac atggtcggat acaatattcc atgctctcca 9540

tgagctctta cacctacatg cattttagtt catacttcat gcacgtggcc atcacagcta 9600

gctgcagcta catatttaca ttttacaaca ccaggagaac tgccctgtta gtgcataaca 9660

atcagaagat ggccgtggct actcgagtta tcgaaccact ttgtacaaga aagctgaacg 9720

agaaacgtaa aatgatataa atatcaatat attaaattag attttgcata aaaaacagac 9780

tacataatac tgtaaaacac aacatatcca gtcactatgg tcgacctgca gactggctgt 9840

gtataaggga gcctgacatt tatattcccc agaacatcag gttaatggcg tttttgatgt 9900

cattttcgcg gtggctgaga tcagccactt cttccccgat aacggagacc ggcacactgg 9960

ccatatcggt ggtcatcatg cgccagcttt catccccgat atgcaccacc gggtaaagtt 10020

cacgggagac tttatctgac agcagacgtg cactggccag ggggatcacc atccgtcgcc 10080

cgggcgtgtc aataatatca ctctgtacat ccacaaacag acgataacgg ctctctcttt 10140

tataggtgta aaccttaaac tgcatttcac cagtccctgt tctcgtcagc aaaagagccg 10200

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acatcatata tgccttgagc aactgatagc tgtcgctgtc aactgtcact gtaatacgct 10380

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tctagattac gccccgccct gccactcatc gcagtactgt tgtaattcat taagcattct 10560

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cttgtcgcct tgcgtataat atttgcccat ggtgaaaacg ggggcgaaga agttgtccat 10680

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catattctca ataaaccctt tagggaaata ggccaggttt tcaccgtaac acgccacatc 10800

ttgcgaatat atgtgtagaa actgccggaa atcgtcgtgg tattcactcc agagcgatga 10860

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cgtaatatcc agctgaacgg tctggttata ggtacattga gcaactgact gaaatgcctc 11100

aaaatgttct ttacgatgcc attgggatat atcaacggtg gtatatccag tgattttttt 11160

ctccatttta gcttccttag ctcctgaaaa tctcgccgga tcctaactca aaatccacac 11220

attatacgag ccggaagcat aaagtgtaaa gcctggggtg cctaatgcgg ccgccatagt 11280

gactggatat gttgtgtttt acagtattat gtagtctgtt ttttatgcaa aatctaattt 11340

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tgataaccgg tactagtgtg cacgtcgagc gtgtcctctc caaatgaaat gaacttcctt 11460

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agatgtcaca tcaatccact tgctttgaag acgtggttgg aacgtcttct ttttccacga 11580

tgctcctcgt gggtgggggt ccatctttgg gaccactgtc ggcagaggca tcttgaatga 11640

tagcctttcc tttatcgcaa tgatggcatt tgtaggagcc accttccttt tctactgtcc 11700

tttcgatgaa gtgacagata gctgggcaat ggaatccgag gaggtttccc gaaattatcc 11760

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agtagaccag agtgtcgtgc tccaccatgt tgacgaagat tttcttcttg tcattgagtc 11880

gtaaaagact ctgtatgaac tgttcgccag tcttcacggc gagttctgtt agatcctcga 11940

tttgaatctt agactccatg catggcctta gattcagtag gaactacctt tttagagact 12000

ccaatctcta ttacttgcct tggtttatga agcaagcctt gaatcgtcca tactggaata 12060

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ccgttataca caacgtagta gttgatatga gggtgttgaa tacccgattc tgctctgaga 12720

ggagcaactg tgctgttaag ctcagatttt tgtgggattg gaattggatc ctctagagca 12780

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tccacacaac atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag 12900

ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg 12960

ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggccaaa 13020

gacaaaaggg cgacattcaa ccgattgagg gagggaaggt aaatattgac ggaaattatt 13080

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tagtaacata gatgacaccg cgcgcgataa tttatcctag tttgcgcgct atattttgtt 13260

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taacgtcatg cattacatgt taattattac atgcttaacg taattcaaca gaaattatat 13380

gataatcatc gcaagaccgg caacaggatt caatcttaag aaactttatt gccaaatgtt 13440

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agcatttttg acaagaaata tttgctagct gatagtgacc ttaggcgact tttgaacgcg 14160

caataatggt ttctgacgta tgtgcttagc tcattaaact ccagaaaccc gcggctgagt 14220

ggctccttca acgttgcggt tctgtcagtt ccaaacgtaa aacggcttgt cccgcgtcat 14280

cggcgggggt cataacgtga ctcccttaat tctccgctca tgatcagatt gtcgtttccc 14340

gccttcagtt taaactatca gtgtttgaca ggatatattg gcgggtaaac ctaagagaaa 14400

agagcgttta ttagaataat cggatattta aaagggcgtg aaaaggttta tccgttcgtc 14460

catttgtatg tgcatgccaa ccacagggtt ccccagatct ggcgccggcc agcgagacga 14520

gcaagattgg ccgccgcccg aaacgatccg acagcgcgcc cagcacaggt gcgcaggcaa 14580

attgcaccaa cgcatacagc gccagcagaa tgccatagtg ggcggtgacg tcgttcgagt 14640

gaaccagatc gcgcaggagg cccggcagca ccggcataat caggccgatg ccgacagcgt 14700

cgagcgcgac agtgctcaga attacgatca ggggtatgtt gggtttcacg tctggcctcc 14760

ggaccagcct ccgctggtcc gattgaacgc gcggattctt tatcactgat aagttggtgg 14820

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gatccgtgcc gccctggacc tgttgaacga ggtcggcgta gacggtctga cgacacgcaa 14940

