HUT57828A - Process for producing improved organic compounds - Google Patents

Description

A találmány tárgya egy DNS szekvencia, egy himportok-specifikus promoter, valamint ezek alkalmazása.

A himsteril kultúrnövények kifejlesztése régóta a gazdaságos növénytermesztés előterében áll, mivel ezek lehetővé teszik a számos növényfajtában előforduló, és az uj kultúrák termesztését gátló önbeporzás megakadályozását.

A himsterilitás különösen a hibrid magok termesztésében elsődleges fontosságú. Hibrid magokból számos egy- és készikü kultúrnövényt, mint például gabonát, zöldséget és dísznövényt termesztenek. Az ilyen hibrid magok előállása a két szülővonal egyikének himsterilitásával jelentősen egyszerűsíthető. Néhány himsteril kultúrnövény a már ismert kiválasztásos eljárással termeszthető. Az ilyen növények létrehozása azonban nehéz.

A Solanum tuberosum-ból izolált wunl gén nevű DNS szekvenciát tartalmazó gén a szakirodalomból, mint például a The Plánt Cell, 1. kötet, 151-158 (1989); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85. kötet, 1136-1140 (1988) irodalmi közleményekből, valamint a 38 37 752 számú NSZK-beli közrebocsátási iratból ismert. Ismeretes, hogy a wunl gén sérülés vagy patogén fertőzés esetén eredményezi a géntermékek kifejezését. Kimutatható, hogy a wunl gén esetében egy 1022 bp hosszú promoter-régió (+179bp wunl 5 nem leolvasott régió) megtartja a sérüléssel indukálható aktivitását, még akkor is, ha az aktuális szerkezeti gén régió egy másik szerkezeti génnel van helyettesítve (például CAT, GUS). így transzgén dohány-növényekben a sérülés-indukálható wunl promoter a le• · • » « * · · · • ···· · · ·« · ···· · ··· ·· ··

- 3 velekben, szárban és gyökérben is kimutatható.

A sérülés-stimulált DNS szekvenciára és alkalmazására vonatkozó 38 37 752 számú NSZK-beli közrebocsátási irattal ellentétben a jelen találmány tárgyát himportok-specifikusan kifejezett DNS szekvenciák és alkalmazásuk képezi. Ezek a DNS szekvenciák szerkezeti gének specifikusan himportokban való kifejezésére alkalmazhatók.

Azt tapasztaltuk, hogy a fentiekben ismertetett irodalomból ismert wunl gén nemcsak sérülés és/vagy fertőzés-indukált DNS szekvenciaként alkalmazható, hanem a wunl gén promoter röviditésével egy himportok-specifikusan kifejezett DNS szekvencia nyerhető. A fenti tulajdonság felismeréséhez szükséges tartomány 1201 bázispárra (bpú terjed ki (1022 bp wunl promoter + 172 bp 5' nem leolvasott tartomány). Ha az 1201 bázispár hosszúságot csökkentjük, például úgy, hogy a wunl promoter 5' végénél eltávolítunk 451 bp-t, a megrövidített promoter csak a himportokban lesz aktiv. Ez egy úgynevezett tudósító génnel, azaz olyan génnel igazolható, amely a rövidített promoterhez kapcsolt transzformált sejt vagy növény fenotipusában kiválasztható vagy láthatóan kszürhető változatokat hoz létre. A fenotipusban létrejövő változás, például elszíneződés nem található meg a növény minden részén, csak a himporon és a himportok stomiumán.

így például, ha tudósitó génként GUS-t alkalmazunk, és a wunl promoter 5' végénél például 451 bp-t (-571 wunl-GUS) távolítunk el, és ezt a csonka promotert például transzgén dohánynövényben vizsgáljuk, ezek mind a sérült, mind a nem • · 9 9 99

9999 9 · 99· « · 9 · ····

- 4 sérült levelekben, szárakban és gyökerekben inaktívak lesznek.

A csonka promoter azonban a himportokban alkotó aktivitást mutatnak.

Az egyszerűség kedvéért a wunl gén 1201 bp szakaszát, amely a promoter régió 1022 bp-jét és a promoter régió 3' végéhez kapcsolódó, 5' nem leolvasott régió 179 bp-jét tartalmazza, leírásunk tovébbi részében -1022 wunl-nek nevezzük. Az 5' végnél x bp-vel (például 451 bp-vel) rövidített fragmenteket (-1022 + x) wunl-nek (például -571 wunl)-nek nevezzük. Az US gén 5’ végéhez kapcsolódóan ilyen promotert (például -571 wunl-t) tartalmazó vektorokat (1022 + x) wunl-GUS-nak (például -571 wunl-GUS-nak) nevezzük.

A -571 wunl-GUS-hoz hasonló kifejezést tapasztaltunk más wunl promoter fragmentekkel, például -86 wunl-GUS-sal is.

A találmány tárgya a fentieknek megfelelően a wunl gén 5' vége felett elhelyezkedő DNS frakciójának olyan DNS szekvenciája, valamint az ezekkel homológ DNS szekvenciák vagy ezek részei, amelyek alkotó himportok-specifikus promoter aktivitást fejtenek ki.

A találmány szerinti alkotó himportok-specifikus promoter DNS szekvenciával homológ DNS szekvencia kifejezés olyan, találmány szerinti, alkotó himportok-specifikus DNS szekvenciára vonatkozik, amely megfelelő hibridizációs körülmények között, bizonyos számú nukleotid szekvencia beépülése és/vagy kiesése után is képes marad a találmány • ·

- 5 szerinti, alkotó himportok-specifikus promoter DNS szekvenciára komplementer nukleotid szekvencia hibridizálására. A találmány céljára megfelelő hibridzálási körülmények egy 5 x standard citrátsót (SSC), 0,5 tömeg% nátrium-dodecil-szulfátot (SDS), 5 x Denhardt-oldatot, 50 tömeg% formamidot, és 100 Mg/ml DNS-hordozót tartalmazó pufférrendszerben (a továbbiakban pufferrendszer) 16 órán át 42 °C-on végzett inkubálást, majd 1 x SSC-t és 0,1 tömeg% SDS-t tartalmazó pufferrel 65 °C-on, 3x1 órán át végzett mosást foglalnak magukban.

