JP2001514893A - 植物成長及び発達の遺伝子制御 - Google Patents
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Abstract
Description
伝子のクローニング及び発現に関する。より詳しくは、本発明は、トリチクム・
アエスチブム(Triticum Aestivum)のRht遺伝子、及び他
の種からの相同体のクローニング及び発現、並びに該遺伝子の植物中での使用に
関する。
的植物の特徴を変化させるための手段を供する。成長及び/又は発達特性の操作
が有利であり得る種には、全ての作物があり、重要な例は穀類、おそらく温暖な
気候帯において最も農業経済的に重要である、コメ及びトウモロコシ、並びによ
り温帯性の気候における、コムギ、オオムギ、オート及びライ麦である。種子製
品のための重要な作物は、脂肪種子なたね及びカノーラ、トウモロコシ、ひまわ
り、ダイズ及びモロコシ類である。それらの根のために収集される多くの作物は
、もちろん種子から毎年、成長され、いずれの種の種子の生産も、植物が開花し
、授粉し、そして種子をつける能力に極めて依存する。園芸において、開花を含
む成長及び発達の時期の制御は重要である。開花を制御できる園芸植物には、レ
タス、エンダイブ及びアブラナ属植物、例えばキャベツ、ブロッコリー及びカリ
フラワー、並びにカーネーション及びゼラニウムがある。一方で矮性植物及び他
方で過剰に大きく丈の高い植物が、樹木、プランテーション作物及び稲科植物を
更に含めて、種々の園芸及び農業関係において有利であり得、及び/又は要求さ
得る。
りコムギ収率が非常に増加している。これらの増加は、コムギ生産性を世界人口
の上昇の要求と歩調をそろえることを可能にしている。以前、我々は、アラビド
プシス・ガイ(Arabidopsis gai)対立遺伝子のクローニングを
記述した(1997年2月12日に出願され、1998年8月14日にWO97
/29123として公開されたPCT/GB97/00390、John In
nes Centre Innovations Limited、この全ての
内容は引用により本明細書に組み込まれる)。それは、コムギ(単子葉植物)に
おけるRht変異体対立遺伝子と同様、アラビドプシス(双子葉植物)における
半優性矮性表現型及び植物成長ホルモンジベレリン(GA)に対する応答性の減
少を与える。gaiは、野生型(GAI)タンパク質のN末端近くに見い出され
る17アミノ酸残基を欠如する変異体タンパク質(gai)をコードする。この
セグメントの配列はコメcDNA配列(EST)中で高度に保存されている。こ
こで、我々はこのcDNAがRht座を含むことが知られている重複する穀類の
ゲノムマップの短いセクションにマッピングされること、及び我々がそのcDN
Aを用いてコムギのRht遺伝子を単離したことを示す。アラビドプシス(Ar abidopsis )及びトリチクム(Triticum)のものとして広範囲
に分岐したこのゲノムは、変異させた時にGA応答性に作用し、植物界を通して
保存されているGAシグナル伝達において配列のための役割を示す保存された配
列を有するはずである。更に、Rhtのクローニングは、以前にコムギで得られ
たものと同様に大きい収率増強の目的で、多くの異なる作物種への転移を許容す
る。
n10遺伝子として元来、知られている)の、純血コムギ育種系への導入はいわ
ゆる“グリーン・レボルーション”への最も大きな寄与の1つであった(Galeら
、1985, Dwarfing genes in wheat : Progress in Plant Breeding, G.E. Russe
ll (ed) Butterworths, London pp 1-35) 。これらのホメオアレルを含むコムギ
は、一貫してそれらを欠如するコムギをより多く生産し、現在、世界のコムギ作
物の約80%を含む。この収率増強の生物学的基礎は2重であるようである。第
1に、Rht対立遺伝子により供される半矮性表現型は倒伏(風/両による植物
の平担化、結果として収率を減少させる)に対する耐性を増加させる。第2に、
これらの対立遺伝子は、光吸収の再配分を引きおこし、これは穀粒に対して多く
、幹に対して少くなる(Galeら、1985)。これらの特性は、コムギ収率に大きな
効果を有し、これは、Rht含有系が農業者により収穫される年の間、20%超
、UKコムギ収率が増加したという事実により証明される。
るそれらの応答を害する遺伝的に優性の変異体rht対立遺伝子を含むので、矮
小になっている(Galeら、1976, Heredity 37 ; 283-289)。これにより、rht 変異体の子葉鞘は、野生型コムギ植物のものと異なり、GA適用に対して応答し
ない。更に、rht変異体は野生型対照において見い出されるより高いレベルま
で、生物学的に活性なGAを蓄積する(Lentonら、1987)、Gibberellin insens
itivity and depletion in wheat - consequences for development : Hormone
action in Plant Development - a critical appraisal. GV Haod, JR Lenton,
MB Jackson and RK Atkin (eds) Butterworths, London pp 145-160)。これらの
特性(遺伝子優性、GA応答性の減少、及び高い内因性GAレベル)は他の種に
おける変異により与えられる表現型に共通しており(トウモロコシのD8/D9 ;アラビドプシスのgai)、このことは、これらの変異体対立遺伝子はこれら
の異なる種においてオルソロガス遺伝子を規定していることを示し、これは、D 8/D9 及びRhtがトウモロコシ及びコムギのゲノム内でシンテニーの座であ
るという観察結果により更に支持される。
ヌクレオチド配列を含む核酸分子を供する。用語“Rht機能”は、トリチクム
のRht遺伝子と同様に植物の表現型に作用する能力を示す。“Rht機能”は
、植物成長の阻害、サプレッション、リプレッション又は削減として植物内で表
現型として観察することができ、ここでその阻害、サプレッション、リプレッシ
ョン又は削減はGAにより拮抗される。Rht発現はGAにより拮抗される植物
上の矮性表現型を与える傾向がある。
過剰発現は、GAでの処置により癒され得る植物に矮性表現型を与えるのに用い
ることができる。 また、本発明の一態様によれば、発現に基づいてrht変異体表現型を与える
能力を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を供す
る。rht変異体植物は野生型と比べて矮小しており、ここでその矮小はGA不
感受性である。
rht”(大文字で始まらない)は変異体機能をいうのに用いる。 多くの植物成長及び発達課程はジベレリン(GA)として知られる四環式ジテ
ルペノイド成長因子のファミリーの特定のメンバーにより制御される。(Hooley
, Plart. Mol. Riol. 26, 1529-1555 (1994))。ジベレリン又はGAは、図5に
示す基本的な炭素環構造を有するジテルペノイド分子を意味し、生物活性を有す
る場合、我々は、生物学的に活性なジベレリンという。
顕在化の1又は複数の刺激により定義することができる。当該技術で利用できる
多くの標準的アッセイが存在し、それらのいずれかの1又は複数における陽性結
果はテストジベレリンを生物的に活性であるとして示す(Hoadら、Phytochemist
ry 20, 703-713 (1981) ; Serebryakov ら、Phytochemistry 23, 1843-1854 (19
84) ; Smith ら、Phytochemistry 33, 17-20 (1993))。
セイ、及びオート第1葉アッセイがあり、それら全てが、適用されるジベレリン
が各々の組織の伸長を引きおこす能力に基づいて生物活性を決定する。好ましい
アッセイは、テスト組成物がジベレリン欠損植物に適用されるものである。この
ような好ましいアッセイには、成長を決定するための矮性GA欠損アラビドプシ
スの処理、節間伸長が決定される矮性エンドウアッセイ、葉鞘の伸長が決定され
るTan−ginbozu矮性ライスアッセイ、及び葉鞘の伸長が決定されるd 5 −トウモロコシアッセイがある。エロンゲーションバイオアッセイは、各々の
器官中の全般的な細胞伸長の効果を測定し、特定の細胞型に制限されない。
アリューロンα−アミラーゼアッセイがある。穀粒内の内乳の周囲にあるアリュ
ーロン細胞は、デンプンを消化して後に成長中の植物により用いられる糖を作り
出すα−アミラーゼを発芽により分泌する。その酵素生産はGAにより制御され
る。生物学的に活性なGAをキシコ単離されたアリューロン細胞はα−アミラー
ゼを分泌し、その活性は、例えばデンプンの分解の測定によりアッセイすること
ができる。
要な構造的特徴はB−環のC−6上のカルボキシル基;C−19,C−10ラク
トン;及びC−3におけるβ−水酸化である。C−2におけるβ−水酸化は(G
A8 ,GA29,GA34及びGA51により示される)不活性を引きおこす。rht 変異体はGA処理、例えばGA1 ,GA3 又はGA4 での処理に応答しない。
10-4MのGA3 又はGA4 を、週ごとに又はより頻繁に、噴霧することにより
行われ、また噴霧でなく植物上に液滴をたらすことにより行ってもよい。GAは
、有機溶媒、例えばエタノール又はアセトンに溶かして適用することができる。
なぜならそれは水よりこれらにより可溶性であるからであるが、これは、これら
の溶媒は植物を傷つける傾向があるので好ましくない。有機溶媒を用いるなら、
適切な製剤は、80%エタノールに溶かした24ηlの0.6,4.0又は30
0mM GA3 又はGA4 を含む。植物、例えばアラビドプシスは、GAを含む培
地、例えば寒天で固体化し、補給GAを含む組織培養培地(GM)上で成長させ
ることができる。
される配列の突然変異体、誘導体、変異体又は対立遺伝子であってもよい。好ま
しい突然変異体、誘導体、変異体及び対立遺伝子は、野生型遺伝子によりコード
されるタンパク質の機能的特徴、特にGAにより拮抗される植物成長阻害の能力
、又は植物のGA処理に応答する1もしくは複数の他の特徴を植物に与える能力