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gggactcgcg gtgattgtcg atggattggc gaaaaggagg ctcgttgtca ggaacgttga 15480

aggaccgaga aagggtgacg attgatcagg accgctgccg gagcgcaacc cactcactac 15540

agcagagcca tgtagacaac atcccctccc cctttccacc gcgtcagacg cccgtagcag 15600

cccgctacgg gctttttcat gccctgccct agcgtccaag cctcacggcc gcgctcggcc 15660

tctctggcgg ccttctggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc 15720

gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa 15780

tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt 15840

aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa 15900

aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt 15960

ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg 16020

tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg cttttccgct gcataaccct gcttcggggt 16080

cattatagcg attttttcgg tatatccatc ctttttcgca cgatatacag gattttgcca 16140

aagggttcgt gtagactttc cttggtgtat ccaacggcgt cagccgggca ggataggtga 16200

agtaggccca cccgcgagcg ggtgttcctt cttcactgtc ccttattcgc acctggcggt 16260

gctcaacggg aatcctgctc tgcgaggctg gccggctacc gccggcgtaa cagatgaggg 16320

caagcggatg gctgatgaaa ccaagccaac caggaagggc agcccaccta tcaaggtgta 16380

ctgccttcca gacgaacgaa gagcgattga ggaaaaggcg gcggcggccg gcatgagcct 16440

gtcggcctac ctgctggccg tcggccaggg ctacaaaatc acgggcgtcg tggactatga 16500

gcacgtccgc gagctggccc gcatcaatgg cgacctgggc cgcctgggcg gcctgctgaa 16560

actctggctc accgacgacc cgcgcacggc gcggttcggt gatgccacga tcctcgccct 16620

gctggcgaag atcgaagaga agcaggacga gcttggcaag gtcatgatgg gcgtggtccg 16680

cccgagggca gagccatgac ttttttagcc gctaaaacgg ccggggggtg cgcgtgattg 16740

ccaagcacgt ccccatgcgc tccatcaaga agagcgactt cgcggagctg gtgaagtaca 16800

tcaccgacga gcaaggcaag accgagcgcc tttgcgacgc tca 16843

<210> 3

<211> 1921

<212> DNA

<213> 合成序列

<220>

<223> DsRed表达盒的核苷酸序列

<400> 3

cgaagctggc cgctctagaa ctagtggatc tcgatgtgta gtctacgaga agggttaacc 60

gtctcttcgt gagaataacc gtggcctaaa aataagccga tgaggataaa taaaatgtgg 120

tggtacagta cttcaagagg tttactcatc aagaggatgc ttttccgatg agctctagta 180

gtacatcgga cctcacatac ctccattgtg gtgaaatatt ttgtgctcat ttagtgatgg 240

gtaaattttg tttatgtcac tctaggtttt gacatttcag ttttgccact cttaggtttt 300

gacaaataat ttccattccg cggcaaaagc aaaacaattt tattttactt ttaccactct 360

tagctttcac aatgtatcac aaatgccact ctagaaattc tgtttatgcc acagaatgtg 420

aaaaaaaaca ctcacttatt tgaagccaag gtgttcatgg catggaaatg tgacataaag 480

taacgttcgt gtataagaaa aaattgtact cctcgtaaca agagacggaa acatcatgag 540

acaatcgcgt ttggaaggct ttgcatcacc tttggatgat gcgcatgaat ggagtcgtct 600

gcttgctagc cttcgcctac cgcccactga gtccgggcgg caactaccat cggcgaacga 660

cccagctgac ctctaccgac cggacttgaa tgcgctacct tcgtcagcga cgatggccgc 720

gtacgctggc gacgtgcccc cgcatgcatg gcggcacatg gcgagctcag accgtgcgtg 780

gctggctaca aatacgtacc ccgtgagtgc cctagctaga aacttacacc tgcaactgcg 840

agagcgagcg tgtgagtgta gccgagtaga tcctcgccac catggcctcc tccgagaacg 900

tcatcaccga gttcatgcgc ttcaaggtgc gcatggaggg caccgtgaac ggccacgagt 960

tcgagatcga gggcgagggc gagggccgcc cctacgaggg ccacaacacc gtgaagctga 1020

aggtgacgaa gggcggcccc ctgcccttcg cctgggacat cctgtccccc cagttccagt 1080

acggctccaa ggtgtacgtg aagcaccccg ccgacatccc cgactacaag aagctgtcct 1140

tccccgaggg cttcaagtgg gagcgcgtga tgaacttcga ggacggcggc gtggcgaccg 1200

tgacccagga ctcctccctg caggacggct gcttcatcta caaggtgaag ttcatcggcg 1260

tgaacttccc ctccgacggc cccgtgatgc agaagaagac catgggctgg gaggcctcca 1320

ccgagcgcct gtacccccgc gacggcgtgc tgaagggcga gacccacaag gccctgaagc 1380

tgaaggacgg cggccactac ctggtggagt tcaagtccat ctacatggcc aagaagcccg 1440

tgcagctgcc cggctactac tacgtggacg ccaagctgga catcacctcc cacaacgagg 1500

actacaccat cgtggagcag tacgagcgca ccgagggccg ccaccacctg ttcctgtagc 1560

