JP2002511270A

JP2002511270A - 開花遺伝子座ｔ（ｆｔ）および花の発育が調節された遺伝的改変植物

Info

Publication number: JP2002511270A
Application number: JP2000543618A
Authority: JP
Inventors: ウェイゲル，デトレフ
Original assignee: Salk Institute for Biological Studies
Current assignee: Salk Institute for Biological Studies
Priority date: 1998-04-15
Filing date: 1999-04-13
Publication date: 2002-04-16
Also published as: AU757842C; WO1999053070A9; US6713663B2; BR9910123A; US20020029395A1; CN1302328A; EP1073743A1; NZ507854A; WO1999053070A1; KR20010042756A; US6225530B1; AU3560199A; AU757842B2; CA2328461A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、開花遺伝子座Ｔの遺伝子（「FT」と呼ばれる）、およびFTによりコードされて植物の花の発育を調節するポリペプチドを提供する。FTは、調節された花の発育（例えば、早期または晩期開花）の表現型形質をもつ点に特徴がある遺伝的改変植物を作出するための本発明方法において有用である。この種の植物は、例えば、植物の開花を調節するために、機能性FTペプチドをコードする核酸、FTの少なくとも１つのアンチセンス核酸、野生型FTポリペプチドをコードする構造遺伝子、または優性ネガティブポリペプチドをコードする構造遺伝子により遺伝的に改変され得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】技術分野本発明は一般的には植物の遺伝子工学に関し、特に花の調節された発育の表現
型を有するものとして特徴づけられる、新規な遺伝子操作された植物、及びこの
ような植物の生産方法に関する。

【０００２】背景ほとんどの被子植物種では光周期や温度のような環境的な刺激及び年齢のよう
な内部的合図に応答して開花が誘導される。顕花植物の成体器官は、分裂組織と
呼ばれる幹細胞の群から発生する。分裂組織の実体は、それをつくる構造から推
論される。即ち、栄養分裂組織は根や葉のもととなり、花序分裂組織は花の分裂
組織のもととなり、花の分裂組織はがく片や花弁のような花の器官のもととなる
。分裂組織は異なる実体の新しい分裂組織を生成することができるばかりでなく
、それら自体の実体も発生の間に変化し得る。例えば、栄養苗条分裂組織は花の
誘導の際に花序分裂組織へ変化することができ、ある種においては、花序分裂組
織自体が最終的に花の分裂組織になる。植物の発生における分裂組織のトランジ
ションは重要であるにも拘わらず、基礎となっている機構についてはほとんど知
られていない。

【０００３】発芽に続いて、シュート分裂組織はその隣接部に一連の葉の分裂組織を生成す
る。しかし、開花の誘導が起こった後は、シュート分裂組織は花の分裂組織を生
成するように変化する。花の分裂組織は花器官の原基を生成し、これは個々にが
く片、花弁、雄しべまたは心皮へと発生する。このように、花の形成は一連の異
なる発生の段階、即ち、花の誘導、花原基の形成及び花器官の生成からなるもの
と考えられる。各ステップを中断させる突然変異は様々な種において単離されて
おり、遺伝的階層が開花プロセスを支配することが示唆されている(総説につい
てはWeigel と Meyerwitz, Molecular Basis of Morphogenesis (M. Bernfield
編). 51st Annual Symposium of the Society for Development Biology, pp.93
-107, New York, 1993 参照)。

【０００４】最近、遠い関係にある二つの双子葉植物、ナズナ(Arabidopsis thaliana)とキ
ンギョソウ(Antirrhinum majus)の研究により、単独であるいは共同して作用し
て花の器官を決定する３つのクラスのホメオティック遺伝子が同定された(Bowma
nら, Development,112:1, 1991; Carpenter と Coen, Genes Devl.,4:1483, 199
0; Schwarz-Sommer ら, Science, 250:931, 1990)。これらの遺伝子いくつかは
、保存されたＤＮＡ結合ドメインがMADSボックスと称される転写因子である(Sch
warz-Sommerら,上出)。

【０００５】花の分裂組織の実体を制御する、より早期に作用する遺伝子も特徴づけられて
いる。花の分裂組織は、アラビドプシス(Arabidopsis)属及びアンチリナム(Anti
rrhinum)属のいずれにおいても花序分裂組織に由来する。分裂組織細胞の花への
発生を制御する二つの因子が知られている。アラビドプシス属においては、その
因子はLEAFY遺伝子(Weigelら、Cell69:843, 1992)及びAPETALA1(Mandelら、Natu
re 360:273, 1992)遺伝子の産物である。これらの遺伝子のいずれかが突然変異
によって不活性化されると、花と花序との特徴部分を結合している構造が発生す
る(Weigelら、上出; Irish and Sussex, Plant Cell, 2:741, 1990)。アンチリ
ナム属においては、アラビドプシス属LEAFY遺伝子の相同体はFLORICAULA(Coen
ら, Cell, 63:1311, 1990)であり、APETALA1遺伝子の相同体はSQUAMOSAである(H
uijserら、EMBO J.,11:1239, 1992)。後者の対はMADSボックスドメインを含んで
いる。

【０００６】顕花植物は、2つのタイプの花序構成、すなわち無限(花序が不定に発育する)
または有限(終端に花をつける)のうちの一つを示す。遠縁の種における二つの変
異体、アラビドプシス(Arabidopsis)のterminal flower 1およびキンギョソウ属
(Antirrhinum)のcentroradialisでは、通常は無限の花序が有限構成に変換され
る。キンギョソウ遺伝子CENTRORADIALIS(CEN)およびアラビドプシス遺伝子TERMI
NAL FLOWER 1(TFL1)は、相同であることが分かっており、これはこれらの植物に
おける無限性には共通のメカニズムが存在するということを示唆するものである
。しかしながら、CENとは異なり、TFL1は生育期にも発現され、花序発育への拘
束を遅延させ、よって花序分裂組織の形成のタイミングおよびその実体に影響を
及ぼす(例えば、PCT/GB96/02276を参照。この開示内容は参照により本明細書に
組み込まれる。)。

【０００７】植物バイオテクノロジーの分野の研究者には、主要な農作物の品種を含む植物
を遺伝子工学的に作出しようとする気運が高まっている。経済的に望ましい遺伝
学的改変として植物の開花時期を早めることがある。開花の誘導は農作物植物を
成長させることにおいて制限因子となることが多い。開花の誘導を制御する最も
重要な因子は、季節的及び地理的に変動する光周期である。場所的あるいは環境
的な条件に関わりなく、植物における開花を制御し、誘導する方法を開発し、任
意の所定の時期に農作物を生産できるようにすることに対する要請がある。ほと
んどの農作物、例えば、種子、穀物、果実は花から得られるので、このような開
花の制御方法は経済的に非常に価値が高い。

【０００８】発明の概要本発明は、植物の開花を調節する遺伝子の発見に基づくものである。この遺伝
子は「開花遺伝子座T（flowering locus T）」または「FT」と名付けられ、開花
期を調節する機能を果たす。FTの過剰発現はアラビドプシス（Arabidopsis）に
おいて極端な早期開花をもたらし、FTまたはFTに対するアンチセンスにおける機
能変異喪失（loss of function mutations）は、晩期開花をもたらす。

【０００９】第１の実施形態において、本発明はFTポリペプチドを提供する。FTポリペプチ
ドは、SDS-PAGEで測定したところ約20kDの分子量を有し、Arabidopsisの第１染
色体上に位置し、開花期を調節する機能を有することを特徴とする。FTポリペプ
チドのアミノ酸配列の例が、配列番号２に記載されている。開花促進活性を有す
るFTペプチドの例は配列番号４、より具体的には配列番号６に記載されている。
また、本発明には、FTポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドも
含まれる。FTをコードするヌクレオチド配列の例は、配列番号１に記載されてい
る。

【００１０】他の実施形態において、本発明は、少なくともFTコード化核酸配列等の少なく
とも１つの外因性核酸配列をそのゲノム中に含み、花の発育が調節されているこ
とを特徴とする、遺伝子改変された植物を提供する。花の発育は、本発明の方法
により抑制または促進することができる。

【００１１】他の実施形態において、本発明は、その植物細胞から生成された植物の花の発
育が、野生型植物と比較して調節されたものとなるように、植物細胞を遺伝子改
変するための方法を提供する。この方法は、少なくとも本発明のFTコードポリヌ
クレオチドを植物細胞中に導入して形質転換植物細胞を取得し、FTポリヌクレオ
チドの発現を可能とする条件下でこの形質転換植物細胞を生育させて花の発育が
調節された植物を作出することを含む。

【００１２】さらに他の実施形態において、本発明は、花の早期発育を特徴とする、遺伝子
改変された植物の作出方法を提供する。この方法は、少なくともFTポリペプチド
をコードする構造遺伝子（この遺伝子はプロモーターに機能的に結合している）
を含む核酸配列を含むベクターに植物細胞を接触させて形質転換植物細胞を取得
し、この形質転換植物細胞から植物を作出し、花の早期発育を示す植物を選択す
ることを含む。

【００１３】さらに他の実施形態において、本発明は、植物細胞において花の発育を調節す
るための方法を提供する。この方法は、花の発育を調節するためのFTポリペプチ
ドをコードする少なくとも１つの構造遺伝子（この遺伝子はプロモーターに機能
的に結合している）を有する核酸配列を含むベクターに植物細胞を接触させて形
質転換細胞を取得し、この形質転換植物細胞を植物形成条件下で生育させ、花の
発育を調節するのに十分な条件下および十分な期間で該植物の花の早期発育を誘
導することを含む。花の発育の調節には、発育の促進または抑制が含まれる。

【００１４】また本発明は、開花期遺伝子（FT）の発現を破壊または妨害するトランスジー
ンがその植物のゲノムの染色体に組み込まれた遺伝子改変植物も提供する。また
本発明は、花の晩期発育を特徴とするこのような植物の作出方法も含む。この方
法は、少なくともFTポリペプチドの発現を破壊または妨害する構造遺伝子（この
遺伝子はプロモーターに機能的に結合している）を含む核酸配列を含むベクター
に植物細胞を接触させて形質転換細胞を取得し、この形質転換植物細胞から植物
を作出し、花の晩期発育を示す植物を選択することを含む。またこの方法は、FT
ポリペプチドの発現を破壊または妨害する構造遺伝子を、FTアンチセンス核酸配
列またはFT優性ネガティブコード化核酸配列を含むベクターで置換することも含
む。

【００１５】他の実施形態において、本発明は、FT活性または遺伝子発現を調節する化合物
の同定方法も提供する。この方法は、該化合物およびFTポリペプチドまたはFTを
発現する組換え細胞を含む成分を、該成分を相互作用させるのに十分な条件下で
インキュベートし、FTの活性または発現に対する該化合物の効果を調べることを
含む。化合物は、FTの活性または発現を抑制するものであっても刺激するもので
あってもよい。

【００１６】他の実施形態において、本発明は、野生型FTの活性もしくは発現を模倣または
抑制するFTのペプチドを同定するための方法を提供する。このようなペプチドは
、野生型FTの代わりに使用することができ、その際この野生型FTは、該ペプチド
の開花期に対する影響を測定するための対照となる。

【００１７】他の実施形態において、本発明は、その植物細胞から作出された植物が野生型
植物と比較して花の発育が調節されていることを特徴とするように、植物細胞を
遺伝子的に改変する方法を提供する。前記方法は、少なくともFTコード化ポリヌ
クレオチドを植物細胞中に導入して形質転換植物細胞を取得し、FTポリヌクレオ
チドの発現を可能とする条件下でこの形質転換植物細胞を生育させて花の発育が
調節された植物を作出することを含む。１つの実施形態において、該植物は、FT
およびLFYの両方の発現により花の発育が増強されている。他の実施形態におい
て、該植物は、TFL1を発現する一方でFTの発現が抑制されていることにより、花
の発育が抑制されている。このようなポリヌクレオチドの組合せの発現または抑
制発現は、任意の他のポリヌクレオチドの発現前、実質的に該発現と同時、また
は該発現後に行われ得る。

【００１８】詳細な説明本発明は、植物において花の発育を調節するポリペプチドをコードする遺伝子
を提供する。開花遺伝子座Tにちなんで「FT」と名付けられたこの遺伝子は、調
節された花の発育（例えば早期開花または晩期開花）の表現型特性を有すること
を特徴とする、遺伝子改変された植物を作出するのに有用である。このような植
物は、少なくとも植物における開花を調節するためのFTをコードする構造遺伝子
により遺伝子改変することができる。

【００１９】ポリペプチド、ポリヌクレオチドおよびベクター本発明は、実質的に精製された開花遺伝子座T（FT）ポリペプチドおよびFTを
コードするポリヌクレオチドを提供する。本発明のFTは、SDS-PAGEで測定したと
ころ約20kDの分子量を有し、Arabidopsisの第１染色体上に位置し、開花期を調
節する機能を果たすことを特徴とする。

【００２０】１つの実施形態において、本発明は、実質的に精製されたFTポリペプチドを提
供する。好ましくは、FTは配列番号２に記載されたアミノ酸配列を有する。本明
細書中で使用する用語「実質的に精製された」とは、他のタンパク質、脂質、炭
水化物、または天然でこれと随伴している他の物質を実質的に含まないポリペプ
チドを指す。当業者であれは、標準的なタンパク質精製方法を用いてFTを精製す
ることができる。実質的に純粋なポリペプチドは、非還元ポリアクリルアミドゲ
ル上に単一の大きなバンドを生成する。FTポリペプチドの純度は、アミノ末端側
のアミノ酸配列分析によっても決定することができる。