A találmány céljára alkalmas, előnyös hibridizálási körülmények a pufferrendszerben 16 órán át, 49 °C-on végzett inkubálást és 0,1 x SSC-t és 0,1 tömeg% SDS-t tartalmazó pufferrel 55 °C-on, 3x1 órán át végzett mosást foglalnak magukban. A találmány céljára legelőnyösebb hibridizálási körülmények a pufferrendszerben 16 órán át, 55 °C-on végzett inkubálást és 0,1 x SSC-t és 0,1 tömeg% SDS-t tartalmazó, pufferrel 65 °C-on, 3x1 órán át végzett mosást foglalnak magukban.

A találmány szerinti, megfelelő alkotó himportok-specifikus aktivitású, promoter elemek a következő wunl gén bázispár szekvenciák:

a)	(-571)	- (+179),
b)	(-571)	- (+ 1),
c)	( 86)	- (+179),
d)	(- 86)	- (+ 1),
e)	(-571)	- (-111), amely 3' kapcsolással a (-86)

- (+179) szekvenciához kapcsolódik, és

f) (-571) - (-111), amely 3' kapcsolással a (-86) -

- (+1) szekvenciához kapcsolódik, valamint az ezekkel homológ DNS szekvenciák és ezek részei.

Egyéb, alkotó himportok-specifikus promoter aktivitású, DNS szekvenciák a -1022 wunl promoterből való előállítása úgy történhet, hogy a megfelelő bázispárokat eltávolítjuk, és a megrövidített promotert a szakterületen ismert eljárással, például a fentiekben ismertetett tudósító gén, mint például GUS alkalmazásával a versenyképes himportok-specifikus promoter aktivitásuk szerinti szűrő vizsgálatnak vetjük alá.

A találmány szerinti promoterek a himportok-beli géntermékek szelektív kifejezésére alkalmazhatók. A találmány szerinti promotert erre a célra működőképesen egy olyan szerkezeti génhez kapcsoljuk, amelynek a himportokban történő szelektív kifejezése kívánatos, például a sejtképződés megakadályozása vagy befolyásolása céljából, vagy díszítési céllal.

Ennek megfelelően a találmány tárgya olyan transzformációs vektor, amely egy szerkezeti génelemhez működőképesen kapcsolódó, találmány szerinti alkotó himportok-specif ikus promotert tartalmaz.

A himportok-specifikus kifejezésre alkalmas gének közé tartoznak a fejlődési elfajulásokat, köztük himsterilitást eredményező gének, például a rolC gén; vagy a sejtfiziológiát inaktiváló géntermékeket kódoló gének, például tionin

gén; DNS degradáló géntermékeket kódoló gének, például az EcoRI endonukleáz szintézisét kódoló gén; vagy a himportok fejlődésében lényeges gének, például a wunl antiszenz gén inaktiválása. Az ilyen gének himportok-specifikus kifejezése himsteril növényeket eredményez.

FI hibridmag előállításához, abban az esetben, ha az FI hibridnövény gyümölcsre vagy magra termesztett, megfelelő helyreállító-rendszerrel van szükség. A találmány céljára alkalmas helyreállitó-rendszert a transzgén növény himsteilitásának kialakításához alkalmazott gén, antiszenz génjének alkalmazásával állítjuk elő. Az antiszenz inhibitálás kiváltására alkalmas eljárások imsertek. Ilyen tipusu eljárás például, ha a himsterilitás kialakítást Δ wunl-rolC szerkezettel végezzük, az antiszenz rolC gén alkalmazása; vagy tionin gén esetén hasonló eljárás alkalmazása. Ha a himsterilitást endonukleáz gén indukálja, a himsterilitás helyreállítására nemcsak az antiszenz stratégia, hanem a megfelelő metiláz gén beültetése is alkalmazható.

Az anyavonal genetikusán szerkesztett himsterilitásának megfelelő helyreállító gént tartalmazó himvonallal való kombinálása olyan, termékeny FI hibridterméket eredményez, amely szokásos hozamú gyümölcsöt vagy magot termel.

A génsebészeti utón létrehozott himsterilitás előnye, hogy a növény genetikai kódjába egy meghatározott gént úgy építhetünk be, hogy a növény többi tulajdonsága nem változzon. Az eljárás elsősorban genetikusán viszonylag jói manipulálható kultúrnövényeknél, például a szövettenyésztésre

4 4 «««··· • · * 4 4«·· • · » · 4 4·

444« 44 444

4444 · *44 4444 és transzformálásra alkalmas kétszikű növényeknél alkalmazható, de egyéb kultúrnövények esetén is hatásos eljárás.

Lehetőség van természetesen olyan, himportok-specifikus gének kifejezésére is, amelyek a himsterilitást nem befolyásolják, de a nemesitők számára egyéb tulajdonságaik érdekesek, ilyenek például a fehér vagy különböző szirmú virágoknál színes himportok kialakítás érdekében az antocianin bioszintézisbe beavatkozó géntermékek.

A találmány további tárgya a találmány szerinti alkotó himportok-specifikus promotert tartalmazó himsteril növények vagy növényanyagok.

Ezek a növények vagy növényanyagok a szakterületen ismert, hagyományos transzformációs eljárásokkal, majd az igy kapott transzgén növények hagyományos termesztésével állíthatók elő.

A következőkben bemutatjuk, hogy a fentiekben ismertetett irodalmakból ismert wunl promoter deléciója himportok-specif ikus kifejezést eredményez.

