WO2005080577A2 - Verfahren zur modulation gibberellinsäure-abhängiger prozesse in pflanzen - Google Patents

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WO2005080577A2
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Helmut BÄUMLEIN
Jens Tiedemann
Rumen Ivanov
Wim Reidt
Mats ELLERSTRÖM
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Ipk - Institut Für Pflanzengenetik Und Kulturpflanzenforschung
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8291—Hormone-influenced development
    • C12N15/8297—Gibberellins; GA3
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants

Definitions

  • the present invention relates to a method for modulating gibberellic acid-dependent processes in transgenic plants.
  • the invention relates to a method for the inhibition of gibberellic acid-dependent processes in transgenic plants by the transgenic expression of a negative transcription regulator of gibberellic acid-controlled processes.
  • the invention further relates to transgenic plants and plant cells which have repressed gibberellic acid-dependent processes compared to wild type plants or cells, and also to transgenic harvest products and transgenic nutrient material of these transgenic plants.
  • Gibberellic acid gibberellic acid (GA) belongs to the group of phytohormones which, like animal hormones, are characterized by the fact that they are organic in nature, are formed in small quantities and their place of formation and action within an organism are different. In contrast to animal hormones, the phytohormones have a low organ and activity specificity. The phytohormones have an effect on various metabolic processes in the plant, such as growth or flower induction.
  • auxins In addition to gibberellins, four other main groups of plant hormones are known: auxins, cytokinins, abscisins and ethylene.
  • the auxins and cytokinins have a mainly positive effect on physiological processes, while the abscisins and ethylene have a rather negative effect on the metabolic processes of the plant.
  • the hormones of different groups do not act separately, but also influence the activity of the other hormone groups, so that the physiological response ultimately depends on the ratio of the positive and negative hormones.
  • Gibberellic acid 3 was isolated from the fungus pathogen Gibberellafujikori in the 20s of the 20th century, the rice infested and a strong one Stretching triggers, which results in the rice grains becoming smaller and the yield lower. It was later found that the active substances are found not only in this fungus, but also endogenously in plants, where they perform various functions. Since then, at least 125 members of the Gibberellin family have been identified, of which around 30% are biologically active. All higher plants contain at least one, but usually several Gibberellins. The highest gibberellin concentrations can be detected in young and immature tissues that are developing rapidly.
  • Gibberellin family Common to all members of the Gibberellin family is a Gibbs skeleton, which is a four-ring diterpene and is formed from four isoprene units through a series of cyclization and oxidation reactions.
  • a key enzyme for the synthesis of gibberellins is GA20 oxidase, the expression of which is regulated by GA feedback. Degradation of the gibberellins, however, is initiated by a 2ß-hydroxylation, which is catalyzed by the GA2 oxidase.
  • the main effect of Gibberellins is to promote stretching growth by stimulating cell division and stretching. This becomes particularly clear when dwarf mutants, e.g. B. of bean or corn, in which the biosynthesis of gibberellins is genetically blocked, are treated with exogenous gibberellins, which can trigger normal extension growth.
  • the gibberellins act synergistically with the auxins, which are also capable of promoting the biosynthesis of the gibberellins.
  • Another important function comes from the Gibberellins in seed germination, e.g. B. the barley, too.
  • GA is synthesized and released by the skutellum of the embryo and stimulates the production of the starch-digesting enzyme ⁇ -amylase and other hydrolytic enzymes by the aleurone.
  • the simple sugars created by the activity of the enzymes are absorbed by the scutellum and serve as growth substances for the embryo.
  • the ⁇ -amylase This stimulation of transcription is inhibited by the antagonistic hormone abscisic acid, which induces dormancy and the effect of which must be overcome by increasing the GA concentration.
  • Parthenocarpy fruit formation without gamete population, such as occurs in apples, grapes and pumpkins, can also be triggered by GA administration.
  • Gibberellins are also able to break bud rest. This occurs naturally through a cold-induced, gradual increase in the Gibberellin concentration during dormancy, so that after a certain threshold value is exceeded, the inhibitory effect of the abscisic acid is overcome.
  • GA binds extracellularly to its receptor and initiates an intracellular signaling pathway which ultimately leads to a change in gene expression.
  • Components of this pathway have been identified by mutants that show altered growth. Mutants that are characterized by dwarf growth have Components that positively influence the GA effect, while mutants with increased growth are likely to affect negative regulators of the GA response (Olszewski et al. (2002) The Plant Cell, Supplement, S61-S80).
  • GAMYB is a GA-induced Myb transcription factor that binds to the GA “response element” (GARE) in the promoter, for example of ⁇ -amylase, and stimulates its expression.
  • GARE proliferative protein activator
  • the RGA / GAI proteins were identified as negative regulators of the GA pathway throughout plant development.
  • the members of this family act as transcriptional regulators and are inactivated by an active GA signaling pathway by being destabilized.
  • the transcription factor HRT and the putative O-GlnAc protein transferase SP Y also act as negative regulators or repressors of the GA route.
  • GA inhibition is also used in the cultivation of ornamental plants such as chrysanthemums or poinsettias, which after treatment with inhibitors of the GA Synthesis Remains Shorter and Sturdier
  • ornamental plants such as chrysanthemums or poinsettias
  • Other economic uses of GA inhibition related to plant growth are in the treatment of trees in populated areas where reduced growth is desired and in the treatment of golf lawns.
  • the objects of the present invention are achieved by the provision of a method for modulating GA-dependent processes in transgenic plants and plant cells by the transgenic expression of certain transcription regulators, which are also referred to in the art as ET factors and which are negative regulators of GA-dependent processes , Genes for such repressors have been isolated from Viciafaba, Brassica napus and Arabidopsis thaliana.
  • the regulators according to the invention are characterized by one or more highly conserved C-terminal protein domains with a typical cysteine pattern of the structure:
  • the invention thus relates to a method for inhibiting GA-dependent processes in transgenic plants and plant cells, which is characterized in that a DNA sequence which codes for a protein contains one or more repeats of the amino acid sequence
  • Xi is preferably G, X 4 is L, X 13 is P, X 14 is V and / or X 7 is R.
  • Xi is particularly preferably G; at X 2 around V or F, preferably around V; at X 3 around I or K; at X 4 around L; at X 5 around D, P, H, C or Y; at X 6 around D, E or N, preferably around D or N; at X 7 around M or G; at X 8 around S, V, E, L or I, preferably around S; at X around I, R, P or V; at X 10 around S, R, N or E; at Xu around K, R or S, preferably around K; at X 12 around M, K, T, R or S; at X 13 around P; at X ⁇ um V; at X 15 around G, S, P or K; at X 16 around K, G or R, preferably around G; at X ⁇ 7 around R; at X 18 around V or K, preferably around K; at X ⁇ around N, E or Q, preferably around E; and / or for X 20 around E or D, preferably
  • the objects of the present invention are achieved by providing a method for inhibiting GA-dependent processes in transgenic plants and plant cells, a DNA sequence selected from the group consisting of: i. DNA sequences comprising nucleotide sequences derived from SEQ ID No. 1, 3 or 5 or fragments thereof are encoded, ii. DNA sequences comprising nucleotide sequences which are suitable for proteins with the in SEQ ID No. Encode 2, 4 or 6 of the given amino acid sequence or fragments thereof, iii. DNA sequences that belong to one of the sequences shown in SEQ ID No. 1, 3 or 5 specified nucleotide sequences have a sequence identity of at least 80%, and / or iv. DNA sequences comprising nucleotide sequences which hybridize under stringent conditions with a complementary strand of a nucleotide sequence from i) to iii) which codes for a protein which has one or more repeats of the amino acid sequence
  • Xi is preferably G
  • X is L
  • X 13 is P
  • X ⁇ 4 is V and / or X ⁇ is R.
  • Xi is particularly preferably G; at X 2 around V or F, preferably around V; at X around I or K; at X 4 around L; at X 5 around D, P, H, C or Y; at X 6 around D, E or N, preferably around D or N; at X 7 around M or G; at X 8 around S, V, E, L or I, preferably around S; at X 9 around I, R, P or V; at X 10 around S, R, N or E; at X ⁇ around K, R or S, preferably around K; at X ⁇ around M, K, T, R or S; at X 13 around P; at X ⁇ 4 around V; at X 15 around G, S, P or K; at X ⁇ 6 around K, G or R, preferably around G; at X ⁇ by R; at X ⁇ 8 around V or K, preferably around K; at X ⁇ around N, E or Q, preferably around E; and / or for X 20 around E or D,
  • the DNA sequence comes from Brassica napus.
  • the invention also relates to isolated nucleic acid molecules which have a nucleotide sequence which is selected from the group consisting of: i. DNA sequences comprising nucleotide sequences derived from SEQ ID No. 1 or fragments thereof are encoded, ii. DNA sequences comprising nucleotide sequences which are suitable for proteins with the in SEQ ID No. 2 encode specified amino acid sequence or fragments thereof, iii. DNA sequences that correspond to those in SEQ ID No. 1 indicated nucleotide sequence have a sequence identity of at least 80%, and / or iv.
  • DNA sequences comprising nucleotide sequences which hybridize under stringent conditions with a complementary strand of a nucleotide sequence from i) to iii), contain as well as recombinant ET proteins that are encoded by these nucleic acid sequences.
  • the invention also relates to the inhibition of the expression of the ET proteins, which leads to an increase in the processes dependent on gibberellic acid.
  • Suitable methods for inhibiting the expression of proteins are known to the person skilled in the art and include RNA interference, antisense and co-suppression methods.
  • cysteine domain of the ET proteins with the amino acid sequence C-X ⁇ -X2-X 3 -X -X5-X6- 7- 8 -X9 "-X ⁇ o" ⁇ 1-X12- 1 3- 1 4- 1 5- 1 6-X1 7 -X 1 8-R -X 19 -X 2 0-HK-GMR, where Xi to X 20 are any amino acids, to be expressed transgenically by "titration "of interacting factors or by binding to the corresponding binding sites in the promoter acts as a dominant negative regulator.
  • gibberellic acid-dependent process in the sense of the invention denotes a physiological or molecular or biochemical process within the plant or plant cell that is regulated by gibberellic acid. Examples of such processes have been mentioned in the introduction and can also be found in the literature. Such processes include GA-mediated activation at the transcriptional level.
  • Gibberellic acid are regulated in the transgenic plant compared to wild type plants by at least 20% or 35%, particularly preferably by at least 50% or 65%, particularly preferably reduced by at least 80% or 85% and most preferably by at least 90% or 95%.
  • Xi is preferably G, X 4 is L, X ⁇ 3 is P, X ⁇ 4 is V and / or X ⁇ is R.
  • Xi is particularly preferably G; at X 2 around V or F, preferably around V; at X 3 around I or K; at X 4 around L; at X 5 around D, P, H, C or Y; at X 6 around D, E or N, preferably around D or N; at X 7 around M or G; at X 8 around S, V, E, L or I, preferably around S; at X 9 around I, R, P or V; at X 10 around S, R, N or E; for Xu around K, R or S, preferably around K; at X 12 around M, K, T, R or S; at X ⁇ 3 around P; at X 14 around V; at X ⁇ 5 around G, S, P or K; at X ⁇ 6 around K, G or R, preferably around G; at X ⁇ 7 around R; at X ⁇ 8 around V or K, preferably around K; at X ⁇ 9 around N, E or Q, preferably around E; and / or for X 20 around
  • fragment of DNA refers to portions of DNA that encode a protein that repeats one or more amino acid sequences
  • fragments of the protein refers to portions of the protein that are one or more repeats of the amino acid sequence
  • Xi is preferably G, X 4 is L, X 13 is P, X ⁇ 4 is V and / or X ⁇ is R.
  • Xi is particularly preferably G; at X 2 around V or F, preferably around V; at X 3 around I or K; at 4 ⁇ m L; at X 5 around D, P, H, C or Y; at X 6 around D, E or N, preferably around D or N; at X around M or G; at X 8 around S, V, E, L or I, preferably around S; at X 9 around I, R, P or V; at X 10 around S, R, N or E; for Xu around K, R or S, preferably around K; at X12 around M, K, T, R or S; at X ⁇ 3 around P; at X ⁇ 4 around V; at X ⁇ 5 around G, S, P or K; at X ⁇ 6 around K, G or R, preferably around G; at X ⁇ around R; at X ⁇ 8 around V or K, preferably around K; at X ⁇ 9 around N, E or Q, preferably around E; and / or for X 20 around E
  • hybridization under stringent conditions in the context of this invention means that the hybridization in vitro under Conditions are carried out that are stringent enough to ensure a specific hybridization.
  • stringent hybridization conditions are known to the person skilled in the art and can be found in the literature (Sambrook and Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York).
  • “specifically hybridize” means that a molecule binds preferentially to a certain nucleotide sequence under stringent conditions if this sequence is present in a complex mixture of (eg total) DNA or RNA.
  • stringent conditions generally stands for conditions under which a nucleic acid sequence will preferentially hybridize to its target sequence and to a significantly lesser extent or not at all to other sequences. Stringent conditions are in some cases sequence-dependent and become different under different circumstances Longer sequences hybridize specifically at higher temperatures
  • T m the thermal melting point
  • the T m is the temperature (under defined ionic strength, pH and nucleic acid concentration) at which 50% of the molecules complementary to the target sequence hybridize to the target sequence in the equilibrium state.
  • stringent conditions are those in which the salt concentration is at least about 0.01 to 1.0 M sodium ion concentration (or other salt) at a pH between 7.0 and 8.3 and the temperature is at least 30 ° C for short molecules (e.g. 10-50 nucleotides).
  • stringent conditions can be achieved by adding destabilizing agents such as formamide.
  • Typical hybridization and washing buffers have the following composition, for example: Pre-hybridization solution: 0.5% SDS 5x SSC 50 mM NaPO 4 , pH 6.8 0.1% Na pyrophosphate 5x Denhardt's solution 100 ⁇ g / ml salmon sperm
  • Hybridization solution prehybridization solution lxlO 6 cpm / ml probe (5-10 min 95 ° C)
  • Denhardt's reagent 5 g Ficoll 5 g polyvinylpyrrolidone 5 g Bovine Serum Albumine ad 500 ml A. dest.
  • Prehybridization at least 2 h at 50-55 ° C
  • sequence identity in the sense of the invention denotes an identity over the entire coding sequence to one of the nucleic acid sequences given in SEQ ID No. 1, 3 or 5 of at least 80%, preferably at least 85%, particularly preferably at least 90, 91 , 92, 93 or 94% and most preferably at least 95, 96, 97, 98 or 99%
  • sequence identity within 600 base pairs is one of those in SEQ ID No. 1, 3 or 5 starting from the 3 'end specified nucleotide sequences at least 90%, preferably at least 92%, particularly preferably at least 94%, particularly preferably at least 96% and most preferably at least 98% to one of the sequences given in SEQ ID No.
  • Sequence identity is determined by a number of programs based on different algorithms. The algorithms from Needleman and Wunsch or Smith and Waterman deliver particularly reliable results. For the sequence comparisons, the PileUp program (Feng and Doolittle (1987) J. Mol. Evolution 25: 351-360; Higgins et al. (1989) CABIOS 5: 151-153) or the programs Gap and Best Fit (Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443-453 and Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482-489) used in the GCG software package (Genetics Computer Group, 575 Science Drive , Madison, Wisconsin, USA) are included. The sequence identity values given above in percent were determined with the GAP program over the entire sequence range with the following settings: Gap Weight: 50, Length Weight: 3, Average Match: 10000 and Average Mismatch: 0.000.
  • Nucleic acid sequences that differ from the nucleic acid sequences given in SEQ ID No. 1, 3 or 5 can e.g. by introducing one or more nucleotide substitutions, additions or deletions into a nucleotide sequence of SEQ ID No. 1, 3 or 5 are generated, so that proteins are formed, in which compared to the in SEQ ID No. 2, 4 or 6 specified sequence one or more amino acid substitutions, additions or deletions were introduced. Mutations can be found in one of the sequences of SEQ ID No. 1, 3 or 5 by standard techniques such as site-specific mutagenesis and PCR-mediated mutagenesis. Conservative amino acid substitutions are preferably made on one or more of the predicted non-essential amino acid residues, that is to say on amino acid residues which have the activity of a negative one
  • Regulators do not affect Gibberellin-dependent processes.
  • conservative amino acid substitution an amino acid residue is exchanged for an amino acid residue with a similar side chain.
  • Families of amino acid residues with similar side chains have been defined in the art. These families include amino acids with basic side chains (e.g. lysine, arginine, histidine), acidic side chains (e.g. aspartic acid and glutamic acid), uncharged polar side chains (e.g. glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine), non-polar side chains (e.g.
  • a predicted non-essential amino acid residue in the ET factor used according to the invention is thus preferably the same from another amino acid residue
  • the mutations can be introduced randomly over all or part of the sequence coding for the ET factor, e.g. by saturation mutagenesis, and the resulting mutants can be screened for the activity of a negative regulator of gibberellin-dependent processes by recombinantly expressing the encoded protein to identify mutants that have retained this activity.