【００２１】本発明は、配列番号２に記載されたアミノ酸配列またはその機能性断片と実質
的に同じ配列または配列番号２と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドを含む。「実質的に同じ」または「実質的に同一」とは、比較するアミ
ノ酸配列または核酸配列に対して少なくとも80％、好ましくは85％、より好まし
くは90％、最も好ましくは95％の相同性を示すポリペプチドまたは核酸を意味す
る。ポリペプチドの場合、比較配列の長さは、一般には少なくとも16アミノ酸、
好ましくは少なくとも20アミノ酸、より好ましくは少なくとも25アミノ酸、およ
び最も好ましくは35アミノ酸である。核酸の場合、比較配列の長さは、一般には
少なくとも50ヌクレオチド、好ましくは少なくとも60ヌクレオチド、より好まし
くは少なくとも75ヌクレオチド、および最も好ましくは110ヌクレオチドである
。FTと実質的に同じ配列を有するFT相同体は、例えば図３Bに示した系統樹を用
いて同定することができる。FT相同体は、例えばTFL1/CENではなくFTの近くに位
置している。

【００２２】機能性断片には、FTの機能または活性（例えば開花を促進する能力など）を保
持するFTのこれらの断片が含まれる。このようなペプチドの例は配列番号４に記
載されており、より具体的には配列番号６に記載されている（植物由来のペプチ
ド）。当業者であれば、本明細書中に記載した実施例（全長FTが記載されている
）を用いて断片の機能についてスクリーニングすることができる（例えばトラン
スジェニック植物については実施例３を参照されたい）。また、開花を抑制する
または遅らせるFTの断片も同様に同定することができると思われる。

【００２３】また、「実質的に同一」とは、例えば１つのアミノ酸が同じクラスの他のアミ
ノ酸に置換される（例えばグリシンの代わりにバリン、リジンの代わりにアルギ
ニン等）等の保存的アミノ酸置換によってのみ異なるアミノ酸配列、あるいは、
アッセイするタンパク質の機能を損なわないアミノ酸配列の場所に位置する１以
上の非保存的置換、欠失または挿入（例えば本明細書に記載されたもの等）によ
ってのみ異なるアミノ酸配列も意味する。このような配列は、配列番号２に対し
てアミノ酸レベルで好ましくは少なくとも85％同一、より好ましくは全く同一で
ある。

【００２４】相同性は、しばしば配列解析ソフトウエア（例えば、Getenics Computer Grou
p, University of Wisconsin Biotechnology Center（1710 University Avenue,
Madison, WI 53705）の配列解析ソフトウエアパッケージ）で測定される。この
ようなソフトウエアは、様々な置換、欠失、置換、および他の改変について相同
性の程度を割り当てることにより類似の配列をマッチングさせる。

【００２５】「実質的に純粋なポリペプチド」は、天然に随伴する成分を分離したFTポリペ
プチドを意味する。典型的には、該ポリペプチドは、60重量%以上で、天然に随
伴するタンパク質および天然有機分子を含まないときに、実質的に純粋である。
好ましくは、該調製物は、75重量%以上、さらに好ましくは90重量%以上、そして
最も好ましくは99重量%以上のFTポリペプチドである。実質的に純粋なFTポリペ
プチドは、例えば、天然源（例えば、植物細胞）から抽出により；FTポリペプチ
ドをコードする組換え核酸の発現により；または該タンパク質を化学的に合成す
ることにより得ることができる。純度は、任意の適当な方法、例えばカラムクロ
マトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはHPLC分析に記載され
ている方法により測定することができる。

【００２６】タンパク質は、天然の状態でそれに随伴する夾雑物から分離されたときに、天
然に随伴する成分を実質的に含まない。したがって、化学的に合成されたまたは
天然起源の細胞とは異なる細胞系で産生されたタンパク質は、実質的に天然に随
伴する成分を含まないであろう。したがって、実質的に純粋なポリペプチドは、
真核生物から誘導されるが大腸菌(E.coli)または他の原核生物中で合成されたポ
リペプチドを含む。

【００２７】 FTの一次アミノ酸配列のわずかな改変は、本明細書に記載の未改変の対応ポリ
ペプチドと比較して、実質的に等価の活性をもつタンパク質を生じうる。このよ
うな改変は、部位特異的突然変異誘発により計画されてもよいし、または自発的
であってもよい。これらの改変により作られる全てのポリペプチドは、FTの生物
学的活性がなお存在する限りは、本発明に含まれる。例えば、本発明はFTポリペ
プチドの生物学的活性を有するFTのペプチドを提供する。FTペプチドの例は、配
列番号４（AADISQWAGPL）、そしてさらに特定的には配列番号６（SINIRDPL）に
示される（Rn HNCPおよびAt FTペプチド配列については、それぞれ図3Cを参照す
ること；AtはArabidopsis thaliana；RnはRattus norvegicus（ラット））。

【００２８】本発明のポリペプチドはまた、FTの生物学的活性をもたないFTポリペプチドの
優性ネガティブ型を含む。FTの「優性ネガティブ型（dominant negative form）
」は、構造的にFTに類似しているが野生型FT機能を有しないポリペプチドである
。例えば、優性ネガティブFTポリペプチドは、正常でFTポリペプチドと機能的に
相互作用する上流または下流成分のような調節物質に結合させるか、さもなけれ
ば該物質を隔離することによって、野生型FT機能を妨害することができる。

【００２９】本発明は、FTタンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。これらの
ポリヌクレオチドは、FTをコードするDNA、cDNAおよびRNA配列を含む。FTをコー
ドする全てのポリヌクレオチドも、それらがFT活性をもつポリペプチドをコード
する限り、本発明に含まれると理解される。このようなポリヌクレオチドは、天
然、合成、および意図的に遺伝子操作されたポリヌクレオチドを含む。例えば、
FTポリヌクレオチドは、部位特異的突然変異誘発に付すことができる。FTのため
のポリヌクレオチド配列はまた、アンチセンス配列、FTの優性ネガティブ型をコ
ードする配列、ならびに配列番号４およびさらに特定的には配列番号６のような
FTペプチドをコードする配列を含む。本発明のポリヌクレオチドは、遺伝子コー
ドの結果として縮重した配列を含む。20個の天然アミノ酸の殆どは複数のコドン
により規定される。したがって、全ての縮重ヌクレオチド配列は、ヌクレオチド
配列によりコードされるFTポリペプチドのアミノ酸配列が機能的に不変である限
り、本発明に含まれる。

【００３０】本発明で特定的に開示されるのは、FT遺伝子を含有するポリヌクレオチド配列
である。好ましくは、該FTヌクレオチド配列は、配列番号１である。用語「ポリ
ヌクレオチド」または「核酸配列」は長さが10塩基以上のヌクレオチドの多量体
型を意味する。「単離されたポリヌクレオチド」は、それが誘導された生物の天
然のゲノムにおいて隣接しているコード配列の両方（１つは5'末端および１つは
3'末端）と隣接していないポリヌクレオチドを意味する。したがって、該用語は
、例えば、ベクター中に；自律的に複製するプラスミドもしくはウイルス中に；
または原核生物もしくは真核生物のゲノムDNA中に組み込まれた、あるいは、他
配列から独立している分離した分子（例えば、cDNA）として存在する、組換えDN
Aを含む。本発明のヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオ
チド、またはいずれかのヌクレオチドの改変された型であることができる。該用
語は1本鎖および２本鎖のDNAを含む。

【００３１】「実質的に同一の」核酸配列は、上に定義されたのと実質的に同一のアミノ酸
配列をコードする。

【００３２】「精製されたDNA」または「単離されたDNA」は、それが誘導された生物の天然
のゲノムにおいて隣接しているコード配列の両方（１つは5'末端および１つは3'
末端）と隣接していないDNAを意味する。したがって、該用語は、例えば、ベク
ター中に；自律的に複製するプラスミドもしくはウイルス中に；または原核生物
もしくは真核生物のゲノムDNA中に組み込まれた、あるいは、他配列から独立し
ている分離した分子（例えば、cDNAまたはPCRもしくは制限エンドヌクレアーゼ
処理により作られたゲノムDNA断片）として存在する、組換えDNAを含む。該用語
はまた、追加のポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部分であ
る組換えDNAを含む。

【００３３】「実質的に純粋なDNA」は、本発明のDNAが誘導された生物の天然ゲノムにおい
て該遺伝子に隣接する遺伝子を含まないDNAを意味する。したがって、該用語は
、例えば、ベクター中に；自律複製するプラスミドもしくはウイルス中に；また
は原核生物もしくは真核生物のゲノムDNA中に組み込まれた、あるいは、他配列
から独立している分離した分子（例えば、cDNAまたはPCRもしくは制限エンドヌ
クレアーゼ消化により作られたゲノムもしくはcDNA断片）として存在する、組換
えDNAを含む。該用語はまた、追加のポリペプチド配列をコードするハイブリッ
ド遺伝子の一部分である組換えDNAを含む。

【００３４】 FTをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１、FTの優性ネガティブ型、お
よび配列番号１に相補的な核酸配列を含む。相補的な配列はアンチセンスヌクレ
オチドを含み得る。該配列がRNAであるときは、配列番号１のデオキシヌクレオ
チドA、G、C、およびTは、それぞれ、リボヌクレオチドA、G、C、およびUで置き
換わる。本発明にはまた、15塩基以上の長さをもつ上記核酸配列の断片が含まれ
る。この長さは、該断片を生理学的条件のもとで配列番号２のタンパク質をコー
ドするDNAまたはFTの近いファミリーメンバーと選択的にハイブリダイズするた
めに十分なものである。用語「選択的にハイブリダイズする」は、中度または高
度にストリンジェントな条件下で無関係なヌクレオチド配列を排除するハイブリ
ダイゼーションを意味する。

【００３５】核酸ハイブリダイゼーション反応において、特定のレベルのストリンジェンシ
ーを達成するために使われる条件は、ハイブリダイズする核酸の性質によって変
わる。例えば、長さ、相補性の程度、ヌクレオチド配列組成（例えば、GC対AT含
量）、および核酸のハイブリダイゼーション領域の核酸型（例えば、RNA対DNA）
を、ハイブリダイゼーション条件を選択する際に考慮することができる。さらに
考慮すべきは、核酸の１つを、例えばフィルター上に固定するかどうかである。

【００３６】次第に高くなるストリンジェンシー条件の例は、次のとおりである： 2 x SSC
/0.1% SDS、ほぼ室温（ハイブリダイゼーション条件）； 0.2 x SSC/0.1% SDS、
ほぼ室温（低ストリンジェンシー条件）； 0.2 x SSC/0.1% SDS、ほぼ42℃（中
ストリンジェンシー条件）； 0.1 x SSC、ほぼ68℃（高ストリンジェンシー条件
）。洗浄はこれらの条件の１つだけで、例えば高ストリンジェンシー条件を使っ
て行うことができるし、または条件のそれぞれを、例えばそれぞれ10-15分間、
上記の順で、上記のステップのいずれかまたは全てを繰返して、使うことができ
る。しかし、上に述べたように、最適条件は、関わる特定のハイブリダイゼーシ
ョン反応によって変わり、実験的に決定することができる。

【００３７】本発明のFTポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、開示された配列お
よびそれらの保存的変異体を含む。本明細書で使われる用語「保存的変異」は、
生物学的に類似した他の残基によるアミノ酸残基の置換を示す。保存的変異の例
は、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンのような１つの疎水性残
基の他への置換、またはリシンのアルギニンへの置換、アルパラギン酸のグルタ
ミン酸への置換、またはアスパラギンのグルタミンへの置換などの置換のような
１つの極性残基の他への置換を含む。用語「保存的変異」はまた、置換されたポ
リペプチドに対して産生される抗体が無置換のポリペプチドとも免疫反応するこ
とを条件として、無置換の親アミノ酸の代わりに置換したアミノ酸を使用するこ
とも含む。

【００３８】 FTをコードするDNA配列は、適当な宿主細胞中へのDNA導入によりin vitroで発
現することができる。「宿主細胞」は、そこにベクターが伝播しそのDNAを発現
することができる細胞である。該細胞は原核生物または真核生物であってよい。
該用語はまた、対象の宿主細胞のいずれの子孫も含む。複製中に起こる突然変異
がありうるので、全ての子孫は親細胞と同じであるとは限らないことは理解され
ている。しかし、用語「宿主細胞」が使われるときには、このような子孫が含ま
れる。外来DNAが宿主内で継続して維持されることを意味する安定な導入の方法
は、当業界で公知である。

【００３９】本発明において、FTポリヌクレオチド配列を発現ベクター中に挿入することが
できる。用語「発現ベクター」は、FT遺伝子配列の挿入または組み込みにより遺
伝子操作したプラスミド、ウイルスまたは当業界で周知の他のビヒクルを意味す
る。FTをコードするポリヌクレオチド配列は、発現制御配列に機能しうる形で連
結することができる。「機能しうる形で連結された」は、記載された成分がそれ
らが意図されたように機能することを可能にする関係にあるように併置すること
（juxtaposition）を意味する。コード配列に機能しうる形で連結される発現制
御配列は、発現制御配列と両立しうる条件のもとでコード配列の発現が達成され
るように、コード配列にライゲートされる。本明細書で使われる用語「発現制御
配列」は、それと機能しうる形で連結された核酸配列の発現を調節する核酸配列
を意味する。発現制御配列が核酸配列の転写および適当に翻訳を制御しかつ調節
するとき、発現制御配列は核酸配列と機能しうる形で連結されている。したがっ
て、発現制御配列は、適当なプロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター
、タンパク質をコードする遺伝子の前方の開始コドン（すなわち、ATG）、イン
トロンのスプライシングシグナル、mRNAの適当な翻訳を可能にする遺伝子の正し
いリーディングフレームの維持、および停止コドンを含むことができる。用語「
制御配列」は、最小限、その存在が発現に影響を与えることができる成分を含み
、また、その存在が、例えばリーダー配列および融合パートナー配列に有利であ
る、さらなる成分を含むことができることを意図する。発現制御配列はプロモー
ターを含むことができる。

