EP1244802A2 - Wurzelspezifischer promotor - Google Patents
Wurzelspezifischer promotorInfo
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- EP1244802A2 EP1244802A2 EP00993417A EP00993417A EP1244802A2 EP 1244802 A2 EP1244802 A2 EP 1244802A2 EP 00993417 A EP00993417 A EP 00993417A EP 00993417 A EP00993417 A EP 00993417A EP 1244802 A2 EP1244802 A2 EP 1244802A2
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Links
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Classifications
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- C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
- C12N15/8223—Vegetative tissue-specific promoters
- C12N15/8227—Root-specific
Definitions
- the present invention relates to transgenic plants with a regulatory nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 1 to 3 which is stably integrated into the genome after their transformation, or their fragment or derivative and a nucleic acid sequence coding for a gene product and functionally linked to this nucleic acid sequence. Furthermore, the present invention relates to processes for the production of the transgenic plants according to the invention and the nuclear acid sequences according to SEQ ID NO: 1 to 3.
- the regulatory nucleic acid sequence relates to polynucleotides which naturally permit largely root-specific expression of a foreign gene in plants of the Arabidopsis thahana species.
- promoters are used in plants to regulate the transcription of natural and recombinant genes.
- the entirety of all DNA sections which regulate the specificity of the transcription of a gene is referred to as the promoter of the gene, with different regulatory elements being distinguished from one another within promoters.
- the promoters determine the spatial and temporal transcription of the genes, i.e. at which location of the plant and at what time in the course of the development of the plant the genes which they control are expressed.
- Figure 1 shows the nucleic acid sequence of the 5 'upstream region before the transcription start point of the PyKlO gene. This region is also referred to below as pPYKlO and is listed in SEQ ID NO: 1. Position 1 marks the start of the transcription. The underlined italicized base indicates the position -1 before the transcription start point. The areas in bold and underlined indicate primer sequences that have been modified to insert an Xhol interface. The bold and underlined area indicates the reverse primer sequence.
- Figure 2 shows the nucleic acid sequence of a fragment of pPYKlO.
- the fragment is also referred to below as pPYKlOc and is listed in SEQ ID NO: 2 without the restriction sites introduced.
- Position 1 marks the start of the transcription.
- the underlined italicized base indicates the position -1 before the transcription start point.
- the area in bold and underlined indicates a primer sequence that was modified to insert an Xhol interface.
- the bold and underlined area indicates the reverse primer sequence.
- Figure 3 shows the nucleic acid sequence of a fragment of pPYKlO and pKYKlOc.
- the fragment is also referred to below as pPYKlOb and is listed in SEQ ID NO: 3 without the restriction sites introduced.
- Position 1 marks the start of the transcription.
- the underlined italicized base indicates the position -1 before the transcription start point.
- the area in bold and underlined indicates a primer sequence that was modified to insert an Xhol interface.
- the bold and underlined area indicates the reverse primer sequence.
- the term "functionally linked" as used herein means that a regulatory sequence such as a promoter controls expression of a gene.
- transgenic plant used here relates to plants which were produced by means of recombinant genetic engineering and / or microbiological processes and not by means of conventional breeding processes.
- vector denotes naturally occurring or artificially created constructs for the uptake, multiplication, expression or transfer of nucleic acids, e.g. Plasmids, phagemids, cosmids, artificial chromosomes, bacteriophages, viruses, retroviruses.
- homologs or “homologous sequences” used here denote nucleic acid sequences with significant similarity to the comparison sequence or parts thereof. Homologous sequences are thus nucleic acid sequences which hybridize with the comparison sequences or parts of these sequences under stringent or less stringent conditions (for stringent and less stringent conditions see Sambrook et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1989), ISBN 0-87969- 309-6).
- stringent hybridization conditions is: Hybridization in 4 x SSC at 65 ° C (alternatively in 50% formamide and 4 X SSC at 42 ° C), followed by several washing steps in 0.1 x SSC at 65 ° C for a total of about one Hour.
- homologous sequences are also to be considered nucleic acid sequences or parts thereof which, with the aid of the BLAST similarity algorithm (Basic Local Alignment Search Tool, Altschul et al., Journal of Molecular Biology 215, 403-410 (1990)) have a significant similarity to a comparison sequence. Sequences are described as significantly similar, as used here, which, for example using standard parameters in the BLAST service of the NCBI, have an identity of at least 60% when compared with the comparison sequence, ie they are then at least 60% homologous.
- the polynucleotides according to the invention are functionally defined on the one hand by the feature that they allow largely root-specific expression of a foreign gene (hereinafter also referred to as transgene) in plants of the Arabidopsis thahana species.
- transgene a foreign gene
- “Largely” means in mind the invention that the expression of the transgene in the roots clearly outweighs any expression in the plant's shoot organs.
- the expression in the root clearly outweighs the meaning of the invention if it is at least twice as high as that of the shoot organs.
- the promoter activity of the polynucleotides according to the invention can be restricted to certain root tissues or to certain root areas such as, for example, root tips, lateral root buds or the like.
- the promoter activity can also extend over the entire plant root without restriction to individual areas or tissues.
- a polynucleotide according to the invention as a promoter has an unspecific phase, for example at the beginning of the development of a transgenic plant, in which the promoter activity is not restricted to the root.
- the functional feature mentioned does not imply any restriction of this property claim directed to a polynucleotide to use only in plants of the Arabidopsis thahana species. Rather, the polynucleotide according to the invention can also be used to produce transgenic dicotyledonous plants, in particular those of the Brassicaceae family, e.g. of the genera Brassica, Sinapis or Raphanus, or the family Solanaceae e.g. of the genera Lycopersicon, Solanum or Capsicum, or the family Fabaceae e.g.
