CN116463349B - 水稻气孔组织特异性表达的启动子OsP04g0617800及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了水稻气孔组织特异性表达的启动子OsP04g0617800及其应用，属于植物基因工程技术领域。所述水稻组织特异性表达启动子OsP04g0617800的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，具有以下特点：位于Os04g0617800基因的5’端及其上游；碱基长度为2096bp；具有引发转录的必要位点及转录起始点；在水稻气孔中特异性表达；本发明公开的水稻组织特异性表达启动子OsP04g0617800能够有效在水稻气孔中特异性表达，具有在特定组织中发挥外源基因表达产物的功能，调控外源基因在植物特定组织器官中持续地表达，避免浪费并增加转基因的效果。
Description
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，特别是涉及水稻气孔组织特异性表达的启动子OsP04g0617800及其应用。
背景技术
高等植物的生长发育是不同基因在不同时空有序表达和协同作用的结果。启动子是基因表达的重要顺式作用元件，其通过与转录因子的结合进而决定了基因的表达模式与表达强度。根据启动子调控基因转录的模式不同将其分为组成性、诱导性和组织特异性启动子三种类型。
组织特异性启动子可调控目的基因在某个组织(根、茎、叶、果实)中特异性表达，而在非靶向组织基本无表达，表现出发育调节的特性，能够减少非目的蛋白的积累、提高目的蛋白的含量以避免能量浪费，减少了基因因为组成性方式表达而引起的植株矮化、基因沉默等问题。为了避免同时使用同一个类型启动子驱动多个外源基因而导致基因沉默或共抑制的现象，需要用不同的启动子分别驱动外源基因、筛选基因和报告基因。从水稻中已获得了大量优良的功能基因，而对组织特异型启动子的报道却相对较少，其数量远远不能匹配基因数量的增长。
水稻作为人类最重要的粮食作物之一，其产量的高低对人类生活、经济具有重要的影响，而病虫害及逆境常常造成水稻大量减产，因此利用基因工程技术改良水稻，使其获得抗病、抗虫能力以及对环境的耐受性是提高水稻产量的有效途径之一。要使外源基因有效、合理、稳定的表达，需要有相应的启动子来驱动。因此，分离鉴定天然或者人工合成组织特异型启动子对水稻转基因育种具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供水稻气孔组织特异性表达的启动子OsP04g0617800及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明提供组织特异型启动子能够有效在水稻气孔中特异性表达，可以在特定组织中特异性地发挥外源基因表达产物的功能，调控外源基因在植物气孔中持续地表达，避免浪费并增加转基因的效果。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种水稻气孔组织特异性表达启动子OsP04g0617800，所述水稻气孔组织特异性表达启动子OsP04g0617800的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明还提供一种用于扩增所述水稻气孔组织特异性表达启动子OsP04g0617800的引物组，所述引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO：2-3所示。
本发明还提供一种含有所述水稻气孔组织特异性表达启动子OsP04g0617800的重组载体、表达盒或重组菌。
本发明还提供一种构建所述水稻气孔组织特异性表达启动子OsP04g0617800的方法，包括以下步骤：
以水稻的DNA为模板，利用所述的引物组进行PCR扩增，获得所述水稻气孔组织特异性表达启动子OsP04g0617800。
本发明还提供一种创制转基因植物的方法，包括将所述的重组载体、表达盒或重组菌转入植物中的步骤。
本发明还提供一种所述的水稻气孔组织特异性表达启动子OsP04g0617800或所述的引物组或所述的重组载体、表达盒或重组菌在植物中启动目的基因表达中的应用。
进一步地，所述目的基因在植物气孔组织中特异性表达。
进一步地，所述植物包括水稻。
