ES2304304A1 - Uso dea mutacionen ocp3 como regulador de la resistencia a sequia en plantas. - Google Patents

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Abstract

Uso de la mutación OCP3 como regulador de la resistencia a sequía en plantas. La presente invención se encuadra dentro del campo técnico de la biotecnología vegetal, y en concreto se refiere al uso del gen OCP3 como regulador de la resistencia a sequía en plantas y a las plantas obtenidas con dicha resistencia a sequía o tolerancia a la sequía incrementada.

Description

Uso de la mutación OCP3 como regulador de la resistencia a sequía en plantas.
La presente invención se encuadra dentro del campo técnico de la biotecnología vegetal, y en concreto se refiere al uso del gen OCP3 como regulador de la resistencia a sequía en plantas y a las plantas obtenidas con dicha resistencia a sequía o tolerancia a la sequía incrementada.
Estado de la técnica
La sequía es, probablemente, el problema más importante de la agricultura moderna, siendo la causante de cuantiosas pérdidas año tras ano. Exposiciones prolongadas a una escasez de agua provocan en la planta daños devastadores e irreversibles que derivan a menudo en mermas en la productividad de los cultivos y en ocasiones en la muerte de los mismos.
Durante la sequía se produce un aumento de la concentración de solutos debido a un una pérdida de agua que a su vez hace caer el potencial hídrico de la planta. Esto provoca, en sus etapas iniciales, una desestabi1ización del conjunto del sistema de membranas (incluida la membrana plasmática), y a su vez la disrupción de procesos fisiológicos y bioquímicos de gran importancia para la homeostasis celular entre los cuales cabe resaltar a la fotosíntesis por su especial relevancia en los organismos vegetales (Holmberg y Bülow, 1998). De hecho, en condiciones de sequía o ante situaciones de riego limitado la tasa fotosintética puede llegar a caer a niveles tan bajos que incluso puede llegar a comprometer la síntesis de la suficiente cantidad de ATP necesario para mantener el metabolismo celular equilibrado y ello puede conllevar a la muerte de la célula. Adicionalmente a la caída en la tasa fotosintética durante el proceso de sequía, la luz sigue incidiendo y excitando los cloroplastos. Ello deriva, por tanto, en un aumento en la síntesis y acumulación de especies de oxígeno reactivas que inevitablemente participan en la generación del daño celular mencionado anteriormente y conducen así a un deterioro celular acelerado (Holmberg y Billow, 1998).
Las plantas han desarrollado sofisticadas estrategias de defensa y adaptación para hacer frente a todos estos complejos procesos fisiológicos y bioquímicos que se inducen o están asociados a la sequía. Una de las estrategias más tempranas es la de evitar una pérdida excesiva de agua a través de la activación de unas cascadas de señalización que rinden un aumento en los niveles de ácido abscísico (ABA) y el correspondiente cierre de los estomas; todo ello mediado por un aumento en los niveles del Ca^{2+} citosólico en las células guarda (McAinsh et al., 1990). Además de este mecanismo celular, y en el caso de que el periodo de la sequía se prolongue en el tiempo, la planta pone en marcha, además, otros mecanismos de adaptación y protección con el fin de mantener su metabolismo en unos límites sostenibles. Esto implica la activación de diferentes rutas de señalización que resultan en la expresión de una batería de genes que codifican proteínas que podrían funcionar como antioxidantes y osmoprotectores con el fin de proteger y/o reparar el daño celular producido por la disminución del potencial hídrico (Courtois et al., 2000).
El ABA es la principal hormona que regula todos estos procesos de adaptación y protección orquestados en respuesta al estrés hídrico. Fundamentalmente es la encargada de mantener un balance hídrico en las células guarda de los estomas y de aumentar la tolerancia al estrés osmótico a través de la regulación de gran número de genes. Así, mutantes deficientes en la síntesis o percepción de ABA muestran una drástica disminución de la tolerancia a estrés hídrico siendo incapaces de responder de manera efectiva a periodos de escasez de agua relativamente cortos (Xiong et al., 2001). Por otra parte, gran parte de estos genes regulados por ABA poseen en sus regiones promotoras una secuencia reguladorora común denominada caja o elemento ABRE (ABA-responsive element). Se han identificado proteínas que muestran capacidad de unión estas secuencias ABRE y a dichas proteínas se les denomina factores AREB (ABA-responsive element binding) o ABF (Auxin binding factors). Estos son factores de transcripción de tipo bZIP (Basic leucine zipper) y funcionan como activadores transcripcionales en respuesta a ABA (Uno et al., 2000; Choi et al., 2000). Las sobreexpresiones de algunos de estos elementos, tal y como ocurre con el factor ABF3 o el factor ABF4, confieren a las plantas transgénicas un aumento de la tolerancia a la sequía que se ve acompañada de una alteración en la expresión de genes de respuesta a estrés tales como los genes rd29B, rd22, rab18, ABI1 y ABI2 (Kang et al., 2002). Por otro lado, las proteínas MYB y MYC son reguladores transcripcionales de gran importancia que también participan como activadores en los sistemas de regulación dependientes de ABA (Abe et al., 2003).
Adicionalmente a esta cascada de regulación transcripcional, las denominadas especies de oxígeno reactivas o ROS (Reactive oxygen species), juegan un papel preponderante en los mecanismos de percepción y adaptación a la sequía (Sanders et al., 1999). Así, las ROS son inducidas por ABA y se propone que podrían actuar como intermediarios de la señalización mediada por esta hormona en respuesta a la sequía (Pei et al., 2000).
Existe sin embargo, otro grupo de genes tal y como es el caso del gen rd29A (responsive to dehydration) cuya expresión se induce en respuesta a sequía aunque de una manera independiente a ABA (Seki et al., 2003). Estos genes habitualmente presentan en su región promotora una secuencia o elemento CIS conservado al cual se unen proteínas reguladoras denominadas DRE (Dehydration-responsive element) o CRT (C-repeat) (Yamaguchi-Shinozaki y Shinozaki, 1994, Baker et al., 1994). Estas proteínas son factores de transcripción pertenecientes a la familia ERF/AP2 (Ethylen-responsive element binding factor/Apetala2) (Weigel, 1995, Seki et al., 2003). Existen dos grupos de proteínas DRE/CRT. El grupo DREB2, implicado en la respuesta a sequía, y el grupo DREB 1, implicado además en la respuesta a frío (Liu et al., 2000). Se ha demostrado que sobreexpresando tanto DREB1A como una versión modificada de DREB2A se consigue un gran aumento en la tolerancia de las plantas transgénicas a la sequía atribuible a un aumento en la inducción de la expresión de genes de respuesta a estrés, tales como el gen rd29A mencionado con anterioridad (Liu et al., 2000; Gilmour et al., 2000; Sakuma et al., 2006). Sin embargo estas plantas presentan un fenotipo pleiotrópico en el que aún siendo resistente al estrés impuesto, las mismas sufren serios trastornos en su pauta de desarrollo; son enanas y de morfología foliar aberrante. En posteriores trabajos se ha mostrado una alternativa tecnológica para paliar este aspecto pleiotrópico de dicha sobreexpresión mediante el uso de un sistema inducible para sobreexpresar este tipo de genes obteniendo plantas más resistentes a sequía sin mermar su crecimiento (Kasuga et al., 1999; Sakuma et al., 2006).
