CN102367439B - 植物气孔特异性启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了植物气孔特异性启动子及其应用。本发明所提供的启动子具有下述核苷酸序列的核酸：1)序列表中的序列1；2)将序列表中序列1的核苷酸序列经过5’端删除和/或3’端删除后，并且仍然具有气孔特异性启动子功能的核苷酸序列；3)将1)或2)中核苷酸序列的一个或几个脱氧核苷酸残基经过取代、添加或缺失，且具有气孔特异性启动子功能的核苷酸序列。实验证明本发明所提供的启动子不仅具有良好的气孔特异性，而且该特异性能够稳定地传递给后代。这不仅对气孔和保卫细胞的分子生物学研究和气孔运动等的理论研究具有重要的意义，而且在培育抗旱和抗病作物而去提高作物的光合效率进而提高产量和品质等方面具有重大的应用价值和广阔的市场前景。

Description

植物气孔特异性启动子及其应用

技术领域

本发明涉及植物气孔特异性启动子及其应用。

背景技术

启动子(Promoter)是基因组基因的一个重要组成部分，它像“开关”一样，在转录水平上基本决定其控制下的编码基因是否表达、何时表达、何处表达和表达强度。一般根据启动子作用方式和功能将其大体可以分为三大类：组成型启动子、特异性启动子和诱导型启动子[王关林，方宏筠，2002，植物基因工程原理与技术(第二版)，北京，科学技术出版社]。但这种分类不是绝对的，在某些情况下，一种类型的启动子往往兼有其它类型启动子的特性，例如，诱导增强性组成型启动子(肖兴国等，发明专利号200710177962.4)。

组成型启动子(Constitutive promoter)是指能够驱使其控制下的编码基因在不同器官和/或组织大体恒定表达的一类启动子。它的特点是：受其控制的编码基因的表达具有持续性，但不具有时空特异性；RNA和蛋白质表达量相对恒定，不受外界因素的诱导。例如：花椰菜花叶病毒35S启动子CaMV35S(Odell et al.，Nature，1985，313：810-812)、玉米Ubiquitin启动子(Holtorf et al.，Plant Mol.Biol.，1995，29：637-646)和水稻的Actinl启动子(McElroy et al，1990，Plant Cell，2：163-171)。

诱导型启动子(Inducible promoter)是指能够响应某些特定的物理、化学和生物信号(统称为“诱导子”或“诱导因子”)而驱动其控制的编码基因大幅度地增加转录水平的一类启动子。它的特征为，在没有诱导因子存在的条件下，它控制的编码基因不表达或者只有非常低的表达(也称为“本底表达”)，但一旦受到诱导因子的诱导，基因的表达量迅速并且大幅度增加。诱导型启动子常常根据其诱导信号来分类和命名，例如：真菌诱导启动子、共生细菌诱导启动子、化学诱导启动子、金属离子诱导启动子、光诱导启动子、热诱导启动子和创伤诱导启动子等。

器官和/或组织特异性启动子(Organ-and/or Tissue-specific promoter)，能够驱使其控制下的编码基因仅仅在生物体的某一或某些特定的器官和/或组织，或者仅仅在生长发育的某一或某些特定阶段表达的一类基因。它的特征为，受其控制或调节的基因表达具有明显的时空性，并往往表现出发育调节的特性。例如，植物上的根特异性启动子、叶片特异性启动子、花特异性启动子、气孔特异性启动子、气孔绒毡层特异性启动子、花粉特异性启动子、果实特异性启动子、种子特异性启动子、胚乳特异性启动子、棉花纤维特异性启动子和韧皮部特异性启动子等等。

气孔(Stomatal pore)是植物与外界环境进行气体交换的门户，也是水分蒸腾的通道。植物进行光合作用所必需的CO₂依靠气孔进入体内，而呼吸作用所产生的O₂则依靠气孔排除到体外。此外，植物的水分蒸腾也依靠气孔作为主要通道。因此，气孔的开关控制着植物的蒸腾作用、光合作用和呼吸作用等重要生理过程。

一般植物的气孔由一对保卫细胞组成，有些植物中还有副卫细胞(Subsidiary cells)围绕着这一对保卫细胞，组成气孔复合体(Stomatal complex)或称气孔器(Stomaltalapparatus)。气孔分布在植物的地上部分，主要集中在叶片。组成气孔的保卫细胞是一种高度分化的细胞，在大多数双子植物和一些单子叶植物、裸子植物、蕨类和藓类上呈肾形，而在禾本科植物和几种苔草上则呈哑铃形。保卫细胞的体积比叶表皮细胞和叶肉细胞的体积小得多。它的细胞壁按其和相邻细胞的相对位置而命名：背壁(Dorsalwal1)，指和表皮细胞相邻的壁；腹壁(Ventral wal1)，与背壁相对、近孔处的壁；外侧壁(Outer lateral wal1)，靠叶片外表面的壁；内侧壁(Inner lateral wal1)，靠气孔下腔的壁。保卫细胞的壁各处厚薄不均，一般背壁薄而腹壁特别加厚。这样，在细胞膨压大时，保卫细胞呈弯月形，气孔开放；在细胞膨压小时，保卫细胞呈直肾形或圆柱形，气孔关闭(Wilmer and Fricker，1996，Stomata，Ed Chapman and Hall，London，1-375)。保卫细胞正是通过自身的膨压大小的改变而改变自身体积的大小和形状来调控气孔的开、关和张开程度以应对其感受的外界环境中的生物和非生物刺激(例如ABA、CO₂和干旱等)以及由自身植物根传来的信号(Bergmann and Sack FD，2007，Annu Rev Plant Biol，58：163-81)。引起这种自身的膨压大小的改变及由此导致的自身体积大小和形状的改变的机理，一般认为，主要是通过细胞膜和液泡膜的一些通道蛋白进行的跨膜离子和水的运输(Pandey et al.，2007，FEBS Lett，581：2325-36；Schroeder et al.，2001，Annu RevPlant Physiol Plant Mol Biol，52：627-58)。在C3和C4植物上，能够引起气孔开放的主要环境因子有：蓝光、红光、高湿和低CO₂(Marten et al，2007，Plant J，2007.50：129-139；Shimazaki et al，2007，Annu Rev Plant Biol，58：219-47)；能够引起气孔关闭的主要环境因子有：黑暗、干旱、高CO₂和高臭氧浓度(Sirichandra et al，2009，J Exp Bot，60：1439-63)。此外，内源激素ABA能够引起气孔关闭(Wilkinson and Davies，2002，PlantCell Env，25：195-210；Israelsson M et al，2006，Curr Opin Plant Biol，9：654-63)，其它激素，如生长素、激动素、乙烯、芥末酸和油菜素内酯，对气孔的开关也都有一定的影响(Acharya and Assmann，2009，Plant Mol Biol.69：4451-4462；Kim et al，2010，AnnuRev Plant Biol，61：561-591)。