Az ábrák bemutatása:

Az 1. ábra a wunl-85 genom kiónon belül wunl elrendezést mutatja be. A genom klón 4 kb EcoRI fragmentje 1,0 kb wunl promoterből, 0,8 kb wunl gént kódoló régióból, és 2,0 kb 3' végből áll. Ezt a 4 kb fragmentet klónozzuk a pUC8 (pLSOOO) EcoRI hasitóhelyére.

A 2. ábra a wunl-genom wunl-85 klón deléciós elemzése. A wunl-85 genom klón aszimmtrikus Xhol hasítási helyén a 4 kb fragmentet az M13mpl8-ban mindkét orientációban detektál**««

- 9 hatjuk (85MP18; 85*MP18). EndonukleázIII-mal való sikeres emésztéssel különböző méretű fragmenteket kapunk.

A 3. ábra a qunl transzkripciós startpontjának meghatározása. Sérült burgonyagumóból származó wunl-mRNS-t hibridizálunk pLSOOO 1,2 kb EcoRI/XhoI fragmenttel. Ennek eredményeként az egyszál-specifikus SÍ nukleázzal szemben védett DNS-RNS hibridet kapunk. Denaturáló poliakrilamid-gélen (TU sáv) látható, hogy a nukleáz-védett DNS fragment hossza 162-179 bp. A transzkripció tényleges startpontja az Xhol hasítási helytől (A, C, G, T = a DNS fragment méretét meghatározó szekvencia diagramm) igy 162-179 bp 5' távolságban van.

A 4. ábra wunl és wunl-85 szegélyező régiók nukleotid szekvenciái. Fekete háttérrel a CAAT-Box, TATA-Box és PolyA-szignál láthatók. A transzkripciós start-stop helyeket nyíl jelzi.

Az 5. ábra wunl-ben lévő fontos régiók elrendezése és helye. A süni promotert feketével, a wunl gént vonalkázva jelöljük. A fontos felismerő szekvenciákat bekereteztük; az mRNS-t hullámos vonal, a protein-kódoló régiót keresztezett vonalkázás jelöli. Az egyedi régió méreteket [bp]-ben adjuk meg.

A 6. ábra wunl-GUS 5' deléció szerkezetek stabil dohány transzformánsokban végzett expressziós analízishez. A pPR69 vektor jobb- és baloldali T-DNS határszekvenciája között a nopalin szintáz promoter (nos) ellenőrzése alatt egy NPT II gén helyezkedik el. Ez a kanamicin kiválasztáshoz szükséges.

« · • · · ·* 9 · · • « · · · · · « ···· · · · · » ···· ν ·*· ·· · ·

- 10 A GUS gén egy nos-terminátor szekvenciához kapcsolódik, és szabályozása a wunl promoter különböző 5' deléciós fragmenteivel történik. Az 5' deléciós fragmentek véghelyzetét az adott szerkezet határozza meg. R = promoter klónozás fordított irányban.

A 7. ábra üvegházi transzgén dohánylevelén különböző 5' promoterelemektől függő GUS aktivitást analizálunk. Az enzim aktivitását az abszcisszán feltüntetett pmol MU/mg protein/perc egység jelzi. Az ordináták 6-12 különböző vizsgált növény 3 jellemző egyedének aktivitását mutatják. Ezek a vizsgált növények sérülést követő legnagyobb, közepes és legkisebb aktivitásértékét reprezentálják.

A 8. ábra pLS034-571 szerkezet csírázó pllenjei. A pollenben és pollengumókon lévő kék színeződés az enzim tevékenység helyét mutatja.

Az alkalmazott anyagok és eljárások ismertetése a következő irodalmi helyeken található:

(1) Ansorge, V., De Mayer, L. (1980).

Thermally stabilized very thin (0.02-0.3 mm) polyacrylamide gels fór electrophoresis. J. Chromatogr., 202: 45-53.

(2) Ansorge, V., Barker, R. (1984).

System fór DNA sequencing with resolution of up to 600 base pairs. J. Biochem.. Biophys. Meth., 9:33-47.

(3) Bedbrook, J. (1981).

A plánt nuclear DNA preparation procedure.

P.N.B. Nevsletter II, 24.

(4) Benoist, C., O'Hare, K., Breathnach, R., Chambon, P. (1980). The ovalbumin gene sequence of putative control regions. Nucl. Acids Rés., 8:127-142.

(5) Benton, V.D. and Davis, R.V. (1977). Screening Lambda gt recombinant clones by hybridization to single plaques in situ. Science, 196:180.

(6) Berk, A. and Sharp, P.A. (1987). Spliced early mRNAs of SV40. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:1274-1278.

(7) Bevan, M. (1984). Binary Agrobacterium vectors fór plánt transformation. Nucl. Acids Rés. 12: 8711-8721.

(8) Ebért, P.R., HA, S.B., An, G. (1987). Identification of an essential upstream element in the nopalin synthase promoter by stable and transient assays. Proc.Natl.Acad.Sci USA 84: 5745-5749.

(9) Fickett, F.W. (1982).

Recognition of protein coding regions in DNA sequences. Nucl. Acids Rés., 10:5303-5318.

(10) Frischauf, A.M., Lehrach, H., Poustka, A. and Murray, N. (1983). Lambda replacement vectors carrying polylinker sequences. J. Mól. Bioi., 170:827-842.

(11) Henikoff, S. (1984).

Unidirectional digestion with exonuclease III creates targeted breakpoints fór DNA sequencing. Gene, 28:351-359.

(12) Hoekema, A., Hirsch, P., Hooykaas, P., Schilperoort, R. (1983). A binary plánt vector strategy based on separation or vir- and T-region of A.tumefaciens. Natúré 303: 179-180.

(13) Hohn, B. and Murray, K. (1977).

Packaging recombinant DNA molecules intő bacteriophage particles in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 3259-3263.

