DE60027770T2 - Chemisch induzierbarer promoter zur gewinnung von transgenen pflanzen mit stillem marker sowie pflanzen und verfahren die diese benutzen - Google Patents

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Description

  • Transgenische Techniken sind ein wirksames Mittel bei der Bearbeitung von wichtigen biologischen Problemen in multizellulären Organismen geworden, wobei dies insbesondere für das Pflanzengebiet gilt. Viele Ansätze, die mit der traditionellen Genetik nicht durchgeführt werden können, können nun mit den transgenischen Techniken realisiert werden, einschließlich der Einführung von homologen oder heterologen Genen in Pflanzen mit modifizierten Funktionen und veränderten Expressionsmustern. Der Erfolg von diesen Techniken hängt oft von der Verwendung von Markern ab, um die transgenischen Pflanzen zu identifizieren, sowie von den Promotoren zur Steuerung der Expression der Transgene.
  • Selektierbare Marker werden bei der pflanzlichen Transformation in einem großen Umfang verwendet. Historisch waren solche Marker oft dominante Gene, die für eine Antibiotika- oder Herbizidresistenz codierten (Yoder und Goldsbrough, 1994). Obwohl solche Marker sehr nützlich sind, haben sie jedoch auch einige Nachteile. Die für die Selektion der transformierten Zellen verwendeten Antibiotika und Herbizide haben im Allgemeinen negative Auswirkungen auf die Proliferation und Differenzierung und können die Differenzierung von zufälligen Sprossen während des Transformationsverfahrens verzögern (Ebinuma et al., 1997). Ferner sind einige Pflanzenarten nicht empfindlich oder tolerant gegenüber diesen selektiven Mitteln, wodurch es schwierig ist, transformierte und nicht-transformierte Zellen oder Gewebe zu trennen (Ebinuma et al., 1997). Ferner werden diese Gene konstitutiv exprimiert und es gibt Umwelt- und Gesundheitsbedenken hinsichtlich der Insertion von solchen konstitutiv exprimierten Genen in Pflanzen, die außerhalb der Laborumgebung wachsen (Bryant und Leather, 1992; Gressel, 1992; Flavell et al., 1992).
  • Ein Marker, der weder ein Antibiotikum noch ein Herbizid ist, ist das ipt Gen von dem Ti-Plasmid von Agrobacterium tumefaciens. Dieses Gen codiert für die Isopentenyltransferase, die bei der Cytokininsynthese verwendet wird (Barry et al., 1984). Die Isopentenyltransferase verwendet 5'-AMP und Isopentenyldiphosphat für die Katalyse der Bildung von Isopentenyladenosin-5'-monophosphat, dem ersten Intermediat in der Cytokininsynthese. Die Überexpression des ipt Gens führt zu erhöhten Cytokininniveaus (Medford et al., 1989; McKenzie et al., 1998; Faiss et al., 1997; Redig et al., 1996; Ebinuma et al., 1997). Cytokinine sind pflanzliche Hormone, die eine wichtige Rolle bei der pflanzlichen Entwicklung durch das Herbeiführen einer Reihe von morphologischen Veränderungen spielen (Mok und Mok, 1994; Davies, 1995; Coenen und Lomax, 1997). Cytokinine können zum Beispiel die Blattexpansion stimulieren und die Blattseneszenz verzögern (Kuraish und Okumura, 1956; Wingler et al., 1998; Gan und Amasino, 1995). In jungen, im Dunkeln gewachsenen Keimlingen können hohe Cytokininmengen einen deetiolierten Phänotyp hervorbringen, der in seiner Morphologie im Licht gewachsenen Keimlingen mit kurzen Hypokotylen, offenen Haken und verbreiterten Cotyledonen ähnelt (Chaudhury et al., 1993; Miklashevichs und Walden, 1997). Cytokinine können auch laterale Knospen aus Apikaldominanz freisetzen und die de novo Knospenbildung stimulieren (Cline, 1991; Skoog und Miller, 1957; Sachs und Thimmann, 1967). Diese Klasse an Hormonen spielt somit eine wichtige Rolle bei der Bildung von zufälligen Sprossen. Wie von Skoog und Miller (1957) gezeigt, können hohe Cytokininmengen die Sprossbildung aus Tabakkallus induzieren, was eine Voraussetzung für die Regeneration von transgenischen Pflanzen ist. Neben der Unterstützung von Tumorwachstum kann die Einführung von T-DNA in eine pflanzliche Zelle auch die Regeneration von physiologisch abnormalen Sprossen aus transformierten Protoplasten oder Blattscheiben induzieren.
  • Die Überexpression des ipt Gens (Akiyoshi et al., 1984; Barry et al., 1984), das eine Komponente der T-DNA ist, führt zu erhöhtem Cytokinin relativ zu Auxin, was die Sprossregeneration fördert (Tran Thanh Van, 1981). Die Überproduktion von Sprossen kann zu einem Phänotyp mit einer großen Zahl an Sprossen führen (im Folgenden bezeichnet als „Sprossphänotyp"). Dieser Phänotyp kann als ein Marker verwendet werden (Ebinuma et al., 1997). Studien, bei denen das ipt Gen unter der Kontrolle von konstitutiven Promotoren verwendet wurde, zeigten, dass eine ipt Überexpression erhöhte Cytokininmengen in transgenischen Pflanzen hervorruft (Smigocki und Owens, 1988; Medford et al., 1989). Ein chimäres ipt Gen unter der Kontrolle des Blumenkohlmosaikvirus (CaMV)-Promotors wurde in Zellen der Kartoffel (Ooms et al., 1983), Gurke (Smigocki und Owens, 1989) und verschiedenen Nicotiana-Arten (Smigocki und Owens, 1988) eingeführt. Diese transgenischen Zellen proliferierten und zeigten einen extremen Sprossphänotyp und einen Verlust der Apikaldominanz in einem hormonfreien Medium. Studien haben gezeigt, dass in mit ipt zur Überproduktion von Cytokininen transformierten Pflanzen die Cytokinine nur lokal als ein Paracrinhormon wirken (Faiss et al., 1997). Pfropfexperimente, die mit Wildtyp-Tabakpflanzen und Tabakpflanzen, bei denen das ipt Gen überexprimiert war, durchgeführt wurden, zeigten, dass die erhöhte Cytokininmenge auf den Teil der Pflanze beschränkt bleibt, der ipt überexprimiert (Faiss et al., 1997).
  • Ein Problem bei der Verwendung von konstitutiv exprimiertem ipt als ein Marker besteht darin, dass die erzielte, transgenische Pflanze die Apikaldominanz verliert und nicht in der Lage ist, Wurzeln zu bilden aufgrund der Überproduktion von Cytokininen (Ebinuma et al., 1997). Ferner besitzen die Pflanzen, die konsitutiv ipt überexprimieren, eine veränderte Blattmorphologie und eine verzögerte Blattseneszenz. Solche Pflanzen zeigen ein geringes Wurzelwachstum und eine schwache Internodienstreckung, eine verzögerte Blattseneszenz und sind oft steril (Mok und Mok, 1994; Klee et al., 1987; Ebinuma et al., 1997).
  • Ebinuma et al. (1997) entwickelten ein Verfahren zur Verwendung des ipt Markers, um die mit der konstitutiven Überexpression von ipt zusammenhängenden Probleme zu überwinden. Sie entwickelten einen Vektor, in dem das ipt Gen in ein Plasmid eingebaut war, welches das transponible Element Ac umfasste. Das Konstrukt umfasste die T-DNA (Teil des Ti-Plasmides, der in pflanzliche Zellen überführt wird) und den 35S CaMV-Promotor. Dieses Konstrukt wurde in A. tumefaciens transformiert. Blattsegmente wurden mit den transformierten Bakterien inokuliert und wuchsen auf nicht-selektiven Medien. In seltenen Fällen verfehlte das Ac-Element die Re-Integration oder integrierte in ein Schwesterchromatid nach seinem Ausschneiden. Abnormale Sprosse mit einem besonderen Sprosstyp wurden selektiert und für weitere sechs Monate kultiviert. Von diesen wuchsen verschiedene normale Sprosse. Einige von diesen waren ein Ergebnis des transponierbaren Elementes Ac, das aus dem Genom zusammen mit dem ipt Gen ausgeschnitten worden war, wie dies durch DNA-Analyse bestimmt wurde. Einige von diesen Pflanzen behielten die anderen notwendigen Marker, die auch auf dem Plasmid vorlagen. Dieses Verfahren überwindet somit die Probleme der Gegenwart eines konstitutiv exprimierten ipt Gens. Unglücklicherweise erfordert dieses Verfahren mehrere Monate der Kultivierung und führt nur zu wenigen Pflanzen, die das ipt Gen verlieren. Ebinuma et al. (1997) berichteten, dass sechs Monate nach der Infektion die Häufigkeit von Marker freien Pflanzen 0,032 betrug. Ferner basierte die Auswahl von „normalen" Sprossen von den abnormal regenerierten Pflanzen auf einem variablen, morphologischen Kriterium. Die morphologische Selektion unterscheidet ferner nicht zwischen Pflanzen, die das 35S-ipt Gen verloren haben, und chimären Pflanzen oder Pflanzen mit einem sehr niedrigen ipt Expressionsniveau.
  • Die Verwendung von induzierbaren Promotoren ist ein anderes Mittel, das verwendet wurde, um die Probleme zu überwinden, die mit der konstitutiven Überexpression des ipt Gens in transgenischen Pflanzen assoziiert sind. Die Verwendung eines durch Kupfer induzierbaren Promotors zur Regulation der ipt-Expression führte zu der spezifischen Expression des ipt Gens in den Wurzeln, die das Hauptorgan für die Cytokininbiosynthese darstellen (McKenzie et al., 1998). Ferner stellte die durch das Tetracyclin induzierbare System (Gatz et al., 1992) regulierte ipt Expression Daten über die biologischen Wirkungen von Cytokininen in Pflanzen und ihren Transport durch das vaskuläre System bereit (Faiss et al., 1997; Redig et al., 1996). Transgenische Pflanzen, die das ipt Gen unter der Kontrolle von Hitzeschockpromotoren (Medford et al., 1989) und unter der Kontrolle von durch Licht induzierbaren Promotoren (Redig et al., 1996) tragen, wurden auch berichtet. All diese Systeme wurden verwendet, um die biologischen Wirkungen von Cytokininen zu studieren, wobei sie aber nicht für die Transformation verwendet wurden.
  • Das CKI1 Gen wurde vor kurzem identifiziert (Kakimoto, 1996). Die Überproduktion von diesem Gen in Pflanzen führt zu Pflanzen, die typische Cytokininreaktionen zeigen, einschließlich einer schnellen Zellteilung und Sprossbildung in der Gewebekultur in Abwesenheit von exogenem Cytokinin (Kakimoto, 1996). Das CKI1 Gen kann als ein selektierbarer Marker in einer ähnlichen Weise wie ipt verwendet werden, das heißt, das CKI1 Gen kann unter die Kontrolle eines Promotors gestellt werden und in transgenischen, pflanzlichen Zellen überexprimiert werden, so dass eine Sprossbildung in Abwesenheit von exogenen Pflanzenhormonen induziert wird. Solche Sprosse können abgeschnitten werden, um transgenische Pflanzen zu erzielen. Diese Sprosse, die entweder von Zellen abstammen, die mit ipt oder mit CKI1 transformiert wurden, können nicht normal wachsen, solange die Zellen diese Transgene überexprimieren.
  • Das Knotted Gen und Knotted-ähnliche Gene sind eine dritte Gruppe von Genen, die bei Überexpression zu einer ektopischen Produktion von zufälligen Sprossen führen können (Chuck et al., 1996; Lincoln et al., 1994; Matsuoka et al., 1993). Diese können als selektierbare Marker in der gleichen Weise wie bei dem ipt Gen und dem CKI1 Gen verwendet werden. Generell können alle pflanzlichen Gene, welche die Sprossbildung und Entwicklung fördern, als selektierbare Marker in der gleichen Weise wie ipt, CKI1 und Knotted-ähnlich verwendet werden.
  • Zusätzlich zu der Verwendung von Marker für die Identifizierung von transgenischen Pflanzen ist die Verwendung von Promotoren zur Kontrolle der Expression der Transgene ein normaler Teil von solchen Experimenten. In den meisten Experimenten werden die Transgene von einem starken Promotor transkribiert, wie der 35S Promotor des Blumenkohlmosaikvirus (CaMV). Jedoch ist ein flexibleres Genexpressionssystem notwendig, um die großen Vorteile aus der transgenischen Technologie zu gewinnen. Gute, induzierbare Transkriptionssysteme sind erwünscht, da transgenische Pflanzen mit induzierbaren Phänotypen genauso nützlich sind wie konditionale Mutanten, die mit der traditionellen Genetik isoliert wurden. Diesbezüglich wurden verschiedene Induktionssysteme berichtet und erfolgreich verwendet (Ainley und Key, 1990; Gatz et al., 1992; Mett et al., 1993; Weinmann et al., 1994). Von diesen sind die Tetracyclin-abhängigen Expressionssysteme am weitesten fortgeschritten (zur Übersicht siehe Gatz, 1996).
  • Der Glucocorticoidrezeptor (GR) ist ein Mitglied der Familie der tierischen Steroidhormonrezeptoren. GR ist nicht nur ein Rezeptormolekül, sondern auch ein Transkriptionsfaktor, der in Gegenwart eines Glucocorticoids die Transkription von Promotoren aktiviert, die Glucocorticoid-Reaktionselemente (GREs) enthalten (zur Übersicht siehe Beato, 1989; Picard, 1993). Es wurde angenommen, dass das GR-System ein gutes Induktionssystem in Pflanzen sein könnte, da es einfach ist und Glucocorticoid selbst keine pleiotrope Effekte in Pflanzen hervorruft. Unabhängig davon wurde bisher jedoch ein allgemeines und effizientes durch Glucocorticoid induzierbares System unter Verwendung von GR für transgenische Pflanzen nicht erstellt, obwohl gezeigt wurde, dass ein System, welches GR und GREs umfasst, in einem transienten Expressionssystem mit kultivierten pflanzlichen Zellen arbeiten könnte (Schena et al., 1991). Andererseits wurde berichtet, dass die (hormonelle) regulatorische Region (oder Domänen) von GR die Funktion der pflanzlichen Transkriptionsfaktoren in transgenischen Pflanzen regulieren könnte (Aoyama et al., 1995; Lloyd et al., 1994). Lloyd et al. (1994) zeigten, dass die Trichomentwicklung in Arabidopsis erfolgreich durch ein chimäres Protein kontrolliert werden konnte, welches die regulatorischen Glucocorticoid-Domänen und den transkriptionellen Mais-Regulator R umfasste. Die Konstruktion von solch einem chimären Transkriptionsfaktor, dessen Aktivität streng durch die Glucocorticoid-Rezeptordomäne reguliert ist, ist nicht immer einfach und in jedem Fall zu erreichen. Eine strikte Regulation scheint in kritischer Weise abhängig von der intramolekularen Struktur des chimären Proteins zu sein, insbesondere die relative Position zwischen der Glucocorticoid-Rezeptordomäne und der Domäne, dessen Funktion zu regulieren ist.
  • Die regulatorische Region der tierischen Steroidhormonrezeptoren, die eine Hormonbindungsdomäne (HBD) und Bindungsstellen für HSP90 umfassen, scheint repressive Wirkungen auf die kovalent verbundenen Nachbardomänen in Abwesenheit von ihren Erkennungsliganden zu haben. Die Bindung des geeigneten Liganden an eine HBD führt zu einer Derepression (Picard, 1993). Dieser Mechanismus wurde in vorteilhafter Weise verwendet bei der Konstruktion eines Transkriptionsfaktors, bei dem eine konstitutiv aktive, transaktivierende Funktion durch die regulatorische Region der Ratten GR in cis reguliert wird (Picard et al., 1988; Rusconi und Yamamoto, 1987). Ein chimärischer Transkriptionsfaktor, der die DNA-bindende Domäne des Hefe-Transkriptionsfaktor GAL4 (Keegan et al., 1986) und die transaktivierende Domäne des vitalen Herpesprotein VP16 (Triezenberg et al., 1988) umfasst, wurde als eine konstitutiv aktive, transaktivierende Funktion ausgewählt. Von dem chimären Protein GAL4-VP16 wurde angenommen, dass es als ein starker Transkriptionsfaktor in allen Zelltypen wirkt, da bekannt ist, dass die Aktivierungsdomäne von VP16 direkt mit allgemeinen Transkriptionsfaktoren interagiert, von denen angenommen wird, dass sie evolutionär konserviert innerhalb der Eukaryoten sind (Goodrich et al., 1993; Lin et al., 1991; Sadowski et al., 1988). Es wurde gezeigt, dass die regulatorische Region des menschlichen Östrogen-Rezeptors ähnliche chimäre Transkriptionsfaktoren in der Hefe und in tierischen Gewebekulturzellen regulieren kann (Braselmann et al., 1993; Louvion et al., 1993). Die regulatorische Region des Ratten GR wurde zu dem chimären Transkriptionsfaktor zugefügt und der erzielte Hybridtranskriptionsfaktor wurde als „GVG" bezeichnet, da er aus jeweils einer Domäne von GAL4, VP16 und GR besteht. Ein für den GVG-Transkriptionsfaktor codierendes DNA-Fragment wurde zwischen dem Blumenkohlmosaikvirus 35S-Promotor (Odell et al., 1985) und der Poly(A) Additionssequenz des Erbsen-Ribulosebisphosphatcarboxylase-kleine Untereinheit-Gen rbcS-E9 (Coruzzi et al., 1984) angeordnet. Als eine Bindungsstelle für GVG wurde ein DNA-Fragment, das sechs Kopien von GAL4 UAS (einiger et al., 1985) enthielt, 5' zu dem CaMV 35S Minimalpromotor (–46 bis +9) fusioniert.