- the genera Vicia, Medicago, Trifolium, Glycine or Pisum or the family Cucurbitaceae e.g. of the genera Cucumis or Cucurbita, or the family Apiaceae e.g. of the genera Daucus or Apium, or the family Rosaceae e.g. of the genera Malus, Pyrus, Rubus, Fragaria or Prunus, or the family Convulvulaceae e.g. the genus Ipomoea, or the family Euphorbiaceae e.g. the genus Manihot, or the family Chenopodiaceae e.g. the genus Beta can be used.
- the polynucleotide according to the invention for the production of transgenic monocotyledonous plants in particular those of the Poaceae family, e.g. of the genera Triticum, Hordeum, Avena, Seeale, Oryza, Zea or Saccharum, or the family Musaceae e.g. the genus Musa, or the family Arecaceae e.g. of the genera Phoenix, Elaeis or Cocos can be used.
- the minimum length of a polynucleotide according to the invention according to feature a) or b) is 200 nucleotides.
- Preferred minimum lengths are 300, 400, 500, 600 and 700 nucleotides.
- a polynucleotide according to the invention is at least 60% homologous to a corresponding number of successive nucleotides from SEQ ID NO: 1.
- a homology of at least 70%, 80% and 90% is further preferred.
- a criterion to be used, regardless of the degree of homology, is whether a polynucleotide can hybridize as a single strand with a single strand of corresponding length from SEQ ID NO: 1 under stringent conditions.
- the invention furthermore relates to polynucleotides which can be obtained by screening a DNA bank of a plant of the Bassicaceae family with a corresponding gene probe.
- DNA banks of the genus Arabidopsis are mentioned by way of example, within this genus in turn DNA banks of the species Arabidopsis thaliana. Such DNA banks are readily accessible to the person skilled in the art.
- the invention further relates to fragments of the polynucleotides found by means of a gene probe, which show extensive root-specific promoter activity. The minimum length of such fragments having promoter activity is likewise preferably 200 nucleotides.
- a polynucleotide with the biological function of a promoter which largely expresses a functionally linked foreign gene in transgenic plants in a root-specific manner.
- certain polypeptides can be accumulated specifically in roots or, by means of such polypeptides, for example, influence the growth of the roots or increase their resistance or defense against pathogens and parasites.
- "Foreign gene" in the sense of the invention means that both endogenous and exogenous nucleic acid sequences coding for a gene product can be used. Endogenous means that the nucleic acid sequence comes from the same organism in which it is integrated using the method according to the invention. Exogenous, on the other hand, means that the nucleic acid sequence comes from another organism.
- polypeptides specifically produced and / or enriched and optionally isolated in the roots can originate from any organism such as humans, animals, plants, fungi, bacteria, protozoa or viruses and can be any polypeptide.
- Polypeptides that can affect the growth of the roots e.g. Growth factors, plant hormones, inhibitors or enzymes of the secondary metabolism.
- Pathogens or parasites which are intended to be weakened or warded off by polypeptides specifically expressed in the roots can e.g. of the genera Pythium, Fusarium or Verticillium, or soil-based protozoa e.g. of the genera Plasmodiophora or Spongospora, or plant parasitic nematodes e.g. of the genera Globodera, Heterodera, Pratylenchus, Radopholus, Trichodorus or Longidorus, or insects e.g. of the genera Melolontha, Otiorhynchus or Tipula.
- Preferred polynucleotides which can be used according to the invention are given in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3. Preference is furthermore given to those polynucleotides which are at least 60%, preferably 70%, further preferably 80%, further preferably 90% homologous to the aforementioned sequences.
- the invention also relates to a vector which, in addition to a foreign gene to be introduced into a plant cell or plant tissue, also has a functionally associated gene contains polynucleotide 1 according to the invention.
- the invention further relates to plant cells which contain such a vector or the polynucleotide according to the invention which is stably integrated into the genome and the functionally linked foreign gene, and to transgenic plants which contain such plant cells.
- Transgenic plants according to the invention can be dicotyledonous or monocotyledonous plants of the families and genera listed above.
- a transgenic plant according to the invention preferably originates from the genus Arabidopsis, for example it can be Arabidopsis thahana.
- the invention further relates to the use of a polynucleotide according to the invention for the root-specific expression of a foreign gene in a plant and a corresponding method for producing a transgenic plant, which comprises the following steps: fusing a foreign gene with a polynucleotide according to the invention, optionally producing a vector which contains the fusion product Introducing the vector or the fusion product into a plant cell or plant tissue and regenerating the plant cell or tissue into a plant, in particular into a fertile plant.
- a genomic bank of A. thaliana wild type C24 was used to isolate the promoter pPYKlO.
- a 750 bp HindIII restriction fragment from the 5 'region of the PyklO cDNA clone was used as a probe for screening the bank.
- the plaque hybridization led to the identification of a positive clone on the parent plate.
- the clone designated ⁇ -glc was isolated and isolated by two to three replatings.
- the phage DNA was subjected to a restriction enzyme analysis and the five corresponding fragments, which contained the promoter sequences, were subcloned into the vector pBluescript-M13 +.
- the 3 'end of the promoter was determined using the primer extension method (adenine Example 2
- the promoter sequence pPYKlO was examined for possible cis-regulatory sequence elements.
- Cis-regulatory sequence elements are predominantly relatively short sequence regions which, through interaction with specific, DNA-binding proteins, the trans factors, influence the gene expression positively or negatively.
- the sequence analysis revealed various upstream cis elements which have homologies to known regulatory sequences in other eukaryotic promoters.
- the specific sequence elements are summarized in Table 1 for an overview. All cis sequences listed here, with the exception of the repressor elements GAAAGAA and ATGGG, are transcriptional activator sequences.
- ACGT ACGT cores 9 e.g. GBFs, HBPs, CPRFs
- TGACG as-1 element 3 ASF-1, TGA1 family
- AAACCA ARE sequence 2
- the ACGT core motifs are sequences that are contained in many plant genes and transmit signals of environmental and development-related stimuli.