【００４０】「プロモーター」とは、転写を指令するために十分な最小の配列を意味する。
本発明にはまた、プロモーターに依存する遺伝子発現を、細胞型特異的、組織特
異的に制御可能にし、または外部シグナルもしくは作用剤により誘導可能にする
ために十分であるプロモーターエレメントが含まれ；このようなエレメントを該
遺伝子の5'または3'領域に配置することができる。構成的および誘導的プロモー
ターの両方が本発明に含まれる（例えば、Bitterら, 1987, Methods in Enzymol
ogy, 153:516-544を参照すること）。本発明に用いられる構造遺伝子の発現は、
複数のプロモーターにより駆動することができる。対象とする構造遺伝子の内因
性プロモーターを該遺伝子の転写調節のために利用することはできるが、好まし
くは、該プロモーターは外来の調節配列である。植物発現ベクターに対して、適
当なウイルスプロモーターは、CaMVの35S RNAおよび19S RNAプロモーター（Bris
son,ら, Nature, 310:511, 1984; Odell,ら, Nature, 313:810, 1985）；Figwor
tモザイクウイルス（FMV）由来の完全長転写プロモーター（Gowda,ら, J. Cell
Biochem., 13D: 301, 1989）およびTMVのコートタンパク質プロモーター（Takam
atsuら, EMBO J. 6: 307, 1987）を含む。あるいは、以下のような植物プロモー
ターを使うことができる：リブロースビスホスフェートカルボキシラーゼの小サ
ブユニット（ssRUBISCO）由来の光誘導プロモーター（Coruzzi,ら, EMBO J., 3:
1671, 1984；Broglie,ら, Science, 224:838, 1984）；マンノピンシンターゼ（
mannnopine synthase）プロモーター（Velten,ら, EMBO J., 3:2723, 1984）、
ノパリンシンターゼ（NOS）およびオクトピンシンターゼ（OCS）プロモーター（
Agrobacterium tumefaciensの腫瘍誘導プラスミドに運ばれ、植物活性を有する
）；その活性レベルがエチレンまたは（プロピレンのような）同等化合物による
処置に反応して増加するエチレン誘導プロモーター；熱ショックプロモーター、例えば、ダイズhsp17.5-Eまたはhsp17.3-B（Gurleyら,
Mol. Cell. Biol., 6:559, 1986；Severinら, Plant Mol. Biol., 15:827, 1990
）；またはエタノール誘導プロモーター（Caddickら, Nature Biotech., 16:177
, 1998）。

【００４１】本発明に有用なプロモーターは、構成的および誘導的天然プロモーターならび
に遺伝子操作されたプロモーターを含む。CaMVプロモーターは、構成プロモータ
ーの例である。誘導プロモーターは、最も有用であるために、１）インデューサ
ーの非存在下で低発現を与え；２）インデューサーの存在下で高発現を与え；３
）植物の正常な生理学を妨害することのない誘導スキームを使い；そして４）他
の遺伝子の発現に影響を与えないことが必要である。植物で有用な誘導プロモー
ターの例は、以下のような化学的方法により誘導されるものを含む：銅イオンに
より活性化される酵母メタロチオネインプロモーター（Mett,ら, Proc. Natl. A
cad. Sci. U.S.A., 90:4567, 1993）；置換ベンゼンスルホンアミド、例えば除
草剤セーフナー（herbicide safener）により活性化されるIn2-1およびIn2-2調
節配列（Hershey,ら, Plant Mol. Biol., 17:679, 1991）；グルココルチコイド
により誘導されるGRE調節配列（Schena,ら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 8 8 ;10421, 1991）；ならびにエタノール誘導プロモーター（Caddickら, 前掲）。
他の構成的および誘導的両方のプロモーターは、当業者には周知である。

【００４２】選択される特定のプロモーターは、構造遺伝子産物（例えば、早期開花を誘発
するためにはFT、または晩期開花を誘発するためにはアンチセンス）の有効な量
の産生を得るために十分な発現を誘発する能力がなければならない。本発明のベ
クター構築物に使われるプロモーターは、もし所望であれば、それらの制御特性
に影響する改変を行うことができる。組織特異的プロモーターも本発明に利用す
ることができる。本明細書に使われる用語「組織特異的プロモーター」は、プロ
モーターとして作用する、すなわち、該プロモーターに機能しうる形で連結され
た選択されたDNA配列の発現を調節するDNA配列を意味する。組織特異的プロモー
ターは、特定細胞中の、例えば植物の根またはシュート中の選択されたDNA配列
の発現に影響を与える。該用語はまた、主にある組織内の選択されたDNAの発現
を調節するが他組織内の発現も誘発する、いわゆる「漏れのある（leaky）」プ
ロモーターを含む。このようなプロモーターはまた、イントロンおよびエンハン
サー配列などの、発現に必要である追加のDNA配列を含むことができる。組織特
異的プロモーターの例は、シュート分裂組織に発現されるHHAプロモーター（Ata
nassova,ら, Plant J., 2:291, 1992）である。cdc2aプロモーターおよびcyc07
プロモーターを含む、トランスジェニック植物に有用な他の組織特異的プロモー
ターは、当業者には周知である（例えば、Itoら, Plant Mol. Biol., 24:863, 1
994；Martinezら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:7360, 1992；Medfordら, P
lant Cell, 3:359, 1991；Terada,ら, Plant Jounal, 3:241, 1993；Wissenbach
ら, Plant Journal, 4:411, 1993を参照）。花分裂組織に活性のある組織特異的
プロモーターの例は、ジャックら（Jackら, Cell, 76:703, 1994）およびヘンペ
ルら（Hempelら, Development, 124:3845, 1997）に記載されているapetala 3お
よびapetala 1遺伝子のプロモーターである。さらに、UFO遺伝子由来の分裂組織
特異的プロモーターが含まれる。

【００４３】場合によっては、選択マーカーを、異種核酸配列、すなわちプロモーターと機
能しうる形で連結された構造遺伝子に結合させることができる。本明細書で使わ
れる用語「マーカー」は、マーカーを含有する植物または植物細胞の選択または
スクリーニングを可能にする形質または表現型をコードする遺伝子を意味する。
マーカー遺伝子は、適当な抗生物質を使って形質転換してない細胞の中から形質
転換した細胞を選択することができる抗生物質耐性遺伝子であってもよいし、ま
たは該マーカー遺伝子は殺虫剤耐性遺伝子であってもよい。適当な選択マーカー
の例は、アデノシンデアミナーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、ハイグロマイシ
ン-B-ホスホトランスフェラーゼ、チミジンキナーゼ、キサンチン-グアニンホス
ホリボシルトランスフェラーゼ、グリホスフェートおよびグルホシネート耐性な
らびにアミノ-グリコシド 3'-O-ホスホトランスフェラーゼII（カナマイシン、
ネオマイシンおよびG418耐性）を含む。他の適当なマーカーは、当業者には知ら
れている。

【００４４】本発明において用いられる、花分裂組織の発育を調節するための植物細胞形質
転換用ベクターは、プロモーターと機能しうる形で連結された、花分裂組織の発
育を調節するタンパク質をコードする１以上の構造遺伝子を含有する核酸配列を
含んでなる。本発明による形質転換プロセスを開始するには、適当なベクターを
構築しそして植物細胞内に適当に導入することが先ず必要である。そこで本発明
に使われるベクターの構築の詳細は、植物遺伝子工学分野の熟練者には知られて
いる。本発明においては、好ましくは、花分裂組織の発育を調節するタンパク質
をコードする遺伝子はFT遺伝子である。FT遺伝子は、単独で、あるいは他の構造
遺伝子、例えば開花の発育に重要であるタンパク質をコードする他の遺伝子と組
合せて用いることができる。このような遺伝子の例は、LEAFY（LFY）、APETALA1
（AP1）、CONSTANS（CO）、TERMINAL FLOWER1（TFL1）、FLORICAULA（FLO）、SQ
UAMOSA（SQUA）、FLOWERING LOCUS CA（FCA）およびそれらの組合わせを含む。
組合わせで使うときに、該遺伝子の組合わせは、他遺伝子の発現の前に、実質的
に同時に、または後に発現させることができると理解されるべきである。本明細
書に記載された全ての方法および植物において、語句「少なくともFT遺伝子」ま
たは類似の語句は、上記のまたは当分野で公知の１以上の他の花の発育遺伝子の
使用を含むと理解されるべきである。

【００４５】例えば、本発明で利用される異種核酸配列は、Tiプラスミド、根誘導（Ri）プ
ラスミド、および植物ウイルスベクターを使って植物細胞中に導入することがで
きる。（これらの技術のレビューは、例えば、いずれも参照により本明細書に組
み入れられる、Weissbach & Weissbach, 1988, Methods for Plant Molecular B
iology（植物分子生物学の方法）, Academic Press, NY, Section VIII、pp. 42
1-463；およびGrierson & Corey, 1988, Plant Molecular Biology（植物分子生
物学）, 2nd Ed., Blackie, London, Ch.7-9、およびHorschら, Science, 227:1
229, 1985を参照すること）。

【００４６】当業者であれば、相対的に無傷な状態にある異種核酸配列を導入するための適
当なベクターを選択することができるであろう。したがって、導入したDNA配列
を保有する植物を作るであろう任意のベクターで十分である。DNAの裸の断片で
も、低効率ではあるが、本発明の特性を与えることが可能であると期待される。
ベクターの選択またはベクターを使うかどうかは、典型的には選択された形質転
換の方法を考慮して決定される。

【００４７】本発明による植物の形質転換は、本質的に、植物分子生物学の分野の熟練者が
精通している様々な方法のいずれかで実施することができる（例えば、参照によ
り本明細書に組み入れられるMethods of Enzymology（酵素学の方法）, Vol. 15
3, 1987, WuおよびGrossman,編, Academic Pressを参照）。本明細書に使われる
用語「形質転換」は、異種核酸配列の導入による宿主植物の遺伝子型の改変を意
味する。「形質転換」は、外因性ポリヌクレオチドの宿主細胞中への挿入を意味
し、その挿入に使われる方法、例えば、直接取り込み、形質導入、ボンバードメ
ントまたはエレクトロポレーションに関わらない。外因性ポリヌクレオチドは、
非組み込みベクター例えばプラスミドとして維持されても、あるいはまた、宿主
ゲノム中に組み込まれてもよい。

【００４８】直接形質転換として知られる１つの方法は、植物プロトプラスト、すなわち細
胞壁物質を剥離した単一細胞のゲノム中へのプラスミドまたは線状化DNAの取り
込みおよび組み込みを誘導する（Lorzら, 1985, Mol. Genet. 199:178-182）。
他の方法は、植物特性を改変するための、外因性バクテリオファージまたはプラ
スミドDNAの発芽花粉粒（germinating pollen grain）中への移送に関わる。花
粉管が成熟花粉粒から現れると、細胞壁物質は成長端のうしろに沈積する。

【００４９】第３の方法は、アグロバクテリウム属細菌による感染に依るものであり、該細
菌はTi-プラスミドとして知られるプラスミドの配列を植物細胞のゲノム中に挿
入する（Chiltonら, 1977, Cell 11:263-271）。異種核酸配列は、該Tiプラスミ
ドを含有するアグロバクテリウムAgrobacterium tumefaciensを利用して植物細
胞中に導入することができる。A. tumefaciens培養を形質転換ビヒクルとして使
う場合、形質転換組織の正常な非発癌性分化が可能であるように、アグロバクテ
リウムの非発癌性をベクター担体として使うことが最も有利である。該アグロバ
クテリウムはバイナリーTiプラスミド系を有することも好ましい。このバイナリ
ー系は、１）トランスファーDNA（T-DNA）を植物中に導入するために本質的であ
る病原性（virulence）領域を有する第１のTiプラスミド、および２）キメラプ
ラスミドを含んでなる。後者は、移送されるべき核酸にフランキングする野生型
Ti-プラスミドのT-DNA領域の１以上の境界領域を含有する。バイナリーTiプラス
ミド系は、植物細胞を形質転換するために有効であることが示されている（De F
ramond, Biotechnology, 1:262, 1983；Hoekemaら, Nature, 303:179, 1983）。
このようなバイナリー系が好ましいのは、アグロバクテリウム中のTiプラスミド
への組み込みを必要としないからである。

【００５０】アグロバクテリウムの使用に関わる方法は、限定されるものでないが、１）ア
グロバクテリウムと培養単離プロトプラストとの共培養；２）アグロバクテリウ
ムによる植物細胞または組織の形質転換；または３）アグロバクテリウムによる
種子、頂端または分裂組織の形質転換を含む。

【００５１】さらに、遺伝子移送は、Bechtoldら（C. R. Acad. Sci. Paris, 316:1194, 19
93）が記載するように、アグロバクテリウムによるin situ形質転換により達成
することができる。この方法は、アグロバクテリウム細胞の懸濁液の真空湿潤に
基づく。

【００５２】植物細胞中に異種核酸を導入する好ましい方法は、このような植物細胞、外植
体、分裂組織または種子を、上記の形質転換したアグロバクテリウムAgrobacter
ium tumefaciensに感染させることである。当業者には公知である適当な条件の
もとでは、形質転換した植物細胞は増殖してシュート、根を形成し、さらに植物
体に発育する。