  • Die genetische Analyse ist einer der wichtigsten Meilensteine, auf denen die modernen Biowissenschaften aufgebaut sind. Historisch basieren genetische Studien zum großen Teil auf der Bestimmung von Funktionsverlust-Mutationen. Dieser Ansatzpunkt ist auch heute noch das primäre Werkzeug für das genetische Zerlegen eines Stoffwechselweges. Funktionsverlust-Überprüfungen haben jedoch zwei Hauptnachteile. Erstens ist dieser Typ der Überprüfung nicht in der Lage, Gene zu identifizieren, die funktionell redundant sind. Genetische und funktionelle Analysen des Ethylensignal-Stoffwechselweges zeigen solch ein Beispiel. Verschiedene Rezeptor-ähnliche Histidinkinasen wurden in Arabidopsis identifiziert und sie zeigen eine hohe Homologie zueinander. Von diesen Proteinen wurde angenommen, dass sie an dem Ethylensignal beteiligt sind, in dem sie wahrscheinlich als Rezeptoren für das Hormon dienen. Während keine der Null-Mutationen in diesen Genen einen apparenten Phänotyp hatte, zeigten transgenische Pflanzen, welche 35S-Antisens Transgene für alle diese Gene trugen, einen Funktionsverlust-Phänotyp für die Ethylenreaktion (Hua und Meyerowitz, 1998). Dominant positive oder Funktionsgewinn-Mutationen in allen diesen Genen führt zur konstitutiven Repression der Ethylenreaktion. Als genomische Sequenzprojekte die Gegenwart von vielen Multicopy-Genen in einer Reihe von Arten (Lin et al., 1999; Mayer et al., 1999) aufzeigten, wurde das Problem der funktionellen Redundanz deutlicher. Eine zweite Limitierung für die Funktionsverlust-Überprüfungen basiert auf der Tatsache, dass einige Mutationen eine gametophytische oder embryogene Letalität hervorrufen, was es extrem schwierig oder sogar unmöglich macht, solch ein Gen oder eine Mutation zu identifizieren. Einige der Arabidopsis Embryo-defekten (emb) und verwandten Mutationen wurden zum Beispiel identifiziert durch mikroskopische Dissektion von individuellen Embryonen durch Meinke und Mitarbeiter (Meinke, 1985; Meinke, 1995), was die technischen Schwierigkeiten für solche Überprüfungen anzeigt.
  • Als Alternative wurden Überprüfungen für dominant positive oder Funktionsgewinn-Mutationen entwickelt und in den vergangenen Jahren verwendet. In Pflanzen wurde die Prüfung auf Funktionsgewinn-Mutationen, die auch als Aktivierungsmarkierung bekannt sind, als erstes von Hayashi et al. (1992) versucht, der vier Kopien des 35S Enhancers verwendete, um Gene nahe einer T-DNA Insertion, die den Enhancer trug, zu aktivieren. Das erfolgreichste Beispiel war die Identifizierung des Arabidopsis CKI1 (Cytokinin Independent I) Gens, dessen Überexpression zur Regeneration von Sprossen aus Explantaten in Abwesenheit von externen Cytokininen führt (Kakimoto, 1996). Vor kurzem wurden ähnliche Aktivierungsmarkierungs-Konstrukte verwendet, um eine große Zahl an transgenischen Arabidopsis-Pflanzen zu erzeugen, von denen etwa 30 dominante Mutanten isoliert wurden (Weigel et al., 2000). Analog zu den Funktionsverlust-Überprüfungen ist der Hauptnachteil der Aktivierungsmarkierung die Letalität aufgrund der konstitutiven Überexpression von einigen Genen, wodurch es nicht möglich wird, diese Gene zu identifizieren. Tatsächlich wurden nur Mutationen in Bezug auf morphologische Veränderungen oder die Blühzeit von diesem großen Prüfungsansatz isoliert (Weigel et al., 2000). Dies lässt vermuten, dass bestimmte dominante Mutationen, insbesondere solche, die stark die pflanzliche Entwicklung beeinflussen (z. B. Embryogenese), durch solche Verfahren wahrscheinlich nicht zu erkennen sind.
  • Während die Aktivierungsmarkierung die funktionelle Bedeutung von einigen Genen erkennen kann, können die Funktionsverlust-Mutationen mehr direkte Einsichten hinsichtlich den Funktionen für die meisten Gene bereitstellen. Deshalb sollte die Kombination aus Funktionsgewinn- und Funktionsverlust- Ansatz während der post-genomischen Ära am stärksten sein. In dieser Veröffentlichung stellen wir eine neue Strategie zur Erzeugung von pflanzlichen Mutanten bereit, die beide konditionale Funktionsgewinn- und Funktionsverlust-, GLF genannt, Mutationen an einer einzelnen genetischen Stelle tragen. Der Funktionsgewinn oder der Funktionsverlust einer Zielposition wird reziprok sein und stark von dem XVE chemisch-induzierbaren Expressionssystem kontrolliert werden, was die Phänotypexpression einer Targetposition zu einer gegebenen Entwicklungszeit von Interesse ermöglicht. Die kontrollierbare Expression von beiden Funktionsgewinn- und Funktionsverlust- Phänotypen in einer Targetposition wird ein besseres Verständnis der Genfunktion im Vergleich zu der Verwendung der individuellen Ansätze erlauben. Im Prinzip ist dieses Verfahren mehr anwendbar auf Arten, bei denen eine hochfrequente homologe Rekombination möglich ist, das heißt, bei Säugetier- und Hefezellen. Dies kann erzielt werden durch die spezifische Unterbrechung eines natürlichen Promotors und durch seine Ersetzung mit einem induzierbaren Promotor, der in geeigneter Weise in Säugetier- und Hefezellen funktionell ist.
  • Die Überexpression des Isopentenyltransferasegens (ipt) von dem Ti-Plasmid von Agrobacterium tumefaciens kann das endogene Niveau von Cytokinin in transgenischen Pflanzen erhöhen, was zu der Regeneration von Sprossen aus transformierten pflanzlichen Zellen führt. Wenn dies mit einem durch Dexamethason (DEX) induzierbaren System kombiniert wird, kann die kontrollierte Expression des ipt Gens verwendet werden, um spezifisch auf transgenische Regenerate zu selektieren, ohne dass dafür ein Antibiotika-Resistenzfaktor notwendig ist. Das kombinierte System erlaubt mit einer hohen Effizienz die Co-Transformation mit zusätzlichen Genen und führt zu transgenischen Pflanzen ohne morphologische oder Entwicklungsdefekte.
  • Gemäß einem Aspekt bezieht sich die Erfindung auf einen Vektor, der für die Herstellung von transgenischen Pflanzen nützlich ist. Der Vektor umfasst eine DNA-Sequenz, die für einen Transkriptionsfaktor codiert, mit den folgenden Elementen in der 5' zu 3' Richtung, (i) einen Promotor, (ii) DNA, die für eine DNA-Bindungsdomäne des bakteriellen Repressors LexA codiert, (iii) DNA, die für eine Transaktivierungsdomäne von VP16 codiert, (iv) DNA, die für eine regulatorische Domäne eines Östrogenrezeptors codiert. Der Vektor ist so aufgebaut, dass er ein Gen umfassen kann, das für einen selektierbaren Marker codiert, dessen Expression von dem Transkriptionsfaktor kontrolliert wird.
  • Optional ist das Gen ipt, CKI1, Luciferase, ein Mitglied der Knotted Familie oder ein Gen, dessen Expression die Sprossregeneration und Entwicklung fördern kann.
  • Die Erfindung ist ferner auf eine Nukleinsäure gerichtet, die i) einen konstitutiven Promotor, ii) eine DNA, die für eine DNA-Bindungsdomäne des bakteriellen Repressors LexA codiert, iii) eine DNA, die für eine Transaktivierungsdomäne von VP16 codiert und iv) eine DNA, die für einen Östrogenrezeptor codiert, umfasst.
  • Die Erfindung bezieht sich gemäß einem anderen Aspekt auf eine transgenische Pflanze oder auf eine transgenische pflanzliche Zelle, welche die Nukleinsäure umfasst und ferner optional ein Gen umfasst, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus ipt, CKI1, einem Mitglied der Knotted Familie oder aus einem Gen besteht, dessen Expression die Sprossregeneration und Entwicklung fördern kann.
  • 1 ist eine schematische Darstellung des Inserts zwischen dem linken und dem rechten Rand in pTA7002. RB stellt den rechten Rand und LB stellt den linken Rand dar. Restriktionsenzym-Stellen sind oberhalb der Zeichnung dargestellt. Die Restriktionsenzym-Stellen sind durch Abkürzungen dargestellt und sind: B – BamHI, N – HindIII, E – EcoRI.
  • 2 zeigt die Insertionspunkte in pMON721 von den Luciferase- und GVG-Konstrukten. Die Luciferase wird in die NotI Restriktionsstelle eingefügt. GVG wird in die Multiklonierungsstelle des Vektors eingefügt.
  • 3A stellt eine Skala dar und zeigt die Lumineszenzintensität von dunkelgrau (niedrigste) bis weiß (höchste). Obgleich als Skala von dunkelgrau bis weiß dargestellt, hat die Lumineszenz tatsächlich eine blaue Farbe. Diese Skala wird verwendet zur Interpretation der Ergebnisse der 3B. Die 3B zeigt die stationären Expressionsniveaus der Luciferaseaktivität, die durch verschiedene Konzentrationen von DEX induziert wurden. Die 3C zeigt die Ergebnisse der 3B gegen die DEX-Konzentrationen aufgetragen. Der bei 0 μM DEX (das basale Nicht-Induktions-Niveau) erzielte Wert wurde auf 1 festgelegt.
  • Die 4A–C zeigen die Induktion der Luciferaseaktivität in Arabidopsis. Die 4A ist eine Farbskala und zeigt die Lumineszenzintensität von dunkelgrau (niedrigste) bis weiß (höchste) (wie in der 3, ist die Lumineszenz blau und nicht wie in der Figur dargestellt grau). Die 4B ist eine transgenische Pflanze, die für drei Wochen im Topf herangezogen wurde und dann mit einer Lösung besprüht wurde, die 0,5 mM Kaliumluciferin und 0,01% (Gew./Vol.) Tween-20 enthielt. Die Pflanze wurde dann hinsichtlich der Luciferaseaktivität überprüft. Die 4C zeigt die gleiche Pflanze wie in der 4B, aber hier wurde die Pflanze mit einer Lösung besprüht, die 30 μM DEX und 0,01 (Gew./Vol.) Tween-20 enthielt. Nach 24 Stunden wurde die Pflanze wieder mit der Luciferinlösung besprüht und dann getestet. Bei beiden
  • 4B und 4C wurde die Lumineszenz von der Pflanze unter Verwendung eines hoch empfindlichen Kamerasystems (Hamamatsu Photonic Systems) dargestellt. Die Heterogenität der Lumineszenz, die bei der Pflanze auftritt, welche mit DEX behandelt wurde, wurde durch eine ungleiche Absorption von Luciferin hervorgerufen.
  • Die 5A–B zeigen die Kinetiken der durch DEX induzierten luc mRNA Niveaus. Transgenische Tabakpflanzen, die das GVG-Gen und das luc-Reportergen tragen, wuchsen zunächst auf Agarmedium für 14 Tage und wurden dann adaptiert für ein Wachstum in einem hydroponischen Medium für 3 Tage. Die DEX-Behandlung wurde gestartet durch Zugabe von DEX zu dem Medium mit einer Endkonzentration von 10 μM (Zeit als 0 angezeigt). Nach einer 24-stündigen Behandlung wurde DEX dann aus dem Medium entfernt. Die Gesamt-RNA wurde von 20 Pflanzen zu jedem angezeigten Zeitpunkt isoliert und einer Northern Blot-Analyse unterworfen. cDNA-Fragmente der Feuerfliegen-Luciferase (5A) und des GVG-Gens (5B) wurden als Sonden verwendet. Die Signale wurden mit dem BAS-2000 System dargestellt (Fuji Photo Films Co.). Geschlossene und offene Pfeile zeigen die Zeitpunkte der Zugabe und der Entfernung von DEX an.
  • Die 6 zeigt die Intensität und die Aufrechterhaltung der Induktion durch verschiedene Glucocorticoide. Transgenische Tabakpflanzen, die das GVG-Gen und das luc-Reportergen tragen, wuchsen zuerst für 14 Tage auf Agarmedium und wurden dann für weitere 2 Tage auf ein frisches Agarmedium übertragen, das 30 μM von verschiedenen Glucocorticoiden enthielt. Nach der Induktion wurden die Pflanzen zurück zu dem Agarmedium ohne Glucocorticoid (Zeitpunkt als 0 angezeigt) transferiert. Die durch DEX (•), Triamcinolonacetonid (
    Figure 00120001
    ), Betamethason(
    Figure 00120002
    )und Hydrocortison (☐) induzierten, relativen Luciferaseaktivitäten wurden aufgetragen. Der erzielte Wert ohne Glucocorticoid (das Nicht-Induktionsniveau) wurde willkürlich auf 1 gesetzt.
  • Die 7 zeigt die lokale Induktion der Luciferaseexpression durch Glucocorticoid-Sprühung.
  • Die 8 zeigt die Dexamethason abhängige Regeneration von Tabak- und Salatsprossen. Blattscheiben vom Tabak (obere Reihe) und Salat (untere Reihe) wurden mit der in der 12 gezeigten Transformationskassette transformiert. Die Pflanzenmaterialien wuchsen dann für 40 Tage unter induktiven (10 μM DEX) oder nicht-induktiven (0 μM DEX) Bedingungen.
  • Die 9A–F zeigen die Luciferaseaktivität in den Tabak- und Salatregeneraten. Die Luciferaseaktivitäten wurden in 40 Tage alten Regeneraten gemessen, die unter induktiven Bedingungen (10 μM DEX) für die Expression des ipt Gens wuchsen. Die Luciferaseaktivität in den Regeneraten wurde unter Verwendung eines Videobildsystems mit über 5 Minuten integrierten Messungen und Abzug des Hintergrundes von den Bildern gemessen. Die Luciferasebilder wurden von 16 zu 8 bit Bilder transformiert und für die Darstellung artifiziell gefärbt. Die rot/grün-Überlast zeigt eine Überlagerung der Hellfeld- und Luciferaseaktivitätsbilder, um einen einfachen Nachweis der luc positiven und negativen Regenerate zu ermöglichen. Die 9A, 9C und 9E zeigen Tabak und die 9B, 9D und 9F zeigen Salat. Die 9A–B zeigen Hellfeldbilder, 9C–D sind Luciferasebilder und 9E–F sind Bilder mit einer Rot/Grün-Überlagerung.
  • Die 10A–D zeigen eine Northern-Analyse der ipt und luc Transkripte vom Tabak. Das Niveau der ipt und luc Transkripte von 30 Tage alten Regeneraten, die eine (+1 bis +10) oder keine (–a bis –g) nachweisbare Luciferaseaktivität hatten, sind gezeigt. Die Regenerate wuchsen in Gegenwart von 10 μM Dexamethason. Die 10A und 10C zeigen die ipt Transkriptniveaus und die 10B und 10D zeigen die luc Transkriptniveaus.
  • Die 11A–C zeigen die Segregation und die Southern-Analyse des luc Gens in transgenischen Tabakkeimlingen. Die Luciferaseaktivität wurde in 44 zufällig ausgewählten Keimlingen gemessen. 33 der Keimlinge zeigten die Luciferaseaktivität und 11 der Keimlinge zeigten die Luciferaseaktivität nicht (vergleiche die 11A und 11B), was eine 3:1 Segregation des dominanten luc Gens darstellt. Die Southern-Blot-Analyse der DNA aus den Keimlingen ist in der 11C gezeigt. Einzelne Banden wurden nachgewiesen mit ungeschnittener DNA (U) und nachdem die DNA mit BamHI (B), SacI (S), NcoI (N) und XbaI (X) geschnitten wurde, und hybridisiert mit radioaktiv markierten Fragmenten des luc Gens.
  • Die 12 zeigt die Transformationskassette für die induzierbare Expression des ipt Gens. Das ipt Gen aus Agrobacterium tumefaciens wurde kloniert unter der Kontrolle eines auf Glucocorticoid reagierenden Promotors (6 × UAS fusioniert an -46 des CaMV 35S Minimalpromotors), um die regulierte Expression des Gens zu erlauben. Die Expression des ipt Gens wird durch einen durch Glucocorticoid aktivierten Transkriptionsfaktor (GVG) vermittelt, wie dies beschrieben wurde von Aoyama und Chua (1997). Die Gene, welche für die Hygromycinphosphortransferase (hpt) (Waldron et al., 1985) und Feuerfliegen-Luciferase (luc) (Miller et al., 1992) codieren, wurden unter die Kontrolle der konstitutiven Promotoren (NP, NOS Promotor; 35S; CaMV 35S Promotor) kloniert, um einen einfachen Nachweis der Transformations- und Co-Transformationseffizienzen zu ermöglichen. Die obigen Gene wurden zwischen den linken und rechten Rand (LB, RB) der T-DNA (Klee et al., 1987; Beavan und Chilton, 1982) (pBI 101, Clontech, Inc.) von dem Ti Plasmid aus Agrobacterium tumefaciens kloniert, um eine Agrobacteriumvermittelte Transformation zu ermöglichen.
  • Die 13 ist eine schematische Karte der XVE-Vektoren (Zuo et al., 2000). Nur die in das pflanzliche Genom (zwischen dem rechten Rand oder RB und dem linken Rand oder LB) zu integrierenden Regionen sind gezeigt (nicht im Maßstab). G1090: Ein synthetischer Promotor (Ishige et al., 1999), XVE antreibend; XVE: DNA-Sequenzen, die für einen chimären Transkriptionsfaktor codieren, welcher die DNA-bindende Domäne (DBD) von LexA (Reste 1–87), die Transkriptiansaktivierungsdomäne von VP16 (413–490) und die regulatorische Region des menschlichen Östrogenrezeptors (272–595) enthält; E9T: rbcs E9 polyA Additionssequenz; NOS: Nopalinsynthasepromotor; HPT: Hygromycin-Selektionsmarker; KAN: Kanamycin-Selektionsmarker; NOST: Nopalinsynthase-polyA- Additionssequenz; 8 × lexA: 8 Kopien der LexA Repressor-Bindungsstellen; -46: der 35S Minimalpromotor; 3AT: rbcs 3A polyA-Additionssequenz; MCS: Multiklonierungsstelle.
  • Die 14A–B zeigen die Expression des GFP Gens, das durch das induzierbare XVE System kontrolliert wird. Die 14A zeigt Wurzeln einer pER8-GFP transgenischen Arabidopsis-Linie. Die GFP-Signale (grün), die von den gleichen Wurzeln emitiert wurden, wurden unter einem Fluoreszenzmikroskop betrachtet, wie dies in der 14B dargestellt ist.
  • Die 15 zeigt die Dosisabhängigkeit von 17-β-Östradiol des XVE induzierbaren Systems. Drei Wochen alte, pER8-GFP transgenische Pflanzen, die in Abwesenheit des Induktors kultiviert wurden, wurden auf ein Medium transferiert, welches verschiedene Konzentrationen von 17-β-Östradiol enthielt, und werden für 16 Stunden inkubiert. RNAs wurden präpariert aus nicht behandelten (Linie 0; Kontrolle) oder 17-β-Östradiol-behandelten Pflanzen und mittels Northern-Blotting unter Verwendung von GFP cDNA als eine Sonde analysiert. Die Nummern oberhalb von jeder Linie zeigen die Konzentrationen (in Mikromolar) der Behandlung an.
