CN113881690B

CN113881690B - 一种含编码塔城蜱病毒2核蛋白基因的融合质粒、宿主菌及蛋白的制备方法和应用

Info

Publication number: CN113881690B
Application number: CN202111141732.9A
Authority: CN
Inventors: 王远志; 孙力涛; 张玉; 蒋良; 杜珊; 李赞
Original assignee: Shihezi University; Sun Yat Sen University
Current assignee: Shihezi University; Sun Yat Sen University
Priority date: 2021-09-28
Filing date: 2021-09-28
Publication date: 2024-03-12
Anticipated expiration: 2041-09-28
Also published as: CN113881690A

Abstract

本发明涉及一种含编码塔城蜱病毒2核蛋白基因的融合质粒、宿主菌及蛋白的制备方法和应用，属于病原检测试剂技术领域。本发明提供了密码子优化后的编码塔城蜱病毒2核蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明所述融合质粒生产的塔城蜱病毒2核蛋白能在大肠杆菌中大量表达可溶性TcTV‑2‑NP，能与相应的抗体特异性的结合，用于NP抗体的检测时具有较高的敏感性和特异性，具有开发成为检测试剂盒的应用价值。

Description

一种含编码塔城蜱病毒2核蛋白基因的融合质粒、宿主菌及蛋白的制备方法和应用

技术领域

本发明涉及病原检测试剂技术领域，具体涉及一种含编码塔城蜱病毒2核蛋白基因的融合质粒、宿主菌及蛋白的制备方法和应用。

背景技术

布尼亚病毒可广泛感染节肢动物、植物和包括人类的哺乳动物，多数布尼亚病毒都是通过节肢动物(蚊子、蜱和白蛉)传播的，并在自然界中以吸血节肢动物和易感脊椎动物为宿主进行循环。塔城蜱病毒2(Tacheng Tick Virus 2，TcTV-2)是一种新现的布尼亚病毒，属于布尼亚病毒目白玲病毒属。白蛉病毒属包括大量的虫媒病毒，有多种吸血的节肢动物传播，主要包括蚊传病毒(sandfly/mosquito-borne phleboviruses)和蜱传病毒(Tick-borne phleboviruses，TBPVs)。2009年，两种新现蜱传白玲病毒：发热伴血小板减少综合证病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus，SFTSV)和心脏地带病毒(Heartlandvirus，HRTV)被证明与严重的人类疾病相关。塔城蜱病毒2已经被报道与人类的发热性疾病有关，主要的临床症状包括发热、皮疹随后不久出现寒战、严重疲劳、头痛、厌食、恶心和呕吐等。这类病毒的发现表明TBPVs可能导致严重的新发人类疾病，并对公共卫生构成重大的、可能以前未认识到的威胁。因此对于此次新发的TcTV-2仍然需要保持较高的警惕意识。病毒感染早期的核酸和抗体检测技术的建立是对病毒进行有效防控和早期诊断的重要措施和手段。但目前尚无针对TcTV-2的商品化检测试剂盒。

发明内容

本发明的目的在于提供一种含编码塔城蜱病毒2核蛋白基因的融合质粒、宿主菌及蛋白的制备方法和应用。本发明所述融合质粒生产的塔城蜱病毒2核蛋白能与相应的抗体特异性的结合，用于NP抗体的检测时具有较高的敏感性和特异性，具有开发成为检测试剂盒的应用价值。

本发明提供了密码子优化后的编码塔城蜱病毒2核蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了含上述技术方案所述基因的融合质粒，所述融合质粒的骨架载体包括pET-21a。

本发明还提供了含上述技术方案所述基因或上述技术方案所述融合质粒的宿主菌。

优选的是，所述宿主菌包括大肠杆菌。

本发明还提供了基于上述技术方案所述宿主菌的塔城蜱病毒2核蛋白制备方法，包括以下步骤：

将所述宿主菌在液体培养基中培养，至OD₆₀₀为0.4～0.6，加入IPTG诱导；

诱导完成后，收集菌体，进行细胞裂解，离心取上清液；

将所述上清液进行镍柱纯化，得到粗蛋白；

将所述粗蛋白进行凝胶过滤层析纯化，得到塔城蜱病毒2核蛋白。

优选的是，所述诱导的条件包括：IPTG终浓度设置为0.2mM，诱导温度为16℃，诱导时间为18h。

优选的是，所述细胞裂解的条件包括：将菌体溶于细胞裂解液，超声破碎。

优选的是，所述镍柱纯化使用500mM的咪唑洗脱液进行洗脱。

本发明还提供了上述技术方案所述基因编码的塔城蜱病毒2核蛋白或上述技术方案所述融合质粒表达的塔城蜱病毒2核蛋白或上述技术方案所述宿主菌表达的塔城蜱病毒2核蛋白在制备塔城蜱病毒2核蛋白抗体检测试剂盒中的应用。

本发明还提供了一种塔城蜱病毒2核蛋白的抗体检测试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述宿主菌表达获得的塔城蜱病毒2核蛋白和反应液。

本发明提供了一种含编码塔城蜱病毒2核蛋白基因的融合质粒。本发明含有编码塔城蜱病毒2核蛋白(TcTV-2-NP)基因的融合质粒能在大肠杆菌中大量表达可溶性TcTV-2-NP，TcTV-2-NP灵敏度强，特异性好，适合作为检测用抗原。本发明还提供了一种塔城蜱病毒2核蛋白的制备方法，本发明所述制备方法简单易行，操作方便，易于生产，制备的蛋白纯度高，产量大，可溶性强，易纯化，可快速获得较多且纯度较高的重组蛋白。本发明制备方法得到的塔城蜱病毒2核蛋白，即重组基因工程抗原TcTV-2-NP在ELISA检测人群血清抗体中有很好的应用，检测敏感性强、特异性好，设备要求低、检测周期短，有很广的应用面。