ggcccatgga tattcgaacg cgtaggtacc acatggttaa cctagacttg tccatcttct 1620

ggattggcca acttaattaa tgtatgaaat aaaaggatgc acacatagtg acatgctaat 1680

cactataatg tgggcatcaa agttgtgtgt tatgtgtaat tactagttat ctgaataaaa 1740

gagaaagaga tcatccatat ttcttatcct aaatgaatgt cacgtgtctt tataattctt 1800

tgatgaacca gatgcatttc attaaccaaa tccatataca tataaatatt aatcatatat 1860

aattaatatc aattgggtta gcaaaacaaa tctagtctag gtgtgttttg cgaatgcggc 1920

c 1921

<210> 4

<211> 1444

<212> DNA

<213> 水稻

<400> 4

gagcgaactg cttggttggg aatggcggcg cccgtggccg gccgcctctc cgggctcctc 60

cggcgatgcg cggcggccgg ggcggtccgg ccgggagagc aggcgcacgc gagggcggtg 120

gtgggcgggt ggctccccga cgccaccctg gagaccgacc tcgtgctgat gtactgcagg 180

tgcggcgagc gtcggcgcgc acgcagggtg ttcgacggaa tgcgtgcgcc gtccatgcac 240

gcgtacaacg tgctcctcgc ggcgtcgcct ccccgcgacg cgatggaggt gttctcccgc 300

ctcctcgcgt cggggctccg ccctgacggt tactctgtcc ccgccgtggt acgtgcctgc 360

gctgagctcc ccgacgcggt gcttggcggg gtgatccacg gcttcgccgt ccggctcggc 420

ttgatgggga acgttgttgt ggccgctgcg cttctggata tgtatgccaa ggctggtttc 480

ctggatgatg cggtgagggt gttcgacgag atgacggaga gggatgctgt cgtctggaac 540

tgcatggttg cagggtatgc gagggctggg agggcagtag aaacctttga gattttcagc 600

agagcgcagg ttgaggcggt gaacatggtg aatggtctgc aggctgtgcc cagcgtgttg 660

aatatctgcg cgaaggaagg ggagctgatg aagggtaggg aaatccatgg taggatggtg 720

aggtgccttg catttgattc ggatatcgca gtggggaacg ctttgatcaa catgtatgca 780

aagtgcggcc gggtcaatgt atcacaagca gtgttttctg gcatgcagca gagggatgtg 840

gtgagctggt ctacaatgat tcatagctac agcattcatg gcaaggggga acaggcattg 900

aaggtttaca tggaaatgtt gtctgaggga gtgaaaccaa attggatcac attcacatca 960

gttctgtcaa gttgcagcca ctccgggctt gtaaccgagg gtcggaagat cttcgagtcg 1020

atgactaagg ttcatggtgt ccaccctgct gctgagcact atgcatgtat ggttgacctc 1080

ttagggcgtg ctggagccat tgaagaagct gttgggctta taaggaagat gcccatggaa 1140

ccttgtgcta gcgtgtgggg agctttgctc tctgcatgtg ctatgcataa taacgtcgat 1200

gttggagaga ttgcagcttt taggctattt gagttagaag aaggcagtgc tagcaattat 1260

gttaccctct gtggaattta tgacgcagtt ggtcaatctg atggtgttgc agggttgaga 1320

tcaaggatga gagaactcgg catggtgaag acgcctgggt gcagtcggat cgatgtgaag 1380

ggaagagctc atgctttcta ccaggggagc atcccacgtt atttgaggag atgaatgctt 1440

tggg 1444

<210> 5

<211> 1413

<212> DNA

<213> 水稻

<400> 5

atggcggcgc ccgtggccgg ccgcctctcc gggctcctcc ggcgatgcgc ggcggccggg 60

gcggtccggc cgggagagca ggcgcacgcg agggcggtgg tgggcgggtg gctccccgac 120

gccaccctgg agaccgacct cgtgctgatg tactgcaggt gcggcgagcg tcggcgcgca 180

cgcagggtgt tcgacggaat gcgtgcgccg tccatgcacg cgtacaacgt gctcctcgcg 240

gcgtcgcctc cccgcgacgc gatggaggtg ttctcccgcc tcctcgcgtc ggggctccgc 300

cctgacggtt actctgtccc cgccgtggta cgtgcctgcg ctgagctccc cgacgcggtg 360

cttggcgggg tgatccacgg cttcgccgtc cggctcggct tgatggggaa cgttgttgtg 420

gccgctgcgc ttctggatat gtatgccaag gctggtttcc tggatgatgc ggtgagggtg 480

ttcgacgaga tgacggagag ggatgctgtc gtctggaact gcatggttgc agggtatgcg 540

agggctggga gggcagtaga aacctttgag attttcagca gagcgcaggt tgaggcggtg 600

aacatggtga atggtctgca ggctgtgccc agcgtgttga atatctgcgc gaaggaaggg 660

gagctgatga agggtaggga aatccatggt aggatggtga ggtgccttgc atttgattcg 720

gatatcgcag tggggaacgc tttgatcaac atgtatgcaa agtgcggccg ggtcaatgta 780

tcacaagcag tgttttctgg catgcagcag agggatgtgg tgagctggtc tacaatgatt 840

catagctaca gcattcatgg caagggggaa caggcattga aggtttacat ggaaatgttg 900

tctgagggag tgaaaccaaa ttggatcaca ttcacatcag ttctgtcaag ttgcagccac 960

tccgggcttg taaccgaggg tcggaagatc ttcgagtcga tgactaaggt tcatggtgtc 1020

caccctgctg ctgagcacta tgcatgtatg gttgacctct tagggcgtgc tggagccatt 1080

gaagaagctg ttgggcttat aaggaagatg cccatggaac cttgtgctag cgtgtgggga 1140

gctttgctct ctgcatgtgc tatgcataat aacgtcgatg ttggagagat tgcagctttt 1200

aggctatttg agttagaaga aggcagtgct agcaattatg ttaccctctg tggaatttat 1260