を保持するタンパク質をコードするものである。他の好ましい突然変異体、誘導
体、変異体及び対立遺伝子はrht変異体表現型、即ち植物成長の減少であって
その減少がGAに対して不感受性、即ちGA処理によって克服されないものを与
えるタンパク質をコードする。突然変異体、変異体又は誘導体を生産するための
配列の変化は、コードされるポリペプチド内の1又は複数のアミノ酸の付加、挿
入、欠失又は置換を導く、核酸内の1又は複数のヌクレオチドの1又は複数の付
加、挿入、欠失又は置換により行うことができる。もちろん、コードされるアミ
ノ酸配列に差を生じない核酸の変化も含まれる。
ノ酸配列をコードするもの、特に図3aに示すRhtコーディング配列である。
好ましいrht変異体は、図3bに下線で示される17アミノ酸のうちの一部も
しくは全部、及び/又は図3bに下線で示される17アミノ酸配列の直後にある
一部もしくは配列:
酸をコードし、特に図に示すコーディング配列である。更に、本発明の更なる実
施形態は、全ての態様において、図6b,7b,8b,9b,11b,11d又
は12bに示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を用いる。このよう
なコーディング配列は、図6a,7a,8a,9a,11a,11c又は12a
に示されるものである。
ター、好ましくはその核酸配列によりコードされるポリペプチドがそれから発現
され得る構成物又はベクターも供する。その構成物又はベクターは、好ましくは
植物細胞への形質転換のために適している。本発明は、このような構成物又はベ
クターで形質転換された宿主細胞、特に植物細胞を更に含む。これにより、本発
明による核酸を含む宿主細胞、例えば植物細胞が供される。その細胞内で、核酸
は、染色体内に組み込むことができる。半数体ゲノム当りに1超の異種ヌクレオ
チド配列が存在し得る。これは、例えば、以下に議論するように、内因的なレベ
ルと比べて、遺伝子産物の発現の増加を可能にする。
の組換えのために細胞内に核酸を導入するために用いる場合、プロモーター又は
他の調節配列を含む必要はない。しかしながら、一態様において、本発明は、発
現の調節のための調節配列に連結された(トリチクム以外からの相同体を含む) Rht 又はrhtコーディング配列を含む核酸構成物を供する。ここでその調節
配列は、そのコーディング配列に天然で融合しているもの以外のものであり、好
ましくは別の遺伝子のもの又はそれから得られるものである。
ら、実質的に純粋もしくは均一な形態、又は開花を含み得る、成長及び/又は発
達に作用し得るポリペプチドをコードする配列以外の関心の種もしくは起源の核
酸もしくは遺伝子、例えばRhtコーディング配列以外のトリチクム・アエスチ
ブム核酸を含まない、もしくは実質的に含まない単離物であり得る。用語“核酸
単離物”には、全体的に又は部分的に合成された核酸を包含する。
、RNA、全体的又は部分的に合成したものであり得る。もちろん、本発明によ
る核酸はRNAを含み、ここで示される配列の引用は、TのかわりにUでおきか
えて、RNA等価物を包含するとして解釈すべきである。 本発明は、開示される核酸配列のいずれかの発現産物、及び適切な宿主細胞内
で適切な条件下で、コーディング核酸からの発現により発現産物を生産する方法
も包含する。当業者は、組換え遺伝子発現の産物の発現及び回収のためのベクタ
ー及びデザインプロトコルを十分に作製することができる。適切なら、プロモー
ター配列、ターミネーターフラグメント、ポリアデニル化配列、エンハンサー配
列、マーカー遺伝子及び他の配列を含む、適切な調節配列を含む、適切なベクタ
ーを選択し又は作製することができる。更なる詳細については、例えば、Molecu
lar Cloning : a Laboratory Manual : 2nd edition, Sambrook ら、1989, Cold
Spring Harbor Laboratory Press を参照のこと。形質転換手順は用いる宿主に
依存することが、十分知られている。核酸の操作のための多くの周知の技術及び
プロトコル、例えば核酸構成物の調製、変異誘発、配列決定、DNAの細胞への
導入及び遺伝子発現、並びにタンパク質の分析におけるものは、Protocols in M
olecular Biology, Second Edition, Ausubel ら、eds, John Wiley & Sons, 19
92に詳細に記載される。植物で広範囲に成功して以前に用いられている特定の手
順及びベクターは、Bevan, Nucl. Acids Res. (1984) 12, 8711-8721、並びにGu
erinean 及びMullineaux (1993) Plant transformation and expression vector
s : Plant Molecular Biology Labfax (Croy RRD ed) Oxford, Bios ScientiPic
Publisher, pp 121-148に記載される。Sambrookら及びAusubel ら並びに全ての
他の本明細書に言及される文献の開示は引用により本明細書に組み込まれる。
(USA)及びDIAGEN GmbH(Germamy)から利用できるNi
−NTAを用いて行われるRht又はrhtの精製を行うことができる。Jarkne
cht ら(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 8972-8976 (1991) 並びにEP−A−
0253303及びEP−A−0282042を参照のこと。Ni−NTA樹脂
はタンパク質のN−又はC−末端近くに連続的ヒスチジンを有するタンパク質に
ついて高いアフィニティーを有するので、植物、植物の一部もしくは抽出物から
、又はそのタンパク質を発現する組換え生物、例えばイーストもしくは細菌から
ヒスチジン標識化Rht又はrhtタンパク質を精製するのに用いることができ
る。
え生産されたものを、当該技術分野で標準的である技術を用いて抗体を生じさせ
るために用いることができる。抗体及び抗体の抗原結合フラグメントを含むポリ
ペプチドを、更に後述するように、他の種からの相同体を同定するのに用いるこ
とができる。
ウマ、ヤギ、ヒツジ又はサル)を、タンパク質又はそのフラグメントで免疫化す
ることを含む。抗体は、当該技術で周知である種々の技術のいずれかを用いて免
疫化動物から得ることができ、好ましくは関心の抗原への抗体の結合を用いて、
スクリーニングすることができよう。例えば、ウエスタンブロット技術又は免疫
沈降法を用いることができる(Armitageら、1992, Nature 357 : 80-82) 。抗体
はポリクローナルでもモノクローナルでもよい。
る抗体は、例えば表面上に、機能的なイムノグロブリン結合ドメインを提示する
ラムダバクテリオファージ又は繊維状バクテリオファージを用いて、発現される
イムノグロブリン可変ドメインの組換え生産されたライブラリーから得ることが
できる。例えばWO92/01047を参照のこと。
及び後にそのコーディング遺伝子の同定及び/又は単離に用いることができる。
これにより、本発明は、Rht機能又はrht変異体表現型を与える能力を有す
るポリペプチドを同定し又は単離する方法であって、トリチクム・アエスチブム
Rhtもしくはrhtポリペプチドに結合することができ、又は好ましくはこの
ようなポリペプチド、例えば図3bに示すアミノ酸配列を有するものについての
結合特異性を有する抗体の抗原結合ドメインを含むポリペプチド(例えば完全な
抗体又はそのフラグメント)で候補のポリペプチドをスクリーニングすることを
含む方法を供する。
る核酸を用いて作られた発現ライブラリーの産物であっても、天然のソースから
の精製過程の産物であってもよい。 抗体に結合することが見い出されたポリペプチドは単離することができ、次に
アミノ酸配列決定にかけることができる。全体的に又は部分的にポリペプチドを
配列決定するためにいずれかの適切な技術を用いることができる(例えばポリペ
プチドのフラグメントを配列決定することができる)。例えば更に後述されるよ
うに、候補核酸へのハイブリダイゼーションにおいてプローブ又はプライマーと
して用いるための1又は複数のオリゴヌクレオチド(例えばオリゴヌクレオチド
の縮重プール)をデザインすることにより、ポリペプチドをコードする核酸を得
ることにおいて、アミノ酸配列情報を用いることができる。
、クローン化する方法であって、図2もしくは図3a、又は本明細書の他の図に
示すいずれか由来のヌクレオチド配列を用いる方法を供する。これら由来の配列
は、それら自体、他の配列を同定し、クローン化することに用いることができる
。本明細書に供されるヌクレオチド配列情報又はそのいずれか一部は、相同な配
列を見い出すためにデータベースサーチに用いることができ、その発現産物はR ht 機能についてテストすることができる。あるいは、核酸ライブラリーは、当
業者に公知の技術を用いてスクリーニングすることができ、それにより、相同な
配列を同定し、次にテストすることができる。
方法であって、Rht機能を有するポリペプチドをコードする核酸又はそのフラ
グメント、変異体、誘導体もしくは対立遺伝子で候補(又は“標的”)核酸をプ
ロービングすることを含む方法も供する。(例えばcDNA又はゲノムDNAで
あり得る)候補核酸は、このような相同体をコードする核酸を含み得る又は含む
と予想されるいずれかの細胞又は生物から得ることができる。
めに用いる核酸は、コーディング配列に相補的である図3bに示すアミノ酸配列
、又はこれらのいずれかのフラグメントをコードし、最も好ましくは図3aに示
すヌクレオチド配列を含む。 あるいは、上述の通り、プローブは、図3bに示すRhtアミノ酸配列を有す
るもののようなRht又はrhtポリペプチドに結合することができる抗体の抗
原結合ドメインに結合することができるものとして同定されるポリペプチドを配
列決定することにより得られるアミノ酸配列情報を用いてデザインすることがで
きる。
て同定される少数のハイブリダイゼーションで単純なパターンであるために十分
にストリンジェントであるものである。少しだけの陽性クローンが残るまで、次
第にハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを増加させることが当該技術
分野で公知である。