【００５３】本発明の好ましいベクターは、異種核酸配列がFTタンパク質をコードするTiプ
ラスミドバイナリー系を含んでなる。このようなベクターは、場合によっては、
LEAFY（LFY）、APETALA1（AP1）、CONSTANS（CO）、TERMINAL FLOWER1（TFL1）
、FLORICAULA（FLO）、SQUAMOSA（SQUA）、FCAおよびそれらの組合わせのような
第２の花の発育因子をコードする１以上の他の核酸配列を含んでなることができ
る。あるいは、それぞれのベクターが１以上の異種核酸配列を含有する２つのベ
クターを用いることができる。このような核酸を組合わせで発現させる場合、第
１の核酸配列を第２の核酸配列の前に、実質的に同時に、または、後に発現させ
ることができる。他の花の発育遺伝子を、類似の方法で、１以上のベクターの構
築に利用することができる。

【００５４】あるいは、異種核酸を機械的または化学的方法を使って植物細胞に接触させる
ことにより、植物細胞中に導入することができる。例えば、核酸を、マイクロピ
ペットを使って、植物細胞中に直接、マイクロインジェクションにより機械的に
移送することができる。あるいは、核酸を、細胞に取り込まれる遺伝子物質と沈
降複合体を形成するポリエチレングリコールを使うことによって、植物細胞中に
移送することができる。

【００５５】異種核酸はまた、エレクトロポレーションにより植物細胞中に導入することが
できる（参照により本明細書に組み入れられる、Frommら, Proc. Natl. Acad. S
ci. U.S.A., 82:5824, 1985）。この技術においては、植物プロトプラストを、
関係核酸配列を含有するベクターまたは核酸の存在下で電気穿孔する。高い電場
強度の電気インパルスは膜を可逆的に浸透可能にして核酸の導入を可能にする。
電気穿孔された植物プロトプラストは細胞壁を再形成し、分裂して植物カルスを
形成する。形質転換遺伝子を有する形質転換された植物細胞の選択は、本明細書
に記載の表現型マーカーを使って達成することができる。

【００５６】核酸を植物細胞中に導入する他の方法は、小ビーズまたは粒子のマトリックス
内またはそれらの表面上のいずれかに含有された導入すべき核酸を伴なう小粒子
による高速度弾道貫通（Kleinら, Nature 327:70, 1987）である。典型的には、
新しい核酸配列の1回の導入しか必要でないが、この方法は特定的には多回導入
をすることができる。

【００５７】カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）も、異種核酸の植物細胞中への導入用
のベクターとして使うことができる（米国特許第4,407,956号）。CaMVウイルスD
NAゲノムを親細菌プラスミド中に挿入し、組換えDNA分子を作製し、それを細菌
内で増殖することができる。クローニングの後、組換えプラスミドを再びクロー
ニングして、さらに所望の核酸配列の導入により改変することができる。組換え
プラスミドの改変されたウイルス部分を、その後、親細菌プラスミドから切除し
、植物細胞または植物に接種するために使う。

【００５８】遺伝的に改変した植物の作出方法他の実施形態においては、本発明は、ある植物細胞を遺伝的に改変して、該細
胞から作られる植物が、野生型植物と比較して、調節された花の発育を有するよ
う特徴付けられる方法を提供する。該方法は、少なくとも本発明のポリヌクレオ
チドをコードするFTを植物細胞中に導入して形質転換した植物細胞を取得し、形
質転換した植物細胞をFTポリペプチドの発現を可能にする条件のもとで増殖させ
、それによって、調節された花の発育を有する植物を作ることを含む。用語「調
節された」は、加速された花の発育または抑制もしくは遅延された花の発育を意
味する。

【００５９】花の発育の加速は、FT遺伝子発現またはFTポリペプチド活性の誘導または増加
により達成することができる。FTポリペプチドをコードする本発明の方法に有用
であるベクターは、本明細書に記載されている。例えば、誘導プロモーターまた
は構成プロモーターの制御下でのFT遺伝子発現を使って、野生型植物に見出され
るレベルを超えてFT発現を増加することができる。

【００６０】同様に、花の発育の抑制は、植物中のFT遺伝子発現またはFTポリペプチド活性
を抑制することにより達成することができる。例えば、FTアンチセンスまたはFT
優性ネガティブ核酸配列を使って、FT遺伝子発現を抑制することができる。

【００６１】本発明の実施例は花調節遺伝子（FT）の構成的発現が開花の加速を生じさせ、
そしてアンチセンス核酸の発現を使って開花を抑制または遅延することができる
ことを実証するが、この系は、優性ネガティブポリペプチドを使って開花を抑制
するように改変することができる。例えば、FTおよび/または他の花調節遺伝子
の優性ネガティブ体を構成的に発現させることができる。優性ネガティブ変異体
は、正常な内因性タンパク質の機能を妨害する活性をもつタンパク質である。し
たがって、構造遺伝子自身またはそのRNAを不活性化することなく、遺伝子の作
用をブロックすることができる。この戦略は、シグナル伝達分子および転写因子
の両方に対して成功している（例えば、Attardiら, Proc. Natl. Acad. Sci. US
A,90:10563, 1993；Lloydら, Nature, 352:635, 1991；Logeatら, EMBO J., 10:
1827, 1991；Mantovaniら, J. Biol. Chem., 269:20340, 1994；Ransoneら, Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA, 87:3806, 1990；Richardsonら, Mech. Dev., 45:173
, 1994；Tsaiら, Genes Dev., 6:2258, 1992；Thomasら, Nature Genetics, 17:
58, 1997；Wittbrodt, J.およびRosa, F., Genes and Development, 8:1448, 19
94；Kashlesら, Mol. Cell, Biol., 11:1454, 1991；Pierce & Kimelman, Devel
ompent, 121:755, 1995）。

【００６２】他の実施形態においては、本発明は調節された花分裂組織の発育を有する特徴
をもつ遺伝的に改変された植物の作出方法であり、該方法はプロモーターと機能
しうる形で連結されたFTポリペプチドをコードする１以上の構造遺伝子を含んで
なる異種核酸配列を含むベクターを、植物細胞に接触して形質転換された植物細
胞を取得し；形質転換された植物細胞から植物を成長させ；そして調節された花
分裂組織の発育を表す植物を選択する、ことを含む。

【００６３】本明細書で使用する用語「接触する」は、上に記載した化学的および物理的方
法を含む、ベクターを植物細胞中に導入する任意の方法を意味する。好ましくは
、接触は、核酸またはベクターを、植物細胞（外植体、分裂組織または種子を含
む）中に、上記の異種核酸を用いて形質転換したアグロバクテリウムAgrobacter
ium tumefaciensを経由して導入することを意味する。

【００６４】通常は、植物細胞を再生して形質転換プロセスから全植物体を取得する。形質
転換の直接産物は、「トランスゲノート（transgenote）」と呼ばれる。本明細
書で使われる用語「成長（growing）」または「再生（regeneration）」は、全
植物体を、植物細胞、植物細胞群、植物部分（種子を含む）、または植物片（例
えば、プロトプラスト、カルス、または組織部分）から成長させることを意味す
る。本明細書に使われる植物細胞は、限定されるものでないが、海藻、藍藻類、
種子、懸濁培養物、胚、分裂組織領域、カルス組織、葉、根、シュート、配偶体
、胞子体、花粉および小胞子を含む。

【００６５】プロトプラストからの再生は、植物の種それぞれによって変化するが、一般的
にプロトプラストの懸濁液を最初に作る。ある特定の種においては、その後、胚
形成をプロトプラスト懸濁液から誘導して、天然の胚として成熟および発芽の段
階へと進むことができる。培地は、一般的に、成長と再生のために必要な様々な
アミノ酸とホルモンを含有する。用いられるホルモンの例はオーキシンおよびサ
イトキニンを含む。ある時には、特にトウモロコシおよびアルファルファのよう
な種に対しては、グルタミン酸およびプロリンを培地に添加することが有利であ
る。効率的な再生は、培地に、遺伝子型に、そして培養の歴史に依存する。もし
これらの変数を制御すれば、再生は再現性がある。

【００６６】再生はまた、植物カルス、外植体、器官または部分から起こる。形質転換を、
器官または植物部分の再生と関係付けて実施することができる（Methods in Enz
ymology（酵素学の方法）, Vol.118、およびKleeら, Annual Review of Plant P
hysiology, 38:467, 1987を参照）。Horschら（Science, 227:1229, 1985）のリ
ーフディスク-形質転換-再生法を用いて、ディスクを選択培地上で培養し、その
後、約2-4週間のシュート形成を行う。発育するシュートをカルスから切除し、
適当な根-誘導選択培地に移植する。根が出た小植物を、根が現れた後できるだ
け早く土壌へ移植する。小植物は成熟に達するまで、必要に応じて植え替えるこ
とができる。

【００６７】栄養的繁殖作物においては、成熟トランスジェニック植物を、挿木（cuttings
）をすることによりまたは組織培養技術により繁殖させて、多数の同じ植物を作
る。所望のトランスゲノートの選択を行って新しい変種を取得し、そして商業用
として栄養的に繁殖させる。

【００６８】種子繁殖作物においては、成熟トランスジェニック植物を自己交雑して、ホモ
接合性の近交系植物を作ることができる。該近交系植物は新しく導入した外来遺
伝子を含有する種子を作る。これらの種子を育て、選択された表現型、例えば早
期開花を表す植物を作ることができる。

【００６９】花、種子、葉、枝、果実などのような再生植物から得た部分は、もしこれらの
部分が記載した形質転換が行われた細胞を含んでなるのであれば、本発明に含ま
れる。該再生植物の子孫および変種、ならびに変異体も、もしこれらの部分が導
入した核酸配列を含んでなるのであれば、本発明の範囲に含まれる。

【００７０】調節された花の発育を表す植物は、目視観察により選択することができる。本
発明は、本発明の方法により作られた植物を含み、かつ、遺伝的に改変された該
植物から誘導された植物組織、種子、および他の植物細胞を含む。

【００７１】さらに他の実施形態においては、本発明は、植物細胞の花分裂組織の発育を調
節する方法を提供し、該方法は植物細胞を上記のベクターに接触させて形質転換
植物細胞を取得し、形質転換された植物細胞を植物を形成する条件のもとで育て
、そして植物の花分裂組織の発育を調節する、ことを含む。本発明の方法は、プ
ロモーター配列が構造遺伝子と機能しうる形で連結されていることを必要とする
。花の発育の誘導が所望であるときは、該プロモーターは誘導プロモーターであ
る。例えば、植物細胞および植物を上記のように作り、適当なインデューサーを
用いてFTをコードする核酸配列と連結されたプロモーターと接触させることによ
り、調節された花分裂組織の発育を誘導する。このような誘導プロモーターは上
に記載されており、好ましくは化学的手法により誘導可能なプロモーターを含む
。

【００７２】「形質転換」により、新しいDNA（すなわち、細胞に対して外因性のDNA）組み
込みの後、細胞内に誘導される遺伝的変化を意味する。細胞が哺乳動物細胞であ
る場合、遺伝的変化は、一般的に、細胞の（すなわち、安定な）ゲノム中へのDN
Aの導入により達成される。「形質転換された細胞」は、その中（またはその祖
先の中）に、組換えDNA技術の方法によって、FTをコードするDNA分子が導入され
ている細胞を意味する。組換えDNAによる宿主細胞の形質転換は、当業者には周
知である通常の技術により実施することができる。

【００７３】抗体本発明のFTポリペプチドを使って、FTポリペプチドのエピトープに免疫反応性
があるかまたは結合する抗体を作ることができる。本質的に様々なエピトープ特
異性をもつプールされた複数のモノクローナル抗体からなる抗体、ならびに明確
なモノクローナル抗体調製物が提供される。

【００７４】ポリクローナル抗体の調製は、当業者には周知である。例えば、参照により本
明細書に組み入れられる、Greenら, Production of Polyclonal Antisera（ポリ
クローナル抗血清の産生）, in: Immunochemical Protocols（免疫化学プロトコル） (Manson編）, pp. 1-5 (Humana Press 1992)； Coliganら, Production of
Polyclonal Antisera in Rabbits, Rats, Mice and Hamsters（ウサギ、ラット
、マウスおよびハムスターのポリクローナル抗血清の産生）in: Current Protoc ols in Immunology（免疫学の最近のプロトコル） , section 2.4.1 (1992)を参
照すること。

【００７５】モノクローナル抗体の調製も同様に通常の方法である。例えば、参照により本
明細書に組み入れられる、Kohler & Milstein, 1975, Nature 256:495；Coligan
ら, sections 2.5.1-2.6.7 ；およびHarlowら, in: Antibodies: a Laboratory Manual（抗体：実験室マニュアル） , page 726 (Cold Spring Harbor Pub. 1988
)を参照すること。簡単に説明すると、モノクローナル抗体は次のように取得す
ることができる：抗原を含んでなる組成物をマウスに注射し、血清サンプルを取
出して抗体産生の存在を検証し、脾臓を取り出してBリンパ球を取得し、Bリンパ
球を骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマを作り、ハイブリドーマをクローニン
グし、抗原に対して抗体を産生するポジティブクローンを選択し、そしてハイブ
リドーマ培養物から抗体を単離する。モノクローナル抗体は、様々な十分確立さ
れた技術によって、ハイブリドーマ培養物から単離し精製することができる。こ
のような単離技術は、プロテインAセファロースを用いるアフィニティクロマト
グラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフ
ィーを含む。例えば、Coliganら, sections 2.7.1-2.7.12およびsections 2.9.1
-2.9.3；Barnesら, Purification of Immunoglobulin G (IgG)（免疫グロブリン
Gの精製）, in: Methods in Molecular Biology(分子生物学の方法), Vol. 10,
pages 79-104（Humana Press 1992）を参照すること。

