CN104561037B - 人工改造的能提高植物耐盐性和抗旱性的基因GsDREB2-mNRD - Google Patents

Abstract

人工改造的能提高植物耐盐性和抗旱性的基因GsDREB2‑mNRD，属于遗传工程技术领域，其特征在于GsDREB2基因内部存在着具有抑制GsDREB2转录激活功能和与DRE元件结合功能的负向调节结构域NRD；人工改造GsDREB2基因，使NRD结构域缺失，改造后基因命名为GsDREB2‑mNRD，其碱基组成Seq ID No:3所示。GsDREB2‑mNRD基因超量表达拟南芥的耐盐和干旱能力较GsDREB2基因超量表达拟南芥高。

Description

人工改造的能提高植物耐盐性和抗旱性的基因GsDREB2-mNRD

技术领域

本发明涉及一种人工改造的能提高植物耐盐性和抗旱性的基因GsDREB2-mNRD，属于遗传工程技术领域。

背景技术

DREBs/CBF（Dehydration Responsive Element Binding protein, 脱水应答元件结合蛋白；CBF-repeat binding factor, C-repeat元件结合因子）类转录因子与DRE/C-repeat元件在胁迫基因表达方面为我们呈现了一个重要的转录调控系统。分析表明，这些转录因子基因的表达与不同的生理条件相关。例如，DREB1A、B、C/CBF1、2、3被低温诱导，DREB1A、DREB1D/CBF4、DREB2A和DREB2B被盐和干旱诱导，DREB1F被盐诱导，而DREB1E受ABA（abscisic acid，脱落酸）诱导。拟南芥中一些胁迫诱导基因如rd29A、Cor6.6、Corl5a和Kinl等都被DREBs/CBFs诱导表达，它们的启动子中均含有DRE/C-repeat元件。Seki等人鉴定出6个新基因，它们的启动子中同时含有DRE/C-repeat和ABRE元件，意味着这些基因可能既存在于胁迫反应的ABA依赖途径中，又存在于ABA不依赖途径中。Liu等从干旱处理的拟南芥cDNA文库中克隆到2个与DRE元件结合，在干旱、高盐胁迫下调控报道基因GUS（β-glucuronidase，β-葡萄糖苷酸酶）表达的基因，定名为DREB2A 和DREB2B 。它们受干旱和高盐诱导表达，为干旱和高盐应答基因，如用干旱或高盐(250mmol/L NaCl)进行胁迫处理，15min内，DREB2A和DREB2B基因即可被快速强烈诱导表达，尤其在植物根部，但是，这两个基因不受外源ABA的诱导。

在DREB转基因植物中，DREB转录因子基因的过量表达可以激活靶基因的表达，提高植物对低温、干旱等逆境的忍耐力。Liu等研究转入35S∶DREB1Ab 和35S∶DREB1Ac的转基因拟南芥，将植株在-6℃处理2天，再恢复正常温度生长，结果对照野生型植株全部死亡，而转入35S∶DREB1Ab和35S∶DREB1Ac的植株的存活力分别为19%和17%。检测对干旱的忍耐力时，对植株作2周不浇水处理，结果对照野生型植株全部死亡，而转入35S∶DREB1Ab和35S∶DREB1Ac的植株再恢复浇水后分别有19%和14%的存活。Dubouzet等和Qin等分别将克隆的水稻OsDREB1A cDNA，玉米ZmDREB1A cDNA转入拟南芥，结果转基因拟南芥对低温、干旱和高盐的忍耐力大大高于野生型拟南芥。2005年，陈受益等在大豆中分离到了3个DREB基因，分别为GmDREBa、GmDREBb、GmDREBc，并推断该3个基因均能应答非生物胁迫。王巧燕等从大豆耐盐品种中克隆了一个新的DREB 基因GmDREB2。并通过拟南芥、烟草验证基因的功能。在后续的研究中发现，该基因提高了转基因拟南芥对干旱和高盐的抗性，并且，过量表达该基因的转基因烟草，在干旱条件下，自由脯氨酸的含量较对照明显提高。该研究表明，该基因在转录激活中起到重要的作用，并能够促进植物对非生物胁迫的抗性，可以应用于非生物胁迫基因工程中，有效地提高作物的耐逆性。2008年，马有志等又分离到大豆GmDREB3基因，在研究中还发现，该基因在组成型启动子的调控下，转基因植株的生长受到抑制，而使用Rd29A启动子则不影响转基因植株的生长。

DREB转录因子的研究已较为深入，但是对该转录因子上游的调控机理并不十分清楚，对该转录因子激活、结合及其它结构的功能也还有欠缺。在研究中发现，拟南芥DREB2A转录因子的内部存在一个负向调节结构域（negative regulatory domain, NRD），该结构域的存在影响着DREB2A转录因子的结合和激活功能，并且研究发现，该结构域的缺失可以提高植物对干旱的耐受性（Sakuma Y, Maruyama K, Osakabe Y, Qin F, Seki M,Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K. Functional analysis of an Arabidopsistranscription factor, DREB2A, involved in drought-responsive gene expression.Plant Cell, 2006,18(5):1292-309）。本研究室克隆了野生大豆的GsDREB2基因（野生大豆DREB基因的筛选与结合功能分析，哈尔滨工业大学学报，2009，41(9):198-200；野生大豆DREB基因cDNA的克隆与分析,草业科学，2009，26(8):17-23），并深入的研究了该基因的功能。但是在进行超量表达GsDREB基因拟南芥和烟草的耐盐和干旱胁迫试验时发现，该基因并没有明显的使转基因拟南芥或烟草的耐逆性提高，鉴于以上的研究，提出这样的疑问，GsDREB2基因内部是否也存在着负向调节结构域，该结构域的存在是否也影响着GsDREB2基因的调节功能呢？通过实验我们发现来源于野生大豆的GsDREB2基因内部含有NRD，该结构域具有抑制DREB转录因子与DRE元件结合的特性，同样也抑制转录激活功能。如何改造GsDREB2基因并将人工改造的GsDREB2-mNRD基因转化拟南芥，用于提高拟南芥的耐盐性和抗旱性成为急需解决的一大难题。所以，发明一种人工改造的能提高植物耐盐性和抗旱性的基因GsDREB2-mNRD（m：mutant）是必要的。