用的な手順を用いて、PCR又は他の核酸の増幅に関連する方法に用いることが
できる。例えば“PCRプロトコル;A Guide to Method and Applications”,
Eds, Innisら、1990, Academic Press, New Yorkを参照のこと。
ノ酸配列は、Rht遺伝子間で(完全に、実質的に又は部分的に)保存された配
列である。 アミノ酸配列情報に基づいて、遺伝コードの縮重、及び適切なら、候補核酸が
得られる生物のコドン用法を考慮して、オリゴヌクレオチドプローブ又はプライ
マーをデザインすることができる。特に、プライマー及びプローブは、例えば図
3及び/又は図4、図10から明らかな保存された配列に基づく情報を用いてデ
ザインすることができる。
より小さな分子を、全長のクローンを得るために用いることができる。挿入物は
、例えば部分的なcDNAクローンから調製することができ、cDNAライブラ
リーをスクリーニングするために用いることができる。単離された全長のクロー
ンは、ベクター、例えば発現ベクター又は植物への形質転換のために適したベク
ターにサブクローン化することができる。全長の配列を供するために重複したク
ローンを用いることができる。
オチド配列を用いて得ることができる相同体、並びに表1に示す配列を含む1又
は複数の、例えば一対のプライマーを用いて得ることができる核酸にも広げられ
る。 本発明の範囲内に、トリチクムのRhtによりコードされるポリペプチドの相
同体であるアミノ酸配列をコードする核酸配列も含まれる。相同体は、トリチク
ム以外の種からのものであり得る。
くは、その核酸及び/又はアミノ酸配列は図3aのヌクレオチド配列によりコー
ドされる配列と、好ましくは少くとも約50%、又は60%、又は70%、又は
80%又は85%の相同性、最も好ましくは少くとも90%、92%、95%又
は97%の相同性を有する。このようなポリペプチドをコードする核酸は、好ま
しくは、トリチクムRht遺伝子と、植物中での発現により特定の表現型、好ま
しくはGA応答性である表現型(即ちGAでの処理により植物の特徴に変化がお
こる)を与える能力、例えば阻害がGAにより拮抗される植物成長を阻害する能
力を共有し得る。注意すべきは、植物中でのRht発現は植物の1又は複数の他
の特徴に作用し得る。トリチクムRht遺伝子と共有し得る好ましい特徴は、ト
リチクムのような植物においてRht又は変異体表現型を補給する能力である。
ここで、このような表現型はパクロブトラゾールの矮性効果に対する耐性である
。オオムギのslender変異体はコムギゲノム内のRhtのものと等価なオ
オムギゲノム内の位置に存在する。このような変異体植物は強力にパクロブトラ
ゾール耐性である。本発明者らはslenderオオムギ変異体は、オオムギ変
異体のコムギ遺伝子での補給を許容する、コムギRhtに対するオルソロガス遺
伝子の又は変異体対立遺伝子である。オオムギにslender変異体を補給す
る能力は、本発明の実施形態の特徴であり得る。
ドの特定の好ましい実施形態には、図3bに下線で示される17アミノ酸配列、
又は図3bに下線で示される17アミノ酸中の(位置に関して)各々の対応する
残基と類似性もしくは同一性を有する少くとも約10残基、より好ましくは11
,12,13,14,15,16もしくは17残基を有するアミノ酸の隣接配列
、及び/又は配列:
とも約5残基、より好ましくは6,7,8もしくは9残基を有するアミノ酸の隣
接配列がある。更なる実施形態には、27アミノ酸配列:
を有する少くとも約15残基、好ましくは16,17,18,19,20,21
,22,23,24,25もしくは26残基を有するアミノ酸の隣接配列がある
。 十分に理解されるように、アミノ酸レベルでの相同性は一般に、アミノ酸類似
性又は同一性に関する。類似性は、“保存性変異”、即ち1つの疎水性残基、例
えばイソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニンの他のものへの置換、又は
1つの極性残基の他のものへの、例えばリシンのアルギニンへの、アスパラギン
酸のグルタミン酸への、アスパラギンのグルタミンへの置換を許容する。類似性
は、当該技術に標準的に用いられるAltschulら(1990) J. Mol. Biol. 215 : 40
3-10のTBLASTNプログラム、より好ましくは配列をアラインするためのNe
edleman 及びWunschのアルゴリズムを用いるGAP(Program Manual for the W
isconsin Package, Version 8, September 1994, Genetics Computer Group, 57
5 Science Drive, Madison, USA)により規定され、決定される通りであり得る。
GAPのための適切なパラメーターには、デフォルトパラメータ、ギャップ・ク
リエーション・ペナルティー=12及びギャップ・エクステンション・ペナルテ
ィー=4、又はギャップ・クリエーション・ペナルティー=3.00及びギャッ
プエクステンション・ペナルティー=0.1がある。相同性は、図3bのRht 配列の全長にわたってもよく、又は好ましくは配列:
ノ酸と比べて17アミノ酸の隣接配列、及び/又は配列:
の17アミノ酸及び/又は配列:
ミノ酸にわたってもよい。 核酸レベルにおいて、相同性は、全長にわたっても、又は好ましくは図3aの
配列内の30ヌクレオチドコーディング配列及び配列:
列及び図3bに下線で示す17アミノ酸配列をコードする配列、又はより長い配
列、例えば約60,70,80,90,100,120,150又はより多くの
ヌクレオチド、好ましくは図3bの下線の17アミノ酸をコードする図3の51
ヌクレオチドを含む配列によってもよい。
J. Mol. Biol. 215 : 403-10のTBLASTNプログラム、又はWisconsin Pack
age, Version 8, September 1994, (Genetics Computer Group, 575 Science Dr
ive, Madison, Wisconsin, USA, Wisconsin 53711)の一部である標準的プログラ
ムBestFitにより規定され、決定される。BestFitは、2つの配列
間の類似性の最も優れたセグメントの最適なアラインメントを作り出す。最適な
アラインメントは、Smith 及びWaterman(Adv. Appl. Math. (1981) 2 : 482-48
9)の局所的相同性アルゴリズムを用いて対の数を最大にするようにギャップを挿
入することにより見い出される。他のアルゴリズムには、対の数を最大にし、か
つギャップの数を最小にするよう2つの完全な配列をアラインするためにNeedle
man 及びWunschアルゴリズムを用いるGAPがある。いずれのアルゴリズムであ
っても、一般に、GAPギャップ・クリエーション・ペナルティー=12及びギ
ャップエクステンション・ペナルティー=4であるデフォルトパラメータが用い
られる。(Pearson及びLipman(1988) PNAS USA 85 : 2444-2448
の方法を用いる)アルゴリズムFASTAが更にかわりとして用いられる。
クレオチド配列が適切な条件下で組換えるために十分に類似していることを単に
要求する“相同時組換え”のような用語の標準的使用において、比較される配列
間のいずれの必要な進化的な関係も包含しない。本発明による核酸によりコード
され得る本発明によるポリペプチドの更なる議論は以下に記す。
れか一又は複数のものとハイブリダイズする核酸も包含する。 ハイブリダイゼーションは、核酸でプロービングし、そして(周知の技術に従
って)適切なストリンジェント条件下でポジティブなハイブリダイゼーションを
同定することにより決定することができる。プロービングのために、好ましい条
件は、更に研究することができる陽性として同定される少数のハイブリダイゼー
ションで単純なパターンであるのに十分にストリンジェントであるものである。
少い陽性クローンだけが残るまで次第にハイブリダイゼーションのストリンジェ
ンシーを増加させるために当該技術で公知である。
のいずれかを用いて測定することができる。例えば、プローブは、放射能で、蛍
光で、又は酵素により標識することができる。プローブの標識化を用いない他の
方法には、制限フラグメント長多形性の検査、PCRを用いる増幅、RNAse
開裂及び対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプロービングがある。
ば、DNAは細胞から抽出し、異なる制限酵素で消化することができる。次に、
制限フラグメントは、変性前に、アガロースゲルでの電気泳動により分離し、そ
してニトロセルロースフィルターに移すことができる。標識化プローブは、フィ
ルター上でDNAフラグメントにハイブリダイズさせ、結合を決定することがで
きる。プロービングのためのDNAは、逆転写酵素−PRCのような技術により
細胞からのRNA調製物から調製することができる。
種々のプローブをハイブリダイズさせることにより予備実験を行うことができる
。プロービングのために、好ましい条件は、更に研究することができる陽性とし
て同定される少数のハイブリダイゼーションで単純なパターンであるのに十分に
ストリンジェントである条件である。少しの陽性クローンだけが残るまで、次第
にハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを増加させることが当該技術で
公知である。適切な条件は、バックグラウンドハイブリダイゼーションが低い時
に多数のハイブリダイズするフラグメントが得られる時に達成されるであろう。
これらの条件を用いて、核酸ライブラリー、例えば発現される配列の代表的なc
DNAライブラリーを調査することができる。当業者は、オリゴヌクレオチド長
並びに塩基組成、温度等のような因子を考慮して、選択的ハイブリダイゼーショ
ンのための要求されるストリンジェンシーの適切な条件を十分に用いることがで
きる。
ムアミド濃度、及び中〜低の塩(例えばStandard Saline Ci
trate(‘SSC’)=0.15M塩化ナトリウム;0.15Mクエン酸ナ
トリウム;pH7)濃度を含む条件下で最初に行うことができる。 あるいは、約50℃又はそれ超の温度及び高い塩(例えば‘SSPE’=0.