  • Die 16 zeigt den Induktionszeitverlauf des XVE-Systems. Drei Wochen alte, pER8-GFP transgenische Pflanzen, die in Abwesenheit des Induktors kultiviert wurden, wurden auf ein Medium transferiert, welches 2 μM 17-β-Östradiol enthielt, und werden über verschiedene Zeiträume (angezeigt in Stunden oberhalb von jeder Linie) inkubiert. Die Analyse der GFP-Transkripte wurde durchgeführt, wie dies in der 15 beschrieben ist.
  • Die 17 ist ein schematisches Diagramm des XVE Aktivierungsmarkierungs-Vektors pER16. Nur die Region zwischen dem rechten Rand (RB) und dem linken Rand (LB) ist dargestellt (nicht im Maßstab). Zwei Transkriptionseinheiten und der OLexA-46 Promotor sind zwischen RB und LB angeordnet. In der ersten Transkriptionseinheit steuert der G10–90 Promotor (Ishige et at., 1999) das XVE-Fusionsgen, welches durch die rbcs E9 polyA-Additionssequenz terminiert ist. Die zweite Transkriptionseinheit besteht aus dem Nopalinsynthasegen (NOS) Promotor, der codierenden Sequenz des Neomycin Transferase II (NPT II) Gens und der NOS Polyadenylationssequenz. Der OLexA-46 Promotor besteht aus acht Kopien der LexA Operatorsequenz, die an den -46 CaMV35S Promotor fusioniert ist. Nach Integration in das pflanzliche Genom kann der OLexA-46 Promotor die Transkription der Sequenzen aktivieren, die stromabwärts von dem Promotor fusioniert sind, und zwar in einer 17-β-Östradiol abhängigen Weise.
  • Wir folgerten, das induzierbare Systeme die Entwicklung von Protokollen ermöglichen, welche das ipt Gen als ein Transformationsvektor verwenden, ohne das die Nachteile der konstitutiven Expression auftreten. Unter induktiven Bedingungen sollten mit dem ipt Gen transformierte Zellen erhöhte Cytokininniveaus besitzen und somit das Potential zur Regeneration von Sprossen aus pflanzlichen Kalli oder Explantaten. In diesem Zusammenhang kann die Überexpression des ipt Gens als ein Antibiotikum freies Markersystem dienen, welches spezifisch auf transformierte Zellen selektiert. Wie von Aoyama und Chua (1997) beschrieben, erlaubt das durch Dexamethason induzierbare System die stark regulierte Expression von Zielgenen in transgenischen Pflanzen. Dieses System besteht aus einem Hybrid-Transkriptionsfaktor, welcher die Transkription vermittelt, wenn er mit DEX aktiviert wird, und einem regulierten Gen unter der Kontrolle von cis Elementen, welche nur auf diesen Transkriptionsfaktor reagieren. Wir verwendeten somit eine Transformationskassette, welche das ipt Gen unter der Kontrolle des durch DEX induzierbaren Systems enthielt, das als ein Antibiotika freier Marker für die Co-Transformation von zwei anderen, konstitutiv exprimierten Genen (Hygromycinphosphortransferase (hpt) (Waldron et al., 1985) und Feuerfliegen-Luciferase (luc) (Millar et al., 1992) diente. Dieses neue Transformationssystem wurde für Tabak und Salat unter Verwendung der durch Agrobacterium vermittelten Transformation etabliert.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich gemäß einer Ausführungsform auf transgenische Pflanzen, die mit einem Vektor transformiert worden sind, welcher einen selektierbaren Marker umfasst, der unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors steht. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die transgenische Pflanze eine Tabakpflanze. In einer alternativen, bevorzugten Ausführungsform nach der Erfindung ist die transgenische Pflanze eine Salatpflanze.
  • Nach einer Ausführungsform gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst der Vektor, der zur Bildung von transgenischen Pflanzen verwendet wird, einen chemisch induzierbaren Promotor, der den selektierbaren Marker aktiviert. Falls gewünscht, kann jedes andere Gen von Interesse auch unter die Kontrolle des induzierbaren Promotors gestellt werden, so dass das Gen angedreht werden kann, wann immer es erwünscht ist. Solch ein Gen muss kein Marker sein. Beispiele für solche Vektoren werden in den folgenden Beispielen dargestellt, die nicht nur die Vektoren, sondern auch die verwendeten Verfahren zur Herstellung und zur Überprüfung von transgenischen Pflanzen, welche solche Vektoren enthalten, beschreiben.
  • Nach einer Ausführungsform gemäß der vorliegenden Erfindung kann der Promotor induziert werden, um für Zellen oder Pflanzen zu selektieren, die transgen geworden sind. Er wird aber nicht unter natürlichen Wachstumsbedingungen induziert werden. Auf diese Weise wird das selektierbare Markergen, obwohl es in den transgenischen Pflanzen vorhanden ist, vollständig während dem normalen Wachstum der Pflanze stumm sein und nicht mit dem Wachstum der Pflanzen interferieren. Solch ein stummes Markergen wird auch einen besseren Anklang unter Umweltaspekten haben als zum Beispiel ein vorhandener Antibiotikaresistenz-Genmarker, da dieses Resistenzgen während dem normalen Wachstum der Pflanze exprimiert wird. Die Verwendung von diesem letzteren Typ an Marker stößt auf Bedenken, da er zu der Entwicklung von Organismen führen kann, die resistent gegenüber diesem Antibiotika sind.
  • Nach einer Ausführungsform gemäß der vorliegenden Erfindung ist der induzierbare Promotor der Glucocorticoidrezeptor. Von diesem wird angenommen, dass er ein gutes Induktionssystem für Pflanzen darstellt, da Glucocorticoid selbst keine pleiotrope Wirkungen in Pflanzen entfaltet. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Transkriptionsfaktor, der an den Glucocorticoidrezeptor bindet, ein chimärer Transkriptionsfaktor, bei dem die regulatorische Region von Ratten-GR zu der DNA-Bindungsdomäne des Hefe-Transkriptionsfaktors GAL4 und der Transaktivierungsdomäne des viralen Herpesprotein VP16 hinzugefügt wird. Der erzielte Hybridtranskriptionsfaktor wird bezeichnet als „GVG", da er aus jeweils einer Domäne von GAL4, VP16 und GR besteht. Das GVG Gen wurde in Tabak zusammen mit einem Luciferase (Luc)-Reportergen eingeführt, welches von einem Promotor transkribiert wird, der sechs Kopien der GAL4 stromabwärts aktivierenden Sequenz (GAL4UAS) enthält. Eine gute Induktion der Luciferaseaktivität als auch des luc mRNA Niveaus wurde nach Glucocorticoidbehandlung beobachtet.
  • Ein wesentlicher Vorteil des GVG-Systems in Pflanzen ist die Tatsache, dass GR und Glucocorticoid, zumindest bei den verwendeten Konzentrationen, nicht-toxisch sind und keine beobachtbaren nachteiligen physiologischen Effekte auf Pflanzen besitzen, was die Induktion von Zielgenen ohne pleiotrope Wirkungen ermöglicht. Um diesen Vorteil zu erhalten, wurden alle anderen Komponenten in dem GVG-System auch aus nicht-pflanzlichen Quellen erzielt.
  • Ein weiterer Vorteil des Systems besteht darin, dass Glucocorticoid Eigenschaften besitzt, die es für einen chemischen Induktor geeignet machen. Da Glucocorticoid einfach pflanzliche Zellen permeieren kann, kann eine schnelle Geninduktion unter Verwendung von verschiedenen Verfahren durchgeführt werden. Eine lokale Induktion der Genexpression kann einfach durch Sprühen einer Glucocorticoidlösung erzielt werden. Es ist klar, dass die Induktorchemikalie in Blättern mit einer hohen Konzentration akkumuliert, wenn die ganze Pflanze unter Freiluftbedingungen behandelt wird. Selbst unter solchen Bedingungen ruft das akkumulierte Glucocorticoid keine sichtbaren Schäden an den Blättern hervor. Das Induktionsniveau kann reguliert werden, indem verschiedene Konzentrationen oder verschiedene Derivate von Glucocorticoid verwendet werden. Dieses Merkmal kann hilfreich sein für die Analyse von dosisabhängigen Wirkungen der induzierten Genprodukte. Glucocorticoid ist eines der am Besten studierten, biologischen Verbindungen und über 100 verschiedene Typen von Glucocorticoid-Derivaten sind nun von kommerziellen Quellen verfügbar. Einige dieser Glucocorticoid-Derivate können in Pflanzen sehr stabil sein, während andere sehr schnell abgebaut werden. Diese Typen an Glucocorticoid wären sehr nützlich für eine stabile beziehungsweise für eine transiente Induktion. Ferner können einige Glucocorticoid-Antagonisten verwendet werden für die Herabregulation der Induktion.
  • Obwohl weiter unten spezifische Konstrukte beschrieben werden, können von Fachleuten andere einfach erdacht und hergestellt werden. Das hier entwickelte GVG-System ist sehr flexibel in seiner Zusammensetzung. Die transkriptionelle Induktion kann zum Beispiel auf ein spezifisches Gewebe beschränkt werden, indem der 35S Promotor für das GVG Gen durch einen gewebespezifischen Promotor ersetzt wird. Jede funktionelle Domäne in dem GVG Fusionsprotein ist ferner austauschbar, was eine weitere Verfeinerung des Systems möglich macht. Mit einer anderen DNA-Bindungsdomäne und regulatorischen Region eines anderen Steroidhormonrezeptors ist es möglich, andere Steroidinduktionssysteme zu entwickeln, die dann in Kombination mit dem GVG-System verwendet werden können.
  • Ein anderes Konstrukt ist auch entwickelt worden, das Vorteile gegenüber oder in Verbindung mit dem GVG-System besitzt. Dieses Konstrukt wird als XVE bezeichnet. Es ist ähnlich dem GVG-System, wobei es aber die DNA-Bindungsdomäne des bakteriellen Repressors LexA und die regulatorische Region des menschlichen Östrogenrezeptors enthält. Das XVE-Konstrukt kann anstelle des GVG-Konstruktes verwendet werden und zwar an jeder Stelle, wo das GVG-Konstrukt hier in dieser Veröffentlichung beschrieben wird, soweit ein geeigneter Induktor für das verwendete Konstrukt benutzt wird. Das XVE-Konstrukt kann zusammen mit dem GVG-Konstrukt verwendet werden und kann getrennt von dem GVG-Konstrukt kontrolliert werden.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der verwendete, selektierbare Marker das ipt Gen. Wenn dieses Gen induziert wird, führt es zu dem extremen Sprossphänotyp, bei dem pflanzliche Zellen viele Sprosse im Gegensatz zu Wurzeln ausbilden. Dieser Phänotyp wird einfach durch visuelle Beobachtung selektiert. Wenn das induzierende Mittel entfernt wird, wird das ipt Gen stumm und die Zellen werden dann noch normal wachsen. Gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können andere selektierbare Marker, zum Beispiel das CKI1 Gen, in einer ähnlichen Weise verwendet werden. Welcher Marker auch immer verwendet werden wird, dieser Marker wird nur aktiv sein, wenn er induziert wird, und wird stumm sein, wenn der chemische Induktor entfernt wird.
  • Eine Vielzahl von DNA-Konstrukten können hergestellt werden, welche das Prinzip der Verwendung eines chemischen, induzierbaren Markers beinhalten. Die Theorie hinter dem Design der Plasmide, die im Folgenden hier beschrieben werden, bestand darin, Regionen innerhalb des Plasmides zu haben, die gut kontrolliert werden können.
  • Eine andere Ausführungsform der Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Selektion von transgenischen Pflanzen unter Verwendung eines selektierbaren Markers, der unter der Kontrolle eines chemisch induzierbaren Promotors steht. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das ipt Gen unter die Kontrolle eines durch Glucocorticoid induzierbaren Promotors innerhalb eines Plasmides gestellt. Gemäß einer alternativ bevorzugten Ausführungsform wird das CKI1 Gen oder eines der Gene der Knotted Familie unter die Kontrolle eines durch Glucocorticoid induzierbaren Promotors innerhalb eines Plasmides gestellt. Das durch Dexamethason induzierbare System besteht aus einem Hybridtranskriptionsfaktor, der die Transkription von dem Glucocorticoidrezeptor in Gegenwart von DEX vermittelt. Dieses System erlaubt eine stark regulierte ipt Expression in transgenischen Pflanzen. Pflanzliche Zellen werden mit diesem Plasmid tranformiert und die Zellen wachsen auf MS-Medium ohne pflanzliche Hormone, aber in Gegenwart oder Abwesenheit von Dexamethason, was ein synthetisches Glucocorticoid-Analogon ist. Unter induktiven Bedingungen werden die mit dem ipt Gen transformierten Zellen erhöhte Cytokininniveaus besitzen und werden von den pflanzlichen Kalli oder Explantaten Sprosse regenerieren. Da die Zellen in Abwesenheit von pflanzlichen Hormonen wachsen, werden sich nur Sprosse aus Zellen entwickeln, die transformiert sind und Cytokinine in Anwesenheit von Dexamethason überproduzieren. Nicht-transformierte Zellen werden keine Sprosse herstellen und Zellen, die in Abwesenheit von Dexamethason wachsen, werden keine Sprosse produzieren. Die Überexpression des ipt Gens kann somit als ein Antibiotika-freies Markersystem fungieren, das spezifisch auf transformierte Zellen selektiert. Dieses System könnte auch als ein zweiter Marker zur Einführung von zusätzlichen Genen in Pflanzen dienen, die bereits resistent gegenüber Antibiotika sind. Teratom-Sprosse sollten in 2–3 Wochen auf transformierten Zellen erscheinen, die in Anwesenheit von Dexamethason wachsen. Diese Sprosse können abgeschnitten und auf ein MS-Medium gebracht werden, das Indolessigsäure, aber kein Dexamethason enthält. Unter dieser Umgebung sollte das ipt, CKI1 oder das Knotted Gen nicht länger aktiviert sein und die transgenischen Pflanzen sollten normal aussehen und fruchtbar sein und in der Lage sein, Samen zu erzeugen. Im Prinzip ist dieses Verfahren auf alle pflanzlichen Gene anwendbar, die unter der Kontrolle eines geeigneten, induzierbaren Expressionssystems die Sprossregeneration und Entwicklung fördern.
  • Es muss angemerkt werden, dass, obwohl einige Pflanzen sich so verhalten, wie oben beschrieben (die einzigen Sprosse, die hergestellt werden, sind solche von transformierten Pflanzen), einige Pflanzen Sprosse in einem hormonfreien Medium selbst dann produzieren können, wenn sie nicht transformiert sind. Eine Reihe von Techniken kann bei solchen Pflanzen verwendet werden, um erfolgreiche Ergebnisse hinsichtlich der Selektion von transformierten Pflanzen zu erzielen. Ein solches Verfahren besteht darin, dass, obwohl die Sprosse von nicht-transformierten Pflanzen hergestellt werden können, solche Sprosse normal (Wildtyp) aussehen, während die transformierten Pflanzen den Sprossphänotyp zeigen. Somit kann der Phänotyp benutzt werden, um transformierte Sprosse von nicht-transformierten Sprossen zu unterscheiden. Ein alternatives Verfahren besteht in dem Zusatz eines Hormons, wie ein Auxin, zu dem Wachstumsmedium, um die Sprossbildung von nicht-transformierten Explantaten zu unterdrücken. Dies wird die Hintergrundmenge des Auftretens von nicht-transformierten Sprossen reduzieren. Die Menge an hinzuzufügendem Auxin kann mittels einer Titration bestimmt werden, das heißt, es werden verschiedene Konzentrationen von Auxin verwendet, um die Menge zu bestimmen, welche das Wachstum von Sprossen in nicht-transformierten Explantaten unterdrückt, wobei andererseits aber ein Sprosswachstum in transformierten Explantaten noch möglich ist.
  • Nach einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurde eine Transformationskassette (12), welche das ipt Gen unter der Kontrolle des GVG Glucocorticoid induzierbaren Systems (Aoyama und Chua, 1997), welches als ein Antibiotika-freier Marker fungiert, verwendet für die Co-Transformation von zwei anderen, konstitutiv exprimierten Genen (Hygromycinphosphortransferase (hpt) und Feuerfliegen-Luciferase (luc)). Wenn eine Induktion mit DEX erfolgt, wird die Isopentenyltransferase von dem ipt Gen exprimiert, was zu erhöhten Cytokininmengen führt. Unter induktiven Bedingungen für die ipt-Expression werden die erhöhten Cytokininmengen zu einer wirksamen Regeneration von transgenischen Sprossen von Tabak- oder Salatexplantaten führen (8). Die Bestimmung der ipt-Transkriptniveaus in den Regeneraten zeigte, dass die Regeneration eng an die ipt-Expression gekoppelt war (10A–D). Selbst unter nicht-induktiven Bedingungen, wo nur wenige Sprosse von den Explantaten regeneriert werden, enthielten mindestens 50% der Regenerate das Transgen. Southern- und Segregationsanalyse der transgenischen Sprosse und Pflanzen ergab, dass die Mehrheit der Regenerate nur eine Kopie des ipt Gens enthielt (11A–C). Zeitverlaufsexperimente zeigten, dass die Regeneration schnell war und die Spezifität dieses Prozesses über einen Zeitraum von wenigstens 20 Tagen aufrecht erhalten wurde. Die Wirkungen der Cytokinine waren somit lokal und die Hormone diffundierten und förderten die Regeneration von nicht-transformierten Zellen nicht. Dieses Ergebnis ist in guter Übereinstimmung mit der Beobachtung, dass selbst hohe, exogen angewandte Konzentrationen von Cytokinin mehr oder weniger lokale Reaktionen hervorrufen. Die Effizienz der Co-Transformation der hpt und luc Gene wurde bestimmt durch Messung der luc-Aktivität (9A–F) und durch Analyse der Regenerate auf Hygromycinresistenz. Die Nothern-Analyse wurde auch durchgeführt, um die hpt und luc Transkriptniveaus zu bestimmen (10A–D). Bei etwa 80% der Sprosse waren die luc und hpt Gene erfolgreich co-transformiert mit dem durch ipt induzierbaren System. Nachdem die Regenerate zu nicht-induktiven Bedingungen transformiert worden waren, war die Morphologie der Tabak- und Salatblätter vollständig normal. Mehr als 40% der Tabakregenerate entwickelten starke Wurzelsysteme innerhalb von 20 Tagen und konnten einfach in Erde überbracht werden. Die erzielten Pflanzen zeigten keine morphologische oder Entwicklungsabnormalität und die Transgene wurden auf die Nachkommenschaft vererbt. Diese Ergebnisse zeigen die Vorteile, welche die induzierbare ipt-Expression über die konstitutive Expression von ipt besitzt.
