CN101979548A - 叶片特异性表达人工microRNA提高水稻对白叶枯病抗性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物基因工程技术领域。具体涉及一条21nt水稻抗病相关DNA分子的设计、验证及应用。本发明人工设计了一条21nt的人工microRNA序列，并利用天然microRNAosa-mi528的前体作为骨架，构建了人工microRNA前体。在转基因水稻中，利用水稻或拟南芥来源的叶片特异性启动子特异性地表达这条人工microRNA的前体，可以增强转基因水稻对白叶枯病的抗性，同时不影响转基因水稻的育性等重要农艺性状。

Description

叶片特异性表达人工microRNA提高水稻对白叶枯病抗性的方法

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域。具体涉及一条21nt水稻抗病相关DNA分子的设计、验证及应用。本发明人工设计了一条21nt的人工microRNA序列，并利用天然microRNA osa-MIR528前体作为骨架，构建了人工microRNA前体。在转基因水稻中，叶片特异性地表达这条人工microRNA的前体，可以增强转基因水稻对白叶枯病的抗性，同时不影响转基因水稻的育性等重要农艺性状。

背景技术

抗病、虫育种是农业生产上主要育种目标之一。在抗病、虫育种中，抗性基因资源是最重要的。因此，育种家和生物学家们在大量的栽培品种或野生品种中进行大规模的鉴定以获得抗性基因资源。水稻白叶枯病由白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.Oryzae，Xoo)引起，是世界上对水稻危害最大的细菌性病害。幸运的是，由于生产上抗白叶枯病品种的应用使得这种水稻细菌性病害在生产生被有效控制。

目前在水稻中已鉴定出30多个抗白叶枯病菌主效基因，其中有5个是隐性的。xa13基因是近年来从水稻籼稻品种IRBB13克隆的一种特殊的水稻隐性抗白叶枯病基因(Chu et al.2006)。xa13与其显性等位基因Xa13在基因的编码区没有差异，但是xa13启动子部分的序列变异导致了其在水稻叶片中的表达显著下降，从而使得水稻植株获得了对白叶枯病菌菌株PXO99特异性的抗性。组成型抑制xa13等位显性基因Xa13的表达可以提高水稻对菌株PXO99抗性，但是同时会导致花粉育性显著下降，表明该基因不仅控制水稻的抗病性还与水稻的育性有关(Bart et al.2006；Chu et al.2006)。

在育种上特别是杂交育种，由于隐性抗性基因的使用并不方便(需要同时改良杂交品种的两个亲本)，因此育种家更重视显性抗白叶枯基因如Xa21或Xa23等的应用。由于致病菌的进化，一种抗病基因在生产上使用几年或者十几年后会逐步丧失其抗性。隐性抗病基因xa13的功能与抗病和育性有关，和以往发现的抗病基因有较大差异，其抗病机理与其他抗病基因应有较大的差异，是对抗病基因资源的重要补充。因此人类在生产上与病原菌进行长期斗争的过程中，充分利用这些隐性抗性基因具有重要意义。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是近年来发现的一种RNA介导的基因沉默现象。利用RNAi技术特异性地沉默植物内源相关代谢途径上的关键基因来改良作物品质，已经取得了很多成功的例子。比如，提高小麦籽粒中直链淀粉含量(Regina et al.2006)；提高玉米赖氨酸和色氨酸含量(Huang et al.2006)；提高棉籽油中硬脂油和油酸含量(Liu et al.2002)，降低棉籽中棉酚的含量(Ganesan et al.)；提高油菜油酸含量，降低芥酸含量(Peng et al.2010)；提高番茄中类胡萝卜素和类黄酮含量(Davulurj et al.2005)，延长番茄成熟期(Xiong et al.2005)；降低木薯块茎氰苷含量(Jorgensen et al.2005)等等。由于RNAi导致基因沉默的分子机理是通过RNA介导的反式作用方式来实现的，因而利用RNAi机理改良的作物性状均为显性遗传。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，利用水稻和拟南芥来源的叶片特异性启动子，精确地抑制Xa13基因在叶片中的表达而不影响其在花药中发挥功能，既能提高转基因水稻对白叶枯病的抗性，又不影响其的育性。