  • the activity of the protein can e.g. can be determined using the tests described here.
  • the easiest way to determine the activity of a negative regulator of Gibberellin-dependent processes is to introduce the DNA that codes for this regulator, together with a reporter gene that is under the control of a GA-dependent promoter, into the plant cells and either treated with GA or left untreated.
  • a control wild-type cells are transfected with the same reporter gene construct and left stimulated or left unstimulated. If the expression of the reporter gene is not induced by the addition of GA in the cells that have been transfected with the DNA to be tested, while it is induced in the wild-type cells, the transfected DNA is a negative regulator of gibberellin-dependent processes.
  • Suitable reporter genes are, for example, the ß-glucuronidase (GUS) gene from E. coli, a fluorescence gene such as the green fluorescence protein (GFP) gene from Aequoria victoria, the luciferase gene from Photinus pyralis or the ⁇ -galactosidase (lacZ) gene from E. coli.
  • GUS ß-glucuronidase
  • FFP green fluorescence protein
  • lacZ ⁇ -galactosidase
  • Suitable GA-dependent promoters are known to the person skilled in the art and can be found in the literature. For example, it is the promoter of the aquaporin gene (Kaldenhoff R. et al. (1996) Journal of Photochemistry Photobiology 36 (3): 351-354), of the cytosolic glutamine synthetase gene (Gomez-Maldonado et al. ( 2004) Planta 218 (6): 1036-1045), the A121 gene from wheat (Cejudo et al. (1992) Plant Mol. Biol. 20 (5): 849-856) and the ⁇ -amylase gene from barley (Gubler and Jacobsen (1992) Plant Cell 4 (11): 1435-1441).
  • the controlled expression of the regulators or ET factors according to the invention in transgenic plants offers the possibility of influencing gibberellic acid-dependent processes in the plant, so that the external administration of chemical GA-
  • the changed expression of the ET factors in transgenic plants has various positive effects due to the influence of gibberellic acid-dependent processes.
  • stretching growth can generally be inhibited, which is particularly important for increasing the yield of cereals such as wheat or rice, because the transgenic plants invest less nutrients in the growth and more in the development of the reproductive organs.
  • Inhibition of stretching growth is also useful in trees and grasses where lower growth is desired, such as. B. golf lawn.
  • the present invention can also prevent the unwanted germination of seeds and tubers. This is used, among other things, in grain farming to avoid the "preharvest sprouting" syndrome, the sprouting on the ear.
  • transgenic expression of the ET factors also offers the possibility of influencing the flowering and thus also the fruiting in various useful plants.
  • gibberellic acid-dependent processes such as stretching growth, germination and
  • Fruit formation in the transgenic plants are influenced, this preferably being done by overexpression of the gene which codes for regulators of the ET family (as defined in claim 1) in the transgenic plants or plant cells.
  • plants can be produced which show less stretching growth than the wild type plants and are therefore more productive and more resistant to wind and rain. Plants can also be modified Germination behavior are generated, which also leads to an increase in yield. Further applications are already listed above and also result from the natural processes as they are controlled by GA.
  • transformation systems The basic requirement for the production of such crops is the availability of suitable transformation systems.
  • a wide range of transformation methods have been developed and established here over the past two decades. These techniques include the transformation of plant cells with T-DNA using Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes as transformation agents, the fusion of protoplasts, the direct gene transfer of isolated DNA into protoplasts, the injection and electroporation of DNA into plant cells, the introduction of DNA using biolistic Methods and other options.
  • transformation techniques are known to the person skilled in the art or can be found in overview articles or corresponding reference works.
  • the person skilled in the art can find further corresponding DNA sequences from other organisms by means of conventional molecular biological techniques and within the framework of the present invention.
  • the person skilled in the art can derive suitable hybridization probes from the ET sequences according to the invention and use them for the screening of cDNA and / or genomic banks of the desired organism, that is, B. potatoes or cereals from which a new ET gene is to be isolated.
  • Suitable primer pairs for the amplification of ET genes are, for example:
  • Primer pair ET1 (optimal attachment temperature: 53 ° C): ETla-new 5 'ATGTTCAAGAGACGACTACATTCG 3' ETlb 5 'AAGATGTCATTCTCATCCCCTTGTGC 3'
  • Suitable PCR conditions for the amplification of ET genes with the primer pairs listed above are:
  • hybridization probes or oligonucleotide primers will be selected such that they comprise the nucleic acid sequence coding for the amino acid sequence motif specified in claim 1.
  • the hybridization probes or oligonucleotide primers will be selected such that they comprise the nucleic acid sequence coding for the amino acid sequence motif specified in claim 1.
  • the proteins isolated in this way can be tested as described above in reporter gene assays with regard to their activity as a negative regulator of Gibberellin-dependent processes.
  • the invention further relates to recombinant nucleic acid molecules, comprising the following elements in a 5 '-3' orientation:
  • a DNA sequence which codes for a transcription regulator according to the invention operatively linked to it a DNA sequence which codes for a transcription regulator according to the invention, - If necessary, operationally linked regulatory sequences which can serve as transcription, termination and / or polyadenylation signals in the plant cell.
  • the coding nucleic acid sequence is in operative linkage with a promoter active in plants, as in the native gene, that is to say in a 5 '-3' orientation , In this way, an overexpression of the coding sequence in the transgenic plants can be achieved.
  • operably linked thereto means that the nucleotide sequence of interest is linked to the regulatory sequence (s) in such a way that expression of the nucleotide sequence is possible and the two sequences are linked to one another in such a way that they predict the predicted sequence Perform function.
  • Suitable regulatory sequences which control the transcription of an operatively linked DNA sequence according to the invention in the transformed plant or plant cell are well known to the person skilled in the art and can be isolated using methods of the prior art or taken from the databases and the literature.
  • the promoter can be selected so that the expression is constitutive or is only switched on in specific tissues and / or at a specific time in plant development and / or at a time determined by external influences, biotic or abiotic stimuli (induced gene expression).
  • the promoter can be homologous or heterologous with respect to the plant to be transformed.
  • cell-specific or tissue-specific expression can also be achieved in that the gene expression is inhibited in the cells or tissues in which it is not desired, for example by expressing antibodies which bind the gene product and thus inhibit its activity, or by suitable inhibitors.
  • the person skilled in the art can find constitutive or tissue or development-specific or inducible genes or promoters from the prior art, in particular from the relevant scientific journals and databases.
  • the average person skilled in the art is able to isolate other suitable promoters using routine methods. So the expert can with the help of common molecular biological methods, for. B. hybridization experiments or DNA-protein binding studies, e.g. B. Identify tissue-specific regulatory nucleic acid molecules.
  • a certain tissue e.g. B. a storage organ, the desired organism from which the regulatory sequences are to be isolated, the entire poly (A) + RNA isolated and a cDNA bank created from it.
  • cDNA clones based on poly (A) + RNA molecules from a non-storage organ tissue are used to identify those clones from the first bank by hybridization whose corresponding poly (A) + - RNA molecules are merely accumulate in the tissue of the storage organ. With the help of these cDNAs identified in this way, promoters are isolated which have regulatory organ-specific storage elements.
  • Suitable promoters for use in the methods according to the invention are constitutive promoters such as the CaMV35S, the octopine synthase, the nopaline synthase or the ubiquitin promoter.
  • Suitable inducible promoters are, for example, estrogen-inducible promoters such as are present in the pMDC-GATEWAY ectors (Curtis MD and Grossnikiaus U. (2003) Plant Physiology 133: 462-469).
  • estrogen-inducible promoters such as are present in the pMDC-GATEWAY ectors (Curtis MD and Grossnikiaus U. (2003) Plant Physiology 133: 462-469).
  • the promoter of the class I patatin gene is suitable (Rocha-Sosa M. et al. (1989) EMBO J 8: 23-29).
  • Promoters that are particularly active in fruits include the promoter of the polygalacturonase gene or an ACC oxidase and the 2A11 promoter (Nicholass et al. (1995) Plant Mol. Biol. 28: 423-435; Atkinson et al (1998) Plant Mol. Biol. 38: 449-460; van Haaren et al. (1991) Plant Mol. Biol. 17: 615-630).
  • a cambium-specific promoter such as the CAD promoter can be used to influence the ratio of cellulose and lignin (S. Hawkins et al. (1997) Plant Physiol. 113: 321-325).
  • the recombinant nucleic acid molecules according to the invention can also z. B. Enhancer elements, they may also contain resistance genes, replication signals and other DNA regions that propagate the vectors in bacteria such as. Enable BEcoli.
  • the regulatory elements also include sequences that stabilize the recombinant nucleic acid molecules in the host cells.
  • such regulatory elements comprise sequences which enable stable integration of the recombinant nucleic acid molecule into the host genome of the plant or an autonomous replication of the recombinant nucleic acid molecule in the plant cells.
  • Such regulatory elements are known to the person skilled in the art.
  • transcription or termination sequences are optionally present in the recombinant nucleic acid molecule, which serve to correctly terminate the transcription and can also be used to add a PolyA tail to the transcript, to which a function in stabilizing the transcripts is attributed.
  • Such elements are described in the literature and are interchangeable.
  • a plant expression cassette preferably contains, in addition to the elements described above, other functionally linked sequences, such as translation enhancers, for example the overdrive sequence which comprises the 5'-untranslated leader sequence from tobacco mosaic virus, which increases the protein / RNA ratio contains (Gallie et al. (1987) Nucl. Acids Research 15: 8693-8711).
  • chimeric gene constructs in which the coding DNA sequences are under the control of regulatory sequences which ensure expression in plant cells are produced by means of conventional cloning methods (see, for example, Sambrook and Russell (2001), vide supra).
  • the present invention thus relates to a recombinant nucleic acid molecule comprising: a) regulatory sequences of a promoter active in plant tissues; b) operatively linked to a DNA sequence that codes for an ET regulator; and c) if necessary, operatively linked regulatory sequences which can serve as transcription, termination and / or polyadenylation signals in plant cells.
  • the DNA sequence encoding an ET regulator can be isolated from natural sources or synthesized by known methods.
  • the DNA sequence encoding an active ET protein is selected from the group consisting of: i. DNA sequences comprising nucleotide sequences derived from SEQ ID No. 1, 3 or 5 or fragments thereof are encoded, ii. DNA sequences comprising nucleotide sequences which are suitable for proteins with the in SEQ ID No. Encode 2, 4 or 6 of the given amino acid sequence or fragments thereof, iii. DNA sequences that belong to one of the SEQ ID no. 1, 3 or 5 specified nucleotide sequences have a sequence identity of at least 80%, and / or iv. DNA sequences comprising nucleotide sequences which hybridize under stringent conditions with a complementary strand of a nucleotide sequence from i) to iii).
  • the DNA sequence described coding for an ET protein comes from Brassica napus (as indicated in SEQ ID No. 1).
  • the invention further relates to vectors and microorganisms which contain nucleic acid molecules according to the invention and the use of which enables the production of plant cells and plants in which gibberellic acid-dependent processes are inhibited.
  • the vectors are in particular plasmids, cosmids, viruses, bacteriophages and other vectors which are common in genetic engineering.
  • the microorganisms are primarily bacteria, viruses, fungi, yeasts and algae.
  • the recombinant expression vectors used to express the ET proteins can be active both in prokaryotic and in eukaryotic cells. This is advantageous since intermediate steps of vector construction are often carried out in microorganisms for the sake of simplicity.
  • These cloning vectors contain a replication signal for the corresponding microorganism and a marker gene for the selection of successfully transformed bacterial cells.
  • Vectors suitable for expression in prokaryotic organisms are known to the person skilled in the art, these include, for example in E.
  • the expression vector represents a yeast expression vector or a bacillovirus expression vector.
  • the ET proteins can be found in single-cell plant cells (such as algae), see Falciatore et al., 1999, Marine Biotechnology 1 (3): 239-251 and literature references cited therein, and plant cells from higher plants (for example spermatophytes such as crops) are expressed.
  • plant expression vectors include those described in detail in: Becker, D., Kemper, E., Schell, J., and Masterson, R. (1992) Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197; and Bevan, M.W. (1984), Nucl. Acids Res. 12: 8711-8721; Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, ed .: Kung and R. Wu, Academic Press, 1993, pp. 15-38.
  • a recombinant ET protein in particular an ET protein with SEQ ID No. 2, provided.
  • the invention further relates to a method for producing plants or
  • Plant cells with gibberellic acid-dependent processes inhibited against wild-type plants or plant cells comprising the following steps: a) Production of a recombinant nucleic acid molecule which comprises the following sequences: - regulatory sequences of a promoter active in plants; operatively linked to a DNA sequence encoding an ET protein; and optionally operatively linked to regulatory sequences that can serve as transcription, termination and / or polyadenylation signals in plant cells; b) transfer of the nucleic acid molecule from a) to plant cells; and c) if appropriate, the regeneration of intact plants from the transformed plant cells.
  • the invention further relates to transgenic plant cells which contain the nucleic acid molecules according to the invention which encode an ET protein and in which the amount of the negative regulator is increased in comparison with wild type plants.
  • the invention also relates to transgenic crop products and transgenic propagation material from transgenic plants and to the transgenic plants themselves which contain a nucleic acid molecule according to the invention.
  • Transgenic plants of the present invention have GA-dependent processes inhibited by wild-type plants due to the introduction of an ET coding DNA sequence.
  • Nucleic acid sequences, expression cassettes or vectors are all such constructions which have been obtained by genetic engineering methods and in which either a) the nucleic acid sequence according to the invention, or b) a genetic control sequence functionally linked to the nucleic acid sequence according to the invention, for example a promoter, or c) a) and b)
  • Natural genetic environment means the natural genomic or chromosomal locus in the organism of origin or the presence in a genomic library.
  • the natural, genetic environment of the nucleic acid sequence is preferably at least partially preserved.
  • the environment flanks the nucleic acid sequence at least on one side and has a sequence length of at least 50 bp, preferably at least 500 bp, particularly preferably at least 1000 bp, very particularly preferably at least 5000 bp.
  • a naturally occurring expression cassette - for example the naturally occurring combination of the natural promoter of the ET factor with the corresponding genes which code for the ET factor - becomes a transgenic expression cassette if this is carried out by non-natural, synthetic ("artificial") methods how mutagenization is changed, for example.
  • non-natural, synthetic artificial methods how mutagenization is changed, for example.
  • Corresponding methods are described, for example, in US 5,565,350 or WO 00/15815.
  • transgenic plant or plant cell in the sense of the invention is understood to mean that the nucleic acids used in the method are not in their natural position in the genome of the plant or plant cell, the nucleic acids expressing homologously or heterologously can be.
  • transgene also means that the nucleic acids according to the invention are in their natural place in the genome of an organism, but that the sequence has been changed compared to the natural sequence and / or that the regulatory sequences of the natural sequences have been changed.
  • Transgenic is preferably to be understood as meaning the expression of the nucleic acids according to the invention at a non-natural location in the genome, that is to say that the nucleic acids are homologous or preferably heterologous.
  • nucleic acid sequence used for the production of the transgenic plant or plant cell which codes for an ET factor, may have to be adapted to the organism-specific use of codons.
  • the codon usage can be determined on the basis of computer evaluations of other known genes of the selected organism.
  • cloning vectors which contain a replication signal for E. coli and a marker gene for the selection of transformed bacterial cells.
  • examples of such vectors are pBR322, pUC series, M13mp series, pACYC184 etc.
  • the desired sequence can be introduced into the vector at a suitable restriction site.
  • the plasmid obtained is then used for the transformation of E. co / z cells.
  • Transformed E. co / z ' cells are grown in an appropriate medium and then harvested and lysed, and the plasmid is recovered.
  • Restriction analyzes, gel electrophoresis and other biochemical-molecular biological methods are generally used as analysis methods for characterizing the plasmid DNA obtained. After each manipulation, the plasmid DNA can be cleaved and DNA fragments obtained from it can be linked to other DNA sequences. As already mentioned, a large number of techniques are available for introducing DNA into a plant host cell, and the person skilled in the art can determine the appropriate method in each case without difficulty.
  • plasmids When injecting and electroporation of DNA into plant cells, there are no special requirements per se for the plasmids used. The same applies to direct gene transfer. Simple plasmids such as e.g. B. pUC derivatives can be used. However, if whole plants are to be regenerated from such transformed cells, the presence of a selectable marker gene is recommended.
  • the usual selection markers are known to the person skilled in the art and it is not a problem for him to select a suitable marker.
  • the DNA to be inserted can be cloned into special plasmids, either in an intermediate or in a binary vector.
  • the intermediate vectors can be integrated into the T? I or Ri plasmid of the agrobacteria by means of sequences which are homologous to sequences in the T-DNA by homologous recombination. This also contains the vir region necessary for the transfer of the T-DNA. However, intermediate vectors cannot replicate in agrobacteria.