气孔运动(开和关)是一个非常复杂的生理过程，有人认为它是植物适应环境变化的一种主动调节，也有人认为是被动调节，并且都有一定的实验结果作为支撑。无论是主动调节还是被动调节，人们都希望从调控气孔开关运动入手，提高植物的节水抗旱能力和光合效率[李军等，中国科学C辑生命科学，2004，34(4)：299-303]，从而提高植物、特别是作物的产量和品质。为此，鉴定、分离和功能研究保卫细胞特异性基因及其主要调控者-启动子的研究在全世界展开。

Zhao等从22000多株拟南芥(Arabidopsis thaliana)中分离到3×10⁸个保卫细胞叶绿体，由此鉴定出1734种独特蛋白[Zhao et al.2008，Plant Cell，20(12)：3210-3226]。一些保卫细胞优势表达和/或特异性表达的蛋白和/或其编码基因，如拟南芥Akt1(Sentenac et al，1992，Science，256：663-665)、Kat1(Anderson et al，1992，PNAS，89：3736-3740)和TPC1(Rienmuller et al，2010，Plant and Cell Physiol，51：91548-91554)以及马铃薯Kst1(Muller-Roeber et al，1995，EMBO J，14：2409-2416)等陆续被鉴定和/或克隆。随着这些基因的克隆，其主要调控区域-启动子的鉴定、分离、重组和功能研究方面，近年来取得了明显的进展。例如，Kat1启动子(Nakamura et al，1995，PlantPhysiol，109：371-374)、Kst1(Plesch et al，2000，Gene，249：83～89)、Abh1启动子(Hugouvieux et al.，Cell，2001，106：477-487)、Chl1启动子(Guo et al.，Plant Cell，2001，13：1761-1777)、Osm1启动子(Zhu et al.，Plant Cell，2002，14：3009-3028)、Ost1启动子(Mustilli et al.，Plant Cell，2002，14：3089-3099)，Rac1(Lemichez et al.，Genes Dev.，2001，15：1808-1816)、SLAC1启动子(Vahisalu et al，2008，Nature，452：487-491)、CDeT6-19启动子以及拟南芥单加氧酶基因CYP86A2启动子(Taylor et al，1995，Plant Journal，7(1)：129-134；Galbiati et al，2008，Plant Journal，53：750-762.Francia et al，2008，Plant Signaling&Behavior，3(9)：684-686)等。然而，这些启动子虽然能够驱动其控制的基因在气孔强势表达，但同时也在它组织和器官有不同程度的表达。也就是说，它们还缺乏气孔表达的特异性。

发明内容

本发明的目的是提供植物气孔特异性启动子及其应用。

本发明所提供的植物气孔特异性启动子来源于陆地棉(Gossypium hirsutum L.)，是下述a)或b)或c)的DNA片段：

a)3′端至少含有序列表中序列1的第538-1005位核苷酸序列，并且从序列1的第538位开始、按照序列1的核苷酸序列向序列1的5′端延长，得到长度为468至1005bp的任意一个DNA片段；所述DNA分子具有启动子功能；

b)与a)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同源性，且具有启动子功能的DNA片段；

c)在严格条件下与a)或b)限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA片段。

所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次。每次5min.0.5X SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次。每次15min。

所述启动子的最后一位核苷酸是序列1的第1005位。

所述启动子为下述1)-3)中任一种：

1)3′端至少含有序列表中序列1的第520-1005位核苷酸序列，并且从序列1的第520位开始、按照序列1的核苷酸序列向序列1的5′端延长，得到长度为486至1005bp的任意一个DNA片段；

2)3′端至少含有序列表中序列1的第410-1005位核苷酸序列，并且从序列1的第410位开始、按照序列1的核苷酸序列向序列1的5′端延长，得到长度为596至1005bp的任意一个DNA片段；

3)3′端至少含有序列表中序列1的第355-1005位核苷酸序列，并且从序列1的第355位开始、按照序列1的核苷酸序列向序列1的5′端延长，得到长度为651至1005bp的任意一个DNA片段。

在本发明的实施例中，所述启动子具体为下述a1)-a5)中任一种：

a1)核苷酸序列为序列表中序列1所示的DNA分子(GhSLSP)；

a2)核苷酸序列为序列表中序列1的第355-1005位核苷酸所示DNA分子(GhSLSP-F2)；

a3)核苷酸序列为序列表中序列1的第410-1005位核苷酸所示DNA分子(GhSLSP-F3)；

a4)核苷酸序列为序列表中序列1的第520-1005位核苷酸所示DNA分子(GhSLSP-F4)；

a5)核苷酸序列为序列表中序列1的第538-1005位核苷酸所示DNA分子(GhSLSP-F5)。

在本发明的实施例中，所述启动子具体为上述a1)-a5)中任一种。

本发明提供的植物气孔特异性启动子，还可以是下述d)或e)或f)的DNA片段：

d)3′端至少含有序列表中序列1的第355-643位核苷酸序列(GhSLSPF2-SH)，并且从序列1的第355位开始、按照序列1的核苷酸序列向序列1的5′端延长，得到长度为289至643bp的任意一个DNA片段；所述启动子的最后一位核苷酸是序列1的第643位；

e)与d)或e)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同源性，且具有启动子功能的DNA片段；

f)在严格条件下与d)或e)限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA片段。

所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次。每次5min.0.5X SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次。每次15min。