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Antibiotika- und Herbizidresistenzgene unter die Kontrolle eines Glucocorticoidrezeptor induzierbaren Promotors gestellt. Der Promotor kann induziert werden, um die Expression der Antibiotika- oder Herbizidresistenzgene zu ermöglichen zur Selektion von transformierten pflanzlichen Zellen. Nachdem die transformierten pflanzlichen Zellen selektiert sind, kann die Expression der Antibiotika- und Herbizidresistenzgene unterdrückt werden. Dieses System ist unter Umweltaspekten akzeptabler als ein System, bei dem die transformierten Pflanzen konstitutiv die aktiven Antibiotika- oder Herbizidresistenzgene exprimieren.
  • Das chemisch induzierbare System kann allgemeiner verwendet werden und ist selbstverständlich nicht darauf beschränkt, das ipt, CKI1 oder Knotted Gen oder einen anderen selektierbaren Marker zu induzieren. Es kann verwendet werden, um jedes Gen von Interesse chemisch zu induzieren. Es kann verwendet werden für die Induktion eines überprüfbaren Markers, wie die Luciferase, oder eines anderen gewünschten, überprüfbaren Markers.
  • Die Entwicklung des Systems, welches verwendet wird, wurde mit einer Serie von Schritten vorgenommen, um die individuellen Aspekte des Endkonstruktes zu testen. Diese Schritte sind in den folgenden Beispielen festgelegt. Eine kurze Einführung zur Erläuterung des Fortschritts der Exprimente wird zunächst hier gegeben. Das GVG-System wurde zunächst verwendet, um zu zeigen, das ein Konstrukt hergestellt werden kann, welches ein Gen umfassen kann, das durch DEX oder ein Glucocorticoid- Analogon induzierbar ist. Das Plasmid pMON721 wurde für diesen Zweck verwendet, wobei luc unter die Kontrolle von UAS gestellt wurde. Dieses Plasmid wurde verwendet um transgenische Tabakpflanzen herzustellen, die auf Kanamycin-Medien selektiert wurden. Diese Experimente zeigten, dass solch ein System arbeiten kann (Ayoama und Chua, 1997). Gemäß dem Wunsch zur Vermeidung von Antibiotikaresistenz als ein Marker wurden dann neue Konstrukte hergestellt, wobei das ipt Gen als Marker verwendet wurde. Die Konstrukte wurden hergestellt mit den pTA7001 oder pTA7002 Vektoren mit Multiklonierungsstellen stromabwärts von 6 × UAS. Diese Konstrukte umfassten das chimäre GVG Transkriptionssystem unter einem 35S Promotor und umfassten ferner ein Hygromycinresistenzgen, das von dem NOS-Promotor reguliert wurde. Das ipt Gen wurde stromabwärts zu 6 × UAS angeordnet. Die Verwendung dieses Konstruktes zeigte, dass der „Sprossphänotyp", der sich aus der ipt Überexpression ergibt, als ein Marker verwendet werden kann. Unterschiedliche Konstrukte wurden dann hergestellt, um die Ergebnisse auf Pflanzen, die kein Tabak waren, auszudehnen. Das pTA7002/ipt Konstrukt wurde so modifiziert, dass der 35S Promotor, der verwendet wurde für die Expression der GVG codierenden Sequenz, ersetzt wurde durch einen synthetischen Promotor, genannte G10–90, der als ein stärkerer Promotor als der 35S-Promotor wirkt. Dieser bestand aus vier Kopien einer G-Box, die an den -90 35S Promotor fusioniert wurde. Ferner wurde ein zusätzliches Gen, 35S-luc, hinzugefügt. Dieses Konstrukt wurde bei Tabak- und Salatpflanzen verwendet. Selektierte Sprosse wurden dann hinsichtlich der Luciferaseexpression und der Hygromycinresistenz getestet. Die Ergebnisse zeigen, dass ein sehr hoher Prozentsatz der Sprossregenerate sowohl die Luciferaseexpression als auch die Hygromycinresistenz zeigten. Dies belegt, dass die Verwendung des GVG-Systems und des ipt Gens erlaubt, den Sprossphänotyp als ein Marker in unterschiedlichen Pflanzen zu verwenden.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist die Aktivierungsmarkierung via einem Funktionsgewinn oder Funktionsverlust (GLF)-System. Das Prinzip des GLF-Systems besteht in dem Austausch des nativen Promotors eines Gens von Interesse in dem pflanzlichen Genom durch einen induzierbaren Promotor. Deshalb wird der Austausch eine Funktionsverlust-Mutation aufgrund des Fehlens des Promotors des Zielgens hervorrufen. Andererseits wird die Expression des Zielgens durch einen Induktor gesteuert und die induzierte ektopische Überexpression des Zielgens wird zu Funktionsgewinn-Phänotypen führen. Da beide Typen von Mutationen konditional sind, kann ferner die Funktionsverlust-Mutation durch die induzierbare Expression des Zielgens unter geeigneten Bedingungen komplementiert werden. Die Expression des Gens unter der Kontrolle des transgenischen, induzierbaren Promotors kann kontrolliert werden durch die Konzentration des Induktors, welche vorhanden ist. In Abwesenheit des Induktors oder bei sehr geringen Mengen des Induktors wird der Promotor inaktiv oder minimal aktiv sein und eine Expression wird nicht auftreten. Bei höheren Mengen des Induktors kann der Promotor das Gen überexprimieren. Bei einer intermediären Menge des Induktors kann die Expression des Gens äquivalent zu der Wildtyp-Expression sein und die Pflanze, Zelle oder der Organismus kann als Wildtyp erscheinen.
  • Das GFL-System erfordert einen stark regulierten und sehr effizienten, induzierbaren Promotor und eine relativ präzise Anordnung der Zielpromotorsequenz in dem Wirtsgenom. Das XVE-System, das hier beschrieben ist, erfüllt vollständig die Anforderungen für das GFL-System. Zusätzlich zu der starken Kontrolle kann das XVE-System die Zielgenexpression 8-fach über einen 35S Promotor stimulieren, was es ideal für ektopische Überexpressionsstudien macht. Obwohl homologe Rekombination in hoher Frequenz zur Zeit schwierig in höheren Pflanzen aus nicht bekannten Gründen zu erzielen ist, ist es möglich, eine große Menge an Mutanten zu erzeugen und anschließend die Funktionsgewinn- und/oder die Funktionsverlust-Mutationen von Interesse zu überprüfen. Wir haben in der Tat verschiedene Mutanten identifiziert, bei denen die Promotoren der Zielgene durch den induzierbaren Promotor ausgetauscht waren, so dass Funktionsgewinn- und Funktionsverlust-Mutationen an einem einzelnen Ort erzeugt wurden. Wie oben angemerkt, ist das System sehr nützlich für genspezifische Mutationen in Säugetieren und in Hefen, wo homologe Rekombination praktisch möglich ist.
  • Der GFL-Vektor (17) wurde hergestellt auf Basis des hier beschriebenen XVE-Vektors und ist ferner beschrieben in Zuo et al. (2000), wobei diese Veröffentlichung hiermit durch Verweis eingeführt ist. Nach Einfügung in das Wirtsgenom kann der OLex-46 Promotor ein stromabwärts fusioniertes Gen in einer 17-β-Östradiol abhängigen Weise aktivieren oder die LexA Operatorsequenz (OLexA) kann auch als ein starker, 17-β-Östradiol abhängiger Enhancer dienen, um die Gene nahe der T-DNA Insertion zu aktivieren.
  • Die vorliegende Erfindung wird im folgenden unter Bezug auf die folgenden Beispiele beschrieben, die nur der Darstellung dienen und die nicht die Erfindung in irgendeiner Weise limitieren. Standardtechniken, die im Stand der Techniken gut bekannt sind, oder die unten spezifisch beschriebenen Techniken wurden verwendet.
  • Beispiel 1
  • DNA-Konstrukt
  • A) Konstrukt pTA7002
  • Plasmid pTA7002 ist ähnlich zu pB1101 (Clontech), wobei aber die Sequenz zwischen dem rechten Rand und dem linken Rand durch drei Transkriptionseinheiten ausgetauscht ist. Das Insert zwischen dem rechten und dem linken Rand von pTA7002 ist in der 1 dargestellt und umfasst ein Plasmid, welches die folgenden Elemente umfasst: Einen 35S Promotor, eine GAL4 DNA-Bindungsdomäne, eine VP16 Transaktivierungsdomäne, regulatorische Domänen des Glucocorticoidrezeptors und eine Erbsen-Ribulosebisphosphatcarboxylase – kleine Untereinheit – rbcS-E9 poly(A) Additionssequenz, die alle als Teil einer ersten Transkriptionseinheit (35S-GVG-E9) vorliegen; einen Nopalinsynthase (NOS)-Promotor, eine für Hygromycinphosphortransferase codierende Sequenz und den NOS-Terminator als Teil einer zweiten Transkriptionseinheit (NOS-HPT-NOS); und sechs Tandemkopien einer GAL4 stromaufwärts Aktivierungssequenz (UAS), die stromaufwärts von einem 35S Minimalpromotor angeordnet ist (–46 bis +8), einschließlich der TATA-Region als Teil einer dritten Transkriptionseinheit (6 × UAS-(–46/35S)-3A). Diese dritte Transkriptionseinheit umfasst auch Restriktionsorte (XhoI und SpeI) für die Insertion einer gewünschten codierenden Sequenz und die Erbse-Ribulosebisphosphatcarboxylase – kleine Untereinheit – rbcS-3A (Fluhr et al., 1986). Eine codierende Region, die in die XhoI-SpeI Stelle inseriert ist, sollte sowohl Initiationscodons als auch Terminationscodons enthalten.
  • Im größeren Detail umfasst die 35S-GVG-E9 Transkriptionseinheit die Basen –343 bis +9 des CaMV 35S Promotors (Odell et al., 1985). Die GAL4 DNA Bindungsdomäne umfasst die Aminosäuren 1–74 (Laughon und Gesteland, 1984). Die saure VP16 Domäne umfasst die Aminosäuren 413–490 (Dalrymple et al., 1985). Die GR Rezeptordomäne umfasst die Aminosäuren 519–795 (Miesfeld et al., 1986). Das 3' Ende dieser Transkriptionseinheit ist die poly(A) Additionssequenz von Erbse-Ribulosebisphosphatcarboxylase – kleine Untereinheit – rbcS-E9 (Coruzzi et al., 1984). Der 35S Promotor, der das GVG Gen antreibt, kann zu einem gewählten Promotorfragment unter Verwendung der Sse83871 und PmeI Restriktionsenzymstellen verändert werden. Damit kann ein Promotor inseriert werden, der das eingefügte Gen in einem spezifischen Gewebe oder während eines spezifischen Zeitraums in Abhängigkeit von den Eigenschaften des Promotors induziert.
  • B) pTA7001
  • Dieses Plasmid ist identisch mit pTA7002 mit der Ausnahme hinsichtlich der Orientierung des Fragmentes, welches den 6 × GAL4 UAS-TATA Klonierungsstellen – 3A Terminator enthält. Deshalb enthält es sowohl die cis-Elemente als auch die trans-Elemente in der T-DNA Region des Plasmides. Das trans-Element ist die GVG Region, die besteht aus der GAL4 DNA-Bindungsdomäne, der VP16 Transaktivierungsdomäne und der GR Rezepetordomäne, angetrieben durch den 35S Promotor. Das cis-Element besteht aus 6 × GAL4 UAS und der TATA Region des 35S Promotors. Das Plasmid basiert wieder auf pBI101 (Clontech), wobei die Region zwischen RB und LB ausgetauscht wurde. In pTA7001 ist diese Region wie folgt:
    1–39: pTiPOST37 von pBI101 (RB = 1–25)
    47–858: 35S Promotor von pBI221 (TATA = 813–816)
    867–1097: GAL4 (aa 1–77)
    1117–1340: VP16 (aa 413–490)
    1347–2180: Ratte GR (aa 519–795)
    2207–2764: Erbse rbcs-E9 Terminator
    2780–3112: NOS Promotor von pBI101
    3120–4145: Hygromycinphosphortransferase
    4147–4399: NOS Terminator von pBI101
    4893–4423: Erbse rbcs-3A Terminator
    4941–4894: Klonierungsstellen XhoI, SpeI
    4995–4942: 35S Promotor TATA Region (TATA = 4980–4977)
    5197–4996: 6 × GAL4 UAS
    5198–5357: M13mmpl19 EcoRI-HaeII Fragment von pBI101
    5358–5862: pTiPOST37 von pBI101 (LB = 5838–5862).
  • C) pTA7002/ipt
  • Dieses Plasmid wurde hergestellt durch Insertion eines Restriktionsfragmentes (XhoI, SpeI), welches das Isopentenyltransferase (ipt) Gen des pTiT37 Plasmides (Goldberg et al., 1984) stromabwärts von dem 6 × UAS Promotor in dem pTA7002 Plasmid enthält.
  • D) pMON721/Luc
  • Dieses Plasmid ist im Aufbau ähnlich dem pTA7002 Plasmid, da es das gleiche GVG-System enthält. Im Gegensatz zu dem pTA7002 Plasmid basierte dieses Plasmid jedoch auf dem pMON721 Vektor (Monsanto Corp., St. Louis, MO). Das GVG Gen, welches transkribiert wird von der –343 bis +1 Region des CaMV 35S Promotors (Odell et al., 1985), war flankiert an dem 3' Ende durch die poly(A) Additionssequenz von Erbse-Ribulosebisphosphatcarboxylase – kleine Untereinheit – rbcS-E9 (Coruzzi et al., 1984). Die für spezifische Domänen codierenden DNA-Fragmente wurden durch die Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung von Primern mit geeigneten Sequenzen für die In-Rahmen-Klonierung hergestellt. Die GAL4 DNA-Bindungsdomäne umfasst die Aminosäuren 1–74 (Laughon und Gesteland, 1984), die saure VP16 Domäne umfasst die Aminosäuren 413–490 (Dalrymple et al., 1985) und die GR Rezeptordomäne umfasst die Aminosäuren 519–795 (Miesfeld et al., 1986). Die GAL4 UAS DNA (5'-CGGGTGACAGCCCTCCG-3', SEQ ID Nr. 1) wurde chemisch synthetisiert und die codierende Sequenz für das luc Gen (de Wet et al., 1987) wurde ausgeschnitten aus pGEM-luc (Promega Co.). Die Luc kodierende Sequenz wurde transkribiert von sechs Kopien von GAL4 UAS, angeordnet 5' zu der –46 bis +1 Region des 35S Promotors und flankiert an dem 3' Ende durch die poly(A) Additionssequenz von Erbse – rbcS-3A (Fluhr et al., 1986). Die 2 zeigt die Punkte der Insertion in pMON721 von GVG und die luc Nukleinsäurekonstrukte.
  • E) pTA7002G/ipt/luc (pYS4)
  • Dieses Plasmid ist ähnlich zu pTA7002ipt, wobei es aber zwei Unterschiede aufweist. Der 35S Promotor des pTA7002/ipt Vektors wurde durch einen synthetischen Promotor, genannt G10–90, ersetzt. Dieser letztere Promotor besteht aus vier Kopien einer G-Box (GCCACGTGCC, SEQ ID Nr. 2), die an den -90 35S Promotor fusioniert sind.
  • Auch ein 35S-luc Gen wurde aufgenommen, um die visuelle Erkennung der Transformanten unter Verwendung eines empfindlichen Bildsystems zu erleichtern. Dieser Vektor ist in der 12 dargestellt. Siehe Kunkel et al., 1999.
  • F) XVE-Vektoren
  • Die XVE-Vektoren (siehe 13) wurden beschrieben in Zuo et al. (2000). XVE: Ein chimärer Transkriptionsfaktor, der die DNA-Bindungsdomäne von LexA (Reste 1–87) enthält, Transaktivierungsdomäne von VP16 (413–490) und die regulatorische Region des humanen Östrogenrezeptors (272–595). Die zweite Expressionskassette, welche das Gen von Interesse kontrolliert, wurde hergestellt durch Fusion von acht Kopien der LexA Bindungsstellen an -46 des 35S Minimalpromotors.
  • pER8-CKI1 (XVE-CKI1): Ein XhoI/SpeI DNA-Fragment, welches die codierende als auch der Teil der 5'- und 3'-nicht-translatierten Region der CKI1 cDNA enthält, wurde in die gleichen Stellen des pER8 Vektors stromabwärts von dem 8 × LexA-46 Promotors inseriert. Bei diesem Konstrukt wurde das CKI1 Gen so unter die Kontrolle des XVE induzierbaren Systems gestellt, und seine Transkription kann nur aktiviert werden durch 17-β-Östradiol oder 4-Hydroxyltamoxifen.
  • pER8-Lex1 (XVE-Lec1): Ein XhoI/SpeI DNA-Fragment, welches die codierende als auch den Teil der 5'- und 3'-nicht-translatierten Region der Lec1 cDNA enthält, wurde in die gleichen Stellen des pER8 Vektors stromabwärts von dem 8 × LexA-46 Promotors inseriert. Bei diesem Konstrukt wurde das Lec1 Gen so unter die Kontrolle des XVE induzierbaren Systems gestellt, und seine Transkription kann nur aktiviert werden durch 17-β-Östradiol oder 4-Hydroxyltamoxifen.
  • pER8-SERK (XVE-SERK): Ein genomisches DNA-Fragment, welches das Arabidopsis SERK Gen enthält (ohne den SERK Promotor und die Transkriptionsterminations-Sequenzen) wurde in die gleichen Stellen des pER8 Vektors stromabwärts von dem 8 × LexA-46 Promotors inseriert. Bei diesem Konstrukt wurde das SERK Gen so unter die Kontrolle des XVE induzierbaren Systems gestellt und seine Transkription kann nur aktiviert werden durch 17-β-Östradiol oder 4-Hydroxyltamoxifen.