本发明还提供一种所述的水稻气孔组织特异性表达启动子OsP04g0617800或所述的引物组或所述的重组载体、表达盒或重组菌在植物遗传改良中的应用。
进一步地，所述植物包括水稻。
本发明公开了以下技术效果：
本发明的水稻组织特异性表达启动子OsP04g0617800来源于水稻粳稻品种日本晴，所述水稻组织特异性表达启动子OsP04g0617800片段大小为2096bp，具有以下特点：(1)位于Os04g0617800基因的5’端及其上游；(2)碱基长度为2096bp；(3)具有引发转录的必要位点及转录起始点；(4)在水稻气孔中特异性表达，调控外源基因在植物特定组织器官中持续地表达，避免能源浪费并增加转基因的效果，减少了基因因为组成性表达而引起的植株矮化、基因沉默等问题，不仅可以为转基因水稻育种服务，也可以为长远的启动子改造和设计储备资源服务。本发明还公开了含有组织特异性表达启动子OsP04g0617800的重组表达载体，在重组表达载体的组织特异性表达启动子OsP04g0617800调控下使下游基因在植物气孔中特异性表达，为植物基因工程领域研究基因在植物气孔中高效、稳定、特异性地表达提供了工具，具有广泛的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为PCR产物检测结果；M为Marker，A中三条带均为目的DNA片段的PCR扩增产物，B中条带为含目的DNA片段的载体转入大肠杆菌后进行菌落PCR的扩增产物；
图2为重组质粒pCAMBIA1391Z-OsP04g0617800和启动子OsP04g0617800的结构示意图，其中，A为重组质粒pCAMBIA1391Z-OsP04g0617800的结构示意图，LB和RB分别表示T-DNA的左边界和右边界，Hyg表示潮霉素抗性基因，OsP04g0617800表示启动子，NOS表示基因的终止子；B为启动子OsP04g0617800的多克隆位点图(MCS)；
图3为实施例2中的转基因植株PCR检测结果，其中，M为DNALadder，1～16为转基因植株外源目的基因PCR扩增产物(2096bp)；
图4为实施例2中的转基因植株中启动子OsP04g0617800驱动GUS基因在气孔组织的表达，其中，A为放大400倍的叶片横切面GUS染色图，B为放大200倍的叶片GUS染色图，C为根段GUS染色图，D为放大200倍的根部横切面GUS染色图，E为茎段GUS染色图，F为放大200倍的茎部横切面GUS染色图，G为谷粒GUS染色图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径购置得到。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的GUS染色液(pH7.0)：溶剂为200mmol/LPBS缓冲液，溶质及其在染色液中的浓度分别为：100mmol/L亚铁氰化钾、100mmol/L氰化钾、0.5mmol/L EDTA(pH8.0)、10mg/ml X-Gluc、0.1％(体积比)Triton X-100。
下述实施例中所用引物均由北京睿博兴科生物技术有限公司合成，睿博兴科生物技术有限公司测序；Taq酶购自美国APExBIO公司；Trans5α感受态及相关的试剂盒均购自北京全式金生物技术有限公司；质粒小提试剂盒购自天根生化科技有限公司；胶回收试剂盒购自德国QIAGEN公司；限制性内切酶HindIII和BamHI、T4连接酶均购自赛默飞世尔科技公司；抗生素购自北京酷来搏科技有限公司；pCAMBIA1391Z载体和农杆菌AGL1均由本实验室冷冻保存；其余试剂均为国产分析纯。
实施例1水稻组织特异性启动子OsP04g0617800的获得
1.1引物的设计
根据NCBI中提供的水稻品种日本晴(Oryza sativa L cv.Nipponbare)全基因组序列，依据水稻基因Os04g0617800启动子的序列设计扩增引物，上游引物加Hind III的AAGCTT酶切位点及保护碱基，下游引物加Bam HI的GGATCC酶切位点及保护碱基。引物序列如下：
上游引物(SEQ ID NO：2)
5’-GATTACGCCAAGCTTTCGGCTTAGACACAAGAACCA-3’；
下游引物(SEQ ID NO：3)
5’-AATTCCCGGGGATCCTGGACCGCATCTATCTTGG-3’。
1.2PCR扩增
以全式金公司植物基因组试剂盒提取的水稻日本晴基因组DNA为模板，用步骤1中设计的上游引物和下游引物进行PCR扩增，得到PCR产物。