所述启动子为下述b1)或b2)：

b1)核苷酸序列为序列表中序列1的第1-643位核苷酸所示的DNA分子(GhSLSP-SH)；

b2)核苷酸序列为序列表中序列1的第355-643位核苷酸所示DNA分子(GhSLSPF2-SH)。

对GhSLSP启动子(序列表中序列1)进行5’端删除分析得到的仍然具有气孔特异性驱动能力的启动子序列。其中，GhSLSP-F5(序列表中序列1的第538-1005位核苷酸)为GhSLSP启动子5’端删除直到转录起始位点(序列表中序列1自5′端第634位核苷酸)上游96bp仍具有气孔特异性启动子活力的小片段，是GhSLSP启动子的核心片段。

对GhSLSP(序列表中序列1)进行3′端删除分析得到的仍然具有气孔特异性驱动能力的启动子序列。其中，GhSLSPF2-SH(序列表中序列1的第355-643位核苷酸序列)为GhSLSP启动子3′端删除直到距离转录起始位点(序列表中序列1自5′端第634位核苷酸)9bp仍具有气孔特异性启动子活力的小片段。

GhSLSP启动子由1005个脱氧核苷酸组成，其核苷酸序列为序列表中序列1，其中第603-608位脱氧核苷酸为TATA盒(TATA box)，第634位脱氧核苷酸为转录起始位点，635-1005位脱氧核苷酸为5′端非翻译区(5′-UTR)。

GhSLSP-F2启动子由651个脱氧核苷酸组成，其核苷酸序列为序列表中序列1的第355-1005位。其中第603-608位脱氧核苷酸为TATA盒(TATA box)，第634位脱氧核苷酸为转录起始位点，635-1005位脱氧核苷酸为5′端非翻译区(5′-UTR)。

GhSLSP-F3启动子由596个脱氧核苷酸组成，其核苷酸序列为序列表中序列1的第410-1005位。其中第603-608位脱氧核苷酸为TATA盒(TATA box)，第634位脱氧核苷酸为转录起始位点，635-1005位脱氧核苷酸为5′端非翻译区(5′-UTR)。

GhSLSP-F4启动子由486个脱氧核苷酸组成，其核苷酸序列为序列表中序列1的第520-1005位。其中第603-608位脱氧核苷酸为TATA盒(TATA box)，第634位脱氧核苷酸为转录起始位点，635-1005位脱氧核苷酸为5′端非翻译区(5′-UTR)。

GhSLSP-F5启动子由468个脱氧核苷酸组成，其核苷酸序列为序列表中序列1的第538-1005位。其中第603-608位脱氧核苷酸为TATA盒(TATA box)，第634位脱氧核苷酸为转录起始位点，635-1005位脱氧核苷酸为5′端非翻译区(5′-UTR)。

GhSLSP-SH启动子由643个脱氧核苷酸组成，其核苷酸序列为序列表中序列1的第1-643。其中第603-608位脱氧核苷酸为TATA盒(TATA box)，第634位脱氧核苷酸为转录起始位点，634-643位脱氧核苷酸为5′端非翻译区(5′-UTR)。

GhSLSPF2-SH启动子由289个脱氧核苷酸组成，其核苷酸序列为序列表中序列1的第355-643位。其中第603-608位脱氧核苷酸为TATA盒(TATA box)，第634位脱氧核苷酸为转录起始位点，634-643位脱氧核苷酸为5′端非翻译区(5′-UTR)。

从陆地棉(Gossypium hirsutum L.)中分别克隆得到GhSLPS全长启动子，并对其进行功能分析，产生了本发明。

含有上述启动子的遗传材料或获得所述启动子的一个引物对也属于本发明的保护范围。

所述遗传材料为表达盒、重组表达载体、重组菌、转基因植物细胞或组织或器官。

在所述表达盒中，所述气孔特异性启动子的下游连接结构基因，或调节基因，或结构基因或调节基因的反义基因，或者能够干扰内源基因表达的小RNA的编码DNA，用于驱动结构基因，或调节基因，或结构基因或调节基因的反义基因，或者天然小RNA或人工合成的小RNA的表达。

所述重组表达载体是含有上述表达盒，例如但不限于质粒和病毒。所述重组表达载体也可为重组植物表达载体。所述重组植物表达载体含有上述表达盒并且能够将所述的表达盒转送进入植物宿主细胞、组织或器官及其后代并且能够或者至少方便所述的表达盒整合到宿主的基因组中，它包括但不限于双元载体、共合载体。在本发明的实施例中，所述重组表达载体具体为在pBI121质粒的多克隆位点插入所述启动子的核苷酸序列得到的重组质粒。

所述重组表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导或基因枪等常规生物学方法转化植物器官或组织或细胞，得到转基因植物细胞或组织或器官及由此分化、再生的完整植株及其无性系或其后代。在本发明的实施例中，具体使用的是农杆菌介导法。

在本发明的实施例中，所述引物对具体为下述c1)-c7)中的任一对：

c1)序列表中序列3的第7-30位核苷酸所示DNA片段和序列2的第7-27位核苷酸所示DNA片段组成的引物对；

c2)序列表中序列3的第7-30位核苷酸所示DNA片段和序列4所示DNA片段组成的引物对；

c3)序列表中序列3的第7-30位核苷酸所示DNA片段和序列5的第7-21位核苷酸所示DNA片段组成的引物对；

c4)序列表中序列3的第7-30位核苷酸所示DNA片段和序列6的第7-28位核苷酸所示DNA片段组成的引物对；

c5)序列表中序列3的第7-30位核苷酸所示DNA片段和序列7的第7-34位核苷酸所示DNA片段组成的引物对；

c6)序列表中序列8的第7-22位核苷酸所示DNA片段和序列2的第7-27位核苷酸所示DNA片段组成的引物对；

c7)序列表中序列8的第7-22位核苷酸所示DNA片段和序列4所示DNA片段组成的引物对。

所述启动子在植物中启动目的基因表达中的应用也属于本发明的保护范围。

所述植物是陆生植物，优选是双子叶植物，更优选是烟草；所述表达为气孔特异性表达。

实验证明，本发明所提供的启动子(包括GhSLSP-F2、GhSLSP-F3、GhSLSP-F4、GhSLSP-F5、GhSLSP-SH和GhSLSPF2-SH)均可启动报告基因GUS在烟草的气孔中特异表达，而在其它花器官和营养器官都没有检测到表达，这说明本发明所提供的启动子具有良好的气孔特异性。同时经相关实验还证明该特异性能够稳定地传递给后代。