- the CANNTG motifs regulate the spatial and temporal, as well as the gene expression induced by light.
- the C / EBP elements mediate cell type-specific gene activity.
- Myb-Motife control secondary metabolism, regulate cellular morphogenesis and are involved in the signal transduction pathways of plant growth regulators.
- Elicitor boxes convey a gene induction caused by elicitors.
- the regulatory sequence TATTTTG is a wound-responsive element.
- the CTCC element is both wound and elicitor responsive. Genes that have as-1 type elements in their promoter can be induced by auxin, salicylic acid and methyl jasmonate.
- AP-1 elements occur in several eukaryotic promoters, but their function is not described in detail. Since they also exist in large numbers in the promoter regions of the myrosinases TGG1 and TGG2, they were regarded as relevant sequence elements. Sequences that occur repeatedly as direct and / or inverted repeats in the promoter region are often cis-regulatory Elements. In the sequence examined, several direct repetitions of the sequence element GATA occur. GATA motifs occur in many promoter areas of dicotyledons and have been described as light and tissue-specific elements. The arrangement of the cis elements occurring in the 5 'region of the PyklO gene is shown schematically in Figure 2. For reasons of clarity, only the most important regulatory sequences have been taken into account.
- a promoter test was carried out using the GUS reporter gene system (Jefferson, 1987). For this purpose, a promoter fragment was produced, fused with the GUS gene and transferred to Arabidopsis thaliana using Agrobacterium tumefaciens.
- the organ and tissue-specific GUS gene activity should be determined on the basis of the transgenic plants.
- the pPYKlOb and pPYKlOc fragments intended for cloning were produced using PCR.
- the fragments were amplified using the Pfu polymerase, which has proof-reading activity.
- the primers used were provided with restriction sites as shown in the table below.
- promoter fragment B led to a strong GUS expression in the root.
- the promoter constructs B and C show a similar expression pattern, but the promoter B construct has a lower blue coloration in the cotyledons.
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft transgene Pflanzen mit einer nach ihrer Transformation stabil in das Genom integrierten regulatorischen Nukleinsäuresequenz gemäss SEQ ID NO:1 bis 3, oder ihrem Fragment oder Derivat und einer mit dieser Nukleinsäuresequenz funktionell verbundenen für ein Genprodukt codierenden Nukleinsäuresequenz. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemässen transgenen Pflanzen sowie die Nukleinsäuresequenzen gemäss SEQ ID NO:1 bis 3. Die regulatorische Nukleinsäuresequenz betrifft Polynukleotide, die natürlicherweise in Pflanzen der Art <i>Arabidopsis thaliana</i> eine weitgehend wurzelspezifische Expression eines Fremdgens erlauben.
Description
Wurzelspezifischer Promotor
Die vorliegende Erfindung betrifft transgene Pflanzen mit einer nach ihrer Transformation stabil in das Genom integrierten regulatorischen Nukleinsauresequenz gemäß SEQ ID NO:l bis 3, oder ihrem Fragment oder Derivat und einer mit dieser Nukleinsauresequenz funktioneil verbundenen für ein Genprodukt codierenden Nukleinsauresequenz. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen sowie die Nuklemsäuresequenzen gemäß SEQ ID NO:l bis 3. Die regulatorische Nukleinsauresequenz betrifft Polynukleotide, die natürlicherweise in Pflanzen der Art Arabidopsis thahana eine weitgehend wurzelspezifische Expression eines Fremdgens erlauben.
Promotoren dienen unter anderem in Pflanzen zur Regulation der Transkription natürlicher und rekombinanter Gene. Die Gesamtheit aller DNA-Abschnitte, die die Spezifität der Transkription eines Gens regulieren, wird als Promotor des Gens bezeichnet, wobei innerhalb von Promotoren verschiedene regulatorische Elemente voneinander unterschieden werden. Die Promotoren bestimmen die räumliche und zeitliche Transkription der Gene, d.h. an welchem Ort der Pflanze und zu welchem Zeitpunkt im Entwicklungsverlauf der Pflanze die von ihnen gesteuerten Gene exprimiert werden.
Es ist auf offenkundiger Vorbenutzung bekannt, Fremdgene in Pflanzen zur Expression zu bringen. In solchen transgenen Pflanzen werden häufig konstitutive Promotoren eingesetzt, die zur permanenten Expression des Gens in weitgehend allen Pflanzengeweben führen. Aus verschiedenen Gründen, wie etwa der Verbesserung der Genexpression und Steigerung der Konzentration des durch ein Fremdgen exprimierten Proteins, der Verbesserung der Energiebilanz (Protein wird nur da gebildet, wo es gebraucht wird) oder der Verbesserung der Umweltsicherheit kann es erwünscht sein, Fremdgene nicht konstitutiv sondern gewebespezifisch zu exprimieren. Beispielsweise kann es erwünscht sein, mittels bestimmter Polypeptide Wurzeln vor Pathogenen oder Parasiten zu schützen oder bestimmte Polypeptide in den Wurzeln zwecks Gewinnung anzureichern.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, Polynukleotide mit einer Nukleinsauresequenz bereitzustellen, die eine wurzelspezifische Expression von Transgenen in Pflanzen erlauben.
Die Aufgabe wird durch den in den Patentansprüchen definierten Gegenstand gelöst.
Die Erfindung wird durch die folgenden Figuren erläutert.
Figur 1 zeigt die Nukleinsauresequenz der 5'-stromaufwärts liegenden Region vor dem Transkriptionsstartpunkt des PyKlO-Gens. Diese Region wird im folgenden auch als pPYKlO bezeichnet und ist in SEQ ID NO:l aufgeführt. Die Position 1 kennzeichnet den Transkriptionsstartpunkt. Die kursiv gedruckte, unterstrichene Base kennzeichnet die Position -1 vor dem Transkriptionsstartpunkt. Die fettgedruckten und doppelt unterstrichenen Bereiche kennzeichnen Primersequenzen, die zur Insertion einer Xhol Schnittstelle modifiziert wurden. Der fettgedruckte und einfach unterstrichene Bereich kennzeichnet die reverse Primersequenz.