  • Beispiel 2
  • Pflanzen, die mit Vektoren auf Basis von pMON721 transformiert wurden
  • Der Vektor pMON721 kann in Verbindung mit dem A. tumefaciens Stamm ABI verwendet werden, während er nicht mit A. fumefaciens Stamm LB4404 verwendet werden kann. Der Stamm ABI kann alleine Sprosse auf Tabakblattscheiben induzieren, die auf einem MS-Medium ohne Hormone kultiviert werden und er ist somit nicht zu verwenden für Experimente, bei dem der Marker das Sprosswachstum ist. Die pMON721 – A. tumefaciens Stamm ABI-Kombination ist für solche Experimente nützlich, bei denen andere Marker geprüft werden, zum Beispiel wenn auf Antibiotikaresistenz selektiert wird. Bei diesen Experimenten werden die Zellen in einem Medium mit Hormonen wachsen und mittels Kanamycinresistenz selektiert werden. Sie werden in Gegenwart und in Abwesenheit des Induktors angezogen, zum Beispiel Dexamethason.
  • A) Transformation der Plasmide in Bakterien
  • Die Plasmide wurden in Agrobacterium tumefaciens eingeführt. Die Plasmide, die von pMON721 abstammten, wurden in den Stamm ABI (Monsanto Corp., St. Louis, MO) durch Verfahren eingeführt, die für Fachleute gut bekannt sind. Zum Beispiel wurde für pMON721/Luc eine Einzelkolonie von dem Agrobacterium tumefaciens Stamm ABI (Monsanto Corp., St. Louis, MO), der pMON721/Luc enthielt, von YEB-Platten selektiert, die 50 mg/l Kanamycin, 25 mg/l Chloramphenicol, 100 mg/l Spectinomycin und 100 mg/l Streptomycin enthielten. Die Agrobacterium-Zellen wurden in 50 ml sterile Röhrchen mit Schraubverschluss überführt, die 10 ml YEB Flüssigmedium mit 50 mg/l Kanamycin, 25 mg/l Chloramphenicol, 100 mg/l Spectinomycin und 100 mg/l Streptomycin enthielten. Die Kultur wuchs bei 28°C für 24 Stunden. Die Agrobacterium-Zellen in Kultur wurden durch Zentrifugation bei 3.000 Umdrehungen pro Minute und bei 4°C für 10 Minuten gesammelt. Das Zellpellet wurde einmal in 10 ml YEB-Medium mit Antibiotika gewaschen und dann resuspendiert in 30 ml B5-Medium, das für die Inokulation der Explantate verwendet wurde. Das YEB-Medium wird hergestellt mit folgenden Inhaltsstoffen auf 1,0 Liter: 5 g Saccharose, 5 g Pepton, 5 g Rinderextrakt, 1 g Hefeextrakt und 0,04 g MgSO4 × 7H2O.
  • B) Co-Kultur mit Agrobakterien
  • Blattscheiben von Nicotiana tabacum cv SR1 wurden transformiert und, wie von Horsch et al. (1988) beschrieben, regeneriert, und die Transformation von Arabidopsis wurde gemäß dem Verfahren von Valvekens et al. (1988) durchgeführt.
  • C) Luciferase enthaltende, transgenische Pflanzen
  • Primäre transgenische Pflanzen wurden selbst befruchtet und der Samen wurde gesammelt. Die transgenische Nachkommenschaft keimte auf MS-Medium (Murashige und Skoog, 1962), das ergänzt war mit 3 Saccharose, 0,8% Agar und 100 μg/ml Kanamycin für die Selektion. T3 homozygote Pflanzen, die auf dem gleichen Agarmedium für 14 Tage nach der Keimung wuchsen, wurden für die Induktionsexperimente verwendet. In einigen Experimenten wurden die Pflanzen transferiert auf ein hydroponisches Wachstumsmedium mit 1/100 Konzentration an MS-Salzen und auf die Wachstumsbedingungen für 3 Tage vor Verwendung adaptiert. In allen Fällen wurden die Pflanzen kontinuierlichem Licht und einer Temperatur von 27°C (Tabak) oder 22°C (Arabidopsis) ausgesetzt.
  • Beispiel 3
  • Pflanzen, transformiert mit Vektoren auf Basis von PTA7002 oder PTA7001
  • Die Vektoren PTA7002 und PTA7001 wurden mit dem A. tumefaciens Stamm LB4404 verwendet. Im Gegensatz zu A. tumefaciens Stamm ABI induziert der LB4404 Stamm keine Sprosse und diese Kombination von Vektor und bakteriellem Stamm kann in solchen Experimenten verwendet werden, bei denen das Sprosswachstum der Marker darstellt. Bei den hier beschriebenen Experimenten wurde pTA7002/ipt verwendet. Der verwendete Vektor kann jedoch auch andere Gene von Interesse umfassen, die entsprechend dem Wunsch zur Transformation von Genen in Pflanzen nicht unter der Kontrolle des GVG-Systems stehen. In diesen Experimenten wurden die Pflanzen auf einem Medium ohne Hormone und ohne Antibiotika, aber in Gegenwart und in Abwesenheit des Induktors (zum Beispiel Dexamethason) selektiert. Nur Zellen, die in Gegenwart des Induktors wachsen, sollten Sprosse generieren. Diese Sprosse werden abgeschnitten und in einem Medium mit Auxin, aber ohne den Induktor, transferiert. Die Abwesenheit des Induktors stoppt die Transkription des ipt-Gens und das Auxin in dem Medium fördert die Wurzelregeneration. Diese können dann durch Northern Blot-Analyse oder hinsichtlich der Resistenz gegenüber Hygromycin getestet werden, um zu bestimmen, welche regenerierten Pflanzen tatsächlich transformiert sind.
  • A) Transfer von Plasmide in Bakterien
  • Die Plasmide wurden in Agrobacterium tumefaciens eingeführt. Die von pTA7002 oder pTA7001 abstammenden Plasmide wurden in den Stamm LB4404 (Clontech Laboratories, Inc.) durch Verfahren eingebracht, die für Fachleute gut bekannt sind. Zum Beispiel wurde für pTA7002/ipt eine Einzelkolonie von LB4404, die pTA7002/ipt enthielt, von YEB-Platten selektiert, die 50 mg/l Kanamycin und 100 mg/l Streptomycin enthielten. Die Agrobacterium-Zellen wurden in ein 50 ml steriles Röhrchen mit Schraubverschluss transferiert, das 10 ml YEB Flüssigmedium mit 50 mg/l Kanamycin und 100 mg/l Streptomycin enthielt. Die Kultur wuchs bei 28°C für 24 Stunden. Die Agrobacterium-Zellen in Kultur wurden mittels Zentrifugation bei 3.000 Umdrehungen pro Minute und 4°C für 10 Minuten gesammelt. Das Zellpellet wurde einmal in 10 ml des YEB-Mediums mit Antibiotika gewaschen und dann resuspendiert in 30 ml des B5-Mediums, welches für die Inokulation der Explantate verwendet wurde.
  • B) Cokultivierung mit Agrobakterien
  • Tabakblätter wurden in Abschnitte von 4 mm × 4 mm auf einem feuchten sterilen Filterpapier geschnitten und dann in steriles, deionisiertes Wasser transferiert. Die Blattabschnitte wurden für mehrere Minuten in die Agrobacterium-Lösung (in B5 Medium) in einer Petrischale eingetaucht. Die Abschnitte wurden auf einem Stück sterilem Filterpapier getrocknet und dann auf MBDK-Platten angeordnet. Die MBDK Medienzusammensetzung war die folgende: MS-Salze – 4,3 g/l; B5-Vitamine – 112 mg/l; 2,4-D – 0,5 mg/l; Kinetin – 0,1 mg/l; Saccharose – 20 g/l; Phytagel – 2 g/l; pH 5,7.
  • C) Wurzelregeneration
  • Nach 3 Tagen der Cokultivierung von Tabakblättern mit Agrobakterien wurden die Explantate dreimal durch Eintauchen in 30 ml steriles Wasser, das 200 mg/l Carbenicillin enthielt, in einer Petrischale gewaschen. Nach Trocknung auf sterilem Papier wurden die Explantate auf MBC-Medium mit oder ohne Dexamethason (DEX, 30 μM) angeordnet. Die MBC-Medienzusammensetzung war die folgende: MS Salze – 4,3 g/l; B5-Vitamine – 112 mg/l; Saccharose – 20,0 g/l; Carbenicillin – 200 mg/l; Phytagel – 2,0 g/l; pH 5,7. Die Platten wurden inkubiert in einem Gewebekulturraum bei 25°C und 16 Stunden Licht/8 Stunden Dunkelheit. Nach 2 Wochen erschienen an den verwundeten Stellen der Explantate grüne Sprossknospen nur auf dem Medium, das DEX (30 μM) enthielt. Die Sprosse wurden abgeschnitten und auf MBCI-Platten transferiert. Das MBCI-Medium war das folgende: MS-Salze – 4,3 g/l, B5-Vitamine – 112 mg/l; Saccharose – 20,0 g/l; Carbenicillin – 200 mg/l; Phytagel – 2,0 g/l; pH 5,7; Indolessigsäure (IAA) – 0,15 mg/l.
  • D) Selektion der transgenischen Pflanzen
  • Nach 10 Tagen der Kultur auf MBCI-Platten erschienen viele zufällige Sprosse. Diese wurden abgeschnitten und auf neue MBCI-Platten transferiert. Diese Sprosse waren nach 10 Tagen der Kultur normal aussehend. Sie regenerierten Wurzeln und wuchsen zu Pflanzen mit 4–6 Blättern nach 2–3 Wochen heran. Bei diesem Stadium sind sie zur Testung geeignet, um festzustellen, ob sie tatsächlich transformiert sind. Da das pTA7001-Plasmid oder das pTA7002-Plasmid ein NOS-Hpt Gen enthält, sollten die transformierten Sprosse gegenüber Hygromycin resistent sein. Deshalb werden Blattproben, die Blattstiele aufwiesen, abgeschnitten und auf ein MBCI Medium mit 40 mg/l Hygromycin für die Wurzelinduktion übertragen. Nur etwa 10% der gesammelten Sprosse waren tatsächlich transformiert. Nicht-transgenische Zellen können Sprosse als Ergebnis der Absorption von Cytokininen bilden, welches von den Nachbarzellen hergestellt wird, die transformiert sind und Cytokinine herstellen. Das Wachstum der ausgewählten Sprosse in Gegenwart von Hygromycin kann verwendet werden, um auf transformierte Sprosse zu selektieren. Die Northern- oder Southern-Blot Analyse ist ein anderes Mittel, um auf Transformation zu testen. Diese letzteren Verfahren sind nützlich bei Experimenten, bei denen das NOS-hpt Gen von dem pTA7001-Plasmid oder dem pTA7002-Plasmid deletiert wurde und ein Gen von Interesse an seine Stelle inseriert wurde. Bewurzelte Sprosse werden in Töpfe übertragen und im Gewächshaus zur Reife herangezogen. Die transgenischen Pflanzen sehen normal aus, sind fertil und produzieren Samen.
  • Beispiel 4
  • Induktion mit Glucocorticoid
  • Alle Glucocorticoid-Derivate, Dexamethason (DEX), Triamcinolonacetonid, Betamethason und Hydrocortison, wurden von Wako Pure Chemical Industries gekauft. Die Chemikalien wurden in Ethanol mit 30 mM vor Verwendung gelöst und entweder in dem Wachstumsmedium oder in der Sprühlösung verdünnt. Das gleiche Volumen an Ethanol wurde dem Medium oder der Lösung als Negativkontrolle zugegeben. Im Falle von Gewebekulturexperimenten (wie im Beispiel 3) ist DEX in dem Gewebekulturmedium mit Phytagel enthalten. Im Falle der Behandlung von ganzen Pflanzen wuchsen die Pflanzen auf einem Agarmedium, welches Glucocorticoid enthielt, oder ihre Wurzeln wurden in ein hydroponisches Wachstumsmedium, das Glucocorticoid zu 0,01 mM enthielt, eingetaucht. Für das Sprühverfahren enthielt die Lösung 30 μM DEX und 0,01% (Gew./Vol.) Tween-20, wobei das Tween als Benetzungsmittel hinzugefügt wurde. Bei Experimenten, wo eine Blatthälfte besprüht wurde, wurde die andere Blatthälfte und die anderen Teile der Pflanze mit einer Kunststofffolie abgedeckt. Es sollte vermerkt werden, dass obwohl DEX nicht eine besonders toxische Chemikalie ist, es jedoch einen bestimmten physiologischen Effekt auf den Menschen haben kann und man sollte somit Vorkehrungen treffen, insbesondere zum Schutz des Auges, wenn diese Verbindung versprüht wird.
  • Beispiel 5
  • Luciferase-Tests
  • Die Extraktion der Luciferase und die Tests auf die relativen Luciferaseaktivitäten wurden durchgeführt gemäß der Beschreibung von Millar et al. (1992). Um die Luciferaselumineszenz darzustellen, wurden die Wurzeln der mit DEX behandelten Pflanzen in eine Lösung für 1 Stunde eingetaucht, die 0,5 mM Kaliumluciferin (Sigma) enthielt, oder der Blattstiel eines besprühten Blattes wurde für 30 Minuten in eine Lösung von 0,5 mM Kaliumluciferin eingetaucht. Pflanzen in Töpfen wurden mit einer Lösung, die 0,5 mM Kaliumluciferin und 0,01% (Gew./Vol.) Tween-20 enthielt, besprüht und für 30 Minuten stehen gelassen. Die Luciferaselumineszenz von den Pflanzen wurde visualisiert unter Verwendung einer Bildverstärkungskamera (VIM) und von Photonenzählenden Bildprozessoren (ARGUS-50), gekauft von Hamamatsu Photonic Systems. Die Expositionszeit betrug 10 Minuten. Um ein Bild der Luciferaselumineszenz von dem besprühten Blatt aufzunehmen, wurden das Blatt und ein Sofortfarbfilm (LP100, Fuji Photo Films Co.) in Kontakt miteinander für 5 Stunden angeordnet, wobei eine dünne Plastikfolie dazwischen angeordnet wurde.
  • Beispiel 6
  • RNA-Analyse
  • Die Gesamt-RNA-Isolierung und die Northern-Blot-Hybridisierung wurden gemäß der Beschreibung von Nagy et al. (1988) durchgeführt. Nach Hybridisierung wurde die Signale dargestellt mit dem BAS-2000 System (Fuji Photo Films Co.).
  • Beispiel 7
  • Selektion der besten transgenischen Linien
  • Verschiedene unabhängige, transgenische Linien sollten erzielt und getestet werden. Man sollte die beste Linie selektieren, das heißt, eine Linie mit einem niedrigen Grundniveau und einem hohen Induktionsniveau. Mehrere Kopien des T-DNA Fragmentes werden oft an einer Stelle inseriert. In solch einem Fall kann der 35S Promotor nahe RB in Nachbarschaft zu dem induzierbaren Promotor angeordnet sein und den induzierbaren Promotor zu einem konstitutiv aktiven Promotor verändern. Anders als in solch einem Fall, kann eine chromosomale Sequenz in Nachbarschaft zu dem induzierbaren Promotor auch seine Aktivität beeinflussen. Deshalb ist es am besten, die erzielten transgenischen Linien zu testen, um diejenige herauszufinden, die eine niedrige Grundaktivität und ein hohes Induktionsniveau hat.
  • Beispiel 8
  • Induktion der Luciferaseaktivität in transgenischen Pflanzen
  • Stationäre Induktionsniveaus der Luciferaseaktivität wurden in Reaktion auf unterschiedliche Konzentrationen eines Glucocorticoides gemessen. Junge transgenische Pflanzen (hergestellt unter Verwendung des pMON721/luc Vektors), die auf einem Agarmedium herangezogen wurden, wurden auf ein frisches Agarmedium übertragen, welches verschiedene Konzentrationen von DEX enthielt. Nach 2 Tagen auf dem Induktionsmedium wurde ein Gesamtzellysat von 10 Pflanzen hergestellt und auf Luciferaseaktivität getestet. Die 3B zeigt ein Bild der Luciferaselumineszenz von Pflanzen unter Verwendung eines hochempfindlichen Kamerasystems. Die Farbskala für die 3B ist in der 3A gezeigt. Die 3C zeigt die relative Luciferaseaktivität, die von verschiedenen Konzentrationen von DEX induziert wurde. Die in Abwesenheit von DEX nachgewiesene Luciferaseaktivität war sehr niedrig und vergleichbar zu der, die von transgenischen Pflanzen erzielt wird, welche ein Luciferasegen tragen, das nur von der TATA-Region (Daten nicht gezeigt) vorangestellt ist. Dieses Ergebnis zeigt, dass GAL4 UAS in den Pflanzen stumm war und durch endogene pflanzliche Transkriptionsfaktoren nicht erkannt wurde. Die Induktion war nachweisbar bei einer Konzentration von 0,1 μM DEX oder höher und eine gute Korrelation zwischen den DEX-Konzentrationen und den Induktionsniveaus wurde in dem Konzentrationsbereich von 0,1 bis 10 μM erzielt. Das maximale Induktionsniveau lag 100-fach über dem Grundniveau.
  • Bei diesem Experiment wurden die Pflanzen mit DEX über einen ausreichend langen Zeitraum behandelt, um sicher zu stellen, dass die Luciferaseaktivität für jede DEX-Konzentration ein Plateau erreicht hatte. Die Induktion war sehr langsam in Kunststoffgefäßen, wie bei diesem Experiment beobachtet wurde, was wahrscheinlich auf einem Transpirationswasserfluss in die Pflanzen unter den abgeschlossenen Bedingungen zurückzuführen ist. Die Aufnahme von Glucocorticoid war somit über die Wurzeln langsam im Vergleich zu nicht-abgeschlossenen Freiluftbedingungen. Andererseits ist es unter den letzteren Bedingungen schwierig, die Glucocorticoidkonzentration in den Pflanzen präzise zu kontrollieren, da das Hormon sehr schnell in den Blättern akkumuliert als Ergebnis der Transpiration.
  • Verschiedene pflanzliche Arten werden verwendet für Studien unter Grundlagen- und angewandten Aspekten der Pflanzenwissenschaften und unter ihnen hat sich Arabidopsis als eine Modellpflanze für Grundlagenuntersuchungen der Pflanzenbiologie herausgestellt. Bisher wurde jedoch noch kein gutes Induktionssystem für diese Modellpflanze entwickelt. Induktionssysteme unter Verwendung von pflanzlichen Promotoren, zum Beispiel Hitzeschockpromotoren, sind nicht geeignet, da sie pleiotrope Effekte hervorrufen. Obgleich das Tetracyclin-abhängige Expressionssystem erfolgreich in Tabak verwendet wurde, scheint es in Arabidopsis nicht zu funktionieren (Gatz, 1996). Andererseits hat es sich hier herausgestellt, dass das GVG-System auch in Arabidopsis arbeiten kann. Die 4A–C zeigen, dass die Luciferaseaktivität in transgenischen Arabidopsispflanzen effektiv durch DEX induziert wurde. Das GVG-System sollte breit bei vielen Genen und in verschiedenen Arten von transgenischen Pflanzen anwendbar sein.