  • the intermediate vector can be transferred to Agrobacterium tumefaciens using a helper plasma (conjugation).
  • Binary vectors can replicate in E. coli as well as in Agrobacteria. They contain a selection marker gene and a left or polylinker, which are framed by the right and left T-DNA border region. They can be transformed directly into the agrobacteria.
  • the Agrobacterium serving as the host cell is said to contain a plasmid which carries a vir sequence within the T-DNA, which we transfer into the plant cell. Additional T-DNA may be present.
  • the agrobacterium transformed in this way is used to transform plant cells.
  • the use of T-DNA for the transformation of plant cells has been intensively investigated and has been sufficiently described in well-known overview articles and manuals for plant transformation.
  • plant explants can expediently be cultivated with Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes.
  • the infected plant material for example leaf pieces, stem segments, roots, but also protoplasts or suspension-kialtiviert plant cells
  • a suitable medium which Aübiotika or Contain biocides for the selection of transformed cells, whole plants can be regenerated again.
  • Cells are the transformation using the biolistic approach (Wan and Lemaux (1994) Plant Physiol. 104, 37-48; Vasil et al. (1993) Bio / Technology 11, 1553-1558; Ritala et al. (1994) Plant Mol. Biol. 24, 317-325; Spencer et al. (1990), Theor. Appl. Genet. 79, 625-631), the protoplast transformation, the electroporation of partially permeabilized cells and the introduction of DNA using glass fibers.
  • the introduced DNA is integrated into the genome of the plant cell, it is generally stable there and is also retained in the offspring of the originally transformed cell. It normally contains a selection marker which gives the transformed plant cells resistance to a biocide or an antibiotic such as kanamycin, G 418, bleomycin, hygromycin, methotrexate, glyphosate, streptomycin, sulfonylurea, gentamycin or phosphinotricin and others.
  • the individually selected marker should therefore allow the selection of transformed cells from cells that lack the inserted DNA.
  • Alternative markers such as nutritive markers or screening markers (such as GFP, green fluorescent protein) are also suitable for this.
  • selection markers can also be completely dispensed with, but this is associated with a fairly high need for screening. If marker-free transgenic plants are desired, strategies are also available to the person skilled in the art which permit a subsequent removal of the marker gene, for. B. cotransformation or sequence-specific recombinases.
  • the plant cells according to the invention comprise differentiated and undifferentiated plant cells, including protoplasts, which were produced by the method according to the invention and which have integrated the nucleic acid molecules described below into the plant genome or contain them as autonomously replicating molecules.
  • the regeneration of the transgenic plants from transgenic plant cells is carried out according to conventional regeneration methods using known nutrient media.
  • the plants obtained in this way can then be examined using conventional methods, including molecular biological methods, such as PCR, blot analyzes, for the presence of the nucleic acid which codes for an ET protein or for the presence of the gene product, that is to say the ET protein.
  • the transformed cells grow within the plant in the usual way (see also McCormick et al. (1986), Plant Cell Reports 5, 81-84).
  • the resulting plants can be grown normally and crossed with plants that have the same transformed genetic makeup or other genetic makeup.
  • the resulting hybrid individuals have the corresponding phenotypic properties.
  • transgenic lines can be determined using conventional methods, which are homozygous for the new nucleic acid molecules and which investigate their phenotypic behavior with regard to an existing or non-existing pathogen responsiveness and compare it with that of hemizygotic lines.
  • plant cells containing the nucleic acid molecules according to the invention can also be further cultivated as plant cells (including protoplasts, calli, suspension cultures and the like).
  • the transgenic plant or the transgenic plant cells can be any monocot or dicot plant or plant cell in which gibberellic acid-dependent processes are to be inhibited. They are preferably useful plants or cells of useful plants. Ornamental plants or cells of ornamental plants in which bushy growth is desired are also preferred. It is particularly preferably dicotyledonous plants such as timber plants, potatoes, mango, chrysanthemum, poinsettia or monocotyledonous plants such as. B. rice, wheat, grass grass. In principle, any plant is suitable in which a normal reaction to GA leads to undesirable properties.
  • the invention also relates to transgenic propagation material and transgenic harvest products of the plants according to the invention, for example fruits, seeds, tubers, rhizomes, seedlings, cuttings, etc.
  • the invention further relates to cellulose obtained from transgenic timber plants with inhibited gibberellic acid-dependent processes, the Cellulose content compared to wild-type plants is increased, the cellulose being obtained from the timber using methods customary in the paper industry.
  • the specific expression of the ET protein in the plants according to the invention or in the plant cells according to the invention can be detected and monitored with the aid of conventional molecular biological and biochemical methods. These techniques are known to the person skilled in the art and he is easily able to select a suitable detection method, for example a Northern blot analysis for the detection of ET-specific RNA or for determining the amount of the accumulation of ET-specific RNA or a Southern Blot analysis for the detection of DNA sequences coding for ET.
  • a suitable detection method for example a Northern blot analysis for the detection of ET-specific RNA or for determining the amount of the accumulation of ET-specific RNA or a Southern Blot analysis for the detection of DNA sequences coding for ET.
  • EMBL / Genbank accession number J02798 the USP- (EMBL / Genbank accession number X56240) or the legumin B4- (LeB4) Promotors (EMBL / Genbank accession number X03677) from V. faba.
  • the oligonucleotides were designed to yield double-stranded phosphorylated samples with either 3 'recessed ends or BamHI or EcoRI sticky ends after attachment to allow oligomerization by ligation. The concatamerized
  • Oligonucleotides (200 bp average) were labeled by nick translation using ⁇ - [ 32 P] -dNTPs (Amersham International, Amersham, UK). Southwestern screening was performed with an incubation buffer consisting of 25 mM HEPES (pH 8.0), 0.1 mM EDTA, 4 mM KC1, 7% glycerol, 1 mM MgCl 2 , 0.5 mM DTT and 1.0 mM ZnSO 4 was composed.
  • BnET isolated from a Brassica napus seed-specific cDNA library, was amplified by PCR with primers containing additional Ncol sites. The fragment was in cloned and sequenced the pCR script vector (Stratagene). The BnET cDNA was then cloned directly into the binary vector pBinAR (Höfgens R. and Willmitzer L. (1990) Plant Science 66: 221-230). The regeneration of the transgenic plants was carried out as described (Bäumlein, H. et al, (1991) Mol. Gen. Genet. 225: 459-467; Bäumlein, H. et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 225: 121 -128.).
  • plasmid DNA 5 ⁇ g of each plasmid
  • carrier DNA 160 ⁇ g
  • the mixture was added the same amount of PEG solution (40%, PEG 6000, 0.1 M Ca (NO 3 ) 2 , 0.4 M mannitol, 0.1% MES, pH 6.5).
  • PEG solution 50%, PEG 6000, 0.1 M Ca (NO 3 ) 2 , 0.4 M mannitol, 0.1% MES, pH 6.5.
  • the transformed protoplasts were diluted in 4 ml K3 medium and transferred to small petri dishes. After incubation with 10 ⁇ M GA (Duchefa Biochemie, the Netherlands) for 16 to 18 hours at 25 ° C.
  • the GUS reporter gene was used as the reporter construct under the control of the aquaporin promoter (Kaldenhoff R. et al. (1996) Journal of Photochemistry Photobiology 36 (3): 351-354). A control construct that contained the GUS reporter gene under the control of the 35S CaMV promoter was efficiently expressed in this system and used to standardize the various experiments.
  • Fig. 1 Sequence comparison of the zinc-binding domains of the regulators from the species Viciafaba, Brassica napus and Arabidopsis thaliana
  • the lower case letters a to d each represent different motifs within a protein.
  • the bold and underlined amino acids correspond to the amino acids conserved in the consensus motif.
  • Fig. 2 Reduction of the GA induction of the GA-responsive aquaporin promoter (NtAqPl) by the transient expression of BnET in tobacco protoplasts
  • the wild-type control plants of Arabidopsis thaliana (top) and Nicotiana tabacum (bottom) are shown on the left and independent transgenic lines of Arabidopsis thaliana (top) and Nicotiana tabacum (bottom) are shown on the right.
  • the transgenic lines each contain a Nucleic acid molecule that expresses the BnET sense sequence under the control of the 35S CaMN promoter. The pictures of the plants were taken after 30 days in Nicotiana tabacum and after 20 days in Arabidopsis thaliana.
  • Fig. 4 Reduction of germination through ectopic expression of the BnET gene
  • Germination of seeds from wild-type control plants and transgenic tobacco lines which express the BnET transgene under the control of the 35 S CaMN promoter was investigated. While the wild-type seeds germinate 100% within 60 hours, the transgenic seeds only reach a germination rate of about 30% even after 350 hours.
  • Fig. 5 Stem anatomy of tobacco plants that express BnET ectopically compared to wild-type plants
  • the transverse and longitudinal half-thin sections of fixed material show a reduced formation of the secondary cell wall in plants which express BnET ectopically (b, d, f) compared to wild type (a, c, e).
  • the autofluorescence of lignified secondary cell walls from fresh stem sections was detected after excitation with blue light. Compared to the bright signal of the wild type xylem (g), no significant fluorescence signal could be detected in the sections of the plants expressing BnET (h). All microscopic examinations were carried out with at least three different transgenic plants with comparable results.
  • mX, metaxylem; Ph, Phloem; pX, protoxylem. Scale 150 ⁇ m.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Hemmung Gibberellinsäure­abhängiger Prozesse in transgenen Pflanzen durch die Modulation der Expression eines negativen Regulators Gibberellinsäure-gesteuerter Prozesse. Ferner betrifft die Erfindung transgene Pflanzen und Pflanzenzellen, die im Vergleich zu Wildtyppflan­zen bzw. -zellen gehemmte Gibberellinäure-abhängige Prozesse aufweisen, sowie transgene Ernteprodukte und transgenes Vermehrungsmaterial der transgenen Pflan­zen.

Description

Verfahren zur Modulation Gibberellinsäure-abhängiger Prozesse in Pflanzen
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Modulation Gibberellinsäure- abhängiger Prozesse in transgenen Pflanzen. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Hemmung Gibberellinsäure-abhängiger Prozesse in transgenen Pflanzen durch die transgene Expression eines negativen Transkriptionsregulators Gibberellinsaure-gesteuerter Prozesse. Ferner betrifft die Erfindung transgene Pflanzen und Pflanzenzellen, die im Vergleich zu Wildtyppflanzen bzw. -zellen reprimierte Gibberellinsäure-abhängige Prozesse aufweisen, sowie transgene Ernteprodukte und transgenes Nermehrungsmaterial dieser transgenen Pflanzen.
Gibberellinsäure, gibberellic acid (GA), gehört zur Gruppe der Phytohormone, die wie die tierischen Hormone dadurch gekennzeichnet sind, dass sie organischer Natur sind, in geringen Mengen gebildet werden und ihr Bildungs- und Wirkungsort innerhalb eines Organismus verschieden sind. Im Gegensatz zu tierischen Hormonen besitzen die Phytohormone aber eine geringe Organ- und Wirkungsspezifität. Ihre Wirkung entfalten die Phytohormone auf verschiedene Stoffwechselprozesse in der Pflanze, wie etwa Wachstum oder Blüteninduktion.
Neben den Gibberellinen sind vier weitere Hauptgruppen von Pflanzenhormonen bekannt: Auxine, Cytokinine, Abscisine und Ethylen. Dabei wirken die Auxine und Cytokinine hauptsächlich positiv auf physiologische Prozesse, während die Abscisine und Ethylen eine eher negative Wirkung auf Stoffwechselprozesse der Pflanze entfalten. Die Hormone verschiedener Gruppen wirken aber nicht separat, sondern beeinflussen auch die Aktivität der anderen Hormongruppen, so dass die physiologische Reaktion letztlich vom Mengenverhältnis der positiv und negativ wirkenden Hormone abhängig ist.
Die Gibberellinsäure 3 (GA ) wurde in den 20er Jahren des 20. Jahrhunderts aus dem Pilzpathogen Gibberellafujikori isoliert, das Reis befällt und ein starkes Streckungswachstum auslöst, was zur Folge hat, dass die Reiskörner kleiner und der Ertrag geringer werden. Später wurde herausgefunden, dass die wirksamen Stoffe nicht nur in diesem Pilz, sondern auch endogen in Pflanzen vorkommen, wo sie verschiedene Funktionen erfüllen. Seither wurden mindestens 125 Mitglieder der Gibberellin-Familie identifiziert, von denen etwa 30% biologisch aktiv sind. Alle höheren Pflanzen enthalten mindestens ein, üblicherweise aber mehrere Gibberelline. Die höchsten Gibberellinkonzentrationen können in jungen und unreifen Geweben, die sich rasch entwickeln, detektiert werden.
Allen Mitgliedern der Gibberellin-Familie gemeinsam ist ein Gibbanskelett, das ein Diterpen aus vier Ringen ist und aus vier Isopreneinheiten über eine Reihe von Zyklisierungs- und Oxidationsreaktionen gebildet wird. Ein Schlüsselenzym für die Synthese der Gibberelline ist die GA20-Oxidase, deren Expression durch GA Feedback-reguliert wird. Der Abbau der Gibberelline dagegen wird durch eine 2ß- Hydroxylierung eingeleitet, die von der GA2-Oxidase katalysiert wird. Die
Expression sowohl der Schlüsselenzyme der GA-Synthese als auch der des GA- Abbaus wurde in der Vergangenheit moduliert, um GA-abhängige Prozesse in transgenen Pflanzen zu beeinflussen (Coles et al. (1999) Plant J. 17: 547-556; Eriksson et al. (2000) Nature Biotechnology 18 (7): 784-788; Sakamoto et al. (2001) Plant Physiol. 125: 1508-1516; Schomburg et al. (2003) Plant Cell 15: 151-163).
Die Hauptwirkung der Gibberelline ist die Förderung des Streckungswachstums durch Stimulation der Zellteilung und der Zellstreckung. Dies wird besonders deutlich, wenn Zwergmutanten, z. B. von Bohne oder Mais, in denen die Biosynthese der Gibberelline genetisch blockiert ist, mit exogenen Gibberellinen behandelt werden, wodurch normales Streckungswachstum ausgelöst werden kann. Bei der Regulation des Streckungswachstums wirken die Gibberelline synergistisch mit den Auxinen, die auch in der Lage sind, die Biosynthese der Gibberelline zu fordern. Eine weitere wichtige Funktion kommt den Gibberellinen bei der Samenkeimung, z. B. der Gerste, zu. In diesem Falle wird GA vom Skutellum des Embryos synthetisiert und freigesetzt und stimuliert die Produktion des stärkeverdauenden Enzyms α-Amylase sowie anderer hydrolytischer Enzyme durch das Aleuron. Die durch die Aktivität der Enzyme entstehenden einfachen Zucker werden durch das Skutellum absorbiert und dienen dem Embryo als Wachstumsstoffe. In diesem physiologischen System konnte erstmals gezeigt werden, dass GA in der Lage ist, die Aktivierung von Genen auszulösen, in diesem Falle der α-Amylase. Diese Stimulation der Transkription wird gehemmt durch das antagonistische Hormon Abscisinsäure, das die Dormanz induziert und dessen Wirkung durch ein Ansteigen der GA-Konzentration überwunden werden muss.
Die Parthenokarpie, die Fruchtbildung ohne Gametenkopulation, wie sie zum Beispiel bei Äpfeln, Trauben und Kürbissen auftritt, kann ebenfalls durch GA-Gabe ausgelöst werden.
Weiterhin sind Gibberelline in der Lage, die Knospenruhe zu brechen. Dies geschieht natürlicherweise durch eine kälteinduzierte, allmähliche Zunahme der Gibberellinkonzentration während der Knospenruhe, so dass nach Überschreiten eines bestimmten Schwellenwerts die hemmende Wirkung der Abscisinsäure überwunden wird.
Alle diese oben beschriebenen Funktionen werden dadurch erfüllt, dass GA extrazellulär an ihren Rezeptor bindet und einen intrazellulären Signalweg initiiert, der letztlich zur Veränderung der Genexpression führt. Komponenten dieses Signal wegs wurden durch Mutanten identifiziert, die ein verändertes Wachstum zeigen. Mutanten, die durch Zwergwachstum gekennzeichnet sind, weisen auf Komponenten hin, die die GA- Wirkung positiv beeinflussen, während Mutanten mit verstärktem Wachstum wahrscheinlich negative Regulatoren der GA- Antwort betreffen (Olszewski et al. (2002) The Plant Cell, Supplement, S61-S80).
Auf diese Weise konnten unter anderem das Protein DWARF 1 , bei dem es sich um die α-Untereinheit eines heterotrimeren G-Proteins handelt und das somit wichtig für die Signaltransduktion ausgehend vom Rezeptor ist, und der Transkriptionsfaktor GAMYB als positive Regulatoren des GA-Weges identifiziert werden. GAMYB ist ein GA-induzierter Myb-Transkriptionsfaktor, der an das GA-„response element" (GARE) im Promotor z. B. der α-Amylase bindet und deren Expression stimuliert. Die Expression von GAMYB selbst wird auch durch GA stimuliert.