Figur 2 zeigt die Nukleinsauresequenz eines Fragments von pPYKlO. Das Fragment wird im folgenden auch als pPYKlOc bezeichnet und ist ohne die eingeführten Restriktionsschnittstellen in SEQ ID NO:2 aufgeführt. Die Position 1 kennzeichnet den Transkriptionsstartpunkt. Die kursiv gedruckte, unterstrichene Base kennzeichnet die Position -1 vor dem Transkriptionsstartpunkt. Der fettgedruckte und doppelt unterstrichene Bereich kennzeichnet eine Primersequenz, die zur Insertion einer Xhol Schnittstelle modifiziert wurde. Der fettgedruckte und einfach unterstrichene Bereich kennzeichnet die reverse Primersequenz.
Figur 3 zeigt die Nukleinsauresequenz eines Fragments von pPYKlO und pKYKlOc. Das Fragment wird im folgenden auch als pPYKlOb bezeichnet und ist ohne die eingeführten Restriktionsschnittstellen in SEQ ID NO:3 aufgeführt. Die Position 1 kennzeichnet den Transkriptionsstartpunkt. Die kursiv gedruckte, unterstrichene Base kennzeichnet die Position -1 vor dem Transkriptionsstartpunkt. Der fettgedruckte und doppelt unterstrichene Bereich kennzeichnet eine Primersequenz, die zur Insertion einer Xhol Schnittstelle modifiziert wurde. Der fettgedruckte und einfach unterstrichene Bereich kennzeichnet die reverse Primersequenz.
Der hier verwendete Ausdruck "funktionell verbunden" bedeutet, daß eine regulatorische Sequenz wie ein Promotor die Expression eines Gens steuert.
Der hier verwendete Ausdruck „transgene Pflanze" betrifft Pflanzen, die mittels rekombinanter Gentechnik und/oder mikrobiologischen Verfahrens und nicht mittels herkömmlicher Züchtungsverfahren hergestellt wurden.
Der hier verwendete Ausdruck "Vektor" bezeichnet natürlich vorkommende oder künstlich erschaffene Konstrukte zur Aufnahme, Vermehrung, Expression oder Übertragung von Nukleinsäuren, z.B. Plasmide, Phagemide, Cosmide, künstliche Chromosomen, Bakteriophagen, Viren, Retroviren.
Die hier verwendeten Ausdrücke „Homologe" oder „homologe Sequenzen" bezeichnen Nukleinsäuresequenzen mit signifikanter Ähnlichkeit zur Vergleichssequenz oder Teilen davon. Als homologe Sequenzen gelten somit Nukleinsäuresequenzen, die mit den Vergleichssequenzen oder Teilen dieser Sequenzen unter stringenten oder wenig stringenten Bedingungen hybridisieren (zu stringenten und wenig stringenten Bedingungen siehe Sambrook et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory (1989), ISBN 0-87969-309-6). Ein Beispiel für stringente Hybridisierungsbedingungen ist: Hybridisierung in 4 x SSC bei 65° C (alternativ in 50% Formamid und 4 X SSC bei 42° C), gefolgt von mehreren Waschschritten in 0,1 x SSC bei 65°C für insgesamt etwa eine Stunde. Ein Beispiel für wenig stringente Hybridisierungsbedingungen ist Hybridisierung in 4 x SSC bei 37° C, gefolgt von mehreren Waschritten in 1 x SSC bei Raumtemperatur. Als homologe Sequenzen sollen des weiteren Nukleinsäuresequenzen oder Teile davon gelten, die unter Zuhilfenahme des Similaritätsalgorithmus BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, Altschul et al., Journal of Molecular Biology 215, 403-410 (1990) eine signifikante Ähnlichkeit mit einer Vergleichssequenz aufweisen. Als signifikant ähnlich werden, wie hier verwendet, Sequenzen bezeichnet, die z.B. unter Verwendung von Standardparametern im BLAST-Service des NCBI eine Identität von mindestens 60% aufweisen, wenn Sie mit der Vergleichssequenz verglichen werden, d.h. sie sind dann zu mindestens 60% homolog.
Die erfindungsgemäßen Polynukleotide sind zum einen funktioneil durch das Merkmal definiert, daß sie in Pflanzen der Art Arabidopsis thahana eine weitgehend wurzelspezifische Expression eines Fremdgens (im weiteren auch Transgen genannt) erlauben. „Weitgehend" bedeutet im Sinn
der Erfindung, daß die Expression des Transgens in den Wurzeln eine etwaige Expression in Sproßorganen der Pflanze deutlich überwiegt. Die Expression in der Wurzel überwiegt im Sinne der Erfindung deutlich, wenn sie gegenüber den Sproßorganen mindestens doppelt so hoch ist. Dabei kann die Promotoraktivität der erfindungsgemäßen Polynukleotide auf bestimmte Wurzelgewebe oder auf bestimmte Wurzelbereiche wie zum Beispiel Wurzelspitzen, Seitenwurzelknospen oder ähnliches beschränkt sein. Die Promotoraktivität kann sich jedoch auch über die gesamte Pflanzenwurzel ohne Beschränkung auf einzelne Bereich oder Gewebe erstrecken. Im Rahmen der Erfindung ist es möglich, daß ein erfindungsgemäßes Polynukleotid als Promotor eine unspezifische Phase beispielsweise zu Beginn der Entwicklung einer transgenen Pflanze aufweist, in der die Promotoraktivität nicht auf die Wurzel beschränkt ist.