Descripción de la invención
Un primer objeto de la presente invención se relaciona con la implicación funcional del gen OCP3, que codifica un factor de transcripción de tipo Homeobox, como nodo regulador de la respuesta de las plantas frente a la sequía, es decir el uso del gen OCP3 como regulador de la resistencia a sequía en plantas. En la presente invención se demuestra que la generación de plantas que tienen bloqueada la capacidad de sintetizar proteínas funcionales OCP3 mediante mutagénesis química con EMS, se obtiene plantas con un gran incremento de la resistencia frente a periodos prolongados de sequía, como queda patente en el mutante ocp3. También se demuestra que la inhibición de la expresión de dicho gen en planta mediante aproximaciones de silenciamiento génico, de la misma manera que la pérdida de función asociado al mutante ocp3, también genera resistencia frente a periodos prolongados de sequía.
Por tanto, un segundo aspecto de la presente invención consistiría en las plantas obtenidas con la expresión disminuida del gen OCP3, presentando un gran incremento de la resistencia frente a periodos prolongados de sequía.
En sus inicios, el aislamiento del mutante ocp3 se realizó a partir de una población mutagenizada con metano sulfonato de etilo (EMS) y procedente, a su vez, de una línea transgénica de Arabidopsis thaliana -designada como línea 5.2- en la que el promotor del gen Ep5C de Lycopersicon esculentum (inicialmente descrito en Coego et al., 2005a), dirigía la expresión del gen uidA (GUS), que codifica para la enzima \beta-glucuronidasa (Jefferson et al., 1987). En este escrutinio se aislaron varios mutantes ocp (overexpressor of cationic peroxidase). En concreto, el mutante recesivo ocp3 presenta una expresión constitutiva del gen GUS dando una intensa y homogénea coloración azul en toda la planta cuando se realiza una tinción GUS con el sustrato X-Gluc. Una de las características más importantes de este mutante es su incontestable resistencia frente a patógenos de tipo necrotrofo (Coego et al., 2005b).
Las plantas ocp3 presentan una elevada resistencia a sequía
Una profusa caracterización molecular del mutante ocp3 desveló algunos caracteres de interés agronómico inherentes al mecanismo de pérdida de función atribuible a la mutación ocp3. Dentro de estos caracteres, destaca la observación de una elevada resistencia frente a exposiciones prolongadas de ausencia de agua o riego cuando se compara con plantas de genotipo silvestre (Col-0) no mutantes, a partir de ahora plantas wt (Wild type). Así, las plantas wt de entre 4 a 6 semanas de edad crecidas en condiciones normales de día corto, si se dejan de regar durante 12 días, se deterioran de forma irreversible; en cambio esto no ocurre en el mutante ocp3. La figura 1 muestra plantas representativas de cada genotipo: wt y ocp3 crecidas bien de manera individual (en macetas independientes) o bien agrupadas en la misma maceta. Como se puede apreciar, las plantas wt presentan un acusado marchitamiento llegando incluso a morir, mientras que las plantas mutantes ocp3 permanecen aparentemente sanas o inalteradas tras el periodo prolongado de sequía. Aún reponiendo el régimen de riego tras dicho periodo prolongado de sequía, las plantas wt no se recuperaron, mientras que las plantas ocp3 continuaron su desarrollo normal (Figura 1). Estos resultados demuestran que la pérdida de función del gen OCP3, a través de la mutación recesiva ocp3, es suficiente para conferir a las plantas de Arabidopsis thaliana una evidente resistencia a la sequía y argumenta a favor de que la proteína OCP3 podría funcionar como un regulador negativo de un mecanismo existente de adaptación de las plantas para la supervivencia ante periodos prolongados de escasez de agua o sequía.
El mutante ocp3 es hipersensible a ABA
Son muchas las evidencias de la implicación del ABA en la respuesta de las plantas al estrés hídrico (Zeevaart y Creelman, 1988; Davies y Jones, 1991; Koornneef et al., 1998; Hetherington, 2001; Schroeder et al., 2001). Así, por ejemplo, plantas mutantes insensibles a la aplicación exógena de ABA tal y como es el caso de los mutantes abi1 o abi2, son incapaces de responder de manera efectiva a un régimen de ausencia de agua, y dichas plantas mutantes se marchitan y mueren en periodos relativamente cortos de tiempo. Entre los varios efectos desencadenados por la aplicación exógena de hormona ABA a plantas de Arabidopsis, uno de ellos es el de desencadenar una disminución en la capacidad de elongación de la raíz, aspecto que además se ve reflejado en un menor porte de la parte aérea de las plantas. Así, los mutantes insensibles a ABA, tales como abi1 y abi2, muestran una menor inhibición del desarrollo radicular comparado a la sufrida por los controles Col-0 y Ler (Koornneef et al., 1984).
Para estudiar cualquier posible efecto de la aplicación exógena de ABA en el desarrollo de las plantas ocp3 se sembraron semillas de dicho mutante en placas de MS-Agar, así como en placas de MS-Agar suplementadas con una concentración de ABA de 0,8 \muM, y siempre utilizando como plantas control en estos experimentos al genotipo silvestre wt (Col-0). Como se muestra en la figura 2, el desarrollo del mutante ocp3 queda arrestado en los primeros estadios de la germinación si la misma acontece en presencia de ABA y presenta, por tanto, una mayor sensibilidad a la hormona ABA comparada con el control wt (Col-0). De ello cabría deducir, por tanto, que la pérdida de función atribuible a la mutación ocp3 rinde una hipersusceptibilidad a la hormona ABA y por tanto la función normal del gen OCP3 sería compatible con la de regular algún aspecto de represión de la ruta de transducción de la hormona ABA, bien en el sentido de su síntesis o bien en el de su correcta percepción.
El mutante ocp3 no presenta alteraciones en los niveles de expresión de genes de respuesta a deshidratación
Una posibilidad que explicaría la mayor sensibilidad a ABA del mutante ocp3 así como el aumento en la resistencia a la sequía, podría ser que la mutación en dicho gen hubiera causado una activación constitutiva de la ruta de señalización dependiente de ABA y que tendría como última consecuencia la expresión constitutiva de genes de respuesta a deshidratación que aumentasen los niveles de protección contra el daño producido por el estrés hídrico y por tanto esto ayudaría a las plantas a soportar mejor este tipo de estrés. Con el fin de estudiar esta posibilidad, se realizó un análisis molecular determinando los niveles de expresión (medido como acumulación del ARNm correspondiente por RT-PCR) de algunos genes marcadores de la señalización en respuesta a deshidratación, tanto de aquellos genes que se activan por la vía dependiente de ABA como de aquellos cuya activación es independiente de la vía del ABA. Como marcadores de la ruta dependiente de ABA se utilizaron los genes rd29B y rd22, mientras que para la ruta independiente de ABA se utilizó rd29A. Se analizaron los niveles de los transcritos de estos genes a diferentes tiempos (0, 1 h, 3 h y 6 h) tras la incubación de las plantas en un medio líquido con 150 \muM de ABA. Como se muestra en la figura 3A, no existen diferencias observables en los niveles de inducción y acumulación de los transcritos correspondientes a los marcadores utilizados cuando se comparan las poblaciones de ARN obtenidas de plantas wt (Col-0) y plantas ocp3 tratadas de manera similar. Ello indica que no existe defecto observable en la ruta de señalización que media la inducción de la expresión de estos genes por ABA y elimina la consideración de que la mutación ocp3 esté afectando dicha vía de activación génica.
Para complementar la caracterización molecular, se compararon los niveles de los transcritos de estos mismos genes marcadores en respuesta a deshidratación. Los experimentos se realizaron tal y como se describe en Sakuma et al. Se crecieron in vitro plántulas Col-0 y ocp3 en placas MS-Agar y a las 3 semanas se trasladaron las plántulas a placas Petri estériles sin medio de cultivo para provocar así su deshidratación. Se analizaron los niveles de acumulación de los transcritos correspondientes a los genes marcadores reseñados anteriormente a los 0, 10', 30', 1 h, 3 h y 6 h de deshidratación. Los resultados (Figura 3B) demuestran que tanto rd29B y rd22 como rd29A muestran una acumulación acusada en condiciones inductivas de deshidratación pero, a su vez, no se observan diferencias entre los niveles de inducción y acumulación de los transcritos correspondientes cuando se comparan las poblaciones de ARN obtenidas de plantas wt (Col-0) y plantas ocp3 tratadas de manera similar. Todo ello indica, por tanto, que el mutante ocp3 tampoco muestra defecto en cuanto a la activación de las cascadas de señalización que inducen estos genes marcadores en respuesta a la deshidratación.