附图说明

图1为本发明提供的TcTV2-NP镍柱纯化SDS-PAGE结果；

图2为本发明提供的塔城蜱病毒2核蛋白凝胶过滤层析纯化后紫外吸收峰图；

图3为本发明提供的塔城蜱病毒2核蛋白凝胶过滤层析纯化后SDS-PAGE结果，图中箭头所指部分为目的蛋白塔城蜱病毒2核蛋白的条带；

图4为本发明提供的纯化的塔城蜱病毒2核蛋白用质印迹法(免疫印迹试验)即Western blot检测抗体结果图；

图5为本发明提供的目的蛋白在普通载体pet-28a上的阴离子交换层析纯化结果；

图6为本发明提供的目的蛋白在普通载体pet-28a上的阴离子交换层析纯化SDS-PAGE结果。

具体实施方式

本发明提供了密码子优化后的编码塔城蜱病毒2核蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。密码子优化的TcTV-2核蛋白NP基因序列中大肠杆菌偏爱的密码子出现频率增加，但是其编码的TcTV-2核蛋白的氨基酸序列不发生变化，从而使其能更适合在大肠杆菌的蛋白表达。由于目前对基因序列的密码子优化尚没有统一的标准或原则，因此不同的研究人员完全会设计出不同的核苷酸序列用于目标蛋白质的表达，相应地表达效率也存在明显差异。本发明优化的核苷酸序列，克服了上述缺陷，提高了TcTV-2核蛋白表达水平。

本发明还提供了含上述技术方案所述基因的融合质粒，所述融合质粒的骨架载体包括pET-21a。本发明对pET-21a的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规市售pET-21a(含C-His)即可。原核表达载体pET-21a与塔城蜱病毒2核蛋白NP的融合表达使得后续的纯化过程简单而高效，蛋白回收纯度较高。制备过程简单，耗时短。

在本发明中，所述宿主菌包括大肠杆菌。

诱导完成后，收集菌体，进行细胞裂解，离心取上清液；

将所述上清液进行镍柱纯化，得到粗蛋白；

本发明将所述宿主菌在液体培养基中培养，至OD₆₀₀为0.4～0.6，加入IPTG诱导。在本发明中，所述诱导的条件优选包括：IPTG终浓度设置为0.2mM，诱导温度为16℃，诱导时间为18h。

诱导完成后，收集菌体，进行细胞裂解，离心取上清液。在本发明中，所述细胞裂解的条件优选包括：将菌体溶于细胞裂解液，超声破碎。

取上清液后，本发明将所述上清液进行镍柱纯化，得到粗蛋白。在本发明中，所述镍柱纯化优选使用500mM的咪唑洗脱液进行洗脱。

得到粗蛋白后，本发明将所述粗蛋白进行凝胶过滤层析纯化，得到塔城蜱病毒2核蛋白。本发明优选使用Superose 6层析柱进行凝胶过滤层析，流速优选为0.5ml/min。

本发明制备的塔城蜱病毒2核蛋白(检测用抗原)在检测相应抗体时表现了较高的敏感性和特异性，灵敏度好。证明了本发明的实用价值。在检测人源血清的应用中，结果显示该方法达到了100％的敏感性和90％的特异性，与临床诊断符合率达到93.3％，为本发明的进一步研发提供了坚实的实用基础。

本发明首次为高危地区蜱咬患者提供了一个快速检测蜱传塔城蜱病毒2血清抗体的ELISA检测的手段，检测具有敏感性高、特异性强、灵敏度好、操作简单、样本用量少等特色，无需特别仪器，可手工操作，也可全自动化检测，且检测成果准确度高，重复性好。而且检测的样本量大，它不只适用于蜱咬重症患者临床标本的快速检查，还适合于高危人群血清流行病学筛查。

下面结合具体实施例对本发明所述的一种含编码塔城蜱病毒2核蛋白基因的融合质粒、宿主菌及蛋白的制备方法和应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

含塔城蜱病毒2核蛋白基因的融合质粒制备

(1)密码子优化：以TC252株为参考序列(GenBank：KM817744)，选取TcTV-2核蛋白基因，全长1323bp，序列如SEQ ID NO.1所示；委托公司化学合成密码子优化后的TcTV-2核蛋白基因序列，编码序列如SEQ ID NO.2所示。密码子优化的基因序列所编码的蛋白质氨基酸序列SEQ ID NO.3所示与原有的氨基酸序列保持一致。