PCR反应体系(50μL)：2×Phanta Flash Master Mix(Dye Plus)25μL、上游引物2.5μL、下游引物2.5μL、DNA模板2μL、ddH2O 18μL。。
PCR反应条件如下：98℃预变性30s，98℃变性10s，52℃退火30s，68℃延伸2min30s，共35个循环；68℃延伸2min。
1.3PCR产物检测
PCR反应结束后，使用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物；然后使用胶回收试剂盒回收并纯化目的DNA片段。结果如图1所示，其中M为DNAMarker，A中三条带均为目的DNA片段的PCR扩增产物，B中条带为含目的DNA片段的载体转入大肠杆菌后进行菌落PCR的扩增产物。结果表明，PCR扩增得到大小为2096bp的DNA片段，测序该2096bp的DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，将该核苷酸序列的DNA片段命名为OsP04g0617800，其由2096个碱基组成。
SEQ ID NO：1(5’-3’)：
TCGGCTTAGACACAAGAACCAAAAAACTCTGTGTGAGAGACAAGTGTCCTATATTAATCGTAAAGAGCTAATTATTATATGGATGGACTGAGAGAAGTCTTAAAAAAATCTTATAGCCAACAAGTCAGCTATATTATTAGCCTCGCTCTTAATGGAGTTTGTAGAGAACTTGCAATAGCATATTTTAGAGCAACTTTTCAACCTTGTAATAGTAGTTAATTTATTTAATTCGGACGAAAAGACCTACTAGGCATGATCAGTCAAAGGTTCTCCAAACCTACAAGTCACAAGGTTGAAATAGTTTTTCAGAGAATTTGCAACCCATGGAATATAAATTCTAAAACCTTATTAGTACACTGCAGAACGACAGTGCTGCTCATGACTCTGTATTACCAGTTTGACGTGGATCCATCATCGGATAATTAAGGAGTTCGATTGTAGCATCAGGTACAGAGATAACTAACGCCTAAGCAAATGGGACTGGTTCTGGTTCAGTATCACAGTTTTTTCAGACGAAAATTATGGGTGTCACACAAGTACAGAATTGATATTCTGAACATGATGCTGCAGTGTTTTAATTGGGCTCTGCAATTAACTGCAAAATTTTGGTACTACAATGACTGAAGAATACTGCTCCACTACAAGCAACTACTGCTTGCCAATGCATTTTTCTGTTAATTAACAGAAGCAAGCTACACTGCTCTGGAGTACGTACTTGTTGCAACAGTAGTAATTAATTCCTCGTTTTAATTAGCAGCGTAGCGAGAGTACGTTCGTCCTGCAGACTGCATATACGACTACTGGCAATGGCAATAATCAATGTTGGGTTTTCAGCATTTGGACGAAAAGCATACGTACGCTAATTAAGCTACAATTGTTCTTTTCGTTCATTTATTAATATTACTTTTTTGCTTCTGGTCTCGATCGATCAATCGATGTATATCAATTGGAAGAACGGCGTTGCAAATGCTGCTGCAGTTAATTGAATCTGTACCACTTGGTTCGGTATAGAGACAGTACTGTCCATCCAGTTGTTGATCAACTTGACCTCTGAACAAATCAGCAAATTTGTTTGGTTTAATTGCAAGCAGATAGAAGTCTATGTTTTGTACTGTGTATTGATTTGTTTGGTCTTAGTCTACTACACTAGTTAAAAGTATATTACAGGTGGGCAATCAATTAGTTTTAATTGTTGATTTATTAAGTTGTGCCATGCAAGTTGAGAAATGGGAAACCATATTCAACCTCATATTTTTTTTCTTTCTAAAATAATGAGAAGCCATGCATTCAACTTGTGAATTTCTTATCCATTTCAGTGGGTGAGAGTCAGCCTTCAGCATGTCATGATCTCTTTTTTTTTTCCTTTTTGACACATTGACTACTACAATTATATGAAGTTTAGTTTTTCAGAGCCGCATAAGAGGACGAGTTTTTTGTTCTCTAGTCAGTTTGATAATGAATTAAACAGGGATTTTAATTAATAATATGAACACCAATTCAGTACTCTCGATACAGCTGGGCCGTGCATGCATCATATTGCATCACTGTGCTCGATTTGCAAGCTGTGCTTATTGACGGTCAAATTGAGCCGACACGCACCGGCAAATGAAAGATATCTCTGATAATCTCGCTTAATTTCACGAAAGTGAGAGATGGACATTAATTGTAACTACCACTAAATCTGAATAGATCCATTTTTTCACCGTCTCAAATCTGAATGTCAATATCTGGTCGAGTGACCTACGGACACGCGTAAATTTTATACTATCATTTTGGAAGAAATTTTTGTTGAAACATCAGCGTTACTCCAAATAGAATTCTTCCCATGATCACTCCCTCCCTTCCTCTTAAACCGACTCCTAAATATTTTTTAGACAATAAAATGGAAATAGTTTAGGGTGTGTTTAGTTGGATGGATGAAGCTAGATAGGAGATAGCTGTAGGGGTATAAATGGGTCAGCCGCGAACCCACTTATAGGTCAAAATAATCGGGTTCGTGGCTTATTTTAGCTTATAAGTAGGTTTCGCTGGTTAGCCACTTACACCGCTAGATAGCTGGCCGATTTTTTTTTAGAGGCCAAGATAGATGCGGTCCA。
1.4表达载体的构建
使用限制性内切酶HindIII和BamHI双酶切上一步回收的目的DNA片段以及pCAMBIA1391Z载体，得到OsP04g0617800片段与pCAMBIA1391Z载体骨架片段；将OsP04g0617800片段与pCAMBIA1391Z载体骨架片段使用连接酶进行连接，获得重组质粒pCAMBIA1391Z-OsP04g0617800(图2)，并测序。测序正确的重组质粒pCAMBIA1391Z-OsP04g0617800为将SEQ ID NO：1所示的OsP04g0617800启动子插入pCAMBIA1391Z载体的HindIII和BamHI酶切位点间，且保持pCAMBIA1391Z载体的其他序列不变得到的载体；OsP04g0617800启动子用于启动pCAMBIA1391Z载体中GUS基因的表达。之后使用CaCl2法制备大肠杆菌感受态，以热激法将重组质粒转入大肠杆菌中并通过菌落PCR验证(图1中B)，在-80℃下甘油保存。
实施例2OsP04g0617800启动子的功能验证
1.1转基因株系的获得
从实施例1中所得到的大肠杆菌中提取含有目的基因的重组质粒，将重组质粒pCAMBIA1391Z-OsP04g0617800导入农杆菌AGL1后，将所述农杆菌重悬于液体共培养基(AAM液体培养基+50mg/L乙酰丁香酮，pH5.2)中培养，经调整得到OD600nm为0.12-0.15的菌液。
取水稻材料日本晴的愈伤组织(日本晴种子在添加有2,4-D 2mg/L的MS培养基上诱导28d左右生成)，用得到的菌液浸泡30min，然后经共培养、筛选、生根、壮苗，得到T0代转基因植株。
提取T0代转基因植株的DNA，利用实施例1中的上游引物和下游引物进行PCR扩增，PCR程序同实施例1。PCR扩增得到大小为2096bp的DNA片段即为阳性转OsP04g0617800启动子基因植株。最终经PCR检测的结果如图3所示，获得的T0代试管苗(16株)都是转基因阳性植株。
1.2转OsP04g0617800启动子植株的染色
分别对阳性转OsP04g0617800启动子植株不同部位进行GUS组织化学染色。具体操作步骤为：选取阳性转OsP04g0617800启动子植株的不同组织器官(根、茎、叶、种子)，并将各组织块移入加有适量的GUS染色液的试管中，使GUS染色液浸没组织块，37℃下保存10h；染色结束后，将染色组织先置于75％乙醇漂洗脱色，再依次用50％和20％乙醇分别浸泡20min以上，直到材料呈白色；最后在显微镜下观察染色处理过的组织块或组织块的切片，组织部位被染成蓝色即为GUS基因在该组织部位得到了表达。