本发明是这样实现的：

参考Chu等人(2006)发表的文献获得Xa13基因的基因序列号编号并在网上查到其序列。利用amiRNA设计软件(http://wmd3.weigelworld.org/cgi-bin/webapp.cgi？page＝Designer；project＝stdwmd)设计21nt的amiRNA序列。通过人工分析，挑选其中2条amiRNA序列命名为amiA和amiB，并设计引物，利用PCR的方法构建amiRNA的植物表达载体。由于Xa13的基因功能与水稻花粉发育相关，本发明使用叶片特异性表达启动子水稻的rbcS启动子(Osrbcsp)以及拟南芥rbcS1A启动子(Atrbcsp)驱动amiRNA前体的表达。通过农杆菌介导的遗传转化将amiRNA表达载体转化到水稻优良恢复系明恢63中。人工接种检测表明，转含amiB表达载体的水稻植株高抗白叶枯病菌菌株POX99，而转amiA表达载体的水稻植株抗性增强不明显。对这些转基因植株的育性进行考察发现，转基因水稻植株花粉发育正常，育性与野生型明恢63无显著差异。

本发明的优点在于：

(1)利用基因沉默技术将隐性抗病性状转化为显性抗病性状；

(2)利用组织特异性启动子，将目标基因的沉默限定在特定组织内，减少基因沉默导致的其他不良后果如育性下降。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是人工microRNA：amiA的前体DNA序列，长度为257nt。

序列表SEQ ID NO：2是人工microRNA amiA的DNA序列，长度为21nt。

序列表SEQ ID NO：3是人工microRNA：amiB的前体DNA序列，长度为257nt。

序列表SEQ ID NO：4是人工microRNA amiB的DNA序列，长度为21nt。

序列表SEQ ID NO：5是水稻来源的叶片特异性启动子Osrbcsp的序列，长度为1631bp。

序列表SEQ ID NO：6是拟南芥来源的叶片特异性启动子Atrbcsp的序列，长度为1703bp。

序列表SEQ ID NO：7-37是本发明的相关引物序列。

图1：本发明所涉及的基础质粒载体pC1300示意图。

图2：本发明所涉及的中间载体pC1300-NOS示意图。

图3：本发明所涉及的中间载体pC1300-amiA-NOS示意图。

图4：本发明所涉及的中间载体pC1300-amiB-NOS示意图。

图5：4个最终表达载体的示意图。a)载体Osrbcsp+amiA；b)载体Atrbcsp+amiA；c)载体Osrbcsp+amiB；d)载体Atrbcsp+amiB。

图6：转基因植株的叶片及花药中amiRNA的RT-PCR检测，U6被作为内源对照。检测结果表明野生型明恢63的叶片及花药中均无amiRNA表达。转基因植株的叶片中amiA和amiB均可高效表达，而花药中几乎没有表达。a)和g)野生型明恢63叶片；d)和g)野生型明恢63花药；b)Osrbcsp+amiA叶片；c)Atrbcsp+amiA叶片；e)Osrbcsp+amiA花药；f)Atrbcsp+amiA花药；h)Osrbcsp+amiB叶片；i)Atrbcsp+amiB叶片；k)Osrbcsp+amiB花药；1)Atrbcsp+amiB花药。

图7：部分抗病转基因株系叶片中Xa13基因的相对表达量。这些转基因家系的叶片中Xa13的表达量下降了57％-95％，证明了amiRNA的表达的确导致了Xa13表达量的下降。

图8：转基因水稻接种PXO99菌株14天后的表现。a)野生型明恢63；b)Osrbcsp+amiB；c)Atrbcsp+amiB；d)Osrbcsp+amiA；e)Atrbcsp+amiA

图9：转基因水稻的花粉的碘化钾染色观察。转基因水稻的花粉碘化钾染色率和野生型的无明显差异。a)野生型明恢63；b)Osrbcsp+amiA；c)Atrbcsp+amiA；d)Osrbcsp+amiB；e)Atrbcsp+amiB