发明内容

为了克服如何改造GsDREB2基因并将人工改造的GsDREB2-mNRD基因转化拟南芥，用于提高拟南芥的耐盐性和抗旱性的难题，本发明提供了一种人工改造的能提高植物耐盐性和抗旱性的基因GsDREB2-mNRD，该人工改造的能提高植物耐盐性和抗旱性的基因GsDREB2-mNRD利用对GsDREB2基因进行改造，使NRD结构域缺失，将人工改造的GsDREB2-mNRD基因转化拟南芥，可以达到提高拟南芥的耐盐性和抗旱性目的。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

本发明的人工改造的能提高植物耐盐性和抗旱性的基因GsDREB2-mNRD，其特征在于GsDREB2基因内部存在着具有抑制GsDREB2转录激活功能和与DRE元件结合功能的负向调节结构域NRD；人工改造GsDREB2基因，使NRD结构域缺失，改造后基因命名为GsDREB2-mNRD（Seq ID No:3）。

所述的NRD结构域的预测是用拟南芥AtDREB2A基因（At5g05410）与GsDREB2基因的氨基酸序列进行序列比对，确定GsDREB2基因的结构域区域，选择AP2结构域（即转录因子与DNA结合的结构区区域）和转录激活区域之间的丝氨酸(Ser)苏氨酸(Thr)富集区域（GsDREB2全长基因140-204 aa）做为预测的NRD区域。根据预测的NRD位点，设计不同缺失片段扩增的引物序列，并添加相应的酶切位点，以便于构建转录激活和转录结合的载体pGBKT7与pGADT7-Rec2。

所述的不同缺失片段于DRE元件结合能力的分析，首先构建4 mer DRE报告载体：以CCGAC为核心序列（DRE元件的核心序列），进行4次重复，核心元件之间以ATGAGTATACTA间隔，合成双链4 mer DRE元件序列，分别为DRE(+)和DRE(-)，并且为了便于连接到pHIS2报告载体（酵母单杂交用的报告载体，Invitrogen 公司商业化载体）上，在上下游分别加Eco RI和Sac I 限制性酶切识别序列，分别是GAATTC和GAGCTC。合成的序列为（DRE(+)：Seq IDNo:911和DRE(-)：Seq ID No:12）。各取20 ul 浓度为1ug/uL的DRE(+)和DRE(-)，混匀，在70℃下退火，得到约80bp的片段，上下游分别是Eco R I和Sac I的粘性末端。将此混合物与经过Eco R I和Sac I酶切过的pHIS2报告载体连接。转化大肠杆菌，提取阳性克隆质粒DNA，进行酶切鉴定，并对插入片段的阳性克隆进行测序。经测序得到含转录因子DREB与DRE顺式作用元件结合的DNA核心元件序列的双链DNA片段的重组报告载体，命名为pHIS2-DRE。按照同样的方法，构建4 mer 突变的DRE报告载体做为对照，除核心序列改为TTTTT外，其方法同上。将构建后的报告阴性对照载体命名为pHIS2-mDRE。

其次分析不同缺失片段的结合能力：将重组的报告载体pHIS2-DRE转化酵母Y187(MATa, ura3-52, his3-200, ade2-101, trp1-901, leu2-3, 112, gal4Δ, gal80Δ,met-, URA3:: GAL1UAS-Gal1TATA-LacZ MEL1)，得到整合有pHIS2-DRE的酵母菌株Y187/pHIS2-DRE，再分别把不同缺失片段连接pGADT7（酵母单杂交用的报告载体，Invitrogen 公司商业化载体）的质粒转化重组酵母Y187/pHIS2-DRE，涂布Leu^-/Trp^- （亮氨酸、色氨酸缺陷）平板，在28℃下培养3-5天。通过PCR检测的方法筛选同时含有2个质粒的阳性克隆。不同缺失片段的阳性克隆，在40 mmol/L 3-AT（3-amino-1,2,3-triazole, 3-氨基-1,2,4-三氮唑）和HIS^-/Leu^-/Trp^- （组氨酸、亮氨酸、色氨酸缺陷）3种氨基酸缺陷的培养基上划线，28℃培养3-5天。具有结合能力的重组酵母Y187/pHIS2-DRE能够生长，并且菌落直径大于2mm，不具有结合能力的生长受到抑制，菌落直径都小于1mm。提高3-AT的浓度，60mmol/L，80mmol/L，提高浓度，酵母菌的生长速度和大小差异更为明显。为了定性和定量的测算结合能力的大小，借助Image J图形分析软件，通过菌的浓度间接衡量结合能力的差异。具体做法如下：将在为Leu^-/Trp^- （平板上生长并鉴定阳性克隆的酵母菌，在液体Leu^-/Trp^-培养基振荡培养，并通过测定菌的OD值，基本调平菌液的浓度。菌液分别进行10倍，100倍，1000倍稀释，将稀释的菌液1ul 滴在含有60 mmol/L，80 mmol/L 3-AT 和HIS^-/Leu^-/Trp^- 3缺的培养基上，28℃培养2-3天。重复3次，分别在3个相同的平板上，按照相同的顺序点样。待菌落出现后，在同一照相模式和光线情况下照相，尽量保证图片的明暗度基本一致。使用Image J图形分析软件，调整一致的对比度，选择一样的菌落大小面积，对菌液的浓度进行分析。结果显示，AP2 结构域为GsDREB2转录因子与DRE元件结合的关键元件，只要该结构域完整，该基因就具有转录因子结合的功能。但是NRD区域的存在会抑制该基因的结合强度，在低菌液浓度高3-AT浓度下，差异更为明显，NRD结构域的存在与全长基因一样，都具有较低的结合强度，而只含有AP2结构域和NRD缺失的情况下，则具有较高的结合强度。证明GsDREB2在酵母体内具有与DRE元件核心序列（CCGAC）的结合特性，NRD结构域的存在抑制GsDREB2转录因子与DRE元件结合，改造的GsDREB2-mNRD基因具有更强的与DRE元件结合的能力。

