CN108239655A

CN108239655A - 提升水稻籽粒淀粉品质的方法

Info

Publication number: CN108239655A
Application number: CN201711499312.1A
Authority: CN
Inventors: 张国栋; 刘佳音; 米铁柱; 万吉丽; 王克响; 孙伟航
Original assignee: Qingdao Yuan Ce Biology Technology Co Ltd
Current assignee: Yuanmi Agricultural Technology Co ltd
Priority date: 2017-12-31
Filing date: 2017-12-31
Publication date: 2018-07-03

Abstract

本申请公开了一种提升水稻籽粒淀粉品质的方法，其重组载体构建，包括：(1)T4连接酶连接形成重组载体；(2)重组载体转化；(3)挑选连接正确的质粒转化农杆菌。(1)将带谷蛋白GluB‑1启动子Glb的质粒Puc18‑Glb酶切，分离回收目的片段，与酶切后的pCAMBIA1300上用T4连接酶连接形成中间载体，再将SBE1基因的cDNA片段酶切，分离回收目标片段，与酶切过中间载体用T4连接酶连接形成重组载体。本发明方法易行，操作简单，包括通过转基因方法融合基因转化水稻，获得转基因植株。

Description

提升水稻籽粒淀粉品质的方法

技术领域

本发明涉及分子生物学植物基因工程技术领域，特别涉及一种提升水稻籽粒淀粉品质的方法。

背景技术

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，全世界约有1/2的人口以其为主食。我国水稻育种长期偏重于提高产量，而忽视品质的改良与提高(黄发松等，1998)。随着社会的发展，工、农业对稻米品质的要求越来越高，品质育种已成为水稻育种的一个十分重要的方面。

稻米胚乳的主要成分是淀粉，因此淀粉的含量和性质直接影响稻米的品质。淀粉贮藏在由高度有序的葡萄糖多聚体构成的半晶体质体淀粉体中。

根据其结构不同，淀粉可分为直链淀粉(amylose)和支链淀粉 (amylopectin)。直链淀粉是以a-1，4糖苷键连接而成的线性多聚糖，而支链淀粉是由a-1，4糖苷键和a-1，6糖苷分支键连接而成的具有分支的多聚糖，约占淀粉组成的70％-80％(French，1984)。当稻米的直链淀粉含量高时，煮成的米饭较硬且无光泽，反之则柔软细腻。

稻米品质还与支链淀粉的精细结构和含量有关，直链淀粉含量相同时，支链淀粉结构不同，品质也有差异，如缺乏中等长度葡聚糖链分支的支链淀粉的水稻，糊化温度较低(Umemoto et al.，2002)。

目前人们对Wx基因的遗传调控机理已有深入研究，在该基因位点上至少存在3种复等位基因，即Wxa、Wxb、wx，分别存在于普通籼稻、粳稻和糯稻中。其中Wxb与Wxa相比，由于在第一内含子5’端剪切位点的碱基由G突变为T，使得剪切效率大大降低，从而成熟mRNA量降低，造成GBSS累积较少，进而影响直链淀粉的含量。

而wx则是由于在第二外显子的翻译起始位点下游108bp处比正常的籼、粳稻多了一个23bp的重复，从而在第2外显子的下游172bp处

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于，提供了一种改良水稻籽粒淀粉品质的方法。本发明方法易行，操作简单，包括通过转基因方法，将SBE1基因的一段cDNA片段和水稻籽粒专一性谷蛋白GluB-1启动子的融合基因转化水稻，获得转基因植株；结合聚合酶链式反应和分子杂交方法，生化分析方法等，在转基因植株后代中选育支链淀粉含量显著提高，单株产量不变或有提高的转基因株系，创造水稻改良品质新材料。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种提升水稻籽粒淀粉品质的方法，包括以下步骤：

A.重组载体构建；

B.转化农杆菌的建立；

C.获得独立转化植株；

D.选择纯合单株；

E.选留的纯合单株进行表型选择。

所述A.重组载体构建，进一步包括：

(1)T4连接酶连接形成重组载体；

(2)重组载体转化；

(3)挑选连接正确的质粒转化农杆菌。

所述步骤进一步包括：

(1)将带谷蛋白GluB-1启动子Glb的质粒Puc18-Glb酶切，分离回收目的片段，与酶切后的pCAMBIA1300上用T4连接酶连接形成中间载体，再将SBE1基因的cDNA片段酶切，分离回收目标片段，与酶切过中间载体用T4连接酶连接形成重组载体。