En resumen, los resultados indican que pese a que las plantas ocp3 muestran una marcada sensibilidad frente al ABA comparada con las plantas Col-0 en términos de inhibición de desarrollo, no existen diferencias en la inducibilidad de la expresión de genes marcadores dependientes de ABA (como rd29B y rd22) ni independientes de ABA (como rd29A). Por tanto la resistencia a la sequía mostrada por el mutante ocp3 parece ser independiente de la expresión de estos genes.
La expresión del gen OCP3 se reprime en respuesta tanto a la aplicación exógena de ABA como a deshidratación
En condiciones tanto de sequía como de deshidratación, las plantas responden aumentando los niveles de ABA endógenos, lo que conlleva a la activación de una cascada de señalización que tiene como resultado una serie de cambios a nivel transcriptómico. Para estudiar el posible efecto que el ABA pudiera tener en la regulación transcripcional de OCP3 en plantas wt, medimos por RT-PCR cuantitativa (q-RT-PCR) los niveles relativos del ARNm correspondientes al gen OCP3 a diferentes tiempos tras la aplicación de ABA, así como tras someter a las plantas a estrés por deshidratación. Como control se utilizó en los experimentos el gen ABI1, cuya expresión se sabe que se induce en respuesta tanto a ABA como a deshidratación. Como se puede observar en la figura 4, tanto como consecuencia de la aplicación de 150 \muM de ABA como tras imponer un estrés hídrico a las plántulas, se observa una fuerte caída de los niveles de acumulación del transcrito correspondiente al gen OCP3. Dicha represión en la expresión del gen OCP3 como consecuencia del tratamiento con ABA o de la deshidratación, se hace patente ya a tiempos muy cortos. Además, dicha caída es inversamente proporcional a la activación observada para el gen ABI1 (Figura 4). Ello indica por tanto, que el gen OCP3 podría estar implicado en una señalización temprana en respuesta al aumento en los niveles de ABA, de manera que su represión sea necesaria, aunque no necesariamente suficiente, para promover la activación del programa transcripcional demostrado para los genes de referencia anteriormente indicados, incluyendo el propio gen ABI1. Por otra parte, la inducción de la proteína ABI1, la cual funciona como un regulador negativo de la respuesta a ABA, serviría para modular está fuerte demanda transcripcional activada por las condiciones inductivas empleadas.
El mutante ocp3 no muestra alteraciones en respuesta a la desecación
Uno de los primeros eventos característicos que acontecen en las plantas tras la percepción de un aumento en los niveles de ABA endógeno como consecuencia de periodos prolongados de sequía, es el cierre de los estomas, ya que el ABA promueve el cierre de los mismos así como inhibe la apertura de los estomas cerrados (Schroeder et al., 2001). Por tanto, una medida indirecta de la capacidad de las plantas para cerrar los estomas consiste en determinar la pérdida de peso fresco a lo largo del tiempo en hojas escindidas de la planta y colocadas bajo condiciones controladas de temperatura y humedad ambiental. Así, mutantes alterados en la síntesis, percepción y/o respuesta al ABA son incapaces de cerrar los estomas de una manera efectiva, y por tanto en dichos mutantes se produce un descenso más rápido del peso fresco en respuesta a este proceso de desecación (Allen et al., 1999; Finkelstein y Somerville, 1990; Koornneef et al., 1984; Leung et al., 1997).
Con el fin de observar el comportamiento de las plantas ocp3 en referencia a este aspecto fisiológico, realizamos este tipo de ensayo de medición de la velocidad de deshidratación y referenciamos los datos a los obtenidos con plantas abi-1 y las plantas control (wt) correspondientes; Col-0 como parental del mutante ocp3 y Ler como parental del mutante abi1-1. Para ello se cortaron hojas de roseta de plantas de cada uno de los genotipos, se dividieron en tres réplicas y fueron colocadas en placas Petri estériles en una cabina de flujo laminar para provocar su desecación, realizando medidas de la pérdida de peso fresco a diferentes tiempos. Como puede observarse en la Figura 5, el mutante abi1-1 tiene una pérdida de peso fresco abrupta con pérdidas cercanas al 80% de su peso fresco a las tres horas de iniciarse la desecación. Por el contrario, los controles Ler y Col-0 solo han perdido el 20% de su peso fresco original, al igual que ocurre con las muestras procedentes del mutante ocp3. Así pues, a pesar de las acusadas diferencias observadas en respuesta a sequía entre el mutante ocp3 y las plantas wt, no existen diferencias significativas en la respuesta a desecación entre dichas plantas. Esta diferencia en el comportamiento, alta resistencia a sequía en plantas crecidas en macetas pero normal comportamiento a la desecación rápida por parte de las plantas ocp3, podría deberse a que los dos tipos de estreses ensayados (sequía y desecación) tienen un mecanismo de señalización diferente y precisamente el mutante ocp3 revela dicha diferencia.
El mutante ocp3 no presenta alteraciones en la disposición y número de estomas
A tenor de los resultados obtenidos, y dado que el número de estomas, su disposición, y también el grado de apertura/cierre de los mismos pueden jugar un papel fundamental en la respuesta de las plantas frente al estrés hídrico, se planteó la posibilidad de que ocp3 pudiera mostrar alguna alteración estomática. Tras un análisis con microscopía de barrido (Figura 6), no se observaron diferencias entre las plantas ocp3 y las plantas wt ni en la disposición ni en la cantidad de estomas a lo largo de la lámina foliar. Tampoco se encontraron diferencias significativas en el grado de apertura de los estomas entre las plantas ocp3 y las plantas wt cuando son crecidas en condiciones de normal temperatura, iluminación y riego (Figura 6), aunque ambos si se diferenciaban drásticamente de lo observado para el mutante abi1 que mostraba apertura estomática permanente y que explica el comportamiento observado de las plantas abi1 frente a la deshidratación.
Existen diferentes estímulos que modifican la velocidad así como el grado de apertura/cierre de los estomas y entre ellos cabría resaltar el someter a las plantas a sequía o privarlas de la luz, y siempre ambas señalizaciones están directamente relacionadas con un aumento de los niveles endógenos de ABA, hormona que determina el cierre de estomas bajo condiciones inductivas o de estrés. Para determinar si en el mutante ocp3 existe algún defecto en la señalización mediada por ABA, se decidió comparar la velocidad de cierre de los estomas entre plantas ocp3 y plantas Col-0 que acontece tras la aplicación directa de ABA en muestras epidérmicas (peelings) obtenidas de hojas de roseta. Como puede verse en la Figura 7, la presencia de ABA provoca un cierre acelerado de los estomas en las plantas ocp3 que ya es observable de manera significativa a los 30 minutos tras la aplicación de ABA y en situaciones donde el control wt aún no ha iniciado el proceso de cierre de sus estomas. Sin embargo estas diferencias desaparecen a las 2 horas posteriores a la aplicación de ABA, tiempo en el que los estomas de las plantas ocp3 y las plantas wt están completamente cerrados. Por tanto, se desprende de estos experimentos que el mutante ocp3 es más sensible a la hormona ABA y ello se traduce en una pronta 1 respuesta a esta hormona que se manifiesta con un cierre estomático acelerado. La mayor susceptibilidad al ABA concuerda con la hipersusceptibilidad mostrada por las plántulas cuando son germinadas y crecidas en presencia de ABA (Figura 2). Además, dicha hipersusceptibilidad al ABA podría explicar el fenotipo de resistencia a sequía, ya que la sequía provoca aumentos en la síntesis de ABA que a su vez conducen al cierre de estomas para evitar la pérdida de agua por evapotranspiración. De esta manera, el mutante ocp3 al ser más sensible al ABA aceleraría el cierre de sus estomas ante la señal de sequía y esa inmediatez en la respuesta le podría proporcionar una ventaja para resistir mejor o durante más tiempo los inconvenientes metabólicos que se derivan de la privación de agua.