将本发明的启动子下游衔接内源基因、外源基因及其反义基因或能够干扰内源基因表达的小RNA(包括天然的和人工合成的小RNA)的编码DNA，构建表达盒并与不同的表达载体连接，转化到植物中，利用其气孔异性表达活性，在气孔中特异性表达其控制或指导的所述内源基因、外源基因及其反义基因或小RNA。在转基因植株中使其内源基因、外源基因及其反义基因或能够干扰内源基因表达的小RNA(包括天然的和人工合成的小RNA)的表达局限于气孔中，排除了这些基因在植体其它组织或器官的表达。

利用本发明的启动子的气孔特异性表达活性，用含有本发明启动子或该启动子与内源基因与外源基因及其反义基因、能够干扰内源基因表达的小RNA(包括天然的和人工合成的小RNA)编码DNA的表达载体转化宿主细胞或宿主组织及其后代细胞，并由此再生完整的转基因植株，培育耐旱、耐高或低浓度CO₂、抗真菌病害和高光合效率的植物或作物品种。所述植物是显花植物，包括但不限于陆生植物、被子植物和裸子植物、单子叶植物和双子叶植物、草本植物、藤本植物和木本植物、园林园艺植物和农作物及牧草植物、一年生植物和多年生植物以及有性和无性繁殖植物，优选为陆生植物。

本发明的气孔特异性启动子可用于功能分析、鉴定和分离植物气孔形成和发育所必须的基因和调控气孔运动的基因，同时可以用于培育耐旱、耐高或低CO₂、抗真菌病害、高光合效率和高产优质的植物或作物品种。具体可在本发明的气孔特异性启动子下游衔接异源或同源基因或其反义基因或小RNA编码DNA，并构建到植物表达载体，转化宿主植物，在其气孔表达目的蛋白、抑制或干扰目标基因的转录或翻译，以开或关气孔或者增强或降低气孔的开关程度。本发明分离的气孔特异性启动子对植物气孔生长和发育基因的功能分析和鉴定、培育耐旱、耐高或低CO₂、抗真菌病害、高光合效率和高产优质的植物或作物品种等都具有重大的应用前景。

本发明这不仅对气孔和保卫细胞的分子生物学研究和气孔运动等的理论研究具有重要的意义，而且在培育抗旱和抗病作物而去提高作物的光合效率进而提高产量和品质等方面具有重大的应用价值和广阔的市场前景。

附图说明

图1为GhSLSP启动子全长克隆的PCR产物电泳图。其中泳道M为分子量标记：λDNA/EcoRI+Hind III；泳道1为引物1和引物2双引物PCR扩增产物；泳道2为引物1单引物PCR扩增产物；泳道3为引物2单引物PCR扩增产物；泳道4为无模板DNA的双引物PCR扩增对照。

图2为外加酶切位点的GhSLSP启动子全长序列图。其中，下划线部分为外加的限制性内切酶识别位点(5′端为HindIII，3′端为BamHI)，方框处为TATA盒；双下划线者为转录起始位点。

图3为气孔特异性启动子GhSLSP驱动报告基因GUS的植物表达载体图谱。

图4为转pBI-GhSLSP的烟草T₀代植株PCR鉴定图。其中，泳道M：DNA大小分子标记λDNA/EcoRI+HindIII；泳道1-8：转基因烟草T₀代8个独立的单株；泳道9：载体质粒(pBI-GhSLSP)对照；泳道10：未转基因的烟草NC89对照；泳道11：蒸馏水为模板的对照。

图5为转基因(GhSLSP-GUS)烟草T₀代植株的叶片圆盘的GUS染色图。其中，A为转GhSLSP-GUS烟草T₀代植株的叶圆盘；a为A所示叶圆盘的局部放大照片。

图6为转基因(GhSLSP-GUS)烟草T₁代植株幼苗GUS染色图。其中，A为T₁代幼苗整株的GUS染色照片；a为A的真叶局部放大图。

图7为气孔特异性启动子GhSLSP的5′端删除和3′端删除不同长度后的各个片段(GhSLSP-F2、GhSLSP-F3、GhSLSP-F4、GhSLSP-F5、GhSLSP-SH和GhSLSPF2-SH)与全长启动子(GhSLSP-F)之间的关系示意图。其中，位于转录起始位点(TSS)上游(即：左端)的数据-X表示GhSFSL经过5′端删除后残留的核苷酸片段的长度。

图8气孔特异性启动子GhSLSP 5′端删除和3′端删除不同长度后的各个片段的PCR产物电泳图。其中，泳道M1和M2分别为DNA分子量标记λDNA/EcoRI+HindIII和Marker 1(100bp标记)；泳道1至6分别为GhSLSP、GhSLSP-F2、GhSLSP-SH、GhSLSP-F3、GhSLSP-F4和GhSLSP-F5的HindIII和BamH I双酶切结果。

图9为气孔特异性启动子GhSLSP 5′端删除和3′端删除不同长度后的各个片段驱动GUS基因在转基因烟草T₀植株表达的GUS染色图。其中F2表示GhSLSP-F2在转基因烟草T₀植株驱动GUS基因表达的GUS染色图；F3表示GhSLSP-F3在转基因烟草T₀植株驱动GUS基因表达的GUS染色图；F4表示GhSLSP-F4在转基因烟草T₀植株驱动GUS基因表达的GUS染色图；F5表示GhSLSP-F5在转基因烟草T₀植株驱动GUS基因表达的GUS染色图；F-SH表示GhSLSPF-SH在转基因烟草T₀植株驱动GUS基因表达的GUS染色图；F2-SH表示GhSLSPF2-SH在转基因烟草T₀植株驱动GUS基因表达的GUS染色图。F2至F2-SH共6个系列图中，均是左侧为叶圆盘的GUS染色图，右侧为左侧图片的局部放大图。

图10为气孔特异性启动子GhSLSP 5′端删除后的片段GhSLSP-F2、GhSLSP-F5和GhSLSP-SH驱动GUS基因在转基因烟草T₁代植株特异性表达的GUS染色图。其中F2表示GhSLSP-F2在转基因烟草T₁植株驱动GUS基因表达的GUS染色图；F5表示GhSLSP-F5在转基因烟草T₁植株驱动GUS基因表达的GUS染色图；F-SH表示GhSLSP-SH在转基因烟草T₁植株驱动GUS基因表达的GUS染色图；A为T₁代幼苗整株的GUS染色照片；a为A的真叶局部放大图。