(2)将重组载体转化大肠杆菌感受态DH5α，在抗性培养基上挑选白色单菌落。

(3)将挑选的白色单菌落富集抽提DNA，酶切后电泳检测，挑选连接正确的质粒转化农杆菌EHA105。

所述B.转化农杆菌的建立，进一步包括：

(1)、诱导；

(2)、继代；

(3)、预培养；

(4)、农杆菌培养；

(5)、侵染；

(6)、筛选；

(7)、分化；

(8)、生根；

(9)、移栽。

所述B.转化农杆菌的建立，进一步包括：

(1)、诱导：将成熟的水稻种子去壳，然后依次用70％体积比的乙醇处理1min，2％浓度的次氯酸钠种子表面消毒15min；用灭菌水洗种子4-5 次；将种子放在粳稻诱导培养基上；将接种后的培养基放置于黑暗处培养 4周，温度26℃。

所述B.转化农杆菌的建立，进一步包括：

(2)、继代：挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于粳稻继代培养基上黑暗，26℃条件下培养2-3周。

所述B.转化农杆菌的建立，进一步包括：

(3)、预培养：挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于粳稻预培养基上黑暗，26℃条件下培养4-5天。

所述B.转化农杆菌的建立，进一步包括：

(4)、农杆菌培养：在带有卡那霉素抗性选择的PEB培养基上预培养农杆菌株两天，温度28℃；刮取农杆菌至悬浮培养基中悬浮培养，培养温度为28℃。

本发明有益效果包括：

在水稻籽粒中表达的SBE1基因的cDNA片段可以提高水稻籽粒支链淀粉含量，从而提高了水稻籽粒淀粉品质，同时，单株产量也有一定的提高；

本发明方法采用转基因方法提高水稻籽粒品质，改良周期短，效率高；

本发明方法可以直接应用于其他作物品质的改良实践；

将SBE1基因的一段cDNA片段和水稻籽粒专一性谷蛋白GluB-1启动子的融合基因转化水稻，获得转基因植株；结合聚合酶链式反应和分子杂交方法，生化分析方法等，在转基因植株后代中选育支链淀粉含量显著提高，方法易行，操作简便，单株产量不变或有提高的转基因株系，创造水稻改良品质新材料。本发明所产生的材料对促进人身体健康和预防疾病以及水稻的可持续性生产等具有极其重要的意义。

附图说明

图1为本发明实施例所述转化所用cDNA片段的核苷酸序列以及氨基酸序列图；该cDNA片段有455个碱基组成，编码95个氨基酸；

图2为本发明实施例所述T0代转基因植株阳性检测示意图；

第1泳道为分子量标记，第2泳道为阴性对照(野生型武育粳7号的扩增结果)，第3泳道为阳性对照(重组载体扩增结果)，第4-16泳道为部分T0代转基因植株扩增结果；

图3为本发明实施例所述Northern杂交检测T0代转基因植株导入基因片段的表达量示意图；

上排为rRNA，下排为各单株籽粒RNA与RNA杂交结果；

图4为本发明实施例所述Southern杂交检测基因整合的拷贝数示意图；其中，

左图为Southern杂交检测基因整合的拷贝数示意图：有3个为单拷贝转化株；

右图为Southern杂交检测基因整合的拷贝数示意图：有3个为单拷贝转化株。

具体实施方式

下面结合实施例详述本发明。为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚、明确，以下参照附图并举实施例对本发明进一步详细说明，但本发明并不局限于这些实施例。

本发明将SBE1基因的一段cDNA片段，用专一性谷蛋白GluB-1启动子驱动，转化水稻，使这段cDNA片段在水稻籽粒中特异表达，以提高水稻籽粒中支链淀粉的含量，改良水稻籽粒淀粉品质，创造水稻改良新材料。