Angemerkt sei in diesem Zusammenhang, daß das genannte funktionelle Merkmal keine Beschränkung dieses auf einen Polynukleotid gerichteten Sachanspruchs auf eine Verwendung lediglich in Pflanzen der Art Arabidopsis thahana beinhaltet. Vielmehr kann das erfindungsgemäße Polynukleotid femer zur Herstellung transgener dikotyler Pflanzen insbesondere solcher der Familie Brassicaceae z.B. der Gattungen Brassica, Sinapis oder Raphanus, oder der Familie Solanaceae z.B. der Gattungen Lycopersicon, Solanum oder Capsicum, oder der Familie Fabaceae z.B. der Gattungen Vicia, Medicago, Trifolium, Glycine oder Pisum, oder der Familie Cucurbitaceae z.B. der Gattungen Cucumis oder Cucurbita, oder der Familie Apiaceae z.B. der Gattungen Daucus oder Apium, oder der Familie Rosaceae z.B. der Gattungen Malus, Pyrus, Rubus, Fragaria oder Prunus, oder der Familie Convulvulaceae z.B. der Gattung Ipomoea, oder der Familie Euphorbiaceae z.B. der Gattung Manihot, oder der Familie Chenopodiaceae z.B. der Gattung Beta verwendet werden.
Femer kann das erfindungsgemäße Polynukleotid zur Herstellung transgener monokotyler Pflanzen insbesondere solcher der Familie Poaceae z.B. der Gattungen Triticum, Hordeum, Avena, Seeale, Oryza, Zea oder Saccharum, oder der Familie Musaceae z.B. der Gattung Musa, oder der Familie Arecaceae z.B. der Gattungen Phoenix, Elaeis oder Cocos verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen Polynukleotide sind femer durch eines der vier folgenden Merkmale gekennzeichnet:
a) wenigstens 200 Nukleotide mit einer aufeinanderfolgenden Nukleinsauresequenz aus der SEQ ID NO:!
b) wenigstens 200 Nukleotide, die zu einer entsprechenden Zahl von Nukleotiden mit einer aufeinanderfolgenden Nukleinsauresequenz aus der SEQ ID NO:l zu wenigstens 60% homolog sind, c) Polynukleotide, die erhältlich sind durch Absuchen einer DNA-Bank einer Pflanze der Familie Brassicaceae mit einer Gensonde mit wenigstens 50 Nukleotiden mit einer aufeinanderfolgenden Nukleinsauresequenz aus der SEQ ID NO:l, d) Promotoraktivität aufweisende Fragmente der in c) definierten Polynukleotide.
Die Mindestlänge eines erfindungsgemäßen Polynukleotids gemäß Merkmal a) oder b) beträgt 200 Nukleotide. Bevorzugte Mindestlängen sind 300, 400, 500, 600 bzw. 700 Nukleotide.
Gemäß Merkmal b) ist ein erfindungsgemäßes Polynukleotid zu einer entsprechenden Zahl von aufeinanderfolgenden Nukleotiden aus der SEQ ID NO:l zu wenigstens 60% homolog. Weiter bevorzugt ist eine Homologie von wenigstens 70%, 80% bzw. 90%. Ein gegebenenfalls unabhängig von dem Grad der Homologie anzuwendendes Kriterium besteht darin, ob ein Polynukleotid als Einzelstrang mit einem Einzelstrang entsprechender Länge aus der SEQ ID NO:l unter stringenten Bedingungen hybridisieren kann.
Gemäß Merkmal c) sind Gegenstand der Erfindung femer Polynukleotide, die erhältlich sind durch Absuchen einer DNA-Bank einer Pflanze der Familie Bassicaceae mit einer entsprechenden Gensonde. Beispielhaft genannte seien DNA-Banken der Gattung Arabidopsis, innerhalb dieser Gattung wiederum DNA-Banken der Art Arabidopsis thaliana. Solche DNA- Banken sind dem Fachmann ohne weiteres zugänglich. Gegenstand der Erfindung sind femer Fragmente der mittels einer genannten Gensonde aufgefundenen Polynukleotide, die eine weitgehende wurzelspezifische Promotoraktivität zeigen. Bevorzugt liegt die Mindestlänge solcher Promotoraktivität aufweisender Fragmente ebenfalls bei 200 Nukleotiden.
Erfmdungsgemäß wird somit ein Polynukleotid mit der biologischen Funktion eines Promotors bereitgestellt, das ein funktioneil verbundenes Fremdgen in transgenen Pflanzen weitgehend wurzelspezifisch exprimiert. Man kann so bestimmte Polypeptide spezifisch in Wurzeln anreichem oder mittels solcher Polypeptide beispielsweise das Wachstum der Wurzeln beeinflussen oder deren Widerstandskraft oder Abwehr gegen Pathogene und Parasiten erhöhen.
"Fremdgen" bedeutet im Sinn der Erfindung, daß sowohl endogene als auch exogene für ein Genprodukt codierende Nukleinsäuresequenzen verwendet werden können. Endogen bedeutet, daß die Nukleinsauresequenz aus dem gleichen Organismus stammt, in den sie mit dem erfindungsgemäßen Verfahren integriert wird. Exogen hingegen bedeutet, daß die Nukleinsauresequenz aus einem anderen Organismus stammt.
Die spezifisch in den Wurzeln hergestellten und/oder angereicherten und gegebenenfalls isolierten Polypeptide können dabei aus einem beliebigen Organismus wie z.B Mensch, Tier, Pflanze, Pilz, Bakterium, Protozoen oder Virus stammen und jedes beliebige Polypeptid sein.
Polypeptide, die das Wachstum der Wurzeln beeinflussen können z.B. Wachstumsfaktoren, Pflanzenhormone, Hemmstoffe oder Enzymen des sekundären Stoffwechsels sein.