186mM塩化ナトリウム;9mMリン酸水素二ナトリウム;9mMリン酸二水素ナト
リウム;1mM EDTAナトリウム;pH7.4)で行うことができる。好ましく
は、スクリーニングは約37℃、約20%のホルムアミド濃度、及び約5×SS
Cの塩濃度、又は約50℃の温度及び約2×SSPEの塩濃度で行われる。これ
らの条件により、安定なハイブリッドの同定のための完全な相同性を要求するこ
となく、プローブ配列との実質的な相同性(類似性、同一性)を有する配列を同
定することができよう。
42℃で一晩の、0.25MのNa2 HPO4 ,pH7.2,6.5%のSDS,
10%のデキストランスルフェートでのハイブリダイゼーション及び0.1×S
SC,0.1% SDS中で55℃での最後の洗浄がある。約90%の同一性に
より大きい配列の検出のために、適切な条件には、65℃で一晩の、0.25M
Na2 HPO4 ,pH7.2,6.5%のSDS,10%のデキストランスルフ
ェート中でのハイブリダイゼーション及び0.1×SSC,0.1% SDS中
で60℃での最後の洗浄がある。
条件は、以下の手順を含み得る。 第1及び第2のDNA分子をアガロースゲル上に走らせ、メンブランフィルタ
ーにブロットする(Sambrookら、1989)。そのフィルターを、一定に振とうしな
がら、5時間、65℃で、プレハイブリダイゼーション溶液(6×SSC,5×
Denhart’s溶液、20mM Tris−HCl,0.1% SDS,2mM
EDTA,20μg/mlサケ精子DNA)中でインキュベートする。次に、そ
の溶液を放射能標識化第2DNAを含む30mlの溶液に置換し(標準的技術に従
って調製したもの;Sambrookら、1999を参照のこと)、一定に振とうしながら6
5℃で一晩、インキュベートする。次の朝に、フィルターをそそぎ(3×SSC
−0.1% SDS溶液で1回、そそぐ)、次に洗う:65℃で25分、3×S
SC−0.1% SDS溶液での第1の洗浄;及び同じ時間、同じ温度で0.1
×SSC−0.1% SDSでの第2の洗浄。次に、そのフィルター上の放射線
パターンを標準的な技術を用いて記録する(Sambrookら、1989を参照のこと)。
ini洗浄液を減少させ又は全く省略することにより増加させることができる。 (SSCは、150mM NaCl,15mMクエン酸ナトリウムである。50×
Denhart’s溶液は1%(w/v)ficoll,1%ポリビニルピロリ
ドン、1%(w/v)ウシ血清アルブミンである)。
、図3bに下線で示す17アミノ酸、又は図3bに下線で示す17アミノ酸中の
対応する残基と類似性又は同一性を有する少くとも約10(より好ましくは11
,12,13,14,15,16又は17)アミノ酸を有する17アミノ酸の隣
接アミノ酸を含むが、変異体はそうでない場合、変異体であり得る。同様に、野
生型が、配列:
は6,7,8又は9)アミノ酸を有する10アミノ酸の隣接配列を含むが変異体
はそうでない場合であり得る。このような変異体ポリペプチドをコードする核酸
は、植物内での発現に基づいて、(GAの供給又は涸渇に基づき植物中でいくら
かの応答があり得るが)GAでの植物の処理に基づき克服されない又は野生型表
現型にもどらない変異体表現型である、GAでの植物の処理に不感受性又は非応
答性である表現型を与える。
ミノ酸配列の突然変異体、対立遺伝子、誘導体もしくは変異体配列であり、又は
他の種の相同体もしくはその突然変異体、対立遺伝子、誘導体、もしくは変異体
であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する
核酸単離物を供する。ここでその突然変異体、対立遺伝子、誘導体、変異体又は
相同体は1又は複数のアミノ酸の挿入、欠失、付加及び/又は置換により図3b
に示すアミノ酸と異なる。それらは、パクロブトラゾールの矮小効果に対して耐
性であるRht又は変異体表現型を有する植物をテスト核酸で形質転換すること
によりトランスジェニック植物を生産し、そのトランスジェニック植物内でテス
ト核酸から発現を引きおこし又は許容し、そのトランスジェニック植物をRht 又は変異体表現型の補給を示すものについてスクリーニングしてRht又は変異
体を補給することができるテスト核酸を同定し、そのRht又は変異体を補給す
ることができるとして同定された核酸から、図3bに下線で示す17アミノ酸又
は図3bに下線で示す17アミノ酸中の対応する位置内の各々のアミノ酸と類似
性又は同一性を有する少くとも10残基、より好ましくは11,12,13,1
4,15,16又は17残基を有する隣接17アミノ酸をコードするヌクレオチ
ド配列、及び/又は配列:
,7,8又は9)残基を有する10アミノ酸の隣接配列を削除することにより得
ることができる。 本発明の核酸を含む細胞、特に植物細胞又は細菌細胞は本発明の更なる態様を
形成する。
きるいずれかの適切な技術を用いる形質転換により、タンパク質をコードする核
酸を含み得る。 本発明によれば、ゲノム内に組み込まれた開示される核酸を有する植物細胞も
供する。
植物のものであり得る。 本発明は、このような植物細胞を含む植物も供する。 本発明によれば、発現の制御のための調節配列の作用的制御下で、本発明によ
り供されるヌクレオチドの配列をそのゲノム内に組み込んだ植物細胞も供する。
オチドの配列を含むベクターを植物細胞に導入し、そしてそのベクターと植物細
胞との間の組換えを引きおこし又は許容してヌクレオチドの配列をゲノム内に導
入することに関する方法も供する。 本発明による植物は、1又は複数の特性において本気に受粉しないものであり
得る。植物品種、特に植物育種者の権利による登録可能な植物品種は排除される
。植物は“植物品種”であると考える必要はないことに注意のこと。なぜならそ
れは、植物又はその祖先の細胞内に導入されたトランスジーンをゲノム内に安定
に含むだけだからである。
又はハイブリッド子孫及び後継、並びにこれらのいずれかのいずれか一部、例え
ば挿穂(cutting)、種子を供する。本発明は挿穂、種子等を含む、有性
又は無性的な再生又は繁殖に用いることができるいずれか一部であるいずれかの
植物零余子を供する。このような植物の有性的又は無性的に繁殖された子孫、ク
ローンもしくは後継、又はその植物、子孫、クローンもしくは後継のいずれか一
部もしくは零余子も本発明に含まれる。
されるようなその突然変異体、対立遺伝子、誘導体もしくは相同性)の発現を含
む、植物の特徴に影響を与える方法を供する。用語“異種”は、問題のヌクレオ
チドの遺伝子/配列が、遺伝子工学を用いて、即ち形質転換を含み得るヒトの介
入により、前記植物の細胞又はその祖先に導入されていることを示す。その遺伝
子は、ゲノム外ベクター上にあっても、ゲノム内に好ましくは安定に組み込まれ
てもよい。異種遺伝子は、内因性の等価な遺伝子、即ち成長及び/又は発達の制
御下で同じ又は類似する機能を通常、行うものであってもよく、又はその挿入さ
れた配列は、内因性遺伝子に加えてもよい。異種遺伝子の導入の利点は、遺伝発
現、並びにそれにより優性に従った植物の成長及び/又は発達に影響を与えるこ
とができるために、選択されたプロモーターの制御下に遺伝子の発現をおく能力
である。更に、野生型遺伝子の突然変異体及び誘導体は、内因性遺伝子のかわり
に用いることができる。挿入された遺伝子は宿主細胞に対して外のもの又は外来
性、例えば別の植物種のものであってもよい。
は、少くとも(例えば補うであろう内因性相同体を有するアラビドプシス(Ar abidopsis )でない)Rht機能を与える唯一の内因性遺伝子を有する
植物において、成長を促進するために用いることができる。これは、アンチセン
ス又はセンス制御の使用に関連し得る。丈の高い植物は、関心の植物中のRht 又は関連する相同体をバックアウトすることにより作ることができる。例えば雑
草を矮小に維持するためのGA生合成インヒビターの使用を許容するが作物を高
く成長させるため、パクロブトラゾールのようなGA生合成を阻害する化合物に
対して耐性である植物を作ることができる。
での処理により補うことができる矮性植物を導き得る。 rht変異体遺伝子は表現型において優先であるので、それらは、GA不感受
性矮性植物を作るために用いることができる。これは、例えばいずれかの形質転
換可能な作物、樹木又は果樹種に適用することができる。それは、Rhtコムギ
のようなより高収率/少い倒伏を供し得る。コメにおいて、これは、日本及び他
所で問題となっているBakane病に対するGA不感受性のコメを供すること
ができる。矮性装飾植物は、園芸及び切り花市場のために価値あるものであり得
る。配列操作は、種々の程度の激しさの矮小、GA不感受性表現型を供し得、各
々の作物の必要性又は操作者の希望に対して激しさの程度を調節を許容する。r ht 変異体配列の過剰発現は潜在的に最も有用である。
物において、及び特定の環境条件において、GAシグナルは開花誘導のために必
要とされる。例えば、短日条件下で成長させたGA欠損変異体アラビドプシス植
物はGAで処理しなければ開花しないであろう:これらの植物は、長日条件下で
成長する時に正常に開花する。アラビドプシス・ガイ(Arabidopsis gai )変異体植物は、短日条件下で開花の遅れを示す:激しい変異体は全く
開花することができない。これにより、例えばRht又はrht遺伝子発現又は
過剰発現により、開花を誘導するための所定のGA処理まで生長を保持する植物
を生産することができる。これは、園芸の分野において又は抽苔の抑制が要求さ
れるホウレンソウ、レタス及び他の作物のために役立つ。
おくために外から誘導できる遺伝子プロモーターの制御下におくことができる。 プロモーターに適用される用語“誘導可能(誘導性)”は、当業者に十分に理
解される。本質において、誘導性プロモーターの制御下の発現は、“スイッチ・
オン”され、又は適用された刺激に応答して増加する。それら刺激の性質はプロ
モーター間で多様である。特定の誘導性プロモーターは適切な刺激の欠如下で極
めて少い又は検出できないレベルの発現を引きおこす(又は発現しない)。他の
誘導性プロモーターは、刺激の欠如下で検出可能な構成物発現を引きおこす。発
現のレベルが刺激の欠如下にあっても、正常な刺激の存在下でいずれの誘導性プ
ロモーターからの発現も増加する。好ましい刺激は発現のレベルが表現型の特徴
を変えるために有効な量による関連する刺激の適用に基づいて増加する場合であ
る。これにより、レベルが低すぎて要求される表現型をもたらさない(実質的に
ゼロであり得る)刺激の欠如下で発現の基底レベルを引きおこす誘導性(又は“
スイッチ可能な”)プロモーターを用いることができる。刺激の適用に基づいて
、要求される表現型をもたらすレベルに発現は増加される(又はスイッチ・オン
にされる)。
れるカリフラワーモザイクウィルス35S(CaMV 35S)遺伝子プロモー
ター(Benfeyら、1990a及び1990b);外来性のセーフナーの適用に応答して活
性化されるトウモロコシグルタチオン−S−トランスフェラーゼ異型II(GST
−II−27)遺伝子プロモーター(WO93/01294,ICI Ltd);
植物の頂端分裂組織及び植物体内のいくつかの十分に局在化した位置、例えば内
生師部、花の原基、根及び苗条内の分岐点で発現されるカリフラワーmeri5
プロモーター(Medford, 1992 ; Medford ら、1991) 並びに花の発達において極
めて初期に発現されるアラビドプシス・タリアナ(Arabidopsis t haliana )LEAFYプロモーター(Weigelら、1992)がある。
る特定の化学的化合物により誘導されることが示されている。プロモーターは、
単子葉及び双子葉植物の両方で機能的である。それゆえ、それは、畑の作物、例
えばカノーラ、ひまわり、タバコ、シュガービート、綿;穀類、例えばコムギ、
オオムギ、コメ、トウモロコシ、モロコシ類;果樹、例えばタバコ、マンゴー、
モモ、リンゴ、西洋ナシ、イチゴ、バナナ、及びメロン;及び野菜、例えばニン
ジン、レタス、キャベツ及びオニオンを含む。遺伝的に改変された種々の植物内
で遺伝子発現を制御するために用いることができる。GST−II−27プロモー
ターは、根、葉、幹及び再生した組織を含む、種々の組織に用いるためにも適し
ている。
配列、例えばトリチクムのRht遺伝子、他の植物種からの相同体又はそのいず
れかの変異体、誘導体もしくは対立遺伝子に作用可能に連結された誘導性プロモ
ーターを含む遺伝子構成物を供する。これは、遺伝子の発現の制御を可能にする
。本発明は、前記遺伝子構成物で形質転換された植物、並びにこのような構成物
の植物細胞への導入及び/又は適切な刺激、有効な外来インデューサーの適用に
よる植物細胞内での構成物の発現の誘導を含む方法も供する。プロモーターは、
GST−II−27遺伝子プロモーター又はいずれかの他の誘導性植物プロモータ
ーであり得る。
らず、これは当業者に公知である。挿入すべき核酸は、転写を駆動するであろう
有効な調節因子を含む構成物内でアセンブルされるべきである。その構成物を細
胞に輸送する方法が利用できなければならない。構成物が細胞膜内にあるなら、
内因性染色体材料への組込みは行っても行わなくてもよい。最後に、植物を考慮
する限り、標的細胞型は、細胞が完全な植物に再生され得るようでなければなら
ない。
ルスルフロン、メトトレキセート、ゼンタマイシン、スペクチノマイシン、イミ
ダゾリノン及びグリホセートに対する耐性のような選択的表現型を与えるキメラ
遺伝子からなる選択遺伝子マーカーを用いることができる。 本発明の一態様は、トランスジェニック植物の生産における本発明による核酸
の使用である。
の組込みを引きおこし又は許容することを含む方法を供する。 植物形質転換のいずれかの適切な方法を用いて本発明に従って、核酸を含む植
物細胞を作り出すことができる。形質転換の後、植物は形質転換された植物細胞
及び組織から再生することができる。
れた構成物で形質転換されたものは、核酸の植物細胞への導入の後、任意に植物
への再生の後、例えば1又は複数のマーカー遺伝子、例えば抗生物質耐性を用い
て(上述)、選択することができる。 その配列を含むDNAセグメントで形質転換された植物は、植物の遺伝子操作
のために既に知られている標準的な技術によって作り出すことができる。DNA
は、いずれかの適切な技術、例えばその天然の遺伝子転移能力を利用するアグロ
バクテリウムにより行われるジスアームドTi−プラスミド・ベクター(EP−
A−270355,EP−A−0116718,NAR12(22)8711−
87215 1984)、パーティクル又はマイクロプロジェクティルボンバー
ドメント(US5100792,EP−A−444882,EP−A−4346
16)、マイクロインジェクション(WO92/09696,WO94/005
83,EP331083,EP175966,Green ら(1987) Plant Tissue a
nd Cell Culture, Academic Press)、エレクトロポレーション(EP29039
5,WO87066/4 Gelvin Debeyser−添付を参照のこと
)、他の形態の直接的DNA取込み(DE4005152,WO9012096
,US4684611)。リポソーム媒介DNA取込み(例えばFreeman ら、Pl
ant Cell Physiol. 29 : 1353 (1984)) 、又はボルテキシング法(例えば Kindl
e, PNAS U.S.A. 87 : 1228 (1990d))を用いて植物細胞に形質転換することが
できる。植物細胞の形質転換のための物理的方法はDard, 1991, Biotech. Adv.