A.重组载体构建；

B.转化农杆菌的建立；

C.获得独立转化植株；

D.选择纯合单株；

E.选留的纯合单株进行表型选择。

所述A.重组载体构建，进一步包括：

(1)T4连接酶连接形成重组载体；

(2)重组载体转化；

(3)挑选连接正确的质粒转化农杆菌。

所述步骤进一步包括：

所述B.转化农杆菌的建立，进一步包括：

(1)、诱导；

(2)、继代；

(3)、预培养；

(4)、农杆菌培养；

(5)、侵染；

(6)、筛选；

(7)、分化；

(8)、生根；

(9)、移栽。

所述B.转化农杆菌的建立，进一步包括：

一种改良水稻籽粒淀粉品质的方法，其步骤是：

SBE1基因的cDNA片段由455个碱基组成，编码95个氨基酸(图1)。将它与水稻籽粒专一性谷蛋白GluB-1启动子酶切连接到表达载体 pCAMBIA1300上(Cambia公司产品)，构建重组载体。

利用农杆菌(Takara公司产品)介导的转基因方法将重组载体导入水稻品种武育粳7号中，获得转基因植株；

利用聚合酶链式反应(PCR)对T0代转基因植株进行阳性检测，通过Northern杂交检测阳性转基因植株转入片段的表达，通过Southern杂交鉴定阳性转基因植株的整合拷贝数，选择含单考贝的转入片段、且正常结实的转基因植株，收获单株自交种子；

将步骤3选留的转基因植株的种子种成家系(T1代)，继续利用PCR 对T1代单株进行阳性检测，利用Northern杂交方法对阳性单株检测转入片段的表达，结合田间表现选择多个表现优良的转基因单株，自交留种；

继续种植步骤4中选留的目标单株成T2代家系，利用PCR对T2代单株进行阳性检测，对阳性单株进行农艺性状考察和水稻种子淀粉分析，从中选择表型稳定，淀粉品质和农艺性状有较大改善的纯合单株，自交留种；

对选留的纯合单株进行表型选择，培育新材料。

实施例1：重组载体的构建和转化农杆菌的建立：

(1)、将带谷蛋白GluB-1启动子(Glb)的质粒Puc18-Glb(根据EMBL 序列X5433314进行PCR扩增克隆到Puc18载体(Takara公司产品)上，方法参照Lee etal，2001，Constitutive and seed-specific expression of a maize lysine)用EcoRI和Hind III双酶切，分离回收目的片段，与用EcoRI和 Hind III双酶切后的pCAMBIA1300上(Cambia公司产品)用T4连接酶连接形成中间载体，再将SBE1基因的cDNA片段(序列见图1)用KpnI 和SacI双酶切，分离回收目标片段，与用KpnI和SacI双酶切过中间载体用T4连接酶连接形成重组载体，以上限制性内切酶(EcoRI、Hind III、KpnI 和SacI)和T4连接酶均购于Takara公司；

(2)、将重组载体转化大肠杆菌感受态DH5α(Takara公司产品)，在含X-Gal、IPTG和卡那霉素(上海生工公司产品)的抗性培养基上挑选白色单菌落；

(3)、将挑选的白色单菌落富集抽提DNA，用EcoRI和Hind III双酶切后电泳检测，挑选连接正确的质粒转化农杆菌EHA105(Takara公司产品)中，转化后的菌株命名为S1；

上述分子克隆方法及试剂配方参照J.萨姆布鲁克等，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，2002.

实施例2：农杆菌介导的遗传转化：

(1)、诱导：

将成熟的水稻品种武育粳7号种子去壳，然后依次用70％体积比的乙醇处理1min，2％浓度的次氯酸钠(NaClO)种子表面消毒15min；用灭菌水洗种子4-5次；将种子放在粳稻诱导培养基上；将接种后的培养基放置于黑暗处培养4周，温度26℃。

(2)、继代：

挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于粳稻继代培养基上黑暗，26℃条件下培养2-3周。

(3)、预培养：

挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于粳稻预培养基上黑暗，26℃条件下培养4-5天。

(4)、农杆菌培养：

在带有卡那霉素抗性(上海生工公司产品)选择的PEB培养基上预培养农杆菌株S1两天，温度28℃；刮取农杆菌至悬浮培养基中悬浮培养，培养温度为28℃。

(5)、侵染：

将预培养的愈伤转移至灭好菌的瓶子内；调节农杆菌S1的悬浮液至 OD6000.1-0.2；将预伤在农杆菌悬浮液中浸泡30min；转移预伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在粳稻共培养基上培养3天，温度20℃。

(6)筛选：

用灭菌水洗涤愈伤8遍；浸泡在含400mg/L羧苄青霉素(CN)(上海生工公司产品)的灭菌水中30min，转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；转移愈伤至含有250mg/L羧苄青霉素(CN)、50mg/L潮霉素(Roche公司产品)粳稻选择培养基上选择培养2-3次，每次2周。

(7)、分化：

将抗性愈伤转移至粳稻分化培养基上，26℃，光照条件下培养。

(8)生根：

剪掉再生分化苗时产生的根；然后将其转移至生根培养基中，26℃，光照下培养2-3周.