Als negative Regulatoren des GA-Weges während der gesamten Pflanzenentwicklung wurden die RGA/GAI-Proteine identifiziert. Die Mitglieder dieser Familie wirken als transkriptionelle Regulatoren und werden durch einen aktiven GA-Signalweg inaktiviert, indem sie destabilisiert werden. Ebenfalls als negative Regulatoren bzw. Repressoren des GA-Wegs wirken der Transkriptionsfaktor HRT und die mutmaßliche O-GlnAc-Proteintransferase SP Y.
Die oben beschriebenen Wirkungen der Gibberelline auf beispielsweise das Streckungswachstum und die Samenkeimung werden in verschiedenen wirtschaftlichen Anwendungen ausgenutzt. So werden z. B. Trauben mit GA behandelt, um die Traubengröße und den Abstand der einzelnen Beeren innerhalb eines Fruchtstandes zu erhöhen. Durch letzteres wird die Gefahr des Pilzbefalles oder anderer Krankheiten minimiert. Ebenfalls zu erhöhtem Wachstum und damit erhöhtem Ertrag führt die GA-Behandlung bei Sellerie und Zuckerrohr. Bei zweijährig blühenden Nutzpflanzen, die natürlicherweise eine Kältebehandlung benötigen, wie etwa Rote Beete oder Kohl, bewirkt die Applikation von GA eine Blütenbildung jedes Jahr. In Brauereien wird GA verwendet, um den Stärkeabbau im Mälzereiverfahren dadurch zu steigern, dass die GA-induzierte α-Amylase verstärkt exprimiert wird.
Andererseits besteht bei verschiedenen Pflanzen auch wirtschaftliches Interesse, die Gibberellinwirkung zu hemmen. Dies ist zum Beispiel der Fall, wenn das Streckungs Wachstum auf Kosten des Ertrages geht, wie etwa bei Weizen oder Reis. So trugen Mutanten des GA-Weges in den siebziger Jahren zur „grünen Revolution" beim Anbau von Weizen bei, da diese Mutanten kürzer sind und dafür mehr Ausbeute liefern, da sie wenig Energie in das Streckungswachstum, aber viel in die reproduktiven Teile investieren. Zusätzlich sind diese Pflanzen resistenter gegenüber Schäden, die von Wind und/oder Regen hervorgerufen werden, da sie standfester sind. Ebenfalls genutzt wird die GA-Hemmung bei der Zucht von Zierpflanzen wie bspw. Chrysanthemen oder Weihnachtssternen, die nach der Behandlung mit Hemm- Stoffen der GA-Synthese kürzer und stämmiger bleiben. Weitere wirtschaftliche Anwendungen der GA-Hemmung im Zusammenhang mit dem Pflanzenwachstum bestehen bei der Behandlung von Bäumen in bewohnten Gebieten, wo reduziertes Wachstum erwünscht ist, und bei der Behandlung von Golfrasen.
Des Weiteren kann in manchen Nutzpflanzen, wie etwa Mango, durch verringerte GA-Signale die Blüten- und damit auch die Fruchtbildung gesteigert werden. Ebenfalls möglich ist es, durch die GA-Hemmung die vorzeitige Keimung verschiedener Nutzpflanzen wie Kartoffel oder Getreide zu verhindern. So führt das „preharvest sprouting", das Auskeimen auf der Ähre nach Regen kurz vor oder während der Ernte, zu Qualitätseinbußen beim Weizen und daraus hergestellten Produkten durch einen verfrühten Stärkeabbau. Ein weiteres Anwendungsgebiet für die Hemmung der GA- Antworten ist die Beeinflussung des Lignin/Zellulose-Nerhältnisses in Nutzhölzern. Durch Hemmung des GA-Weges kann die Lignifizierung vermindert und der Gehalt an Zellulose gesteigert werden, was insbesondere für die Papierindustrie von Bedeutung ist.
Bisher wurde diese wirtschaftlich bedeutsame Hemmung des GA-Signalwegs hauptsächlich durch die Verwendung von chemischen Hemmstoffen der GA- Synthese, wie etwa Paclobutrazol (Produktname z. B. Profile 2SC oder Bonzi) oder Ancymidol, erreicht. Jedoch besitzen diese chemischen Stoffe die gleichen Nachteile wie andere Pestizide, etwa den möglichen Übergang ins Grundwasser. Darüber hinaus müssen diese chemischen Inhibitoren mehrmals appliziert werden, was ihre Verwendung teuer und aufwendig macht.
Im Rahmen der „grünen Revolution" wurden, wie oben beschrieben, Weizenstämme gezüchtet, die gegenüber der GA- Verabreichung unempfindlich waren. Der Nachteil der Verwendung dieser Mutanten besteht darin, dass die Mutagenisierung ungerichtet erfolgt und dass die Züchtung einen hohen Zeitaufwand erfordert. Auch müssten diese Mutanten für alle Arten von Nutzpflanzen einzeln in einem aufwendigen Verfahren hergestellt werden.
Bei detaillierter Analyse der mutanten Weizenstämme stellte sich heraus, dass in diesen Pflanzen die GAI-Gene, die für einen negativen transkriptioneilen Regulator GA-abhängiger Prozesse kodieren, mutiert sind.
Die Tatsache, dass die GAI-Gene den GA-Weg negativ beeinflussen, hat man auch in transgenen Reispflanzen untersucht (Fu et al. (2001), The Plant Cell 13: 1791- 1802). Diese Pflanzen zeigen unter anderem Zwergwachstum und eine Blockierung der GA-Induktion der α-Amylase im Aleuron. Die oben aufgeführten Beispiele zeigen, dass ein hoher wirtschaftlicher Bedarf an Pflanzen mit veränderten GA-Antworten besteht, die verschiedene veränderte physiologische Prozesse aufweisen.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, Verfahren zur Hemmung GA- abhängiger Prozesse in transgenen Pflanzen und Pflanzenzellen bereitzustellen. Weiterhin ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, transgene Pflanzenzellen und Pflanzen mit gehemmten GA-Antworten zur Verfügung zu stellen. Da die Pflanzen endogen den Repressor exprimieren, wird die teure und aufwendige Verwendung von chemischen GA-Inhibitoren überflüssig.
Diese und andere Aufgaben werden durch die Gegenstände der unabhängigen Ansprüche gelöst. Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind in den abhängigen Ansprüchen definiert.
Die Aufgaben der vorliegenden Erfindung werden gelöst durch die Bereitstellung eines Verfahrens zur Modulation GA-abhängiger Prozesse in transgenen Pflanzen und Pflanzenzellen durch die transgene Expression bestimmter Transkriptionsregulatoren, die in der Fachwelt auch als ET-Faktoren bezeichnet werden und die negative Regulatoren GA-abhängiger Prozesse sind. Gene für derartige Repressoren wurden aus Viciafaba, Brassica napus und Arabidopsis thaliana isoliert. Die erfindungsgemäßen Regulatoren sind durch eine oder mehrere hochkonservierte C-terminale Proteindomänen mit einem typischen Cystein-Muster der Struktur:
C-Λι- 2- .3-Λ4-X5-X6-X7-Xg-Xg-C-Xιo-Xπ"^12"^13-^l -^15"^16-^17"^18"^^-^1 -^20--WK.-GMR. charakterisiert, die durch einen Linker voneinander getrennt sind (vgl. Abb. 1). Jede dieser Proteindomänen bindet ein Zink-Ion, was die ET-Proteine in die verwandtschaftliche Nähe der Zinkfinger-Transkriptionsfaktoren rückt. Jedoch besitzen die klassischen Zinkfingerproteine das gemeinsame Sequenzmotiv X3-C-X2_4-C-Xi2-H-X -4-H-X4, das von dem der ET-Proteine abweicht. Beiden Familien gemeinsam ist aber die Fähigkeit, über die durch das Zink-Ion gefalteten Proteindomänen an die DNA zu binden und die Transkription gewebespezifisch, zeitlich und quantitativ zu regulieren.
Es wurde gefunden, dass durch die Expression von Genen, die für derartige Transkriptionsregulatoren kodieren, unter Kontrolle geeigneter Promotoren in transgenen Pflanzen GA-abhängige Prozesse negativ beeinflusst werden können.
Somit betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Hemmung GA-abhängiger Prozesse in transgenen Pflanzen und Pflanzenzellen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass eine DNA-Sequenz, die für ein Protein kodiert, das eine oder mehrere Wiederholungen der Aminosäuresequenz
C- ]-X2- 3- 4-X5-X6-X7-X8"^9-C-Xιo- ll- l2"^13"^14-^15-^16-^17-^I8-^^-^19"^20-Wl^-^J^'l ^ aufweist, wobei es sich bei Xi bis X20 um beliebige Aminosäuren handelt, und das die Aktivität eines negativen Regulators Gibberellinsäure-abhängiger Prozesse besitzt, in die Pflanze bzw. Pflanzenzelle eingeführt und dort exprimiert wird.
Bevorzugt handelt es sich bei Xi um G, bei X4 um L, bei X13 um P, bei X14 um V und/oder bei Xι7 um R.
Besonders bevorzugt handelt es sich bei Xi um G; bei X2 um V oder F, bevorzugt um V; bei X3 um I oder K; bei X4 um L; bei X5 um D, P, H, C oder Y; bei X6 um D, E oder N, bevorzugt um D oder N; bei X7 um M oder G; bei X8 um S, V, E, L oder I, bevorzugt um S; bei X um I, R, P oder V; bei X10 um S, R, N oder E; bei Xu um K, R oder S, bevorzugt um K; bei X12 um M, K, T, R oder S; bei X13 um P; bei Xι um V; bei X15 um G, S, P oder K; bei X16 um K, G oder R, bevorzugt um G; bei Xι7 um R; bei X18 um V oder K, bevorzugt um K; bei Xι um N, E oder Q, bevorzugt um E; und/oder bei X20 um E oder D, bevorzugt um E.
Im besonderen werden die Aufgaben der vorliegenden Erfindung durch das Bereitstellen eines Verfahrens zur Hemmung GA-abhängiger Prozesse in transgenen Pflanzen und Pflanzenzellen gelöst, wobei eine DNA-Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: i. DNA-Sequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die von SEQ ID No. 1, 3 oder 5 oder Fragmenten davon kodiert werden, ii. DNA-Sequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die für Proteine mit der in SEQ ID No. 2, 4 oder 6 angegebenen Aminosäuresequenz oder Fragmente davon kodieren, iii. DNA-Sequenzen, die zu einer der in SEQ ID No. 1, 3 oder 5 angegebenen Nukleotidsequenzen eine Sequenzidentität von mindestens 80% aufweisen, und/oder iv. DNA-Sequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die unter stringenten Bedingungen mit einem komplementären Strang einer Nukleotidsequenz von i) bis iii) hybridisieren, die für ein Protein kodiert, das eine oder mehrere Wiederholungen der Aminosäuresequenz
C-X1-X2-X3- 4-X5- 6-X7-X8-X9-C-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-RC-X19-X20-HK-GMR aufweist, wobei es sich bei Xi bis X20 um beliebige Aminosäuren handelt, und das die Aktivität eines negativen Regulators Gibberellinsäure-abhängiger
Prozesse besitzt, in die Pflanze bzw. Pflanzenzelle eingeführt und dort exprimiert wird. Bevorzugt handelt es sich bei Xi um G, bei X um L, bei X13 um P, bei Xι4 um V und/oder bei Xπ um R.
Besonders bevorzugt handelt es sich bei Xi um G; bei X2 um V oder F, bevorzugt um V; bei X um I oder K; bei X4 um L; bei X5 um D, P, H, C oder Y; bei X6 um D, E oder N, bevorzugt um D oder N; bei X7 um M oder G; bei X8 um S, V, E, L oder I, bevorzugt um S; bei X9 um I, R, P oder V; bei X10 um S, R, N oder E; bei Xπ um K, R oder S, bevorzugt um K; bei Xι um M, K, T, R oder S; bei X13 um P; bei Xι4 um V; bei X15 um G, S, P oder K; bei Xι6 um K, G oder R, bevorzugt um G; bei Xι um R; bei Xι8 um V oder K, bevorzugt um K; bei Xι um N, E oder Q, bevorzugt um E; und/oder bei X20 um E oder D, bevorzugt um E.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform stammt die DNA-Sequenz aus Brassica napus.
Gegenstand der Erfindung sind auch isolierte Nukleinsäuremoleküle, die eine Nukleotidsequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: i. DNA-Sequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die von SEQ ID No. 1 oder Fragmenten davon kodiert werden, ii. DNA-Sequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die für Proteine mit der in SEQ ID No. 2 angegebenen Aminosäuresequenz oder Fragmente davon kodieren, iii. DNA-Sequenzen, die zu der in SEQ ID No. 1 angegebenen Nukleotidsequenz eine Sequenzidentität von mindestens 80% aufweisen, und/oder iv. DNA-Sequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die unter stringenten Bedingungen mit einem komplementären Strang einer Nukleotidsequenz von i) bis iii) hybridisieren, enthalten sowie rekombinante ET-Proteine, die von diesen Nukleinsäuresequenzen kodiert werden.
Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls die Hemmung der Expression der ET- Proteine, was zu einer Steigerung der Gibberellinsäure-abhängigen Prozesse führt. Geeignete Verfahren zur Hemmung der Expression von Proteinen sind dem Fachmann bekannt und schließen ein RNA-Interferenz-, Antisense- und Co- Suppressionsverfahren. Ebenfalls möglich ist es, ausschließlich die Cystein- Domäne der ET-Proteine mit der Aminosäuresequenz C-Xι-X2-X3-X -X5-X6- 7- 8-X9" -Xιo" ι 1-X12- 13- 14- 15- 16-X17-X18-R -X19-X20-HK-GMR, wobei es sich bei Xi bis X20 um beliebige Aminosäuren handelt, transgen zu exprimieren, die durch ein "Austitrieren" von interagierenden Faktoren bzw. durch das Binden an die entsprechenden Bindungsstellen im Promotor als dominantnegativer Regulator wirkt.
Der Begriff „Gibberellinsäure-abhängiger Prozess" im Sinne der Erfindung bezeichnet einen physiologischen oder molekularen bzw. biochemischen Vorgang innerhalb der Pflanze bzw. Pflanzenzelle, der durch Gibberellinsäure reguliert wird. Beispiele für solche Prozesse wurden einleitend erwähnt und sind darüber hinaus der Literatur zu entnehmen. Solche Prozesse schließen auch die durch GA vermittelte Aktivierung auf Transkriptionsebene ein.
Die Begriffe „Hemmung Gibberellinsäure-abhängiger Prozesse" und „gehemmte Gibberellinsäure-abhängige Prozesse", wie sie hier verwendet werden, bedeuten, dass endogene physiologische Vorgänge, die in Wildtyppflanzen durch
Gibberellinsäure reguliert werden, in der transgenen Pflanze im Vergleich zu Wildtyppflanzen um mindestens 20% oder 35%, besonders bevorzugt um mindestens 50% oder 65%, insbesondere bevorzugt um mindestens 80% oder 85% und am meisten bevorzugt um mindestens 90% oder 95% vermindert sind.
Die Begriffe „ET-Faktor", „ET-Protein", „ET-Regulator", „negativer Regulator Gibberellinsäure-abhängiger Prozesse" oder „Regulator im Sinne der Erfindung" werden im Rahmen der Erfindung verwendet für ein Protein, das eine oder mehrere Wiederholungen der Aminosäuresequenz
C-X1-X2-X3-X4-X5- 6-X7-X8- 9-C-X10-X11- 12-X13- M- 15-X16- 17-X18-RC-X19-X20-HK-GMR aufweist, wobei es sich bei Xi bis X20 um beliebige Aminosäuren handelt, und das die Aktivität eines negativen Regulators Gibberellinsäure-abhängiger Prozesse besitzt.
Bevorzugt handelt es sich bei Xi um G, bei X4 um L, bei Xι3 um P, bei Xι4 um V und/oder bei Xπ um R.
Besonders bevorzugt handelt es sich bei Xi um G; bei X2 um V oder F, bevorzugt um V; bei X3 um I oder K; bei X4 um L; bei X5 um D, P, H, C oder Y; bei X6 um D, E oder N, bevorzugt um D oder N; bei X7 um M oder G; bei X8 um S, V, E, L oder I, bevorzugt um S; bei X9 um I, R, P oder V; bei X10 um S, R, N oder E; bei Xu um K, R oder S, bevorzugt um K; bei X12 um M, K, T, R oder S; bei Xι3 um P; bei X14 um V; bei Xι5 um G, S, P oder K; bei Xι6 um K, G oder R, bevorzugt um G; bei Xι7 um R; bei Xι8 um V oder K, bevorzugt um K; bei Xι9 um N, E oder Q, bevorzugt um E; und/oder bei X20 um E oder D, bevorzugt um E.