gacgcagttg gtcaatctga tggtgttgca gggttgagat caaggatgag agaactcggc 1320

atggtgaaga cgcctgggtg cagtcggatc gatgtgaagg gaagagctca tgctttctac 1380

caggggagca tcccacgtta tttgaggaga tga 1413

<210> 6

<211> 470

<212> PRT

<213> 水稻

<400> 6

Met Ala Ala Pro Val Ala Gly Arg Leu Ser Gly Leu Leu Arg Arg Cys

1 5 10 15

Ala Ala Ala Gly Ala Val Arg Pro Gly Glu Gln Ala His Ala Arg Ala

20 25 30

Val Val Gly Gly Trp Leu Pro Asp Ala Thr Leu Glu Thr Asp Leu Val

35 40 45

Leu Met Tyr Cys Arg Cys Gly Glu Arg Arg Arg Ala Arg Arg Val Phe

50 55 60

Asp Gly Met Arg Ala Pro Ser Met His Ala Tyr Asn Val Leu Leu Ala

65 70 75 80

Ala Ser Pro Pro Arg Asp Ala Met Glu Val Phe Ser Arg Leu Leu Ala

85 90 95

Ser Gly Leu Arg Pro Asp Gly Tyr Ser Val Pro Ala Val Val Arg Ala

100 105 110

Cys Ala Glu Leu Pro Asp Ala Val Leu Gly Gly Val Ile His Gly Phe

115 120 125

Ala Val Arg Leu Gly Leu Met Gly Asn Val Val Val Ala Ala Ala Leu

130 135 140

Leu Asp Met Tyr Ala Lys Ala Gly Phe Leu Asp Asp Ala Val Arg Val

145 150 155 160

Phe Asp Glu Met Thr Glu Arg Asp Ala Val Val Trp Asn Cys Met Val

165 170 175

Ala Gly Tyr Ala Arg Ala Gly Arg Ala Val Glu Thr Phe Glu Ile Phe

180 185 190

Ser Arg Ala Gln Val Glu Ala Val Asn Met Val Asn Gly Leu Gln Ala

195 200 205

Val Pro Ser Val Leu Asn Ile Cys Ala Lys Glu Gly Glu Leu Met Lys

210 215 220

Gly Arg Glu Ile His Gly Arg Met Val Arg Cys Leu Ala Phe Asp Ser

225 230 235 240

Asp Ile Ala Val Gly Asn Ala Leu Ile Asn Met Tyr Ala Lys Cys Gly

245 250 255

Arg Val Asn Val Ser Gln Ala Val Phe Ser Gly Met Gln Gln Arg Asp

260 265 270

Val Val Ser Trp Ser Thr Met Ile His Ser Tyr Ser Ile His Gly Lys

275 280 285

Gly Glu Gln Ala Leu Lys Val Tyr Met Glu Met Leu Ser Glu Gly Val

290 295 300

Lys Pro Asn Trp Ile Thr Phe Thr Ser Val Leu Ser Ser Cys Ser His

305 310 315 320

Ser Gly Leu Val Thr Glu Gly Arg Lys Ile Phe Glu Ser Met Thr Lys

325 330 335

Val His Gly Val His Pro Ala Ala Glu His Tyr Ala Cys Met Val Asp

340 345 350

Leu Leu Gly Arg Ala Gly Ala Ile Glu Glu Ala Val Gly Leu Ile Arg

355 360 365

Lys Met Pro Met Glu Pro Cys Ala Ser Val Trp Gly Ala Leu Leu Ser

370 375 380

Ala Cys Ala Met His Asn Asn Val Asp Val Gly Glu Ile Ala Ala Phe

385 390 395 400

Arg Leu Phe Glu Leu Glu Glu Gly Ser Ala Ser Asn Tyr Val Thr Leu

405 410 415

Cys Gly Ile Tyr Asp Ala Val Gly Gln Ser Asp Gly Val Ala Gly Leu

420 425 430

Arg Ser Arg Met Arg Glu Leu Gly Met Val Lys Thr Pro Gly Cys Ser

435 440 445

Arg Ile Asp Val Lys Gly Arg Ala His Ala Phe Tyr Gln Gly Ser Ile

450 455 460

Pro Arg Tyr Leu Arg Arg

465 470

<210> 7

<211> 2315

<212> DNA

<213> 水稻

<400> 7

cgaatggccg gcaatgtcat ccggcttgaa ctctctgagg cttctttggg tggccaagtt 60

ttgcaaggcc ggatgagtcc ttccttggct tctctcgagc atcttgagta cctcgacctc 120

agtgctctcg tccttccggg catcaacagc agtagcccaa agttcttggg ttctatgacg 180

aacctgagat atcttgatct ctctgggtgt tttctctctg gtagtgtgtc tccttggctc 240

ggcaaccttt ccaaattgga gtaccttgat ctctctttct caaccttgtc aggtagggtt 300

ccacctgagc tcggtaacct gacaaggttg aaacatctgg accttggtaa catgcaacat 360

atgtactcgg cagatatctc atggattact catctgcgat ccttggagta tcttgacatg 420

agcttggtga atctgctgaa cacaattcca tctttggagg ttctcaacct tgtgaaattc 480

acacttccta gtacacccca agcactcgcg caactaaacc tcacgaaact cgtgcagctc 540

gatctctcgt cgaacagatt gggccatcca atccaatcat gttggttttg gaacctgacg 600

agtatcgaat ccctcgagct ctctgaaaca tttcttcatg gtccgtttcc taccgcgcta 660

ggaagtttca cggcactcca gtggcttggg tttagtgata acggtaatgc agcaacgttg 720

ctagcggaca tgagaagtct ctgttctatg aaaagcttgg gtctaggtgg tagtctatct 780

catgggaaca tagaggattt ggtagacagg ttgccacatg gtattactag agataaacca 840

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gggattatac catcagatat tgcatatacc atccctagct tatgtcacct tgacctttct 960