SEQ ID NO.1如下：

ATGAACTCAGGTAAGAAGCAAGAGACAGCAAAAAAGAGAGGGAGGAAGCCAGCCACAGTCCCGCCCGGACCAAGAAGAGAGACCAGAAGCCAGTCCCGATCCACAATGTCGGACGATCAACAGCACACCAACCCACCCCCACCTCCGACAGGGAGAGGGTCCGGAGGAGGAGGTGGCCAAGGCGGAGGAGGAGGCCAAGGAGGTGCAGGGGGGTCAGGAAGAGGAGGCGGAGGCACTGGTGGAGGTGGCCCTGCTCCGAAGCCAGGACCCTCCCAGCAGCCTGATCTTGCAGGAGGCCCTGAGGTCCCCTCCTGCGTGGAAATTGATCTCCTCAACGGCAACTATGAGGATGACCCCGAGGACACCCCACGGGTTAGGTACATCAAGTGGTGGGGCAGGGCCAACCGCAGGGCCTCGGTGAGGGGGTTGCTGGGGCCAGAAGCAGGTGCAGATCCTGCCAACATGCCAGCCGGCTTCGTGGAGGGCCTGCAGTGGGCCATGGATGCGATGGACAACGCATCAACACCAGTGCCTCGGGAGACAATCCTGCGTCTCATCAGGCGGTCCTTCCAATACAAGCCAGTCACCAAGGACATAGAGGAGGCCGCTGAGCTCTTCCAGTACCAGGGCTTTGACCCTGTGTTGGTGACAGCCCAACTGCTGTCCTGTGGGAAGGCAAAGAACCAAGGCGCAGGGGAGGTGGCCAAGGACATTGTGGCCATGATTGTGCTCTACCTCACAAGGGGCACAAACACAGAAAAAATGAAGAACCGCATGTCCGAGATGGGCAAGATGCTGATGGATCGGCTGGAAAAACAGTACCAGATCCGGAAGGGTGCCGTGGCGCCCAAGGAGATCACCCTGGCCAGGGTTGCCCTCACCTACCCGGCCATCACCATCAGATGCACCATGCAGCTGGGCGAAAAGCTGCCAGTGCCCATCTCACACATGCGCCAGCTCTCACCACTGTACCCTGTGGCCATGTGCACACAAGCCTTCTCCGCCGTCATCCCCCGAGGCTCTGCCCATGAGACCGTCCTGGTCCATGCTCATGCCCTCTTCCTGGCAGAGTTCTCCAAGGTCATCAACCCCGACCTGAGAGGGAAGGGCAGCTCCGACATCAGGGACTCCTTCAAGGGAGCCCTGAAGACCGCCCTGGAGAAGCGGGAGCCCTACCTGAATGAGGCCAGGCAGGCACTGGTGAAGGGCATCGGCATCTTGGTGGCAGGAGGGGAAGAAGGGGCCGCACTGGTGTTGGCAGCTGGCATTCAAGAGGCTGCCAACACTTTTGTCAACACGTATGGCCC GCTGGCCTTCAATTGA。

SEQ ID NO.2如下：

ATGAACAGTGGTAAAAAGCAGGAAACCGCAAAAAAGCGTGGTCGTAAACCGGCCACCGTGCCGCCGGGTCCTCGTCGTGAAACCCGCAGCCAGAGCCGTAGCACCATGAGCGATGATCAGCAGCATACCAATCCGCCGCCGCCGCCTACCGGCAGAGGTAGCGGTGGTGGCGGCGGTCAGGGCGGTGGTGGTGGTCAAGGTGGTGCAGGCGGTAGCGGCCGCGGTGGTGGTGGCACCGGTGGTGGTGGACCGGCTCCTAAACCGGGCCCGAGCCAGCAGCCGGATCTGGCAGGTGGCCCGGAAGTGCCGAGCTGCGTTGAAATTGATCTGCTGAATGGTAATTATGAAGATGATCCGGAAGATACCCCGCGCGTTCGCTATATTAAGTGGTGGGGTCGCGCCAATCGCCGCGCAAGCGTTCGTGGTCTGCTGGGTCCGGAAGCAGGTGCAGATCCGGCAAATATGCCGGCCGGCTTTGTTGAAGGCCTGCAGTGGGCAATGGATGCAATGGATAATGCCAGTACCCCGGTTCCGCGCGAAACCATTCTGCGTCTGATTCGTCGTAGTTTTCAGTATAAACCGGTGACCAAAGATATTGAAGAAGCCGCAGAACTGTTTCAGTATCAGGGTTTTGATCCGGTGCTGGTGACCGCACAGCTGCTGAGCTGTGGTAAAGCAAAAAATCAGGGTGCAGGTGAAGTTGCAAAAGATATTGTTGCAATGATTGTGCTGTATCTGACCCGCGGTACCAATACCGAAAAAATGAAAAATCGCATGAGCGAAATGGGCAAAATGCTGATGGATCGCCTGGAAAAACAGTATCAGATTCGTAAAGGTGCCGTTGCACCGAAAGAAATTACCCTGGCCCGTGTTGCCCTGACCTATCCGGCAATTACCATTCGCTGCACCATGCAGCTGGGCGAAAAACTGCCGGTGCCGATTAGCCATATGCGCCAGCTGAGCCCGCTGTATCCGGTGGCAATGTGTACCCAGGCATTTTCTGCAGTTATTCCGCGCGGTAGTGCCCATGAAACCGTTCTGGTGCATGCACATGCACTGTTTCTGGCCGAATTTTCTAAAGTTATTAACCCGGATCTGCGCGGCAAAGGCAGTAGTGATATTCGTGATAGCTTTAAAGGCGCACTGAAAACCGCCCTGGAAAAACGTGAACCGTATCTGAATGAAGCACGTCAGGCACTGGTTAAAGGCATTGGCATTCTGGTTGCAGGTGGCGAAGAAGGCGCCGCACTGGTGCTGGCAGCCGGTATTCAGGAAGCAGCAAATACCTTTGTTAATACCTATGGCCCGCTGGCCTTTAATTAA。