Der Begriff „Fragmente der DNA", wie er hier verwendet wird, bezeichnet Teilstücke der DNA, die für ein Protein kodiert, das eine oder mehrere Wiederholungen der Aminosäuresequenz
C-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-C-X10-X11-X12-X13-XM- 15-X16-X17- 18-RC-X19-X20-HK-GMR aufweist, wobei es sich bei Xi bis X20 um beliebige Aminosäuren handelt, und das die Aktivität eines negativen Regulators Gibberellinsäure-abhängiger Prozesse besitzt, wobei die von den DNA-Teilstücken kodierten Proteine die gleichen Wirkungen auf Gibberellinsäure-abhängige Prozesse ausüben wie die von der vollständigen DNA-Sequenz kodierten Proteine.
Der Begriff „Fragmente des Proteins", wie er hier verwendet wird, bezeichnet Teilstücke des Proteins, das eine oder mehrere Wiederholungen der Aminosäuresequenz
C-Xι-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9"C-Xl0-Xl l"Xl2-Xl3-Xl4"Xl5-Xl6-Xl7-Xl8-R -Xi9-X20-HK-GMR aufweist, wobei es sich bei Xi bis X20 um beliebige Aminosäuren handelt, und das die Aktivität eines negativen Regulators Gibberellinsäure-abhängiger Prozesse besitzt, wobei die Teilstücke des Proteins die gleichen Wirkungen auf Gibberellinsäure-abhängige Prozesse ausüben wie das Protein in seiner vollen Länge.
Bevorzugt handelt es sich bei Xi um G, bei X4 um L, bei X13 um P, bei Xι4 um V und/oder bei Xι um R.
Besonders bevorzugt handelt es sich bei Xi um G; bei X2 um V oder F, bevorzugt um V; bei X3 um I oder K; bei 4 um L; bei X5 um D, P, H, C oder Y; bei X6 um D, E oder N, bevorzugt um D oder N; bei X um M oder G; bei X8 um S, V, E, L oder I, bevorzugt um S; bei X9 um I, R, P oder V; bei X10 um S, R, N oder E; bei Xu um K, R oder S, bevorzugt um K; bei X12 um M, K, T, R oder S; bei Xι3 um P; bei Xι4 um V; bei Xι5 um G, S, P oder K; bei Xι6 um K, G oder R, bevorzugt um G; bei Xπ um R; bei Xι8 um V oder K, bevorzugt um K; bei Xι9 um N, E oder Q, bevorzugt um E; und/oder bei X20 um E oder D, bevorzugt um E.
Der Begriff „Hybridisierung unter stringenten Bedingungen" bedeutet im Zusammenhang dieser Erfindung, dass die Hybridisierung in vitro unter Bedingungen durchgeführt wird, die stringent genug sind, um eine spezifische Hybridisierung zu gewährleisten. Solche stringenten Hybridisierungsbedingungen sind dem Fachmann bekannt und können der Literatur entnommen werden (Sambrook und Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3. Auflage, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York).
Allgemein bedeutet "spezifisch hybridisieren", dass ein Molekül unter stringenten Bedingungen präferenziell an eine bestimmte Nukleotidsequenz bindet, wenn diese Sequenz in einem komplexen Gemisch von (z. B. Gesamt-) DNA oder RNA vorliegt. Der Begriff „stringente Bedingungen" steht allgemein für Bedingungen, unter denen eine Nukleinsäuresequenz präferenziell an ihre Zielsequenz hybridisieren wird, und zu einem deutlich geringeren Ausmaß oder gar nicht an andere Sequenzen. Stringente Bedingungen sind z. T. Sequenz-abhängig und werden unter verschiedenen Umständen unterschiedlich sein. Längere Sequenzen hybridisieren spezifisch bei höheren Temperaturen. Im Allgemeinen werden stringente
Bedingungen so ausgewählt, dass die Temperatur etwa 5°C unter dem thermischen Schmelzpunkt (Tm) für die spezifische Sequenz bei einer definierten Ionenstärke und einem definierten pH liegt. Die Tm ist die Temperatur (unter definierter Ionenstärke, pH und Nukleinsäurekonzentration), bei der 50% der zu der Zielsequenz komplementären Moleküle zu der Zielsequenz im Gleichgewichtszustand hybridisieren. Typischerweise sind stringente Bedingungen solche, bei denen die Salzkonzentration mindestens ungefähr 0,01 bis 1,0 M Natriumionen-Konzentration (oder ein anderes Salz) bei einem pH zwischen 7,0 und 8,3 und die Temperatur mindestens 30°C für kurze Moleküle (also z. B. 10-50 Nukleotide) beträgt. Zusätzlich können stringente Bedingungen durch Zugabe destabilisierender Agenzien, wie beispielsweise Formamid, erreicht werden.
Typische Hybridisierungs- und Waschpuffer haben z.B. folgende Zusammensetzung: Prähybridisierungslösung: 0,5 % SDS 5x SSC 50 mM NaPO4, pH 6,8 0,1% Na-Pyrophosphat 5x Denhardt's Lösung 100 μg/ml Lachssperm
Hybridisierungslösung: Prähybridisierungslsg. lxlO6 cpm/ml Sonde (5-10 min 95°C)
20x SSC: 3 M NaCl 0,3 M Natriumeitrat ad pH 7 mit HC1
50x Denhardt's Reagenz: 5 g Ficoll 5 g Polyvinylpyrrolidon 5 g Bovine Serum Albumine ad 500 ml A. dest.
Eine typische Verfahrensweise für die Hybridisierung sieht folgendermaßen aus:
Optional: Blot 30 min in lx SSC/ 0,1% SDS bei 65°C waschen
Prähybridisierung: mindestens 2 h bei 50-55°C
Hybridisierung: über Nad tat bei 55-60°C
Waschen: 05 min 2x SSC/ 0,1% SDS Hybridisierungstemp, 30 min 2x SSC/ 0,1% SDS Hybridisierungstemp, 30 min lx SSC/ 0,1% SDS Hybridisierungstemp, 45 min 0,2x SSC/ 0,1% SDS 65°C 5 min 0,lx SSC Raumtemperatur Der Fachmann weiß, dass die genannten Lösungen und das dargestellte Protokoll je nach Anwendung modifiziert werden kann oder muss.
Der Begriff „Sequenzidentität" im Sinne der Erfindung bezeichnet eine Identität über die gesamte kodierende Sequenz zu einer der in SEQ ID No. 1, 3 oder 5 angegebenen Nukleinsäuresequenzen von mindestens 80%, bevorzugt von mindestens 85%, besonders bevorzugt von mindestens 90, 91, 92, 93 oder 94% und am meisten bevorzugt von mindestens 95, 96, 97, 98 oder 99%. Insbesondere beträgt die Sequenzidentität innerhalb von 600 Basenpaaren ausgehend vom 3'- Ende einer der in SEQ ID No. 1, 3 oder 5 angegebenen Nukleotidsequenzen mindestens 90%, bevorzugt mindestens 92%, besonders bevorzugt mindestens 94%, insbesondere bevorzugt mindestens 96% und am meisten bevorzugt mindestens 98% zu einer der in SEQ ID No. 1, 3 oder 5 angegebenen Sequenzen und auf Aminosäureebene innerhalb von 200 Aminosäuren ausgehend vom C-Terminus einer der in SEQ ID No. 2, 4 oder 6 angegebenen Sequenzen mindestens 90%, besonders bevorzugt mindestens 92 oder 94%, insbesondere bevorzugt mindestens 96 oder 97% und am meisten bevorzugt mindestens 98 oder 99% zu einer der in SEQ ID No. 2, 4 oder 6 angegebenen Sequenzen.
Die Sequenzidentität wird über eine Reihe von Programmen, die auf verschiedenen Algorithmen beruhen, bestimmt. Dabei liefern die Algorithmen von Needleman und Wunsch oder Smith und Waterman besonders zuverlässige Ergebnisse. Für die Sequenzvergleiche wurde das Programm PileUp (Feng und Doolittle (1987) J. Mol. Evolution 25: 351 - 360; Higgins et al. (1989) CABIOS 5: 151 - 153) oder die Programme Gap und Best Fit (Needleman und Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443 - 453 und Smith und Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482 - 489) verwendet, die im GCG-Software-Paket (Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA) enthalten sind. Die oben in Prozent angegebenen Sequenzidentitätswerte wurden mit dem Programm GAP über den gesamten Sequenzbereich mit folgenden Einstellungen ermittelt: Gap Weight: 50, Length Weight: 3, Average Match: 10000 und Average Mismatch: 0,000.
Diese Einstellungen wurden, falls nicht anders angegeben, als Standardeinstellungen für Sequenzvergleiche verwendet.
Nukleinsäuresequenzen, die von den in SEQ ID No.l, 3 oder 5 angegebenen Nukleinsäuresequenzen abweichen, können z.B. durch Einbringen einer oder mehrerer Nukleotidsubstitutionen, -additionen oder -deletionen in eine Nukleotidsequenz der SEQ ID No. 1, 3 oder 5 erzeugt werden, so dass Proteine entstehen, in die gegenüber der in SEQ ID No. 2, 4 oder 6 angegebenen Sequenz eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen, -additionen oder -deletionen eingebracht wurden. Mutationen können in eine der Sequenzen der SEQ ID No. 1, 3 oder 5 durch Standardtechniken, wie z.B. stellenspezifische Mutagenese und PCR-vermittelte Mutagenese, eingebracht werden. Vorzugsweise werden konservative Aminosäuresubstitutionen an einem oder mehreren der vorhergesagten nicht-essentiellen Aminosäurereste, also an Aminosäureresten, die die Aktivität eines negativen
Regulators Gibberellin-abhängiger Prozesse nicht beeinflussen, hergestellt. Bei einer "konservativen Aminosäuresubstitution" wird ein Aminosäurerest gegen einen Aminosäurerest mit einer ähnlichen Seitenkette ausgetauscht. Im Fachgebiet sind Familien von Aminosäureresten mit ähnlichen Seitenketten definiert worden. Diese Familien umfassen Aminosäuren mit basischen Seitenketten (z.B. Lysin, Arginin, Histidin), sauren Seitenketten (z.B. Asparaginsäure und Glutaminsäure), ungeladenen polaren Seitenketten (z.B. Glycin, Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin, Tyrosin, Cystein), unpolaren Seitenketten (z.B. Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan), beta-verzweigten Seitenketten (z.B. Threonin, Valin, Isoleucin) und aromatischen Seitenketten (z.B. Tyrosin, Phenylalanin, Tryptophan). Ein vorhergesagter nicht-essentieller Aminosäurerest in dem erfindungsgemäß verwendeten ET-Faktor wird somit vorzugsweise durch einen anderen Aminosäurerest aus der gleichen
Seitenkettenfamilie ausgetauscht. Alternativ können bei einer anderen Ausführungsform die Mutationen zufallsgemäß über die gesamte oder einen Teil der für den ET- Faktor kodierenden Sequenz eingebracht werden, z.B. durch Sättigungsmutagenese, und die resultierenden Mutanten können nach der Aktivität eines negativen Regulators Gibberellin-abhängiger Prozesse durchmustert werden, indem das kodierte Protein rekombinant exprimiert wird, um Mutanten zu identifizieren, die diese Aktivität beibehalten haben. Die Aktivität des Proteins kann z.B. unter Verwendung der hier beschriebenen Tests bestimmt werden.
Die Aktivität eines negativen Regulators Gibberellin-abhängiger Prozesse lässt sich am einfachsten dadurch bestimmen, dass die DNA, die für diesen Regulator kodiert, zusammen mit einem Reportergen, das unter der Kontrolle eines GA-abhängigen Promotors steht, in die Pflanzenzellen eingebracht wird und diese entweder mit GA behandelt werden oder unbehandelt belassen werden. Als Kontrolle werden Wildtypzellen mit dem gleichen Reportergen-Konstrukt transfiziert und mit GA stimuliert bzw. unstimuliert belassen. Wird in den Zellen, die mit der zu testenden DNA transfiziert wurden, die Expression des Reportergens durch die Zugabe von GA nicht induziert, während sie in den Wildtypzellen induziert wird, handelt es sich bei der transfizierten DNA um einen negativen Regulator Gibberellin-abhängiger Prozesse.
Geeignete Reportergene sind beispielsweise das ß-Glucuronidase-(GUS)-Gen aus E. coli, ein Fluoreszenzgen wie etwa das Green-Fluorescence-Protein (GFP)-Gen aus Aequoria victoria, das Luziferase-Gen aus Photinus pyralis oder das ß-Galaktosida- se-(lacZ)-Gen aus E. coli. Weitere geeignete Reportergene sind dem Fachmann bekannt.
Geeignete GA-abhängige Promotoren sind dem Fachmann bekannt und können der Literatur entnommen werden. Beispielsweise handelt es sich um den Promotor des Aquaporin-Gens (Kaldenhoff R. et al. (1996) Journal of Photochemistry Photobiology 36 (3): 351-354), des cytosolischen Glutamin-Synthetase-Gens (Gomez-Maldonado et al. (2004) Planta 218(6): 1036-1045), des A121-Gens aus Weizen (Cejudo et al. (1992) Plant Mol. Biol. 20(5): 849-856) und des α-Amylase- Gens aus Gerste (Gubler und Jacobsen (1992) Plant Cell 4(11): 1435-1441).
Die kontrollierte Expression der erfindungsgemäßen Regulatoren bzw. ET-Faktoren in transgenen Pflanzen bietet die Möglichkeit, Gibberellinsäure-abhängige Prozesse in der Pflanze zu beeinflussen, so dass die äußere Gabe von chemischen GA-
Syntheseinhibitoren bzw. die langwierige Selektion von Mutanten und anschließende Züchtung auf klassischem Wege überflüssig wird.
Die veränderte Expression der ET-Faktoren in transgenen Pflanzen hat durch die Beeinflussung Gibberellinsäure-abhängiger Prozesse verschiedene positive Effekte.
Zum einen kann allgemein das Streckungswachstum gehemmt werden, was vor allem für eine Ertragssteigerung bei Getreidesorten wie Weizen oder Reis von Bedeutung ist, weil die transgenen Pflanzen weniger Nährstoffe in das Wachstum und dafür mehr in die Entwicklung der reproduktiven Organe investieren. Die
Hemmung des Streckungs Wachstums ist auch nützlich bei Bäumen und Gräsern, bei denen geringeres Wachstum erwünscht ist, wie z. B. Golfrasen. Zum anderen kann durch die vorliegende Erfindung auch die ungewollte Keimung von Samen und Knollen verhindert werden. Dies findet unter anderem Anwendung bei der Getreidezucht zur Vermeidung des „preharvest sprouting"-Syndroms, dem Austreiben auf der Ähre.
Da die Menge an aktivem Gibberellin auch das Verhältnis von Zellulose und Lignin kontrolliert, kann durch eine Hemmung der Gibberellin- Antworten auch das Verhältnis zugunsten der Zellulose verschoben werden, wodurch eine größere Menge an Rohstoffen für die Papierindustrie zur Verfügung gestellt wird.
Schließlich bietet die transgene Expression der ET-Faktoren auch die Möglichkeit, die Blüten- und damit auch die Fruchtbildung bei verschiedenen Nutzpflanzen zu beeinflussen.
Weitere nützliche Anwendungen des erfindungsgemäßen Verfahrens ergeben sich aus den von GA natürlicherweise in den Pflanzen regulierten Vorgängen.
Durch die Bereitstellung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Hemmung Gibberellinsäure-abhängiger Prozesse in transgenen Pflanzen können Gibberellinsäure-abhängige Prozesse wie Streckungswachstum, Keimung und
Fruchtbildung in den transgenen Pflanzen beeinflusst werden, wobei dies bevorzugt durch Überexpression des Gens, das für Regulatoren der ET-Familie (wie in Anspruch 1 definiert) kodiert, in den transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen erfolgt.
Dadurch können Pflanzen erzeugt werden, die ein geringeres Streckungswachstum als die Wildtyppflanzen zeigen und deshalb ertragreicher und resistenter gegen Wind und Regen sind. Außerdem können Pflanzen mit einem veränderten Keimungsverhalten erzeugt werden, was ebenfalls zu einer Erhöhung des Ertrags führt. Weitere Anwendungen sind bereits weiter oben aufgeführt und ergeben sich des Weiteren aus den natürlichen Prozessen, wie sie durch GA gesteuert werden.
Grundvoraussetzung für die Erzeugung solcher Nutzpflanzen ist die Verfügbarkeit geeigneter Transformationssysteme. Hier wurde während der letzten zwei Jahrzehnte ein breites Spektrum an Transformationsmethoden entwickelt und etabliert. Diese Techniken umfassen die Transformation pflanzlicher Zellen mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes als Transformationsmittel, die Fusion von Protoplasten, den direkten Gentransfer isolierter DNA in Protoplasten, die Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzenzellen, die Einbringung von DNA mittels biolistischer Methoden sowie weitere Möglichkeiten. Diese Transformationstechniken sind dem Fachmann bekannt oder können in Übersichtsartikeln bzw. entsprechenden Nachschlagewerken nachgelesen werden.