所述的测定及分析不同缺失片段转录激活活性，将GsDREB2不同缺失的片段，按照图2和表1所示将不同片段克隆到酵母表达载体pGBKT7(Trp⁺)（酵母杂交用转录激活载体，Invitrogen 公司商业化载体）中，得到重组酵母表达载体，然后采用小量LiAc/PEG （醋酸锂/聚乙二醇）法将不同片段连接的pGBKT7，分别转化酵母菌株Y189，涂布于SD/-Trp培养基上，28℃培养3-5天。利用PCR鉴定，得到阳性转化子。将各阳性转化子在SD/-Trp培养基上划线。培养出菌落后，将重组酵母细胞采用滤纸影印法影印到Whatman滤纸上，将滤纸放入液氮中15s，然后恢复到室温使细胞裂解，然后将滤纸浸润在2.5mL Z-buffer/X-GAL溶液中，30℃培养观察蓝白斑。其中，Z-buffer（pH7.0）主要成分为Na₂HPO₄.7H₂O 16.1g/L，NaH₂PO₄.H₂O 5.50g/L，KCl 0.75 g/L，MgSO₄.7H₂O 0.246g/L。Z-buffer/X-GAL溶液的主要成分为20mL Z-buffer，0.054mL β-巯基乙醇，67µL 20mg/mL X-GAL（ 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）。结果显示，全长GsDREB2基因具有较NRD结构域缺失的改造的GsDREB2-mNRD基因更弱的激活活性。在定性分析的基础上，使用CPRG（chlorophenol red-b-D-galactopyranoside，氯酚红-β-D-半乳吡喃糖苷）做为底物，进行激活活性的定量分析。具体方法如下：阳性克隆在5ml SD/-Trp液体培养基振荡培养过夜。吸取2ml酵母菌液，8ml YPD培养基，30°C振荡（230–250 rpm）培养3-5小时，直至OD₆₀₀达到0.5–0.8，涡旋菌体，测定OD₆₀₀值。吸取菌液1.5ml分别放在3个1.5-ml离心管中，14,000 rpm (16,000 x g)离心30秒，去上清，加入1ml Buffer 1（缓冲液1）重悬菌体。14,000 rpm (16,000 x g)离心30秒，去除上清，加入300 ml Buffer 1。吸取0.1 ml 重悬液到新的离心管中，将离心管放入液氮中速冻0.5–1 min，再迅速转移到37°C水浴0.5–1min。重复液氮冷冻和水浴2次。每个离心管加入0.7 ml Buffer 2，混合均匀。记录加入Buffer 2的时间，为起始时间。1 ml Buffer 2 （缓冲液2）为溶液加入另外的离心管中，做为空白对照。当离心管中液体的颜色转变为红色，加入0.5 ml 3.0 mM ZnCl₂ 终止颜色反应，记录终止时间。14,000 rpm 离心 1 min，用上清液测吸光值。利用空白对照调零，测定样品的OD₅₇₈ （OD₅₇₈ 值在0.25-1.8为实验的线性范围）。按照如下公式计算β-galactosidase （β-半乳糖苷酶）的活性（Miller, J. H.，1972.)：

结果与定性的结果基本相一致，激活结构域对于转录因子的激活是必须的，没有该区域的缺失片段，虽具有结合功能，但是却没有激活功能。但是NRD区域的存在，对于GsDREB2转录因子的激活具有较明显的抑制作用，改造的GsDREB2-mNRD基因则具有较全长基因更强转录激活活性。

所述的构建GsDREB2-mNRD与GsDREB2-FL基因植物表达载体，以pBI121为载体基本骨架，利用原始载体上EcoRI和Pst I 酶切位点，将Gus基因切除，替换为GsDREB2-mNRD或GsDREB2-FL，分别构建植物表达载体。该表达载体以Npt-II基因作为植物筛选标记基因，受CaM35S组成型启动子调控。将重组质粒转化根癌农杆菌LBA4404，并进行PCR鉴定。