9 : 1-11を参照のこと。
広く用いられている。現在、ほとんど全ての経済的に関連のある単子葉植物中で
の安定な繁殖力のあるトランスジェニック植物のルーチン的な生産に対する実質
的な進行がある(Toriyama, et al. (1988) Bio/Technology 6, 1072-1074 ; Zh
ang, et al. (1988) Plant Cell Rep. 7, 379-384 ; Zhang, et al. (1988) The
or Appl Genet 76, 835-840 ; Shimamoto, et al. (1989) Nature 338, 274-276
; Datta, et al. (1990) Bio/Technology 8, 736-740 ; Christou, et al. (19
91) Bio/Technology 9, 957-962 ; Peng, et al. (1991) International Rice R
esearch Institute, Manila, Philippines 563-574 ; Cao, et al. (1992) Plan
t Cell Rep. 11, 585-591 ; Li, et al. (1993) Plant Cell Rep. 12, 250-255
; Rathore, et al. (1993) Plant Molecular Biology 21, 871-884 ; Fromm, et
al. (1990) Bio/Technology 8, 833-839 ; Gordon-Kamm, et al. (1990) Plant
Cell 2, 603-618 ; D'Halluin, et al. (1992) Plant Cell 4, 1495-1505 ; Wa
lters, et al. (1992) Plant Molecular Biology 18, 189-200 ; Koziel, et al
. (1993) Biotechnology 11, 194-200 ; Vasil, I.K. (1994) Plant Molecular
Biology 25, 925-937 ; Weeks, et al. (1993) Plant Physiology 102, 1077-10
84 ; Somers, et al. (1992) Bio/Technology 10, 1589-1594 ; WO92/14828) 。
特に、アグロバクテリウム媒介性形質転換は、単子葉植物における極めて有効な
形質転換法としても、現在、出現している(Hieiら(1994) The Plant Journal
6, 271-282) 。
ギ、オート、及びオオムギにおいて達成されている(Shimamoto, K. (1994) Cur
rent Opinion in Biotechnology 5, 158-162. ; Vasil, et al. (1992) Bio/Tec
hnology 10, 667-674 ; Vain et al., 1995, Biotechnology Advances 13 (4) :
653-671 ; Vasil, 1996, Nature Biotechnology 14 page 702に報告される)。
接的取込みは、アグロバクテリウムが無能又は無効である場合に好ましい。ある
いは、異なる技術の組合せ、例えばアグロバクテリウムコート化マイクロパーテ
ィクルでのボンバードメント(EP−A−486234)又は傷を誘導するため
のマイクロプロジェクティルボンバードメントの後のアグロバクテリウムとの同
時培養を形質転換過程の効率を増強するために用いることができる。
-242に記載される。 形質転換の後、植物は、例えば単細胞、カルス組織又は葉ディスクから、当該
技術分野で標準であるように再生することができる。ほぼいずれの植物でも、植
物の細胞、組織及び器官から完全に再生することができる。利用できる技術は、
Vasil ら(Cell Culture and Somatic Cel Genetics of Plants, Vol I, II及び
III, Laboratory Procedure and Ther Applications, Academic Press, 1984)及
びWeissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989に
報告される。
れた特定の方法で本発明を実施するヒトの経験及び好みにより決定されよう。植
物細胞に核酸を導入するための形質転換システムの特定の選択は本発明に本質的
でなく、又は本発明を限定するものでもなく、また植物再生のための技術の選択
でもないことは当業者に明らかであろう。
により達成することができる。これにより、本発明は、植物の特徴に影響を与え
る方法であって、植物の細胞内で核酸から本発明による核酸の発現を引きおこし
又は許容することを含む方法を供する。 遺伝子産物ポリペプチドの下降発現は、アンチセンス技術又は“センス制御”
を用いて達成することができる。アンチセンス遺伝子又は部分的遺伝子配列の遺
伝子発現を下降制御するための使用は現在、十分に確立されている。DNAは、
そのDNAの“アンチセンス”鎖の転写が標的遺伝子の“センス”鎖から転写さ
れる通常のmRNAに相補的であるRNAを作り出すように、プロモーターの制
御下におかれる。二本鎖DNAのために、これは、コーディング配列又はそのフ
ラグメントをプロモーターの制御下に“逆方向”におくことにより達成される。
相補的アンチセンスRNA配列は、次に、mRNAと結合して二本鎖を形成し、
標的遺伝子からの内因性mRNAのタンパク質への翻訳を阻害すると考えられる
。これが、実際の作用の態様であるか否かはまだ不確かである。しかしながら、
技術は確立されている。例えば、Rothstein et al, 1987 ; Smith et al, (1988
) Nature 334, 724-726 ; Zhang et al, (1992) The Plant Cell 4, 1575-1588,
English et al., (1996) The Plant Cell 8, 179-188 。Antisense technology
is also reviewed in reviewed in Bourque, (1995), Plant Science 105, 125
-149, and Flavell, (1994) PNAS USA 91, 3490-3496を参照のこと。
えば、十分な長さのフラグメントを用いることができる。アンチセンス阻害のレ
ベルを最適にするためにコーディング配列の種々の部分から種々の大きさのフラ
グメントをスクリーニングすることは当業者にとって慣用的な事項である。開始
メチオニンATGコドン、及びおそらくその開始コドンの上流に1又は複数のヌ
クレオチドを含めることが有利であり得る。更なる可能性は、遺伝子の調節配列
、例えば耐性が要求される1又は複数の病原体中に1又は複数の遺伝子の特徴的
な配列を標的にすることである。適切なフラグメントは、少くとも約14〜23
ヌクレオチド、例えば約15,16もしくは17又はそれ超、少くとも約25、
少くとも約30、少くとも約40、少くとも約50、又はそれ超のヌクレオチド
を有し得る。他のフラグメントは、少くとも約300ヌクレオチド、少くとも約
400ヌクレオチド、少くとも約560ヌクレオチド、少くとも約600ヌクレ
オチド、少くとも約700ヌクレオチド又はそれ超であり得る。このようなセン
ス方向のフラグメントは、同時抑制に用いることができる(以下を参照のこと)
。
ドは標的遺伝子からアンチセンス構成物において異なり得る。特に植物細胞中に
存在する条件下で、各々のアンチセンス及びセンスRNA分子がハイブリダイズ
するために十分な相同性があることが好ましい。 これにより、本発明は、植物の特徴に影響を与える方法であって、植物の細胞
内で本発明による核酸からのアンチセンス転写を引きおこし又は許容することを
含む方法も供する。
れる場合、標的遺伝子からのタンパク質の過剰発現がおこる個体及び下降発現が
おこるいくらかの個体を含む所定範囲の表現型が作られる。その挿入された遺伝
子が内因性遺伝子の一部だけである場合、トランスジェニック集団中の下降発現
する個体の数は増加する。センス制御、特に下降制御がおこるメカニズムは十分
に理解されていない。しかしながら、この技術は、科学及び特許文献にも十分に
報告され、遺伝子制御のために慣用的に用いられる。例えば、van der Krol et
al., (1990) The Plant Cell 2, 291-299 ; Napoli et al., (1990) The Plant
Cell 2, 279-289 ; Zhang et al., (1992) The Plant Cell 4, 1575-1588, and
US-A-5,231,020も参照のこと。
内で本発明による核酸からの発現を引きおこし又は許容することを含む方法も供
する。これは、成長に影響を与えるために用いることができる。 本発明の態様及び実施形態は、添付の図面を引用して例により詳述されよう。
更なる態様及び実施形態は当業者に明らかであろう。本明細書に言及される全て
の文献は引用により本明細書に組み込まれる。
GB97/00390−WO97/29193,1997年8月14日公開)。
野生型(GAI)のDNA配列と変異体(gai)対立遺伝子との比較は、ga i が、タンパク質のN末端近くからの17アミノ酸のセグメントを欠如する変異
体の予想されるタンパク質産物(gai)をコードすることを示した。DNA配
列データベースのGAI配列でのスクリーニングは、gaiタンパク質中のGA
Iから削除されたセグメントのものに極めて密接に関連した配列の領域を含むコ
メEST(D39460)の存在を示した。領域DELLAからEQLEへの予
想されるアミノ酸配列の比較は両方の配列で同じである。2つの差(V/A;E
/D)は保存性置換であり、ここで、1つのアミノ酸残基は極めて類似した化学
特性を有する別のものに置換されている。更に、同一性の領域はgaiタンパク
質内の欠失領域の境界を超えて広がっている。配列:
完全に保存されている。 D39460の約760bpのSalI−NotIサブフラグメントを、コムギ
cDNA及び(種々のChinese SpringからのDNAから作った)
ゲノムライブラリーから並び(系統B73Nから作った)トウモロコシゲノムラ
イブラリーからハイブリダイズするクローンを単離するために低ストリンジェン
シーハイブリダイゼーション実験に用いた。C15−1及びC15−10(cD
NA)、並びに5al及び14al(ゲノムクローン)を含むいくつかのコムギ
クローンを単離した。クローンC15−1は遺伝子マッピング実験に用いられて
いる。零染色体−4染色体分析は、クローンC15−1がコムギ染色体4A,4
B及び4D由来のゲノムDNAフラグメントとハイブリダイズすることを示した
。これは、Rht座がグループ4染色体にマッピングされるので、Rht配列を
含むクローンC15−1と一致する。更に、Rht−Dlb(以前はRht2)
対立遺伝子について分離する集団を用いる組換え体分析は、変異体対立遺伝子と
の完全な同時分離を示すハイブリダイズするフラグメントを同定した。これは、
グループ4染色体の(Rhtを含むことが既に知られていた)2cMセグメント内
のcDNA C15−1中のmRNA配列をコードする遺伝子のゲノム位置に位
置し、cDNA及びゲノムクローンが実際Rht遺伝子を含むという強力な証拠
を供した。ここで開示されるトウモロコシD8 DNA配列は1alからのサブ
クローン化した隣接1.8kb及び3.0kb SalIフラグメント(Blues
criptTM SK+ にクローン化したもの)からのものである。ここで開示さ
れるコムギRht配列はクローン5alから(BluescriptTM SK+ にクローン化した)5.7kb DraIサブフラグメントである。
る。我々は、C15−10のためのDNA配列も得て;それはC15−1のもの
と同一であり、それゆえ示さない。図2b及び2cはクローン14al及び5a
lからの個々の配列決定のランからのオリジナルのデータを示す。図2に示す配
列は、図3aに示す複合DNA配列を作るために重複させることができる。この
配列は、図3bに示すGAIのもの(GAI)との、コムギ配列の予想される翻
訳産物(Rht)のアミノ酸配列の比較により示される通り、アラビドプシスG AI のものとの強力な相同性を示す。特に、仮定上のRhtの予想されるアミノ
酸配列は、gai内で失った領域中にわたってGAIとの近同一性の領域を示す
。図4は、コメEST内のgai削除領域を超えて広がる相同性がRht(
いて見い出されるものに加えて、GAシグナル伝達に関連することを示す。この
領域は、GAIに配列において関連するがGAシグナル伝達には関連しない他の
タンパク質であるSCRにおいて見い出されない。上述の配列決定実験に用いた
プライマーを表1に示す。
る確認は、以下の通り、種々の変異体対立遺伝子からの遺伝子配列の分析により
得られている。 本発明者らは、そのクローンを得て配列決定し、コメEST D39460と
してデータベースに基づいて同定した。この研究から生じた予想されるアミノ酸
配列を各々図6a及び図6bに示す。
つのセクション、周知の機能のいずれかのタンパク質とも相同性を示さないN末
端半分、及びアラビドプシスSCR候補転写因子(Pengら、(1997) Genes and D
evelopment 11 : 3194-3205 : PCT/GB97/00390) と広範囲の相同性を示すC末端
半分からなることを示した。上述の通り、タンパク質のN末端半分の一部分の欠
如はgai変異体対立遺伝子のGA応答特性を減少させる(Pengら、1997 ; PCT
/GB97/00390)。それゆえ、本発明者らは、D8及びRhtが各々アラビドプシス GAI のトウモロコシ及びコムギ機能的相同体(オルソロガス)であるなら、D 8 及びRhtの優性変異体対立遺伝子は、それらがコードするタンパク質のN末
端セクションに作用する変異も引きおこすはずである。