Pathogene oder Parasiten, die durch in den Wurzeln spezifisch exprimierte Polypeptide geschwächt oder abgewehrt werden sollen, können bodenbürtige Pilze z.B. der Gattungen Pythium, Fusarium oder Verticillium, oder bodenbürtige Protozoen z.B. der Gattungen Plasmodiophora oder Spongospora, oder pflanzenparasitäre Nematoden z.B. der Gattungen Globodera, Heterodera, Pratylenchus, Radopholus, Trichodorus oder Longidorus, oder Insekten z.B. der Gattungen Melolontha, Otiorhynchus oder Tipula sein.
Bei der Einschleusung eines derartigen Promotors in die zu modifizierenden Pflanzen wird in der Regel lediglich die Expression des fusionierten Fremdgens beeinflußt. Es sind keine pleiotropen Promotoreffekte zu erwarten. Die Leistungsfähigkeit des Zuchtmaterials der betroffenen Kulturpflanze bleibt somit unberührt, soweit sie nicht durch die gewünschte wurzelspezifische Expression des Fremdgens beeinflußt wird.
Bevorzugte erfindungsgemäß verwendbare Polynukleotide sind angegeben in SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2 und SEQ ID NO:3. Bevorzugt sind femer solche Polynukleotide, die zu den vorgenannten Sequenzen zu wenigstens 60%, vorzugsweise 70%, weiter vorzugsweise 80%, weiter vorzugsweise 90% homolog sind.
Gegenstand der Erfindung ist femer ein Vektor, der neben einem in eine Pflanzenzelle oder Pflanzengewebe einzuschleusenden Fremdgen ein damit funktionell verbundenes
erfindungsgemäßes Polynukleoti 1 enthält. Die Erfindung betrifft femer Pflanzenzellen, die einen solchen Vektor oder das stabil in das Genom integrierte erfindungsgemäße Polynukleotid und das funktionell verbundene Fremdgen enthalten, sowie transgene Pflanzen, die solche Pflanzenzellen enthalten. Erfindungsgemäße transgene Pflanzen können dikotyle oder monokotyle Pflanzen der vorstehend aufgeführten Familien und Gattungen sein. Bevorzugt entstammt eine erfindungsgemäße transgene Pflanze der Gattung Arabidopsis, beispielsweise kann es sich um Arabidopsis thahana handeln.
Gegenstand der Erfindung ist femer die Verwendung eines erfindungsgemäßen Polynukleotids zur wurzelspezifischen Expression eines Fremdgens in einer Pflanze sowie ein entsprechendes Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze, das folgende Schritte aufweist: Fusionieren eines Fremdgens mit einem erfmdungsgemäßen Polynukleotid, gegebenenfalls Herstellen eines Vektors, der das Fusionsprodukt enthält, Einbringen des Vektors oder des Fusionsprodukts in eine Pflanzenzelle oder ein Pflanzengewebe und Regenerieren der Pflanzenzelle oder des Gewebes zu einer Pflanze, insbesondere zu einer fertilen Pflanze.
Die Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen erläutert:
Beispiel 1
Isolierung und Klonierung des Promotors pPYKlO
Zur Isolierung des Promotors pPYKlO wurde eine genomische Bank von A. thaliana Wildtyp C24 verwendet. Für das Sichten der Bank wurde ein 750 Bp-Hindlll-Restriktionsfragment aus dem 5'-Bereich des PyklO-cDNA Klons als Sonde eingesetzt. Die Plaque-Hybridisierung führte zur Identifizierung eines positiven Klons auf der Stammplatte. Der als λ-glc bezeichnete Klon wurde durch zwei bis drei Replattierungen vereinzelt und isoliert. Die Phagen-DNA wurde einer Restriktionsenzymanalyse unterzogen und die fünf entsprechenden Fragmente, die die Promotorsequenzen beinhalteten in dem Vektor pBluescript-M13+ subkloniert.
Das 3 '-Ende des Promotors wurde mit Hilfe des Primer-Extension- Verfahrens ermittelt (Adenin
Beispiel 2
Identifizierung von cis-regulatorischen Sequenzelementen
Die Promotorsequenz pPYKlO wurde auf mögliche cis-regulatorische Sequenzelemente untersucht. Cis-regulatorische Sequenzelemente sind überwiegend relativ kurze Sequenzbereiche, die durch Interaktion mit spezifischen, DNA-bindenden Proteinen, den TransFaktoren, die Genexpression positiv oder negativ beeinflussen. Die Sequenzanalyse ergab neben der TATA- und der CAAT-Box verschiedene stromaufwärtsliegende cis-Elemente, die Homologien zu bekannten Regulationssequenzen in anderen eukaryoti sehen Promotoren aufweisen. Die spezifischen Sequenzelemente sind zur Übersicht in Tab. 1 zusammengestellt. Alle hier aufgeführten cis-Sequenzen sind, bis auf die Repressor-Elemente GAAAGAA und ATGGG, transkriptioneile Aktivator-Sequenzen.
Tab. 1 : Zusammenstellung der relevanten cis-regulatorischen Sequenzelemente im 5'-Bereich des PyklO-Gens. Die Transkriptionsfaktoren wurden, soweit sie bekannt sind, mit aufgeführt. DR = direct repeat.
Sequenz Elemente Anzahl Trans-Faktoren
ACGT ACGT-Cores 9 z.B. GBFs, HBPs, CPRFs
CATTTG CANNTG-Motif 3 CAN
CAGATG CANNTG-Motif CAN
CATATG CANNTG-Motif CAN
CAGCTG CANNTG-Motif CAN
CATGTG CANNTG-Motif CAN
CAACTG CANNTG-Motif CAN
GATA GATA-repeat 1x3 DR, 3x2 DR ASF-2,
TGACG as-1 -Element 3 ASF-1, TGA1-Fam.