具体实施方式

实施例1 amiRNA序列的设计以及amiRNA前体的构建

根据Chu等人(2006)发表的文献获得Xa13基因在Genebank中的序列号“DQ421395”，根据该序列号在NCBI网站(www.ncbi.nlm.nih.gov)的Genebank中获得DQ421395的序列。根据DQ421395的序列在TIGR Rice网站(http://rice.plantbiology.msu.edu/LocusNameSearch.shtml)进行blastn获得其在TIGR Rice中的locus identifier：Os08g42350.1。在Web MicroRNA Designer网页上(http://wmd3.weigelworld.org/cgi-bin/webapp.cgi？page＝Designer；project＝stdwmd)输入Os08g42350.1，软件返回17条Xa13的amiRNA序列，人工筛选出其中的2条分别命名为amiA(序列为TAGACTACTAGTAGATCCGCT)和amiB(序列为TGTAGCGAGAATCTGTCGCCG)进行下一步的研究。

参考Warthmann等人(2008)发表的方法，以质粒pNW55为模板(含有水稻天然miRNA Osa-miR528的前体序列，由德国Max Planck发育生物所Prof.Detlef Weigel惠赠)，利用PCR的方法分别构建含有amiA和amiB的amiRNA前体，该amiRNA前体通过TA克隆的方法构建到T-easy vector上(购自美国Promega公司)。

PCR所用的引物由Web MicroRNA Designer网页(http://wmd3.weigelworld.org/cgi-bin/webapp.cgi？page＝Oligo；project＝stdwmd)设计，引物序列见表1。

amiRNA前体的构建为两轮PCR，下面是amiA前体的构建过程，amiB的构建过程完全一样，仅所用引物不同。

第一轮PCR有3个独立的PCR反应，使用如下所示的引物对：

PCR1：G-4368+Xa13MIRa-II PCR2：Xa13MIRa-I+Xa13MIRa-IV；PCR3：Xa13MIRa-III+G-4369

反应体系为：10xPCR buffer 5μl，2mM dNTPs 5μl，10μM的引物各2μl，pNW55质粒10ng，Pfu酶(购自美国Promega公司)0.5μl，加灭菌双蒸水至50μl。

反应程序为：95℃2min；95℃30s，55℃30s，72℃30s重复34个循环；72℃7min

反应完成后，1％琼脂糖凝胶电泳并回收PCR产物。

第二轮PCR：

反应体系：10xPCR buffer 5μl，2mM dNTPs 5μl，10μM的引物G-4368和G-4369各2μl，PCR1、PCR2、PCR3的回收产物各1μl，Ex-Taq酶(购自宝生物工程大连有限公司)0.5μl，加灭菌双蒸水至50μl

反应程序：94℃2min；94℃30s，55℃30s，72℃30s重复32个循环；72℃7min

将PCR产物于1％琼脂糖凝胶电泳检测并TA克隆于T-easy vector(购自美国Promega公司)。

将构建完成的TA克隆进行测序分析，确认amiA和amiB的前体被正确构建。本发明所涉及到的相关引物的DNA序列如表1所示。

表1本发明所涉及到的引物

实施例2叶片特异性表达启动子的获得

根据申请人所在的华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室黄海群硕士学位论文，获得水稻rbcS启动子Osrbcsp的引物OsrbcS-F和OsrbcS-R，以及拟南芥rbcS1A启动子Atrbcsp的引物序列AtrbcS-F和AtrbcS-R(见表1)。利用这两对引物分别扩增出水稻(基因型日本晴)和拟南芥(基因型Col)中的rbcs基因的启动子Osrbcsp和Atrbcsp。PCR反应体系为：10xPCR buffer 5μl，2mM dNTPs 5μl，10μM引物各2μl，大样DNA 20ng，LA Taq(购自宝生物工程大连有限公司)0.5μl，加入灭菌双蒸水至50μl。反应条件：94℃2min；94℃45s，57℃2min，72℃45s重复32个循环；72℃7min。取10μl PCR产物跑1％琼脂糖凝胶电泳检测大小及其特异性。对PCR产物TA克隆到T-easy vector上(购自美国Promega公司)并测序验证。