La mutación abi1-1 suprime la resistencia de las plantas ocp3 a la sequía
La implicación de la fostatasa 2C ABI1 en la ruta de señalización dependiente de ABA es clara y ha sido muy estudiada (Koornneef et al., 1984; Leung et al., 1997; Allen et al., 1999; Merlot et al., 2001; Mishra et al., 2006). De hecho, la mayor parte de los fenotipos dependientes de esta hormona quedan reflejados en el mutante dominante abi1-1. Estas plantas mutantes son hipersusceptibles a sequía y a deshidratación, ya que son incapaces de cerrar los estomas por tener reprimida de manera constitutiva la señalización mediada por ABA. Además, las plantas abi1-1 presentan insensibilidad a ABA y no muestran, por tanto, inducción en la expresión de los genes marcadores ni en condiciones de deshidratación ni en respuesta a la aplicación exógena de ABA.
Con el fin de determinar si la resistencia a la sequía conferida por la mutación ocp3 es dependiente de ABI1 se introgresó la mutación ocp3 en un fondo mutante abi1-1 generando así el doble mutante ocp3 abi1-1 y se analizó la respuesta de estas plantas en diferentes situaciones.
Por un lado, se estudió el crecimiento del doble mutante ocp3 abi1-1 en placas de MS suplementadas con 0,8 \muM de ABA y se comparó el efecto que ejercía sobre el crecimiento de plántulas de manera comparativa con los genotipos Col-0, ocp3 y abi1-1. Como se puede observar en la figura 8, el doble mutante ocp3 abi1-1 se comporta como abi1-1, y por tanto muestra supresión de la hipersusceptibilidad a ABA atribuible a la mutación ocp3.
Por otro lado, analizando los niveles de los ARNm de los genes marcadores de la ruta de ABA anteriormente utilizados, se observó que las plantas portadoras de la mutación doble ocp3 abi1-1 tienen mermada la inducción de la expresión de dichos genes marcadores en contraposición con lo observado con las plantas wt u ocp3. El doble mutante ocp3 abi1-1 se comporta igual que el mutante abi1-1, el cual tiene también mermada la activación de la expresión de los genes de referencia en respuesta a ABA (Figura 9). Como puede verse tanto en el caso de abi1-1 como del doble mutante ocp3 abi1-1, la inducción de la expresión del gen rd29A queda muy mermada, mientras que en el caso de los genes rd29B y rd22 la misma queda prácticamente anulada. Estos resultados concuerdan con los obtenidos en anteriores trabajos donde la inducción de la expresión de genes marcadores tanto ABA-dependientes como rd29B, como ABA-independientes como rd29A, se ve disminuida en el mutante abi1-1 (Nordin et al., 1993; Shinozaki et al., 2000; Umezawa et al., 2006). En estos experimentos, como control interno para verificar que la aplicación y dosis de ABA utilizadas han sido efectivas, se utilizó el mutante aba2-1 (Figura 9). El mutante aba2-1 no sintetiza ABA (Léon-Kloosterziel et al., 1996) y por tanto cualquier inducción de expresión de los genes dependientes de ABA utilizados anteriormente es atribuible solamente al ABA exógeno aplicado y no a cualquier otra perturbación interna que pueda resultar de los diferentes fondos genéticos empleados.
Por último, se analizó el comportamiento de las plantas Col-0, ocp3, abi1-1 y ocp3 abi1-1 en respuesta a sequía. En la figura 10 se muestran un grupo de plantas representativas de cada genotipo las cuales han sido regadas por dos días, después de permanecer privadas de riego durante 12 días (Figura 10) y la comparación con plantas representativas de cada genotipo que no han sido sometidas a dicho estrés hídrico y que han sido normalmente regadas (Figura 10). Como puede comprobarse en esta figura, las plantas wt (en sus respectivos fondos Col-0 y Ler) presentan síntomas de marchitamiento y estrés, característicos de la privación de riego y que preceden al completo colapso de las mismas si el periodo de estrés se alarga en el tiempo. Asimismo, el mutante abi1-1 y el mutante aba2-1, los cuales tienen alterada la percepción y la síntesis de ABA, respectivamente, muestran una susceptibilidad incrementada al estrés hídrico impuesto -con una manifestación más temprana y acusada de la sintomatología característica- y denota la importancia de esta hormona en este tipo de respuesta. Por el contrario, el mutante ocp3, como era de esperar, presenta un comportamiento de resistencia evidente a dicho estrés. Sin embargo, el doble mutante ocp3 abi1-1 muestra un comportamiento similar al del simple mutante abi1-1 con un acusado marchitamiento que resulta ser, de nuevo, superior al observado en las plantas wt (Col-0) y del que no parecen recuperarse después de reponer el riego (Figura 10). La pérdida de la resistencia a la sequía demostrada por las plantas ocp3 abi1-1 indica, por tanto, que para la manifestación del fenotipo de resistencia atribuible a ocp3 es absolutamente imprescindible mantener intacta la ruta del ABA a través del regulador ABI1. De ello se puede derivar, además, que en condiciones silvestres la proteína OCP3 y ABI1 pueden estar interactuando para mediar un comportamiento tal y como el observado en las plantas wt de cara a la percepción y respuesta a la sequía.
OCP3 interacciona físicamente con ABI1
La identificación de proteínas que interaccionan con OCP3 puede constituir un dato de gran relevancia para el conocimiento de los fenómenos que se desencadenan en las plantas ante estreses tan diferentes como la sequía y la respuesta frente a hongos necrotrofos además de poder establecer un posible nexo entre ellos. Para determinar la existencia de esas interacciones se utilizó la técnica del "Doble Híbrido" en levadura (Ausubel, 1987). Con esta técnica, la expresión de un gen que permite la supervivencia de las levaduras en un medio de cultivo deficiente en algún nutriente, queda bajo el control de un promotor o región reguladora de un gen que únicamente se activa con la formación de un complejo proteico estable entre las dos proteínas en estudio. En este caso se fusionó la proteína OCP3 al dominio activador de gen GAL4, y se utilizó esta fusión (OCP3-AD) como cebo para una genoteca de proteínas de A.thaliana fusionada al dominio de unión al promotor de GAL4 (X-BD). Se expresaron estas fusiones en una levadura que poseía un vector en el que se encontraba el promotor de GAL4 dirigiendo la expresión del gen marcador HIS3, de tal forma que únicamente cuando existiera interacción entre OCP3 y una proteína X, se restauraría el crecimiento de esta levadura en un medio sin histidina. Además, para aumentar la especificidad, se utilizó un inhibidor competitivo de HIS3 como es el 3-AT (ácido 3-amino triazol). Uno de los clones detectados en el rastreo se correspondía con el ADNc de la fosfatasa 2C ABI1, lo que demostraba la existencia de una interacción entre OCP3 y ABI1. En la figura 11 puede observarse como la expresión conjunta de las proteínas de fusión ABI1-BD y OCP3-AD, es capaz de restaurar el crecimiento de la levadura, mientras que cualquiera de las dos por separado, o los vectores vacíos, no lo consiguen. Así pues, se puede concluir que ABI1 interacciona con OCP3. Este resultado está en concordancia con los descritos hasta el momento, en los que la ganancia de función genética de la fosfatasa 2C ABI1 presente en el mutante abi1-1 es capaz de suprimir la resistencia de las plantas ocp3 frente a sequía. OCP3 codifica un factor de transcripción del tipo Homeobox, y son varios los casos descritos en la literatura en los que se ha demostrado la modulación funcional de un factor de transcripción mediante fosforilación/defosforilación (Kaffman et al., 1994; Pines 1999; Whitmarsh et al., 2000; Nowak y Corces, 2000). Por tanto, y dado que ABI1 es una fosfatasa, esta interacción tendría lugar con el fin de defosforilar a OCP3, muy posiblemente para modular así su función.