aggaataatc tgactggacc tatacccata atagagaact ctagcttaag tgagctcatc 1020

ctccgttcca accaactaac gggtcaaata ccgaaattag atagaaaaat tgaagtcatg 1080

gatatctcca taaacttgtt gtcagggcct ttgcccatag atattgggtc tccaaacctt 1140

ctagcactaa ttctgtcctc taattatctt atcggtcgaa ttccagaatc agtttgtgaa 1200

tcacagtcca tgattatcgt ggatttgtcc aacaattttc ttgagggagc ctttcccaag 1260

tgttttcaga tgcaaaggtt gattttcctc ctcttaagtc acaatagctt ctctgctaaa 1320

ctcccatcat ttctccgcaa ctcaaatttg ttaagctatg tggatctatc atggaacaaa 1380

ttcagtggaa cattgccaca atggattgga catatggtga acttgcattt tctacacctt 1440

agccacaaca tgttttacgg tcatattcca atcaaaatca caaatcttaa aaatctccac 1500

tacttcagtt tagcagcaaa caatatatct ggtgcaatac cacggtgttt gtcaaagtta 1560

acaatgatga taggaaaaca atcgacaata atagagatcg attggtttca tgcgtatttt 1620

gacgttgtgg atgggtctct tggaagaatt ttctctgttg tgatgaagca ccaagaacaa 1680

caatatggtg atagcattct cgatgtggtg ggcatcgact tgtcactcaa tagtttaact 1740

ggtggaatac cggatgagat cacttctctt aaaagattgc tcagtttaaa tttatcatgg 1800

aatcaattga gcggagaaat cgtagagaag attggggcga tgaattcatt ggaatcactt 1860

gacctctcgc ggaacaaatt ttctggtgaa attcctccaa gtttggccaa tctggcatat 1920

ctaagctact tggacttgtc atacaataat cttacaggaa gaattccacg aggaagccaa 1980

ctcgataccc tctatgccga gaaccctcac atatatgatg gaaacaacgg tctctatggt 2040

cctcccctcc aaaggaattg cttgggcagt gaactaccaa agaatagcag ccaaatcatg 2100

agcaaaaatg tttctgatga actaatgttc tactttggac ttgggtccgg gtttacagtt 2160

ggtctctggg ttgttttctg tgttgtattg ttcaagaaaa cttggagaat tgccttgttt 2220

cgcctctttg ataggataca cgacaaagta tatgtgtttg tcgccataac ctgggccagt 2280

attggtagag aggctaccac agattaatag gtact 2315

<210> 8

<211> 2304

<212> DNA

<213> 水稻

<400> 8

atggccggca atgtcatccg gcttgaactc tctgaggctt ctttgggtgg ccaagttttg 60

caaggccgga tgagtccttc cttggcttct ctcgagcatc ttgagtacct cgacctcagt 120

gctctcgtcc ttccgggcat caacagcagt agcccaaagt tcttgggttc tatgacgaac 180

ctgagatatc ttgatctctc tgggtgtttt ctctctggta gtgtgtctcc ttggctcggc 240

aacctttcca aattggagta ccttgatctc tctttctcaa ccttgtcagg tagggttcca 300

cctgagctcg gtaacctgac aaggttgaaa catctggacc ttggtaacat gcaacatatg 360

tactcggcag atatctcatg gattactcat ctgcgatcct tggagtatct tgacatgagc 420

ttggtgaatc tgctgaacac aattccatct ttggaggttc tcaaccttgt gaaattcaca 480

cttcctagta caccccaagc actcgcgcaa ctaaacctca cgaaactcgt gcagctcgat 540

ctctcgtcga acagattggg ccatccaatc caatcatgtt ggttttggaa cctgacgagt 600

atcgaatccc tcgagctctc tgaaacattt cttcatggtc cgtttcctac cgcgctagga 660

agtttcacgg cactccagtg gcttgggttt agtgataacg gtaatgcagc aacgttgcta 720

gcggacatga gaagtctctg ttctatgaaa agcttgggtc taggtggtag tctatctcat 780

gggaacatag aggatttggt agacaggttg ccacatggta ttactagaga taaaccagca 840

caagaaggga attttacaag tttgtcttat cttgatcttt ctgacaacca tcttgctggg 900

attataccat cagatattgc atataccatc cctagcttat gtcaccttga cctttctagg 960

aataatctga ctggacctat acccataata gagaactcta gcttaagtga gctcatcctc 1020

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ccatcatttc tccgcaactc aaatttgtta agctatgtgg atctatcatg gaacaaattc 1380

agtggaacat tgccacaatg gattggacat atggtgaact tgcattttct acaccttagc 1440

cacaacatgt tttacggtca tattccaatc aaaatcacaa atcttaaaaa tctccactac 1500

ttcagtttag cagcaaacaa tatatctggt gcaataccac ggtgtttgtc aaagttaaca 1560

atgatgatag gaaaacaatc gacaataata gagatcgatt ggtttcatgc gtattttgac 1620

gttgtggatg ggtctcttgg aagaattttc tctgttgtga tgaagcacca agaacaacaa 1680

tatggtgata gcattctcga tgtggtgggc atcgacttgt cactcaatag tttaactggt 1740

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caattgagcg gagaaatcgt agagaagatt ggggcgatga attcattgga atcacttgac 1860

ctctcgcgga acaaattttc tggtgaaatt cctccaagtt tggccaatct ggcatatcta 1920

agctacttgg acttgtcata caataatctt acaggaagaa ttccacgagg aagccaactc 1980

gataccctct atgccgagaa ccctcacata tatgatggaa acaacggtct ctatggtcct 2040

cccctccaaa ggaattgctt gggcagtgaa ctaccaaaga atagcagcca aatcatgagc 2100

aaaaatgttt ctgatgaact aatgttctac tttggacttg ggtccgggtt tacagttggt 2160

ctctgggttg ttttctgtgt tgtattgttc aagaaaactt ggagaattgc cttgtttcgc 2220

ctctttgata ggatacacga caaagtatat gtgtttgtcg ccataacctg ggccagtatt 2280

ggtagagagg ctaccacaga ttaa 2304

<210> 9

<211> 767

<212> PRT

<213> 水稻

<400> 9

Met Ala Gly Asn Val Ile Arg Leu Glu Leu Ser Glu Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gly Gln Val Leu Gln Gly Arg Met Ser Pro Ser Leu Ala Ser Leu Glu