(9)、移栽：

洗掉再生跟上的残留培养基，移入钵中盆栽，同时在最初几天保持水分湿润，待植株存活健壮后移入大田。

实施例3：

取转基因植株叶片提取DNA，进行聚合酶链式反应(PCR)，PCR程序：94℃预变性5min；33个循环(94℃变性1min；55℃退火1min；72℃ 延伸2min，72℃延伸7min；)。

实施例4：检测阳性转化植株，能扩增出455bp大小条带的单株即为阳性转化单株(图2)。抽提阳性单株籽粒的RNA进行Northem杂交检测转入片段在籽粒中的表达，阳性单株的转入片段全部表达(图3)。抽提阳性单株DNA，分别用Sac I和Xba I(Takara公司产品)酶切，进行Southern 杂交鉴定阳性转化单株的片段整合拷贝数，得到3个单拷贝的独立转化植株(图4)。DNA抽提、RNA抽提、PCR反应体系、Southern和Northern 杂交等相关技术参照J.萨姆布鲁克等，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，2002。

实施例5：

将实施例4中选留的3个单株的种子种成T2代家系，继续利用PCR 方法(方法同实施例3)检测各家系中阳性单株，其中家系3和家系5已经纯合稳定(表1)。考察家系3和家系5的主要农艺性状并分析籽粒支链淀粉含量，从中选择3个支链淀粉含量提高且田间表现良好的纯合单株 (SPD1、SPD2和SPD3)。

表1 T2代阳性植株率(阳性植株数/检测植株数)

Line 3	Line 5	Line 11
			100％	100％	97.91％
48/48	48/48	47/48

主要农艺性状考察标准如下：

株高：收获前于田间测定单株最高穗颖尖距离地面的高度(，cm)；

每穗实粒数：每株选取3个大穗，计数每穗所有实粒数；

结实率：每穗实粒数除以每穗颖花数乘以100(％)；

单株产量：单株全部实粒重(g)

水稻支链淀粉提取、纯度测定参考GB7648287和何照范的方法进行，纯化后的支链淀粉测得纯度分别为97.89％。

米粉制备：取约25克稻谷在出糙机上脱壳，然后用国产JMJ-100型精米机碾米出精，再用旋风式粉碎机(Udy corporation，Colorado，USA) 将精米碎成粉，过100目筛后装入塑料袋封口，置于-20℃冰箱中保存备用。

测定步骤如下：

标准溶液配制：称取100.0mg支链淀粉纯品，放入100mL容量瓶中，加入 1mol/LNaOH溶液10mL，在热水中溶解后，取出，用蒸馏水定容至100mL，混匀，即为1mg/mL支链淀粉标准溶液。0、1、2、3、4、5mL，配置0、20、 40、60、80、100μg/mL的标准溶液系列。

1.选择直链、支链淀粉测定波长、参比波长。

直链淀粉取1mg/ml直链淀粉标准液1ml，放入50ml容量瓶中加蒸馏水

30m1，以0.1mol/L HCl溶液调至pH 3.5左右，加入碘试剂0.5ml，并以蒸馏水定容。静置20min以蒸馏水为空白。

支链淀粉取1mg/ml支链淀粉标准液1ml，放入50m1容量瓶中，以下操作同直链淀粉。在同一坐标内获得支链淀粉可见光波段吸收曲线。

确定直链淀粉和支链淀粉的测定波长、参比波长λ2、λ1、λ3和λ 4。

2.制作双波长直链淀粉标准曲线

吸取1mg/ml直链淀粉标准溶液0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.3ml分别放入6

只不同的50m1容量瓶中，加入蒸馏水30m1以0.1mol/L HCl溶液调至pH 3.5

左右，加入碘试剂0.5ml，并用蒸馏水定容。静置20min，以蒸馏水为空白。用1cm比色杯在λ1、λ2两波长下分别测定Aλ1，Aλ2即得△A直＝ Aλ2-Aλ1以△A直为纵坐标，直链淀粉含量mg为横坐标，制备双波长直链淀粉标准曲线。