实施例3植物表达载体的构建

首先用限制性内切酶EcoR I和Sac I消化质粒PUC-Bt(该质粒由本实验室人工合成，含有0.3kb的胭脂碱合成酶基因NOS终止子)，获得0.3kb的NOS终止子，将回收的NOS终止子构建于以同样以EcoR I和Sac I双酶切的pCAMBIA1300载体上(图1，该质粒由澳大利亚CAMBIA实验室惠赠)，形成中间载体pC1300-Nos(图2)。

利用Kpn I和BamH I双酶切含有的amiA和amiB前体序列的T-easy vector，构建于同样以Kpn I和BamHI双酶的pC1300-Nos的中间载体上获得载体pC1300-amiA-Nos(图3)和pC1300-amiB-Nos(图4)。

将克隆于T-vector上的启动子Osrbcsp用Pst I和Hind III切下，构建于用同样的酶双酶切的中间载体pC1300-amiA-Nos和pC1300-amiB-Nos上，形成终载体Osrbcsp+amiA和Osrbcsp+amiB(图5a和c)；将克隆于T-easy vector上的启动子Atrbcsp用Pst I和Sal I切下，构建于同样的酶双酶切的中间载体pC1300-amiA-Nos和pC1300-amiB-Nos上形成终载体Atrbcsp+amiA和Atrbcsp+amiB(图5b和d)。4个终载体通过点转化的方式转化到农杆菌菌株EHA105(由澳大利亚CAMBIA实验室提供)中，并在-70℃条件下长期保存。

实施例4四个amiRNA表达载体的遗传转化

本发明采用了农杆菌介导的转化方法将构建的4个amiRNA表达载体Osrbcsp+amiA、Osrbcsp+amiB、Atrbcsp+amiA和Atrbcsp+amiB转化到优良的籼稻恢复系明恢63中。本发明所使用的培养基参考了Lin等(2005)发表的农杆菌介导的籼稻转化培养基。

农杆菌介导的遗传转化的步骤如下：

4.1愈伤诱导

将成熟的明恢63水稻种子去壳，然后依次用70％的乙醇处理1分钟，0.15％氯化汞种子表面消毒15分钟；

1)用灭菌水洗种子4-5次；

2)将种子放在诱导培养基上；

3)将接种后的培养基置于黑暗处培养4-6周，温度28±1℃。

4.2愈伤继代

挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养3周，温度28±1℃。

4.3预培养

挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养4天，温度28±1℃。

4.4农杆菌培养

1)在带有对应抗性选择的LA培养基(LA培养基的配制参照J.萨姆布鲁克等，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，2002，北京)预培养农杆菌2天，温度为28±1℃；

2)将农杆菌转移至悬浮培养基里，在摇床上以28℃，200rpm的条件培养2-3小时。

4.5农杆菌侵染

1)将预培养的愈伤转移至灭好菌的瓶子内；

2)调节农杆菌的悬浮液至OD600值为0.3左右；

3)将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡10分钟；

4)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养3天，温度19-20℃。

4.6愈伤洗涤和选择培养

1)灭菌水洗涤愈伤7-8次；

2)浸泡在含400mg/L的羧苄青霉素的灭菌水中30分钟；

3)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；

4)转移愈伤至选择培养基上选择培养3次，每次2周。

4.7分化

1)将抗性愈伤转移至预分化培养基上于黑暗处培养7天，温度26±1℃；

2)转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，光照下培养，温度26±1℃。

4.8生根

剪掉分化时产生的根；然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周，温度26±1℃。

4.9移栽

洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润。

待移栽的转基因植株生长3周后，利用潮霉素抗性基因的PCR引物Hpt-F和Hpt-R进行转基因植株的PCR阳性筛选，最后4个表达载体Osrbcsp+amiA、Osrbcsp+amiB、Atrbcsp+amiA和Atrbcsp+amiB分别获得了32、38、29和25个独立的T₀代阳性转化植株。