20 25 30

His Leu Glu Tyr Leu Asp Leu Ser Ala Leu Val Leu Pro Gly Ile Asn

35 40 45

Ser Ser Ser Pro Lys Phe Leu Gly Ser Met Thr Asn Leu Arg Tyr Leu

50 55 60

Asp Leu Ser Gly Cys Phe Leu Ser Gly Ser Val Ser Pro Trp Leu Gly

65 70 75 80

Asn Leu Ser Lys Leu Glu Tyr Leu Asp Leu Ser Phe Ser Thr Leu Ser

85 90 95

Gly Arg Val Pro Pro Glu Leu Gly Asn Leu Thr Arg Leu Lys His Leu

100 105 110

Asp Leu Gly Asn Met Gln His Met Tyr Ser Ala Asp Ile Ser Trp Ile

115 120 125

Thr His Leu Arg Ser Leu Glu Tyr Leu Asp Met Ser Leu Val Asn Leu

130 135 140

Leu Asn Thr Ile Pro Ser Leu Glu Val Leu Asn Leu Val Lys Phe Thr

145 150 155 160

Leu Pro Ser Thr Pro Gln Ala Leu Ala Gln Leu Asn Leu Thr Lys Leu

165 170 175

Val Gln Leu Asp Leu Ser Ser Asn Arg Leu Gly His Pro Ile Gln Ser

180 185 190

Cys Trp Phe Trp Asn Leu Thr Ser Ile Glu Ser Leu Glu Leu Ser Glu

195 200 205

Thr Phe Leu His Gly Pro Phe Pro Thr Ala Leu Gly Ser Phe Thr Ala

210 215 220

Leu Gln Trp Leu Gly Phe Ser Asp Asn Gly Asn Ala Ala Thr Leu Leu

225 230 235 240

Ala Asp Met Arg Ser Leu Cys Ser Met Lys Ser Leu Gly Leu Gly Gly

245 250 255

Ser Leu Ser His Gly Asn Ile Glu Asp Leu Val Asp Arg Leu Pro His

260 265 270

Gly Ile Thr Arg Asp Lys Pro Ala Gln Glu Gly Asn Phe Thr Ser Leu

275 280 285

Ser Tyr Leu Asp Leu Ser Asp Asn His Leu Ala Gly Ile Ile Pro Ser

290 295 300

Asp Ile Ala Tyr Thr Ile Pro Ser Leu Cys His Leu Asp Leu Ser Arg

305 310 315 320

Asn Asn Leu Thr Gly Pro Ile Pro Ile Ile Glu Asn Ser Ser Leu Ser

325 330 335

Glu Leu Ile Leu Arg Ser Asn Gln Leu Thr Gly Gln Ile Pro Lys Leu

340 345 350

Asp Arg Lys Ile Glu Val Met Asp Ile Ser Ile Asn Leu Leu Ser Gly

355 360 365

Pro Leu Pro Ile Asp Ile Gly Ser Pro Asn Leu Leu Ala Leu Ile Leu

370 375 380

Ser Ser Asn Tyr Leu Ile Gly Arg Ile Pro Glu Ser Val Cys Glu Ser

385 390 395 400

Gln Ser Met Ile Ile Val Asp Leu Ser Asn Asn Phe Leu Glu Gly Ala

405 410 415

Phe Pro Lys Cys Phe Gln Met Gln Arg Leu Ile Phe Leu Leu Leu Ser

420 425 430

His Asn Ser Phe Ser Ala Lys Leu Pro Ser Phe Leu Arg Asn Ser Asn

435 440 445

Leu Leu Ser Tyr Val Asp Leu Ser Trp Asn Lys Phe Ser Gly Thr Leu

450 455 460

Pro Gln Trp Ile Gly His Met Val Asn Leu His Phe Leu His Leu Ser

465 470 475 480

His Asn Met Phe Tyr Gly His Ile Pro Ile Lys Ile Thr Asn Leu Lys

485 490 495

Asn Leu His Tyr Phe Ser Leu Ala Ala Asn Asn Ile Ser Gly Ala Ile

500 505 510

Pro Arg Cys Leu Ser Lys Leu Thr Met Met Ile Gly Lys Gln Ser Thr

515 520 525

Ile Ile Glu Ile Asp Trp Phe His Ala Tyr Phe Asp Val Val Asp Gly

530 535 540

Ser Leu Gly Arg Ile Phe Ser Val Val Met Lys His Gln Glu Gln Gln

545 550 555 560

Tyr Gly Asp Ser Ile Leu Asp Val Val Gly Ile Asp Leu Ser Leu Asn

565 570 575

Ser Leu Thr Gly Gly Ile Pro Asp Glu Ile Thr Ser Leu Lys Arg Leu

580 585 590

Leu Ser Leu Asn Leu Ser Trp Asn Gln Leu Ser Gly Glu Ile Val Glu

595 600 605

Lys Ile Gly Ala Met Asn Ser Leu Glu Ser Leu Asp Leu Ser Arg Asn

610 615 620

Lys Phe Ser Gly Glu Ile Pro Pro Ser Leu Ala Asn Leu Ala Tyr Leu

625 630 635 640

Ser Tyr Leu Asp Leu Ser Tyr Asn Asn Leu Thr Gly Arg Ile Pro Arg

645 650 655

Gly Ser Gln Leu Asp Thr Leu Tyr Ala Glu Asn Pro His Ile Tyr Asp

660 665 670

Gly Asn Asn Gly Leu Tyr Gly Pro Pro Leu Gln Arg Asn Cys Leu Gly

675 680 685

Ser Glu Leu Pro Lys Asn Ser Ser Gln Ile Met Ser Lys Asn Val Ser

690 695 700

Asp Glu Leu Met Phe Tyr Phe Gly Leu Gly Ser Gly Phe Thr Val Gly

705 710 715 720

Leu Trp Val Val Phe Cys Val Val Leu Phe Lys Lys Thr Trp Arg Ile

725 730 735

Ala Leu Phe Arg Leu Phe Asp Arg Ile His Asp Lys Val Tyr Val Phe

740 745 750

Val Ala Ile Thr Trp Ala Ser Ile Gly Arg Glu Ala Thr Thr Asp

755 760 765

<210> 10

<211> 749

<212> DNA

<213> 水稻

<400> 10

ccaggctact actagtactc taccaacaaa aggagcaatg gccccaccgg tcagccaccc 60

gtcaggtggg tgcaacagtc caatcgcgta ggaaagcggc aaacacgaca ccacgagctg 120

cggtcccccc ccccacgcga gacgatccga cgaccctccg tcgcccgcgc ccacgatcgg 180