染色结果如图4所示。其中，A为放大400倍的叶片横切面，B为放大200倍的叶片，C为根段，D为放大200倍的根部横切面，E为茎段，F为放大200倍的茎部横切面，G为谷粒。从图中可以看出，GUS基因只在转OsP04g0617800启动子基因植株的叶片气孔中可表达，而在其他组织(如根、茎、种子)都没有表达。说明本发明的启动子OsP04g0617800在水稻中表现为气孔组织特异性表达模式，可应用于基因工程中启动相应外源目的基因表达。
组织特异性启动子可调控目的基因在某个组织中特异性表达，在非靶向组织基本无表达，减少非目的蛋白的积累以避免能量浪费，提高了目的蛋白的含量。例如，水稻绿色组织特异启动子pOsBI-1L-8、水稻花器官特异启动子OsTFL2、水稻胚特异启动子OsESP1等都是科研工作者在基因工程的实践中普遍使用的组织特异性启动子。本发明获得的组织特异性启动子OsP04g0617800作为水稻内源性启动子，在今后的水稻转基因育种研究和实践中，更利于水稻受体细胞调控因子对外源目的基因的识别，减少甲基化，促进外源基因的整合，提高转化表达效率，该气孔特异性启动子也有助于提高水稻光合效率的基因工程育种方面研究。另外，诱导性启动子在诱导过程中使得大规模生产变得繁琐，生产成本增高；组成性启动子的基因表达可能引起植株矮化、基因沉默等问题。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (8)
1.一种水稻气孔组织特异性表达启动子OsP04g0617800，其特征在于，所述水稻气孔组织特异性表达启动子OsP04g0617800的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种用于扩增权利要求1所述水稻气孔组织特异性表达启动子OsP04g0617800的引物组，其特征在于，所述引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO：2-3所示。
3.一种含有权利要求1所述水稻气孔组织特异性表达启动子OsP04g0617800的重组载体、表达盒或重组菌。
4.一种构建权利要求1所述水稻气孔组织特异性表达启动子OsP04g0617800的方法，其特征在于，包括以下步骤：
以水稻的DNA为模板，利用权利要求2所述的引物组进行PCR扩增，获得所述水稻气孔组织特异性表达启动子OsP04g0617800。
5.一种创制转基因植物的方法，其特征在于，包括将权利要求3所述的重组载体、表达盒或重组菌转入植物中的步骤；所述植物为水稻。
6.一种如权利要求1所述的水稻气孔组织特异性表达启动子OsP04g0617800或权利要求3所述的重组载体、表达盒或重组菌在植物中启动目的基因表达中的应用，其特征在于，所述植物为水稻。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述目的基因在植物气孔组织中特异性表达。
8.一种如权利要求1所述的水稻气孔组织特异性表达启动子OsP04g0617800或权利要求3所述的重组载体、表达盒或重组菌在植物遗传改良中的应用，其特征在于，所述植物为水稻。
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| US7993926B2 (en) * | 2006-05-15 | 2011-08-09 | University Of Maryland, College Park | Guard cell-specific tool for molecular manipulation of drought avoidance/water loss in plants |
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Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN102433338A (zh) * | 2012-01-04 | 2012-05-02 | 中国农业大学 | 一种植物气孔特异性启动子及其应用 |
| KR101494191B1 (ko) * | 2013-10-10 | 2015-02-17 | 고려대학교 산학협력단 | 공변세포 특이적 발현 프로모터 |
| CN106754925A (zh) * | 2016-12-21 | 2017-05-31 | 复旦大学 | 一种脱落酸快速诱导启动子及其应用 |
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