【００７６】モノクローナル抗体のin vitroおよびin vivo増殖の方法は、当業者には周知
である。in vitro増殖は、ダルベッコ改変イーグル培地（Dulbecco's Modified
Eagle Medium）またはRPMI 1640培地のような適当な培地中で、場合によっては
、ウシ胎児血清のような哺乳動物血清または微量元素および正常マウス腹腔浸出
性細胞、脾細胞、胸腺細胞または骨髄マクロファージのような増殖持続補給物を
補給して、実施することができる。in vitroでの生産は相対的に純粋な抗体調製
物を与え、大量の所望の抗体を得るためのスケールアップを可能にする。大規模
なハイブリドーマ培養は、エアリフト反応器内もしくは連続攪拌反応器内の均一
な懸濁培養によって、または固定化されたもしくはエントラップされた細胞培養
で実施することができる。in vivoでの増殖は、細胞クローンを、親細胞と組織
適合性のある哺乳動物、例えばシンジェニックマウス中に注入し、抗体産生腫瘍
の増殖を誘発することによって実施することができる。場合によっては、該動物
を、注入の前に、炭化水素、特にプリスタン（テトラメチルペンタデカン）のよ
うな油でプライムする。1週から3週後に、所望のモノクローナル抗体が該動物の
体液から回収される。

【００７７】本明細書で使われる用語「抗体」は、エピトープ決定基と結合する能力のある
無傷の分子ならびにFab、F(ab')₂、およびFvのようなそれらの断片を含む。これ
らの抗体断片は、その抗原または受容体と選択的に結合する能力を保持し、次の
ように定義される。

【００７８】 (1) Fab、抗体分子の１価の抗原結合断片を含有する該断片は、全抗体の酵素
パパインによる消化により作ることができ、１つの無傷の軽鎖と１つの重鎖の部
分を生じる； (2) Fab'、抗体分子の該断片は、全抗体をペプシンにより処理し、その後、還
元して得ることができ、１つの無傷の軽鎖と重鎖の部分を生じる；抗体１分子当
たり２つのFab'断片が得られる； (3) F(ab')₂、抗体の該断片は、全抗体を酵素ペプシンにより処理しその後の
還元なしに得ることができる；F(ab')₂は、２つのジスルフィド結合により一緒
に保持された２つのFab'断片の２量体である； (4) Fv、２つの鎖として発現された軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域を含有す
る、遺伝的に操作された断片として定義される；そして (5) 1本鎖抗体（「SCA」）、遺伝的に融合した1本鎖分子として適当なポリペプ
チドリンカーにより連結された、軽鎖の可変領域、重鎖の可変領域を含有する、
遺伝的に操作された分子として定義される。

【００７９】これらの断片を作製する方法は当分野で公知である（例えば、参照により本明
細書に組み入れられる、HarlowおよびLane, Antibodies: A Laboratory Manual
（抗体：実験室マニュアル）, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (198
8)を参照）。本発明で使われる用語「エピトープ」は、抗体のパラトープと結合
する抗原上の任意の抗原性決定基を意味する。エピトープ決定基は、通常、アミ
ノ酸または糖側鎖のような分子の化学的活性表面基からなり、通常、特異的な３
次元構造特性、ならびに特異的な電荷特性を有する。

【００８０】本発明の抗体断片は、抗体のタンパク質分解的加水分解によりまたは該断片を
コードするDNAの大腸菌中の発現により調製することができる。抗体断片は、通
常の方法により全抗体のペプシンまたはパパイン消化によって得ることができる
。例えば、抗体断片は、抗体のペプシンによる酵素的切断により作製することが
でき、F(ab')₂で記される5S断片を与える。この断片は、さらにチオール還元剤
、および場合によってはジスルフィド結合の切断から生じるスルフヒドリル基の
ブロッキング基を使って切断し、3.5S Fab'１価断片を作ることができる。ある
いは、ペプシンを使う酵素的切断は２つの１価断片Fab'と１つのFc断片を直接作
る。これらの方法は、例えば、Goldenbergの米国特許第4,036,945号および第4,3
31,647号、ならびにそれらに含まれる参考文献に記載されている。これらの特許
は、参照により本明細書にその全文が組み入れられる。また、Nisonhoffら, 196
0, Arch. Biochem. Biophys. 89:230、Porter, 1959, Biochem. J. 73:119；Ede
lmanら, 1967, Methods in Enzymology(酵素学の方法), Vol.1, page 422 (Acad
emic Press)；ならびにColiganら, sections 2.8.1-2.8.10およびsections 2.10
.1-2.10.4を参照すること。

【００８１】該断片が無傷の抗体により認識される抗原と結合する限り、１価の軽-重鎖断
片を形成する重鎖の分離、さらなる断片の切断、または他の酵素的、化学的また
は遺伝子技術のような他の抗体切断方法を使うこともできる。

【００８２】例えば、Fv断片はV_HおよびV_L鎖の結合を含んでなる。この結合は、Inbarら（1
972, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 69:2659）が記載したように非共有結合であ
りうる。あるいは、可変鎖は分子間ジスルフィド結合により連結するかまたはグ
ルタールアルデヒドのような化学品により架橋することができる。例えば、Sand
hu, 前掲、を参照すること。好ましくは、Fv断片は、ペプチドリンカーにより結
合されたV_HとV_L鎖を含んでなる。これらの1本鎖抗原結合タンパク質（sFv）は、
V_HおよびV_LドメインをコードするDNA配列をオリゴヌクレオチドにより結合して
含んでなる構造遺伝子を構築することにより調製する。構造遺伝子を発現ベクタ
ー中に挿入し、それを、その後、大腸菌のような宿主細胞中に導入する。組換え
宿主細胞は、２つのVドメインを架橋するリンカーペプチドをもつ1本鎖ポリペプ
チドを合成する。sFvを作る方法は、例えば、Whitlowら, 1991, Methods: a Com panion to Mehods in Enzymology（方法：酵素学における方法の必携書） , Vol.
2, page 97；Birdら, 1988, Science 242:423-426；Ladnerら, 米国特許第4,946
,778号；Packら, 1993, Bio/Technology 11:1271-77；およびSandhu,前掲、に記
載されている。

【００８３】抗体断片の他の形態は、単一の相補性決定領域（CDR)をコードするペプチドで
ある。CDRペプチド（「最少認識ユニット」）は、対象とする抗体のCDRをコード
する遺伝子を構築することによって得られる。このような遺伝子は、例えば、抗
体産生細胞のRNA由来の可変領域を合成するポリメラーゼ連鎖反応を使うことに
より調製される。例えば、Larrickら, Methods: a Companion to Mehods in Enz ymology（方法：酵素学における方法の必携書） , Vol.2, page 106 (1991)を参
照すること。

【００８４】本発明のFTポリペプチドと結合する抗体は、対象とする小ペプチドを免疫化抗
原として含有する無傷のポリペプチドまたは断片を使って調製することができる
。動物を免疫化するために使われるポリペプチドまたはペプチドは、翻訳された
cDNAまたは化学合成から得ることができ、それらは、もし所望であれば担体タン
パク質とコンジュゲートすることができる。ペプチドに化学的に結合するのに通
常使われる担体としては、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）、チログ
ロブリン、ウシ血清アルブミン（BSA）、および破傷風トキソイドが挙げられる
。結合したペプチドは、その後、動物（例えば、マウス、ラット、またはウサギ
）を免疫化するために使われる。

【００８５】もし所望であれば、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、例えば、抗
体を生起するポリペプチドまたはペプチドが結合しているマトリクスへの結合、
および該マトリクスからの溶出によって、さらに精製することができる。当業者
は、ポリクローナル抗体ならびにモノクローナル抗体の精製および／または濃縮
のための、免疫学分野において一般的な様々な技術に精通しているであろう（例
えば、参照により組み入れられるColiganら, Unit 9, Current Protocols in Im
munology（免疫学の最近のプロトコル）, Wiley Interscience, 1991を参照）。

【００８６】抗イディオタイプ技術を使って、エピトープを模擬するモノクローナル抗体を
作ることも可能である。例えば、第１のモノクローナル抗体に対して作られた抗
イディオタイプモノクローナル抗体は、第１のモノクローナル抗体が結合するエ
ピトープの「イメージ」である超可変領域に結合ドメインを有するであろう。

【００８７】遺伝的改変植物１つの実施形態において、本発明は、そのゲノム内にFTをコードする異種核酸
配列を少なくとも１つ含む遺伝的改変植物であって、そのFT配列が該植物におけ
る開花（flowering）を調節することを特徴とする該遺伝的改変植物を提供する
。したがって、該植物は、花の発育（flower development）が調節されているも
のとして特徴付けられる。本明細書にはまた、全て本発明の遺伝的改変植物から
誘導された植物細胞および植物組織も含まれる。さらに、発芽して本明細書に記
載のような遺伝的改変植物になる種子も提供される。

【００８８】本明細書中で用いる「遺伝的改変」なる用語は、１つ以上の異種核酸配列を１
個以上の植物細胞に導入することを意味し、これは、性的にコンピテント(つま
り適合可能)で生存可能な植物完全体を生じ得る。本明細書中で用いる「遺伝的
に改変した（された）」なる用語は、上記のプロセスの１つにより作出された植
物をいう。本発明の遺伝的改変植物は、生殖系に担持されている外来遺伝子が農
業上有用な植物品種に挿入または該植物品種に交配できるように、自花受粉また
は同じ種の他の植物と他花受粉することができる。本明細書中で用いる「植物細
胞」なる用語は、プロトプラスト、配偶子産生細胞、および再生して植物完全体
になる細胞をいう。したがって、植物完全体へと再生し得る多数の植物細胞から
なる種子は「植物細胞」の定義に含まれる。

【００８９】本明細書中で用いられる「植物」なる用語は、植物完全体、植物の部分、植物
細胞、または植物細胞群（例えば、植物組織）のいずれかをいう。苗木もまた「
植物」の意味に含まれる。本発明に含まれる植物は、形質転換技術を適用可能な
任意の顕花植物であり、単子葉植物および双子葉植物の両方を含む。

【００９０】単子葉植物の例としては、以下のものに限定されないが、アスパラガス、青刈
りトウモロコシおよび甘味種トウモロコシ、大麦、小麦、イネ、モロコシ、玉ね
ぎ、パールミレット、ライ麦ならびにオート麦が挙げられる。双子葉植物の例と
しては、以下のものに限定されないが、トマト、タバコ、綿、菜種、フィールド
ビーン（field beans）、大豆、コショウ、レタス、エンドウ、アルファルファ
、クローバー、アブラナ属の作物またはBrassica oleracea（例、キャベツ、ブ
ロッコリー、カリフラワー、芽キャベツ）、ラディッシュ、ニンジン、ビート、
ナス、ホウレンソウ、キュウリ、カボチャ、メロン、カンタロープ、ヒマワリ、
および種々の鑑賞植物が挙げられる。樹木種としてはポプラ、マツ、セコイア、
ヒマラヤスギおよびオークが挙げられる。

【００９１】本明細書中で用いる「異種核酸配列」なる用語は、プロモーターのような調節
配列に機能し得る形で結合された少なくとも１つの構造遺伝子をいう。この核酸
配列は、外来種に由来するか、またはその本来の形態から実質的に改変されてい
るならば同じ種に由来する。例えば、「異種核酸配列」なる用語は、同じ種に由
来する核酸を含むが、その場合、かかる配列は天然型すなわち野性型のプロモー
ターとは異なるプロモーターに機能し得る形で連結されている。

【００９２】本明細書中で用いる「核酸配列」なる用語は、独立した断片の形態での、また
は大きな構築物の成分としてのデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオ
チドの多量体をいう。本発明の方法において用いられるタンパク質をコードする
DNAは、cDNA断片から、または組換え転写単位内で発現され得る合成遺伝子を提
供するオリゴヌクレオチドから組み立てることができる。本発明のポリヌクレオ
チドまたは核酸配列としては、DNA配列、RNA配列およびcDNA配列が挙げられる（
前の記載を参照）。

【００９３】アンチセンスポリヌクレオチド開花の抑制または遅延もしくは晩期開花は、形質転換または遺伝的に改変した
植物を生じさせる植物細胞にアンチセンス分子を導入することにより達成できる
。このアプローチはまた、例えば、アンチセンス核酸、リボザイムまたは三重鎖
物質(triplex agent)を含んで、FT mRNAをアンチセンス核酸もしくは三重鎖物質
でマスキングするかまたは該mRNAをリボザイムで切断するかのいずれかにより該
mRNAの転写または翻訳をブロックすることを含む。本発明の例示的なアンチセン
スポリヌクレオチドを配列番号３（図２）に示す。

【００９４】１つの実施形態において、本発明は、開花期遺伝子（FT）の発現を破壊または
妨害し、かつその植物のゲノムに染色体的に組み込まれているトランスジーンを
有する遺伝的改変植物を提供する。「トランスジーン」とは、工夫もしくは術策
（artifice）により細胞に挿入されており、該細胞から発生する生物または植物
のゲノムの一部となる任意のDNAの部分である。そのようなトランスジーンは、
該トランスジェニック生物に対して部分的もしくは完全に異種（すなわち、外来
性）である遺伝子を含んでもよいし、または該生物の内在性遺伝子に相同な遺伝
子に相当するものであってもよい。本明細書中で用いられる「トランスジーン」
なる用語は、該トランスジェニック植物に対して部分的もしくは完全に異種（す
なわち、外来性）であるかまたは該トランスジェニック植物の内在性遺伝子に相
同であるが、該植物のゲノムに天然型の遺伝子の位置とは異なる位置に挿入され
るように設計されている、遺伝的改変植物またはトランスジェニック植物内で発
現しようとする１つ以上の選択されたDNAを含むDNA配列を意味する。トランスジ
ーンは、１つ以上のプロモーターおよび該選択したDNAの発現に必要な任意の他
のDNA（例えば、イントロン）（これらは全て、該選択したDNAに機能し得る形で
連結されている）を含み、エンハンサー配列を含んでもよい。