SEQ ID NO.3如下：

MNSGKKQETAKKRGRKPATVPPGPRRETRSQSRSTMSDDQQHTNPPPPPTGRGSGGGGGQGGGGGQGGAGGSGRGGGGTG

GGGPAPKPGPSQQPDLAGGPEVPSCVEIDLLNGNYEDDPEDTPRVRYIKWWGRANRRASVRGLLGPEAGADPANMPAGFV

EGLQWAMDAMDNASTPVPRETILRLIRRSFQYKPVTKDIEEAAELFQYQGFDPVLVTAQLLSCGKAKNQGAGEVAKDIVA

MIVLYLTRGTNTEKMKNRMSEMGKMLMDRLEKQYQIRKGAVAPKEITLARVALTYPAITIRCTMQLGEKLPVPISHMRQL

SPLYPVAMCTQAFSAVIPRGSAHETVLVHAHALFLAEFSKVINPDLRGKGSSDIRDSFKGALKTALEKREPYLNEARQAL

VKGIGILVAGGEEGAALVLAAGIQEAANTFVNTYGPLAFN。

(2)引物设计：设计引物F1和R1扩增密码子优化后的塔城蜱病毒2的核蛋白基因，设计引物F2和R2扩增pET-21a载体：引物F1如SEQ ID NO.4所示，引物F2如SEQ ID NO.5所示。R1为F2反向互补序列，R2为F1反向互补序列。

SEQ ID NO.4如下：

GTTTAACTTTAAGAAGGAATGAACAGTGGTAAAAAGCAG；

SEQ ID NO.5如下：

ACCTATGGACCGCTGGCCTTTAATCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACTGA。

(3)PCR扩增目的基因和载体：PCR反应的试剂是KOD-Plus试剂盒(来自广州创伟生物科技有限公司)，使用引物F1和R1扩增密码子优化后的塔城蜱病毒2的核蛋白基因，使用引物F2和R2扩增pET-21a载体；具体步骤如下：

将5μL的10×的KOD-Plus聚合酶缓冲液、5μL的2mM dNTP混合物、2μL的25mM硫酸镁溶液、1.5μL的引物、1μL的扩增模板、1μL的KOD-Plus聚合酶和33μL的121℃、20min灭菌后的MiliQ超纯水混合。PCR反应条件：94℃预变性2min、94℃变性15s、54℃复性30s，68℃延伸3min，循环35次，最后68℃延伸10min，获得扩增产物，即扩增后的密码子优化后的塔城蜱病毒2的核蛋白基因(目的基因)和扩增后的pET-21a载体。1％(m/v)琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物的条带大小。

(4)融合质粒的构建：将上述步骤扩增得到的目的基因25μl和扩增后的载体10μl混合后加入1μl DpnI快切酶，37℃水浴30min。将连接产物全部转入200μl E.coli DH5α感受态细胞中进行转化，冰浴30min，42℃热激90秒，冰浴5min后，加入500μl LB液体培养基37℃复苏1小时，最后将菌液涂布在含有100ug/mL氨苄青霉素的琼脂糖平板上37℃培养过夜。挑取单克隆菌落于5ml新鲜LB培养基(加入氨苄青霉素抑制杂菌生长)中培养过夜，提取质粒，测序验证序列构建成功，获得该融合质粒。

实施例2

塔城蜱病毒2核蛋白制备

(1)将实施例1获得的融合质粒转入大肠杆菌BL21 DE3感受态细胞进行转化，冰浴30min，42℃热激90秒，冰浴5min后，加入600μL LB液体复苏1小时，最后将菌液涂布在含有100ug/mL氨苄青霉素琼脂糖平板上37℃过夜培养。克隆菌株在LB固态培养下，呈2mm左右圆形、边缘光滑清晰、白色或米白色的小菌落。

(2)挑取含融合质粒的菌株至50ml新鲜LB培养液中(加入氨苄青霉素抑制杂菌生长)，37℃过夜培养。

(3)取7ml培养物加至750ml新鲜LB液体培养液中(加入氨苄青霉素抑制杂菌生长)，37℃培养3.5h，测OD₆₀₀＝0.4～0.6。

(4)加入诱导剂IPTG诱导蛋白表达，诱导条件为：IPTG终浓度0.2mM/L，诱导温度16℃，诱导时间18h。

(5)4200rpm离心35min收集菌体，倒尽培养基残液，用裂解液(5mM咪唑，20mMTris-Hcl pH7.5，300mM NaCl)重悬菌体后超声波破碎细胞，功率为400W，工作模式设定为超声2秒，间歇8秒，每个循环10分钟，共计三个循环。将破碎后的细胞裂解液在4℃条件下，以25000g的离心力离心35分钟，收集上清，弃去沉淀。

(6)镍亲和层析纯化

将得到的约100ml上清液与预先用裂解液平衡好的NI-NTA柱的beads在4℃下孵育1h。孵育后的上清液流过NI-NTA柱，用咪唑浓度梯度去冲洗镍亲和层析柱，收集对应的蛋白洗脱液，全程处于4℃条件。分别取40μl蛋白洗脱溶液，加入10μl 5×SDS上样缓冲液，100℃变性10min，用SDS-PAGE检测目的蛋白的纯化结果(图1，TcTV2-NP镍柱纯化SDS-PAGE结果)。

