CN104673792A - 豆科植物豆荚相关组织特异性启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种豆科植物豆荚相关组织中的特异性启动子及其应用。该启动子特别适合驱动外源基因在豆科植物豆荚相关组织，例如豆荚或子叶中特异性表达，而在豆科植物的其它组织中表达量极低或不表达。所述启动子的表达特异性和专一性很高。本发明还提供了具有所述启动子的构建物、表达盒和载体等。含本发明启动子的转基因豆科植物可以特异性地改善豆科植物的农艺性状，有效避免外源基因导入对豆科植物其它组织的影响，还能在豆荚相关组织中特异性表达外源基因，从而获得各种相关产物。

Description

豆科植物豆荚相关组织特异性启动子及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域。具体地说，本发明涉及一种豆科植物组织中的特异性启动子及其应用。

背景技术

豆科植物具有重要的经济意义。其中，大豆是植物蛋白和食用油的主要来源，也是世界上产量最多的油料作物。大豆是豆科植物中最富有营养而又易于消化的食物，是蛋白质最丰富最廉价的来源。在今天世界上许多地方是人和动物的主要食物。对于我国而言，豆科植物，尤其是大豆，更是一种重要的经济作物和粮食作物。

常规育种方法在品质改良和新品种选育方面发挥着重要作用，但也存在育种年限长、难以打破性状连锁、多基因重组几率低、远缘杂交困难等种种弊端。植物基因工程技术能定向改良植物的不良性状，使植物获得常规方法难以得到的特定性状，并能大大缩短育种年限，提高经济效益。此种技术在供体总DNA导入前不经过任何修饰和构建，从而避免基因构建元件可能对生态和环境造成的负面影响。转基因育种技术可按人们的预选设计改良作物，创造新种质，丰富种质资源，提高作物的品质、抗性、耐性、增加产量等，可极大的提高育种效率，加快育种进程，对解决粮食和蔬菜安全、生态恶化、资源匮乏及效益低下等问题具有重大的社会、生态和经济意义。

转基因技术在我国主要农作物育种(水稻、小麦、玉米、大豆、高粱、向日葵、油菜)的应用已取得成果。特别是在大豆育种上，采用外源DNA导入技术将优良性状的目的基因导入栽培大豆，获得的后代既保持了原有受体的产量，又培育出集高产、优质、优良性状于一体的新品种和品系。例如，20世纪90年代，雷勃钧等人利用花粉管通道法将外源DNA导入大豆，创造了优质高蛋白品系D89—982(蛋白质占45.32％)和双高品系D90—1217(蛋白质+脂肪占66％)。黑龙江省农业科学院利用花粉管通道法进行遗传转化，即外源DNA直接导入(DIED)技术，将高蛋白野生大豆总DNA直接导入栽培大豆，育成了第一个大豆新品种——黑生101。1996年，徐香玲、李兴华等利用具有质粒的发根农杆菌(大豆花叶病毒外壳蛋白基因)感染大豆品种，得到转化植株，为大豆抗病育种提供了新的途径。徐香玲等(1997)将PKT54B7C5上的B,t,K-8内毒蛋白基因通过农杆菌介导法导入大豆黑农37、黑农39等品种，获得外源基因导入并整合到大豆基因组中的再生大豆植株。2001年，周思军、李希臣等采用农杆菌介导的大豆子叶节转化系统成功地将Bt基因(crylA)导入大豆。1999年，徐香玲等利用农杆菌介导法，将抗真菌的几丁酶基因导入大豆品种——东农37号、吉林28号等14个品种，得到转化植株。

基因通过表达来体现其功能，而启动子是精确启动基因表达的“开关”。借助基因工程的方法，利用组织特异性的启动子能够对植物进行针对性的育种改造。因此，组织特异性启动子对于基因的表达调控研究具有重要意义。但是，出于种种原因，目前找到的组织特异性启动子并不多。例如，有些基因，如非结构基因会发生基因移转，从而很难找到在特定组织中特异性表达的相应启动子。对于启动子区域的普遍特征仅仅知晓启动子位于基因转录起始位点的上游几kb的区域内，具有一定的保守序列特征，GC含量较高等等，技术人员并不能仅仅根据这些普遍特征来精确定位启动子；事实上，即便设计多对PCR引物，也很有可能无法精确定位启动子。此外，由于种种原因，许多基因确切的转录起始位点并未确定，到目前为止，已阐明启动子序列以及它们的调控机制的基因数量非常有限。标准的真核生物有关的启动子数据库Eukaryotic Promoter Database中登录的基因启动子也并不多。