【００９５】本発明は、花の晩期発育を示すものとして特徴づけられる遺伝的改変植物の作
出方法であって、FTポリペプチドの発現を破壊または妨害する構造遺伝子を少な
くとも含む核酸配列を含むベクターに植物細胞を接触させて（その際、該遺伝子
はプロモーターと機能し得る形で結合されている）、形質転換された植物細胞を
得て；該形質転換された植物細胞から植物を生成し；そして、花の晩期発育を示
す植物を選択することによる上記方法を包含する。花の晩期発育は、本明細書の
実施例に示されるようにして、例えば、野生型植物の開花期に対するトランスジ
ェニック植物の開花期を視覚的に観察することにより確定できる。開花期は、最
初の花が生じる前の葉の数を数えることにより決定できる（Koornneefら, Mol.
Gen. Genet., 229:57, 1991）。他の指標には、LEAFYまたはAPETALA 1のような
花分裂組織アイデンティティー遺伝子（floral-meristem identity gene）のプ
ロモーター活性の検出が含まれる（Blazquezら, Development, 124:3835, 1997
；Hempel, 前掲）。

【００９６】花の晩期発育を示すものとして特徴付けられる遺伝的改変植物の作出方法は、
プロモーターと機能し得る形で結合させたFTアンチセンス核酸配列またはFTの優
性ネガティブ形態をコードする核酸配列を含むベクターに植物細胞を接触させる
ことを含む。本明細書で提供する配列番号３のアンチセンス核酸配列を実施例３
に示すようにして用いて、野生型の植物と比べて花の晩期発育を示す遺伝的改変
植物を作出した。

【００９７】アンチセンス核酸とは、特定のmRNA分子の少なくとも一部に相補的なDNA分子
またはRNA分子である（Weintraub, 1990, Scientific American, 262:40）。細
胞において、アンチセンス核酸は、対応するmRNAにハイブリダイズして、二本鎖
分子を形成する。細胞は二本鎖のmRNAを翻訳しないので、アンチセンス核酸はmR
NAの翻訳を妨害する。約15ヌクレオチドのアンチセンスオリゴマーが好ましい。
この理由は、それらのアンチセンスオリゴマーは容易に合成され、標的のFT産生
細胞に導入した際に、より大きな分子よりも問題を引き起こす可能性が低いから
である。遺伝子のin vitroでの翻訳を抑制するためにアンチセンス法を用いるこ
とは当業界では公知である（Marcus-Sakura, 1988, Anal. Biochem., 172:289）
。ウイルスもまたアンチセンス抑制に用い得る（AngellおよびBalcombe, EmboJ.
, 16:3675, 1997）。

【００９８】転写を停止（stall）させるためにオリゴヌクレオチドを用いることは三重鎖
戦略（triplex strategy）として知られている。これは、該オリゴマーは二重ら
せんDNAの周りに巻き付いて三重鎖らせんを形成することによる。したがって、
これらの三重鎖化合物は、選択した遺伝子のユニークな部位を認識するように設
計できる（Maherら, 1991, Antisense Res. and Dev., 1(3):227；Helene, C.,
1991, Anticancer Drug Design, 6(6):569）。

【００９９】リボザイムは、DNA制限エンドヌクレアーゼと類似する様式で他の一本鎖RNAを
特異的に切断する能力を有するRNA分子である。これらのRNAをコードするヌクレ
オチド配列の改変により、RNA分子内の特定のヌクレオチド配列を認識しそれを
切断する分子を遺伝子工学的に作製することが可能である（Ceeh, 1988, J. Ame
r. Med. Assn., 260:3030）。このアプローチの主な利点は、それらが配列特異
的であるために、特定の配列を有するmRNAのみが不活性化されることである。

【０１００】リボザイムには、２つの基本的なタイプ、つまりテトラヒメナ型（Hasselhoff
, 1988, Nature, 334:585）と「ハンマーヘッド」型がある。テトラヒメナ型リ
ボザイムは長さが塩基４個の配列を認識し、「ハンマーヘッド」型リボザイムは
長さが11〜18個の塩基配列を認識する。認識配列が長くなるほど、標的mRNA種内
にその配列だけが存在する可能性が高くなる。したがって、特定のmRNA種を不活
性化するのにはテトラヒメナ型リボザイムよりもハンマーヘッド型リボザイムの
方が好ましく、塩基18個からなる認識配列の方がより短い認識配列よりも好まし
い。

【０１０１】優性ネガティブ突然変異本発明の別の実施形態において、FT優性ネガティブタンパク質をコードするヌ
クレオチド配列が提供される。例えば、そのような優性ネガティブコード遺伝子
を含む遺伝子構築物は、組織特異的プロモーターのようなプロモーターと機能し
得る形で連結できる。そのようなプロモーターおよび使用方法の例は上記に記載
されている。

【０１０２】そのような構築物は、植物における花の発育を調節する方法に有用である。例
えば、本発明の方法は、優性ネガティブFTタンパク質をコードする遺伝子構築物
および機能し得る形で連結されている適切なプロモーターで植物細胞または組織
を形質転換し、そして該優性ネガティブコードFT遺伝子を発現させて、野生型の
FT活性に干渉することにより花の発育を調節することを含む。

【０１０３】FTインヒビターのスクリーニング別の実施形態において、本発明は、FTタンパク質の活性または遺伝子発現を調
節する化合物の同定方法を提供する。この方法は、該化合物とFTポリペプチドも
しくはFTポリペプチドを発現する組換え細胞とを含む成分を、該成分同士を相互
作用させるのに十分な条件下でインキュベートし、そしてFT活性または発現に対
する該化合物の作用を測定することを含む。FT活性に対する該化合物の作用は多
くのアッセイにより測定でき、該化合物の存在下でのインキュベートの前および
後での測定を含み得る。FTの活性または遺伝子発現に影響を及ぼす化合物として
は、ペプチド、ペプチド類似体、ポリペプチド、化学的化合物および生物学的作
用物質が挙げられる。アッセイとしては、（例えば遺伝子発現については）FT m
RNAのノーザンブロット分析、および（例えばタンパク質活性については）ウエ
スタンブロット分析が挙げられる。

【０１０４】インキュベーションは、該試験化合物とFTポリペプチドもしくはFTポリペプチ
ドを発現する組換え細胞との接触を可能にする条件を含む。接触は、溶液中およ
び固相、または細胞内を含む。該試験化合物は、場合により、複数の化合物をス
クリーニングするためのコンビナトリアルライブラリーであってもよい。本発明
の方法において同定される化合物はさらに、溶液中または固相支持体に結合させ
た後のいずれかにおいて、PCR、オリゴマー制限法（Saikiら, Bio/Technology, 3 :1008-1012, 1985）、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ASO）プローブ分
析法（Connerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:278, 1983）、オリゴヌクレ
オチド連結アッセイ（OLA）（Landegrenら, Science, 241:1077, 1988）などの
特定のDNA配列の検出に通常適用される任意の方法により、評価、検出、クロー
ニング、配列決定などを行うことができる。DNA分析のための分子技法は総説と
して記載されている（Landegrenら, Science, 242:229-237, 1988）。

【０１０５】FTに影響を及ぼす化合物の同定方法本発明は、FTの活性を調節できる化合物の同定方法を提供する。この方法は、
FTポリペプチドまたはFTポリペプチドもしくはその改変体を発現する組換え細胞
と試験化合物とを、それらの成分同士を相互作用させるのに十分な条件下でイン
キュベートし、そしてFTの活性または発現に対する該化合物の作用を測定するこ
とを含む。FTの活性または遺伝子発現に影響を及ぼす化合物としては、ペプチド
、ポリペプチド、ペプチド類似体、化学的化合物および生物学的作用物質が挙げ
られる。

【０１０６】「インキュベーション」は、該試験化合物とFTポリペプチドとの接触を可能に
する条件を含む。「接触」は、溶液中および固相を含む。該試験化合物はまた、
複数の化合物をスクリーニングするためのコンビナトリアルライブラリーであっ
てもよい。このスクリーニングアッセイでは、種々の他の物質が含まれ得る。こ
れらとしては、最適なタンパク質−タンパク質結合を促進し、および／または非
特異的もしくはバックグラウンドの相互作用を低減するのに用いられる、塩、天
然のタンパク質（例えばアルブミン）、界面活性剤などのような物質が挙げられ
る。該アッセイの効率を向上させる試薬（例えば、プロテアーゼインヒビター、
ヌクレアーゼインヒビター、抗微生物剤など）を用いてもよい。成分の混合物は
、必要な結合をもたらす任意の順番で添加される。インキュベーションは任意の
適切な温度、典型的には４〜40℃の間、で行われる。インキュベーション時間は
最適活性に関して選択されるが、迅速なハイスループットスクリーニングを容易
にするように最適化されてもよい。典型的には、0.1〜10時間の間で十分である
。

【０１０７】本発明の方法において同定される、本質的に核酸である化合物はさらに、溶液
中または固相支持体に結合させた後のいずれかにおいて、PCR、オリゴマー制限
法（Saikiら, 1985, Bio/Technology, 3:1008-1012）、対立遺伝子特異的オリゴ
ヌクレオチド（ASO）プローブ分析法（Connerら, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci
. USA 80:278）、オリゴヌクレオチド連結アッセイ（OLA）（Landegrenら, 1988
, Science, 241:1077）などの特定のDNAの検出に通常適用される任意の方法によ
り、評価、検出、クローニング、配列決定などを行うことができる。DNA分析の
ための分子技法は総説として記載されている（Landegrenら, 1988, Science, 24
2:229-237）。

【０１０８】 FTに影響を及ぼす候補化合物には化学的化合物が含まれる。１つのクラスは有
機分子であり、好ましくは分子量が50ダルトンより大きく約2,500ダルトンより
も小さい小有機化合物である。候補物質は、タンパク質との構造的相互作用に必
要な官能基（特に水素結合）を含み、典型的には少なくとも１つのアミン基、カ
ルボニル基、水酸基またはカルボキシル基、好ましくは少なくとも２つの該官能
性化学基を含む。この候補物質は、１つ以上の上記官能基で置換されている環状
炭素もしくは複素環構造および／または芳香族もしくは多芳香族構造を含む場合
が多い。

【０１０９】候補化合物は、合成または天然の化合物のライブラリーを含む多種多様な供給
源から得られる。例えば、多種多様な有機化合物および生体分子のランダム合成
および直接合成には非常に多くの手段が利用可能であり、ランダム化オリゴヌク
レオチドおよびオリゴペプチドの発現が含まれる。あるいはまた、細菌、真菌、
植物および動物の抽出物の形態の天然化合物のライブラリーが利用可能であるか
、あるいは容易に作製される。さらに、天然の、または合成により作製されたラ
イブラリーおよび化合物は、慣用の化学的、物理的および生化学的手段により容
易に修飾され、コンビナトリアルライブラリーを得るのに用い得る。既知の薬理
学的作用物質は、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化などのような直
接的またはランダムな化学的修飾に供して、構造類似体を作製することができる
。候補物質はまた、ペプチド、糖質、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン
、誘導体、構造類似体またはそれらの組合せ（しかしこれらに限定しようとする
ものではない）などの生体分子の中にも見出される。

【０１１０】化合物は、レポーター遺伝子の発現の促進（もしくは刺激）または抑制のいず
れかにより該レポーター遺伝子の発現に影響を及ぼし得る。化合物がレポーター
遺伝子の発現を「抑制」しているとされるのは、該レポーター遺伝子から生成さ
れる転写物またはタンパク質産物のレベルが、該試験化合物の不在下でのレベル
と比較して低下している場合である。化合物がレポーター遺伝子の発現を「促進
」しているとされるのは、該レポーター遺伝子から生成される転写物またはタン
パク質産物のレベルが、該試験化合物の不在下でのレベルと比較して増大してい
る場合である。

【０１１１】当業者であれば、本発明のスクリーニング法において用いる多くのレポーター
遺伝子を同定できる。本発明で用いられるレポーター遺伝子の例は、lacZ、ルシ
フェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β-グルクロ
ニダーゼおよび緑色蛍光タンパク質である。

【０１１２】レポーター遺伝子の転写に対する該化合物の作用は、当業界で周知の方法（例
えば、ノーザンブロット、EMSA）により該レポーターの発現を評価することによ
り測定できる。あるいはまた、レポーター遺伝子からのタンパク質産物の産生を
、当業界で周知の方法（例えば、ELISAもしくはRIA；ウエスタンブロット：SDS-
PAGE）により測定できる。

【０１１３】本発明はさらに、FTポリペプチドまたはその改変体に結合する細胞性タンパク
質を同定する方法であって、少なくとも１つの細胞性タンパク質とFTポリペプチ
ドもしくはその改変体とを、それら成分同士を相互作用させるのに十分な条件下
でインキュベートし、FTポリペプチドと推定結合タンパク質との複合体を未結合
のFTから分離し、そして該タンパク質を単離すること（例えば、2-ハイブリッド
系）による上記方法を提供する。

【０１１４】好ましい実施形態では、単離された細胞性タンパク質が用いられる。しかし、
部分的に精製したタンパク質、細胞抽出物の画分、全細胞抽出物、または完全な
細胞が本発明の方法で用いることができる。「インキュベーション」は、該細胞
性成分とFTポリペプチドとの接触を可能にする条件を含む。「相互作用」なる用
語は溶液中および固相を含み、該細胞性成分とFTポリペプチドとのどのような複
合体形成または結合も含む。相互作用はあらゆる酵素的相互作用も含み、その場
合、該細胞性成分はFTポリペプチドの生化学的修飾を行う。