(14) Jefferson, R.A. (1987). Assaying chimeric genes in plants: the GUS gene tusion system. Plánt Mól.Bioi.Rep. 5: 387-405.

(15) Joshi, C.P. (1987). An inspection of the domain betveen putative TATA box and translation start side in 79 plánt genes. Nucl. Acids Rés. 15: 6643-6653.

(16) Lehrach, H., Diamond, D., Wozney, J.M. and Boedtker, H. (1977). RNA molecular veight determinations by gele electrophoresis under denaturing conditions, a critical re-examination. Biochemistry, 16:4743.

(17) Lipphardt, S. (1988).

Dissertation an dér Universitát zu Köln.

• · · · (18) Logemann, J., Schell, J. and Uillmitzer, L. (1987).

Improved method fór the isolation of RNA from plánt tissues. Anal. Biochem., 163: 16-20.

(19) Maniatis, T., Fritsch, E.F., Sambrook, J. (1982). Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, New York.

(20) Messing, J., Geraghty, D., Hu, N.T., Kridl, J. and Rubenstein,

I. (1977). Plánt Gene Structure. In: Kosuge, F., Meredith, C.P., Hollaender, A. (eds.). Genetic engineering of plants. Plenum Press, New York: 211-227.

(21) Murashige, T., Skoog, F. (1962). A rapid method fór rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plánt., 15:473-497.

(22) Murray, M.G., Thompson, W.F. (1980). Rapid isolation of high molecular weight plánt DNA. Nucl.Acids.Res. 8: 4321-4325.

(23) Reiss, B., Sprengel, R., Vili, H., Schaller, H. (1984).

A new and sensitive method fór qualitative and quantitative analysis of neomycinphosphotransferase in crude cell extracts. Gene 30:217-223.

(24) Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A.R. (1977).

DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467.

(25) Southern, E.M. (1975). Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gél electrophoresis. J. Mól. Bioi., 98:503-517.

(26) Van Houte, E., Joos, H., Maes, M., Varren, G., Van Montagu, M., Schell, J. (1983). Intergenic transfer and exchange recombination of restriction fragments cloned in pBR322: a növel • ·· · · · · · · *··» · · ·· · • ··· ·· ··

- 14 strategy fór reversed genetics of Τϊ-plasmids of Agrobacterium tumefaciens. EMBO J., 2:411-418.

(27) Vieira, J., Messing, J. (1982). The pUC plasmid, an M13mp7derived system fór insertion mutagenesis and sequencing vith synthetíc universal prímers. Gene, 19:259-268.

(28) Wassenegger, M. (1988).

Dissertation an dér Universitát zu Köln.

(29) Willmitzer, L., Schmalenbach, V. and Schell, J. (1981). Transcription of T-DNA in octopine and nopaline crown gall tumours is inhibited by lov concentration of alfa-amanitin Nucl. Acids Rés., 9:19.

(30) Yanisch-Perron, C., Vieira, J., Messing, J. (1985).

Improved M13 phage cloning vectors and hőst strains: nucleotide sequencing of the M13mpl8 and pucl9 vectors. Gene 33: 103-119.

(31) Zambrisky, P., Joos, J., Genetello, C., Leemans, J., Van Montagu, M., Schell, J. (1983). Ti-Plasmid vector fór the introduction of DNA intő plánt cells vithout alteration of their normál capacity. EMBO J., 1:147-152.

Az alkalmazott anyagok:

Közeg;

A baktérium kultúrához alkalmazott közeg jellemzőit

Maniatis és munkatársai (1982) által közölt adatokból vettük.

Növény közeg:

Az alkalmazott közeg jellezőit Murashige és Skoog (1962) által közölt közeg (MS) jellemzőiből vettük.

3MS:	MS + 3	tömeg% szacharóz;
3MSC:	MS + 3	tömeg% szacharóz, 500 ^g/ml klaforan;
MSC15:	MS + 3	tömeg% szacharóz, 500 ^g/ml klaforan,

100 μ9/ιη1 kanamicin-szulfát;

MSC16: MS + 0,5 gg/ml BAP +0,1 Mg/ml NAA + 100 gg/ml kanamicin-szulfát + 500 ^g/ml klaforan.

A szilárd közeghez további 8 g/1 bakto-agart adunk.

Törzsek és vektorok:

E. coli törzsek:

BMH 71-18:A(lac-proAB), thi, supE;

F* (lacl<3, ZdeltaM15, proA⁺B⁺) (Messing és munkatársai, 1977)

C600: CR34-ként is ismert (Maniatis és munkatársai, 1982)

Agrobaktérium:

törzsek: LBA 4404 (Hoekema és munkatársai, 1983) plazmidok: pUC8 (Vieiro és Messing, 1982) pPR69 (bin 19 származék, Bevan 1984) fágok: EMBL4 (Frischauf és munkatársai, 1983) • · ·

1

- 16 M13mpl8 (Yanisch-Perron és munkatársai, 1985) M13mpl9 (Yanisch-Perron és munkatársai, 1985) növények: Solanum tuberosum AM 80/5793 (haploid)

Nicotiana tabacum Wisconsin 38 (W38)

Az alkalmazott eljárások:

Ha másképpen nem jelöljük, az alkalmazott standard molekulárbiológiai eljárások mindegyikének kivitelezését, például a restrikciós elemzést, plazmid izolálást, plazmid-DNS minipreparátum előállítását és a baktérium transzformálást a Maniatis és munkatársai (1982) által ismertetett eljárások szerint végezzük.

RNS izolálás:

A burgonya és dohány különböző szerveiből származó RNS izolálását a Logemann és munkatásai (1987) által közölt eljárással végezzük.