我国在转基因技术应用于农作物育种方面虽然已取得可喜成绩，但与国际水平相比仍有较大的差距。寻找有效的组织特异性基因，并构建高效可用的转化载体是改良大豆品质性状和研究大豆功能基因的先决条件。但是转基因质粒的构建是该技术的瓶颈之一，其主要原因是缺乏有效的转基因载体能定向在豆科植物中进行组成型表达，或进行组织特异型表达；以及缺乏能高效转化的载体。

综上所述，本领域急需找到豆科植物，特别是大豆中的组织特异性启动子，进而准确有效地改变豆科植物的各种性状，改良其品系，更好地调控其生长发育以及产量。

发明内容

本发明的目的在于提供一种豆科植物的组织特异性启动子及其应用。

在第一方面，本发明提供一种启动子元件，所述启动子元件选自下组：

(a)核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的多核苷酸；

(b)核苷酸序列与SEQ ID NO:1所示序列的同源性≥95%(较佳地≥98%)，且具有豆科植物豆荚相关组织中特异启动功能的启动子活性的多核苷酸；

(c)如SEQ ID NO:1所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或增加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-6个)核苷酸，且具有豆科植物豆荚相关组织中特异启动功能的启动子活性的多核苷酸。

在优选的实施方式中，所述的豆科植物豆荚相关组织中特异启动功能表示，所述启动子在豆科植物的豆荚相关组织以外的组织中不具有启动功能。

在优选的实施方式中，所述的豆科植物包括百脉根(Lotus corniculatus)、豌豆(Lathyrus odoratus)、大豆(Glycine max)或苜蓿(Medicago sativa)。

在优选的实施方式中，所述的豆科植物豆荚相关组织包括豆荚或子叶。

在另一优选的实施方式中，所述启动子元件的序列如SEQ ID NO:1所示。

在第二方面，本发明提供一种构建物，所述构建物含有外源基因以及与外源基因可操作连接的本发明第一方面所述的启动子元件。

在优选的实施方式中，所述的外源基因在天然状态下并不存在。

在另一优选的实施方式中，所述外源基因包括：抗性基因、筛选标记基因、抗原蛋白基因、RNAi基因、microRNA基因、生物制剂基因、或植物品质相关基因。

在另一优选的实施方式中，所述的抗性基因选自下组：抗除草剂基因、抗病毒基因、耐寒基因、耐高温基因、抗旱基因、抗涝基因、或抗虫基因。

在另一优选的实施方式中，所述的筛选标记基因选自下组：gus(β-葡萄糖苷酸酶)基因、hyg(潮霉素)基因、neo(新霉素)基因、或gfp(绿色荧光蛋白)基因。

在另一优选的实施方式中，所述的抗原蛋白基因选自下组：细菌类抗原蛋白(如霍乱毒素B，破伤风毒素等)、病毒类抗原蛋白(如犬细小病毒)、原生动物类抗原蛋白(如阿米巴病原LecA)、或自身抗原蛋白(如I型糖尿病的CTB–pins抗原蛋白)。

在另一优选的实施方式中，所述的生物制剂基因选自下组：α2b干扰素基因、或胰岛素样生长因子基因。

在另一优选的实施方式中，所述的植物品质相关基因选自下组：氨基酸改良相关基因、脂肪改良相关基因、淀粉改良相关基因、或雄性不育相关基因。

在第三方面，本发明提供一种表达盒，所述表达盒从5’至3’依次具有下述元件：权利要求1所述的启动子元件、基因ORF序列和终止子。

在优选的实施方式中，所述的表达盒还包括选自下组的一种或多种元件：poly(A)元件、增强子、转运元件、或基因靶向元件。

在第四方面，本发明提供一种载体，所述载体含有本发明第一方面所述的启动子元件、或本发明第三方面所述的表达盒。

在优选的实施方式中，所述载体选自：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、或植物细胞病毒载体、穿梭载体。