图1为塔城蜱病毒2核蛋白镍亲和层析纯化后SDS-PAGE结果图；图中“上清”所示的泳道即为菌体破碎并离心后的上清液的泳道；“沉淀”所示的泳道即为菌体破碎并离心后的沉淀物的泳道；“流穿”所示的泳道即为孵育后流过NI-NTA柱的流穿液的泳道；“洗脱液20mM”所示的泳道即为含20mM咪唑的蛋白洗脱液的泳道；“洗脱液40mM”所示的泳道即为含40mM咪唑的蛋白洗脱液的泳道；“洗脱液60mM”所示的泳道即为含60mM咪唑的蛋白洗脱液的泳道；“洗脱液100mM”所示的泳道即为含100mM咪唑的蛋白洗脱液的泳道；“洗脱液110mM”所示的泳道即为含110mM咪唑的蛋白洗脱液的泳道；“洗脱液500mM”所示的泳道即为含500mM咪唑的蛋白洗脱液的泳道；“Marker”所示的泳道即为蛋白Marker(Conventional range)的泳道；图中箭头所指条带为目的蛋白塔城蜱病毒2核蛋白的条带位置。根据图1可知，本发明通过镍亲和层析纯化，在500mM咪唑洗脱液中获得了较纯的目的蛋白。

(7)凝胶过滤层析纯化

将含有目的蛋白的500mM的咪唑洗脱液收集起来，通过截留分子量为30kDa的超滤浓缩离心管(购自Millipore公司)将蛋白质浓缩并置换到凝胶层析缓冲液(20mM Tris-HclpH7.5，300mM NaCl，5mM DTT)中，使其最终体积为0.5ml。使用GE healthcare公司的自动蛋白质纯化仪将浓缩好的蛋白上样至Superose 6层析柱中，以0.5ml/min的流速洗脱目的蛋白。根据纯化过程中紫外吸收峰图(图2)及SDS-PAGE凝胶电泳(图3)鉴定目的蛋白TcTV2-NP。由图2紫外吸收峰图可知，通过多步纯化最终获得出峰位置在10ml处的目的蛋白，由出峰位置推断目的蛋白应为多聚体形式；由图3可知，经过凝胶过滤层析纯化后的目的蛋白相对较纯，在变性胶呈现出与其理论分子量大小47KDa相符的目的条带。即经过凝胶过滤层析纯化后最终能够获得较纯的塔城蜱病毒2核蛋白。

通过以上两步纯化得到的目的蛋白纯度较高，纯度达到90％以上。至此便获得基因工程抗原塔城蜱病毒2核蛋白NP。即本发明通过密码子优化后的质粒重组能获得在上清中大量表达的目的蛋白，利用亲和层析和凝胶过滤层析纯化获得较纯的目的蛋白。

实施例3

western-blot检测塔城蜱病毒2核蛋白NP抗体，具体步骤如下：

(1)配胶

1)将玻璃板洗净，最后用ddH₂O冲洗，将与胶接触的一面向下倾斜置于干净的纸巾晾干。

2)分离胶及浓缩胶均可事先配好(除AP及TEMED外)，过滤后作为储存液避光存放于4℃，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡(否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡)，加入10％AP及TEMED即可。

3)封胶：灌入2/3的分离胶后应立即封胶，胶浓度＜10％时可用0.1％的SDS封，浓度＞10％时用异丁醇或异戊醇，也可以用0.1％的SDS。封胶后静置至胶凝固。待胶凝后将封胶液倒掉，如用醇封胶需用大量清水及ddH₂O。冲洗干净，然后加少量0.1％的SDS，目的是通过降低张力清除残留水滴。

4)灌好浓缩胶后1h拔除梳子，注意在拔除梳子时防止气泡进入梳孔使梳孔变形。拨出梳子后用ddH₂O冲洗胶孔两遍以去除残胶，随后用0.1％的SDS封胶。若上样孔有变形，可用适当粗细的针头拨正。30min后上样，长时间有利于胶结构的形成，因为肉眼观的胶凝时其内部分子的排列尚未完成(10％的AP最好现配现用，如在4℃存放勿超过两周。30％的丙烯酰胺如有沉淀，最好弃掉)。

(2)上样、电泳

1)所有蛋白样品调至等浓度后上样，样品两侧的泳道用等体积的1×loadingbuffer上样，Marker也用1×loading buffer调整至与样品等体积。

2)以初始电压为45V时的电流强度进行稳流电泳，当电压达65V时改为稳压电泳。

3)在目的蛋白泳动至距胶下缘1cm以上结束。

(3)转膜

1)电泳结束前20分钟左右戴上手套开始准备：

湿转使用常规电转液：Tris 3.0g，Gly 14.4g，M-OH 200ml，加去离子水至1000ml。

浸泡NC膜：将NC膜平铺于去离子水面，待其自然吸水后再完全浸入水中10min以排除气泡，随后浸泡入转移液中。PVDF膜则在M-OH中浸泡20min以上后转入转移液中。将滤纸也浸入转移液中。

2)取胶：

将胶卸下，保留30-100KD或分子量范围更广些的胶，左上切角，在转移液中浸泡一下，置于洁净玻璃板上，按顺序铺上膜与膜每侧的一张滤纸。用玻棒逐出气泡后剪去滤纸与膜的过多部分。

3)转膜：

湿转：电转槽用去离子水淋洗晾干，加入1000ml电转液。将胶平铺于海绵上，滴加少许电转液再次驱赶气泡，封紧后放入电转槽，注意膜在正极一侧。降温，将电泳槽置于冰水混合物中。恒流100mA过夜，或400mA，4h。注意不同蛋白的要求不同。