acggtccaga tcgacgtgtc ccccttggcg atcccccgcg gccacgcgcg ggggcgggta 240

tccgcgagcg cgggagaggt ggggcccact tcccctcctc cttgcaggtg ggggacgtgg 300

ggccacgccc tgtcagtggc agcggcgggc gggtacccgc ggcgcgggta agggatggtg 360

ggcggtgaga aaagtttcgt ggtccaattg gttgtacttt ggcgtcagcg tggggcccca 420

cggtgacggg aaggaggcct atgagagctt gccacgtcac cgattttttt tgcgagacga 480

gattgatgca cttggggtgt gatgcgcccc gctttttgag cccccctgcc tgctgtgttt 540

ccccttgctg cccgtatccg attccaaact gtggttgccc ttgtcgaccc atggattgat 600

gcaaacttta gtttttagta ataatagctt ttttttcttt tcaactcgaa attttgaaaa 660

tattttatag gtgcgcatta aagaaattca ataaaaacac cgcattatcg aaagtgttgt 720

cagcgtgaat ctaatgatat actccgtag 749

<210> 11

<211> 147

<212> DNA

<213> 水稻

<400> 11

atggccccac cggtggggga cgtggggcca cgccctgtca gtggcagcgg cgggcgggta 60

cccgcggcgc gggtaaggga tggtgggcgg tgcgcattaa agaaattcaa taaaaacacc 120

gcattatcga aagtgttgtc agcgtga 147

<210> 12

<211> 48

<212> PRT

<213> 水稻

<400> 12

Met Ala Pro Pro Val Gly Asp Val Gly Pro Arg Pro Val Ser Gly Ser

1 5 10 15

Gly Gly Arg Val Pro Ala Ala Arg Val Arg Asp Gly Gly Arg Cys Ala

20 25 30

Leu Lys Lys Phe Asn Lys Asn Thr Ala Leu Ser Lys Val Leu Ser Ala

35 40 45

<210> 13

<211> 949

<212> DNA

<213> 水稻

<400> 13

gagaccgaga gagagaagca gcacccaaac cctagccctc ccctctcctc ccgcacgcgc 60

gcgtcggcgc caccaccggg agctccgccg ccgccgccgc ctcatccgcc ccgtgccatg 120

gcggagaccc ccgagcgcag gaggtactca gggtccccct ctccttacag gggaaaccca 180

aaatcaaggt caagatcacg atcacctgct gctcgatccc agtctaggtc tccagtccct 240

gaccctagat ctcaggcaag gtcaagatca agaagccgcg agagggagcc tgatgctgta 300

aatcatggaa atacactgta tgtgactgga ctctcttctc gagtgactga aagagaactt 360

aaagattact tctctaaaga aggaagggtg actagttgcc atgttgtcct tgaaccccat 420

acacgtgttt ctcgtggatt tgcttttgtc accatggaca ctgttgaaga tgctgaacgc 480

tgtatcaagt atcttaacca gtctgtaatg gaaggccgga acatcacagt tgaaaagtca 540

cgtcgaggtc gcccaaggac gccaactcct ggaagctatc ttggtcatcg atatgaccgt 600

agagagccac gtgggagata ccgcagcaga ggaggtggct atggccgtga tgagtactac 660

ggcaatagct accgcaggtc tccgcctcca atgtacccat cctacaggga cacaagggac 720

taccctccat acagggacac aagggactac tccccccaca gggatgctcg agattactac 780

gacggaaggg gaggcagggg atactcccca catagatctc ctccttatgg cggtggcagg 840

gcccggaggg agcgatctag atcattgccg tattctccct accggatgcc tgagagaggc 900

tatggacgcc aagccggtgg tggtggctat gacaggtaag gttgctccc 949

<210> 14

<211> 822

<212> DNA

<213> 水稻

<400> 14

atggcggaga cccccgagcg caggaggtac tcagggtccc cctctcctta caggggaaac 60

ccaaaatcaa ggtcaagatc acgatcacct gctgctcgat cccagtctag gtctccagtc 120

cctgacccta gatctcaggc aaggtcaaga tcaagaagcc gcgagaggga gcctgatgct 180

gtaaatcatg gaaatacact gtatgtgact ggactctctt ctcgagtgac tgaaagagaa 240

cttaaagatt acttctctaa agaaggaagg gtgactagtt gccatgttgt ccttgaaccc 300

catacacgtg tttctcgtgg atttgctttt gtcaccatgg acactgttga agatgctgaa 360

cgctgtatca agtatcttaa ccagtctgta atggaaggcc ggaacatcac agttgaaaag 420

tcacgtcgag gtcgcccaag gacgccaact cctggaagct atcttggtca tcgatatgac 480

cgtagagagc cacgtgggag ataccgcagc agaggaggtg gctatggccg tgatgagtac 540

tacggcaata gctaccgcag gtctccgcct ccaatgtacc catcctacag ggacacaagg 600

gactaccctc catacaggga cacaagggac tactcccccc acagggatgc tcgagattac 660

tacgacggaa ggggaggcag gggatactcc ccacatagat ctcctcctta tggcggtggc 720

agggcccgga gggagcgatc tagatcattg ccgtattctc cctaccggat gcctgagaga 780

ggctatggac gccaagccgg tggtggtggc tatgacaggt aa 822

<210> 15

<211> 273

<212> PRT

<213> 水稻

<400> 15

Met Ala Glu Thr Pro Glu Arg Arg Arg Tyr Ser Gly Ser Pro Ser Pro

1 5 10 15

Tyr Arg Gly Asn Pro Lys Ser Arg Ser Arg Ser Arg Ser Pro Ala Ala

20 25 30

Arg Ser Gln Ser Arg Ser Pro Val Pro Asp Pro Arg Ser Gln Ala Arg

35 40 45

Ser Arg Ser Arg Ser Arg Glu Arg Glu Pro Asp Ala Val Asn His Gly

50 55 60

Asn Thr Leu Tyr Val Thr Gly Leu Ser Ser Arg Val Thr Glu Arg Glu

65 70 75 80

Leu Lys Asp Tyr Phe Ser Lys Glu Gly Arg Val Thr Ser Cys His Val