所述的GsDREB2-mNRD与GsDREB2-FL基因转化拟南芥，首先制备农杆菌菌液：将农杆菌接种于添加卡那霉素100mg/L、链霉素50 mg/L、利福平50mg/L的YEB固体培养基上，28℃暗培养，至长出单菌落。用接菌环挑取单菌落，接种在5mL含相应抗生素的YEB液体培养基中，于28℃，200r/min 培养36~48h，待菌液长至OD₆₀₀为0.4 ~ 0.6时，将其按1：10的比例接种到新鲜的含相应抗生素的YEB液体培养基中，振荡培养5~6h，进行二次活化。当OD₆₀₀为0.5~ 0.6 时，吸取菌液于无菌离心管中，3000 r/min离心10min，去上清，重悬于500 ml 5%蔗糖溶液（含0.02% silwet-77（表面活性剂，GE公司产品））中备用。其次遗传转化拟南芥：1)拟南芥的培养：将拟南芥种子（哥伦比亚生态型）4℃春化3-7d后，播种于营养钵中（营养土，君子兰土，蛭石按1：1：1混合），置于温室中培养（22℃，光照16h/天），待拟南芥抽出出生苔后，剪去出生苔，待其抽出更多的次生苔且花开较盛时，可用于下述转化。2) 转化拟南芥：将已经结夹的花蕾剪掉，把花序倒置浸入步骤2）所得的含有重组农杆菌的蔗糖溶液中30秒，转化完毕后，将植株套上塑料袋保湿，水平放置于低光强度下生长24h，即可正常培养。一周后，重复侵染一次，可提高转化效率。3) 收集种子进行筛选：将侵染后所收集的种子进行消毒春化后，播种于含有25mg/L潮霉素的1/2MS固体培养基上。待种子萌发后，将绿色的阳性植株（T₀代）移栽至营养钵（营养土，君子兰土，蛭石按1：1：1混合）中培养，并收集种子进行T₁代筛选。

所述的比较转基因拟南芥耐盐性和抗旱性，首先抗盐实验：选取饱满的野生型拟南芥（哥伦比亚生态型）和超量表达拟南芥种子，用5%次氯酸钠消毒液消毒10min后，于4℃春化3-7d，播种于含有125 mmol/L NaCl 的1/2MS固体培养基上，两周后观察表型。结果显示，GsDREB2 和GsDREB2-mNRD超量表达拟南芥幼苗在盐胁迫条件下萌发率都高于未转基因的对照，并且转GsDREB2-mNRD基因植株的耐盐性较转GsDREB2基因拟南芥要强。说明NRD区域的缺失，增强了转录因子与DRE结合的强度，提高了转录因子的激活活性，使转基因植株的耐盐性增强。其次抗旱胁迫实验：选取饱满的野生型拟南芥（哥伦比亚生态型）和2种基因超量表达拟南芥种子，用5%次氯酸钠消毒液消毒10min后，于4℃春化3-7d，播种于含有250mmol/L甘露醇的1/2MS固体培养基上，两周后观察表型。结果显示，GsDREB2和GsDREB2-mNRD超量表达拟南芥幼苗在模拟干旱胁迫条件下萌发率都高于未转基因的对照，并且转GsDREB2-mNRD基因植株的抗旱性较转GsDREB2基因拟南芥要强。说明NRD区域的缺失，增强了转录因子与DRE结合的强度，提高了转录因子的激活活性，使转基因植株的抗旱性增强。

本发明的有益效果为：人工改造的能提高植物耐盐性和抗旱性基因GsDREB2-mNRD的发现：①GsDREB2基因内部存在着由74个富含Ser和Try氨基酸的负向调节结构域（negative regulatory domain, NRD）；②NRD区域的存在抑制了GsDREB2转录激活功能和与DRE元件结合功能；③人工改造GsDREB2基因，使NRD结构域缺失，改造后基因命名为GsDREB2-mNRD（Seq ID No:3），构建植物表达载体；④GsDREB2-mNRD基因的超量表达拟南芥的耐盐和干旱能力较GsDREB2基因超量表达拟南芥高。

附图说明

下面结合附图对本发明进一步说明。

图1为人工改造的能提高植物耐盐性和抗旱性的基因GsDREB2-mNRD的GsDREB2NRD区域设计图。

图2为人工改造的能提高植物耐盐性和抗旱性的基因GsDREB2-mNRD的GsDREB2基因缺失片段的设计图。

图3为人工改造的能提高植物耐盐性和抗旱性的基因GsDREB2-mNRD的GsDREB2基因DNA序列图（Seq ID No:1）。

图4为人工改造的能提高植物耐盐性和抗旱性的基因GsDREB2-mNRD的NRD结构域DNA序列图（Seq ID No:2）。

图5为人工改造的能提高植物耐盐性和抗旱性的基因GsDREB2-mNRD的经改造的GsDREB-mNRD基因的DNA序列图（Seq ID No:3）。

图6为人工改造的能提高植物耐盐性和抗旱性的基因GsDREB2-mNRD GsDREB2各片段转录激活活性图.