Neben der Verwendung der hier erstmals offenbarten bzw. in der Literatur und den Datenbanken bereits verfügbaren DNA-Sequenzen, die für Regulatoren im Sinne der Erfindung kodieren, kann der Fachmann weitere entsprechende DNA-Sequenzen aus anderen Organismen mittels herkömmlicher molekularbiologischer Techniken selbst auffinden und im Rahmen der vorliegenden Erfindung einsetzen. So kann der Fachmann beispielsweise geeignete Hybridisierungssonden von den erfindungsgemäßen ET-Sequenzen ableiten und für das Screening von cDNA- und/oder genomischen Banken des jeweils gewünschten Organismus, also z. B. Kartoffel oder Getreide, aus dem ein neues ET-Gen isoliert werden soll, einsetzen. Hierbei kann der Fachmann auf geläufige Hybridisierungs-, Klonierungs- und Sequenzierungsmethoden zurückgreifen, die in jedem bio- oder gentechnologischen Labor wohlbekannt und etabliert sind (siehe z. B. auch Sambrook und Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3. Auflage, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York). Der Fachmann kann natürlich auch anhand der erfindungsgemäßen Sequenzen geeignete Oligonukleotid-Primer zur PCR- Amplifikation von ET-Sequenzen synthetisieren und einsetzen.
Geeignete Primerpaare zur Amplifikation von ET-Genen sind beispielsweise:
Primerpaar ET1 (optimale Anlagerungstemperatur: 53°C): ETla-new 5' ATGTTCAAGAGAGACGACTACATTCG 3' ETlb 5' AAGATGTCATTCTCATCCCCTTGTGC 3'
Primerpaar ET2 (optimale Anlagerungstemperatur: 58°C): ET2a-out 5 ' CTATATC ATCGGTTTTATCGA AATGGAATT 3 ' ET2b-out 5 ' A AGTGATGC AGAGGTTAGGTGATTCTC ATT 3 '
Primerpaar ET3 (optimale Anlagerungstemperatur: 55°C): ET3a 5' ATGTCGTTTGTTCTATTATCGAAGATGGC 3'
Et3b 5 ' ACC AAATGGTCTC ATC ACTTTGAGTG 3 '
Geeignete PCR-Bedingungen zur Amplifikation von ET-Genen mit den oben aufgeführten Primerpaaren sind:
1. 96°C für 4 Minuten
2. 35 Zyklen: • 96°C für 30 Sekunden • optimale Anlagerungstemperatur für das ausgewählte Primerpaar für 45 Sekunden • 72°C für 30 Sekunden
3. abschließende Verlängerung bei 72°C für 7 Minuten. Üblicherweise werden die Hybridisierungssonden bzw. Oligonukleotid-Primer so ausgewählt werden, dass sie die für das in Anspruch 1 angegebene Aminosäure- Sequenzmotiv kodierende Nukleinsäuresequenz umfassen. Selbstverständlich besteht aber auch die Möglichkeit, eine der in dieser Anmeldung offenbarten DNA-Sequenzen in ihrer Gesamtheit oder wesentliche Teile davon als Hybridisierungssonde in herkömmlichen Hybridisierungstechniken einzusetzen.
Des Weiteren ist es auch möglich, mit Hilfe von geeigneten Oligonukleotidsequen- zen und der Southwestern-Technik Proteine aus weiteren Pflanzenarten zu isolieren, indem Extrakte aus den gewünschten Pflanzen in einem Polyacrylamid-Gel ihrer Größe nach aufgetrennt und auf einen Nitrozellulose-Filter übertragen werden, wo sie mit markierten Oligonukleotidsequenzen, die eine mögliche Bindungsstelle für den Transkriptionsfaktor enthalten, in Kontakt gebracht werden. Die an das Oligo- nukleotid bindenden Proteine können anschließend über die Markierung des Oligo- nukleotids identifiziert werden. Zur Southwestern- Analyse geeignete Oligonukleo- tide sind dem Beispiel 1 der vorliegenden Anmeldung zu entnehmen.
Die auf diese Weise isolierten Proteine können wie oben beschrieben in Reportergen- Assays hinsichtlich ihrer Aktivität als negativer Regulator Gibberellin-abhängiger Prozesse getestet werden.
Die Erfindung betrifft weiterhin rekombinante Nukleinsäuremoleküle, umfassend die folgenden Elemente in 5 '-3 '-Orientierung:
- regulatorische Sequenzen eines in Pflanzenzellen aktiven Promotors,
- operativ daran gebunden eine DNA- Sequenz, die für einen erfindungsgemäßen Transkriptionsregulator kodiert, - ggf. operativ daran gebunden regulatorische Sequenzen, die in der Pflanzenzelle als Transkriptions-, Terminations- und/oder Polyadenylierungssignale dienen können.
In den erfindungsgemäßen rekombinanten Nukleinsäuremolekülen, die eine für einen ET-Faktor kodierende DNA-Sequenz enthalten, liegt die kodierende Nukleinsäure- sequenz wie im nativen Gen, also in 5 '-3 '-Orientierung, in operativer Verknüpfung mit einem in Pflanzen aktiven Promotor vor. Auf diese Weise kann eine Überexpression der kodierenden Sequenz in den transgenen Pflanzen erreicht werden.
In einem rekombinanten Nukleinsäuremolekül bedeutet "operativ daran gebunden", dass die Nukleotidsequenz von Interesse derart an die Regulationssequenz(en) gebunden ist, dass die Expression der Nukleotidsequenz möglich ist und die beiden Sequenzen derart aneinander gebunden sind, dass sie die vorhergesagte, der Sequenz zugeschriebene Funktion erfüllen.
Geeignete regulatorische Sequenzen, die die Transkription einer operativ verknüpften erfindungsgemäßen DNA-Sequenz in der transformierten Pflanze bzw. Pflanzenzelle steuern, sind dem Fachmann wohl bekannt, können mit Verfahren des Standes der Technik isoliert oder den Datenbanken und der Literatur entnommen werden.
Der Promotor kann so gewählt werden, dass die Expression konstitutiv erfolgt oder nur in spezifischen Geweben und/oder zu einem bestimmten Zeitpunkt der Pflanzenentwicklung und/oder zu einem durch äußere Einflüsse, biotische oder abiotische Stimuli bestimmten Zeitpunkt (induzierte Genexpression) angeschaltet wird. In Bezug auf die zu transformierende Pflanze kann der Promotor homolog oder heterolog sein. Bei Verwendung eines konstitutiven Promotors kann eine zell- bzw. gewebespezifische Expression auch dadurch erreicht werden, dass die Genexpression in den Zellen bzw. Geweben, in denen sie nicht erwünscht ist, gehemmt wird, beispielsweise durch Ausprägung von Antikörpern, die das Genprodukt binden und somit seine Aktivität unterbinden, oder durch geeignete Inhibitoren.
Konstitutive oder gewebe- bzw. entwicklungsspezifische oder induzierbare Gene bzw. Promotoren kann der Fachmann dem Stand der Technik, insbesondere den einschlägigen wissenschaftlichen Journalen und Datenbanken entnehmen. Darüber hinaus ist der Durchschnittsfachmann in der Lage, mittels Routinemethoden weitere geeignete Promotoren zu isolieren. So kann der Fachmann mit Hilfe gängiger molekularbiologischer Methoden, z. B. Hybridisierungsexperimenten oder DNA- Protein-Bindungsstudien, z. B. gewebespezifische regulatorische Nukleinsäuremoleküle identifizieren. Dabei wird z. B. in einem ersten Schritt aus einem bestimmten Gewebe, z. B. einem Speicherorgan, des gewünschten Organismus, aus dem die regulatorischen Sequenzen isoliert werden sollen, die gesamte poly(A)+ -RNA isoliert und eine cDNA-Bank daraus angelegt. In einem zweiten Schritt werden mit cDNA-Klonen, die auf poly(A)+-RNA-Molekülen aus einem Nicht-Speicherorgangewebe basieren, aus der ersten Bank mittels Hybridisierung diejenigen Klone identifiziert, deren korrespondierende poly(A)+- RNA-Moleküle lediglich im Gewebe des Speicherorgans akkumulieren. Anschließend werden mit Hilfe dieser so identifizierten cDNAs Promotoren isoliert, die über Speicherorgan-spezifische regulatorische Elemente verfügen.
Geeignete Promotoren zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Verfahren sind konstitutive Promotoren wie der CaMV35S-, der Octopinsynthase-, der Nopalinsynthase- oder der Ubiquitinpromotor.
Als induzierbare Promotoren sind zum Beispiel östrogen-induzierbare Promotoren geeignet, wie sie etwa in den pMDC-GATEWAY- ektoren (Curtis MD und Grossnikiaus U. (2003) Plant Physiology 133: 462-469) vorhanden sind. Zur Transgenexpression in Samen können beispielsweise die LeguminB4- und USP-
Promotoren verwendet werden (Bäumlein, H. et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 225:
459-467; Bäumlein, H. et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 225: 121-128).
Wenn das Transgen spezifisch in den Knollen von Pflanzen exprimiert werden soll, bietet sich unter anderem der Promotor des Klasse I Patatin-Gens an (Rocha-Sosa M. et al. (1989) EMBO J 8: 23-29).
Zu den Promotoren, die insbesondere in Früchten aktiv sind, gehören der Promotor des Polygalacturonase-Gens oder einer ACC-Oxidase und der 2A11 -Promotor (Nicholass et al. (1995) Plant Mol. Biol. 28: 423-435; Atkinson et al. (1998) Plant Mol. Biol. 38: 449-460; van Haaren et al. (1991) Plant Mol. Biol. 17: 615-630).
Um das Verhältnis von Zellulose und Lignin zu beeinflussen, kann ein kambiumspezifischer Promotor wie etwa der CAD-Promotor verwendet werden (S. Hawkins et al. (1997) Plant Physiol. 113: 321 -325).
Die erfindungsgemäßen rekombinanten Nukleinsäuremoleküle können als regulatorische Elemente auch noch z. B. Enhancer-Elemente umfassen, ferner können sie Resistenzgene, Replikationssignale und weitere DNA-Bereiche enthalten, die eine Propagation der Vektoren in Bakterien wie z. B. E.coli ermöglichen. Die regulatorischen Elemente umfassen auch Sequenzen, die eine Stabilisierung der rekombinanten Nukleinsäuremoleküle in den Wirtszellen bewirken. Insbesondere umfassen solche regulatorischen Elemente Sequenzen, die eine stabile Integration des rekombinanten Nukleinsäuremoleküls in das Wirtsgenom der Pflanze oder eine autonome Replikation des rekombinanten Nukleinsäuremoleküls in den Pflanzenzellen ermöglichen. Solche regulatorischen Elemente sind dem Fachmann bekannt. Ferner sind im rekombinanten Nukleinsäuremolekül optional Transkriptions- bzw. Terminationssequenzen vorhanden, die der korrekten Beendigung der Transkription dienen, sowie der Addition eines PolyA-Tails an das Transkript dienen können, dem eine Funktion bei der Stabilisierung der Transkripte beigemessen wird. Derartige Elemente sind in der Literatur beschrieben und beliebig austauschbar.
Da die Pflanzengenexpression sehr oft nicht auf die Transkriptionsebene beschränkt ist, enthält eine Pflanzen-Expressionskassette vorzugsweise zusätzlich zu den oben beschriebenen Elemente andere funktionsfähig verbundene Sequenzen, wie Translationsenhancer, beispielsweise die Overdrive-Sequenz, welche die 5'- untranslatierte Leader-Sequenz aus Tabakmosaikvirus, die das Protein/RNA- Verhältnis erhöht, enthält (Gallie et al. (1987) Nucl. Acids Research 15: 8693-8711).
Schließlich erfolgt die Herstellung chimärer Genkonstrukte, in denen die kodierenden DNA-Sequenzen unter der Kontrolle von regulatorischen Sequenzen stehen, die eine Expression in Pflanzenzellen gewährleisten, mittels konventioneller Klonierungsmethoden (siehe beispielsweise Sambrook und Russell (2001), vide supra).
Die vorliegende Erfindung betrifft somit ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül, umfassend: a) regulatorische Sequenzen eines in Pflanzengeweben aktiven Promotors; b) operativ daran gebunden eine DNA-Sequenz, die für einen ET-Regulator kodiert; und c) ggf. operativ daran gebunden regulatorische Sequenzen, die als Transkriptions-, Terminations- und/oder Polyadenylierungssignale in Pflanzenzellen dienen können.
Die DNA-Sequenz, die einen ET-Regulator kodiert, kann aus natürlichen Quellen isoliert oder nach bekannten Verfahren synthetisiert werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die DNA-Sequenz, die ein aktives ET- Protein kodiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: i. DNA-Sequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die von SEQ ID No. 1, 3 oder 5 oder Fragmenten davon kodiert werden, ii. DNA-Sequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die für Proteine mit der in SEQ ID No. 2, 4 oder 6 angegebenen Aminosäuresequenz oder Fragmente davon kodieren, iii. DNA- Sequenzen, die zu einer der in SEQ ID No. 1, 3 oder 5 angegebenen Nukleotidsequenzen eine Sequenzidentität von mindestens 80% aufweisen, und/oder iv. DNA-Sequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die unter stringenten Bedingungen mit einem komplementären Strang einer Nukleotidsequenz von i) bis iii) hybridisieren.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform stammt die beschriebene, für ein ET-Protein kodierende DNA-Sequenz aus Brassica napus (wie in SEQ ID No. 1 angegeben).
Mittels gängiger molekularbiologischer Techniken (siehe beispielsweise Sambrook und Russell (2001) vide supra), ist es möglich, gewünschte Konstrukte für die Transformation von Pflanzen vorzubereiten bzw. herzustellen. Die für die gentechnologische Manipulation in prokaryontischen Zellen üblicherweise eingesetzten Klonierungs-, Mutagenisierungs-, Sequenzanalyse-, Restriktionsanalyse- und weitere biochemisch-molekularbiologische Methoden sind dem Durchschnittsfachmann wohl bekannt.
Die Erfindung betrifft weiterhin Vektoren und Mikroorganismen, die erfindungsgemäße Nukleinsäuremoleküle enthalten und deren Verwendung die Herstellung von Pflanzenzellen und Pflanzen ermöglicht, in denen Gibberellinsäure- abhängige Prozesse gehemmt sind. Dabei handelt es sich bei den Vektoren insbesondere um Plasmide, Cosmide, Viren, Bakteriophagen und andere in der Gentechnik gängige Vektoren. Bei den Mikroorganismen handelt es sich in erster Linie um Bakterien, Viren, Pilze, Hefen und Algen.
Die verwendeten rekombinanten Expressionsvektoren zur Expression der ET- Proteine können sowohl in prokaryotischen als auch in eukaryotischen Zellen aktiv sein. Dies ist vorteilhaft, da häufig Zwischenschritte der Vektorkonstruktion der Einfachheit halber in Mikroorganismen durchgeführt werden. Diese Klonierungsvektoren enthalten ein Replikationssignal für den entsprechenden Mikroorganismus und ein Markergen zur Selektion erfolgreich transformierter Bakterienzellen. Zur Expression in prokaryotischen Organismen geeignete Vektoren sind dem Fachmann bekannt, zu diesen gehören z.B. in E. coli pLG338, pACYCl 84, die pBR-Reihe, wie z.B. pBR322, die pUC-Reihe, wie z.B. pUC18 oder pUC19, die Ml 13mp-Reihe, pKC30, pRep4, pHSl, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-IIIl 13-B1, λgtl 1 oder pBdCl, in Streptomyces pIJlOl, pIJ364, pIJ702 oder pIJ361, in Bacillus pUBl 10, pC194 oder pBD214, in Corynebacterium pSA77 oder pAJ667. Bei einer weiteren Ausführungsform stellt der Expressionsvektor einen Hefeexpressionsvektor oder einen Bacillovirus-Expressionsvektor dar.
Die oben genannten Vektoren bieten nur einen kleinen Überblick über mögliche geeignete Vektoren. Weitere Plasmide sind dem Fachmann bekannt und sind z.B. beschrieben in: Cloning Vectors (Hrsg. Pouwels, P.H. et al. Elsevier, Amsterdam, New York-Oxford, 1985). Weitere geeignete Expressionssysteme für prokaryotische und eukaryotische Zellen siehe in den Kapiteln 15 und 16 von Sambrook und Russell, vide supra.