85 90 95

Val Leu Glu Pro His Thr Arg Val Ser Arg Gly Phe Ala Phe Val Thr

100 105 110

Met Asp Thr Val Glu Asp Ala Glu Arg Cys Ile Lys Tyr Leu Asn Gln

115 120 125

Ser Val Met Glu Gly Arg Asn Ile Thr Val Glu Lys Ser Arg Arg Gly

130 135 140

Arg Pro Arg Thr Pro Thr Pro Gly Ser Tyr Leu Gly His Arg Tyr Asp

145 150 155 160

Arg Arg Glu Pro Arg Gly Arg Tyr Arg Ser Arg Gly Gly Gly Tyr Gly

165 170 175

Arg Asp Glu Tyr Tyr Gly Asn Ser Tyr Arg Arg Ser Pro Pro Pro Met

180 185 190

Tyr Pro Ser Tyr Arg Asp Thr Arg Asp Tyr Pro Pro Tyr Arg Asp Thr

195 200 205

Arg Asp Tyr Ser Pro His Arg Asp Ala Arg Asp Tyr Tyr Asp Gly Arg

210 215 220

Gly Gly Arg Gly Tyr Ser Pro His Arg Ser Pro Pro Tyr Gly Gly Gly

225 230 235 240

Arg Ala Arg Arg Glu Arg Ser Arg Ser Leu Pro Tyr Ser Pro Tyr Arg

245 250 255

Met Pro Glu Arg Gly Tyr Gly Arg Gln Ala Gly Gly Gly Gly Tyr Asp

260 265 270

Arg

<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> 合成序列

<220>

<223> 克隆OsDN-PPR1基因cDNA的正向引物

<400> 16

gagcgaactg cttggttggg aatg 24

<210> 17

<211> 28

<212> DNA

<213> 合成序列

<220>

<223> 克隆OsDN-PPR1基因cDNA的反向引物

<400> 17

cccaaagcat tcatctcctc aaataacg 28

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<220>

<223> 克隆OsLRP1基因cDNA的正向引物

<400> 18

cgaatggccg gcaatgtcat cc 22

<210> 19

<211> 28

<212> DNA

<213> 合成序列

<220>

<223> 克隆OsLRP1基因cDNA的反向引物

<400> 19

agtacctatt aatctgtggt agcctctc 28

<210> 20

<211> 27

<212> DNA

<213> 合成序列

<220>

<223> 克隆OsDN-LTP1基因gDNA的正向引物

<400> 20

ccaggctact actagtactc taccaac 27

<210> 21

<211> 29

<212> DNA

<213> 合成序列

<220>

<223> 克隆OsDN-LTP1基因gDNA的反向引物

<400> 21

ctacggagta tatcattaga ttcacgctg 29

<210> 22

<211> 25

<212> DNA

<213> 合成序列

<220>

<223> 克隆OsRRM1基因cDNA的正向引物

<400> 22

gagaccgaga gagagaagca gcacc 25

<210> 23

<211> 25

<212> DNA

<213> 合成序列

<220>

<223> 克隆OsRRM1基因cDNA的反向引物

<400> 23

gggagcaacc ttacctgtca tagcc 25

<210> 24

<211> 23

<212> DNA

<213> 合成序列

<220>

<223> OsLRP1基因实时PCR分析的正向引物

<400> 24

ctcccatcat ttctccgcaa ctc 23

<210> 25

<211> 23

<212> DNA

<213> 合成序列

<220>

<223> OsLRP1基因实时PCR分析的反向引物

<400> 25

ccaagagacc catccacaac gtc 23

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<220>

<223> OsDN-LTP1基因实时PCR分析的正向引物

<400> 26

gtgcgcatta aagaaattca 20

<210> 27

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<220>

<223> OsDN-LTP1基因实时PCR分析的反向引物

<400> 27

tcacgctgac aacactttc 19

Claims (4)

1.一种提高植物氮素胁迫耐性的方法，包括：

(a)将重组DNA构建体转入可再生植物细胞，所述重组DNA构建体包括一个多核苷酸和与其可操作连接的至少一个调控序列，其中所述多核苷酸编码具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列的多肽；

(b)步骤(a)后由可再生植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中含有重组DNA构建体；和

(c)获得步骤(b)转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中含有重组DNA构建体；与不含有重组DNA构建体的对照植物相比，所述子代植物显示出提高的氮素胁迫耐性，

其中所述植物是水稻。

2.一种评估植物氮素胁迫耐性的方法，包括：

(a)将重组DNA构建体转入可再生植物细胞，所述重组DNA构建体包括一个多核苷酸和与其可操作连接的至少一个调控序列，其中所述多核苷酸编码具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列的多肽；

(b)步骤(a)后由可再生植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中含有重组DNA构建体；

(c)获得转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中含有重组DNA构建体；和

(d)与不含有重组DNA构建体的对照植物相比，评估所述子代植物的氮素胁迫耐性。

3.一种提高植物耐旱性的方法，包括：

(a)将重组DNA构建体转入可再生植物细胞，所述重组DNA构建体包括一个多核苷酸和与其可操作连接的至少一个调控序列，其中所述多核苷酸编码具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列的多肽；

(b)步骤(a)后由可再生植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中含有重组DNA构建体；和

(c)获得步骤(b)转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中含有重组DNA构建体；与不含有重组DNA构建体的对照植物相比，所述子代植物显示出提高的耐旱性能，

其中所述植物是水稻。

4.一种评估植物耐旱性的方法，包括：

(a)将重组DNA构建体转入可再生植物细胞，所述重组DNA构建体包括一个多核苷酸和与其可操作连接的至少一个调控序列，其中所述多核苷酸编码具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列的多肽；

(b)步骤(a)后由可再生植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中含有重组DNA构建体；

(c)获得转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中含有重组DNA构建体；和

(d)与不含有重组DNA构建体的对照植物相比，评估所述子代植物的耐旱性能。

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