Northern-Blot analízis:

Az RNS elválasztást elektroforézissel végezzük 1,5 tömeg% formaldehid-agaróz gél közegen [Lehrach és munkatársai, (1977)]. Az RNS-t ezt követően a Willmilzer és munkatársai (1982) által ismertetett eljárással nitro-cellulózba transzferáljuk, rögzítjük, és ³²P-vel jelzett cDNS-n hibridizáljuk, majd mossuk, és kitesszük.

DNS elválasztás:

Nukleáris DNS-t állítunk elő burgonyalevélből s Bedbrook és munkatársai (1981) által ismertetett eljárással, és ezt EMBL4 lambda fágban klónozásra alkalmazzuk. A transzformált szövetből származó DNS-t Triton x 100, SDS és K proteináz • ·· ·

- 17 (Wassenegger, 1988) kombinációs bomlasztással tisztítjuk.

Southern Biot analízis:

A DNS elválasztást elektroforézissel végezzük 0,8-1,2 tömeg% agarózgélen, majd nitrocellulózba transzferáljuk, rögzítjük (Southern, 1975), hibridizáljuk, és mossuk Willmitzer és munkatársai (1981) előírásai szerint.

Genom bank létesítése és kutatása:

Genom DNS izolálása

A burgonya genom DNS-ként az AM 80/5793 haploid fajta levél DNS-t alkalmazzuk, amelyet a Bedbrook (1981) által ismertetett eljárással izolálunk. Ezt a DNS-t EcoRI-gyel teljesen elemésztjük.

Fáq DNS izolálása

EMBL4 DNS-t EcoRI-gyel három fragmentre darabolunk. Ezzel az eljárással a két vektorkar a középső fragmentről elektroforézises eljárással, majd az ezt követő fragment izolálással elválasztható. Emellett kereskedelemben beszerezhető, tisztított EMBL4-karokat is alkalmazhatunk (Amersham).

Liqálás és csomagolás

Az EMBL4 karok EcoRI-emésztett genom DNS-sel való ligálását követően a ligáit, nagy molekulatömegü DNS-t in vitro fágfejekbe csomagoljuk (Hohn és Murray, 1977; Hohn, 1979). A csomagoló anyag az Amersham vállalat Lambda in vitro packing kif'-ből (lambda in vitro csomagoló készletből) származik. A genom bankot lemezenként (25 x 25 cm) 25000 folt koncentrációval szélesztjük.

« · * * · · · • · · * · · · · · · ··· · · · · ·· ··

Folt hibridizálás

A cDNS homológ, lambda kiónok izolálását folt-hibridizációs módszerrel Benton és Davies (1977) szerint végeztük, amelyhez jelzett cDNS-t használunk. A pozitív hibridizációs foltokat izoláljuk, majd ezeket bevizsgáljuk.

Rekombináns fág DNS-ének előállítása ml C600-zal roncsolt baktériumkulturát kloroformmal keverünk, az elegyet centrifugáljuk, és igy baktériummentes felüluszót kapunk. A felüluszóból a fágokat 10 000 fordulat /perc sebességű, 4 órán át végzett centrifugálással üllepitjük. A fágüledéket 500 μΐ fágpufferben (10 mmól/1 trisz-HCl, pH = 8,0, 10 mmól/1 MgC12) vesszük fel, majd Dnázzal és Rnázzal kezeljük. Néhány fenolizálással a DNS-t extraháljuk, majd a fág DNS-t etanollal kicsapatjuk, a csapadékot 70 tömeg%-os etanollal mossuk, és TE-ben felvesszük.

Deléciós mutáns előállítása és az ezt követő exonukleázIII-zal lefolytatott kezelés (Henikoff és munkatársai, 1984):

A vizsgálandó fragmentet M13mpl9-ben klónozzuk mindkét irányban. Mivel az exonukleázIII az 5' kinyúló véget emészti csak, és a 3' kinyúló véget megkíméli, a vizsgálandó DNS 20 gg-ját két olyan restrikciós enzimmel emésztjük, amely a klónozott fragment egyik oldalán egy 5' és egy 3' véget hoz létre. Mivel az 5' vég a fragment irányába fordul, megtörténhet az exonukleáz enzimbe való emésztése. A reakció sorozatos megállításával a 200 bp-nél rövidebb fragmentek • ·· ·· · · · • · · * · ♦ · • ···· · · ♦ · · ···· · ··· ·· ·· izolálhatok, és ezek kinyúló végei a következő Sl-kezeléssel a ligálható sime végekbe transzformálhatok. Ezt követően megtörténhet a DNS 7118 sejtekbe való transzformálása, és az egyszálu DNS izolálása.

Szekvenálás:

Az egyszálu DNS szekvenálását a Sanger és munkatársai (1977) által ismertetett lánclezáró eljárással végezzük. A reakciótermékeket 6 tömeg%-os és 8 tömeg%-os szekvenáló géleken elválasztjuk (Ansorge és de Mayer, 1980; Ansorge és Baker, 1984).

SÍ elemzés:

A transzkripciós kezdőpont meghatározását a Berk és Sharp (1987) eljárással végezzük. Erre a célra a pLSOOO plazmidból EcoRI-gyel és Xhol-gyel izoláljuk az 1,2 kb fragmentet, és ezt foszfatázos kezeléssel defoszforilezzük. Ezután a polinukleotid kináz és y-³²P-ATP kombináción keresztül létrejöhet az 5' hidroxilvég radioaktív címkézése. A DNS fragmenteket denaturálás után az egész RNS 50 /tg-jával hibridizáljuk (hibridizáló puffer: 80 tömeg% formamid 0,4 mól/1 nátrium-klorid, 40 mmől/1 6,4 pH-ju PIPES és 1 mmól/1 EDTA). Ezek a körülmények kedvezőbbek az RNS-DNS hibridek képződéséhez, mint a DNS-DNS hibridekhez (Casey és Davidson, 1977). A hőmérséklet a hibridizálás kezdetén 80 °C, majd egy éjszakán át 40 °C-ra csökken. Az ezt követő Sl-nukleáz emésztés (12 U/m) a páratlan szálakat eltávolítja. A wunl gén 5' nem leolvasott régió radioaktív cimkézésü Xhol hasitóhelye várhatóan mRNS homológjával védett lezs.