Bei einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens können die ET-Proteine in einzelligen Pflanzenzellen (wie Algen), siehe Falciatore et al., 1999, Marine Biotechnology 1 (3):239-251 und darin zitierte Literaturangaben, und Pflanzenzellen aus höheren Pflanzen (z.B. Spermatophyten, wie Feldfrüchten) exprimiert werden. Beispiele für Pflanzen-Expressionsvektoren umfassen solche, die eingehend beschrieben sind in: Becker, D., Kemper, E., Schell, J., und Masterson, R. (1992), Plant Mol. Biol. 20:1195-1197; und Bevan, M.W. (1984), Nucl. Acids Res. 12:8711- 8721; Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsgb.: Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15- 38.
Des Weiteren wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein rekombinantes ET- Protein, insbesondere ein ET-Protein mit der SEQ ID No. 2, bereitgestellt.
Weiter betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Erzeugung von Pflanzen bzw.
Pflanzenzellen mit gegenüber Wildtyp-Pflanzen bzw. -Pflanzenzellen gehemmten Gibberellinsäure-abhängigen Prozessen, umfassend die folgenden Schritte: a) Herstellung eines rekombinanten Nukleinsäuremoleküls, das folgende Sequenzen umfasst: - regulatorische Sequenzen eines in Pflanzen aktiven Promotors; - operativ daran gebunden eine DNA-Sequenz, die ein ET-Protein kodiert; und optional operativ daran gebunden regulatorische Sequenzen, die als Transkriptions-, Terminations- und/oder Polyadenylierungssignale in Pflanzenzellen dienen können; b) Übertragung des Nukleinsäuremoleküls aus a) auf pflanzliche Zellen; und c) gegebenenfalls die Regeneration intakter Pflanzen aus den transformierten Pflanzenzellen.
Die Erfindung betrifft ferner transgene Pflanzenzellen, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle, die ein ET-Protein kodieren, enthalten und in denen die Menge des negativen Regulators im Vergleich zu Wildtyppflanzen erhöht ist. Die Erfindung betrifft ebenfalls transgene Ernteprodukte und transgenes Vermehrungsmaterial transgener Pflanzen sowie die transgenen Pflanzen selbst, die ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül enthalten. Transgene Pflanzen der vorliegenden Erfindung weisen aufgrund der Einführung einer ET-kodierenden DNA-Sequenz gegenüber Wildtyppflanzen gehemmte GA-abhängige Prozesse auf.
"Transgen" bzw. "rekombinant" im Sinne der Erfindung bedeutet bezüglich zum Beispiel einer Nukleinsäuresequenz, einer Expressionskassette (= Genkonstrukt) oder einem Vektor enthaltend die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz oder einem Organismus transformiert mit den erfindungsgemäßen
Nukleinsäuresequenzen, Expressionskassetten oder Vektoren alle solche durch gentechnische Methoden zustande gekommenen Konstruktionen, in denen sich entweder a) die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz, oder b) eine mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz funktioneil verknüpfte genetische Kontrollsequenz, zum Beispiel ein Promotor, oder c) a) und b)
nicht in ihrer natürlichen, genetischen Umgebung befindet oder durch gentechnische Methoden modifiziert wurde, wobei die Modifikation beispielhaft eine Substitution, Addition, Deletion, Inversion oder Insertion eines oder mehrerer Nukleotidreste sein kann. Natürliche genetische Umgebung meint den natürlichen genomischen bzw. chromosomalen Locus in dem Herkunftsorganismus oder das Vorliegen in einer genomischen Bibliothek. Im Fall einer genomischen Bibliothek ist die natürliche, genetische Umgebung der Nukleinsäuresequenz bevorzugt zumindest noch teilweise erhalten. Die Umgebung flankiert die Nukleinsäuresequenz zumindest an einer Seite und hat eine Sequenzlänge von mindestens 50 bp, bevorzugt mindestens 500 bp, besonders bevorzugt mindestens 1000 bp, ganz besonders bevorzugt mindestens 5000 bp. Eine natürlich vorkommende Expressionskassette - beispielsweise die natürlich vorkommende Kombination des natürlichen Promotors des ET-Faktors mit den entsprechenden Genen, die für den ET-Faktor kodieren - wird zu einer transgenen Expressionskassette, wenn diese durch nicht-natürliche, synthetische ("künstliche") Verfahren wie beispielsweise eine Mutagenisierung geändert wird. Entsprechende Verfahren sind beispielsweise beschrieben in US 5,565,350 oder WO 00/15815.
Unter einer transgenen Pflanze bzw. Pflanzenzelle im Sinne der Erfindung ist wie oben ausgeführt zu verstehen, dass sich die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren nicht an ihrer natürlichen Stelle im Genom der Pflanze bzw. Pflanzenzelle befinden, wobei die Nukleinsäuren homolog oder heterolog exprimiert werden können. Transgen bedeutet aber auch, dass die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren zwar an ihrem natürlichen Platz im Genom eines Organismus sind, dass jedoch die Sequenz gegenüber der natürlichen Sequenz verändert wurde und/oder dass die Regulationssequenzen der natürlichen Sequenzen verändert wurden. Bevorzugt ist unter transgen die Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren an nicht natürlicher Stelle im Genom zu verstehen, das heißt eine homologe oder bevorzugt heterologe Expression der Nukleinsäuren liegt vor.
Für den Fachmann ist klar, dass die für die Herstellung der transgenen Pflanze bzw. Pflanzenzelle verwendete Nukleinsäuresequenz, die für einen ET-Faktor kodiert, ggf. an die Organismus-spezifische Kodonverwendung angepasst werden muss. Die Kodonverwendung lässt sich anhand von Computerauswertungen anderer bekannter Gene des gewählten Organismus bestimmen.
Zur Vorbereitung der Einführung fremder Gene in höhere Pflanzen bzw. deren Zellen stehen eine große Anzahl von Klonierungsvektoren zur Verfügung, die ein Replikationssignal für E. coli und ein Markergen zur Selektion transformierter Bakterienzellen enthalten. Beispiele für derartige Vektoren sind pBR322, pUC- Serien, M13mp-Serien, pACYC184 usw. Die gewünschte Sequenz kann an einer passenden Restriktionsschnittstelle in den Vektor eingeführt werden. Das erhaltene Plasmid wird dann für die Transformation von E. co/z-Zellen verwendet. Transformierte E. co/z'-Zellen werden in einem geeigneten Medium gezüchtet und anschließend geerntet und lysiert, und das Plasmid wird wiedergewonnen. Als Analysemethoden zur Charakterisierung der gewonnenen Plasmid-DNA werden im Allgemeinen Restriktionsanalysen, Gelelektrophoresen und weitere biochemisch- molekularbiologische Methoden eingesetzt. Nach jeder Manipulation kann die Plasmid-DNA gespalten und daraus gewonnene DNA-Fragmente mit anderen DNA- Sequenzen verknüpft werden. Wie bereits erwähnt, stehen für die Einführung von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle eine Vielzahl von Techniken zur Verfügung, wobei der Fachmann die jeweils geeignete Methode ohne Schwierigkeiten ermitteln kann. Diese Techniken umfassen die Transformation pflanzlicher Zellen mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes als Transformationsmedium, die Fusion von Protoplasten, die Injektion, die Elektroporation, den direkten Gentransfer isolierter DNA in Protoplasten, die Einbringimg von DNA mittels biolistischer Methoden sowie weitere Möglichkeiten, die bereits seit mehreren Jahren gut etabliert sind und zum üblichen Repertoire des Fachmanns in der pflanzlichen Molekularbiologie bzw. Pflanzenbiotechnologie gehören.
Bei der Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzenzellen werden per se keine speziellen Anforderungen an die verwendeten Plasmide gestellt. Ähnliches gilt für den direkten Gentransfer. Es können einfache Plasmide, wie z. B. pUC-Derivate verwendet werden. Sollen aber aus derartig transformierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert werden, ist die Anwesenheit eines selektierbaren Markergens empfehlenswert. Dem Fachmann sind die gängigen Selektionsmarker bekannt, und es stellt für ihn kein Problem dar, einen geeigneten Marker auszuwählen.
Je nach Einführungsmethode der gewünschten Gene in die Pflanzenzelle können weitere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Wird z. B. zur Transformation der Pflanzenzelle das Ti- oder Ri-Plasmid verwendet, so muss mindestens die rechte Begrenzung, häufig jedoch die rechte und linke Begrenzung der im Ti- bzw. Ri- Plasmid enthaltenen T-DNA als Flankenbereich mit den einzuführenden Genen verbunden werden. Werden zur Transformation Agrobakterien verwendet, muss die einzuführende DNA in spezielle Plasmide kloniert werden, und zwar entweder in einen intermediären oder in einen binären Vektor.
Die intermediären Vektoren können aufgrund von Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind, durch homologe Rekombination in das T?i- oder Ri- Plasmid der Agrobakterien integriert werden. Dieses enthält außerdem die für den Transfer der T-DNA notwendige vir-Region. Intermediäre Vektoren können allerdings nicht in Agrobakterien replizieren. Mittels eines Helferplasm ds kann der intermediäre Vektor auf Agrobacterium tumefaciens übertragen werden (Konjugation).
Binäre Vektoren dagegen können sowohl in E. coli als auch in Agrobakterien replizieren. Sie enthalten ein Selektionsmarkergen und einen Linker odesr Polylinker, welche von der rechten und linken T-DNA-Grenzregion eingerahmt werden. Sie können direkt in die Agrobakterien transformiert werden. Das als Wirtszelle dienende Agrobakterium soll ein Plasmid enthalten, welches eine vir-Se quenz innerhalb der T-DNA trägt, welche in die Pflanzenzelle übertragen wir . Zusätzliche T-DNA kann vorhanden sein. Das derartig transformierte Agrobakterium wird zur Transformation von Pflanzenzellen verwendet. Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen ist intensiv untersucht und ausreichend in allseits bekannten Übersichtsartikeln und Handbüchern zur Pflanzentransformation beschrieben worden.
Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflanzen-Explantate zweck- mäßigerweise mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes kultiviert werden. Aus dem infizierten Pflanzenmaterial (z. B. Blattstüc- e, Stengelsegmente, Wurzeln, aber auch Protoplasten oder Suspensions-kialtivierte Pflanzenzellen) können dann in einem geeigneten Medium, welches Aαübiotika oder Biozide zur Selektion transformierter Zellen enthalten kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden.
Während die Transformation dikotyler Pflanzen bzw. derer Zellen über Ti-Plasmid- Vektorsysteme mit Hilfe von Agrobacterium tumefaciens wohl etabliert ist, weisen neuere Arbeiten daraufhin, dass auch monokotyle Pflanzen bzw. deren Zellen der Transformation mittels auf Agrobakterien basierender Vektoren sehr wohl zugänglich sind (siehe u.a. Chan et al. (1993), Plant Mol. Biol. 22, 491-506).
Alternative Systeme zur Transformation von monokotylen Pflanzen bzw. deren
Zellen sind die Transformation mittels des biolistischen Ansatzes (Wan und Lemaux (1994) Plant Physiol. 104, 37-48; Vasil et al. (1993) Bio/Technology 11, 1553-1558; Ritala et al. (1994) Plant Mol. Biol. 24, 317-325; Spencer et al. (1990), Theor. Appl. Genet. 79, 625-631), die Protoplasten-Transformation, die Elektroporation von partiell permeabilisierten Zellen sowie die Einbringung von DNA mittels Glasfasern.
Ist die eingeführte DNA einmal im Genom der Pflanzenzelle integriert, so ist sie dort in der Regel stabil und bleibt auch in den Nachkommen der ursprünglich transformierten Zelle erhalten. Sie enthält normalerweise einen Selektionsmarker, der den transformierten Pflanzenzellen Resistenz gegenüber einem Biozid oder einem Antibiotikum wie Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin, Methotrexat, Glyphosat, Streptomycin, Sulfonylharnstoff, Gentamycin oder Phosphinotricin u.a. vermittelt. Der individuell gewählte Marker sollte daher die Selektion transformierter Zellen gegenüber Zellen, denen die eingeführte DNA fehlt, gestatten. Hierzu sind auch alternative Marker geeignet, wie nutritive Marker oder Screeningmarker (wie GFP, green fluorescent protein). Selbstverständlich kann auch vollkommen auf Selektionsmarker verzichtet werden, was allerdings mit einem ziemlich hohen Screeningbedarf einhergeht. Falls markerfreie transgene Pflanzen erwünscht sind, stehen dem Fachmann auch Strategien zur Verfügung, die eine nachträgliche Entfernung des Markergens erlauben, z. B. Cotransformation oder Sequenzspezifische Rekombinasen.
Die erfindungsgemäßen Pflanzenzellen umfassen differenzierte und undifferenzierte Pflanzenzellen einschließlich Protoplasten, die durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellt wurden und die die im Folgenden beschriebenen Nukleinsäuremoleküle in das pflanzliche Genom integriert haben oder diese als autonom replizierende Moleküle enthalten.
Die Regeneration der transgenen Pflanzen aus transgenen Pflanzenzellen erfolgt nach üblichen Regenerationsmethoden unter Verwendung bekannter Nährmedien. Die so erhaltenen Pflanzen können dann mittels üblicher Verfahren, einschließlich molekularbiologischer Methoden, wie PCR, Blot- Analysen, auf Anwesenheit der eingeführten Nukleinsäure, die ein ET-Protein kodiert bzw. auf Anwesenheit des Genprodukts, also des ET-Proteins, untersucht werden.
Die transformierten Zellen wachsen innerhalb der Pflanze in der üblichen Weise (siehe auch McCormick et al. (1986), Plant Cell Reports 5, 81-84). Die resultierenden Pflanzen können normal angezogen werden und mit Pflanzen, die die gleiche transformierte Erbanlage oder andere Erbanlagen besitzen, gekreuzt werden. Die daraus entstehenden hybriden Individuen besitzen die entsprechenden phänotypischen Eigenschaften.
Es sollten zwei oder mehrere Generationen angezogen werden, um sicherzustellen, dass das phänotypische Merkmal stabil beibehalten und vererbt wird. Auch sollten Samen geerntet werden, um sicherzustellen, dass der entsprechende Phänotyp oder andere Eigenarten erhalten geblieben sind. Ebenso können nach üblichen Methoden transgene Linien bestimmt werden, die für die neuen Nukleinsäuremoleküle homozygot sind und ihr phänotypisches Verhalten hinsichtlich einer vorhandenen bzw. nicht vorhandenen Pathogen-Responsivität untersucht und mit dem von hemizygoten Linien verglichen werden.
Selbstverständlich können Pflanzenzellen, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle enthalten, auch als Pflanzenzellen (einschließlich Protoplasten, Kalli, Suspensionskulturen und dergleichen) weiterkultiviert werden.
Bei der transgenen Pflanze bzw. den transgenen Pflanzenzellen kann es sich um jede beliebige monokotyle oder dikotyle Pflanze bzw. Pflanzenzelle handeln, in der Gibberellinsäure-abhängige Prozesse gehemmt werden sollen. Vorzugsweise handelt es sich um Nutzpflanzen bzw. Zellen von Nutzpflanzen. Ebenfalls bevorzugt sind Zierpflanzen bzw. Zellen von Zierpflanzen, bei denen ein buschiges Wachstum erwünscht ist. Besonders bevorzugt handelt es sich um dikotyle Pflanzen wie Nutzholzgewächse, Kartoffel, Mango, Chrysantheme, Weihnachtsstern bzw. monokotyle Pflanzen wie z. B. Reis, Weizen, Rasengräser. Prinzipiell ist jede Pflanze geeignet, bei der eine normale Reaktion auf GA zu unerwünschten Eigenschaften führt.
Die Erfindung betrifft ebenfalls transgenes Vermehrungsmaterial und transgene Ernteprodukte der erfindungsgemäßen Pflanzen, beispielsweise Früchte, Samen, Knollen, Wurzelstöcke, Sämlinge, Stecklinge usw.
Die Erfindung betrifft weiterhin Zellulose, gewonnen aus transgenen Nutzholzpflanzen mit gehemmten Gibberellinsäure-abhängigen Prozessen, deren Zellulosegehalt gegenüber Wildtyppflanzen erhöht ist, wobei die Zellulose mittels in der Papierindustrie üblicher Methoden aus dem Nutzholz gewonnen wird.
Die spezifische Expression des ET-Proteins in den erfindungsgemäßen Pflanzen bzw. in den erfindungsgemäßen Pflanzenzellen kann mit Hilfe herkömmlicher molekularbiologischer und biochemischer Methoden nachgewiesen und verfolgt werden. Dem Fachmann sind diese Techniken bekannt und er ist problemlos in der Lage, eine geeignete Nachweismethode zu wählen, beispielsweise eine Northern- Blot-Analyse zum Nachweis ET-spezifischer RNA bzw. zur Bestimmung der Höhe der Akkumulation von ET-spezifischer RNA oder eine Southern-Blot- Analyse zum Nachweis von für ET kodierenden DNA-Sequenzen.
Die vorliegende Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen, die nur der Veranschaulichung der Erfindung dienen und in keiner Weise als Einschränkung zu verstehen sind, erläutert.