伝子、特にD8−1,D8−2023及びRht−Dlc(以前はRht10)
を記述する(Boerner ら、(1996) Euphytica 89 : 69-75 ; Harberd and Freeli
ng (1989) Genetics 121 : 827-838 ; Winkler及びFreeling (1994) Planta 193
: 341-348) 。それゆえ、本発明者らは、これらの変異体から候補D8/Rht
遺伝子をクローン化し、そのタンパク質のN末端半分をコードする遺伝子の部分
をDNA配列決定することにより検査した。
植物のゲノムDNAからのPCRにより、増幅のための次のプライマーを用いて
増幅した:D8−1のためにプライマーZM−15及びZM−24;D8−20 23 のためにプライマーZM−9及びZM−11;Rht−Dlcのために、ネ
スティドPCRを、Rht−15及びRht−26、次にRht−16及びRh
t−2を用いて行った。PCR反応を、Perkin Elmer gencA
mp XL PCRキットを用いて、以下の条件を用いて行った:反応を94℃
で1分、インキュベートし、次に94℃,15秒−X℃,15秒−69℃,5分
の13サイクル(ここで、Xは64℃で始めてサイクル当り1℃減少させ52℃
で終える)、次に94℃,15秒−53℃,15秒−65℃,5分の25サイク
ル、次に70℃で10分でインキュベートした。これらのフラグメントを、次に
pGEMR −T Easyベクター(Promega, Technical Manual を参照のこと
)にクローン化し、それらのDNA配列を決定した。
。D8−1変異はアミノ酸VAQK(55−59)を除去し、Gを加える枠内欠
失である(図11a及び図11bの配列を参照のこと)。この欠失は上述の保存
された
ノ酸
の欠失は、gai又はD8−1内の欠失と重複しないが、GAI,D8及びRh
t間で高度に保存された別の領域をカバーする(図10を参照のこと)。最後に
、Rht−Dlcは、それがコードする変異体Rhtタンパク質のN末端領域内
のアミノ酸
LN−PはGAI,D8及びRht間で保存されている。図10を参照のこと)
。 これにより、上述の変異体対立遺伝子の全ては優性であり、GA応答性の減少
に関連した矮性を与える。全部で3つのこれらの対立遺伝子は、それらがコード
するタンパク質のN末端半分の一部分を除去する欠失変異を含む。これらの観察
結果は、トウモロコシ及びコムギのD8及びRht遺伝子がクローン化されてい
ることを示す。
0(O830)とのN末端の予想されるGAIアミノ酸配列(Gai)のアライ
ンメント。
ス配列決定により得たもの)を示す。 Figure2bは、14alからのもとのDNA配列決定ランからのデータ
を示す(シングルパス)。 Figure2cは、5alからのもとのDNA配列決定ランからのデータを
示す(シングルパス)。
ムギRht遺伝子の複合DNA配列を示す。 Figure3bは、アラビドプシスの全体の予想されるGAIタンパク質配
列(Gai)との、図2のコーディング配列によりコードされる全体の予想され
るRhtタンパク質配列(rht)のアラインメントを示す。配列同一性の領域
を白抜きで示す。
ス)を示す。このcDNAは、それが得られるmRNAの3′末端を失っている
不完全な部分的クローンである。 Figure4bは、全体の予想されるRhtタンパク質(コムギ−図2のコ
ーディング配列によりコードされる)の、GAIのもの(Gai)及び図4aの
DNA配列から予想されるコメタンパク質配列とのアラインメントを示す。アミ
ノ酸同一性の領域を白抜きで示し;いくつかの保存性置換を陰で示す。
クレオチド配列を示す。 Figure6bは、Figure6aのコメEST配列によりコードされる
予想されるアミノ酸配列を示す。
れるアミノ酸配列を示す。
。 Figure8bは、Figure8aの5alコムギゲノムクローンの予想
されるアミノ酸配列を示す。
オチド配列を示す。 Figure9bは、Figure9aのトウモロコシ1alゲルクローンの
アミノ酸配列を示す。
ギRhtポリペプチド、本発明者らにより決定されたコメEST配列及びアラビ
ドプシス・タリアナGaiポリペプチドとのPRETTYBOXアラインメント
を示す。
ド配列を示す。 Figure11bは、トウモロコシ対立遺伝子の部分的アミノ酸配列を示す
。 Figure11cは、トウモロコシD8−2023対立遺伝子の部分的ヌク
レオチド配列を示す。 Figure11dは、トウモロコシD8−2023対立遺伝子の部分的アミ
ノ酸配列を示す。
配列を示す。 Figure12bは、コムギrht−10対立遺伝子の部分的アミノ酸配列
を示す。
Claims (54)
- 【請求項1】 アミノ酸配列: 【化1】 を含みそしてトリチクム・アエスチブム(Triticum Aestivum )植物中での発現に基づいて該植物の成長を阻害するポリペプチドをコードする
単離されたポリヌクレオチドであって、該阻害がジベレリンにより拮抗されるこ
とを特徴とするポリヌクレオチド。 - 【請求項2】 前記ポリペプチドが、トリチクム・アエスチブムから得るこ
とができるRhtポリペプチドのアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項1
に記載の単離されたポリヌクレオチド。 - 【請求項3】 Rhtポリペプチドをコードするトリチクム・アエスチブム
から得ることができる核酸のヌクレオチド配列であって次の配列: 【化2】 を含むヌクレオチド配列を含む請求項2に記載の単離されたポリヌクレオチド。 - 【請求項4】 図8bに示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする
単離されたポリヌクレオチド。 - 【請求項5】 図8aに示すコーディングヌクレオチド配列を有する請求項
4に記載の単離されたポリヌクレオチド。 - 【請求項6】 植物中での発現に基づいて該植物の成長を阻害するポリペプ
チドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、該阻害はジベレリンに
より拮抗され、ここで該ポリペプチドは、ヌクレオチド配列: 【化3】 を含むトリチクム・アエスチブムから得ることができる核酸によりコードされる
トリチクム・アエスチブムのRhtポリペプチドのアミノ酸配列と少くとも80
%の類似性を示すアミノ酸配列を有することを特徴とするポリヌクレオチド。 - 【請求項7】 前記ポリペプチドが、アミノ酸配列: 【化4】 を含むことを特徴とする請求項6に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 【請求項8】 前記ポリペプチドが、1のアミノ酸の隣接配列を含み、ここ
で該配列中の少くとも10の残基が、アミノ酸配列: 【化5】 中の対応する位置の残基とアミノ酸類似性又は同一性を示すことを特徴とする請
求項6に記載の単離されたポリヌクレオチド。 - 【請求項9】 前記ポリペプチドが1のアミノ酸の隣接配列を含み、ここで
該配列中の16残基がアミノ酸配列: 【化6】 中の対応する位置の残基とアミノ酸同一性を示すことを特徴とする請求項8に記
載の単離されたポリペプチド。 - 【請求項10】 前記ポリペプチドが、トウモロコシD8ポリペプチドにつ
いて図9bに示すアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項9に記載の単離さ
れたポリペプチド。 - 【請求項11】 図9aに示すコーディングヌクレオチド配列を有する請求
項10に記載の単離されたポリヌクレオチド。 - 【請求項12】 前記ポリペプチドが図6bに示すアミノ酸配列を含むこと
を特徴とする請求項9に記載の単離されたポリペプチド。 - 【請求項13】 図6aに示すコーディングヌクレオチド配列を有する請求
項12に記載の単離されたポリヌクレオチド。 - 【請求項14】 植物中での発現に基づいてジベレリン非応答性矮性である
表現型を該植物に与え、又はパクロブトラゾールの矮性効果に耐性であるrht ヌル変異体表現型植物中での発現に基づいて該rhtヌル変異体表現型を補足す
るポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、該ポリペプ
チドが、ヌクレオチド配列: 【化7】 を含むトリチクム・アエスチブムから得ることができる核酸によりコードされる
トリチクム・アエスチブムのRhtポリペプチドのアミノ酸配列と少くとも80
%の類似性を示すアミノ酸配列を有することを特徴とするポリヌクレオチド。 - 【請求項15】 前記ポリペプチドが、1又は複数のアミノ酸が欠失した、
トリチクム・アエスチブムから得ることができるRhtポリペプチドのアミノ酸
配列を含むことを特徴とする請求項14に記載の単離されたポリヌクレオチド。 - 【請求項16】 アミノ酸配列: 【化8】 が削除されている請求項15に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 【請求項17】 アミノ酸配列: 【化9】 が削除されている請求項15に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 【請求項18】 前記ポリペプチドが、1又は複数のアミノ酸が欠失した、
トウモロコシD8ポリペプチドについての図9bに示すアミノ酸配列を含むこと
を特徴とする請求項14に記載の単離されたポリヌクレオチド。 - 【請求項19】 アミノ酸配列: 【化10】 が削除されている請求項18に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 【請求項20】 図9aに示すコーディングヌクレオチド配列を有する請求
項19に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、アミノ酸配列: 【化11】 をコードするヌクレオチドが削除されていることを特徴とする単離されたポリヌ
クレオチド。 - 【請求項21】 アミノ酸配列: 【化12】 が削除されている請求項18に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 【請求項22】 アミノ酸配列: 【化13】 が削除されている請求項18に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 【請求項23】 前記ポリペプチドが、1又は複数のアミノ酸が欠失した、
図6bに示すアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項14に記載の単離され
たポリヌクレオチド。 - 【請求項24】 アミノ酸配列: 【化14】 が削除されている請求項23に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 【請求項25】 図6aに示すコーディングヌクレオチド配列を有する請求
項24に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、アミノ酸配列: 【化15】 をコードするヌクレオチドが削除されていることを特徴とする請求項24に記載
の単離されたポリヌクレオチド。 - 【請求項26】 アミノ酸配列: 【化16】 が削除されている、図8bに示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする
単離されたポリヌクレオチド。 - 【請求項27】 図8aに示すコーディングヌクレオチド配列を有する請求
項26に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、アミノ酸配列: 【化17】 をコードするヌクレオチドが削除されていることを特徴とする請求項26に記載
の単離されたポリヌクレオチド。 - 【請求項28】 請求項1〜27のいずれかに記載のポリヌクレオチドが発
現のための調節配列に作用可能に連結していることを特徴とする単離されたポリ
ペプチド。 - 【請求項29】 前記調節配列が、誘導性プロモーターを含むことを特徴と
する請求項28に記載の単離されたポリヌクレオチド。 - 【請求項30】 請求項1〜27のいずれかに記載の核酸のコーディング配
列の少くとも50の隣接ヌクレオチドの配列に相補的なヌクレオチド配列、又は
該コーディング配列に相補的な配列であり、該コーディング配列の発現のアンチ
センス又はセンス制御(“同時抑制”)に、転写の調節配列の制御下で用いるた
めに適した単離されたポリヌクレオチド。 - 【請求項31】 前記調節配列が誘導性プロモーターを含むことを特徴とす
る請求項30に記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項32】 先の請求項のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含み、
植物細胞の形質転換のために適した核酸ベクター。 - 【請求項33】 先の請求項のいずれかに記載の異種ポリヌクレオチド又は
核酸ベクターを含む宿主細胞。 - 【請求項34】 微生物である請求項33に記載の宿主細胞。
- 【請求項35】 植物細胞である請求項33に記載の宿主細胞。
- 【請求項36】 染色体内に異種の前記ポリヌクレオチドを有する請求項3
5に記載の植物細胞。 - 【請求項37】 半数体ゲノム当り1超の前記ポリヌクレオチドを有する請
求項36に記載の植物細胞。 - 【請求項38】 植物、植物の一部もしくは植物の零余子、又は植物の抽出
物もしくは誘導体内に含まれる請求項35〜37のいずれかに記載の植物細胞。 - 【請求項39】 請求項33〜37のいずれかに記載の細胞を生産する方法
であって、前記ポリヌクレオチド又は核酸ベクターを形質転換により前記細胞に
組み込むことを含む方法。 - 【請求項40】 前記ポリヌクレオチドを、細胞ゲノム核酸で、安定に中に
組み込まれるように組換えることを含む請求項39に記載の方法。 - 【請求項41】 1又は複数の形質転換された細胞から植物を再生すること
を含む請求項39又は40に記載の方法。 - 【請求項42】 請求項35〜37のいずれかに記載の植物細胞を含む植物