具体实施方式

本发明中所述的启动子核苷酸序列可以是其中一个或多个核苷酸发生取代、缺失、插入或倒位的核苷酸序列，即所分离的核苷酸序列的人工突变体或“天然”突变体，它保留其启动子功能；还可以是所述的核苷酸序列与其它启动子序列或启动子区保守调控序列(“motif”或“box”)的融合序列。本发明中所述的“启动子”为具有TATA盒(TATAbox)的启动子；TATA盒或类似区域，定位于转录起始位点(TSS，在核苷酸计数上为“+1”)上游并且具有指导RNA聚合酶在正确位置上启动转录的功能，但不限于该区域附近的部分；此外，它还可含有与除RNA聚合酶以外的蛋白质相关联的用于调节表达的另一个必须区域。本发明中所述的“启动子区域”定义为含有上文中定义的启动子的区域和转录起始位点下游至少10个核苷酸的区域。本发明中所述的“启动子活性”是指当以某种基因的可表达方式将其连接到启动子的下游，并导入到宿主中，该宿主显示具有在宿主内或宿主外生产该基因产物的能力和功能时，该启动子具有启动活性。通常，是将编码容易定性或定量检测的蛋白质的基因(例如，报告基因)连接到该启动子的下游，将该基因导入宿主内，并检测所表达的蛋白质，可确定特定启动子的活性或是否存在该启动子或者该启动子的效力。本发明中所述的结构基因是指能够编码某种蛋白质或其它活性物质功能的一段核苷酸序列，包括RNA或DNA序列。所述的调节基因是指其编码的某种RNA或蛋白质或其它活性物质能够对其它结构基因的表达进行调节或调控的一段核苷酸序列，包括RNA或DNA序列。所述的正义基因包括上述的结构基因和调节基因。所述的反义基因是指与上述结构基因或调节基因编码的RNA互补的RNA或DNA序列。所述的内源基因是指来自宿主自身的基因，包括RNA或DNA序列。所述外源基因是指任何一段核酸序列，并具有编码某种蛋白质或其它活性物质功能，包括天然的和人工合成的RNA或DNA序列，该序列与气孔特异性启动子在正常情况不相结合。所述的小RNA是指分离自生物体的或人工合成的RNA序列片段，其长度通常为20-26个脱氧核苷酸或者在导入宿舍细胞后能够被剪切成20-26个脱氧核苷酸的RNA片段，它本身对生物体无毒或毒性极低。

本发明中所述的转化是指现有技术中已知的、能够将外源基因导入植物细胞或植物组织的任何一种植物转化方法，如农杆菌介导法和基因枪等。

本发明中所述的宿主细胞或宿主组织或宿主器官及其后代细胞是指所有植物细胞或植物组织或植物器官或由这些细胞、组织或器官通过组织分化或无性胚再生并且发育成熟的整体植株(包括种子)。

术语“核酸序列”或“核苷酸序列”指含有天然存在的核苷酸或核苷单体的序列。该序列也包括具有相似功能的非天然存在的单体或其部分的修饰的或取代的序列。

术语“气孔特异性启动子”是指能够指导其控制下的基因仅仅在气孔表达而在植体的其它组织不表达或按照常规方法检测不到表达的启动子。

术语“具有75％或75％以上同源性的序列”是指与上述启动子的核苷酸序列相比有75％或75％以上的核苷酸序列相同或相似的那些核酸序列或核苷酸序列，这些序列以基本相同的方式发挥作用并且能够驱动其下游基因的气孔特异性表达，它们与上述启动子中序列的差异可能是由于局部结构上的修饰或突变，包括人工突变和非人工突变。

术语“严谨杂交条件”是指本领域技术人员已知的，或者可以在分子生物学或基因工程实验指南，例如《Molecular Cloning》(3^rd Ed)(Sambrook等，Cold Spring HarborLaboratory，New York，2001)(以下简称“《分子克隆》第三版”)中的通用方案中找到，具体为在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次。每次5min.0.5X SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次。每次15min。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

烟草T₀代表示由愈伤组织得到的转基因植株及其无性系，T₁表示T₀代自交产生的种子及由它所长成的植株和无性系。

实施例1、陆地棉气孔特异启动子SLSP(GhSLSP)的克隆与分离

1、陆地棉总DNA的提取

材料取自陆地棉(Gossypium hirsutum)品种“邯郸5833”(河北省邯郸市农业科学院)，嫩叶片1-2g，用CTAB法(《分子克隆》第三版)提取总DNA。取1-5μl DNA样品，用紫外分光光度计测量其浓度和纯度，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度和完整性。将提取的DNA于-20℃保存。

2、PCR扩增与扩增片段的回收

设计并合成如下两条引物(引物1和引物2)扩增陆地棉气孔特异性启动子，为了方便以后的克隆和构建，在两条引物的5′端分别加入了限制性内切酶Hind III和BamHI的识别序列位点(下列引物序列中的下划线序列)

引物1：5′-AAGCTTACAACTTTTCTCTACCAATCA-3′(Hind III)(序列2)；

引物2：5′-GGATCCGCTAGAGAAAAATGGGAAGGTGAG-3′(BamH I)(序列3)。

以步骤1提取的棉花基因组DNA为模板，进行PCR反应：

反应体系为：模板DNA 800ng；10×Ex buffer 2μl；dNTP混合物(2.5mM)2μl；ExTaqDNA Polymerase(5U/μl)0.5μl；引物1(10μM)2μl；引物2(10μM)2μl；无菌重蒸馏水(sddH₂O)补足至20μl。

PCR反应程序：先94℃预变性5min；然后94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环。

PCR结果如图1所示，PCR反应完成后，取15μl扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下快速用一次性刀片小心切下位于DNA标记1000bp左右的特异片段，用DNA片段回收试剂盒回收并纯化(北京鼎国公司产品)，溶于50μl ddH₂O中，-20℃保存备用。