La resistencia frente a Botrytis cinerea conferida por la mutación ocp3 es independiente de ABI1
En trabajos anteriores se ha descrito el fenotipo de resistencia del mutante ocp3 frente a infecciones por patógenos de tipo necrotrofo (P200501035; Coego et al., 2005b) El doble mutante ocp3 abi1-1 generado en el presente trabajo pareció un material genético de gran valor para investigar la existencia de algún papel regulador de la hormona ABA en el establecimiento de una respuesta defensiva de resistencia frente a este tipo de patógenos tal y como muestra el mutante ocp3. En este doble mutante se integran por un lado la incapacidad de percepción y por tanto la no transducción de la señalización mediada por ABA, a través de la mutación abi1-1, y por otro lado, una alteración molecular que es atribuible a la pérdida de función en el locus ocp3 y que tiene como efecto sobresaliente una mayor resistencia frente a hongos tales como Botrytis cinerea o Plectosphaerella cucumerina, además de la mayor resistencia a sequía mostrada con anterioridad.
Con el fin de analizar una posible implicación del ABA en la resistencia a patógenos necrotrofos, se realizaron experimentos de inoculación con B. cinerea de plantas Col-0, Ler, ocp3, abi1-1 y ocp3 abi1-1. En la figura 12 puede apreciarse la respuesta de estas plantas al cabo de 72 horas tras la inoculación con una suspensión de esporas del hongo y en las que la normal susceptibilidad observada en las plantas wt es equiparable a lo observado en las plantas abi1-1. Ello sugiere, por tanto, que la normal susceptibilidad de las plantas wt a dicho hongo necotrofo no parece depender de la correcta percepción de la hormona ABA. Asimismo, el incremento en la resistencia demostrada y característica del mutante ocp3 tampoco se ve afectado cuando dicha mutación se analiza en presencia de la mutación abi1-1 en el doble mutante ocp3 abi1-1.
En resumen, estos resultados ponen de manifiesto que la resistencia frente a hongos necrotrofos inherente al mutante ocp3 sigue un curso independiente al de una correcta percepción y transducción de la hormona ABA. Por el contrario, dicha independencia contrasta con el requerimiento absoluto por el ABA mostrado por el mutante ocp3 para manifestar la resistencia a la sequía demostrada en las páginas anteriores. Por tanto, estos resultados indican un posible papel del gen OCP3 como nodo regulador de respuestas defensivas de las plantas frente a estreses de naturaleza tan diversa como son la sequía y los hongos necrotrofos, y sustancia que para la resistencia a sequía, pero no para la resistencia a hongos, requiere de la implicación 1 de la hormona ABA a través del gen ABI1 como elemento regulador de la misma.
El silenciamiento del gen homólogo de tomate de OCP3 (LeOCP3) reproduce el fenotipo de resistencia a la sequía en plantas de tomate
El silenciamiento génico inducido por virus o VIGS (Virus induced gene silencing) es un método utilizado para interrumpir transitoriamente la función de un gen a través de la interferencia de su ARNm (Baulcombe, 2004). Aunque el mecanismo exacto no es bien conocido, esta herramienta aprovecha la capacidad natural de las plantas de suprimir la acumulación de ARN extraño como mecanismo de defensa frente a infecciones víricos (Dawson, 1996). La generación de vectores víricos recombinantes portando secuencias específicas de genes endógenos de plantas ha permitido suprimir con éxito la expresión de diferentes genes, convirtiéndose en una potente herramienta para el estudio de la función génica (Burton et al., 2002), ya que el fenotipo presentado por las plantas silenciadas por VIGS es comparable al de una pérdida de función. Se han desarrollado numerosos vectores víricos efectivos para estudiar la función génica en diferentes especies vegetales tales como Nicotiana benthamiana (Liu et al., 2002b), Lycopersicon esculentum (Ekengren et al., 2003; Liu et al., 2002a), Petunia (Chen et al., 2004) o Solanum tuberosum (Brigneti et al., 2004).
Con el fin de estudiar si el efecto de la supresión de OCP3 aumenta la resistencia de las plantas también en otras especies vegetales con un mayor interés agronómico se utilizó la tecnología VIGS. En particular, se empleó el vector VIGS de segunda generación basado en el virus TRV (Tobacco Rattle Virus), un virus de ARN bipartito (Liu et al., 2002a). Este vector se ha diseñado de manera que hay un sitio múltiple de clonaje en el TRV ARN2 donde se insertó una secuencia específica de alrededor de 344 pb del gen OCP3 homólogo de tomate (LeOCP3) (Figura 13).
El clonaje del gen ortólogo de tomate (Lycopersicon esculentum), a partir de ahora LeOCP3, se llevó a cabo a partir de una secuencia del gen de patata (Solanum tuberosum) que aparecía en la base de datos Genebank (número de acceso BQ112211) y que mostraba una identidad de secuencia aminoacídica del 48,3% con OCP3 de Arabidopsis thaliana. En base a la secuencia nucleotídica de OCP3 de patata, se diseñaron oligonucleótidos específicos (oligonucleótidos PoRT1 con la SEC. ID. No. 1 y PoRT2 con la SEC. ID. No. 2) y que fueron utilizados como oligonucleótidos en una reacción de PCR sobre una muestra de ADNc obtenido a partir de ARN de hojas de tomate. El producto de dicha reacción de PCR fue donado en el vector pTZ57 y se procedió a la secuenciación de dicho producto de DNA clonado que se denominaría como LeOCP3 (Figura 14). La secuencia resultante de dicha amplificación resultó ser 95% idéntica a la de patata. A partir del clon de tomate, se amplificó por PCR un fragmento de 330 pb (LeOCP3*) con los cebadores específicos de la secuencia de tomate tomOCP3EcoRI y tomOCP3XhoI (que incorporan sitios de corte EcoRI y Soy, respectivamente) y tras digerir con estas enzimas, se procedió a ligar este fragmento en el vector TRV ARN2 generando así la construcción TRV ARN2-LeOCP3* (Figuras 13 y 14).
Cuando se coinfiltran sectores foliares o cotiledones de hojas de plantas de tomate con cultivos de Agrobacterium tumefaciens (agroinfiltración) que contienen las construcciones TRV y TRV ARN2-LeOCP3*, respectivamente, las células vegetales reconocen como extraños los ARN transcritos y los silencia. Este silenciamiento es efectivo tanto para los ARN virales como para el de LeOCP3 endógeno y además el mecanismo de silenciamiento se hace sistémico, englobando a la totalidad de la planta inicialmente agroinfiltrada localmente.