在第五方面，本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明第四方面所述的载体、或其染色体上整合有外源的本发明第一方面所述的启动子元件、或其染色体上整合有本发明第三方面所述的表达盒。

在优选的实施方式中，所述宿主细胞的染色体具有一个或多个(如1-50个，较佳地2-6个)拷贝的本发明第一方面所述的启动子元件、或本发明第三方面所述的表达盒。

在另一优选的实施方式中，所述的宿主细胞选自下组：原核细胞(如大肠杆菌、链霉菌属、或农杆菌)、低等真核细胞(如酵母细胞)、或高等真核细胞(如植物细胞)。

在另一优选的实施方式中，所述的宿主细胞为植物细胞，更佳地为农作物、蔬菜、或花卉的植物细胞，更佳地为豆科植物细胞，最佳地为百脉根(Lotuscorniculatus)、豌豆(Lathyrus odoratus)、大豆(Glycine max)或苜蓿(Medicago sativa)植物细胞。

在第六方面，本发明提供本发明第一方面所述的启动子元件，本发明第二方面所述的构建物，本发明第三方面所述的表达盒特异性调控外源基因在豆科植物豆荚相关组织中的表达的用途。

在第七方面，本发明提供一种在豆科植物豆荚相关组织中特异性表达外源基因的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)提供一构建物，所述构建物含有外源基因以及与该外源基因可操作连接的本发明第一方面所述的启动子元件；

(b)将步骤(a)得到的构建物导入豆科植物细胞，获得转化的豆科植物细胞；

(c)将步骤(b)中转化的豆科植物细胞再生成豆科植株，从而使所述外源基因在豆科植物豆荚相关组织中特异性表达。

在优选的实施方式中，所述外源基因在豆科植物除豆荚相关组织以外的其它组织中不表达或基本不表达。

在优选的实施方式中，所述的豆科植物豆荚相关组织包括豆荚或子叶。

在第八方面，本发明提供一种制备转基因豆科植物的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)提供下述豆科植物细胞，所述豆科植物细胞含有本发明第四方面所述载体、或其染色体整合有本发明第一方面所述启动子、或其染色体整合有本发明第三方面所述表达盒；

(b)将(a)的豆科植物细胞再生为豆科植株，从而获得转基因豆科植物。

在优选的实施方式中，所述的豆科植物豆荚相关组织包括豆荚或子叶。

在第九方面，本发明提供一种豆科植物愈伤组织或豆科植物体细胞，所述豆科植物愈伤组织或豆科植物体细胞包含下述豆科植物细胞或由下述豆科植物细胞构成：所述豆科植物细胞含有本发明第四方面所述的载体、或其染色体整合有本发明第一方面所述的启动子元件、或其染色体整合有本发明第三方面所述的表达盒。

在优选的实施方式中，所述的豆科植物豆荚相关组织包括豆荚或子叶。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1是载体p1301.P0G的结构示意图。

图2是转基因后的愈伤组织照片。

图3是正常生长的百脉根。

图4显示了对叶片样本DNA进行酶切后，对酶切产物作PCR的结果。

图5显示百脉根成熟后，同株的豆荚和叶片的GUS染色结果。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，从大量的大豆基因中出乎意料地发现一个在大豆中组织特异性启动基因表达的启动子，从而为构建转基因表达的组织特异性载体打下基础。在此基础上完成了本发明。