实施例5amiRNA的功能验证

为了检测构建的amiRNA表达载体是否能够在转基因植株中正常的表达并产生成熟的amiRNA，对转基因植株内21bp的成熟amiRNA进行了RT-PCR检测。检测方法参考了Chen等(2005)发表的文献。其中成熟的amiA用具有茎环结构的引物amiA-RT进行反转录，用引物miRNA-RT和amiA-PCR进行特异性的PCR扩增；对amiB用具有茎环结构的引物amiB-RT进行反转录，用引物miRNA-RT和amiB-PCR进行特异性的PCR扩增。

反转录反应体系：总RNA 1μg，1μM引物aimA-RT或amiB-RT(见表1)1μl，5xTranscriptor ReactionBuffer 4μl，10mM dNTP 2μl，RNase Inhibitor 0.5μl，SSIII(购自美国Roche公司)0.5μl，加DEPC灭菌双蒸水至20μl

反应程序：16℃30min，42℃30min，85℃5min，冰上放置3min。

PCR反应体系：10xPCR buffer 2μl，2mM dNTPs 2μl，10μM miRNA-RT 0.5μl，10μM引物amiA-PCR或amiB-PCR(见表1)0.5μl，反转录产物1μl，Ex Taq(购自购自宝生物工程大连有限公司)0.2μl，加灭菌双蒸水至20μl。

反应程序：94℃2min；94℃15s，60℃45s 25循环；72℃5min。

RT-PCR的产物用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测。如图6所示，只有转基因植株的叶片中才能特异性的表达出表达条带，而野生型的明恢63中不能扩增出特异性的表达条带。

为了确定这些特异性的扩增条带是目标amiRNA的扩增条带，申请人将目标条带挖胶回收并克隆到T-easy vector载体上(购自Promega公司，美国)。对阳性的TA克隆进行了序列分析，结果表明扩增条带的确是含有21bp的amiRNA序列和RT引物的特异性扩增序列。该结果表明申请人构建的amiRNA载体在转基因植物中进行了正常的表达并被正确剪切，形成了预期的成熟amiRNA。

为了检测转基因植物是否获得了预期的抗病性，申请人在分蘖盛期，对所有的T0转基因植株接种了白叶枯病菌菌株PXO99(使用比浊法，接菌浓度控制在9亿到12亿/ml之间)。每个转基因单株接种5-6片叶，接种后14天考察病斑长度和病斑面积。接种结果表明，野生型明恢63发病明显，平均叶片病斑长度为23.48cm，病斑面积88.45％。而转amiB片段的转基因植株表现出了显著提高的抗病性(图7)。按储昭晖(2005)采用的标准(接种14天后病斑长度＜3cm为高抗水平)计算，38个转化Osrbcsp+amiB表达载体的T0独立转化植株中，19个转基因植株达到了高抗的标准；25个转化Atrbcsp+amiB表达载体的T0独立转化植株中，8个转基因植株达到了高抗的标准；而采用Osrbcsp启动子(32个T₀转化植株)或Atrbcsp启动子(29个T₀转化植株)的amiA片段的转基因植株中，虽然部分单株和对照相比，表现出了病斑长度有一定出的减少，但没有转基因单株达到高抗水平(图7)。由于转基因植株在T₀代表现出了抗病性，而此时导入的外源基因为杂合状态，因此该由隐性抗病基因介导的抗病性状转化为了显性抗病性状。

为了检测抗性植株的抗病性植株叶片中Xa13基因的表达量是否下降了，申请人利用real-time PCR的方法检测了转基因植株中Xa13基因的表达量，与预期的结果一样，相对于野生型的明恢63，高抗转基因植株叶片中Xa13的表达量显著下降了(图8)。

实施例6amiRNA切割位点(cleavage site mapping)的确定

植物miRNA介导的mRNA切割一般特异性的发生在miRNA与目标mRNA配对的第10和11个碱基之间。为了证明本发明中目标基因mRNA表达量的下降确实是因为发生了amiRNA介导的特异性切割造成的，申请人用5’RACE(RapidAmplification ofcDNA Ends)的策略分离了被降解目标mRNA的5’末端。