图7为人工改造的能提高植物耐盐性和抗旱性的基因GsDREB2-mNRD的验证GsDREB2各片段与DRE元件结合能力的60mM3-AT酵母菌的生长情况图。

图8为人工改造的能提高植物耐盐性和抗旱性的基因GsDREB2-mNRD的验证GsDREB2各片段与DRE元件结合能力的80mM3-AT酵母菌的生长情况图。

图9为人工改造的能提高植物耐盐性和抗旱性的基因GsDREB2-mNRD的FL-GsDREB2与经改造的GsDREB2-mNRD植物表达载体结构示意图。

图10为人工改造的能提高植物耐盐性和抗旱性的基因GsDREB2-mNRD的转FLDREB2和GsDREB2-mNRD基因拟南芥幼苗耐盐性及抗旱性比较图。

图中，1.未处理的拟南芥幼苗，2.含有125 mM NaCl 的1/2MS固体培养基培养的拟南芥幼苗，3.含有250mM甘露醇的1/2MS固体培养基培养的拟南芥幼苗，4.未转基因的对照，5.转GsDREB2-mNRD基因的拟南芥幼苗，6.转FLDREB2基因的拟南芥幼苗，7.拟南芥幼苗。

具体实施方式

在本说明书的上下文中，除非特别指明否则本说明书所用的任何术语具有本领域技术人员在本领域中通常理解的含义，而未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。

实施例一

1. NRD结构域的预测及各片段克隆载体构建

根据文献（Sakuma Y, Maruyama K, Osakabe Y, Qin F, Seki M, Shinozaki K,Yamaguchi-Shinozaki K. Functional analysis of an Arabidopsis transcriptionfactor, DREB2A, involved in drought-responsive gene expression. Plant Cell,2006,18(5):1292-309），用拟南芥AtDREB2A基因（At5g05410）与GsDREB2基因的氨基酸序列进行序列比对，确定GsDREB2基因的结构域区域，选择AP2结构域和转录激活区域之间的Ser和Try氨基酸富集区域（140-204 aa ）。

根据预测的NRD位点，设计不同缺失片段扩增的引物序列，并添加相应的酶切位点，以便于构建转录激活和转录结合的载体 pGBKT7与pGADT7-Rec2。不同缺失片段的设计引物序列如下。选择合适的限制性内切酶识别位点序列，并保证所编码的氨基酸不改变，并按照表1中所述进行构建。

表1： 各缺失扩增的引物序列及构建方法

2.不同缺失片段于DRE元件结合能力的分析

（1）4 mer DRE及4 mer mutant DRE（mDRE）报告载体的构建

以CCGAC为核心序列，进行4次重复，核心元件之间以ATGAGTATACTA间隔，合成4mer DRE元件序列，并且为了便于连接到pHIS2报告载体上，在上下游分别加Eco R I和Sac I 限制性酶切识别序列，分别是GAATTC和GAGCTC。合成的序列为（Seq ID No:11和Seq IDNo:12）。

各取20 ul 浓度为1ug/uL的DRE(+)和DRE(-)，混匀，在70℃下退火，得到约80bp的片段，上下游分别是Eco R I和Sac I的粘性末端。将此混合物与经过Eco R I和Sac I酶切过的pHIS2报告载体连接。转化大肠杆菌，提取阳性克隆质粒DNA，进行酶切鉴定，并对插入片段的阳性克隆进行测序。经测序得到含转录因子DREB与DRE顺式作用元件结合的DNA核心元件序列的双链DNA片段的重组报告载体，命名为pHIS2-DRE。按照同样的方法，构建4 mer突变的DRE报告载体做为对照，除核心序列改为TTTTT外，其方法同上。将构建后的报告阴性对照载体命名为pHIS2-mDRE。

（2）不同缺失片段结合能力分析

将重组的报告载体pHIS2-DRE转化酵母Y187(MATa, ura3-52, his3-200, ade2-101, trp1-901, leu2-3, 112, gal4Δ, gal80Δ, met-, URA3:: GAL1UAS-Gal1TATA-LacZ MEL1)，得到整合有pHIS2-DRE的酵母菌株Y187/pHIS2-DRE，再分别把不同缺失片段连接pGADT7的质粒转化重组酵母Y187/pHIS2-DRE，涂布Leu^-/Trp^- 平板，在28℃下培养3-5天。通过PCR检测的方法筛选同时含有2个质粒的阳性克隆。不同缺失片段的阳性克隆，在40mmol/L 3-AT和HIS^-/Leu^-/Trp^- 3缺的培养基上划线，28℃培养3-5天。具有结合能力的重组酵母Y187/pHIS2-DRE能够生长，并且菌落直径大于2mm，不具有结合能力的生长受到抑制，菌落直径都小于1mm。提高3-AT的浓度，60mmol/L，80mmol/L，提高浓度，酵母菌的生长速度和大小差异更为明显。为了定性和定量的测算结合能力的大小，借助Image J图形分析软件，通过菌的浓度间接衡量结合能力的差异。具体做法如下：将在为Leu^-/Trp^-平板上生长并鉴定阳性克隆的酵母菌，在液体-/Leu-/Trp-培养基振荡培养，并通过测定菌的OD值，基本调平菌液的浓度。菌液分别进行10倍，100倍，1000倍稀释，将稀释的菌液1ul 滴在含有60mmol/L，80 mmol/L 3-AT 和HIS^-/Leu^-/Trp^- 3缺的培养基上，28℃培养2-3天。重复3次，分别在3个相同的平板上，按照相同的顺序点样。待菌落出现后，在同一照相模式和光线情况下照相，尽量保证图片的明暗度基本一致。使用Image J图形分析软件，调整一致的对比度，选择一样的菌落大小面积，对菌液的浓度进行分析。