Ezután az Sl-védett DNS-szálat elektroforézissel, szekvenáló gélen elválasztjuk, és igy egy ismert DNS fragmenst hosszúság összehasonlításra alkalmazhatunk.

DNS transzferálás aqrobaktériumban:

Transzformálás

Az E. coli-ban klónozott DNS-t a Van Houte és munkatársai (1983) által ismertetett konjugálással a tumefaciens LBA4404—be (Hoekamo és munkatársai, 1983) transzferáljuk.

DNS elemzés

Az agrobaktériumba transzferált DNS azonosítást az Ebért és munkatársai (1987) által ismertetett agrobaktérium DNS izolálással végezzük. A DNS restrikciós hasítás, nitro-cellulózba való transzferálás és a megfelelő radioaktív mintán való hibridizálás lehetővé teszi a DNS agrobaktériumba való sikeres transzferálásának igazolását.

Dohány transzformálás:

Agrobaktérium tenyészet

A fertőzéshez szükséges, megfelelő LBA4404 vaktort tartalmazó agrobaktérium törzseket szelektív antibiotikus közegben (Zambrisky és munkatársai, 1983) tenyésztjük, centrifugálással ülepítjük antibiotikum nélküli YEB-közegben mossuk. Újabb ülepités után 3MS közegben abszorbeáljuk. Az igy kapott baktériumokat fertőzésre alkalmazhatjuk.

Levélszekciók fertőzése

A levélszekciók fertőzéséhez steril SNN és W38 fajta steril dohányleveleket alkalmazunk. Körülbelül 1 cm²-es ·· · • · · • · · • · · * · • · · · ·

levéldarabokat a fentiekben ismertetett agrobaktérium szuszpenzióba merítjük, majd ezt követően 3MS közegre visszük. A levéldarabokat 2 napon át, 16 órás megvilágítással 25-27 °C-on inkubáljuk, majd kallus- és csiraindukcióhoz MSC16-ba tesszük. A 4-6 hét múlva megjelenő csirákat leválgjuk, és MSC15 közegben inkubáljuk.

A transzformált növények elemzése;

Genom DNS izolálás

A DNS növényekből való izolálását a Murray és Tompson (1980) által ismertetett eljárás egy változatával végezzük, ezután restrikciós enzimmel hasítjuk, és egy gélen elválasztjuk. Ezt a DNS-t nitro-cellulózba transzferáljuk, radioaktív címkés mintával, amely a vizsgált növény genomba lévő specifikus DNS jelenlétét jelzi, hibridizáljuk.

GUS aktivitás detektálás

A transzformálás után újraépített növényekben mutatott β-glükuronidáz enzim (GUS) aktivitás mértékére vonatkozó vizsgálatot a Jeffertőn (1987) által ismertetett eljárással végezzük. Egy további hisztokémiai vizsgálat (Jefferson, 1987) a szövetben való elhelyezkedést jelzi. Erre a célra a növény vékony szekcióit 5-bróm-4-klór-3-indolil-glukoronidban, X-Gluc-ban inkubáljuk. Az enzim aktivitás helyén kék csapadék képződik.

Eredmények:

Fél kromoszámakészletü (haploid) burgonya qenombank létesítése

Az AM 80/5793 haploid burgonyatenyészet genomjának kis • · · ·· · · · • · · · · · · • ···· ·· · · · ···· < ··· ♦♦ ··

- 22 számú wunl génjéből genom DNS-t tartalmazó genombankot létesítünk, amelyet EcoRI-gyel emésztünk. AM 80/5793-ból származó és EcoRI-gyel hasított DNS 10 ^g-ját EcoRI-gyel hasitot EMBL4 karokkal ligáijuk, és C600 baktérium-pázsiton szélesítjük. így körülbelül 500 000 foltot kapunk, amely statisztikusan véve a burgonya genomot jelzi.

wunl homológ EMBL4 kiónok azonosítása

A foltokat radioaktivan címkézett wunl-cDNS-en végzett folt-hibridizálással nitro-cellulózba transzferáljuk, így két genom kiónt (wunl-22 és wunl-85) azonosíthatunk, és ezeket tisztítjuk.

A wunl-22 és wunl-85-ból való rekombináns EMBL4 DNS-t izoláljuk, felvesszük a restrikciós térképet, és radioaktív wunl-cDNS-en hibridizáljuk. Ennek során a következő eredményeket kapjuk:

A wunl-85-ben a wunl-cDNS ekvivalens fragment mérete 4 kb. Ez pontosan a haploid burgonyából származó, EcoRI-emésztett wunl-cDNS-sel hibridizáló fragment mérete. A cDNS klón 5' régió aszimmetrikus Xhol hasítási helye, valamint a csak a cDNS klón 5' régióját lefedő radioaktív cDNS minta alkalmazása alapján a 4 kb fragmentben lévő gén iránya meghatározható. A wunl gén 5' régiónál ennek megfelelően van egy körülbelül 1 kb-s promoter régió, a gén 3' régiónál pedig egy körülbelül 2 kb-os nem homológ rész (5. ábra). A wunl-85-ben lévő további, 8 kb-os EcoRI fragment a wunl gén közelebbi meghatározásához nem alkalmazható.

A burgonya DNS EcoRI-gyel végzett emésztése valószínűleg azt eredményezi, hogy az ezt követő ligáláskor a két, össze nem tartozó fragment az EMBL4 vektorba megy, azaz funkcionális kapcsolat nem jön létre közöttük.