TTATTCA AP- 1 -Elemente AP-1
AAGTCT AP- 1 -Elemente AP-1
TGAATAA AP- 1 -Elemente 2 AP-1
TGATTCA AP- 1 -Elemente 1 AP-1
TAACTG Myb-Motif 2 MYB-Proteine
Sequenz Elemente Anzahl Trans-Faktoren
TAACAG Myb-Motif 1 MYB-Proteine
CCAAT 3 C/EBP
TGTAAT 1 C/EBP
TGTCAC 1
TATTTTG 2
ATCTAAT Elicitor-BoxL 1
ATTGTTT Elicitor-Box 2
TTGACC Elicitor-Box 1 WRKY-Fam.
CCGTCC Elicitor-Box 1
CTCC Elicitor-Box 1
GTGTC 2 VP1
AAACCA ARE- Sequenz 2
TGGTTT ARE-Sequenz 1
GAAAGA 1
A
ATGGG ATGGG-Core 1
Bei den ACGT-Kernmotifen handelt es sich um Sequenzen, die in vielen pflanzlichen Genen enthalten sind und Signale von umweit- und entwicklungsbedingten Reizen vermitteln. Die CANNTG-Motife regulieren die räumliche und zeitliche, sowie die durch Licht induzierte Genexpression. Die C/EBP-Elemente vermitteln eine zelltypspezifische Genaktivität. Myb- Motife kontrollieren den Sekundärstoffwechsel, regulieren die zelluläre Morphogenese und sind in den Signaltransduktionswegen pflanzlicher Wachstumsregulatoren involviert. Elicitor-Boxen vermitteln eine durch Elicitoren bedingte Geninduktion. Bei der regulatorischen Sequenz TATTTTG handelt es sich um ein wundenresponsives Element. Das CTCC-Element ist sowohl wunden- als auch elicitorresponsiv. Gene, die as-1 -Typ-Elemente in ihrem Promotor aufweisen, sind durch Auxin, Salicylsäure und Methyljasmonat induzierbar. Solche, die das Sequenzelement GTGTC oder TGTCAC besitzen sind abscisinsäure- bzw. auxininduzierbar. AP- 1 -Elemente kommen in mehreren eukaryo tischen Promotoren vor, ihre Funktion ist jedoch nicht näher beschrieben. Da sie in größerer Anzahl auch in den Promotorbereichen der Myrosinasen TGG1 und TGG2 existieren, wurden sie als relevante Sequentelemente angesehen. Sequenzen, die als direct und/oder inverted repeats wiederholt im Promotorbereich vorkommen sind oft cis-regulatorische
Elemente. In der untersuchten Sequenz treten mehrere direkte Wiederholungen des Sequenzelementes GATA auf. GATA-Motife kommen in vielen Promotorbereichen von Dikotyledonen vor und wurden als licht- und gewebespezifische Elemente beschrieben. In der Abbildung 2 ist die Anordnung der im 5'-Bereich des PyklO-Gens vorkommenden cis-Elemente schematisch dargestellt. Aus Gründen der Übersichtlichkeit wurden nur die wichtigsten regulatorischen Sequenzen berücksichtigt.
Beispiel 3
Analyse der Promotoraktivität mit Hilfe einer Gas-Reportergen-Fusion
Um die Promotoraktivität des Gens PYK10 zu analysieren, wurde ein Promotortest mit Hilfe des GUS -Reportergensystems (Jefferson, 1987) durchgeführt. Dazu wurde ein Promotorfragment hergestellt, mit dem GUS-Gen fusioniert und mittels Agrobacterium tumefaciens in Arabidopsis thaliana transferiert.
Anhand der transgenen Pflanzen sollte die organ- und gewebespezifische GUS-Gen-Aktivität bestimmt werden. Die für die Klonierung bestimmten Fragment pPYKlOb und pPYKlOc (siehe oben) wurden mit Hilfe der PCR hergestellt. Die Amplifizierung der Fragmente erfolgte mit der Pfu-Polymerase, die eine proof-reading-Aktivität aufweist. Für eine nachfolgende Klonierung des Fragmentes in den binären Vektor pMOG819 wurden die verwendeten Primer wie in nachfolgender Tabelle dargestellt mit Restriktionsschnittstellen versehen.
Verwendete Primer für die Herstellung der 5'-Promotordeletionen Die jeweilige RE-Erkennungssequenz ist durch Fettdruck hervorgehoben. 4- kennzeichnet die RE-Schnittstelle.
PromB GTTGClTCGAGATAACTGATAACAT for Xhol
PromC GGACC^TCGAGCTGCAACGAAGTGT for Xhol
PromF TGCACCC GGGTTTTTGTTTGTAAT rev Smal
GUS-Expressionsmuster des Promotor-Fragmentes B
Das Promotor-Fragment C führte zu einer starken GUS-Expression in der Wurzel. Die Promotor- Konstrukte B und C zeigen ein ähnliches Expressionsmuster, wobei das Promotor B-Konstrukt in den Kotyledonen jedoch eine geringere Blaufärbung aufweist.
Die regenerierten Pflanzen wurden auf GUS-Expression hin untersucht. Dabei zeigte es sich, dass in Pflanzen mit dem Promotor pPYKlOc eine Blaufärbung bis wenige Tage nach der Keimung zunächst im gesamten Keimling auftrat. Mit fortschreitender Entwicklung der Pflanze war die Blaufärbung zunehmend auf die Wurzeln beschränkt, wobei die Ränder der Kotyledonen noch vereinzelt eine leichte Blaufärbung aufwiesen. In voll entwickelten Arabidopsispflanzen trat eine Blaufärbung nur in den Wurzeln auf, wobei das gesamte Wurzelsystem eine GUS- Expression aufwies. Pflanzen mit dem Promotor pPYKWb zeigen ein ähnliches Expressionsmuster, wobei jedoch in der früheren Entwicklungsphasen die Kotyledonen eine geringere Blaufärbung aufwiesen.