结果显示，AP2 结构域为GsDREB2转录因子与DRE元件结合的关键元件，只要该结构域完整，该基因就具有转录因子结合的功能。但是NRD区域的存在会抑制该基因的结合强度，在低菌液浓度高3-AT浓度下，差异更为明显，NRD结构域的存在与全长基因一样，都具有较低的结合强度，而只含有AP2结构域和NRD缺失的情况下，则具有较高的结合强度。证明GsDREB2在酵母体内具有与DRE元件核心序列（CCGAC）的结合特性，NRD结构域的存在抑制GsDREB2转录因子与DRE元件结合，改造的GsDREB2-mNRD基因具有更强的与DRE元件结合的能力。

3.不同缺失片段转录激活活性测定及分析

将GsDREB2不同缺失的片段，按照图2和表1所示将不同片段克隆到酵母表达载体pGBKT7(Trp)中，得到重组酵母表达载体，然后采用小量LiAc/PEG 法将不同片段连接的pGBKT7，分别转化酵母菌株Y189，涂布于SD/-Trp培养基上，28℃培养3-5天。利用PCR鉴定，得到阳性转化子。将各阳性转化子在SD/-Trp培养基上划线。培养出菌落后，将重组酵母细胞采用滤纸影印法影印到Whatman滤纸上，将滤纸放入液氮中15s，然后恢复到室温使细胞裂解，然后将滤纸浸润在2.5mL Z-buffer/X-GAL溶液中，30℃培养观察蓝白斑。其中，Z-buffer（pH7.0）主要成分为Na₂HPO₄.7H₂O 16.1g/L，NaH₂PO₄.H₂O 5.50g/L，KCl 0.75 g/L，MgSO₄.7H₂O 0.246g/L。Z-buffer/X-GAL溶液的主要成分为20mL Z-buffer，0.054mL β-巯基乙醇，67µL 20mg/mL X-GAL 盐溶液。结果显示，全长GsDREB2基因具有较NRD结构域缺失的改造的GsDREB2-mNRD基因更弱的激活活性。

在定性分析的基础上，使用CPRG（chlorophenol red-b-D-galactopyranoside）做为底物，进行激活活性的定量分析。具体方法如下：

阳性克隆在5ml SD/-Trp液体培养基振荡培养过夜。吸取2ml酵母菌液，8ml YPD培养基，30°C振荡（230–250 rpm）培养3-5小时，直至OD₆₀₀达到0.5–0.8，涡旋菌体，测定OD₆₀₀值。吸取菌液1.5ml分别放在3个1.5-ml离心管中，14,000 rpm (16,000 x g)离心30秒，去上清，加入1ml Buffer 1重悬菌体。14,000 rpm (16,000 x g)离心30秒，去除上清，加入300 ml Buffer 1。吸取0.1 ml 重悬液到新的离心管中，将离心管放入液氮中速冻0.5–1min，再迅速转移到37°C水浴0.5–1 min。重复液氮冷冻和水浴2次。每个离心管加入0.7 mlBuffer 2，混合均匀。记录加入Buffer 2的时间，为起始时间。1 ml Buffer 2 为溶液加入另外的离心管中，做为空白对照。当离心管中液体的颜色转变为红色，加入0.5 ml 3.0 mMZnCl₂ 终止颜色反应，记录终止时间。14,000 rpm 离心 1 min，用上清液测吸光值。利用空白对照调零，测定样品的OD₅₇₈ （OD₅₇₈ 值在0.25-1.8为实验的线性范围）。按照如下公式计算b-galactosidase 的活性（Miller, J. H. (1972) Experiments in MolecularGenetics Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY；.Miller, J. H.(1992) In A Short Course in Bacterial Genetics. Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor; p. 74.)：

β-galactosidase （β-半乳糖苷酶）的活性（Miller, J. H.，1972.)：

结果与定性的结果基本相一致，激活结构域对于转录因子的激活是必须的，没有该区域的缺失片段，虽具有结合功能，但是却没有激活功能。但是NRD区域的存在，对于GsDREB2转录因子的激活具有较明显的抑制作用，改造的GsDREB2-mNRD基因则具有较全长基因更强转录激活活性。

4. GsDREB2-mNRD与GsDREB2-FL基因植物表达载体的构建

以pBI121为载体基本骨架，利用原始载体上EcoRI和Pst I 酶切位点，将Gus基因切除，替换为GsDREB2-mNRD或GsDREB2-FL，分别构建植物表达载体。该表达载体以Npt-II基因作为植物筛选标记基因，受CaM35S组成型启动子调控。将重组质粒转化根癌农杆菌LBA4404，并进行PCR鉴定。

5. GsDREB2-mNRD与GsDREB2-FL基因转化拟南芥

农杆菌菌液的制备

将农杆菌接种于添加卡那霉素100mg/L、链霉素50 mg/L、利福平50mg/L的YEB固体培养基上，28℃暗培养，至长出单菌落。用接菌环挑取单菌落，接种在5mL含相应抗生素的YEB液体培养基中，于28℃，200r/min 培养36~48h，待菌液长至OD₆₀₀为0.4 ~ 0.6时，将其按1：10的比例接种到新鲜的含相应抗生素的YEB液体培养基中，振荡培养5~6h，进行二次活化。当OD₆₀₀为0.5 ~ 0.6 时，吸取菌液于无菌离心管中，3000 r/min离心10min，去上清，重悬于500Ml 5%蔗糖溶液（含0.02% silwet-77）中备用。

拟南芥遗传转化

1) 拟南芥的培养

将拟南芥种子（哥伦比亚生态型）4℃春化3-7d后，播种于营养钵中（营养土，君子兰土，蛭石按1：1：1混合），置于温室中培养（22℃，光照16h/天），待拟南芥抽出出生苔后，剪去出生苔，待其抽出更多的次生苔且花开较盛时，可用于下述转化。