Para evaluar el efecto que el silenciamiento del gen LeOCP3 pudiera tener sobre la resistencia de plantas de tomate a la sequía, se utilizaron plantas de tomate de la variedad Microtom cuyos cotiledones fueron co-infiltrados con cultivos de A.tumefaciens conteniendo por un lado el TRV ARN1 y por otro el TRV ARN2 con un fragmento de 344 pb específico para LeOCP3. Las agroinfiltraciones fueron realizadas en lotes de 20 plantas de 7 días de edad. Como controles internos a dichos experimentos se agroinfiltraron cotiledones de plantas Microtom con el TRV ARN1 y el TRV ARN2 vacío, plantas con solamente el TRV ARN1 o el TRV ARN2, y plantas sin ninguno de estos vectores. Para confirmar que el silenciamiento estaba siendo efectivo, se utilizó además una variante de este vector vírico que incluye un fragmento de alrededor de 500 pb del gen LePDS (Phytoene desaturase). Este gen codifica un enzima clave en la biosíntesis de carotenoides, por lo que una reducción en su expresión resulta en un fenotipo fácilmente detectable como es la pérdida de pigmento de las hojas (Liu et al., 2002a). A los 20 días posteriores a la agroinfiltración se eliminó el riego a las plantas y se fue evaluando el fenotipo de resistencia a sequía. Transcurridos 15 días posteriores a la privación de riego, las plantas fueron fotografiadas. Las plantas control no agroinfiltadas así como las agroinfiltradas con los vectores vacíos (sin secuencia LeOCP3) mostraron un fenotipo de sequía característico que se manifiesta con marchitez y deshidratación foliar acusada. Por el contrario, las plantas agroinfiltradas con A. tumefaciens portando TRV ARN1 + TRV ARN2-LeOCP3 fueron capaces de resistir este periodo de sequía sin sufrir daños apreciables (Figura 15). Por otro lado, al cabo de 10 días y en todos los casos analizados, era evidente el silenciamiento del gen LePDS en las plantas coinfiltradas con TRV ARN1 y TRV ARN2-PDS, apareciendo una acusada clorosis en las hojas y que indicaba que el fenómeno de silenciamiento génico basado en el reconocimiento de secuencias especificas era efectivo en todos los casos.
En suma, parece claro que el silenciamiento delgen endógeno de tomate LeOCP3 es capaz de fenocopiar al mutante ocp3 de A. thaliana, indicando que la función reguladora del gen OCP3 está conservada en dos especies tan distantes. Por tanto, la disminución en los niveles de expresión el gen OCP3 podría ser un mecanismo general de las plantas para responder a la sequía disminuyendo los daños sufridos por este estrés. La obtención de plantas con una expresión disminuida en este gen puede proporcionar una seria herramienta para la obtención de cultivos con una mayor tolerancia a la sequía.
Por tanto, en la presente invención queda demostrado que la pérdida de función del gen OCP3 en Arabidopsis thaliana, tal y como se observa en el mutante ocp3 (mutante inducido por el agente químico etil-metano-sulfonato (EMS)), confiere una marcada resistencia a periodos prolongados de sequía. Dicha resistencia acontece pese a no tener alteradas la inducción de la expresión de genes inducibles por sequía, y ello tanto para los genes cuya inducción está documentado que es dependiente de la hormona ABA como para otros genes cuya inducción es no-dependiente de la hormona ABA, y que habitualmente son utilizados como marcadores moleculares que miden la incidencia del estrés hídrico en plantas. En este respecto, también se demuestra que en plantas silvestres la expresión del gen OCP3 está controlada negativamente y de forma rápida por la hormona ABA, así como por la propia deshidratación; y dicha regulación negativa ocurre siguiendo una pauta temporal similar, aunque inversa, a la inducción del gen ABI1, uno de los principales reguladores de la señalización mediada por ABA. Además de la capacidad de resistir periodos prolongados de sequía, cuando se muta o se pierde la normal función del gen OCP3, en la presente invención también se demuestra que para que ello ocurra, es necesario mantener intacta la percepción de la hormona ABA a través del correcto funcionamiento de la proteína ABI1.
La presente invención también demuestra la existencia de una interacción física entre las proteínas OCP3 y ABI1, estableciendo un nuevo papel para OCP3 como nodo modulador de la respuesta de las plantas frente a la sequía.
Otro aspecto que pone de manifiesto la presente invención es la independencia del ABA en la resistencia a hongos necrotrofos conferida por la ausencia o pérdida de función del gen OCP3. Esto último demuestra que la capacidad de conferir resistencia a sequía y a hongos es a través de rutas diferentes pero ambas convergen en la propia función de este gen cuya función normal es la de actuar como un represor transcripcional de ambas rutas de transducción de señales. Además, la manipulación del gen homólogo a OCP3 en otras plantas, tal y como se ha demostrado para el caso de tomate, mediante silenciamiento del gen ortólogo por tecnología VIGS, reproduce el fenotipo de resistencia a sequía observado en Arabidopsis thaliana a través del mutante ocp3. Por ello la presente invención demuestra que la eliminación o inhibición de la normal función del gen o de la proteína OCP3 es un instrumento para controlar, conferir e inducir incrementos en la resistencia de las plantas a periodos de sequía así como para controlar, conferir e inducir resistencias duraderas al ataque por hongos necrotrofos.
Descripción de las figuras
Figura 1. Ensayo de resistencia a sequía de plantas wt y ocp3.
(A) Plantas de 6 semanas de edad se dejaron de regar durante 13 días y al cabo de este tiempo se restauró el régimen normal de riego (panel inferior). Aspecto de las plantas regadas normalmente (panel superior). (B) Plantas de 4 semanas de edad, del genotipo wt (izquierda) y genotipo ocp3 (derecha) se dejaron de regar durante 12 días y al cabo de este tiempo se restauró el régimen normal de riego. (C) Plantas wt y ocp3, crecidas de manera individual y de 5 semanas de edad; se dejaron de regar durante 14 días y al cabo de este tiempo se restauró el régimen normal de riego. Obsérvese el fenotipo inalterado tras los diferentes tratamientos de privación de agua en el caso del mutante ocp3 y por el contrario el aspecto deletéreo que dicho tratamiento tiene sobre las plantas silvestres wt.
Figura 2. Efecto del ABA en el desarrollo de plantas ocp3 comparado con plantas wt (Col-0). Las semillas fueron esterilizadas, estratificadas a 4ºC durante 4 días y sembradas en placas con medio MS-Agar y MS-Agar suplementado con ABA 0,8 \muM. Las fotografías fueron tomadas a los 17 días de la siembra.
Figura 3. Análisis de la expresión por RT-PCR de genes marcadores de estrés hídrico rd29A, rd29B y rd22 en plantas Col-0 y ocp3, utilizando como control el gen ELF1\alpha. Las plantas fueron crecidas en placas de MS-Agar durante 3 semanas y los ARN fueron extraídos a partir de muestras recolectadas a los diferentes tiempos. (A) Niveles de expresión tras la aplicación exógena de ABA 150 \muM en cultivo líquido. (B) Niveles de expresión a los 10 minutos, 30 minutos y 1, 3 y 6 horas después de someter a las plantas a deshidratación.
Figura 4. Niveles de expresión relativa de OCP3 y ABI1 en respuesta a la aplicación exógena de ABA 150 \muM (A) y deshidratación (B) medidos por PCR en tiempo real. Las gráficas muestran los niveles del transcrito de OCP3 y de ABI1 referidos ambos a los del gen APT y representados como la media de tres medidas independientes. Las barras de error representan la desviación estándar. Los experimentos fueron repetidos al menos tres veces con resultados similares.
Figura 5. Pérdida de peso fresco de hojas sometidas a desecación. Se utilizaron tres réplicas por genotipo, provocando su desecación cortándolas y depositándolas en placas Petri en una cabina de flujo laminar. Se determinó la pérdida de peso según la diferencia entre el peso de las hojas a tiempo 0 y cada uno de los tiempos indicados. El mutante abi1-1 (--X--) se deseca muy rápidamente, mientras que no existen diferencias significativas entre Col-0 (--\sqbullet--), Ler (--\blacktriangle--) y ocp3 (--\bullet--)
Figura 6. Análisis de superficie foliar por microscopía de barrido de hojas procedentes de plantas wt, ocp3 y abi1. El panel inferior es una magnificación donde se muestran estomas representativos para cada genotipo seleccionado y el que la apertura estomática correspondiente a las muestras foliares de plantas abi1 es evidente. Las barras representan 100 micras (panel superior) o 10 micras (panel inferior). No se observan diferencias ni entre el grado de apertura/cierre ni en el número de estomas entre las muestras wt y ocp3.