本发明启动子

发明人在大豆基因组中克隆了启动子序列(SEQ ID NO:1)，将其构建到启动GUS基因的表达载体中，并转化豆科植物百脉根。通过GUS染色，成功获得豆科植物豆荚相关组织的特异性启动子-P1(SEQ ID NO:1-CCAAACAAGAAAACTAAAATACAAAAAACTAAATTACTTCATCCAAACAAAATATTTACAAAATGAAAGGAATTTAAATCAAGACAATTAAAATGTGATGTATTTGAATTTCCTGAAAATTTTCAAATCCTTCATCCAAACACAATGTAAAGGAAGAATTTGGTTTCGTTGCGCCATGAATCAATCAAAAAGCTTTTTTTTTTGTTTTTTTAATTCATTCTATTTTATTTTGGCTAGAGGGAGGTTGTGAGTCACCTGAACTACGGATTTCTCGATTGGTTGATTCTGGAAATAACCTCTTGAGAAAAAAAAATCATCGGGTTCCAAAGAAAAAAATATGTTATAAGAATTTAATTAGGATGTAGTGAGAGTGTTAAGAATTTTATATTATTATTTAATAATATATATATAATAATAAAATTGTTATTTTTCATGATAATTATTTTAAAATCGCATTTGTAGTAATATCCAATTAATTAATTTTTTATATTAAAAATAGACTATTTGATGTATAATCATAATTTAAGAGCATGGATGATGCAACGAAGTTGAAGTAAGGATAAAATATATTTTTTAGAATAGAATATATTCCCAAAAATTAAAATAATTTTATATTTATAAAGTTTCATTATTTGAAATTCAAAAATAATTTCAATCAATAAAAAATCTTAGCAACGTACTATTTTGAACATATTTTATCATCAACTAAAATTTATTAAAAATCACAATTTTTTTAGAATTTTAATTTCTTTTCAAAATTTGTAGTTTTCACTAAAATTTAATAAAAAAAAATAAAATAAATTAAACAAAATATATTAAAAAGTATGTTATCGACATTTTAATAAAATGTGTTACTAAAACAGTTATTCTATTGCCTAAAAAATTATTCTATTCAGTCAATTAAGATATTTAATGACTCTCCATAAAAAAAAGATATTCATTTAATGAAATATTTAATTTTTTTAATGGCATTGAATGAGATATTTAATGACTCTTAATTTACGAATAAAACAATTTAATGCTTATTACGTTACATGACTCTAAATTTACATTCATTTAATTGAGATATTCATTTAAAAGAAAAGAAAGGAAAGGAAATAGTTAACTTAATAATTTTATAAAATTAATCTTAATAAATAAATAAAAGACAATCATATTATTATAATATTAAATTTTAAAATTAAAATGATATTTACTAAAGATAACAATGAAAAAAATAATTAATGTTATATTAAAAAGTTAAATGTAATATTTATATTAAGATTTTTTTTATTACGACATTTATTTTGGAATGAAGAGAATATGTTTTGTTTTTTTTTCGTTATTGACCTGCATGTTTTTTTTCTCTCTTATAACCTGAATTCAGGTCAAATGCAAATTGAATTTAATACTAGAAGCGGTGCCTTTTGTTTGCTAGCTCATGCATTAATATGCTTTATTAATTGTTCCAATTAGAAACACAACACCTGGATTCCACTAACTGCTTGCATAAACTTCTGTTGCTATATATAGCTAGCACATTTCTCAACCTTCCATTCATCCCCATCAAAACACAAGCAAATCCTAAAAAGTTGATTGAGATATATAGAAACTAGCTTCAATTTCACAAAATGAAGAAAGTGTTTGTCACATTT)。

本文所用的术语“本发明启动子”、“豆科植物豆荚相关组织特异性启动子”、“启动子P1”或“P1”可互换使用，均表示源于豆科植物的启动子元件，其序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明的启动子能够高效、专一地在豆科植物豆荚相关组织中特异性启动基因的表达，而在其它组织中表达量极低或不表达。因此，本发明的启动子可以用于特异性改善豆科植物的性状，避免外源基因对豆科植物的其它组织产生影响。

本文所用的术语“启动子”或“启动子区(域)”是指一种准确有效起始基因转录功能的核酸序列，引导基因核酸序列转录为mRNA，其通常存在于目的基因编码序列的上游(5’端)，一般地，启动子或启动子区域提供RNA聚合酶和正确起始转录所必需的其它因子的识别位点。