。 - 【請求項43】 請求項35〜37のいずれかに記載の植物細胞を含む植物
の一部又は零余子。 - 【請求項44】 植物を生産する方法であって、請求項1〜32のいずれか
に記載のポリヌクレオチド又は核酸ベクターを植物細胞に組み込み、そして該植
物細胞から植物を再生することを含む方法。 - 【請求項45】 前記植物から再生された植物の子孫又は派生物を有性又は
無性生殖により繁殖させ又は増殖させることを含む請求項44に記載の方法。 - 【請求項46】 植物の特徴に影響を与える方法であって、植物の細胞内で
、請求項1〜31のいずれかに記載の異種ポリヌクレオチドからの発現を引きお
こし又は許容することを含む方法。 - 【請求項47】 トランスジェニック植物の生産における請求項1〜32の
いずれかに記載のポリヌクレオチドの使用。 - 【請求項48】 請求項6に記載のポリヌクレオチドを同定し又は得る方法
であって、請求項1〜13のいずれかに記載のポリヌクレオチドと特異的にハイ
ブリダイズする核酸分子を用いて候補核酸をスクリーニングすることを含む方法
。 - 【請求項49】 PCRにおいてオリゴヌクレオチドプライマーを用いるこ
とを特徴とする請求項48に記載の方法。 - 【請求項50】 前記プライマーが、表1及び2に示すプライマーから選択
されることを特徴とする請求項49に記載の方法。 - 【請求項51】 請求項1〜27のいずれかに記載のポリヌクレオチドによ
りコードされる単離されたポリペプチド。 - 【請求項52】 請求項51に記載のポリペプチドについての特定の結合ア
フィニティーを有する抗原結合部位を含む抗体。 - 【請求項53】 請求項52に記載の抗体の抗原結合部位を含むポリペプチ
ド。 - 【請求項54】 請求項51に記載のポリペプチドを同定し又は得る方法で
あって、候補ポリペプチドを請求項52又は53に記載の抗体又はポリペプチド
でスクリーニングすることを含む方法。
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WO (1) | WO1999009174A1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2007046403A1 (ja) * | 2005-10-19 | 2007-04-26 | National University Corporation Nagoya University | 優性の矮性形質を示すイネ属植物、およびその利用 |
Families Citing this family (63)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB9717192D0 (en) * | 1997-08-13 | 1997-10-22 | Innes John Centre Innov Ltd | Genetic control of plant growth and development |
FR2797274B1 (fr) * | 1999-08-02 | 2003-09-05 | Agronomique Inst Nat Rech | Gene mutant de la famille gras, et plantes a developpement reduit comprenant ledit gene |
CN100467599C (zh) * | 2002-06-14 | 2009-03-11 | 中国科学院上海植物生理研究所 | 百脉根花型和花序结构调控基因、编码蛋白及其应用 |
US7446241B2 (en) * | 2002-07-30 | 2008-11-04 | Texas Tech University | Transcription factors, DNA and methods for introduction of value-added seed traits and stress tolerance |
NZ538532A (en) * | 2002-09-05 | 2008-04-30 | Genesis Res & Dev Corp Ltd | Polypeptides involved in the regulation of flowering in forage grasses |
US7538260B2 (en) | 2002-09-05 | 2009-05-26 | Jeroen Demmer | Compositions isolated from forage grasses and methods for their use |
US7148401B2 (en) | 2003-09-02 | 2006-12-12 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Brachytic2 (BR2) promoter from maize and methods of use |
WO2006015045A2 (en) * | 2004-07-29 | 2006-02-09 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Methods and compositions for modulating flowering and maturity in plants |
CN100345543C (zh) * | 2005-01-28 | 2007-10-31 | 江苏科技大学 | 多效唑在制备一种增加家蚕产卵量的制剂中的用途 |
CN1966687B (zh) * | 2005-11-16 | 2010-05-12 | 华中农业大学 | 一种调控水稻赤霉素合成的转录因子基因OsYAB1及其应用 |
WO2007124312A2 (en) * | 2006-04-19 | 2007-11-01 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Isolated polynucleotide molecules corresponding to mutant and wild-type alleles of the maize d9 gene and methods of use |
GB0719919D0 (en) * | 2007-10-11 | 2007-11-21 | Plant Bioscience Ltd | Control of plant seed and organ size |
US7964774B2 (en) | 2008-05-14 | 2011-06-21 | Monsanto Technology Llc | Plants and seeds of spring canola variety SCV384196 |
EP2427481A1 (en) | 2009-05-04 | 2012-03-14 | Pioneer Hi-Bred International Inc. | Yield enhancement in plants by modulation of ap2 transcription factor |
MX2011013224A (es) | 2009-06-09 | 2012-06-01 | Pioneer Hi Bred Int | Promotor de endospermo temprano y metodos de uso. |
EP2456874A1 (en) * | 2009-07-24 | 2012-05-30 | Pioneer Hi-Bred International Inc. | The use of dimerization domain component stacks to modulate plant architecture |
US8440891B2 (en) | 2009-09-22 | 2013-05-14 | Board of Trustees of the University of Akransas, N.A. | Rice cultivar CL 142-AR |
US8440892B2 (en) | 2009-10-15 | 2013-05-14 | Board Of Trustees Of The University Of Arkansas, N.A. | Rice cultivar CL 181-AR |
CN102597244B (zh) | 2009-10-26 | 2014-07-23 | 先锋国际良种公司 | 胚珠体细胞特异性启动子及应用方法 |
US20130167262A1 (en) | 2011-12-21 | 2013-06-27 | The Curators Of The University Of Missouri | Soybean variety s05-11268 |
US9204603B2 (en) | 2011-12-21 | 2015-12-08 | The Curators Of The University Of Missouri | Soybean variety S05-11482 |
WO2013103365A1 (en) | 2012-01-06 | 2013-07-11 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Pollen preferred promoters and methods of use |
WO2013103371A1 (en) | 2012-01-06 | 2013-07-11 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Ovule specific promoter and methods of use |
US8878009B2 (en) | 2012-04-26 | 2014-11-04 | Monsanto Technology, LLP | Plants and seeds of spring canola variety SCV318181 |
US8835720B2 (en) | 2012-04-26 | 2014-09-16 | Monsanto Technology Llc | Plants and seeds of spring canola variety SCV967592 |
US8859857B2 (en) | 2012-04-26 | 2014-10-14 | Monsanto Technology Llc | Plants and seeds of spring canola variety SCV259778 |
EP2894967A4 (en) | 2012-08-24 | 2016-05-18 | Commw Scient Ind Res Org | WHEAT WITH NEW ALLELS OF RHT-B1 |
WO2014059155A1 (en) | 2012-10-11 | 2014-04-17 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Guard cell promoters and uses thereof |
WO2014159306A1 (en) | 2013-03-13 | 2014-10-02 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Glyphosate application for weed control in brassica |
WO2014153254A2 (en) | 2013-03-14 | 2014-09-25 | Pioneer Hi-Bred International Inc. | Compositions and methods to control insect pests |
RU2015143825A (ru) | 2013-03-15 | 2017-04-26 | Пайонир Хай-Бред Интернэшнл, Инк. | Полипептиды phi-4 и способы их применения |
CN104177481B (zh) * | 2013-05-21 | 2016-10-12 | 中国农业大学 | 植物倒伏和花器官发育调控蛋白ZmLA1及其编码基因与应用 |
US10006045B2 (en) | 2013-08-16 | 2018-06-26 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
EP4001300A1 (en) * | 2013-08-21 | 2022-05-25 | Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation | Rust resistance gene |
EP3692786B1 (en) | 2013-09-13 | 2022-11-02 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
MX2016010187A (es) | 2014-02-07 | 2017-07-11 | Pioneer Hi Bred Int | Proteinas insecticidas y metodos para su uso. |
CA2955828A1 (en) | 2014-08-08 | 2016-02-11 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Ubiquitin promoters and introns and methods of use |
US20170247719A1 (en) | 2014-09-17 | 2017-08-31 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions and methods to control insect pests |
UA126192C2 (uk) | 2014-10-16 | 2022-08-31 | Піонір Хай-Бред Інтернешнл, Інк. | Інсектицидний білок та спосіб його застосування |