Figura 7. Medida del cierre estomático inducido por ABA (100 \muM) en plantas ocp3 y wt. Se escindieron hojas de roseta de plantas de 6 semanas de edad de los genotipos ocp3 y Col-0 y se incubaron en una solución (Mes-KOH 10 mM pH 6,15 y KCl 30 mM) durante 2 horas para inducir la apertura de los estomas. A continuación se añadió ABA 100 \muM para inducir el cierre de los estomas. Se midió la apertura del ostiolo a los diferentes tiempos indicados en peelings epidérmicos de las hojas de los diferentes fondos genéticos. A los 30 minutos de la aplicación de ABA es evidente y estadísticamente significativo un mayor cierre de los estomas en el mutante ocp3. Las barras representan la media de los experimentos con un mínimo de 90 mediciones por experimento. Las barras de error representan el error estándar de la media (SEM). Los asteriscos indican diferencias significativas según un análisis t-Student (p<0,001)
Figura 8. Efecto del ABA en el desarrollo del doble mutante ocp3abi1-1. Se utilizaron como controles los parentales ocp3 y abi1-1 además de Col-0 y Ler. Las semillas fueron tratadas de igual forma que la descrita para la figura 2.
Figura 9. Comparativa de la inducción por ABA de la expresión de genes marcadores de estrés hídrico rd29A, rd29B y rd22 ensayado por RT-PCR en muestras de ARN procedentes de plantas Col-0, ocp3, aba2-1, abi1-1 y ocp3abi1-1, y utilizando como control la acumulación del mARN correspondiente al gen ELF1\alpha. Se procedió de igual manera que la descrita para la figura 3. La inducción de la expresión de los genes marcadores se ve claramente disminuida tanto en el mutante abi1-1 como en el doble mutante ocp3 abi1-1 si la comparamos con los niveles obtenidos para ocp3
o wt.
Figura 10. Ensayo de resistencia a la sequía de plantas ocp3, abi1-1 y el doble mutante ocp3 abi1-1. Como controles se emplearon Col-0 y Ler como fondos genéticos de los respectivos mutantes, y el mutante aba2-1 como un control de hipersensibilidad a sequía. Plantas de 6 semanas de edad se dejaron de regar durante 12 días (panel inferior). Aspecto de las plantas regadas normalmente (panel superior). El doble mutante ocp3 abi1-1 muestra un comportamiento susceptible similar al observado en el simple mutante abi1-1 que contrasta claramente con la resistencia exhibida por las plantas ocp3.
Figura 11. Interacción entre OCP3 y ABI1. Crecimiento de levaduras portando las diferentes combinaciones de plásmidos en medio selectivo con y sin histidina y diferentes concentraciones de 3AT, un inhibidor de HIS3. Solamente la levadura que produce las proteínas de fusión OCP3-AD y ABI1-BD es capaz de crecer en ausencia de histidina y concentraciones altas de 3AT, indicando que ambas proteínas interaccionan.
Figura 12. Ensayo de resistencia frente a B. cinerea de plantas Col-0, ocp3, Ler, abi1-1 y ocp3abi1-1. (A) Fotografías representativas de la lesión desarrollada por el hongo a las 72 horas de la infección en los diferentes genotipos. (B) Medida del diámetro de la necrosis producida por B.cinerea en los diferentes genotipos. En la gráfica se representa la media de las medidas. Las barras de error representan la desviación estándar. Los asteriscos indican diferencias significativas con respecto al control Col-0.
Figura 13. Vectores VIGS utilizados en los ensayos. El vector TRV ARN2-LePDS utilizado como control de silenciamiento en los ensayos es idéntico al TRV ARN2-LeOCP3 pero sustituyendo LeOCP3 por LePDS.
Figura 14. Alineamiento de las secuencias de los ADNc del gen OCP3 de A.thaliana y sus ortólogos de patata y tomate realizado con el programa CLUSTAL W (1.83). Los asteriscos indican los nucleótidos conservados en las 3 especies.
Figura 15. Ensayo de resistencia a la sequía en tomates Microtom silenciados para LeOCP3 mediante tecnología VIGS. Las fotografías muestran una representación de la notable resistencia de las plantas de tomate Microtom agroinfiltradas con los vectores TRV ARN1 + TRV ARN2-LeOCP3 (derecha) respecto a los controles agroinfiltrados con los vectores TRV ARN1 + el TRV ARN2 vacío (izquierda).
Exposición detallada de un modo de realización Crecimiento de las plantas y material vegetal utilizado
Las plantas se crecieron en sustrato compactado Jiffy-7 (Clause-Tezier Iberica, Valencia, España) a 23ºC con un fotoperiodo de 10 horas de luz y 14 de oscuridad. Para el cultivo in vitro se esterilizaron las semillas añadiendo etanol 70% durante 2 minutos y lejía comercial al 30% durante 7 minutos. Posteriormente se realizaron 5-7 lavados con agua estéril y se estratificaron a 4ºC durante 4 días. El medio de cultivo empleado fue Murashige & Skoog (MS) (Sigma) suplementado con sacarosa (10 g/L) y Agargel (Sigma) en los casos indicados. Las plantas se crecieron durante los periodos de tiempo indicados a 22ºC, un fotoperiodo de 16 horas de luz y 8 de oscuridad, con una intensidad lumínica de 150-200 \muEm^{-2} sec^{-1}.
Se emplearon los mutantes en fondo genético del ecotipo Col-0 de A. thaliana (L.) Heynh.: ocp3 y aba2-1, y el mutante abi1-1 en fondo genético del ecotipo Lansberg erecta (Ler).
Las plantas de tomate fueron crecidas tal y como se describe en Coego et al. (2005ª).
Construcciones génicas
La construcción empleada en el rastreo por doble híbrido en levadura se generó donando el ADNc de OCP3 en el vector pAS2.1 (Clontech) amplificado con los cebadores OCP3-1 con la secuencia identificada como SEC. ID. NO. 19; y OCP3-2 con la secuencia identificada como SEC. ID. NO. 20; que generan sitios de corte EcoRI y SmaI respectivamente.
Para el clonaje del gen LeOCP3 y el fragmento LeOCP3* se diseñaron cebadores que incluían sitios de corte para las enzimas de restricción SacI y NcoI en los extremos 5' y 3' respectivamente:
1
Para las reacciones de amplificación por PCR se empleó la Pwo SuperYield DNA Polymerase (Roche). Las condiciones utilizadas para las diferentes reacciones de 5 PCR se detallan en la siguiente tabla:
2
Los productos de PCR obtenidos fueron digeridos con las enzimas de restricción correspondientes y ligados en los vectores indicados utilizando T4 DNA Ligase (New England Biolabs). Posteriormente se comprobaron las construcciones mediante secuenciación.
Ensayos de deshidratación y aplicación de ABA exógeno
Las plantas fueron crecidas durante 2-3 semanas en medio MS-Agar suplementado con 10 g/L de sacarosa. Para los experimentos de deshidratación, las plantas fueron depositadas en placas Petri. Como tiempo 0 se utilizaron plantas recolectadas directamente de las placas de MS-Agar. En el caso de los experimentos de aplicaciones exógenas de ABA, las plantas fueron transferidas a 50 mL de medio MS líquido en agitación suplementado con 10 g/L de sacarosa y en los casos indicados con 150 \muM de ABA (Sigma). Al cabo de los diferentes tiempos, se tomaron 4-5 plantas por genotipo (150 mg aproximadamente) eliminando los restos de medio y se congelaron en nitrógeno líquido.