3、回收片段的亚克隆与测序

将上述步骤2回收的片段插入到载体pBS-T载体(北京天根公司产品)。将得到的重组质粒(含有上述从陆地棉扩增的片段)通过“冻融法”转化到大肠杆菌菌株DH5α感受态细胞。转化的DH5α在表面涂有IPTG和X-gal的含氨苄青霉素50mg/L的LB固体培养基上于37℃过夜培养，挑取平板上生长的白色菌落，接入氨苄青霉素50mg/L的LB液体培养基中于37℃过夜培养。当菌液浓度达到OD₆₀₀为0.8时，离心收集菌体，按小量碱裂解法(《分子克隆》第三版)提取质粒，用限制性酶Hind III和BamHI双酶切后，用1.0％琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下可见分子大小大约分别为3000bp(载体带)和1000bp(目标带)两条带。将酶切验证正确的克隆和由此克隆提取的质粒送交商业测序公司测序。将测序正确的载体命名为pBS-GhSLSP，其中插入片段(上述大约1000bp的目标带)命名为GhSLSP。测序结果如图2所示，在5′端和3′端分别含有引物1和引物2的序列，表明pBS-GhSLSP中确实含有上述由陆地棉扩增的DNA片段GhSLSP。GhSLSP的核苷酸序列为序列表中序列1。

实施例2、陆地棉气孔特异性启动子(GhSLSP)驱动GUS基因植物表达载体的构建

将pBS-GhSLSP用限制性内切酶Hind III和BamH I双酶切后，用1.0％琼脂糖凝胶电泳，切取1000bp左右的带(GhSLSP)，用DNA片段回收试剂盒(北京鼎国公司产品)回收并纯化，获得GhSLSP。将纯化的GhSLSP与经过Hind III和BamH I双酶切的植物表达载体pBI121质粒(原Clontech公司产品)的大片段(大约为13.9kb)相连，得到重组质粒。将所得到重组质粒用“冻融法”(《分子克隆》第三版)转化到大肠杆菌菌株DH5a。转化的DH5α在含卡那霉素50mg/L的LB固体培养基上于37℃过夜培养，挑取平板上生长的单菌落，接入含卡那霉素50mg/L的LB液体培养基中于37℃振荡过夜培养。当菌液浓度达到OD₆₀₀值0.6-0.8时，离心收集菌体，按上述小量碱裂解法提取质粒，用限制性内切酶HindIII和BamH I双酶切后，在1.0％琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下可见分子大小分别约为13.9kb(pBI121载体带)和1000bp(GhSLSP)两条带，并且进行测序验证。将酶切和测序表明含有气孔特异性启动子GhSLSP片段和pBI121酶切得到的大片段的重组表达载体命名为pBI-GhSLSP。

在重组表达载体pBI-GhSLSP中的GUS基因，需要气孔特异启动子GhSLSP驱动表达。所构建的植物双元表达载体pBI-GhSLSP的图谱见图3。

实施例3、转GhSLSP烟草的获得和鉴定

1、农杆菌的转化与转化子的鉴定

用CaCl₂法(《分子克隆》第三版)制备根癌农杆菌菌株LBA4404和GV3101(美国Life Technology公司产品)的感受态细胞。利用冻融法(《分子克隆》第三版)将实施例2所得的重组表达载体(pBI-GhSLSP)转入制备的LBA4404的感受态细胞。将转化的LBA4404细胞接种到含有链霉素(Str)100mg/L和卡那霉素(Kan)50mg/L的YEB固体培养基，置于28℃在暗处培养48-72h，挑取平板上的单菌落，接入含有Str 100mg/L和卡那霉素50mg/L的YEB液体培养基，在28℃振荡过夜培养。当培养物的浓度达到OD₆₀₀值0.4-0.6时，取少量菌液(1.5-2ml)，按上述小量碱裂解法提取质粒，用限制性内切酶Hind III和BamH I双酶切鉴定，在1.0％琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下可见分子大小大约分别为13.9kb(载体带)和1000bp(GhSLSP)两条带，并测序鉴定。

将酶切和测序鉴定表明含有GhSLSP片段的转入pBI-GhSLSP的LBA4404阳性克隆命名为LBA4404/pBI-GhSLSP。

2、转基因烟草的获得

1)农杆菌的准备

挑取携带植物表达载体pBI-GhSLSP的农杆菌LBA4404单菌落(LBA4404/pBI-GhSLSP)，接种于5ml含Str 100mg/L和Kan 50mg/L的YEB液体培养基中，28℃振荡培养过夜培养，取活化的农杆菌液，按1∶100的比例加入到含Str 100mg/L和Kan 50mg/L的YEB液体培养基中，继续培养至OD₆₀₀值为0.4-0.6；5000rpm离心5min，收集菌体；用1/2MS0液体培养基(MS无机盐+B5维生素+肌醇0.1g/L+蔗糖30g/L，pH5.80)洗涤菌体一次，并将其稀释到离心前菌液3倍体积的1/2MS液体培养基中，准备侵染用。

2)烟草的转化与转化植株的再生

烟草的转化根据叶盘法(Horsch RB等，1985，Science，227：1229-1231)进行。具体操作为：选取约30天苗龄的烟草(品种“NC89”，种子购自中国农业科学院)无菌苗，切下鲜嫩浓绿的叶片，用直径9mm的打孔器制取叶盘外植体；将新制备的外植体投入上步1)已准备好的农杆菌菌液中，侵染15min；取出叶盘，用高压灭菌的吸水纸吸除叶盘表面残余的农杆菌菌液，置于固体再生培养基(MS无机盐+B5维生素+肌醇0.1g/L+BA2.0mg/L+IAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉0.7％，pH5.8)上暗处共培养2天；将共培养的叶盘转到含有羧苄青霉素(Carb)500mg/L和Kan 50mg/L的固体再生培养基进行筛选培养，每隔2-3周更换一次培养基，并逐渐降低Carb至200mg/L。待Kan抗性芽长到1-1.5cm时，将其切下换到含有Carb 200mg/L和Kan50mg/L的固体生根培养基(MS无机盐+B5维生素+肌醇0.1g/L+IAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉0.7％，pH5.80)上诱导生根，获得完整的具有卡那霉素抗性的转基因烟草T₀代植株。