在本文中，所述启动子或启动子区(域)包括启动子的变体，启动子变体可以通过插入或删除调控区域，进行随机或定点突变等来获得。

鉴于本发明的教导和现有技术，本领域普通技术人员应理解，尽管本发明的实施例中提供的启动子P1的序列如SEQ ID NO:1所示，但本发明还应包括与本发明的启动子序列(SEQ ID NO:1)具有50%或以上(优选60%以上，70%以上，80%以上，更优选90%以上，更优选95%以上，最优选98%以上，如99%)同源性的核酸，只要所述核酸也具有在豆科植物豆荚相关组织中特异性表达的功能。“同源性”是指按照位置相同的百分比，两条或多条核酸之间的相似水平(即序列相似性或同一性)。

本领域普通技术人员还应理解，在获得具体的启动子之后，在该启动子的5’端和/或3’端截短或增加若干核苷酸而仍能得到与原启动子功能相同或相似的启动子变体是容易做到的。例如，在具体的实施方式中，本发明包括在SEQ ID NO:1所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或增加1-60个，较佳地1-30，更佳地1-6个核苷酸，且具有豆科植物豆荚相关组织中特异启动功能的启动子活性的多核苷酸。

豆科植物

豆科(Leguminosae sp.)植物广泛分布于全世界。我国有172属，1485种，13亚种，153变种，16变型；各省区均有分布。该科植物具有重要的经济意义，它是人类食品中淀粉、蛋白质、油和蔬菜的重要来源之一。农业上的豆类作物有大豆、花生、蚕豆、豌豆、赤豆、绿豆、豇豆、四季豆和扁豆等。

在优选的实施方式中，本文所述的豆科植物包括百脉根(Lotus corniculatus)、豌豆(Lathyrus odoratus)、大豆(Glycine max)或苜蓿(Medicago sativa)。

本文所用的术语“特异性表达”是指目的基因在植物中特定的时间和/或特定的组织的表达，而在其它组织中表达量极低或不表达。具体地说，本文所述的“豆科植物豆荚相关组织中特异性的表达”是指在本发明的启动子调控下，目的基因高度特异性和专一性地在豆科植物豆荚相关组织中表达。在优选的实施方式中，所述豆科植物豆荚相关组织包括豆荚或子叶。

本文所用的“外源的”或“异源的”是指不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列之间的关系。例如，如果启动子与目的基因序列的组合通常不是天然存在的，则启动子对于该目的基因来说是外源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说也是“外源的”。

本文所用的“顺式调控元件”是指对基因的转录起始和转录效率起调节作用的保守性碱基序列。

本发明的启动子可以可操作地与外源基因连接，该外源基因相对于启动子可以是外源(异源)的。本文所述的外源基因(或目的基因)没有特别限制，可以是RNAi基因或编码具有特定功能蛋白的基因，例如某些在农业或植物或豆科植物改良上有重要特性或功能的蛋白。

所述外源基因的代表性例子包括(但不限于)：抗性基因、筛选标记基因、抗原蛋白基因及生物制剂基因、或植物品质相关基因。

所述的抗性基因选自下组：抗除草剂基因、抗病毒基因、耐寒基因、耐高温基因、抗旱基因、抗涝基因、或抗虫基因。所述的筛选标记基因选自下组：gus(β-葡萄糖苷酸酶)基因、hyg(潮霉素)基因、neo(新霉素)基因、或gfp(绿色荧光蛋白)基因。所述的抗原蛋白基因及生物制剂基因选自下组：细菌类抗原蛋白(如霍乱毒素B，破伤风毒素等)、病毒类抗原蛋白(如犬细小病毒)、原生动物类抗原蛋白(阿米巴病原LecA)、自身抗原蛋白(如I型糖尿病的CTB–pins)、或生物制剂(如α2b干扰素，胰岛素样生长因子等)。所述的植物品质相关基因选自下组：氨基酸改良相关基因、脂肪改良相关基因、淀粉改良相关基因或雄性不育相关基因。