Beispiele
1) Isolierung von ET-Sequenzen durch Southwestern-Screening
Das Southwestern-Screening (Somssich IE und Weisshaar B. (1996) Expression library screening. In: Plant Gene Isolation: Principles and Practice. Foster GD und Twell D (Hrsg.) John Wiley & Sons Ltd.) wurde durchgeführt mit amplifizierten λZAPII cDNA Expressionsbibliotheken (Clontech, Palo Alto, CA, USA). Im
Primärscreen wurden etwa 6xl05 PFU (plaque-bildende Einheiten) getestet unter Verwendung entweder einer Bibliothek aus unreifen Brassica napus- (Taipalensuu J. et al. (1997) Eur. J. Biochem. 243: 605-611) oder Vicafaba-Sa en (Wohlfarth T, 1996: Regulation samenspezifischer Gene der Ackerbohne Viciαfαbα: Analyse von cis-Elementen sowie Isolierung und Charakterisierung von Transkriptionsfaktoren. Dissertation, Martin-Luther-Universität, Halle- Wittenberg, Deutschland). Die Oligonukleotide, die als Proben verwendet wurden, wurden synthetisiert nach den Sequenzen des napA-Promotors aus B. napus (EMBL/Genbank accession number J02798), des USP- (EMBL/Genbank accession number X56240) oder des Legumin B4- (LeB4) Promotors (EMBL/Genbank accession number X03677) aus V. faba. Die Oligonukleotide wurden so konstruiert, dass sie nach dem Aneinanderheften doppelsträngige phosphorylierte Proben mit entweder 3' zurückgesetzten (recessed) Enden oder BamHl- oder EcoRI-kohäsiven (sticky) Enden ergaben, um die Oligomerisierung durch Ligation zu ermöglichen. Die konkatamerisierten
Oligonukleotide (durchschnittlich 200 bp) wurden durch Nick-Translation unter Verwendung von α-[32P]-dNTPs (Amersham International, Amersham, UK) markiert. Das Southwestern-Screening wurde durchgeführt mit einem Inkubationspuffer, der aus 25 mM HEPES (pH 8,0), 0,1 mM EDTA, 4 mM KC1, 7 % Glycerin, 1 mM MgCl2, 0,5 mM DTT and 1,0 mM ZnSO4 zusammengesetzt war.
Das Sequenzieren des Inserts der ausgeschnittenen Plasmide wurde für beide Stränge mit dem Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kit und einem Applied Biosystem 373A DNA-Sequencer (Applied Biosystem, Foster City, CA, USA) durchgeführt. In den einzelnen Schritten wurden molekularbiologische Standardtechniken angewandt (Ausubel et al. (1996) Current protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, NY, U. S. A; Sambrook und Russell, 2001, vide supra).
2) Klonierung des BnET-Expressionsvektors und Regeneration transgener Pflanzen
Standardtechniken für das Klonieren und Sequenzieren wurden durchgeführt nach Ausubel et al. (1996, vide supra). BnET, das aus einer Samen-spezifischen cDNA- Bibliothek von Brassica napus isoliert worden war, wurde durch PCR mit Primern, die zusätzliche Ncol-Schnittstellen enthielten, amplifiziert. Das Fragment wurde in den pCR-Script Vektor (Stratagene) kloniert und sequenziert. Danach wurde die BnET cDNA direkt in den binären Vektor pBinAR (Höfgens R. und Willmitzer L. (1990) Plant Science 66: 221-230) kloniert. Die Regeneration der transgenen Pflanzen erfolgte wie beschrieben (Bäumlein, H. et al, (1991) Mol. Gen. Genet. 225: 459-467; Bäumlein, H. et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 225: 121-128.).
3) Transiente Expression von BnET in Tabakprotoplasten
Für die Protoplastenisolierung wurden Suspensionskulturen von Nicotiana tabacum verwendet. Nach dem Verdau der Zellwand in einer Lösung mit 1 % Zellulase RIO und 0,5%o Macerozym RIO (Duchefa Biochemie, Niederlande) wurden die Protoplasten zentrifugiert und zweimal mit W5-Medium (0,9% NaCl, 1,8% CaCl2, 0,04%) KC1, 0,1 % Glucose, pH 5,6) gewaschen. Dann wurden sie in Mg-Mannitol (0,45 M Mannitol, 15 mM MgCl2, 0,1% MES, pH 5,6) auf eine Dichte von etwa 3x106 Zellen ml konzentriert. Um die resultierenden Protoplasten zu transformieren, wurde eine Lösung, die Plasmid-DNA (5 μg von jedem Plasmid) und Träger-DNA (160 μg) enthielt, zu 330 μl Mg-Mannitol mit lxl 06 Protoplasten zugegeben. Nach 10 Minuten Inkubation wurde dem Gemisch die gleiche Menge PEG-Lösung (40%) PEG 6000, 0,1 M Ca(NO3)2, 0,4 M Mannitol, 0,1% MES, pH 6,5) zugegeben. Nach 20 Minuten wurden die transformierten Protoplasten in 4 ml K3 -Medium verdünnt und in kleine Petrischalen überführt. Nach einer Inkubation mit lOμM GA (Duchefa Biochemie, Niederlande) für 16 bis 18 Stunden bei 25°C in der Dunkelheit wurden die Protoplasten geerntet und die GUS -Aktivität durch einen Chemiluminiszenz- Assay mit dem GUS-Light TM Kit (Tropix, Bedford, USA) und einem Lumat LB9501 Luminometer (Berthold) bestimmt. Die Ergebnisse dieser Messung sind in Abbildung 2 dargestellt. Als Reporterkonstrukt wurde das GUS -Reportergen unter der Kontrolle des Aquaporin-Promotors (Kaldenhoff R. et al. (1996) Journal of Photochemistry Photobiology 36 (3): 351-354) verwendet. Ein Kontrollkonstrukt, das das GUS -Reportergen unter der Kontrolle des 35S CaMV-Promotors enthielt, wurde in diesem System effizient exprimiert und verwendet, um die verschiedenen Experimente zu standardisieren.
4) Untersuchung der Samenkeimung
Die Oberfläche der Samen aus Wildtyp- und BnET-transgenen Pflanzen wurde sterilisiert und jeweils 100 Samen wurden in jeweils fünf Petrischalen überführt, die 1 x Murashige/Skoog-Medium enthielten. Nach der Stratifizierung bei 4°C für drei Tage bei gedämpftem Licht wurden die Samen bei 22°C unter Langtagbedingungen (18L/6D) gekeimt. Die Ergebnisse dieses Versuchs sind in Abbildung 4 dargestellt.
Beschreibung der Abbildungen
Abb. 1 : Sequenzvergleich der zinkbindenden Domänen der Regulatoren aus den Spezies Viciafaba, Brassica napus und Arabidopsis thaliana
Die Kleinbuchstaben a bis d stellen jeweils unterschiedliche Motive innerhalb eines Proteins dar. Die fett und unterstrichen markierten Aminosäuren entsprechen den im Konsensusmotiv konservierten Aminosäuren.
Abb. 2: Reduktion der GA-Induktion des GA-responsiven Aquaporin-Promotors (NtAqPl) durch die transiente Expression von BnET in Tabakprotoplasten
Die Stimulation der Protoplasten mit lOμM GA für 16 Stunden führt zu einer erhöhten Aktivität des GA-abhängigen Aquaporin-Promotors und einer erhöhten
Expression des Reportergens GUS. Exprimieren die Protoplasten das ET-Protein aus Brassica napus, ist die GA-Induktion des Promotors blockiert. Ein Kontrollkonstrukt, das das GUS -Reportergen unter der Kontrolle des 35S CaMV- Promotors enthielt, wurde in diesem System effizient exprimiert und verwendet, um die verschiedenen Experimente zu standardisieren. Die einzelnen Balken repräsentieren unterschiedliche Experimente.
Abb. 3: Ektopische Expression des BnET-Gens führt zu Zwergwachstum
Auf der linken Seite sind jeweils die Wildtyp-Kontrollpflanzen von Arabidopsis thaliana (oben) bzw. Nicotiana tabacum (unten) und auf der rechten Seite unabhängige transgene Linien von Arabidopsis thaliana (oben) bzw. Nicotiana tabacum (unten) gezeigt. Die transgenen Linien enthalten jeweils ein Nukleinsäuremolekül, das die BnET-sense-Sequenz unter der Kontrolle des 35S CaMN-Promotors exprimiert. Die Bilder der Pflanzen wurden bei Nicotiana tabacum nach 30 Tagen und bei Arabidopsis thaliana nach 20 Tagen aufgenommen.
Abb. 4: Reduktion der Keimung durch ektopische Expression des BnET-Gens
Es wurde die Keimung von Samen aus Wildtyp-Kontrollpflanzen und transgenen Tabaklinien untersucht, die das BnET-Transgen unter der Kontrolle des 35 S CaMN- Promotors exprimieren. Während die Wildtyp-Samen innerhalb von 60 Stunden zu 100% auskeimen, erreichen die transgenen Samen selbst nach 350 Stunden nur eine Keimungsrate von etwa 30%.
Abb. 5: Stammanatomie von Tabakpflanzen, die ektopisch BnET exprimieren, im Vergleich zu Wildtyp-Pflanzen
Hellfeld- (a-f) und Fluoreszenzmikroskopieaufnahmen (g, h) von Schnitten durch den Stamm zwischen dem siebten und achten Νodium. Die transversen und longitudinalen halbdünnen Schnitte von fixiertem Material zeigen eine reduzierte Bildung der sekundären Zellwand in Pflanzen, die ektopisch BnET exprimieren (b, d, f) verglichen mit Wildtyp (a, c, e). Die Autofluoreszenz von lignifizierten sekundären Zellwänden von frischen Stammschnitten wurde nach Anregung mit Blaulicht nachgewiesen. Verglichen mit dem hellen Signal des Xylems im Wildtyp (g) konnte kein signifikantes Fluoreszenzsignal in den Schnitten der BnET- exprimierenden Pflanzen (h) nachgewiesen werden. Alle mikroskopischen Untersuchungen wurden mit mindestens drei verschiedenen transgenen Pflanzen mit vergleichbaren Ergebnissen durchgeführt. mX, Metaxylem; Ph, Phloem; pX, Protoxylem. Maßstab = 150μm.

Claims

P A T E N T A N S P R Ü C H E
1. Verfahren zur Hemmung Gibberellinsäure-abhängiger Prozesse in transgenen Pflanzen und Pflanzenzellen, dadurch gekennzeichnet, dass eine DNA-Sequenz, die für ein Protein kodiert, das eine oder mehrere Wiederholungen der Aminosäuresequenz
C-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7- 8-X9-C-X10-X11-X12-X13- M-X15- 16-X17-X18- C-X19-X20-HK-GMR aufweist, wobei es sich bei Xi bis X20 um beliebige Aminosäuren handelt, und das die Aktivität eines negativen Regulators Gibberellinsäure-abhängiger Prozesse besitzt, in die Pflanze bzw. Pflanzenzelle eingeführt und dort exprimiert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei Xi um G, bei 4 um L, bei Xι3 um P, bei
Xι4 um V und bei Xπ um R handelt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei X2 um V oder F, bevorzugt um V; bei X3 um I oder K; bei X5 um D, P, H, C oder Y; bei X6 um D, E oder N, bevorzugt um D oder N; bei X um M oder G; bei X8 um S, V, E, L oder I, bevorzugt um S; bei X9 um I, R, P oder V; bei Xio um S, R, N oder E; bei Xu um K, R oder S, bevorzugt um K; bei Xi2 um M, K, T, R oder S; bei X15 um G, S, P oder K; bei Xι6 um K, G oder R, bevorzugt um G; bei Xι8 um V oder K, bevorzugt um K; bei Xι9 um N, E oder Q, bevorzugt um E; und/oder bei X20 um E oder D, bevorzugt um E handelt.
4. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-Sequenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: i. DNA-Sequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die von SEQ ID No. 1, 3 oder 5 oder Fragmenten davon kodiert werden, ii. DNA-Sequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die für Proteine mit der in SEQ ID No. 2, 4 oder 6 angegebenen Aminosäuresequenz oder Fragmente davon kodieren, iii. DNA-Sequenzen, die zu einer der in SEQ ID No. 1, 3 oder 5 angegebenen Nukleotidsequenzen eine Sequenzidentität von mindestens 80 % aufweisen, und/oder iv. DNA-Sequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die unter stringenten Bedingungen mit einem komplementären Strang einer Nukleotidsequenz von i) bis iii) hybridisieren.
5. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin die DNA- Sequenz aus Brassica napus stammt.
6. Isoliertes Nukleinsäuremolekül, enthaltend eine Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: i. DNA-Sequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die von SEQ ID No. 1 oder Fragmenten davon kodiert werden, ii. DNA-Sequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die für Proteine mit der in SEQ ID No. 2 angegebenen Aminosäuresequenz oder Fragmente davon kodieren, iii. DNA-Sequenzen, die zu der in SEQ ID No. 1 angegebenen Nukleotidsequenz eine Sequenzidentität von mindestens 80 % aufweisen, und/oder iv. DNA-Sequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die unter stringenten Bedingungen mit einem komplementären Strang einer Nukleotidsequenz von i) bis iii) hybridisieren.
7. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 6, wobei die
Nukleinsäuresequenz aus Brassica napus stammt.
8. Rekombinantes Nukleinsäuremolekül, umfassend die folgenden Elemente in 5 '-3 '-Orientierung: - regulatorische Sequenzen eines in Pflanzenzellen aktiven Promotors,
- operativ daran gebunden eine DNA-Sequenz wie in Anspruch 4 angegeben,
- ggf. operativ daran gebunden regulatorische Sequenzen, die in der Pflanzenzelle als Transkriptions-, Terminations- und/oder Polyadenylierungssignale dienen können.
9. Rekombinantes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-Sequenz unter der Kontrolle eines konstitutitven Promotors, bevorzugt des 35S CaMV- oder Ubiquitinpromotors, oder unter der Kontrolle eines gewebespezifischen Promotors, bevorzugt eines samen-, kambium-, knollen- oder fruchtspezifischen Promotors oder unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors steht.
10. Rekombinantes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der samenspezifische Promotor ein USP-, Phaseo lin-, Vicilin- oder LeguminB4-Promotor ist.
11. Rekombinantes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der kambiumspezifische Promotor ein CAD- Promotor ist.
12. Rekombinantes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der fruchtspezifische Promotor ein Polygalacturonase-, ACC-Oxidase- oder 2A11 -Promotor ist.
13. Rekombinantes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der knollenspezifische Promotor ein Patatin- Promotor ist.
14. Rekombinantes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der induzierbare Promotor ein östrogen- induzierbarer Promotor ist.
15. Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen und Pflanzenzellen mit gehemmten Gibberellinsäure-abhängigen Prozessen nach einem der Ansprüche 1 bis
5, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte umfasst: a) Herstellen eines rekombinanten Nukleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 8 bis 14, b) Übertragen des rekombinanten Nukleinsäuremoleküls aus a) in Pflanzenzellen, c) ggf. Regeneration von Pflanzen aus den transformierten Pflanzenzellen.
16. Transgene Pflanzenzelle, enthaltend eine Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 6 oder 7 oder ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 8 bis 14 oder hergestellt nach Anspruch 15.
17. Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 16, die einen gegenüber Wildtypzellen erhöhten Gehalt eines Proteins nach Anspruch 1 aufweist.
18. Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 16 oder 17, die im Vergleich zu Wildtypzellen gehemmte Gibberellinsäure-abhängige Prozesse aufweist.
19. Transgene Pflanze, enthaltend eine Pflanzenzelle nach einem der Ansprüche 16 bis 18 oder hergestellt nach Anspruch 15, sowie transgene Teile dieser Pflanzen, transgene Ernteprodukte und transgenes Vermehrungsmaterial dieser Pflanzen, wie Protoplasten, Pflanzenzellen, Kalli, Samen, Knollen, Stecklinge, sowie die transgenen Nachkommen dieser Pflanze.
20. Transgene Pflanze nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine monokotyledone Pflanze handelt.
21. Transgene Pflanze nach Anspruch 20, bei der es sich um eine Getreidepflanze oder ein Gras handelt.
22. Transgene Pflanze nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine dikotyledone Pflanze handelt.
23. Transgene Pflanze nach Anspruch 22, bei der es sich um ein Nutzholz handelt.
24. Transgenes Nutzholz nach Anspruch 23 mit gegenüber Wildtyppflanzen erhöhtem Zellulosegehalt.
25. Verwendung einer Pflanze nach Anspruch 23 oder 24 zur Gewinnung von Zellulose.
26. Verwendung von DNA-Sequenzen nach Anspruch 6 oder 7 zur Herstellung von transgenen Pflanzen und Pflanzenzellen mit gehemmten Gibberellinsäure-abhängigen Prozessen.
27. Rekombinantes ET-Protein, kodiert durch eine Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 6 oder 7.
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