  • Beispiel 9
  • Kinetik der transkriptionellen Induktion durch DEX
  • Obgleich die Luciferaseaktivität einfach zu messen ist, ist sie nicht geeignet für eine kinetische Studie innerhalb eines kurzen Zeitraums, da die Halbwertszeit der Luciferaseaktivität auf etwa 3 Stunden geschätzt wird (Thompson et al., 1991). Um eine mehr direkte Information hinsichtlich der Kinetik der Induktion zu erhalten, wurde die Gesamt-RNA isoliert und einer Northern-Blot Analyse unterworfen. Bei diesen Experimenten wurden die Pflanzen im Freiland angeordnet, um eine schnelle DEX-Aufnahme zu gewährleisten. Transgenische Pflanzen wurden an hydroponische Wachstumsbedingungen im Freiland adaptiert und DEX wurde dem flüssigen Wachstumsmedium bis zu einer Endkonzentration von 10 μM hinzugefügt. Die Gesamt-RNA wurde aus 20 Pflanzen zu jedem Zeitpunkt isoliert und einer Northern-Blot Analyse unterworfen. Die Ergebnisse für mit pMON721/luc transfezierten Pflanzen sind in den 4A und 5A gezeigt. Die 4A zeigt, dass die luc mRNA erstmals 1 Stunde nach Zugabe von DEX nachgewiesen wurde und die Menge wuchs bis zu einem stationären Niveau innerhalb der nächsten 3 Stunden an. Um die Beständigkeit der Induktion zu untersuchen, wurde DEX von dem Medium entfernt und die von den Pflanzen isolierte Gesamt-RNA wurde analysiert. Die 5A zeigt, dass luc mRNA selbst noch 4 Tage nach Entfernung von DEX nachgewiesen werden konnte.
  • Ein ähnliches Ergebnis wurde erzielt bei der Erfassung der Luciferaseaktivität. Aufgrund der hohen Empfindlichkeit des Nachweises konnte die induzierte Luciferaseaktivität bereits 30 Minuten nach DEX-Zugabe und für 8 Tage nach Entfernung des Hormons (Daten nicht gezeigt) gemessen werden. Aus diesen Ergebnissen kann geschlossen werden, dass die transkriptionelle Induktion durch DEX schnell ist und über einen langen Zeitraum aufrechterhalten werden kann.
  • Beispiel 10
  • Reaktionen auf verschiedene Glucocorticoide
  • Verschiedene Glucocorticoid-Derivate wurden hinsichtlich der Intensität und der Dauer der Induktion überprüft. Junge transgenische Pflanzen (transfiziert mit pMON721/luc), die auf einem Agarmedium wuchsen, wurden auf ein frisches Agarmedium übertragen, welches 30 μM von verschiedenen Glucocorticoiden enthielt, wobei die Pflanzen für weitere 2 Tage herangezogen wurden. Nach der Induktion wurden die Pflanzen auf ein Agarmedium ohne Glucocorticoid übertragen. An jedem in der 6 angezeigtem Zeitpunkt wurden 10 Pflanzen geerntet und ihre Luciferaseaktivitäten getestet. Die 6 zeigt, dass die Induktionsniveaus und die Zeitdauer der Induktion bei den verschiedenen Glucocorticoid-Derivaten unterschiedlich ist. Die höchsten Induktionsniveaus wurden entweder mit DEX oder mit Triamcinolonacetonid erzielt. Im Gegensatz dazu wurden nur niedrige oder mittlere Induktionsniveaus mit Betamethason oder Hydrokortikoid nachgewiesen. Bei diesen Experimenten wurde angenommen, dass das mit jedem Glucocorticoid erzielte Induktionsniveau ein Gleichgewichtsniveau erreicht hatte, da längere Induktionszeiträume die Luciferaseaktivität (Daten nicht gezeigt) nicht signifikant erhöhten. Die Induktion durch DEX wurde über einen längeren Zeitraum im Vergleich zu der Induktion mit Triamcinolonacetonid aufrechterhalten, während beide Glucocorticoide das gleiche Induktionsniveau zu Beginn der Behandlung hervorrief. Obgleich die Stabilität von diesen Glucocorticoiden in Pflanzen bei diesen Experimenten nicht bekannt ist, könnten die Induktionseigenschaften der unterschiedlichen Glucocorticoide verwendet werden, um die Intensität und die Zeitdauer der Induktion zu regulieren.
  • Beispiel 11
  • Lokale Induktion der Luciferaseexpression durch Besprühen mit Glucocorticoid
  • Die rechte und die linke Hälfte eines Blattes (etwa 10 cm in der Länge) an einer reifen Pflanze, welche die GVG- und die Luc-Gene trug (die Pflanze war transgenisch für den pMON721/luc Vektor) wurden mit einer Lösung, die 30 μM DEX und 0,01% (Gew./Vol.) Tween-20 enthielt, oder mit einer Kontrolllösung besprüht. 24 Stunden nach der Besprühung wurde das Blatt abgeschnitten und es wurde die Möglichkeit gegeben, Luciferin über den Blattstiel aufzunehmen. Die 7 zeigt die Fluoreszenz von dem Abschnitt des Blattes, der mit DEX behandelt wurde, während keine Fluoreszenz in dem Teil des Blattes zu erkennen ist, der mit einer Kontrolllösung ohne DEX behandelt wurde. Die 7 wurde aufgenommen durch Anordnung eines Sofortfarbfilms (Fuji Photo Films Co. LP100) auf dem Blatt für 5 Stunden, wobei eine dünne Kunststofffolie dazwischen angeordnet wurde.
  • Beispiel 12
  • Das induzierbare XVE Expressionssystem
  • Es wäre ein großer Vorteil in der Grundlagenforschung sowie in der angewandten Forschung, die Expression von multiplen Genen unabhängig und induzierbar zu kontrollieren. Als ein erster Schritt zu diesem Ziel, entwickelten wir ein neues induzierbares Expressionssystem, XVE genannt (siehe 13). Grundsätzlich ist das XVE-System dem System von GVG ähnlich, bei dem die regulatorische Region eines Kernrezeptors die hormonelle Induzierbarkeit auf das heterologe DBD, fusioniert zu der ersten Sequenz, überträgt. Die XVE-Chimäre enthält DBD von dem bakteriellen Repressor LexA (X) (Horii et al., 1981; Miki et al., 1981) und die regulatorische Region des humanen Östrogenrezeptors (E) (Greene et al., 1986). Diese strukturellen Merkmale erlauben XVE verschiedene DNA-Bindungsspezifitäten zu haben und durch verschiedene Stimuli im Vergleich zu GVG aktiviert zu werden. Demgemäß wurden acht Kopien der LexA Bindungsstellen an den 35S Minimalpromotor bei -46 fusioniert, um Effektorgene zu steuern.
  • Um das XVE-System zu testen, inserierten wir eine cDNA, die für das Grünfluoreszenzprotein (GFP) codiert, in die Effektorkassette eines XVE-Vektors (pER8; siehe 13 für Details). Der pER8-GFP Vektor wurde in Arabidopsis und in Tabak transformiert und die Expression des GFP-Gens wurde überprüft. Für beide Arten wurden ähnliche Ergebnisse erzielt. Hier präsentieren wir die Daten, die von einer detaillierten Analyse von pER8-GFP transgenischen Arabidopsis-Linien erzielt wurden. Anfänglich wurden 22 unabhängige transgenische Linien durch visuelle Inspektion der Pflanzen unter einem konventionellen Fluoreszenzmikroskop gescreent, welche in Abwesenheit (Kontrolle) oder in Gegenwart (induziert) der Induktoren (eine Mischung von 2 μM 17-β-Östradiol und 1 μM 4-Hydroxyltamoxifen) keimten. Das Ergebnis von diesem Test ist in der Tabelle 1 zusammengefasst. Ein hohes Induktionsniveau wurde in mehr als der Hälfte der Linien beobachtet und ein repräsentatives Beispiel ist in der 14 dargestellt. Unter den restlichen Linien wurde das GFP-Gen entweder auf einem niedrigeren Niveau (23%) exprimiert oder in einzelnen Fällen zeigte sich keine nachweisbare Expression (9%). Eine kleine Fraktion von diesen Linien exprimierte das GFP-Gen mit einem ungleichmäßigen Muster (14%). Diese Daten zeigen, dass XVE ein sehr effizientes Expressionssystem ist. In allen überprüften Linien wurde keine Hintergrundexpression (in der Abwesenheit des Induktors) nachgewiesen, was vermuten lässt, dass das System stark kontrolliert ist.
  • Tabelle 1 Zusammenfassung der transgenischen pER8-GFP Arabidopsis-Linien
    Figure 00420001
  • Beispiel 13
  • Charakterisierung des induzierbaren XVE Expressionssystems
  • Bei dem ursprünglichen Test wurde eine Mischung von 17-β-Östradiol und 4-Hydroxyltamoxifen verwendet, welche die am meisten verwendeten Induktoren für die Östrogenrezeptoren darstellen. Um zu unterscheiden, welche Verbindung die aktive Form für die Reaktion ist, wurden diese zwei Chemikalien getrennt hinsichtlich der Induzierbarkeit getestet. Während beide Chemikalien zur Induktion der Expression des Reportergens in der Lage waren, schien 4-Hydroxyltamoxifen etwas weniger aktiv als 17-β-Östradiol zu sein. Der letztere Induktor wurde in allen nachfolgenden Experimenten verwendet.
  • Um die Dosisabhängigkeit des Systems zu untersuchen, wurden 3 Wochen alte Keimlinge, die in Abwesenheit des Induktors keimten, auf ein Medium übertragen, das verschiedene Konzentrationen von 17-β-Östradiol enthielt. Die Inkubation dauerte 16 Stunden. RNAs wurden aus nicht behandelten (Kontrolle) oder aus behandelten Keimlingen isoliert und mittels Northern Blotting analysiert, wobei als Sonde GFP cDNA verwendet wurde. Wie in der 15 dargestellt, konnte das GFP-Transkript bei einer Behandlung mit 0,0004 μM (0,4 nM) 17-β-Östradiol nachgewiesen werden. Die Induktion war bei einer Konzentration von etwa 5 μM gesättigt.
  • Für Zeitverlaufsexperimente wurden 3 Wochen alte Keimlinge auf ein Medium übertragen, das 2 μM 17-β-Östradiol enthielt. Die Keimlinge wurden für verschiedene Zeiträume inkubiert. Die RNAs wurden präpariert und wie oben beschrieben analysiert. Das GFP-Transkript wurde nach einer 30-minütigen Inkubation nachgewiesen und die Expression erreichte ihr maximales Niveau nach einer 24-stündigen Induktion (16). In getrennten Experimenten erschien die GFP-Fluoreszenz nach einer 5-wöchigen Inkubation auf dem Induktionsmedium unverändert, was vermuten lässt, dass das System konstant aktiv bleibt.
  • Drei unabhängige, transgenische Linien wurden in den Experimenten, die in den 15 und 16 dargestellt sind, getestet und es wurden ähnliche Ergebnisse erzielt. In beiden Fällen wurde eine 100–200-fache Induktion der Transkripte routinemäßig erzielt. Wichtiger war, dass keine apparent toxischen Effekte oder physiologische Veränderungen in den getesteten Linien beobachtet wurden. Die obigen Analysen zeigen, dass XVE ein effizientes und zuverlässiges, induzierbares System ist.
  • Beispiel 14
  • Transfektion von Tabakblattscheiben und Wurzelzellen mit XVE-CKI1
  • Zusätzlich zu GVG-ipt wurde pER8-CKI1 (XVE-CKI1) für die Transfektion von Tabakblattscheiben verwendet. Nach Induktion mit 17-β-Östradiol regenerierten Sprosse ohne Verwendung von extern zugeführten pflanzlichen Hormonen. Die Sprosse erschienen 25–35 Tage nach Induktion. Die Zugabe von IAA (0,15 mg/l) erhöhte die Effizienz nicht, sondern hatte vielmehr nachteilige Effekte auf die Sprossbildung. Die Regenerationseffizienz war dosisabhängig zu dem 17-β-Östradiol in dem Medium (getestet bei den Konzentrationen von 1, 5, 10, 20 und 30 μM, wobei die Sättigung bei 10 μM auftrat).
  • Der XVE-CKI Vektor wurde auch verwendet, um Tabakwurzelzellen zu transformieren. Unter Verwendung der Wurzelzellen wurden Sprosse nach Induktion mit 17-β-Östradiol ohne Verwendung von extern zugesetzten, pflanzlichen Hormonen regeneriert. 2,4-D (0,5 mg/l) und Kinetin (0,1 mg/l) wurden bei der Co-Kultur der Wurzeln mit den Agrobakterien (2–3 Tage bei 22°C) verwendet. Infizierte Wurzeln wurden auf MBC-Medium mit oder ohne 17-β-Östradiol (5 μM) angeordnet. Die Explantate wurden alle 2 Wochen auf frisches MBC-Medium (mit oder ohne Induktor) übertragen. Die in Abwesenheit des Induktors herangezogenen Explantate produzierten weiße oder dunkel-gelbe Calli nach einer Kultur von 20–30 Tagen, wobei diese keine Sprosse bilden würden. Die in Gegenwart des Induktors herangezogenen Explantate bildeten grüne Calli. Sprosse erschienen 40–50 Tage nach Induktion. Auf MBC-Medium wurde keiner von 49 weißen/braunen Calli grün und keiner produzierte Sprosse, während auf dem MBC-Medium, das mit 5 μM 17-β-Östradiol ergänzt war, 13 von 65 weißen/braunen Calli grün wurden und Sprosse produzierten. Dieses Experiment verwendete die gleiche Zahl an Wurzelexplantaten mit und ohne Induktor. Da 65 Calli mit Induktor gebildet wurden und andererseits nur 49 ohne Induktor, könnte die Überexpression von CKI1 auch die Effizienz der Callusbildung erhöhen.
  • Beispiel 15
  • Transfektion von Arabidopsis-Wurzeln mit XVE-CKI1
  • A) Herstellung des Wurzelmaterials
  • Frisch geerntete Samen wurden trocken bei 4°C für 2 Wochen vor Verwendung gelagert. Die Samen wurden sterilisiert, indem sie in 1,5 ml Eppendorfröhrchen (oder einen anderen geeigneten Behälter) mit etwa 1 ml Sterilisationslösung (50% Clorox + 0,01% Triton X-100) angeordnet wurden und für 10 Minuten regulär geschüttelt wurden. Es ist am besten, nicht zu viele Samen (> 1.000 oder etwa 50 μl) in einem 1,5 ml Eppendorfröhrchen zu verwenden, da eine zu große Zahl an verwendeten Samen zu einer nicht-effizienten Sterilisierung führt. Die Sterilisierungslösung wurde mit einer sterilen Pipette entfernt und der Samen wurde dreimal in sterilem, destillierten Wasser gewaschen, wobei für jede Spülung 1,0–1,5 ml verwendet wurden.
  • Die sterilisierten Samen wurden in etwa 0,5 ml von sterilem 0,15 Agar in Wasserlösung suspendiert und dann auf der Oberfläche von A-Platten ausgebreitet (MS Salze + 30 g/l Saccharose + 0,8 g/l Agar, pH 5,7). Die Samen wurden bei 4°C für 2 Tage vernalisiert, um die Samenkeimfrequenz zu verbessern. Die Samen wurden dann in einem Kulturraum inkubiert und keimten innerhalb von 3 Tagen. Keimlinge von 1 Woche wurden für die Wurzelkultur verwendet.
  • 10 bis 15 Keimlinge wurden in einen 250 ml Erlenmeyerkolben übertragen, der 100 ml B5 Medium enthielt (B5 Salze + 30 g/l Saccharose + 0,5 g/l MES (2-[N-Morpholino]ethansulfonsäure), pH 5,7). Der Kolben wurde locker mit zwei Schichten Aluminiumfolie abgedeckt und auf einem Schüttler mit 125 Umdrehungen pro Minute angeordnet. Die Kulturen wurden mit schwachen Licht bei 22°C beleuchtet. Nach 10–15 Tagen in Kultur in dem B5 Medium wurden die Wurzeln für die Transformation verwendet. Weiße Wurzeln sollten für die Transformation ausgewählt werden. Gelbe oder leicht braune Wurzeln können nicht gut transformiert werden.
  • B) Vorbehandlung der Wurzelexplantate
  • Die folgenden Schritte sollten unter einer sterilen Werkbank durchgeführt werden. Die im Schritt (A) hergestellten Wurzeln wurden in eine sterile Petrischale übertragen. Ein steriles Skalpell wurde verwendet, um das Wurzelsystem von Pflanzen abzuschneiden. Die Wurzeln wurden in etwa 1 cm große Segmente geschnitten und auf ein steriles Papierhandtuch gelegt, um überschüssiges Medium abzutupfen. Die Wurzelsegmente wurden dann auf F1 Platten übertragen (B5 Salze + 20 g/l Glucose + 0,5 g/l MES + 0,5 g/l 2,4-D + 0,05 mg/l Kinetin + 2 g/l Phytagel, pH 5,7), wobei sterile Pinzetten verwendet wurden. Die Wurzeln wurden so ausgebreitet, dass sie alle in Kontakt mit dem Medium waren. Die Platten wurden mit einer gaspermeablen Klebfolie abgedichtet und in einem Gewebekulturraum für 2–3 Tage inkubiert.
  • C) Wachstum der Agrobakterien
  • Agrobakterien (Stamm LBA4404; Clontech) wurden mit den Konstrukten pER8-CKI1 (XVE-CKI1) transformiert. Die erzielten Transformanten wurden über Nacht bei 28°C kultiviert in YEB Medium (5 g/l Saccharose, 5 g/l Pepton, 5 g/l Rinderextrakt und 1 g/l Hefeextrakt, 0,04 g/l MgSO4 × 7H2O; pH 7,0), welches mit 100 mg/l Spectomycin und 100 mg/l Streptomycin ergänzt war. Die Agrobakterien wurden dann abzentrifugiert und zweimal mit YEB Medium ohne Antibiotika gewaschen und schließlich in 2,0–2,5 ml YEB für die Infektion der Arabidopsis-Wurzelexplantate suspendiert.