A wunl-85 genom klón szekvencia elemzése

A wunl kódoló gén genom elemzését a következő eljárással végezzük. Mivel a wunl-85 és wunl-22 restrikciós viselkedése azonos, a wunl-85 4 kb-s fragmentjét további elemzés céljából EcoRI-hasított pUC8-ba ligáijuk (1. ábra). A wunl promoter és a wunl gén további szekvenálása a 4 kb-s fragment M13mpl8 EcoRI hasítási helybe való további ujraklónozással történhet. Irányának meghatározása az aszimmetrikus Xhol hasítási hely szabályozott emésztésével végezhető. A 85*mpl8 és 85mpl8 kiónok a fragment mindkét irányát képviselik (2. ábra). A plazmidok Sphl- ésXbal-gyel való hasítása lehetővé teszi 85mpl8 klón esetén a wunl gén 3’ végének, és a 85*mpl8 klón esetén a wunl gén 5' végének exonukleáz III alkalmazásával végzett sikeres emésztését.

Az igy kapott, különböző fragmentméretü deléciós kiónokat szekvenálásra alkalmazzuk. Ez az eljárás lehetővé teszi az egész wunl gén kétirányú, és ezen kívül a 3' vég mintegy 400 bp részének egyirányú szekvenálását (4. ábra).

A transzkripciós indulási hely meghatározása

A wunl gén transzkripció pontos indulási helyének meghatározására SÍ nukleáz térképezési eljárást alkalmazunk. Az eljárás azon az elven alapul, hogy a wunl gén 5' régiója egyszálu DNS-ének wunl-mRNS-sel való hibridizálásával csak a homológitásuk miatt kettős szálú régiók védettek az egyszálu t 1 1

- 24 ·· * • · » • · ·· ♦ • · · · « · · · · *«« ·· specifikus SÍ nukleázzal való degradálással szemben. A védett DNS fragment mérete szekvenáló gélen meghatározható, és igy a transzkripció indulása jól követhető.

Az Xhol és EcoRI hasítási helyek segítségével pLSOOO-ből egy olyan 1,2 kb fragmentet izolálunk, amely a wunl gén promotert és az 5' nem leolvasott régiórészeket tartalmazza. Ezt a fragmentet az Xhol hely 5' végénél polinukleotid-kináz segítségével radioaktív ³²P-vel cimékézzük, és sérült burgonyagumó összes RNS-ének 50 Mg-ján hibridizáljuk. A hibrid Sl-kezelése után a védett fragment méretét szekvenáló gélen meghatározzuk; ez a méret 162-179 bp között változik (3. ábra). A leghosszabb fragmentről való indításkor a transzkripció az Xhol-től lefelé, a 179 bp-nél, azaz az ACCATAC-szekvenciánál kezdődik. Ez a szekvencia a központi régióban (CAT) összhangban van a Joshi és munktársai (1987) által a CTCATCA transzkripció indításához meghatározott, megállapodás szerinti szekvenciával. A transzkripció indulási pozíciójától a következő további információk is nyerhetők (4-5. ábra).

1) A transzkripció indulástól számított -33 helyen egy olyan TATA Box CTATATATT szekvenciát találunk, amely összhangban van a Joshi és munktársai (1987) által meghatározott megállapodás szerinti TCACTATATATAG szekvenciával.

2) A Benoist és munkatársai (1980) által ismertetett, -60 és -80 közötti régióban lévő CAAT Box a wunl promoter -58 helyén (CAAACT) található.

3) A wunl gén 5' nem leolvasott régiója a 217 bp-re terjed ki, és ezért összehasonlítható nagyságú.

4) A wunl-mRNS kódoló gén igy ey 794 bp szakaszt zár magába, és ez pontosan a Northern-blot analízissel meghatározott wunl-mRNS méretének felel meg.

5) A wunl gén 5' nem leolvasott régió egy 97 bp szakasza a wunl-25A2 cDNS kiónban hiányzik.

6) A cDNS kiónban már meghatározott nyitott leolvasó kerettói eltekintve a genom klón 5' nem leolvasott régiójában nincs további elágazás.

7) A wunl génnek nincsenek saját rendelkezésű intronjai.

A pPR69 vektor származékainak előőllitása

A -571 bp, -111 bp és -86 bp végpontoknál exonukleáz

III-mal előállított promoter deléciós fragmenteket, valamint az 5' régióban a -1022 bp tartó promotert a pPR69 vektorba ujraklónozzuk (6. ábra). Az előnyös ujraklónozáshoz az Xhol hasítási hely mögötti deléciós fragmentet kivágjuk az M13mpl8-ból. A vektort fordított irányban tartalmazó kontroll előállításához a hasítási helyek 5' átlapoló végeit a DNS polimeráz I Klenow-fragmentjével töltjük fel, és a vektorba klónozzuk. A deléciós fragmentek vektorban való abszorbeálását radioaktív címkés wunl promoter mintán való hibridizálással és restrikcióelemzéssel ellenőrizzük.

wunl-GUS dohányban való stabil transzformálása és elemzése

Transzgén növényekben különböző wunl promoter deléciók

- 26 • ·· · » · · • · « «« · · szerv-specifikus sajátságait és sérülés-indukálhatóságát vizsgáljuk. Erre a célra a pLS034-1022, -571, -111, -89 és -1022R plazmidokat az LBA4404 agrobakteriális törzsbe transzformáljuk. Ezeket az agrobaktériumokat ezután levélszekciós fertőzéssel Wiscosin 38 (W38) dohány transzformálásává alkalmazzuk. A növényen képződő kalluszt kanamicin szelekcióval regeneráljuk, és a Southern-blot analízissel megvizsgáljuk a pLS034-DNS növény genomjába való helyes integrálását.

A transzgén dohánynövények funkcionális elemzését üvegház növények GUS aktivitásának detektálására is kiterjesztjük.

Különböző szerkezetek független transzformánsai különböző szövetekben kifejtett GUS aktivitását vizsgáljuk. Kontrollként (K) nem transzformált dohánynövények szolgálnak.