电转液配方：Tris-base 3g，glycine 14.4g，200ml甲醇/1L

(4)封闭及杂交

1)封闭：将膜从电转槽中取出，去离子水与PBST或TTBS稍加漂洗，放于封闭液中缓慢摇荡一小时。

2)结合一抗：将含有一抗(Mouse Ant-His Mab 1:2000(南京金斯瑞生物科技有限公司))的封闭液滴加在摇床的塑料膜上，从封闭液中取出Western膜，滤纸贴角稍吸干，正面朝下贴在一抗上，注意不要产生气泡，室温下轻摇孵育一小时或4℃静置过夜。在反应体系外面罩一湿润平皿以防止液体过多蒸发。

3)洗涤：一抗孵育结束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。

4)结合二抗：选择合适的二抗(Goat Ant Mouse 1:5000(南京金斯瑞生物科技有限公司))，根据鉴定方法选择HRP或AP标记的抗体，按相应比例稀释(1:1000～1:10000)，室温轻摇一小时。

5)洗涤：二抗孵育结束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min

(5)发光鉴定(HRP-ECL发光法)

将A、B发光液按比例1:1稀释混合。膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于A、B混合液滴上，熄灯至可见淡绿色荧光条带(5min左右)后滤纸贴角吸干，置于保鲜膜内固定于片盒中，迅速盖上胶片，关闭胶盒，根据所见荧光强度曝光。取出胶片立即完全浸入显影液中1-2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水冲净晾干，标定Marker，进行分析与扫描(结果如图4所示，图4为纯化的塔城蜱病毒2核蛋白用质印迹法(免疫印迹试验)即Western blot检测抗体结果图；Lane 1:TcTV2-N protein(1.50μg)，M:Western Blot Marker)。根据图4可知，本申请纯化得到的塔城蜱病毒2核蛋白用质印迹法(免疫印迹试验)即Western blot检测抗体呈现出与其理论分子量47KDa相符的目的条带，条带单一均质。用BSA做标准品，采用Bradford法测定，蛋白浓度为0.330mg/mL。用R250染色的SDS-PAGE胶评估，蛋白纯度>90％。说明用本方法获得的TcTV-2-NP质量较好。

实施例4

ELISA检测塔城蜱病毒2核蛋白NP抗体：

(1)包被ELISA板

1)包被：实施例3合成得到TcTV-2核蛋白浓度0.330mg/mL，用包被液将核蛋白浓度稀释成5ug/mL溶液，每孔加入50μL到ELISA反应板，确保所加液体覆盖ELISA底部，4℃过夜。

2)洗涤：弃去孔内包被液，每孔加入洗涤液150μL置于脱色摇床上，洗涤3遍，5min/次。

(2)封闭、加样、反应

1)封闭：每孔加入配好的封闭液100μL，37℃恒温箱内孵育1h。将封闭液甩干，每孔加入洗涤液100μL置于脱色摇床上，洗涤3遍，5min/次。

2)结合一抗(即待检测血清)：用稀释液将一抗按1：50稀释，即先加45μL稀释液，再加5μL血清，尽量吹打混匀，但不能碰到加样孔底部，37℃恒温箱孵育1h。

洗涤：弃去一抗，每孔加入洗涤液100μL置于脱色摇床上，洗涤3遍，5min/次。

3)结合二抗：用稀释液将辣根过氧化物酶标记山羊抗人二抗(Goat Anti-HumanIgG-HRP(南京金斯瑞生物科技有限公司))按1：20000进行稀释(每2板需预混12mL稀释液，0.6μL IgG)，稀释完的二抗需要震荡混匀，混匀后每孔加入50μL，置于37℃恒温箱孵育1h。

4)洗涤：尽量将二抗甩干，每孔加入100μL洗涤液置于脱色摇床上，洗涤5遍，5min/次。

5)加TMB底物显色液：每孔加入50μL底物显色液(褐色瓶身，避光，速度要快)，置于37℃恒温培养箱内部显色25min(此时将酶标仪打开)。

6)加终止液：取2M H₂SO₄，每孔加入50μL，终止反应。

(3)OD值测定

1)测OD₄₅₀值：在450nm处，用酶标仪测定30份阴性血清OD值。

2)阴阳性结果判定：30份阴性血清OD值的平均值加上3倍的标准差得出临界值，EI(ELISA INDEX)＝样品OD值/临界值，高于1.2的样品EI为TcTV-2血清阳性样品。既血清OD₄₅₀值>0.9100为阳性样本(检测结果见表1)。

3)用构建的ELISA方法检测已知阳性血清(PCR检测阳性)10份，结果与PCR检测结果一致性达到100％(检测结果见表2)，同时检测了另外的20份阴性血清(包含了10份TcTV-1核蛋白抗体阳性的血清)，验证了本发明方法的诊断敏感性和特异度(检测结果见表3)。

表1 ELISA检测阴性血清OD值

表2 ELISA检测已知阳性血清塔城蜱病毒2核蛋白抗体结果

按照免疫定性方法的评价指南评价本发明方法的敏感性和特异性，结果如表3所示。

表3 ELISA方法的评价

ELISA检测人群血清塔城蜱病毒2核蛋白抗体

利用纯化表达的塔城蜱病毒2核蛋白NP构建的ELISA方法调查了玛纳斯县清水河乡5个村庄984份体检牧民的血清携带TcTV-2-NP IgG抗体的阳性率。其中，IgG抗体的阳性率分别为：牙湖村5.53％(11/199)、团庄村10.71％(21/196)、坎苏瓦特村14.53％(26/176)、巴斯陶村18.63％(38/204)、贝母房子村19.90％(41/206)，总的阳性率为13.92％(137/984)；该实验调查了男性447人，IgG抗体的阳性率为12.53％(56/447)；女性537人，IgG抗体的阳性率为15.08％(81/537)。本发明方法用于检测血清中的TcTV-2-NP IgG抗体的特异性高，可以用于高危人群的流行病学血清筛查，也可以用于蜱咬患者是否感染TcTV-2的鉴别诊断。同时检测血清中有TcTV-1抗体阳性血清，但检测结果阴性，说明本发明具有一定的病原抗干扰能力。如表4所示：