  • D) Inokulation der Wurzelexplantate mit Agrobacterium und Cokultivierung
  • Die im obigen Teil B hergestellten Wurzelexplantate wurden auf eine sterile Petrischale übertragen und in 0,5 cm Segmente geschnitten. Die Wurzelexplantate wurden in einen sterilen Behälter transferiert (zum Beispiel eine Glasröhre mit einer Netzabdeckung an einem Ende), der dann in eine Petrischale gegeben wird, die 20 ml B5 Medium enthält. 2 ml der Agrobakterien-Lösung von Schritt C werden dem B5 Medium zugegeben. Der Behälter wird vorsichtig für 2 Minuten geschüttelt, um sicherzustellen, dass die Wurzelexplantate mit dem Agrobacterium inokuliert sind. Nach der Inokulation wird der Behälter, der die Wurzelexplantate enthält, auf vier Schichten sterile Papiertücher angeordnet, um überschüssige Flüssigkeit abzusaugen. Klumpen von Wurzelsegmenten werden nachfolgend von dem Behälter unter Verwendung von Pinzetten entfernt und auf F2 Platten (F1 Platten + 20 mg/l Acetosyringon) in Klumpen von 5–10 Wurzelsegmenten angeordnet. Die Wurzelsegmente werden mit den Agrobakterien für 2–3 Tage bei 22°C cokultiviert.
  • E) Selektion und Regeneration der Transformanten
  • Nach Cokultivierung der Wurzelsegmente mit den Agrobakterien, wurden die Agrobakterien von den Wurzelexplantaten unter Verwendung von sterilem, destillierten Wasser, das 200 mg/l Carbenicillin enthielt, abgewaschen. Die Wurzelexplantate wurden in einem Korb gesammelt, der dann auf sterile Papiertücher gestellt wurde, um überschüssige Flüssigkeit abzuwischen. Die Wurzelsegmente wurden auf MIC Medium (MS Salze + 10 g/l Saccharose + 0,5 g/l MES + 0,15 mg/l Indolessigsäure (IAA) + 100 mg/l Carbenicillin + 20 g/l Phytagel, pH 5,7) mit oder ohne einen chemischen Induktor (5 μM 17-β-Östradiol) übertragen und bei 22°C mit einem Zyklus von 16 Stunden Weißlicht und 8 Stunden Dunkelheit kultiviert. Das MIC Medium enthielt MS Salze, IAA und Carbenicillin, wobei es aber keine Antibiotika für die Selektion von Transformanten enthielt. Es sei angemerkt, dass die Gegenwart von IAA nicht kritisch ist, aber die Effizienz der Regeneration erhöht, wenn Arabidopsis verwendet wird. IAA hat einen negativen Effekt, wenn Tabak verwendet wird.
  • Die obige Kultur wird auf dem gleichen Medium nach der ersten Woche subkultiviert und dann alle 2 Wochen subkultiviert. Nach etwa 10 Tagen Kultur erscheint ein kleiner dunkelgrüner Callus an den Explantaten, die auf dem Medium mit dem chemischen Induktor wuchsen, während andererseits kein grüner Callus auf der Platte ohne einen chemischen Induktor erscheint. Nach etwa 15 Tagen treten kleine Sprosse auf dem Medium mit dem chemischen Induktor auf. Nachdem die Sprosse kleine Rosetten (3–4 Blätter) gebildet haben, werden sie zu dem MIC Medium ohne den chemischen Induktor übertragen, um die Wurzelregeneration zu fördern. Nach der Wurzelregeneration werden die Pflänzchen in Erde übertragen und zur Reife herangezogen. Bei der Übertragung der Pflänzchen in Erde sollte das Agarmedium gründlich von den Pflanzen abgewaschen werden. Während der ersten 2 Tage in Erde sollten die Pflanzen mit einer Plastikabdeckung bedeckt sein, um eine hohe Feuchtigkeit zu gewährleisten.
  • F) Reifung der transgenischen Pflanzen
  • Nach etwa 5 bis 6 Wochen werden die meisten Schoten gelb und trocken. Die Samen werden individuell gesammelt und bei 4°C gelagert.
  • Beispiel 16
  • Transfektion von Arabidopsis mit XVE-Lec1
  • Die Überexpression von Lec1 unter der Kontrolle des induzierbaren XVE Systems (pER8-Lec1) führt zu der Bildung von somatischen Embryonen oder Embryo-ähnlichen Strukturen in den Kotyledonen der transgenischen Arabidopsis-Keimlingen. Dieses System kann zur Herstellung von somatischen Embryonen unter Pflanzenhormon freien Bedingungen in Abwesenheit von jeglichen pflanzlichen Hormonen verwendet werden. Dies unterscheidet es von allen gegenwärtigen Gewebekulturverfahren, bei denen die Bildung von somatischen Embryonen von 2,4-D abhängig ist. Nach Übertragung auf ein Medium ohne Induktor werden die somatischen Embyonen zu Keimlingen herankeimen und so Transformanten produzieren, die keinen antibiotischen Selektionsmarker exprimieren. Die konditionale Überexpression von Lec1 kann auch die Effizienz der Transformation und die Effizienz der Regeneration für Monocotylen und Gymnospermen erhöhen. Unter Verwendung der bisherigen Techniken war es sehr schwierig, Regenerate und/oder Transformanten für die ökonomisch wichtigsten Arten zu erzielen. Dieses Verfahren ist somit insbesondere wichtig für Monocotyle und Gymnospermen, deren Regeneration über den somatischen Embryogeneseweg erfolgt.
  • Beispiel 17
  • Transfektion mit XVE-SERK
  • Das Arabidopsis SERK-Gen wurde mittels PCR (Polymerasekettenreaktion) kloniert. Das SERK-Gen wurde unter die Kontrolle des XVE Systems gestellt. Das XVE-SERK Konstrukt wurde verwendet, um Tabak und Arabidopsis zu transfezieren. Nach der Induktion werden die somatischen Embryonen unter Pflanzenhormon freien Bedingungen in Abwesenheit von jeglichen zugesetzten pflanzlichen Hormonen gebildet werden. Die bisherigen Techniken erfordern die Gegenwart von 2,4-D für die Bildung der somatischen Embryonen. Nach Übertragung auf ein Medium ohne Induktor, werden die somatischen Embryonen zu Keimlingen herankeimen und so Transformanten produzieren, die keinen selektierbaren Antibiotikamarker exprimieren. Die konditionelle Überexpression von SERK wird auch die Effizienz der Transformation und die Effizienz der Regeneration für Monocotyle und Gymnospermen erhöhen, die zuvor schwierig zu regenerieren und/oder zu transformieren waren. Dieses Verfahren ist somit insbesondere wichtig für die Monocotylen und Gymnospermen, deren Regeneration hauptsächlich über den somatischen Embryogeneseweg erfolgt.
  • Beispiel 18
  • Doppelt induzierbare Systeme
  • Ein Hauptziel besteht in der Entwicklung eines doppelt induzierbaren Expressionssystems, indem multiple Gene unabhängig und induzierbar reguliert werden können. Transgenische Arabidopsis-Pflanzen, die a) XVE und b) GVG tragen, können mittels Co-Transformation oder Kreuzungen zwischen individuellen Linien erzeugt werden. Jede Komponente in dem doppelt induzierbaren System wird unabhängig arbeiten und wird nicht mit den anderen System interferieren. Sie werden ihre Induzierbarkeit und ihre starke Kontrolle aufrecht erhalten. Gene unter der Kontrolle von jedem Promotor können in jeglicher Reihenfolge oder gleichzeitig durch geeignete Verwendung und zeitliche Anwendung des Induktors induziert werden.
  • Beispiel 19
  • Verwendung eines Knotted Gens zur Induktion der Sprossbildung
  • Das KnottedI Gen und seine Familienmitglieder, zum Beispiel die KnottedI homologen Gene KNAT1 und KNAT2, werden in Sprossen stark exprimiert (Lincoln et al., 1994; Chuck et al., 1996). Transgenische Pflanzen, die zum Beispiel mit dem KNAT1 Gen unter der Kontrolle eines CaMV 35S Promotors transformiert wurden, zeigten deutliche Veränderungen, einschließlich einer ektopischen Sprossbildung (Lincoln et al., 1994). Solche Sprosse sind jedoch nicht in der Lage, sich normal zu entwickeln aufgrund der unkontrollierten Expression des Knotted Gens. Ein System, bei dem Pflanzen mit Knotted Genen, die regulierbar sind, transformiert werden, wird die Herstellung von Pflanzen ermöglichen, die Sprosse herstellen, und wird ferner die Verwendung der Sprosse zur Regeneration von normalen Pflanzen ermöglichen, indem die Expression des Gens in den Sprossen abgedreht wird. Die vorliegende Erfindung ist ein Verfahren zur Ermöglichung von solch einem Ergebnis. Ein Knotted Gen, zum Beispiel, kn1 vom Mais, wird in einem Vektor angeordnet, so dass es unter der Kontrolle des oben beschriebenen GVG-Systems ist. Pflanzen, die mit diesem Vektor transformiert werden, werden normal in Abwesenheit eines Induktors des GVG oder XVE Systems wachsen. Explantate, zum Beispiel Blattscheiben, von diesen transgenischen Pflanzen, können mit einem Induktor (z. B. Dexamethason oder 17-β-Östradiol) behandelt werden, um die Entwicklung von zufälligen Sprossen zu stimulieren. Die entwickelten Sprosse können abgeschnitten und auf ein Medium ohne den Induktor übertragen werden. Diese Sprosse werden sich normal entwickeln und transgenische Pflanzen ergeben. Die verwendeten Vektoren können ferner andere Gene von Interesse enthalten, die nicht unter der Kontrolle des GVG oder XVE Systems stehen, wobei das gewünschte System zur Transformation in die Pflanzen ausgewählt werden kann. Die ausgewählten Pflanzen werden das Gen von Interesse enthalten und werden selektiert werden ohne die Notwendigkeit der Anwendung eines selektierbaren Antibiotikamarkers. Es sei angemerkt, dass die Selektion der transformierten Sprosse wie in Beispiel 3 durchgeführt werden sollte, das heißt, auf einem Medium ohne Hormone (MBC), aber mit Carbenicillin, um die Agrobakterien abzutöten. Homologe von dem Knotted Maisgen aus anderen monocotylen oder dicotylen Pflanzen können für den gleichen Zweck verwendet werden.
  • Beispiel 20
  • Verwendung eines CKI1 Gens zur Induktion der Sprossbildung
  • Das Gen CKI1 wurde vor kurzem identifiziert (Kakimoto, 1996). Die Überproduktion von diesem Gen in Pflanzen führt zu Pflanzen, die typische Cytokininreaktionen zeigen, einschließlich einer schnellen Zellteilung und Sprossbildung in der Gewebekultur in Abwesenheit von exogenem Cytokinin (Kakimoto, 1996). Das CKI1 Gen kann auch als ein selektierbarer Marker in einer ähnlichen Weise wie ipt verwendet werden. Ein System, bei dem die Pflanzen mit CKI1, das regulierbar ist, transformiert werden, wird die Herstellung von Pflanzen ermöglichen, die Sprosse bilden können, und wird dann die Verwendung dieser Sprosse ermöglichen, um normale Pflanzen zu regenerieren, indem die Expression des Gens in den Sprossen abgestellt wird. Die vorliegende Erfindung ist ein Verfahren zur Erzielung von solch einem Ergebnis. Ein CKI1 Gen wird in einem Vektor so angeordnet, dass es unter der Kontrolle des oben beschriebenen GVG-Systems steht. Pflanzen, die mit diesem Vektor transformiert werden, werden normal in Abwesenheit eines Induktors des GVG Systems wachsen. Explantate, zum Beispiel Blattscheiben, von diesen transgenischen Pflanzen können mit einem Induktor (z. B. Dexamethason) behandelt werden, um die Entwicklung von zufälligen Sprossen zu stimulieren. Die entwickelten Sprosse können abgeschnitten und auf ein Medium ohne den Induktor übertragen werden. Diese Sprosse werden sich dann normal entwickeln und transgenische Pflanzen bilden. Der verwendete Vektor kann andere Gene von Interesse umfassen, die nicht unter der Kontrolle des GVG Systems stehen, wobei die Gene ausgewählt werden, die man in die Pflanze transformieren möchte. Die selektierten Pflanzen werden das Gen von Interesse umfassen und werden ohne die Notwendigkeit der Verwendung eines selektierbaren Antibiotikummarkers selektiert werden können. Wie in den Beispielen 3 und 19 wird die Selektion für Sprosse auf MBC Platten durchgeführt, welche dann auf MBCI für die Bewurzelung übertragen werden.
  • Beispiel 21
  • Vektoren mit Antibiotikaresistenz- oder Herbizidresistenzgenen unter GVG oder XVE Kontrolle
  • Die Antibiotikaresistenz hervorrufenden Gene werden in einem großen Umfang in Vektoren als selektierbare Marker verwendet. Ein Problem bei diesem System besteht darin, dass diese Gene dazu tendieren, konstitutiv aktiv zu sein, und die transformierten Pflanzen, welche dieses System erhalten, werden kontinuierlich diese Gene exprimieren. Es gibt Umwelt- und Gesundheitsbedenken gegenüber der Einfügung von solchen konstitutiv exprimierten Genen in Pflanzen, die außerhalb des Laborumfeldes herangezogen werden (Bryant und Leather, 1992; Gressel, 1992; Flavell et al., 1992). Die Anordnung von solchen Genen unter die Kontrolle des GVG oder des XVE Systems überwindet diese Nachteile. Die Antibiotikaresistenzgene werden nur während des Selektionsprozesses zu einem Zeitpunkt exprimiert, wenn ein Glucocorticoid in dem Wachstumsmedium vorhanden ist, während andererseits die Gene nicht aktiviert sein werden, wenn sie in Abwesenheit des Glucocorticoids außerhalb des Labors wachsen. Jedes gewünschte Antibiotikaresistenzgen kann verwendet werden. Geeignet modifizierte pTA7001 und pTA7002 Vektoren können für diesen Zweck verwendet werden. Das Antibiotikumgen von Interesse wird zum Beispiel in die XhoI-SpeI Klonierungsstelle einkloniert. Die pTA7001 oder pTA7002 Vektoren werden so modifiziert, dass das hpt Gen inaktiviert oder entfernt wird. Diese modifizierten Vektoren können benutzt werden. Geeignete Vektoren können hergestellt werden, indem zum Beispiel mit dem pBI101 (Clontech) Vektor begonnen wird. Der Abschnitt zwischen dem linken und dem rechten Rand des Vektors wird entfernt und mit dem oben beschriebenen GVG- oder dem XVE-System ersetzt, welches in Kürze den 35S Promotor, die GAL4 DNA-Bindungsdomäne, die VP16 Transaktivierungsdomäne und die Glucocorticoidrezeptordomäne plus die 6 × GAL4 UAS Region gefolgt von einer Klonierungsstelle umfasst. Solche Vektoren umfassen kein endogenes Antibiotikaresistenzgen. Jedes gewünschte Antibiotikagen kann in die Klonierungsstelle nahe der 6 × GAL4 UAS Region eingesetzt werden und wird unter der Kontrolle des Glucocorticoids stehen. Das Hygromycinphosphortransferase-Gen und das Neomycinphosphortransferase(npt)-Gen sind zwei Beispiele von Antibiotikagenen, die verwendet werden können. Ti-Vektoren, welche ein DEX regulierbares npt oder hpt Gen umfassen, können benutzt werden, um Pflanzen der gewünschten Art zu transformieren. Während der Gewebekulturphase werden die regenerierten Sprosse in Gegenwart von DEX (welches das geeignete Antibiotikumresistenzgen aktiviert) und in Gegenwart des geeigneten Antibiotikums (Kanamycin oder Hygromycin) selektiert werden. Nach dieser Feststellung können die transgenischen Sprosse dann auf ein Gewebekulturmedium mit dem Antibiotikum aber ohne den chemischen Induktor (DEX), überführt werden. Die erzielten Pflanzen werden die Antibiotikaresistenzgene enthalten, diese Gene werden aber in Abwesenheit eines chemischen Induktors nicht aktiv sein.
  • Herbizidresistenzgene können in ähnlicher Weise unter die GVG oder die XVE Kontrolle angeordnet werden und für die Selektion von transformierten Pflanzen während der Gewebekulturphase benutzt werden. Solche Pflanzen würden keine Herbizidresistenzgene auf dem Feld exprimieren. Beispiele von Herbizidresistenzgenen sind PAT (Phosphinothricinacetyltransferase), die Resistenz gegenüber dem BASTA-Herbizid verleiht (aktiver Wirkstoff Phosphinothricin) (Rathore et al., 1993; Becker et al., 1992), sowie eine mutierte Form der Acetolactatsynthase, die Resistenz gegenüber einem Sulfonylharnstoff-Herbizid von DuPont (siehe z. B. Wiersma et al., 1989; Harms et al., 1992; Hattori et al., 1992; Hattori et al., 1995) verleiht. Theoretisch können diese Gene nicht nur als selektierbare Marker in der Gewebekultur verwendet werden, sondern könnten auch auf dem Feld exprimiert werden. Aufgrund der möglichen Gefahren beim Sprühen von DEX oder von 17-β-Östradiol wäre ein versprühen von DEX auf die Pflanzen im Feld nicht wünschenswert, wobei dieses Verfahren aber benutzt werden könnte, wenn eine sicherere Verbindung als DEX als Induktor verwendet würde.
  • Beispiel 22
  • Pflanzenwachstum und Transformation
  • Nicotiana tabacum Samen des Kultivars SR1 wurden oberflächensterilisiert in 30% kommerziellem Bleichmittel, das 0,02 Tween 20 enthielt und zwar für 10 Minuten. Die Samen wurden anschließend fünfmal mit sterilem Wasser gewaschen. Die Pflanzen wuchsen in einem Gewebekulturraum bei 22°C mit 16 Stunden Licht und 8 Stunden Dunkelheit. Die Tabaktransformation wurde durchgeführt, wie im wesentlichen beschrieben von Horsch et al. (1985) und Klee et al. (1987). Blattscheiben wurden aus jungen Blättern von 4 Wochen alten Pflanzen hergestellt und die Explantate wurden kultiviert für 2 Tage auf MB Medium (MS Salze, B5 Vitamine, 20 g/l Saccharose, 20 mg/l Acetosyringon, 0,2 Phytagel, pH 5,7). Nach einer 3-tägigen Co-Kultur mit Agrobacterium tumefaciens wurden die Blattscheiben auf ein MS Medium transferiert, das unterschiedliche DEX-Konzentrationen enthielt. Nach einer 20- bis 40-tägigen Kultur wurden die regenerierten Sprosse von den Explantaten abgeschnitten und auf MS Medium, das IAA enthielt, kultiviert, um die Wurzelregeneration zu induzieren.
  • Sterilisierte Salatblätter (Lactuca sativa var. Great Lake #118) wurden gekeimt und die Keimlinge wurden herangezogen gemäß der Beschreibung beim Tabak. Die Transformation der Salatblattscheiben wurde durchgeführt gemäß der Beschreibung von Curtis et al. (1996) mit der Ausnahme, dass Cytokinin in den Kulturmedien nicht enthalten war.