【０１１５】該細胞性成分とFTポリペプチドとの複合体は、当業者に周知の慣用の手段によ
り未複合体化FTポリペプチドから分離できる。FTに結合している細胞性成分の存
在は、サイズ分離、物理的分離、または他の標準的な方法により達成できる。例
えば、未変性ゲル電気泳動を用いて、細胞性成分と複合体形成したFTを未複合体
化FTから分離できる。

【０１１６】該複合体を単離したら、当業界で周知の手段により該細胞性成分を単離、特性
決定することができる。例えば、細胞性成分がタンパク質である場合、該タンパ
ク質は当業界で公知の方法論を用いて配列決定できる。該タンパク質をコードす
るポリヌクレオチドは、DNA合成技術を用いて生成できる。次いで、このポリヌ
クレオチドを、当業界で公知の分子技法を用いてベクターに挿入し、上記の技法
を用いて宿主細胞に形質転換することができる。形質転換の後、慣用の方法に従
って大量の該タンパク質を単離、精製することができる。例えば、発現宿主の溶
解物を調製し、該溶解物をHPLC、排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフ
ィニティークロマトグラフィーまたは他の精製技術を用いて精製してもよい。精
製したタンパク質の純粋度は通常少なくとも約80％であり、好ましくは少なくと
も約90％であり、最大100％であり得る。純粋とは、他のタンパク質ならびに細
胞破砕物を含まないことを意味するものである。

【０１１７】上記の開示により、本発明は概ね記載される。さらに完全な理解は、単に説明
の目的で本明細書中に提供されており、かつ本発明の範囲を限定しようとするも
のではない以下の具体的な実施例を参照することにより得ることができる。

【０１１８】実施例１ FTの同定過去何年かの間、本発明者らは、減圧浸潤(vacuum-infiltration)方法(Bechto
ldら，(1993), C.R. Acad. Sci. 316, 1194-1199)を用いて、活性化タギング(ac
tivation-tagging)T-DNAベクターで形質転換されたシロイヌナズナ植物を多数生
成してきた。このベクターは、Waldenおよび共同研究者らによって記載されるよ
うに((1994), Plant Mol. Biol. 26, 1521-1528)、T-DNAの右側の境界に隣接す
る強力なカリフラワーモザイクウイルス35Sエンハンサーの四量体を含む。本発
明者らの形質転換植物の集団から、環境条件に関わらず極めて早期に開花させる
優性かつ遺伝性の突然変異を含む系統を同定した。この系統、即ち1733は、長日
および短日の両方で平均3.5枚の葉を有して開花し、野生型植物はそれぞれ平均1
3および45枚の葉を有して開花した。優性な表現型が活性化タギングベクターと
共分離(co-segregate)したのを確認した後、プラスミドレスキュー(rescue)によ
り隣接配列を単離した。元のベクター由来の多量体化エンハンサーと共に3.4kb
のゲノム配列を含む断片を、別のT-DNAベクターに挿入し、プラスミドpSKI083を
産生した(図１)。この構築物を、減圧浸潤により再び植物に導入した。

【０１１９】多数のpSKI083形質転換植物が、元の変異体系統と同じ表現型を有していた。
これは、pSKI083断片が、早期開花をもたらす遺伝子を含むことを示す。pSKI083
断片を、アレイ化された酵母人工染色体ライブラリーとのハイブリダイゼーショ
ンによりマッピングし、地図上の位置を第１染色体の下部に決定した。この領域
に位置することが知られている唯一の開花期遺伝子はFT遺伝子であった。FT遺伝
子の劣性対立遺伝子は、遅期開花を生じる(Koornneefら, (1991), Mol. Gen. Ge
net. 229, 57-66)。FT遺伝子座をコードする構造遺伝子は、これまでに単離され
ていない。３つの別々のEMS誘導型ft対立遺伝子由来のゲノムDNAを配列決定した
ところ、それら全てが、このゲノム断片に含まれる単一の遺伝子にミスセンス変
異または停止コドンのいずれかが導入された単一塩基対変化を含むことが分かっ
た(以下を参照)。従って、元の活性化タギング変異体は、FT遺伝子座にある優性
な早期開花型対立遺伝子であり、失活により反対の表現型すなわち遅期開花を生
じる。

【０１２０】実施例２ FT配列および他の遺伝子との関係 pSKI083上のゲノム断片の配列、およびこの断片に由来するcDNAの配列を決定
した(図１および図２)。FT cDNAは、175アミノ酸の長さで、分子量が19.8kDで、
等電点が7.89のタンパク質を産生すると予想される単一のオープンリーディング
フレームを含む。

【０１２１】データベース検索により、FTが、植物、菌類、および哺乳動物により提示され
る遺伝子ファミリーのメンバーであることが明らかになった。機能的情報は、植
物由来の一対のオルソロガス遺伝子、および哺乳動物由来の別の一対のオルソロ
ガス遺伝子について入手できた(図３Ａ)。２つの植物遺伝子は、キンギョソウ (
Antirrhinum majus)由来のCENTRORADIALIS(CEN)、およびシロイヌナズナ由来のT
ERMINAL FLOWER 1 (TFL1)である(Bradleyら, 1996, 前掲；Bradleyら, 1997, 前
掲)。これらの遺伝子を、突然変異により失活させると、主シュートおよび側生
シュート上に頂花が形成される。

【０１２２】さらに、tfl1変異体は、野生型と比較して、わずかに早期に開花する(Shannon
およびMeeks-Wagner, (1991), Plant Cell 3, 877-892)。本発明者らは最近、TF
L1が過剰発現される植物を作製した(35S::TFL1)。これらの植物は遅期開花する
。このように、FTに配列上関連するTFL1遺伝子は、開花の際にFTと反対の役割を
果たす。FT過剰発現体(FT overexpressers)は早期に開花し、tfl1機能欠損変異
体も同じく早期に開花する。対照的に、ft機能欠損変異体は、遅期に開花し、TF
L1過剰発現体も同じく遅期に開花する。

【０１２３】シロイヌナズナのゲノムは、FT/TFL1遺伝子ファミリーの少なくとも１つの別
のメンバーを含む。この遺伝子は、不明な発現配列タグ(anonymous expressed s
equence tag)(ESTクローン＃E12A11)(GenBank受託番号AA042630)として同定され
ている。本発明者らは、E12A11 cDNAの完全配列を決定した(図３Ａ)。FTおよびT
FL1とは対照的に、トランスジェニック植物(35S::E12A11)でのこの遺伝子の過剰
発現は、開花をもたらすようには見えない。

【０１２４】 CEN、TFL1、FTおよびE12A11のタンパク質配列の系統樹は、TFL1が、TFL1と同
じ種に由来するFTおよびE12A11とよりも、異なる種に由来するCENとより深く関
連することを示す。TFL1が、FTおよびE12A11と比較して、CENとの間により深い
関連性を有することは、CENがオルソロガス遺伝子であることを裏付ける(図３Ｂ
)。さらに、配列比較により、FTが、E12A11とよりもCEN/TFL1とより深い関連性
を有することが示される。つまり、系統樹は、異なる種におけるFTオルソログを
同定するための重要な基準を提供する。このようなオルソログは、CEN/TFL1また
はE12A11のいずれかとよりも、シロイヌナズナ由来のFTとより深い関連性を有す
るであろう。

【０１２５】哺乳動物由来のFT/TFL1ファミリーの２つのメンバーとして、海馬コリン作用
性神経刺激ペプチドのラットおよびヒト前駆体タンパク質をコードする遺伝子が
ある(Tohdohら、前掲)(図３)。ラットタンパク質は、脳外植片の培養系において
アセチルコリン合成を刺激するペプチドホルモンを生じる前駆体タンパク質とし
て同定されている(Ojikaら、前掲)。海馬コリン作用性神経刺激ペプチドであるH
CNPと称される活性部分は、これまでに精製され、11アミノ酸長のペプチド、ア
セチル-Ala-Ala-Asp-Ile-Ser-Gln-Trp-Ala-Gly-Pro-Leu(配列番号４)(図３Ｃ)で
あることが示されている。前駆体タンパク質を、ペプチド配列から予想されるDN
A配列を使用してクローニングした。活性ペプチドは、メチオニン除去およびア
セチル化と共に、Ｎ末端切断によって生成されることが示された。しかし、活性
のためにアセチル化は必須ではなく、アセチル化HCNPおよび遊離HCNPの両方がin
vivoで見出されている(Ojikaら、前掲)。ヒトHCNP前駆体タンパク質をコードす
る遺伝子もクローニングされた。ラットおよびヒト遺伝子が全体的に非常に類似
しているのに対し、予想されたアミノ末端ペプチドの11アミノ酸のうち６アミノ
酸のみが同一である。しかし、両方とも、ラット内中隔核(medial septal nucle
i)培養物におけるアセチルコリン合成を刺激するのに有効である。ヒトまたはラ
ットHCNP配列を含む短いペプチドの生物活性を検査すると、HCNPのカルボキシ末
端を含むテトラペプチドおよびヘキサペプチドのみが活性であることが分かった
。配列アライメントに基づき、HCNP活性のための最小コンセンサス配列がX-Gly-
Pro-Leuであることが推定された(Ojikaら、1996)。

【０１２６】植物タンパク質のアミノ末端は比較的多様であるが、配列(AspまたはGlu)-Pro
-Leuは全てに共通する(図３Ｃ)。HCNPと同様に、保存されたロイシンの後で植物
タンパク質の切断が生じた場合、予想される植物ペプチドの長さは7〜11アミノ
酸である(図３Ｃ)。配列類似性は、植物タンパク質が、開花をもたらすペプチド
の前駆体としても作用することを強く示唆する。従って、本発明者らは、FTの過
剰発現または失活に加えて、FTペプチドのみの適用(application)または過剰発
現が開花期をもたらすのに有用であると予想する。

【０１２７】実施例３センス方向およびアンチセンス方向にFTを過剰発現するトランスジェニック植物本発明者らは、プラスミドレスキューにより単離したゲノムDNA断片をプロー
ブとして用いて、シロイヌナズナ花 cDNAライブラリー(Weigelら, 1992, Cell 6
9, 843-859)から10以上のcDNAクローンを得た。cDNAクローンを配列決定し、全
て同じ遺伝子に由来することを見い出した。完全なオープンリーディングフレー
ム、ならびに5’および3’非翻訳配列を含むものとして、1814bpにわたるクロー
ンpSKI1.1.1を選択した。記載したいくつかの組換えDNA構築物の部分的な地図を
図１に示し、センスインサート(配列番号５)およびアンチセンスインサート(配
列番号３)の実際の配列を図２に示す。

【０１２８】植物形質転換のために、本発明者らは、T-DNA境界内に除草剤グルホシネート(
glufosinate)(BASTA^TMまたはIgnite^TM)に耐性を付与するBAR遺伝子を含み、それ
と共に、強力な植物ウイルス由来合成プロモーター/翻訳エンハンサー(200bpの
カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター(Odellら, (1985), Identificat
ion of DNA-sequences required for activity of the cauliflower mosaic vir
us-35S promoter, Nature 313, 810-812)、およびタバコモザイクウイルスの70b
pの5’オメガ領域(Sleatら、(1987)、Gene 60, 217-225)を含む)と、Agrobacter
iumノパリン合成酵素(nos)遺伝子由来の転写ターミネーターとの間に複数のクロ
ーニング部位を含む、pSKI090バイナリーT-DNAベクターを構築した(図１を参照)
。pSKI090の作製における２つの中間ステップは、CaMV35Sプロモーターおよび3
’ nos配列を含む、pBluescriptKS+(Stratagene)由来ベクターpSKI087、ならび
にBAR遺伝子を含むT-DNAベクターpSKI089であった。

【０１２９】センス構築物を作製するために、クローンpSKI1.1.1のcDNAインサートを、Xba
I-XhoI断片として切り出し、pSKI087にサブクローニングし、構築物pSKI053を得
た；過剰ポリリンカー配列をBamHI消化および再ライゲーションにより除去し、
構築物pSKI058を得た；最後に、合成プロモーターであるFT cDNAおよびnosター
ミネーターを含む断片を、pSKI089ベクターに挿入し、pSKI059を作製した(図１)
。pSKI059で形質転換されたトランスジェニック植物は、FT mRNAを過剰産生する
と予想される。

【０１３０】アンチセンス構築物を作製するために、クローンpSKI1.1.1のcDNAインサート
をKpnI-XbaI断片として切り出し、適切に消化したpSKI090ベクターDNAとライゲ
ートさせ(図１を参照)、構築物pSKI060を得た。この構築物において、FTオープ
ンリーディングフレームは、正常な転写方向に対して、合成プロモーターと反対
方向にある。pSKI059(35S::FT)およびpSKI060(35S::antiFT)を、Agrobacterium
tumefaciens株ASEに移した(Fraleyら、(1985), The SEV system: a new disarme
d Ti plasmid vector system for plant transformation, Biotechnology 3, 62
9-635)。構築物を、減圧浸潤により、Columbia生態型シロイヌナズナに導入した
(Bechtoldら,1993)。Ignite^TMの1:10,000希釈液を稚苗に繰り返し噴霧すること
でトランスジェニック植物を選択した。pSKI060(35S::antiFT)に対して、本発明
者らは50体の形質転換体を分析した。このうち２体は遅期開花のものであり、(1
3枚の葉を生成する野生型と比較して)25枚以上のロゼット葉が形成された。

【０１３１】 pSKI059(35S::FT)に対して、本発明者らは50体の形質転換体を分析した。この
うち45体は野生型よりもかなり早期に開花し、そのうちの９体は元の1733変異体
と同じ程度に早期であった(葉は3.5枚対13枚)。