WO2016099916A1 (en) | 2014-12-19 | 2016-06-23 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Polylactic acid compositions with accelerated degradation rate and increased heat stability |
RU2017144238A (ru) | 2015-05-19 | 2019-06-19 | Пайонир Хай-Бред Интернэшнл, Инк. | Инсектицидные белки и способы их применения |
MX2017016119A (es) | 2015-06-16 | 2018-03-07 | Pioneer Hi Bred Int | Composiciones y metodos para controlar plagas de insectos. |
BR122023016256B8 (pt) | 2015-08-06 | 2024-04-30 | E I Du Pont De Nemours And Company | Polipeptídeo inseticida recombinante, polinucleotídeo recombinante, construto de dna, método de obtenção de uma planta transgênica ou célula de planta transgênica, composição, proteína de fusão, método para controlar uma praga, método para inibir crescimento ou para exterminar uma população de pragas e uso do polipeptídeo |
CN108513584A (zh) | 2015-08-28 | 2018-09-07 | 先锋国际良种公司 | 苍白杆菌介导的植物转化 |
US20180325119A1 (en) | 2015-12-18 | 2018-11-15 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
BR112018012887B1 (pt) | 2015-12-22 | 2024-02-06 | Pioneer Hi-Bred International, Inc | Cassete de expressão, vetor, métodos de obtenção de célula vegetal e planta transgênica, métodos para expressar um polinucleotídeo |
MX2018013249A (es) | 2016-05-04 | 2019-02-13 | Pioneer Hi Bred Int | Proteinas insecticidas y metodos para sus usos. |
CA3022858A1 (en) | 2016-06-16 | 2017-12-21 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions and methods to control insect pests |
RU2019101793A (ru) | 2016-06-24 | 2020-07-24 | Пайонир Хай-Бред Интернэшнл, Инк. | Регуляторные элементы растений и способы их применения |
MX2018015906A (es) | 2016-07-01 | 2019-04-04 | Pioneer Hi Bred Int | Proteinas insecticidas de plantas y metodos para sus usos. |
US20210292778A1 (en) | 2016-07-12 | 2021-09-23 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions and methods to control insect pests |
BR112019003114A2 (pt) | 2016-08-17 | 2019-07-09 | Monsanto Technology Llc | métodos e composições para plantas de baixa estatura pela manipulação do metabolismo da giberelina para aumentar o rendimento passível de ser colhido |
US11021716B2 (en) | 2016-11-01 | 2021-06-01 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
BR112018013532A2 (pt) * | 2016-12-29 | 2018-12-04 | Univ Estadual Campinas Unicamp | método para aceleração do crescimento vegetal e plantas transgênicas |
BR112020001844A2 (pt) * | 2017-09-14 | 2020-10-06 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | método para reduzir altura de planta, método para identificar um alelo de br1 ou um alelo dw5 em uma população de plantas, planta semianã, planta de sorgo semianã, construção de dna recombinante, célula vegetal, sequência de rna-guia planta, semente, planta de sorgo semianã modificada, planta de sorgo anã, planta de maís mutante, método para reduzir altura de planta, planta de sorgo, população de plantas de sorgo, método para reduzir a frequência de reversão de um alelo anão 3 (dw3) em uma planta de sorgo em um fenótipo alto, planta de arroz, método de seleção assistida por marcador de uma planta |
AU2018337756A1 (en) | 2017-09-25 | 2020-04-02 | Pioneer Hi-Bred, International, Inc. | Tissue-preferred promoters and methods of use |
AR114124A1 (es) | 2018-02-15 | 2020-07-22 | Monsanto Technology Llc | Composiciones y métodos para mejorar el rendimiento de cultivos a través de apilamiento de rasgos |
BR112020023800A2 (pt) | 2018-05-22 | 2021-02-23 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | elementos reguladores de planta e métodos de uso dos mesmos |
EP3833747A1 (en) | 2018-06-28 | 2021-06-16 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Methods for selecting transformed plants |
EP3874050A1 (en) | 2018-10-31 | 2021-09-08 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions and methods for ochrobactrum-mediated plant transformation |
CA3186978A1 (en) | 2020-07-14 | 2022-01-20 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
CN113788889B (zh) * | 2021-09-18 | 2022-07-12 | 山东舜丰生物科技有限公司 | 突变的della蛋白及其应用 |
CN116004649A (zh) * | 2022-08-17 | 2023-04-25 | 西南大学 | 水稻基因ftd1及其突变体与应用 |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB9015198D0 (en) | 1990-07-10 | 1990-08-29 | Brien Caroline J O | Binding substance |
GB9314261D0 (en) | 1993-07-09 | 1993-08-18 | Zeneca Ltd | Dwarf plants |
EP0778895A1 (en) * | 1994-08-16 | 1997-06-18 | The General Hospital Corporation | Ga4 dna, protein and methods of use |
GB9602796D0 (en) | 1996-02-12 | 1996-04-10 | Innes John Centre Innov Ltd | Genetic control of plant growth and development |
US6441270B1 (en) * | 1996-04-26 | 2002-08-27 | New York University | Scarecrow gene |
US5912415A (en) * | 1996-05-16 | 1999-06-15 | Regents Of The University Of Minnesota | Arabidopsis spindly gene, methods of identification and use |
GB9717192D0 (en) * | 1997-08-13 | 1997-10-22 | Innes John Centre Innov Ltd | Genetic control of plant growth and development |
-
1997
- 1997-08-13 GB GBGB9717192.0A patent/GB9717192D0/en active Pending
-
1998
- 1998-08-07 EP EP98938763A patent/EP1003868B1/en not_active Expired - Lifetime
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-
2004
- 2004-03-26 US US10/809,945 patent/US7268272B2/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2007046403A1 (ja) * | 2005-10-19 | 2007-04-26 | National University Corporation Nagoya University | 優性の矮性形質を示すイネ属植物、およびその利用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US7268272B2 (en) | 2007-09-11 |
EP1003868B1 (en) | 2006-04-12 |
US6762348B1 (en) | 2004-07-13 |
EP1681349A3 (en) | 2009-07-22 |
EP1003868A1 (en) | 2000-05-31 |
DE69834192T2 (de) | 2006-12-14 |
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AU8737098A (en) | 1999-03-08 |
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AU738652B2 (en) | 2001-09-20 |
EP1681349A2 (en) | 2006-07-19 |
EP1681349B1 (en) | 2014-01-08 |
CN1250723C (zh) | 2006-04-12 |
WO1999009174A1 (en) | 1999-02-25 |
DE69834192D1 (de) | 2006-05-24 |
CA2299699C (en) | 2011-12-20 |
GB9717192D0 (en) | 1997-10-22 |
ATE323163T1 (de) | 2006-04-15 |
CN1274386A (zh) | 2000-11-22 |
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US20050060773A1 (en) | 2005-03-17 |
PT1003868E (pt) | 2006-08-31 |
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