3.制作双波长支链淀粉标准曲线

吸取1mg/ml支链淀粉标准溶液2.0，2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0ml 分别放入6只不同的5Oml容量瓶中。以下操作同直链淀粉。以蒸馏水为空白，用1cm

比色杯在λ3、λ4两波长下分别测定其Aλ3，Aλ4即得△A支＝A λ4-Aλ3。以△A支为纵坐标，支链淀粉含量mg为横坐标，制备双波长支链淀粉标准曲线。

4.样品中一直链淀粉、支链淀粉及总淀粉的测定

样品粉碎过60目筛，用乙醚脱脂，称取脱脂样品0.1g左右，精确至 lmg置于50ml容量瓶中。加0.5mol/L KOH溶液10ml，在沸水浴中加热 10min，取出以蒸馏水定容至50ml，若有泡沫采用乙醇消除，静置。吸取样品液2.5ml两份，即样品测定液和空白液，均加蒸馏水30ml，以0.1mol/L HCl溶液调至pH 3.5左右样品中加入碘试剂0.5m1，空白液不加碘试剂，然后均定容至50m1。静置20min以样品空白液为对照，用1cm比色杯分别测定λ2，λ1，λ4，λ3的吸收值Aλ4，Aλ1，Aλ2，Aλ3.得到△A直＝Aλ2-A λ1；△A支＝Aλ4-Aλ3.分别查两类淀粉的双波长标准曲线即可计算出脱脂样品中直链淀粉和支链淀粉含量。二者之和等于总淀粉含量。

直链淀粉(％)＝(X₁*50*100)/(2.5*m*1000)

支链淀粉(％)＝(X₂*50*100)/(2.5*m*1000)

X₁---查双波长直链淀粉标准曲线的样品液中直链淀粉的含量(mg)

X₂---查双波长支链淀粉标准曲线的样品液中支链淀粉的含量(mg)

m---样品质量(g)

实施例6：

把上代选择的纯合单株SPD1与对照野生型武育粳7号分别于2016 年6月和12月在东营和海南种植成家系，分析转基因植株和对照的籽粒支链淀粉含量(方法同实施例5)，与对照相比，家系SPD1在东营和海南种植时籽粒支链淀粉含量均提高了4％以上，直链淀粉含量均下降13％以上 (表2)。同时考察海南种植的转基因家系与对照的主要农艺性状(方法同实施例5)，与对照相比，株高无明显差异，而结实率、每穗实粒数和单株产量均有显著提高(表3)。

表2转基因家系SPD1与对照在东营和海南种植的直、支链淀粉含量分析(％)

注：增幅％＝(转基因家系-对照)/对照×100

表3 转基因家系SPD1与对照海南种植主要农艺性状表现

	株高(cm)	结实率(％)	每穗实粒数	单株产量(g)
					SPD1	95.0±2.6	93.5±2.5^**	117.6±2.7^**	29.3±3.0^**
CK	93.2±3.5	76.7±1.0	108.9±1.2	18.6±3.0

*，**，0.05和0.01水平的显著性

实施例7：

把上代选择的纯合单株SPD2与对照野生型武育粳7号分别于2016 年6月和12月在东营和海南种植成家系，分析转基因植株和对照的籽粒直、支链淀粉含量(方法同上实施例5)，与对照相比，家系SPD2在东营和海南种植籽粒支链淀粉含量均提高了3％以上，直链淀粉含量下降13％以上(表4)。同时考察海南种植的转基因家系与对照的主要农艺性状(方法同实施例5)，与对照相比，株高和每穗实粒数无明显差异，而结实率和单株产量均有显著提高(表5)。

表4 转基因家系SPD2与对照在海南种植的直、支链淀粉含量分析(％)

注：增幅％＝(转基因家系-对照)/对照×100

表5 转基因家系SPD2与对照海南种植主要农艺性状表现

	株高(cm)	结实率(％)	每穗实粒数	单株产量(g)
					SPD1	94.7±2.6	92.5±2.5^**	115.6±2.7	28.7±3.0^**
CK	94.2±3.5	75.7±1.0	112.9±1.2	17.9±3.0