用Trizol试剂(购自美国Invitrogen公司)抽提转基因植株叶片的总RNA，用OligotexH mRNA Mini Kit(购自德国Qiagen公司)分离出mRNA。切断mRNA的5’端用GeneRacerTM Kit(购自美国Invitrogen公司)扩增。特异性的扩增的片段在1％的琼脂糖凝胶上电泳挖胶回收，用T-easy vector(购自美国Promega公司)克隆后测序。所有的操作都按照厂家提供的说明书进行，5’race的引物见表1。

对分离的12个含降解目标mRNA的5’端的TA克隆进行了测序，测序结果显示所有的12条被降解目标mRNA发生断裂的位置都是在amiRNA的第10和11个碱基间。该结果证明了目标基因表达量的下降是因为amiRNA介导的mRNA特异性的切割造成的。

实施例7转基因植株的育性考察

在Chu等人(2006)的研究中，虽然利用组成型表达的双链发卡RNA(hairpin RNA)干扰Xa13基因的表达可以提高转基因植株对PXO99菌株的抗病性，但是转基因植株的花粉碘化钾(0.67％的碘化钾和0.33％的碘)染色率异常，且育性普遍下降，该结果表明Xa13除了与抗白叶枯病菌性有关外，与水稻的花粉发育密切相关。

申请人通过对叶片和花药中amiRNA表达的情况进行RT-PCR检测，结果表明amiRNA的表达与预期一样主要在叶片中，花粉中仅有及其微弱的表达(图6)，理论上不会影响转基因植株花粉的育性。

申请人对野生型明恢63对照和部分具有高抗病性转基因水稻株系进行了花粉碘化钾染色的检测，结果表明大多数转基因水稻(包括高抗病的植株)花粉发育正常，与对照无明显差异(图9)。

对成熟后的转基因植株的结实率进行考察，野生型明恢63的结实率为82.65±3.22％；在Osrbsp+amiB的转基因家系中，3个抗病性最好的植株的育性分别是63.73％，85.49％和87.48％；而Atrbsp+amiB片段中抗性最好的3个植株的育性分别是87.5％，85.2％和82.9％(表2)，这6个抗性最好的株系中除了一个植株的育性有一定下降外，其他株系的抗性均和野生型明恢63的育性一致。通常情况下，转基因过程会导致部分转基因植株的育性下降或不育，这往往由于组织培养过程中体细胞突变或外源基因插入导致内源重要基因失活等因素引起。在T₀转基因植株中，申请人发现了许多高抗水稻白叶枯病的株系，其育性和野生型明恢63一致。虽然部分转基因植株出现了育性的下降，但是与其是否高抗病没有相关性，申请人推测其可能与组培变异或T-DNA插入位置有关，而与amiRNA的表达无关。因此，组织特异性Osrbcsp和Atrbcsp启动子驱动amiRNA的表达，可以显著提高其抗病性且不会降低植株的育性。

本发明并不仅仅局限于获得抗白叶枯病的转基因水稻，该发明可以广泛的应用于其他隐性抗病虫作物的分子育种，使其更好的在杂交育种中应用。

表2利用amiRNA组织特异性的抑制Xa13的表达可以提高转基因植株的抗病性，且不影响其育性。

a，仅列出了病斑长小于3cm的高抗转基因株系。

b，数据由平均数±标准差组成。

参考文献

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Claims (3)

1.一种提高水稻对白叶枯病抗性的DNA分子，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：4所述。

2.一种提高水稻对白叶枯病抗性的转基因的方法，其特征在于，利用序列表SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的来源于水稻及拟南芥的叶片特异性表达启动子，以及序列表SEQ IDNO：3所示的人工amiRNA前体构建获得如图5所示的表达载体Osrbcsp+amiB和Atrbcsp+amiB，通过农杆菌介导的遗传转化方法，将所述的表达载体Osrbcsp+amiB和Atrbcsp+amiB导入水稻受体中，使其在转基因水稻中表达21nt的人工microRNA，特异性地抑制水稻中Xa13基因在叶片中的表达，使转基因植株增强对白叶枯病的抗性。

3.权利要求1所述的DNA分子在增加水稻对白叶枯病抗性中的应用。

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