本发明还提供了一种基因表达盒，所述表达盒从5’-3’依次具有下列元件：本发明的启动子、基因ORF序列和终止子。优选地，所述启动子序列如SEQ IDNO.:1所示或与SEQ ID NO.:1所示序列的同源性≥95%，较佳地≥98%，更佳地≥99%。

本发明还提供了一种重组载体，其包含本发明的启动子和/或基因表达盒。在优选的实施方式中，所述重组载体的启动子下游包含多克隆位点或至少一个酶切位点。需要表达目的基因时，将目的基因连接入适合的多克隆位点或酶切位点，从而可操作地连接目的基因与启动子。在另一优选的实施方式中，所述重组载体在5’到3’方向上包括：启动子，目的基因和终止子。如果需要，所述重组载体还可以包括以下元件：3’多聚核苷酸化信号；非翻译核酸序列；转运和靶向核酸序列；抗性选择标记(二氢叶酸还原酶、新霉素抗性、潮霉素抗性以及绿色荧光蛋白等)；增强子；或操作子。

用于制备重组载体的方法是本领域普通技术人员所熟知的。表达载体可以是细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要其能够在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都是可以被采用的。

本领域普通技术人员可以采用熟知的方法构建含有本发明启动子和/或目的基因序列的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。

本发明的启动子、表达盒或载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使宿主表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌：或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物(如大肠杆菌)时，可以用CaCl₂法处理，也可用电穿孔法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法(如显微注射、电穿孔、脂质体包装等)。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、幼胚转化法、花芽浸泡法等。其中，农杆菌Ti/Ri质粒转化法是常见的转基因技术。农杆菌能感染植物，并能将其质粒上的一段DNA插人植物基因组中，引起植物遗传特性的变化。利用此特性，把外源基因整合到质粒上，以质粒为载体导入受体细胞。此法主要采用Ti/Ri质粒衍生载体进行原生质体共培养、植物组织共培养和原生质体融合来实现基因转移。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得转基因的植物。

在优选的实施方式中，制备转基因植物的方法是：将携带可操作连接的启动子和目的基因的载体转入农杆菌，农杆菌再将含启动子和目的基因的载体片段整合到植物的染色体上。在本发明中，所述的重组载体是P1301.p0G质粒，将本发明的启动子构建到该载体中，转化植株，启动子将激活GUS基囚的表达，所述启动受到启动子区顺式作用元件的调控，可以有效模拟基因在体内被激活转录的状况。

β-葡萄糖苷酸酶(GUS)能催化裂解一系列的β-葡萄糖苷，产生具有发色团或荧光的物质，可用分光光度计、荧光计或组织化学等方法对GUS活性进行定量和空间定位分析。在本领域中，GUS基因已被广泛地用作转基因植物、细菌和真菌的报告基因，特别是其可被用于研究外源基因表达的具体细胞和组织部位。

在本发明的具体实施例中，在本发明启动子的启动下，GUS基因可以特异地在豆科植物豆荚相关组织中表达，而在其它组织中不表达。因此该启动子可以用于在豆荚相关组织中特异性改善豆科植物的性状，而不使得外源基因对其它组织造成影响。

本发明的启动子、构建物、或表达盒等可用于在豆科植物豆荚相关组织中特异表达外源基因，从而改善豆科植物的农艺性状(如豆科植物的产量、品质)，或增强豆科植物对不利环境(如冷冻、高温、干旱、病毒、病菌、虫害或人工除草剂)的抵抗能力。本发明也可用于在豆科植物豆荚相关组织中特异性地生产蛋白产物(如抗原蛋白及生物制剂)，或用于研究外源基因在豆荚相关组织中的特定功能。

本发明的优点

1.包含本发明启动子的表达载体在豆科植物的豆荚、子叶等组织表达下游报告基因、或功能基因，而在其他组织中不表达或低表达，从而能有效控制基因的表达位置；

2.本发明的启动子是豆科植物自有的序列，适用于包括大豆、百脉根在内的多种豆科植物，避免了外源序列可能引起的植物内基因表达水平的紊乱；基于本发明启动子开发的转基因品系不存在由启动子序列导致的生物安全性的问题；