*，**，0.05和0.01水平的显著性

实施例8：

把上代选择的纯合单株SPD3与对照野生型武育粳7号分别于2016 年6月和12月在东营和海南种植成家系，分析转基因植株和对照的籽粒直、支链淀粉含量(方法同实施例5)，与对照相比，家系SPD3在东营和海南种植籽粒支链淀粉含量分别提高了5.71％和4.33％，只是在海南种植的提高幅度比东营种植的小(表6)。同时考察海南种植的转基因家系与对照的主要农艺性状(方法同实施例5)，与对照相比，株高和结实率无明显差异，而每穗实粒数和单株产量均有显著提高(表7)。

表6 转基因家系SPD3与对照在海南种植的直、支链淀粉含量分析(％)

注：增幅％＝(转基因家系-对照)/对照×100

表7 转基因家系SPD3与对照海南种植主要农艺性状表现

	株高(cm)	结实率(％)	每穗实粒数	单株产量(g)
					SPD1	95.2±2.6	90.5±2.5	118.6±2.7^**	29.8±3.0^**
CK	93.8±3.5	89.7±1.0	96.9±1.2	17.9±3.0

*，**，0.05和0.01水平的显著性

本发明所用到的遗传转化的培养基及其配制的方法如下所述

(1)试剂和溶液缩写

本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下：

6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤)；

CN(Carbenicillin，羧苄青霉素)；

KT(Kinetin，激动素)；

NAA(Napthalene acetic acid，萘乙酸)；

IAA(Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸)；

2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-二氯苯氧乙酸)；

AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；

CH(Casein Enzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白)；

HN(Hygromycin B，潮霉素)；

DMSO(Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜)；

N6max(N6大量元素成分溶液)；

N6mix(N6微量元素成分溶液)；

MSmax(MS大量元素成分溶液)；

MSmix(MS微量元素成分溶液)

(，2)主要溶液配方

1)N6培养基大量元素母液(按照10倍浓缩液(10X)配制)：

将上述试剂逐一溶解，然后室温(20-25℃，以下相同)下用蒸馏水定容至1000毫升。

2)N6培养基微量元素母液(按照100倍浓缩液(100X)配制

将上述试剂在室温下溶解并用蒸馏水定容至1000毫升。

3)铁盐(Fe2EDTA)贮存液(按照100X浓缩液配制)

将3.73克乙二铵四乙酸二钠(Na2EDTA·2H2O)和2.78克FeSO4·7H2O 分别溶解，混合并用蒸馏水定容至1000毫升，至70℃温浴2小时，4℃ 保存备用。

4)维生素贮存液(按照100X浓缩液配制)

加蒸馏水定容至1000毫升，4℃保存备用。

5)MS培养基大量元素母液(MSmax母液)(按照10X浓缩液配制)

将上述试剂在室温下溶解，并用蒸馏水定容至1000毫升。

6)MS培养基微量元素母液(MSmin母液)(按照100X浓缩液配制)

将上述试剂在室温下溶解，并用蒸馏水定容至1000毫升。

7)2，4-D贮存液(1毫克/毫升)的配制：

秤取2，4-D 100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10 毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，于室温下保存。

8)6-BA贮存液(1毫克/毫升)的配制：

秤取6-BA 100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10 毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，室温保存。

9)萘乙酸(NAA)贮存液(1毫克/毫升)的配制：

秤取NAA 100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10 毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，4℃保存备用。

10)吲哚乙酸(IAA)贮存液(1毫克/毫升)的配制：

秤取IAA 100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，4℃保存备用。

11)葡萄糖贮存液(0.5克/毫升)的配制：

秤取葡萄糖125克，然后用蒸馏水溶解定容至250毫升，灭菌后4℃ 保存备用。

12)AS贮存液的配制：

秤取AS 0.392克，加入DMSO 10毫升溶解，分装至1.5毫升离心管内，4℃保存备用。

13)1N氢氧化钾贮存液

秤取氢氧化钾5.6克，用蒸馏水溶解定容至100毫升，室温保存备用。

(3)用于水稻遗传转化的培养基配方

1)诱导培养基

加蒸馏水至900毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至 1000毫升，分装到50毫升三角瓶(25毫升/瓶)，封口后按常规方法灭菌(例如121℃下灭菌25分钟，下述的培养基灭菌方法与本培养基的灭菌方法相同)。