Claims
1. Polynukleotid, das in Pflanzen der Art Arabidopsis thaliana eine weitgehend wurzelspezifische Expression eines Fremdgens erlaubt, ausgewählt aus der Gmppe bestehend aus:
a) wenigstens 200 Nukleotide mit einer aufeinanderfolgenden Nukleinsauresequenz aus der SEQ ID NO:l b) wenigstens 200 Nukleotide, die zu einer entsprechenden Zahl von Nukleotiden mit einer aufeinanderfolgenden Nukleinsauresequenz aus der SEQ ID NO:l zu wenigstens
60% homolog sind, c) Polynukleotide, die erhältlich sind durch Absuchen einer DNA-Bank einer Pflanze der Familie Brassicaceae mit einer Gensonde mit wenigstens 50 Nukleotiden mit einer aufeinanderfolgenden Nukleinsauresequenz aus der SEQ ID NO:l, d) Promotoraktivität aufweisende Fragmente der in c) definierten Polynukleotide.
2. Polynukleotid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es ausgewählt ist aus der Gmppe bestehend aus SEQ ID NO: l, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, und Polynukleotiden, die zu den vorgenannten Sequenzen zu wenigstens 60% homolog sind.
3. Vektor, umfassend ein Polynukleotid gemäß Anspruch 1 oder 2 enthält.
4. Transgene Pflanze mit mindestens einem nach seiner Transformation stabil in das Genom integrierten Polynukleotid nach Anspruch 1 oder 2, und einer mit dem Polynukleotid funktionell verbundenen für ein Genprodukt codierenden Nukleinsauresequenz, oder mit einem in den Pflanzenzellen vorliegenden Vektor nach Anspruch 3.
5. Transgene Pflanze nach Anspruch 4, wobei die Pflanze ausgewählt ist aus der Familie Brassicaceae insbesondere der Gattungen Brassica, Sinapis oder Raphanus, oder der Familie Solanaceae insbesondere der Gattungen Lycopersicon, Solanum oder Capsicum, oder der Familie Fabaceae insbesondere der Gattungen Vicia, Medicago, Trifolium, Glycine oder Pisum, oder der Familie Cucurbitaceae insbesondere der Gattungen Cucumis oder Cucurbita, oder der Familie Apiaceae insbesondere der Gattungen Daucus oder Apium, oder der Familie Rosaceae insbesondere der Gattungen Malus, Pyrus, Rubus, Fragaria oder Pmnus, oder der Familie Convulvulaceae insbesondere der Gattung Ipomoea, oder der Familie Euphorbiaceae insbesondere der Gattung Manihot, oder der Familie Chenopodiaceae insbesondere der Gattung Beta, oder der Familie Poaceae insbesondere der Gattungen Triticum, Hordeum, Avena, Seeale, Oryza, Zea oder
Saccharum, oder der Familie Musaceae insbesondere der Gattung Musa, oder der Familie Arecaceae insbesondere der Gattungen Phoenix, Elaeis oder Cocos, oder aus der Gattung Arabidopsis insbesondere Arabidopsis thaliana.
6. Transformierte Pflanzenzelle oder transformiertes Pflanzengewebe mit einem Vektor gemäß Anspruch 3 oder mit einem nach seiner Transformation stabil in das Genom integrierten Polynukleotid gemäß Anspruch 1 oder 2 und einer mit dem Polynukleotid funktionell verbundenen für ein Genprodukt codierenden Nukleinsauresequenz.
7. Transformierte Pflanzenzelle oder transformiertes Pflanzengewebe nach Anspruch 6, regenerierbar zu einer fertilen Pflanze.
8. Saatgut, erhalten von Pflanzen nach Anspruch 4 oder 5.
9. Verwendung eines Polynukleotids gemäß Anspruch 1 oder 2 oder eines Vektors nach Anspruch 3 zur wurzelspezifischen Expression eines Fremdgens in einer Pflanze.
10. Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Pflanze ausgewählt ist aus der Familie Brassicaceae insbesondere der Gattungen Brassica, Sinapis oder Raphanus, oder der Familie Solanaceae insbesondere der Gattungen Lycopersicon,
Solanum oder Capsicum, oder der Familie Fabaceae insbesondere der Gattungen Vicia, Medicago, Trifolium, Glycine oder Pisum, oder der Familie Cucurbitaceae insbesondere der Gattungen Cucumis oder Cucurbita, oder der Familie Apiaceae insbesondere der Gattungen Daucus oder Apium, oder der Familie Rosaceae insbesondere der Gattungen Malus, Pyrus, Rubus, Fragaria oder Pmnus, oder der Familie Convulvulaceae insbesondere der Gattung Ipomoea, oder der Familie Euphorbiaceae insbesondere der Gattung Manihot, oder der Familie Chenopodiaceae insbesondere der Gattung Beta, oder der Familie Poaceae insbesondere der Gattungen Triticum, Hordeum, Avena, Seeale, Oryza, Zea oder Sacchamm, oder der Familie Musaceae insbesondere der Gattung Musa, oder der Familie Arecaceae insbesondere der Gattungen Phoenix, Elaeis oder Cocos, oder aus der Gattung Arabidopsis insbesondere Arabidopsis thaliana.
11. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze, umfassend die folgenden Schritte:
a) Fusionieren eines Fremdgens mit einem Polynukleotid nach Anspruch 1 oder 2, b) gegebenenfalls Herstellen eines Vektors, der das Fusionsprodukt aus Schritt a) enthält, c) Einbringen des Fusionsprodukts aus Schritt a) oder des Vektors aus Schritt b) in eine Pflanzenzelle oder ein Pflanzengewebe, d) Regenerieren der Pflanzenzelle oder des Gewebes zu einer Pflanze, insbesondere zu einer fertilen Pflanze.
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