【０１３２】 FTはまた、LEAFYに対してコンピテンス(competence)因子としても作用する(Ru
iz-Garciaら, Plant Cell, 9:1921, 1997)。本発明者らは、35S::FTと35S::LFY
とを標準的方法により交配させて、相乗効果を観察した。換言すると、これらの
植物は、栄養葉を全く形成することなく開花した。このような相乗効果は、他の
遺伝子の発現に先立ち、または実質的に同時に、または後に、少なくとも１つの
遺伝子もしくは他の遺伝子の発現により生じることが理解されなければならない
。例えば、同時過剰発現により、植物は発芽と同時に開花する(表１を参照)。

【０１３３】

【表１】さらに、本発明者らは、35S::FTと35S::TFL1とを標準的方法にて交配し、拮抗
効果を観察した。このような効果は、他の遺伝子の発現に先立ち、または実質的
に同時に、または後に、少なくとも１つの遺伝子もしくは他の遺伝子の発現によ
り生じることが理解されなければならない。例えば、TFL1の過剰発現は、植物が
開花するのを遅らせ、FTおよびTFL1の両方の同時過剰発現は中間表現型を生じる
。しかし、FT発現を抑制しながらのTFL1の過剰発現は、TFL1のみを過剰発現した
場合よりも、植物の開花をさらに遅らせる(表２を参照)。

【０１３４】

【表２】上記記載は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するも
のではない。当然、当業者は、本明細書中の教示に基づき、過度の実験を要する
ことなく、さらなる実施形態を容易に想定し作ることができるであろう。それゆ
え、本発明は以下の請求の範囲によってのみ限定される。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、T-DNAベクターインサートの部分的なマップを表わす。pSKI083につい
ては、もとの1733系から単離したKpn I断片が表わされている。この断片は、FT
転写産物を生じさせるゲノム領域、このもとのT-DNA挿入の右側境界（RB）、お
よびこのもとの活性化-タグ付けベクター（activation-tagging vector）に由来
するCaMV35Sエンハンサー配列の４量体を含む。FTエキソンはボックスとして、
イントロンは細い線で描かれている。3’側および5’側の非翻訳領域は影付きで
、および翻訳領域は黒塗りで示される。pSKI059およびpSKI060については、FT c
DNAにまたがるXba 1/Xho1断片がCaMV35Sプロモーターに関してその方向に沿って
表わされており、3’ nos配列が表わされている。+1は転写開始地点を示す。

【図２】図２は、センス構築物およびアンチセンス構築物に使用されるFT cDNAインサ
ートのヌクレオチド配列（pSKI059（配列番号５）およびpSKI060（配列番号３）
）を表わしている。センス鎖の場合、FTタンパク質の概念的な翻訳は、そのDNA
配列の下の３文字コードで表わされる。ベクター配列には下線が付してある。

【図３】図３は、FTと植物および哺乳動物における関連タンパク質との配列比較を、１
文字のアミノ酸コードと共に表わす。 At-Arabidopsis thaliana; Am-Antirrhinum majus（キンギョソウ）; Rn-Rattus
norvegicus（ラット）; Hs-ヒト(Homo sapiens)。TFL1-TERMINAL FLOWER 1（Br
adleyら(1997), Science 275, 80-83）; CEN-CENTRORADIALIS (Bradleyら(1996)
, Nature 379, 791-797); E12A11-ESTクローン（GenBank [受諾番号AA042630]
の部分配列;Kardailsky & Weigel（未発表）により決定された完全配列）; HCNP
-海馬コリン作用性神経刺激ペプチド前駆タンパク質（Ojikaら（1992）, Brain
Res. 572, 164-171.(1992), Brain Res. 572, 164-171）; Tohdohら（1995）, B
rain Res. Mol. Brain. Res. 30, 381-384）。図３Aは、全タンパク質のアミノ酸配列のアラインメントを表わす。４つのア
ラインメントされたタンパク質のうちの少なくとも２つに存在するアミノ酸のみ
が表わされる。コンセンサスとは異なるアミノ酸はドットで、およびギャップは
水平な破線で示される。図３Bは、全ての５つの遺伝子によりコードされるタンパク質配列のアライン
メントに基づいた系統樹を表わす。枝の長さは進化の距離を反映する。Am CENお
よびAt TFL1は、オルソロガスな（orthologous）機能を有するタンパク質であり
（Bradleyら(1996)前掲; Bradleyら(1997)前掲）、一緒にクラスターを形成して
いる。図３Cは、ラットおよびヒトに由来するHCNPと、植物タンパク質の対応する領
域とのアラインメントを表わしている。HCNP活性にとって必須であることが分か
っている（Ojikaら(1996), Neurosci. Lett. 215, 127-30）３つのカルボキシ末
端アミノ酸のうち２つ（プロリン-ロイシン）は、全ての植物ペプチドにおいて
同一であるが、その前のアミノ酸は、植物では酸性（アスパラギン酸またはグル
タミン酸）であり、哺乳動物ではグリシンである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (71)出願人 10010 ＮｏｒｔｈＴｏｒｒｅｙＰｉｎｅｓＲｏａｄ，ＬａＪｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ 92037，ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａＦターム(参考） 2B030 AB04 AD20 CA06 CA17 CA19 CB02 4B024 AA08 BA79 CA04 DA01 EA01 FA02 FA06 GA11 HA01 4B065 AA88X AA88Y AB01 AC20 BA02 CA24 CA53 4H045 AA10 BA10 CA30 EA05 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】実質的に精製された開花遺伝子座Ｔ（FT）ポリペプチド。
【請求項２】 a) SDS-PAGEで測定して約20kDの分子量をもち、b) アラビド
プシス(Arabidopsis)の第１染色体上に位置し、c) 開花期を調節する働きがある
という特徴を有する、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】前記ポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号２に示したアミ
ノ酸配列またはその機能性断片と実質的に同一である、請求項１記載のポリペプ
チド。
【請求項４】前記アミノ酸配列が配列番号２に示したものである、請求項
１記載のポリペプチド。
【請求項５】請求項１記載のポリペプチドをコードする、単離されたポリ
ヌクレオチド。
【請求項６】次のポリヌクレオチド： a) 配列番号１、 b) TがUであり得る配列番号１、 c) 配列番号１に相補的な核酸配列、 d) 配列番号２のポリペプチドをコードする核酸とハイブリダイズする、少な
くとも15塩基長の上記a)、b)およびc)の断片、からなる群より選択される、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７】植物細胞から単離されたものである、請求項５記載のポリヌ
クレオチド。
【請求項８】請求項５記載のポリヌクレオチド配列を含む組換え発現ベク
ター。
【請求項９】請求項８記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１０】請求項１記載のポリペプチドと結合するか、または該ポリ
ペプチドの抗原性断片と結合する抗体。
【請求項１１】少なくともFTコード化核酸配列を含む外因性核酸配列少な
くとも１つをゲノム中に含み、花の調節された発育を特徴とする遺伝子改変植物
。
【請求項１２】前記調節が花の発育の促進である、請求項11記載の植物。
【請求項１３】前記調節が花の発育の抑制である、請求項11記載の植物。
【請求項１４】 LEAFY(LFY)、APETALA1(AP1)、CONSTANS(CO)、TERMINAL FL
OWER1(TFL1)、FLORICAULA(FLO)、SQUAMOSA(SQUA)、FLOWERING LOCUS CA(FCA)お
よびこれらの組合せからなる群より選択されるポリペプチドをコードする外因性
遺伝子をさらに含む、請求項11記載の植物。
【請求項１５】構造遺伝子が制御核酸配列と機能的に結合されている、請
求項11記載の植物。
【請求項１６】制御核酸配列がプロモーターである、請求項15記載の植物
。
【請求項１７】プロモーターが構成プロモーターである、請求項16記載の
植物。
【請求項１８】プロモーターが誘導プロモーターである、請求項16記載の
植物。
【請求項１９】前記核酸が選択マーカーをさらに含む、請求項11記載の植
物。
【請求項２０】双子葉植物である、請求項11記載の植物。
【請求項２１】単子葉植物である、請求項11記載の植物。
【請求項２２】請求項11記載の植物に由来する植物細胞。
【請求項２３】請求項11記載の植物に由来する植物組織。
【請求項２４】少なくともFTコード化核酸配列を含む外因性核酸配列少な
くとも１つをゲノム中に含み、花の調節された発育を特徴とする植物へと生育す
べく発芽する種子。
【請求項２５】プロモーターと機能的に結合された、花の発育を調節する
ポリペプチドをコードする構造遺伝子少なくとも１つを含む核酸配列を含有する
ベクター。
【請求項２６】 T-DNA由来のベクターからなる、請求項25記載のベクター
。
【請求項２７】前記構造遺伝子がFTポリペプチドをコードする、請求項25
記載のベクター。
【請求項２８】 LEAFY(LFY)、APETALA1(AP1)、CONSTANS(CO)、TERMINAL FL
OWER1(TFL1)、FLORICAULA(FLO)、SQUAMOSA(SQUA)、FLOWERING LOCUS CA(FCA)お
よびこれらの組合せからなる群より選択されるポリペプチドをコードする構造遺
伝子をさらに含む、請求項27記載のベクター。
【請求項２９】プロモーターが構成プロモーターである、請求項25記載の
ベクター。
【請求項３０】プロモーターが誘導プロモーターである、請求項25記載の
ベクター。
【請求項３１】プロモーターが化学的手段により誘導される、請求項25記
載のベクター。
【請求項３２】植物細胞から作られた植物が、野生型植物と比較して、花
の発育が調節されていることを特徴とするように、植物細胞を遺伝的に改変する
方法であって、少なくとも請求項５記載のFTコード化ポリヌクレオチドを植物細胞に導入して
形質転換植物細胞を取得し、該形質転換植物細胞をFTポリペプチドの発現を可能とする条件下で生育させ、
それにより花の発育が調節された植物を作出する、ことを含んでなる、上記方法。
【請求項３３】前記調節が花の発育の促進である、請求項32記載の方法。
【請求項３４】前記調節が花の発育の抑制である、請求項32記載の方法。
【請求項３５】花の発育の促進が前記植物中のFTの発現または活性を誘導
することにより達成される、請求項33記載の方法。
【請求項３６】花の発育の促進が前記植物中のFTの発現または活性を増強
することにより達成される、請求項33記載の方法。
【請求項３７】 LFYの発現または活性を誘導することをさらに含む、請求
項35記載の方法。
【請求項３８】花の発育の抑制が前記植物中のFTの発現または活性を抑制
することにより達成される、請求項34記載の方法。
【請求項３９】前記抑制がFTアンチセンスまたはFT優性ネガティブ核酸配
列により達成される、請求項38記載の方法。
【請求項４０】花の発育の抑制がTFL1を過剰発現させるか、またはTFL1の
活性を増大させることにより達成される、請求項34記載の方法。
【請求項４１】 TFL1の発現または活性を増大させることをさらに含む、請
求項38記載の方法。
【請求項４２】花の早期発育を特徴とする遺伝的に改変された植物の作出
方法であって、植物細胞に、プロモーターと機能的に結合された、FTポリペプチドコード化構
造遺伝子を少なくとも含む核酸配列を含有するベクターを接触させて、形質転換
植物細胞を取得し、該形質転換植物細胞から植物を作出し、花の早期発育を示す植物を選択する、ことを含んでなる、上記方法。
【請求項４３】前記接触が物理的手段による、請求項42記載の方法。
【請求項４４】前記接触が化学的手段による、請求項42記載の方法。
【請求項４５】植物細胞がプロトプラスト、配偶子産生細胞、および全植
物へと再生する細胞からなる群より選択される、請求項42記載の方法。
【請求項４６】プロモーターが構成プロモーターである、請求項42記載の
方法。
【請求項４７】プロモーターが誘導プロモーターである、請求項42記載の
方法。
【請求項４８】請求項42記載の方法により作出された植物。
【請求項４９】請求項42記載の方法により作出された植物に由来する植物
組織。
【請求項５０】植物細胞において花の発育を調節する方法であって、植物細胞に請求項25記載のベクターを接触させて形質転換植物細胞を取得し、該形質転換植物細胞を、植物を形成させる条件下で生育させ、花の発育を促進させるのに十分な条件下および十分な期間で該植物の花の早期
発育を引き出す、ことを含んでなる、上記方法。
【請求項５１】開花期遺伝子（FT）の発現を破壊または妨害するトランス
ジーンが植物のゲノムの染色体に組み込まれている、遺伝的に改変された植物。
【請求項５２】花の晩期発育を特徴とする遺伝的に改変された植物の作出
方法であって、植物細胞に、プロモーターと機能的に結合された、FTポリペプチドの発現を破
壊または妨害する構造遺伝子を少なくとも含む核酸配列を含有するベクターを接
触させて、形質転換植物細胞を取得し、該形質転換植物細胞から植物を作出し、花の晩期発育を示す植物を選択する、ことを含んでなる、上記方法。
【請求項５３】花の晩期発育を特徴とする遺伝的に改変された植物の作出
方法であって、植物細胞に、プロモーターと機能的に結合されたFTアンチセンス核酸配列を含
有するベクターを接触させて、形質転換植物細胞を取得し、該形質転換植物細胞から植物を作出し、花の晩期発育を示す植物を選択する、ことを含んでなる、上記方法。
【請求項５４】配列番号３のヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸配
列。
【請求項５５】配列番号２のアミノ酸配列を有する、単離されたペプチド
。
【請求項５６】 FTの活性または発現に影響を与える化合物の同定方法であ
って、該化合物と、FTポリペプチドまたはFTポリペプチドを発現している組換え細胞
とを含む成分を、該成分の相互作用を可能とする条件下でインキュベートし、 FTの活性または発現に対する該化合物の効果を調べる、ことを含んでなる、上記方法。
【請求項５７】前記効果がFTの活性または発現の抑制である、請求項56記
載の方法。
【請求項５８】前記効果がFTの活性または発現の促進である、請求項56記
載の方法。