2) 转化拟南芥

将已经结夹的花蕾剪掉，把花序倒置浸入步骤2）所得的含有重组农杆菌的蔗糖溶液中30S，转化完毕后，将植株套上塑料袋保湿，水平放置于低光强度下生长24h，即可正常培养。一周后，重复侵染一次，可提高转化效率。

3) 收集种子进行筛选

将侵染后所收集的种子进行消毒春化后，播种于含有25mg/L潮霉素的1/2MS固体培养基上。待种子萌发后，将绿色的阳性植株（T₀代）移栽至营养钵（营养土，君子兰土，蛭石按1：1：1混合）中培养，并收集种子进行T₁代筛选。

6. 转基因拟南芥耐盐性和抗旱性比较

1) 抗盐实验

选取饱满的野生型拟南芥（哥伦比亚生态型）和超量表达拟南芥种子，用5%次氯酸钠消毒液消毒10min后，于4℃春化3-7d，播种于含有125 mmol/L NaCl 的1/2MS固体培养基上，两周后观察表型。结果显示，GsDREB2 和GsDREB2-mNRD超量表达拟南芥幼苗在盐胁迫条件下萌发率都高于未转基因的对照，并且转GsDREB2-mNRD基因植株的耐盐性较转GsDREB2基因拟南芥要强。说明NRD区域的缺失，增强了转录因子与DRE结合的强度，提高了转录因子的激活活性，使转基因植株的耐盐性增强。

2) 抗旱胁迫实验

选取饱满的野生型拟南芥（哥伦比亚生态型）和2种基因超量表达拟南芥种子，用5%次氯酸钠消毒液消毒10min后，于4℃春化3-7d，播种于含有250mmol/L甘露醇的1/2MS固体培养基上，两周后观察表型。结果显示，GsDREB2和GsDREB2-mNRD超量表达拟南芥幼苗在模拟干旱胁迫条件下萌发率都高于未转基因的对照，并且转GsDREB2-mNRD基因植株的抗旱性较转GsDREB2基因拟南芥要强。说明NRD区域的缺失，增强了转录因子与DRE结合的强度，提高了转录因子的激活活性，使转基因植株的抗旱性增强。

综上所述，通过缺失NRD区域，人工改造的GsDREB2-mNRD转录因子基因，转录结合和激活活性较全长基因增强，更能有效的提高转基因植株的耐盐性和抗旱性。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内，本发明要求保护范围由所附的权利要求书其等效物界定。