3)转基因烟草T₀代植株的分子鉴定

对步骤2)和3)得到的烟草T₀代植株进行PCR鉴定。根据SDS法和CTAB(《分子克隆》第三版)提取上述得到的具有Kan抗性基因的烟草T₀代植株和未转基因的对照株(烟草品种“NC89”)的叶片基因组DNA，用气孔特异性启动子GhSLSP两端特异性引物对(引物1和引物2)进行PCR扩增，结果显示，转基因烟草T₀代(图4)扩增得到大小约为1000bp的目标带，而未转化的对照植株在相应位置则没有扩增出此目的片段。这一结果初步表明气孔特异性启动子GhSLSP及其目标基因已整合到烟草基因组中。

实施例4、利用组织化学检测转基因烟草中GUS基因的表达，确定GhSLSP启动子活性和特异性

转基因烟草GUS基因表达的组织化学检测按照Jefferson RA[1987，Plant Mol BiolRep，5(4)：387-405]的方法进行。将转基因烟草T₀代植株及其后代的新鲜的根、茎、叶(叶圆盘)、花萼、花瓣、花丝、子房、柱头和花药在GUS染色液(X-GLuc溶液)中于37℃染色12-16h，然后经脱色液(乙醇∶冰醋酸＝3∶1)脱色后，在显微镜下观测样品并拍照。未转基因的受体品种植株同样染色作为对照。烟草叶圆盘取自近叶柄处。转入每个表达载体的烟草T₀代植株和拟南芥T₁植株均取10株以上的独立转化单株。

转基因T₀代烟草的GUS染色的结果显示，未转基因的对照植株(CK)的各个组织和器官都不能染色，但转GhSLSP的叶片保卫细胞被深度染色，叶肉细胞、叶脉和表皮毛的染色较弱(图5)。

随机取T₀转基因烟草的种子，用5％次氯酸钠表面消毒后接种在含Kan 100mg/L的固体MS培养基表面，在24±1℃暗处发芽，发芽后光照条件改为16h光照/8h黑暗，温度为24±1℃，在此条件下筛选转基因后代。在Kan抗性苗呈现3-4片真叶时，随机取10株以上进行整株GUS染色。T₁烟草幼苗的GUS染色显示，子叶和真叶的气孔都被染成GUS蓝色，幼根中轴也呈现弱的蓝色(图6)

实施例5、气孔特异性启动子的最短活性片段的分析

对气孔特异性启动子的最短活性片段的分析采用的是GhSLSP启动子片段5′端和/或3′端删除分析法。为了解析气孔特异性启动子GhSLSP的最短活性片段，我们设计了4个5′端删除片段(GhSLSP-F2、GhSLSP-F3、GhSLSP-F4、GhSLSP-F5)和2个3′端删除片段(GhSLSP-SH和GhSLSPF2-SH)。这6个部分片段间的关系及大小如图7所示。

1、气孔特异性启动子5′端和/或3′端删除片段的克隆与分离

根据GhSLSP全长序列设计并合成以下5条引物，其中上游引物(也称5′端引物)4条(F2-F5)，下游引物(也称3′端引物)1条(R2)。为了方便以后的克隆和构建，在4条上游引物(F2-F5)的5′端加入了限制性内切酶Hind III识别序列位点，在1条下游引物(R2)的3′端加入了限制性内切酶BamH I的识别序列位点(下列引物序列中的下划线序列)。这些引物如下：

F2：5′-CAATATGAAAAAGCTTGAGTGC-3′(序列4)；

F3：5′-AAGCTTATTTTGGAAGATGAC-3′(序列5)；

F4：5′-AAGCTTCTTTACATGCATCATGTGATCG-3′(序列6)；

F5：5′-AAGCTTATCGTGGGGGACCCGAAACTTGGCATAC-3′；(序列7)

R2：5′-GGATCCGTGGTTGGATGAGA CT-3′；(序列8)。

按照实施例1所述方法，以实施例1鉴定正确的含有GhSLSP全长序列的重组质粒pBS-GhSLSP为模板，将上列4条上游引物(F2-F5)分别与引物2(序列表中序列3)组合作为引物对进行PCR扩增，得到4条不同长度的5′端删除启动子片段；分别以全长上游引物(引物1，即序列表中序列2)或上述F2(序列4)，与R2(序列8)组合作为引物对进行PCR扩增，得到2条不同长度的3′端删除启动子片段。图11是以pBS-GhSLSP重组质粒DNA为模板的PCR产物亚克隆的酶切鉴定图(HindIII+BamHI双酶切)。

对得到的启动子片段进行回收。按照实施例1步骤3所述的方法进行回收片段的亚克隆与测序。所得重组载体依照含有启动子片段的不同分别命名为pBS-GhSLSPF2、pBS-GhSLSPF3、pBS-GhSLSPF4、pBS-GhSLSPF5、pBS-GhSLSP-SH、pBS-GhSLSP-SH2。测序结果表明以上6份质粒中均含有GhSLSP启动子5′端或3′端删除后不同长度后的片段。GhSLSP-F2的核苷酸序列为序列表中序列1的第355-1005位，命名为GhSLSP-F2启动子；GhSLSP-F3的核苷酸序列为序列表中序列1的第410-1005位，命名为GhSLSP-F3启动子；GhSLSP-F4的核苷酸序列为序列表中序列1的第520-1005位，命名为GhSLSP-F4启动子；GhSLSP-F5的核苷酸序列为序列表中序列1的第538-1005位，命名为GhSLSP-F5启动子；GhSLSP-SH的核苷酸序列为序列表中序列1的第1-643位，命名为GhSLSP-SH启动子；GhSLSPF2-SH的核苷酸序列为序列表中序列1的第355-643位，命名为GhSLSPF2-SH启动子。