Ensayo de desecación
Para estos ensayos, se utilizaron plantas de 6 semanas de edad crecidas en condiciones de día corto. Se cortaron 5-6 hojas de roseta de 3 plantas por genotipo y se colocaron en placas Petri. Se colocaron las placas en una cabina de flujo laminar y se hicieron pesadas secuenciales a los 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 75, 90, 120, 150 y 180 minutos. Para cada genotipo se generaron tres réplicas independientes de plantas diferentes. Se representó la media de los porcentajes de pérdida de peso de las tres réplicas junto con sus desviaciones estándar, tomando como 100% el peso inicial. Se repitió el ensayo tres veces con resultados comparables.
Análisis de la expresión génica por RT-PCR
Para la determinación de las cantidades relativas de algunos mARN de interés se utilizó la técnica de RT-PCR semicuantitativa. Para las extracciones de ARN se partió de aproximadamente 150 mg de tejido utilizando Trizol (Invitrogen) siguiendo el protocolo de la compañía. El ARN total fue resuspendido en 50 \muL de agua libre de ARNsa. El ARN (5 \mug) fue retrotranscrito usando el kit Revertaid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas) con los cebadores Random Hexamer Oligonucleótidos suministrados en el kit. A partir del ADNc obtenido se realizaron las diferentes PCRs con cebadores específicos para cada gen en un termociclador PTC-100 Peltier Thermal Cycler. Los productos de las RT-PCR fueron separados en un gel de agarosa al 3% en TAE 1X. Los cebadores utilizados para el caso de muestras derivadas de Arabidopsis thaliana se muestran en la siguiente tabla:
3
PCR en tiempo real
Las muestras fueron analizadas por triplicado y las reacciones de PCR en tiempo real se realizaron usando Sybr Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) en un detector de secuencias ABI PRISM 7000. Los cebadores directo y reverso fueron diseñados usando el paquete informático Oligonucleótido express software. Las Ct que proporciona el software del equipo se usaron para el análisis de la expresión utilizando el programa Excel 5.0 calculando los valores 2
\circun{1}
^{(40-Ct)} y normalizándolos respecto al gen de referencia Actina8. Las secuencias de los cebadores utilizados son:
4
Ensayos de resistencia a sequía
20 plantas por genotipo fueron crecidas en condiciones de día corto durante 6 semanas regándolas 2 veces por semana con solución nutritiva y colocadas al azar en diferentes bandejas. Al cabo de este tiempo se dejaron de regar y a los 12 días se tomaron fotografías representativas de cada genotipo. A continuación se estableció de nuevo el riego y a las 48 horas se tomaron de nuevo fotografías representativas.
Ensayos de infección con B.cinerea
Para las inoculaciones se utilizaron plantas de 5-6 semanas de edad crecidas en condiciones de día corto. Se inocularon 5-6 hojas/planta con 5 \muL de una suspensión de esporas a una concentración final de 10^{6} esporas/mL. Las plantas inoculadas se mantuvieron en una atmósfera de elevada humedad ambiental y se midió el diámetro de la lesión producida por el hongo a las 72 horas de la inoculación. Se utilizaron 20 plantas por genotipo y los experimentos se realizaron un mínimo de tres veces.
Rastreo por doble híbrido en levadura
Para la búsqueda de interactores de OCP3, se realizó un rastreo por doble híbrido en levadura, utilizando una genoteca de ADNc de A. thaliana en el vector pACTII (Clontech) transformada en la cepa de levadura PJ69-4\alpha, expresando así las proteínas como fusiones al dominio activador de GAL4 (GAL4AD). Como cebo se utilizó el ADNc de OCP3 expresado en la levadura PJ69-4A como fusión al dominio de unión a GAL4 (GAL4BD) en el vector pAS2-1 (Clontech) empleando el método descrito por Soellick y Uhrig para determinar las interacciones. La selección se realizó mediante ensayos de crecimiento de las levaduras en medio sin histidina y con diferentes concentraciones de 3-amino-triazol (3AT). Para reconfirmar los clones positivos se extrajeron los plásmidos de las levaduras, se transformó E.coli, se secuenciaron y posteriormente se retransformó la levadura y se comprobó de nuevo la interacción.
Medida de la apertura estomática
Para la determinación de las aperturas de los estomas, se emplearon hojas de roseta totalmente expandidas de plantas de 6 semanas de edad crecidas en condiciones de día corto. Primero se incubaron las hojas durante 2 horas en un tampón inductor de la apertura (Mes 10 mM ajustando el pH a 6,15 con KOH, KCl 30 mM). Se incubaron hojas con ese mismo tampón suplementado con ABA 100 \muM (Sigma) para inducir el cierre de los estomas. Se tomaron 10 fotografías de diferentes peelings de hojas para cada genotipo, tiempo y tratamiento con ayuda de una cámara digital Nikon DXm1200F acoplada a un microscopio Nikon Eclipse E600 y utilizando el software Act-1 (Nikon). Las medidas se realizaron según las consideraciones descritas en Ichida et al., empleando el software libre ImageJ 1.36b (Broken Simmetry software). Los experimentos se realizaron 5 veces con resultados similares.
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<220>
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<223> cebador OCP3 directo
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<400> 13
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aagctgggcg tcgtaaaact agta 
\hfill
24 
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<210> 14
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<211> 24
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<212> DNA
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<213> Artificial
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<220>
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<223> cebador OCP3 reverso
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<400> 14
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tggcggtttt tcatctggta gtgt 
\hfill
24 
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<210> 15
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<211> 22
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<212> DNA
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<213> Artificial
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<220>
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<223> cebador ABI1 directo
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<400> 15
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gtcgagatcc attggcgata ga 
\hfill
22 
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<210> 16
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<211> 21
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<212> DNA
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<213> Artificial
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<220>
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<223> cebador ABI1 reverso
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<400> 16
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tgccatctca cacgcttctt c 
\hfill
21 
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<210> 17
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<211> 23
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<212> DNA
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<213> Artificial
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<220>
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<223> cebador ACT8 directo
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<400> 17
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agtggtcgta caaccggtat tgt 
\hfill
23 
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<210> 18
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<211> 24
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<212> DNA
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<213> Artificial
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<220>
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<223> cebador ACT8 reverso
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gaggatagca tgtggaagtg agaa 
\hfill
24 
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<211> 21
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<212> DNA
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<213> Artificial
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<223> cebador OCP3-1
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gaattcatga taaaagccat g 
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21 
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<210> 20
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<211> 24
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<212> DNA
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<213> Artificial
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<220>
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<223> cebador ocP3-2
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<400> 20
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gttaacatta gatcacccgg gagc 
\hfill
24

Claims (4)

1. Uso de la mutación ocp3 de pérdida de función del gen OCP3, en especies vegetales de interés agronómico e industrial, como regulador de la respuesta de las plantas frente a sequía, para conferir resistencia a sequía o tolerancia a la sequía incrementada.
2. Uso de la mutación ocp3 de pérdida de función del gen OCP3 según la reivindicación 1, para conferir resistencia a sequía en plantas mediante la inhibición de su expresión mediante silenciamiento génico.
3. Uso de la mutación ocp3 de pérdida de función del gen OCP3 según la reivindicación 1, para conferir resistencia a sequía en plantas mediante la pérdida de su funcionalidad mediante mutagénesis química.
4. Plantas modificadas genéticamente, en las que el gen OCP3 se ha manipulado para la inhibición de su expresión o para la pérdida de su funcionalidad, confiriéndolas resistencia a sequía o tolerancia a la sequía incrementada.
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