2)继代培养基

加蒸馏水至900毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至 1000毫升，分装到50毫升三角瓶(25毫升/瓶)，封口，按上述方法灭菌。

3)预培养基

加蒸馏水至250毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口，按上述方法灭菌。使用前加热溶解培养基并加入5毫升葡萄糖贮存液和250微升AS贮存液，分装倒入培养皿中(25毫升/皿)。

4、)共培养基

加蒸馏水至250毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口，按上述方法灭菌。使用前加热溶解培养基并加入5毫升葡萄糖贮存液和250微升AS贮存液，分装倒入培养皿中(25毫升/每皿)。

5)悬浮培养基

加蒸馏水至100毫升，调节pH值到5.4，分装到两个100毫升的三角瓶中，封口，按上述方法灭菌。使用前加入1毫升无菌葡萄糖贮存液和 100微升AS贮存液。

6)选择培养基

加蒸馏水至250毫升，调节pH值到6.0，封口，按上述方法灭菌。使用前溶解培养基，加入250微升HN(50毫克/毫升)和400微升CN(250 毫克/毫升)分装倒入培养皿中(25毫升/皿)。(注：第一次选择培养基羧苄青霉素浓度为400毫克/升，第二次及以后选择培养基羧苄青霉素浓度为 250毫克/升)。

7)预分化培养基

加蒸馏水至250毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，封口，按上述方法灭菌。

使用前溶解培养基，250微升HN(50毫克/毫升)250微升CN(250毫克 /毫升)，分装倒入培养皿中(25毫升/皿)。

8)分化培养基

加蒸馏水至900毫升，1N氢氧化钾调节pH值到6.0。煮沸并用蒸馏水定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶(50毫升/瓶)，封口，按上述方法灭菌。

9)生根培养基

加蒸馏水至900毫升，用1N氢氧化钾调节pH值到5.8。煮沸并用蒸馏水定容至1000毫升，分装到生根管中(25毫升/管)，封口，按上述方法灭菌。

以上所述，仅是本发明的几个实施例，并非对本发明做任何形式的限制，虽然本发明以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于本发明技术方案保护范围内。

Claims

1.一种提升水稻籽粒淀粉品质的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A.重组载体构建；

B.转化农杆菌的建立；

C.获得独立转化植株；

D.选择纯合单株；

E.选留的纯合单株进行表型选择。

2.根据权利要求1所述提升水稻籽粒淀粉品质的方法，其特征在于，所述A.重组载体构建，进一步包括：

(1)T4连接酶连接形成重组载体；

(2)重组载体转化；

(3)挑选连接正确的质粒转化农杆菌。

3.根据权利要求2所述提升水稻籽粒淀粉品质的方法，其特征在于，所述步骤进一步包括：

4.根据权利要求2所述提升水稻籽粒淀粉品质的方法，其特征在于，所述步骤进一步包括：

5.根据权利要求2所述提升水稻籽粒淀粉品质的方法，其特征在于，所述步骤进一步包括：

6.根据权利要求1～5中任一项所述提升水稻籽粒淀粉品质的方法，其特征在于，所述B.转化农杆菌的建立，进一步包括：

(1)、诱导；

(2)、继代；

(3)、预培养；

(4)、农杆菌培养；

(5)、侵染；

(6)、筛选；

(7)、分化；

(8)、生根；

(9)、移栽。

7.根据权利要求6所述提升水稻籽粒淀粉品质的方法，其特征在于，所述B.转化农杆菌的建立，进一步包括：

(1)、诱导：将成熟的水稻种子去壳，然后依次用70％体积比的乙醇处理1min，2％浓度的次氯酸钠种子表面消毒15min；用灭菌水洗种子4-5次；将种子放在粳稻诱导培养基上；将接种后的培养基放置于黑暗处培养4周，温度26℃。

8.根据权利要求6所述提升水稻籽粒淀粉品质的方法，其特征在于，所述B.转化农杆菌的建立，进一步包括：

9.根据权利要求6所述提升水稻籽粒淀粉品质的方法，其特征在于，所述B.转化农杆菌的建立，进一步包括：

10.根据权利要求6所述提升水稻籽粒淀粉品质的方法，其特征在于，所述B.转化农杆菌的建立，进一步包括：