<110> 东北农业大学

<120>人工改造的能提高植物耐盐性和抗旱性的基因GsDREB2-mNRD

<160>12

<210>1

<211>1362

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

AGTTTCATTG AGTACTGTGT GGCGAAGTTT GTGTCTTGGA TTTTGTGGAC ATGGGTGCTT 60

ATGATCAAGT TTCTCTTAAG CCATTGGATT CTTCTAGAAA GAGGAAAAGT AGGAGCAGAG 120

GGGATGGGTC CAAATCTGTG GCTGAGACTA TTGCAAAGTG GAAGGAATAC AATGAGCATC 180

TTTATTCTGG CAAAGATGAT AGTAGAACAA CTCGTAAGGC GCCGGCTAAA GGTTCGAAGA 240

AAGGGTGCAT GAAAGGGAAG GGAGGACCTC AAAATTCTCA GTGTAACTAC AGAGGAGTTA 300

GGCAGAGGAC ATGGGGGAAA TGGGTTGGTG AGATTAGGGA ACCCAATAGA GGAAGCAGGC 360

TTTGGTTGGG TACCTTCTCT TCTGCCCAGG AAGCTGCTCT TGCCTATGAT GAAGCTGCTA 420

GAGCTATGTA TGGTCCTTGT GCACGCCTCA ATTTTCCCGA AATCACAGAT TATCCTTCTG 480

TTAAGGAATC GTTGAAGGAC TCTTCGATGG CTGCATCGTC GTCTTGTTCT TCGGCAGCAA 540

CTGCAGCATC TGACACTACT ACTACAACAT CGAACCAATC GGAGGTTTGT GCTGTTGAGG 600

ATGTTATCGA GAAACCTGCG AATGTGAATG ATAAGTTTAA TGATTGTCAT AAGGCTTACG 660

TATCTGCCTC ACCAACTAGT AGAATGAAGC AAGAGCCTAG GGATGAGGCT GTGGACCACA 720

TGGACACAGG GGCTGGGGAA ATTCAAGATG TCGGACTAGA AGGAACACAT GATACTGGGC 780

AGGTTGCAGA GAATGTAAAT AAAGATCAGA TGGATTTGTC ATGGATTGAT GGCCTTGACT 840

TTATTGACGA TTACTTGAAG AGCCTTTCCG CGGATGAGTT ATTTCAGGTG GACGAACTTT 900

TGGGGCTTAT AGATAATAAC CCAATCGATA ACTCTGTGTT GATGCAAGGT TTGGATTTTG 960

GACAAATGGG TTTTCCTGGA GATGGTAATC CTCAGGTTGA CGATACTCCT TCAAGCTTTA 1020

TTTATCAGTT GCAAAATCCA GATGCCAAGT TGTTAGGAAG TTTGCCCCAT ATGGAGCAGA 1080

CACCATCAGG TGTTGATTAT GGATTAGATT TCTTGAAAAC AGTGGAGCCA GGGGACTATA 1140

ATGGTGGAGG GGAAGAACCA CCATTTCTTA ATTTGGATGA TGATCTAAAC CATGATTCAA 1200

ATGGCATGCA AGCAAGGAAG GGTGGCTAGA GAAGGCTACG TGTATCTGCT TCATTTTCAA 1260

CTGGTTCTAG CGTCTGCTGG TAATCTGTCT CTTGGGCTGT TGTCCCCTTT TTAGCTATAT 1320

AATAGGCGCA TAAGAGGAAT ACCCCTATAC AACTAATACA AG 1362

<210>2

<211>201

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

TATCCTTCTG TTAAGGAATC GTTGAAGGAC TCTTCGATGG CTGCATCGTC GTCTTGTTCT 60

TCGGCAGCAA CTGCAGCATC TGACACTACT ACTACAACAT CGAACCAATC GGAGGTTTGT 120

GCTGTTGAGG ATGTTATCGA GAAACCTGCG AATGTGAATG ATAAGTTTAA TGATTGTCAT 180

AAGGCTTACG TATCTGCCTC A 201

<210>3

<211>1161

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

AGTTTCATTG AGTACTGTGT GGCGAAGTTT GTGTCTTGGA TTTTGTGGAC ATGGGTGCTT 60

ATGATCAAGT TTCTCTTAAG CCATTGGATT CTTCTAGAAA GAGGAAAAGT AGGAGCAGAG 120

GGGATGGGTC CAAATCTGTG GCTGAGACTA TTGCAAAGTG GAAGGAATAC AATGAGCATC 180

TTTATTCTGG CAAAGATGAT AGTAGAACAA CTCGTAAGGC GCCGGCTAAA GGTTCGAAGA 240

AAGGGTGCAT GAAAGGGAAG GGAGGACCTC AAAATTCTCA GTGTAACTAC AGAGGAGTTA 300

GGCAGAGGAC ATGGGGGAAA TGGGTTGGTG AGATTAGGGA ACCCAATAGA GGAAGCAGGC 360

TTTGGTTGGG TACCTTCTCT TCTGCCCAGG AAGCTGCTCT TGCCTATGAT GAAGCTGCTA 420

GAGCTATGTA TGGTCCTTGT GCACGCCTCA ATTTTCCCGA AATCACGGAT CCAACTAGTA 480

GAATGAAGCA AGAGCCTAGG GATGAGGCTG TGGACCACAT GGACACAGGG GCTGGGGAAA 540

TTCAAGATGT CGGACTAGAA GGAACACATG ATACTGGGCA GGTTGCAGAG AATGTAAATA 600

AAGATCAGAT GGATTTGTCA TGGATTGATG GCCTTGACTT TATTGACGAT TACTTGAAGA 660

GCCTTTCCGC GGATGAGTTA TTTCAGGTGG ACGAACTTTT GGGGCTTATA GATAATAACC 720

CAATCGATAA CTCTGTGTTG ATGCAAGGTT TGGATTTTGG ACAAATGGGT TTTCCTGGAG 780

ATGGTAATCC TCAGGTTGAC GATACTCCTT CAAGCTTTAT TTATCAGTTG CAAAATCCAG 840

ATGCCAAGTT GTTAGGAAGT TTGCCCCATA TGGAGCAGAC ACCATCAGGT GTTGATTATG 900

GATTAGATTT CTTGAAAACA GTGGAGCCAG GGGACTATAA TGGTGGAGGG GAAGAACCAC 960

CATTTCTTAA TTTGGATGAT GATCTAAACC ATGATTCAAA TGGCATGCAA GCAAGGAAGG 1020

GTGGCTAGAG AAGGCTACGT GTATCTGCTT CATTTTCAAC TGGTTCTAGC GTCTGCTGGT 1080

AATCTGTCTC TTGGGCTGTT GTCCCCTTTT TAGCTATATA ATAGGCGCAT AAGAGGAATA 1140

CCCCTATACA ACTAATACAA G 1161

<210>4

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

GAATTCGGTG CTTATGATCA AGTTTCT 27

<210>5

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

GGATCCGTGA TTTCGGGAAA ATTG 24

<210>6

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

GAGCTCTGGT GAGGCAGATA CGTAAGC 27

<210>7

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

CTGCAGTGGT GAGGCAGATA CGTAAG 26

<210>8

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

GGATCCAACT AGTAGAATGA AGCAAGAGCC TAGG 34

<210>9

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

GAGCTCGCCA CCCTTCCTTG CTTG 24

<210>10

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

CTGCAGGCCA CCCTTCCTTG CTTG 24

<210>11

<211>78

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

AATTCATACT ACCGACATGA GTATACTACC GACATGAGTA TACTACCGAC ATGAGTATAC 60

TACCGACATG AGTGAGCT 78

<210>12

<211>70

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

GTATGATGGC TGTACTCATA TGATGGCTGT ACTCATATGA TGGCTGTACT CATATGATGG 60

CTGTACTCAC 70

Claims (1)

1.人工改造的能提高植物耐盐性和抗旱性的基因GsDREB2-mNRD，其特征在于GsDREB2基因内部存在着具有抑制GsDREB2转录激活功能和与DRE元件结合功能的负向调节结构域NRD；人工改造GsDREB2基因，使NRD缺失，改造后基因命名为GsDREB2-mNRD，碱基组成Seq IDNo:3所示。