2、气孔特异启动子各片段驱动GUS基因达的植物表达载体的构建

气孔特异启动子各片段驱动GUS基因植物表达载体的构建方法同实施例2，即将步骤1所得的6份质粒(pBS-GhSLSPF2至pBS-GhSLSPF5、pBS-GhSLSP-SH和pBS-GhSLSPF2-SH)分别经限制性内切酶Hind III和BamH I双酶切后，分别得到6个气孔特异启动子片段，将这些片段回收后分别与经过Hind III和BamH I双酶切的植物表达载体pBI121的大片段(大约为13.9kb)相连，得到重组质粒。按照实施例2所述方法转化，摇菌，小量碱裂解法提取质粒，再分别用步骤1中各自克隆时所用的特异性引物对进行PCR鉴定，结果如图8所示。PCR鉴定后再进行测序鉴定，将PCR和测序表明含有预先设计的气孔特异启动子片段(GhSLSP-F2、GhSLSP-F3、GhSLSP-F4、GhSLSP-F5、GhSLSP-SH或GhSLSPF2-SH)与pBI121酶切得到的大片段用T4连接酶连接起来，得到重组表达载体，分别命名为pBI-GhSLSPF2、pBI-GhSLSPF3、pBI-GhSLSPF4、pBI-GhSLSPF5、pBI-GhSLSP-SH、pBI-GhSLSPF2-SH(简称为GhSLSPX-GUS；X＝F2、F3、F4、F5、-SH或F2-SH)。

在上述6个植物表达载体中，GUS基因由各气孔特异启动子片段驱动表达。

3、转气孔特异性启动子片段烟草的获得

按照实施例3的方法分别将上述GhSLSPX-GUS系列6个植物重组表达载体转入烟草(品种“NC89”，种子购自中国农业科学院)中，从而筛选获得转基因的烟草T₀代植株。

分别提取转各表达载体的烟草T₀代植株基因组DNA，用引物F2-F5(序列分别为序列4、序列5、序列6、序列7)中任一个与引物2(序列3)组成引物对进行PCR扩增，或者使用引物1(序列2)或引物F2(序列4)与引物R2(序列8)组成引物对进行PCR扩增，从而分别检测转基因的烟草中是否转入了相应的启动子。接着，将检测阳性的转基因烟草进行GUS基因表达的组织化学检测(按照实施例4的方法)详见步骤5。

4、转GhSLSPX-GUS系列重组载体的烟草T₀代植株中GUS基因表达的组织化学检测

按照实施例4的方法分别对上述PCR检测阳性的转GhSLSPX-GUS系列重组表达载体的烟草T₀代植株进行GUS基因表达的组织化学染色，每个启动子片段GhSLSPX-GUS阳性的植株均随机取样3-5个独立单株，同时以未转基因的烟草为对照。

转基因烟草T₀代的染色结果如图9所示。结果表明，GhSLSP-F2(图9F2)、GhSLSP-F3(图9F3)都能够驱动GUS基因在保卫细胞中特异性地强表达，尽管在叶肉细胞中似乎有微量的表达；GhSLSP-F4能够驱动GUS基因在保卫细胞完全特异性表达(图9F4)，只是表达强度比GhSLSP-F3要弱一些；GhSLSP-F5能够驱动GUS基因在保卫细胞优势表达，在叶肉细胞的表达相对较弱(图9F5)；GhSLSP-SH驱动的GUS基因在保卫细胞、叶肉和叶脉中都有表达，尽管在保卫细胞中表达稍强(图9F-SH)；GhSLSPF2-SH驱动的GUS基因在保卫细胞中有微量表达，而且只能在局部有GUS着色(图9F2-SH)。

5、转GhSLSPX-GUS系列重组载体的烟草T₁代植株中GUS基因表达的组织化学检测

取GhSLSP-F2、GhSLSP-F5和GhSLSP-SH转基因烟草T₀植株的种子，用5％次氯酸钠表面消毒后接种在含Kan 100mg/L的固体MS培养基表面，在24±1℃暗处发芽，发芽后光照条件改为16h光照/8h黑暗，温度为24±1℃，在此条件下筛选转基因后代。在Kan抗性苗呈现3-4片真叶时，每个构建随机取10株以上进行整株GUS染色。T₁代烟草幼苗的GUS染色显示(图10)，转GhSLSP-F2的T₁代烟草子叶和真叶的气孔都被染成很深的GUS蓝色，幼根中轴也呈现弱的蓝色(图10F2)；转GhSLSP-F5的T₁代烟草子叶和真叶的气孔都被染成浅的GUS蓝色，幼根未见染色(图10F5)；转GhSLSP-SH的T₁代烟草幼苗子叶和真叶的气孔仅仅有部分能被GUS染色，而去染色成极浅；幼根没有观察到染色(图10F-SH)。

上述的实施例结果表明并且确证，本发明所提供的棉花气孔特异性启动子GhSLSP及其5′端和3′端删除后的启动子(GhSLSP-F2、GhSLSP-F3、GhSLSP-F4、GhSLSP-F5、GhSLSP F-SH和GhSLSPF2-SH)不仅具有良好的气孔特异性，而且该特异性能够稳定地传递给后代。因此，本发明所提供的分离自陆地棉的启动子GhSLSP是一个稳定、驱动力和特异性都很强的气孔特异性启动子。

Claims (6)

1.DNA分子，是下述a2）-a5）中任一种：

a2）核苷酸序列为序列表中序列1的第355-1005位核苷酸所示DNA分子；

a3）核苷酸序列为序列表中序列1的第410-1005位核苷酸所示DNA分子；

a4）核苷酸序列为序列表中序列1的第520-1005位核苷酸所示DNA分子；

a5）核苷酸序列为序列表中序列1的第538-1005位核苷酸所示DNA分子。

2.获得权利要求1所述DNA分子的引物对；所述引物对为下述c2）-c5）中的任一对：

c2）序列表中序列3的第7-30位核苷酸所示DNA片段和序列4所示DNA片段组成的引物对；

c3）序列表中序列3的第7-30位核苷酸所示DNA片段和序列5的第7-21位核苷酸所示DNA片段组成的引物对；

c4）序列表中序列3的第7-30位核苷酸所示DNA片段和序列6的第7-28位核苷酸所示DNA片段组成的引物对；

c5）序列表中序列3的第7-30位核苷酸所示DNA片段和序列7的第7-34位核苷酸所示DNA片段组成的引物对。

3.含有权利要求1所述DNA分子的表达盒。

4.含有权利要求1所述DNA分子的重组载体。

5.含有权利要求1所述DNA分子的重组菌。

6.权利要求1所述DNA分子在植物中启动目的基因表达中的应用；

所述植物是烟草；所述表达为气孔特异性表达。

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