  • Beispiel 23
  • Optimierung der Bedingungen für die Induktion des ipt Gens in transformierten Zellen
  • Tabakblattscheiben und Salatblattscheiben, die nach Transformation mit pTA7002G/ipt/luc erzielt wurden, wurden auf Medien angeordnet, die Carbenicillin und unterschiedliche Konzentrationen von Dexamethason (DEX) enthielten. Die Explantate wurden auf frisches Medium alle zwei Wochen transferiert, um konstante Kulturbedingungen aufrecht zu erhalten. Die Zahl der Sprosse, die von einer gegebenen Zahl an Blattscheiben regeneriert wurden, wuchs dramatisch mit zunehmender Konzentration von DEX (Tabelle 2). 170 Tabaksprosse und 198 Salatsprosse wurden von 28 Explantaten bei 10 μM DEX regeneriert. In Abwesenheit von DEX regenerierten nur 7 Sprosse beim Tabak und 30 Sprosse beim Salat bei jeweils 28 Explantaten (8).
  • Tabelle 2
    Figure 00540001
  • Beispiel 24
  • Messung der Luc-Aktivität in Tabak- und Salatregeneraten
  • Die Transformationskassette pTA7002G/ipt/luc (12) enthielt ein luc Gen unter der Kontrolle des CaMV 35S Promotors (Millar et al., 1992; Benfey und Chua, 1990). Die luc-Aktivität wurde gemessen, um die Zahl der transgenischen Sprosse zu bestimmen, wobei das Videobildsystem verwendet wurde, welches von Michelet und Chua (1996) beschrieben worden ist. Die Messungen wurden über 5 Minuten integriert und der entsprechende Hintergrund wurde von den Bildern abgezogen (9A–F). Etwa 50% der Regenerate exprimierten das luc Gen (Tabelle 2). Unter nicht-induktiven Bedingungen (0 μM DEX) zeigten 42% der Tabakregenerate und 12% der Salatregenerate eine nachweisbare Luc-Aktivität (Tabelle 2). Dies zeigt, dass ein geringer Prozentsatz der transformierten Zellen sehr empfindlich gegenüber Cytokinin war, dessen Niveau etwas erhöht gewesen sein könnte aufgrund einer undichten ipt-Expression. Aufgrund der hohen Ausbeute an Regeneraten wurden die im Folgenden beschriebenen Experimente unter Verwendung von Sprossen aus Explantaten durchgeführt, die mit 10 μM DEX behandelt waren.
  • Beispiel 25
  • Messung des Effektes der Induktion von ipt mit DEX über die Zeit
  • Um das Transformationssystem weiter zu charakterisieren, wurden der Effekt der Dauer der Induktion sowie der Effekt von exogen zugeführten Phytohormonen untersucht. Zeitverlaufsexperimente wurden durchgeführt, um zu bestimmen, ob die Spezifität der Induktion des ipt Gens über die Zeit abnimmt aufgrund der Überproduktion und Diffusion von Cytokinin, welches Regenerationsereignisse in benachbarten, nicht-transformierten Zellen fördern könnte. Die Luc-Aktivität in 54 Tabakregeneraten (erzielt von einer Transfektion mit pTA7002G/ipt/luc) wurde nach 20, 30 und 40 Tagen der Induktion mit 10 μM DEX gemessen, um die Transformationsfrequenz zu bestimmen. Es wurde kein signifikanter Unterschied in dem Prozentsatz der Regenerate mit nachweisbarer Luc-Aktivität über die Zeit gefunden. Nach 20 Tagen zeigten 46% der Regenerate eine nachweisbare Luc-Aktivität und nach 30 und 40 Tagen hatten 53% der Regenerate eine nachweisbare Luc-Aktivität. Ferner gab es keine nachweisbaren Veränderungen in der Transformationseffizienz (bestimmt als Luc-Aktivität), wenn die ipt Genexpression direkt während der Cokultivierungsphase mit Agrobacterium induziert wurde. Ähnliche Ergebnisse wurden mit Salat erzielt.
  • Beispiel 26
  • Einfluss von exogen zugeführtem Auxin während der Induktion
  • Die Luciferaseaktivität wurde gemessen in Sprossen von Tabak-Explantaten (erzielt nach einer Transfektion mit pTA7002G/ipt/luc), die für 40 Tage auf Medien kultiviert wurden, die 1,0, 1,5 und 2,0 mg/ml Auxin und 10 μM DEX enthielten. Hohe Auxin- gegenüber Cytokininniveaus favorisierten eine Wurzelregeneration und hatten einen hemmenden Effekt auf die Sprossregeneration und könnten somit die Zahl der nicht-transgenischen Regenerate reduzieren. Es wurde kein signifikanter Unterschied in der Luciferaseaktivität bei verschiedenen Auxinkonzentrationen beobachtet. Bei 1,0 mg/ml Auxin zeigten 45% der Regenerate eine nachweisbare Luc-Aktivität, bei 1,5 mg/ml Auxin hatten 58% der Regenerate eine nachweisbare Luc-Aktivität und bei 2,0 mg/ml Auxin zeigten 47% Regenerate eine nachweisbare Luc-Aktivität.
  • Beispiel 27
  • Bestimmung der ipt Transkriptniveaus in Sprossen unter Verwendung der Northern-Analyse
  • Die Menge der ipt Transkripte wurde bestimmt in 30 Tage alten Tabak- und Salatregeneraten (aus einer Infektion mit pTA7002G/ipt/luc) mit und ohne nachweisbare Luciferaseaktivität. Die Regenerate wuchsen in Gegenwart von 10 μM Dexamethason.
  • Die RNA wurde aus 0,1 g Pflanzenmaterial unter Verwendung der Qiagen RNA-Extraktionskits und Protokolle extrahiert. Die Gesamt-RNA wurde auf 1% Agarosegelen, die 0,8 M Formaldehyd enthielt, getrennt. Die RNA wurde auf Duralon UV-Membranen gemäß den Anweisungen des Herstellers (Stratagene) transferiert. Nach dem Blotting wurde die RNA auf der Membran durch UV-Bestrahlung kreuzvernetzt. Die Membranen wurden geblockt und die Hybridisierung wurde durchgeführt unter Verwendung der Stratagene QuikHyb® Lösung bei 68°C gemäß den Anweisungen des Herstellers. Nach der Hybridisierung wurden die Membranen dreimal für 15 Minuten mit 2 × SCC + 0,1% SDS bei 65°C und einmal mit 0,1 × SSC + 0,1% SDS bei 60°C für 15 Minuten gewaschen.
  • Die Ergebnisse der Northern-Analyse zeigten, dass mit einer Ausnahme (10C, Probe f) alle getesteten Tabak- und Salatregenerate ipt Transkripte (Tabelle 3) exprimierten. Die Menge des ipt Transkripts war größer in den Tabak- als in den Salatregeneraten und variierte zwischen den unterschiedlichen Sprossen. Die Transkriptmengen für ipt waren in LUC+ Sprossen höher als in Regeneraten ohne nachweisbare Luciferaseaktivität (LUC–). Dies zeigt, dass die Regeneration fast vollständig an die ipt Genexpression gekoppelt ist, was zu erhöhten Cytokininmengen führt.
  • Tabelle 3
    Figure 00570001
  • Beispiel 28
  • Bestimmung auf Gegenwart des luc Gens und der Menge seiner Transkripte in Sprossen unter Verwendung der Southern- und der Northern-Analyse
  • Um auf die Gegenwart des luc Gens zu testen, wurde eine Southern-Blot Analyse durchgeführt unter Verwendung von DNA aus LUC+ und LUC– Tabakregeneraten (erzielt aus Transfektion mit pTA7002G/ipt/luc). Die DNA wurde aus 0,1 g Tabak-Pflanzenmaterial extrahiert unter Verwendung der Nucleon DNA Extraktionskits und Protokolle. Die DNA wurde auf 0,8 Agarosegelen aufgetrennt. Die DNA wurde auf Duralon UV-Membranen gemäß den Anweisungen des Herstellers (Stratagene) transferiert. Nach Blotting wurde die DNA kovalent an die Membran durch UV-Bestrahlung kreuzvernetzt. Die Membranen wurden blockiert und hybridisiert unter Verwendung der Stratagene QuikHyb® Lösung bei 68°C gemäß den Anweisungen des Herstellers. Nach Hybridisierung der Membranen wurde dreimal für 15 Minuten mit 2 × SCC + 0,1% SDS bei 65°C und einmal mit 0,1 × SSC + 0,1% SDS bei 65°C für 15 Minuten gewaschen. Das luc Gen wurde in allen LUC+ Regeneraten und in 50% der LUC– Sprosse gefunden.
  • Die Northern-Analyse wurde gemäß Beispiel 27 durchgeführt, um auf die Gegenwart von luc Transkripten in LUC+ und LUC– Tabakregeneraten zu testen. Die LUC– Regenerate besaßen kleinere, weniger zahlreiche luc Transkripte im Vergleich zu den luc Transkripten aus den LUC+ Regeneraten, die größer und zahlreicher waren (Tabelle 3).
  • Beispiel 29
  • Analyse der Hygromycinresistenz
  • Die Expression des hpt Gens verleiht eine Hygromycinresistenz. Um auf die Gegenwart des hpt Gens in den LUC+ und den LUC– Tabakregeneraten (erzielt durch Transfektion mit pTA7002G/ipt/luc) zu testen, wurde die Hygromycinresistenz überprüft, wie dies in Beispiel 3 diskutiert wurde. Junge Blattspreiten mit Blattstielen wurden auf ein Agarmedium mit Hygromycin angeordnet und hinsichtlich einer Wurzelbildung beobachtet. Die Hygromycinresistenz wurde auf Platten mit nicht-induktivem Medium, das 20 mg/Hygromycin enthielt, getestet. 95% aller getesteten LUC+ Tabakregenerate waren resistent gegenüber Hygromycin und mehr als 60 der getesteten LUC– Sprosse waren gegenüber Hygromycin resistent.
  • Beispiel 30
  • Wurzelregeneration, Pflanzenmorphologie und Kopienzahl im Tabak Tabaksprosse (erzielt aus Transfektion mit pTA7002G/ipt/luc) wurden auf ein wurzelinduzierendes Medium übertragen (1 × MS Salze, B5 Vitame, 0,15 mg/l IAA, 20 g/l Saccharose, 0,2% Phytagel, pH 5,7), welches kein DEX enthiel. Über 40% der transgenischen Tabaksprosse entwickelten ein starkes Wurzelsystem innerhalb von 20 Tagen nach Übertragung. Mit sehr wenigen Ausnahmen (weniger als 2%) war die Morphologie der transgenischen Tabakpflanzen normal. Die Tabakpflanzen wurden dann in Erde übertragen. Die Pflanzen entwickelten normale Blätter und Blüten und waren hinsichtlich der Samenproduktion nicht beeinflusst.
  • Die Segregationsanalyse für die luc Genfamilie wurde durchgeführt mit 44 zufällig ausgewählten Keimlingen (T1 Nachkommenschaft) einer transgenischen Tabaklinie (11A–B). Die Samen wurden von transgenischen Pflanzen, die sich selbst befruchteten, genommen. Eine Population der Nachkommenschaft (gekeimte Pflänzchen) wurde analysiert. Die Messung der Luciferaseaktivität in diesen Keimlinge zeigte eine klare 3:1 Aufspaltung des dominanten luc Gens. Dies zeigt eine Insertion an einer Stelle an und zeigt ferner, dass das Transgen stabil in die zweite Generation übertragen wurde.
  • Die Southern-Analyse wurde mit DNA aus Keimlingen nach Verdau der DNA mit Restriktionsenzymen durchgeführt. Einzelne Gelbanden wurden nachgewiesen (Spur 11C).
  • Beispiel 31
  • Southern-Blot Analyse der Tabakregenerate
  • Die Southern-Analyse wurde mit DNA aus 18 Tabakregeneraten (erzielt aus Transfektion mit pTA7002G/ipt/luc) nach Verdau mit BamHI, SacI und XbaI durchgeführt. Die meisten Sprosse enthielten nur eine Kopie des Transgens. Nur zwei von 18 Regeneraten zeigten die Gegenwart von mehr als einer Hybridisierungsbande (Tabelle 3).
  • Beispiel 32
  • Merkmale und Anwendungen des GLF-Systems
  • Die 17 ist eine schematische Darstellung des XVE Aktivierungsmarkierungsvektors pER16. Nur der Abschnitt zwischen dem rechten Rand (RB) und dem linken Rand (LB) ist dargestellt (nicht im Maßstab). Zwei Transkriptionseinheiten und der OLexA-46 Promotor sind zwischen RB und LB angeordnet. In der ersten Transkriptionseinheit steuert der G10–90 Promotor (Ishige et al., 1999) das XVE Fusionsgen, das durch die rbcs E9 polyA-Additionssequenz terminiert ist. Die zweite Transkriptionseinheit besteht aus dem Nopalinsynthase(NOS)-Genpromotor, der codierenden Sequenz des Neomycintransferase II(NPT II)-Gen und der NOS Polyadenylierungssequenz. Der OLexA-46 Promotor besteht aus acht Kopien der LexA Operatorsequenz, die an den -46 CaMV 35S Promotor fusioniert ist. Nach Integration in das pflanzliche Genom kann der OLexA-46 Promotor die Transkription von Sequenzen aktivieren, welche stromabwärts von dem Promotor angeordnet sind, und zwar in einer 17-β-Östradiol abhängigen Weise.
  • Das GLF System kann bei groß angelegten, genetischen Tests auf interessierende Mutanten verwendet werden. Zum Beispiel haben wir eine große Zahl von Arabidopsis-Mutanten (Bechtold et al., 1993) erzeugt, die den GLF-Vektor für funktionelle, molekulare Genomforschung tragen. Eine Funktionsverlust-Mutante kann sofort aus der T1 Nachkommenschaft identifiziert werden, die auf dem induktiven Medium, das 17-β-Östradiol enthält, herangezogen wird. Die Entfernung des Induktors wird die Entdeckung der Mutante selbst in solchen Fällen ermöglichen, wo die Funktionsverlust-Mutation letal ist. Es ist zu beachten, dass dieser Typ an letalen Mutationen durch alle vorher publizierten Systeme (Hayashi et al., 1992; Kakimoto, 1996; Weigel et al., 2000) nicht entdeckt werden kann. Andererseits kann der Funktionsverlust-Phänotyp dann in der T2 Nachkommenschaft charakterisiert werden. Ein zusätzlicher Vorteil des GLF Systems besteht in der Möglichkeit der konditionalen genetischen Komplementation der Funktionsverlust-Mutation. Dies kann durch geeignete Behandlung einer Funktionsverlust-Mutante mit 17-β-Östradiol erzielt werden, wodurch der mutierte Phänotyp konditional zum Wildtyp-Phänotyp wiederhergestellt wird.
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Claims (14)

  1. Vektor, umfassend eine für einen Transkriptionsfaktor codierende DNA-Sequenz, der die folgenden Elemente in der 5' zu 3' Richtung aufweist; (i) einen Promotor, (ii) DNA, die für eine DNA-Bindungsdomäne des bakteriellen Repressors LexA codiert, (iii) DNA, die für eine Transaktivierungsdomäne von VP16 codiert, (iv) DNA, die für eine Regulationsdomäne eines Östrogenrezeptors codiert.
  2. Vektor nach Anspruch 1, wobei der Vektor ferner ein Gen umfasst, das für einen selektierbaren Marker oder einen screenbaren Marker codiert, dessen Expression von dem Transkriptionsfaktor kontrolliert wird.
  3. Vektor nach Anspruch 2, wobei das Gen ipt, CKI1, Luciferase, ein Mitglied der knotted-Familie oder ein Gen ist, dessen Expression die Sprossregeneration und Entwicklung fördert.
  4. Vektor nach Anspruch 2, wobei der Vektor ferner ein Gen für Antibiotikaresistenz umfasst.
  5. Vektor nach Anspruch 2, wobei der Vektor ferner ein Gen für Herbizidresistenz umfasst.
  6. Vektor nach einem der Ansprüche 2 bis 5, wobei der Vektor ferner ein oder mehr Gene von Interesse umfasst.
  7. Vektor nach Anspruch 1, wobei der Promotor ein konstitutiver Promotor ist.
  8. Vektor nach Anspruch 7, wobei der konstitutive Promotor G1090 ist.
  9. Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der Promotor ein gewebespezifischer Promotor ist.
  10. Vektor nach Anspruch 1 oder 2, der ferner eine rechte Randsequenz benachbart zum 5'-Ende des Promotors (i) und, stromabwärts von der DNA, die für die Regulationsdomäne eines Östrogenrezeptors (iv) codiert, in der 5' zu 3' Richtung eine OLexA Bindungsstelle, einen Minimalpromotor, der eine TATA-Box enthält, und eine linke Randsequenz umfasst.
  11. Nukleinsäure, die in der 5' zu 3' Richtung (i) einen konstitutiven Promotor, (ii) eine DNA, die für eine DNA-Bindungsdomäne des bakteriellen Repressors LexA codiert, (iii) DNA, die für eine Transaktivierungsdomäne von VP16 codiert, (iv) DNA, die für eine Regulationsdomäne eines Östrogenrezeptors codiert, umfasst.
  12. Transgenische Pflanze oder transgenische Pflanzenzelle, die eine Nukleinsäure nach Anspruch 11 umfasst.
  13. Transgenische Pflanze oder transgenische Pflanzenzelle nach Anspruch 12, die ferner ein Gen umfasst, das aus der Gruppe ausgewählt ist, welche aus ipt, CKI1, einem Mitglied der knotted-Familie oder einem Gen besteht, dessen Expression die Sprossregeneration und Entwicklung fördert.
  14. Verfahren zur Darstellung eines fluoreszierenden Designs oder eines Wortes oder von Wörtern durch eine transgenische Pflanze, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: a) Herstellen einer transgenischen Pflanze, die ein Luciferasegen unter der Kontrolle eines chemisch induzierbaren Promotors umfasst, der durch ein Östrogen kontrolliert wird, wobei der Promotor eine Nukleinsäure nach Anspruch 11 umfasst, und b) Anordnen eine Chemikalie, welche den chemisch induzierbaren Promotor induziert, auf der transgenischen Pflanze in dem Muster des Designs, des Wortes oder der Wörter, die gewünscht werden, wodurch die Pflanze Luciferase herstellen und gemäß dem Muster, mit dem die Chemikalie auf der transgenichen Pflanze angeordnet wurde, fluoreszieren wird.
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