表4 ELISA检测人群血清塔城蜱病毒2核蛋白抗体结果

对比例1

利用载体pet-28a构建融合质粒后的蛋白纯化情况：

将目的蛋白密码子优化后的序列构建在载体pet-28a上进行重组蛋白表达(除了载体不同，蛋白表达的方法与实施例1相同)，图5是目的蛋白表达后进行的阴离子交换层析紫外吸收峰图，峰1是未挂柱的流穿峰，峰2峰3峰4是盐离子浓度梯度增加洗脱时的蛋白峰。

图6是目的蛋白在普通载体pet-28a上的阴离子交换层析纯化SDS-PAGE结果；“M”指Protein Marker；泳道“1”指阴离子交换层析纯化前的蛋白；“峰1”“峰2”“峰3”“峰4”分别对应于图5中的“峰1”“峰2”“峰3”“峰4”；其中，“峰2”圈出部分对应目的蛋白条带。

由图6可知，峰2包含目的蛋白，但纯度欠佳。

鉴于普通载体pet-28a表达纯化后蛋白纯度欠佳，本发明所用的pet-21a载体能够更好的表达塔城蜱病毒2核蛋白，经纯化后蛋白纯度较好。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 石河子大学

中山大学

<120> 一种含编码塔城蜱病毒2核蛋白基因的融合质粒、宿主菌及蛋白的制备方法和应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1323

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgaactcag gtaagaagca agagacagca aaaaagagag ggaggaagcc agccacagtc 60

ccgcccggac caagaagaga gaccagaagc cagtcccgat ccacaatgtc ggacgatcaa 120

cagcacacca acccaccccc acctccgaca gggagagggt ccggaggagg aggtggccaa 180

ggcggaggag gaggccaagg aggtgcaggg gggtcaggaa gaggaggcgg aggcactggt 240

ggaggtggcc ctgctccgaa gccaggaccc tcccagcagc ctgatcttgc aggaggccct 300

gaggtcccct cctgcgtgga aattgatctc ctcaacggca actatgagga tgaccccgag 360

gacaccccac gggttaggta catcaagtgg tggggcaggg ccaaccgcag ggcctcggtg 420

agggggttgc tggggccaga agcaggtgca gatcctgcca acatgccagc cggcttcgtg 480

gagggcctgc agtgggccat ggatgcgatg gacaacgcat caacaccagt gcctcgggag 540

acaatcctgc gtctcatcag gcggtccttc caatacaagc cagtcaccaa ggacatagag 600

gaggccgctg agctcttcca gtaccagggc tttgaccctg tgttggtgac agcccaactg 660

ctgtcctgtg ggaaggcaaa gaaccaaggc gcaggggagg tggccaagga cattgtggcc 720

atgattgtgc tctacctcac aaggggcaca aacacagaaa aaatgaagaa ccgcatgtcc 780

gagatgggca agatgctgat ggatcggctg gaaaaacagt accagatccg gaagggtgcc 840

gtggcgccca aggagatcac cctggccagg gttgccctca cctacccggc catcaccatc 900

agatgcacca tgcagctggg cgaaaagctg ccagtgccca tctcacacat gcgccagctc 960

tcaccactgt accctgtggc catgtgcaca caagccttct ccgccgtcat cccccgaggc 1020

tctgcccatg agaccgtcct ggtccatgct catgccctct tcctggcaga gttctccaag 1080

gtcatcaacc ccgacctgag agggaagggc agctccgaca tcagggactc cttcaaggga 1140

gccctgaaga ccgccctgga gaagcgggag ccctacctga atgaggccag gcaggcactg 1200

gtgaagggca tcggcatctt ggtggcagga ggggaagaag gggccgcact ggtgttggca 1260

gctggcattc aagaggctgc caacactttt gtcaacacgt atggcccgct ggccttcaat 1320

tga 1323

<210> 2

<211> 1323

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgaacagtg gtaaaaagca ggaaaccgca aaaaagcgtg gtcgtaaacc ggccaccgtg 60

ccgccgggtc ctcgtcgtga aacccgcagc cagagccgta gcaccatgag cgatgatcag 120

cagcatacca atccgccgcc gccgcctacc ggcagaggta gcggtggtgg cggcggtcag 180

ggcggtggtg gtggtcaagg tggtgcaggc ggtagcggcc gcggtggtgg tggcaccggt 240

ggtggtggac cggctcctaa accgggcccg agccagcagc cggatctggc aggtggcccg 300

gaagtgccga gctgcgttga aattgatctg ctgaatggta attatgaaga tgatccggaa 360

gataccccgc gcgttcgcta tattaagtgg tggggtcgcg ccaatcgccg cgcaagcgtt 420

cgtggtctgc tgggtccgga agcaggtgca gatccggcaa atatgccggc cggctttgtt 480

gaaggcctgc agtgggcaat ggatgcaatg gataatgcca gtaccccggt tccgcgcgaa 540

accattctgc gtctgattcg tcgtagtttt cagtataaac cggtgaccaa agatattgaa 600

gaagccgcag aactgtttca gtatcagggt tttgatccgg tgctggtgac cgcacagctg 660

ctgagctgtg gtaaagcaaa aaatcagggt gcaggtgaag ttgcaaaaga tattgttgca 720

atgattgtgc tgtatctgac ccgcggtacc aataccgaaa aaatgaaaaa tcgcatgagc 780

gaaatgggca aaatgctgat ggatcgcctg gaaaaacagt atcagattcg taaaggtgcc 840

gttgcaccga aagaaattac cctggcccgt gttgccctga cctatccggc aattaccatt 900

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gccggtattc aggaagcagc aaataccttt gttaatacct atggcccgct ggcctttaat 1320