3.本发明的表达载体不受转基因技术种类的影响，适用于包括农杆菌侵染愈伤组织，茎尖法在内的多种转基因技术；

4.利用本发明启动子构建的转基因表达载体以及对大豆进行基因改造(抗逆、抗虫害、提高固氮效率)的工具，能够有效挖掘未知功能的基因，筛选有效的组织特异启动子载体，用于构建转基因载体；

5.在植物基因工程中利用本发明启动子能够使得外源目的基因在特定组织中高效表达，以便实现对外源基因表达进行定时、定点、定量的三维精确调控。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例

实施例1.大豆中豆荚相关组织特异性启动子的克隆

以常规方法抽提的大豆Williams82基因组DNA为模板，利用以下引物对(SEQ ID NO.:2和3)和KOD高保真酶，通过常规PCR方法扩增出启动子P1，并纯化：

正向引物:CATGCCATGGAAATGTGACAAACACTTTCTTCATTT(SEQID NO:2)；

反向引物:GGGGTACCAAACAAGAAAACTAAAATACAAAAAACTAAAT(SEQ ID NO:3)。

PCR扩增条件为：

94℃,2min；

98℃,10sec；

60℃,30sec；

68℃,1min；

68℃,7min；

35个循环。

琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物。

实施例2.构建GUS表达载体

将实施例1获得的启动子序列与载体p1301.P0G(刘伟等，蒺藜苜蓿小G蛋白RO在共生过程中的作用：2.MtROP5调节根毛生长发育的功能分析，中国农业科学，2010,43(8))相连接，转化到大肠杆菌DH5α菌株(上海杰美基因医药科技有限公司，上海)中加以保存。经测序验证后，转化根瘤农杆菌EHA105(北京拜尔迪生物技术公司，北京)。具体步骤如下所示：

1.酶切PCR产物和p1301.P0G载体

用内切酶NcoI/KpnI对PCR产物和p1301.P0G载体作双酶切，其中，PCR产物的酶切反应条件如下所示：

PCR产物：1ug

10*fast digest buffer：5ul

NcoI:1ul

KpnI:1ul

总体积：50ul

37℃,5min。

载体的酶切反应条件如下所示：

P1301.p0G质粒：1ug

10*fast digest buffer：5ul

NcoI：1ul

KpnI：1ul

总体积：50ul

37℃,5min。

对PCR产物和载体的酶切产物作琼脂糖凝胶电泳，割胶回收。回收的PCR酶切产物及载体酶切产物经琼脂糖电泳作定量分析。用Alpha Imager凝胶成像系统计算PCR酶切产物和载体酶切产物之间的摩尔比关系。

2.载体连接

用T4DNA连接酶连接载体和PCR产物获得连接产物，反应条件如下所示：

10*T4DNA连接酶缓冲液：1ul

p1301.P0G：50ng

PCR产物：20ng

T4DNA连接酶：1ul

总体积：10ul

16℃,24h

3.连接产物转化感受态细胞DH5α

取100ul冷冻感受态细胞(对数生长期，OD：0.4-0.5)，加入10ul连接产物，样品轻轻混匀，冰上放置30分钟。42℃下热激90秒，迅速放于冰上冷却2分钟。向EP管中加入400ul LB培养基，37℃振荡培养1小时。取培养液100ul涂布于含卡那霉素的LB平板，37℃恒温培养过夜(12-16小时)。

4.克隆验证

挑取10个克隆并编号。用菌落PCR验证克隆是否为阳性。PCR扩增条件如上所述。PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，有目的的条带编号的克隆可以初步确定为阳性克隆。

6.载体测序验证

挑取菌落PCR阳性克隆，液体LB+Kan于37℃培养16小时，提取质粒。送生工生物工程(上海)股份有限公司用通用引物测序。序列确认无误，载体构建成功。

7.转化根瘤农杆菌EHA105

取100ul冷冻感受态细胞，加入10ul连接产物，样品轻轻混匀，冰上放置30分钟。42℃下热激90秒，迅速放于冰上冷却2分钟。向EP管中加入400ul LB培养基，37℃振荡培养1小时。取培养液100ul涂布于含卡那霉素的LB平板，37℃恒温培养过夜(12-16小时)。