Ez az aktivitás a dohánylevelekben kifejtett GUS aktivitásához képest a pLS034-86, -111 és pLS0₄34-1022R növény konstrukciókban kicsi, körülbelül a kontroll növény aktivitásának megfelelő szintű. Ezekkel összehasonlítva a pLsO34-571 GUS aktivitása körülbelül négyszer nagyobb, és az egész promoter aktivitása 13-370-szer nagyobb, mint a legrövidebb szerkezeté (pLS034-86) (7. ábra).

Az enzim különböző növényszövetekben kifejtett aktivitását in situ hisztokémiai elemzéssel mérjük. Vékony szövetszekciókat egy éjszakán át, 37 °C-on az 5-bróm-4-klór-3-indolil-glukoronid (X-Gluc) enzim szubsztrátjával ·« · * ···¥ ·· • · * ·· · · · • · · * · · · • ·«·« » ♦ ♦ · * • «· · · ·*·<·* ·«

- 27 inkubáljuk. Az enzim aktivitás helyén kék csapadék képződik. Ezzel az elemzéssel kimutathatjuk, hogy a pLS034-86, -111, 571 és -1022R növényszérkézetekben nincs aktivitás a levelekben, szárban vagy gyökerekben.

A teljes wunl promotert hordozó növények az összes fenti szövetben aktivitást mutatnak.

A virágok elemzése eltérő képet mutat. A különböző szerkezetek virágjainak keresztmetszetében a következő enzim aktivitás I-eloszlást találjuk. A pLS034-1022 növényszerkezetek a himportok stomiumban és pollen szemcsékben mutatnak GUS aktivitást. A pollen szemcsék 30 %-a X-Gluc-kal való inkubálás után kék elszíneződést mutatnak. A pLS034-571 és -86 himportokok ugyanilyen, csak kisebb intenzitású aktivitást mutatnak (8. ábra). A pLS034-lll és pLS034-1022R kontroll növényszerkezeteknél a stomiumban nincs kék elszíneződés, és a pollen szemcse elszienződése 0,75 %-kal csökken.

A pLS034-1022 himportokban mérhető GUS aktivitása 2-10-szer erősebb, mint a pLSÓ34-571-ben lévőé. A teljes promoter átlagos enzimaktivitása a himportokban eléri az 1276 pmol MU/mg/perc értéket. A pLS023-571 szerkezet hímportok pLS034-86-hoz viszonyított aktivitása kétszeres. Az átlagos enzim aktivitás 217 pmol MU/mg/perc, illetve 97 pmol MU/mg/perc.

Ismeretes, hogy a kelvirág mozaikvirus 35S promoter a himportokban aktiv. Az aktivitás 500 pmol MU/mg/perc. Mivel a CaMV 35S promoter a növényekben aktiv, erős promoter, a • 44 •«4

4· 4 • 4444 ··· * t

....

* 4

- 28 wunl promoter fragment deléció az egész ektivitására ki hatással van.

Claims (8)

1. Szabadalmi igénypontok

   1. A wunl gén 5' alsó régiójának DNS szekvenciája, az ezzel homológ DNS szekvenciák és ezek részei, azzal jellemezve, hogy alkotó himportok-specifikus aktivitást mutatnak.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti DNS szekvencia, azzal jellemezve, hogy a wunl gén 5’ alsó régiója olyan 1201 bázispár hosszúságú DNS szekcióból származik, amely a wunl promoter régió-beli 1022 bázispárokat és a promoter régió 3’ végéhez csatlakozó 5' wunl nem leolvasott 179 béázispárokat tartalmazza.
3. 3. A 2. igénypont szerinti DNS szekvencia, ezzel homológ DNS szekvencia, és ezek részei, azzal jellemezve, hogy a wunl promoter -571 bp tartományától a wunl gén 5' nem leolvasott régió +179 bp-jéig terjed.
4. 4. A 3. igénypont szerinti DNS szekvencia és az ezzel homológ DNS szekvenciák, azzal jellemezve, hogy

   a) a wunl promoter -571 bp tartományától a wunl gén
5. 5' nem leolvasott régió +179 bp tartományáig;

   b) a wunl promoter -571 bp tartományától az 5'nem leolvasott régió +1 bp tartományáig;

   c) a wunl promoter -86 bp tartományától az 5’nem leolvasott régió +179 bp tartományáig;

   d) a wunl promoter -86 bp tartományától az 5' nem leolvasott régió +1 tartományáig;

   e) a wunl promoter -86 bp tartományától az 5' nem leolvasott régió +179 bp tartományáig terjedő DNS • «4 * ·*·· 99 » · · · · ♦ • · · · * ? * • ···· · · · · · ···· · ··· ·· ·· szekvenciával 3' módon kapcsolódóan a wunl ^k promoter -571 bp tartományától a -111 bp tartomáI nyáig;

   f) a wunl promoter -86 bp tartományától a nem leolvasott régió +1 bp tartományáig terjedő DNS szekvenciával 3' módon kapcsolódóan a wunl promoter -571 bp tartományától a -111 bp tartományáig terjed.

   5. Az 1-4. igénypontok szerinti DNS szekvencia alkalmazása, azzal jellemezve, hogy pollen/himportok-specifikus kifejezésre alkalmazzuk.
6. 6. Az 5. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy megnövekedett díszítő értékű vagy himsteril növények előállítására alkalmazzuk.
7. 7. Transzformációs vektor, azzal jellemezve, hogy működőképesen egy szerkezeti gén elemhez kapcsolva az 1-4. igénypontok szerinti alkotó himportok-specifikus promotert tartalmazza.
8. 8. Növény vagy növényanyag, azzal jellemezve, hogy egy 1-4. igénypont szerinti alkotó himportok-specifikus promotert tartalmaz.