taa 1323

<210> 3

<211> 440

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Asn Ser Gly Lys Lys Gln Glu Thr Ala Lys Lys Arg Gly Arg Lys

1 5 10 15

Pro Ala Thr Val Pro Pro Gly Pro Arg Arg Glu Thr Arg Ser Gln Ser

20 25 30

Arg Ser Thr Met Ser Asp Asp Gln Gln His Thr Asn Pro Pro Pro Pro

35 40 45

Pro Thr Gly Arg Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly

50 55 60

Gly Gln Gly Gly Ala Gly Gly Ser Gly Arg Gly Gly Gly Gly Thr Gly

65 70 75 80

Gly Gly Gly Pro Ala Pro Lys Pro Gly Pro Ser Gln Gln Pro Asp Leu

85 90 95

Ala Gly Gly Pro Glu Val Pro Ser Cys Val Glu Ile Asp Leu Leu Asn

100 105 110

Gly Asn Tyr Glu Asp Asp Pro Glu Asp Thr Pro Arg Val Arg Tyr Ile

115 120 125

Lys Trp Trp Gly Arg Ala Asn Arg Arg Ala Ser Val Arg Gly Leu Leu

130 135 140

Gly Pro Glu Ala Gly Ala Asp Pro Ala Asn Met Pro Ala Gly Phe Val

145 150 155 160

Glu Gly Leu Gln Trp Ala Met Asp Ala Met Asp Asn Ala Ser Thr Pro

165 170 175

Val Pro Arg Glu Thr Ile Leu Arg Leu Ile Arg Arg Ser Phe Gln Tyr

180 185 190

Lys Pro Val Thr Lys Asp Ile Glu Glu Ala Ala Glu Leu Phe Gln Tyr

195 200 205

Gln Gly Phe Asp Pro Val Leu Val Thr Ala Gln Leu Leu Ser Cys Gly

210 215 220

Lys Ala Lys Asn Gln Gly Ala Gly Glu Val Ala Lys Asp Ile Val Ala

225 230 235 240

Met Ile Val Leu Tyr Leu Thr Arg Gly Thr Asn Thr Glu Lys Met Lys

245 250 255

Asn Arg Met Ser Glu Met Gly Lys Met Leu Met Asp Arg Leu Glu Lys

260 265 270

Gln Tyr Gln Ile Arg Lys Gly Ala Val Ala Pro Lys Glu Ile Thr Leu

275 280 285

Ala Arg Val Ala Leu Thr Tyr Pro Ala Ile Thr Ile Arg Cys Thr Met

290 295 300

Gln Leu Gly Glu Lys Leu Pro Val Pro Ile Ser His Met Arg Gln Leu

305 310 315 320

Ser Pro Leu Tyr Pro Val Ala Met Cys Thr Gln Ala Phe Ser Ala Val

325 330 335

Ile Pro Arg Gly Ser Ala His Glu Thr Val Leu Val His Ala His Ala

340 345 350

Leu Phe Leu Ala Glu Phe Ser Lys Val Ile Asn Pro Asp Leu Arg Gly

355 360 365

Lys Gly Ser Ser Asp Ile Arg Asp Ser Phe Lys Gly Ala Leu Lys Thr

370 375 380

Ala Leu Glu Lys Arg Glu Pro Tyr Leu Asn Glu Ala Arg Gln Ala Leu

385 390 395 400

Val Lys Gly Ile Gly Ile Leu Val Ala Gly Gly Glu Glu Gly Ala Ala

405 410 415

Leu Val Leu Ala Ala Gly Ile Gln Glu Ala Ala Asn Thr Phe Val Asn

420 425 430

Thr Tyr Gly Pro Leu Ala Phe Asn

435 440

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtttaacttt aagaaggaat gaacagtggt aaaaagcag 39

<210> 5

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

acctatggac cgctggcctt taatcaccac caccaccacc accaccacca ccactga 57

Claims

1.一种塔城蜱病毒2核蛋白制备方法，包括以下步骤：

将宿主菌在液体培养基中培养，至OD₆₀₀为0.4~0.6，加入IPTG诱导；

诱导完成后，收集菌体，进行细胞裂解，离心取上清液；所述诱导的条件包括：IPTG终浓度设置为0.2mM，诱导温度为16℃，诱导时间为18h；

将所述上清液进行镍柱纯化，得到粗蛋白；

将所述粗蛋白进行凝胶过滤层析纯化，得到塔城蜱病毒2核蛋白；

所述宿主菌为大肠杆菌BL21 DE3；所述宿主菌含融合质粒；所述融合质粒的骨架载体为pET-21a；所述融合质粒含密码子优化后的编码塔城蜱病毒2核蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述镍柱纯化使用500mM的咪唑洗脱液进行洗脱。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述细胞裂解的条件包括：将菌体溶于细胞裂解液，超声破碎。