实施例3.转基因植株的获得

利用实施例2获得的根瘤农杆菌对豆科植物进行全植株转化。选择豆科植物百脉根用于验证组织特异表达载体的功能。将含有组织特异表达启动子载体的根瘤农杆菌EHA105转染植物愈伤组织，于温室内培养，从而获得转基因植株。图2和图3分别显示了转基因后的愈伤组织照片与正常生长的百脉根。

实施例4.GUS组织化学染色

转基因百脉根成熟后，提取叶片样本DNA，根据设计好的酶切位点：Nco1和Kpn1，进行酶切，回收酶切产物进行PCR。结果图4所示。左边第二条带为参考条带，第三到第五条带为3个叶子的样本，GUS基因片段约为600bp左右，结果显示GUS基因存在。

再取结荚后的植株的豆荚及叶片进行GUS染色，酒精脱色后观察叶片及豆荚颜色，结果如图5所示。由图5所示可以看出，GUS基因仅在豆荚组织表达，表型明显，而叶片组织虽然存在但是并不表达。从而说明本发明的启动子能在豆科植物的豆荚相关组织中特异性地正确启动GUS基因表达。

综上所述，本发明的转基因载体能成功感染豆科植物植株，构建转基因品系，该转基因品系并不明显改变植株形态。转基因载体可以成功插入基因组，在叶片和豆荚组织DNA样本中均能检测到GUS基因的存在，但是仅在豆荚组织中有GUS基因的表达，证明所构建的组织特异表达载体是成功的。

由此，本发明得到了在豆科植物的豆荚相关组织中特异性表达的启动子。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (9)

1.一种启动子元件，所述启动子元件选自下组：

(a)核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的多核苷酸；

(b)核苷酸序列与SEQ ID NO:1所示序列的同源性≥95%(较佳地≥98%)，且具有豆科植物豆荚相关组织中特异启动功能的启动子活性的多核苷酸；

(c)如SEQ ID NO:1所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或增加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-6个)核苷酸，且具有豆科植物豆荚相关组织中特异启动功能的启动子活性的多核苷酸。

2.一种构建物，所述构建物含有外源基因以及与外源基因可操作连接的权利要求1所述的启动子元件。

3.一种表达盒，所述表达盒从5’至3’依次具有下述元件：权利要求1所述的启动子元件、基因ORF序列和终止子。

4.一种载体，所述载体含有权利要求1所述的启动子元件、或权利要求3所述的表达盒。

5.一种宿主细胞，所述宿主细胞含有权利要求4所述的载体、或其染色体上整合有外源的权利要求1所述的启动子元件、或其染色体上整合有权利要求3所述的表达盒。

6.权利要求1所述的启动子元件，权利要求2所述的构建物，权利要求3所述的表达盒的用途，用于特异性调控外源基因在豆科植物豆荚相关组织中的表达。

7.一种在豆科植物豆荚相关组织中特异性表达外源基因的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)提供一构建物，所述构建物含有外源基因以及与该外源基因可操作连接的权利要求1所述的启动子元件；

(b)将步骤(a)得到的构建物导入豆科植物细胞，获得转化的豆科植物细胞；

(c)将步骤(b)中转化的豆科植物细胞再生成豆科植株，从而使所述外源基因在豆科植物豆荚相关组织中特异性表达。

8.一种制备转基因豆科植物的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)提供下述豆科植物细胞，所述豆科植物细胞含有权利要求4所述载体、或其染色体整合有权利要求1所述启动子、或其染色体整合有权利要求3所述表达盒；

(b)将(a)的豆科植物细胞再生为豆科植株，从而获得转基因豆科植物。

9.一种豆科植物愈伤组织或豆科植物体细胞，所述豆科植物愈伤组织或豆科植物体细胞包含下述豆科植物细胞或由下述豆科植物细胞构成：所述豆科植物细胞含有权利要求4所述的载体、或其染色体整合有权利要求1所述的启动子元件、或其染色体整合有权利要求3所述的表达盒。