CN101704882A - 一种植物黄矮病抗性相关蛋白及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物黄矮病抗性相关蛋白及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质，是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物黄矮病抗性相关的由序列1衍生的蛋白质。本发明还公开了所述蛋白的编码基因，以及含有该基因的重组表达载体。转入所述编码基因后，感病小麦的抗病性大大提高。本研究为开展小麦抗黄矮病作用的分子机制研究和分子育种，高效地培育抗黄矮病、高产、优质的小麦新品种奠定了坚实基础。

Description

一种植物黄矮病抗性相关蛋白及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及一种植物黄矮病抗性相关蛋白及其编码基因和应用。

背景技术

小麦黄矮病是一种世界性的小麦重要病毒病。小麦一旦感染黄矮病即无药可治，造成小麦的严重减产和品质下降，因此黄矮病也有“小麦癌症”之称，且分布广泛，在世界各麦区地均有发生。1978年美国因小麦黄矮病的大爆发致使小麦减产60％～80％，1988年德国冬小麦因黄矮病流行而减产40％。近年来，澳大利亚小麦因此病每年损失约3000万美元，新西兰、阿根廷、土耳其、突尼斯等国也有黄矮病的发生。1966年、1970年、1973年、1978年、1980年、1987年、1998～1999年我国的西北、华北部分地区和东北大面积发生此病害，仅1999年陕西、山西等麦区因黄矮病造成小麦减产20％～30％，个别严重麦区减产超过50％，小麦产量损失达数亿公斤(张增艳，辛志勇，抗黄矮病小麦生物技术育种研究进展，作物杂志，2005，5：4-7)。近年来由于暖冬、暖春现象频繁，降水明显减少，给蚜虫越冬、繁殖和毒源保存创造了有利条件，致使黄矮病在我国有扩展和危害加重的趋势，小麦黄矮病流行范围已遍及陕西、山西、甘肃、四川、宁夏、内蒙古、河北和江苏等多个小麦产区。因此，黄矮病的防治对于保证小麦高产稳产和农业持续发展非常重要。

小麦黄矮病是由蚜虫介导的大麦黄矮病毒引起的。根据不同蚜虫的传播特性，把大麦黄矮病毒分为BYDV-PAV、BYDV-MAV、BYDV-GAV、BYDV-GPA、CYDV-RPV和SGV株系及RMV株系。其中BYDV-GPV(我国特有的株系类型)，BYDV-GAV为我国主流株系。

选育和推广应用抗黄矮病小麦新品种，是防治小麦黄矮病的最经济有效途径。优良可利用的抗病基因是抗病育种的前提。然而，迄今，小麦初级基因库中尚未发现真正有效的抗性基因，仅鉴定出对BYDV-MAV株系表现一定耐性的Bdv1基因。近年来从偃麦草属、冰草属、赖草属、披碱草属、鹅冠草属中鉴定出十几种小麦远源亲缘植物免疫或高抗黄矮病，其中以中间偃麦草的研究与利用最多(张增艳，辛志勇，抗黄矮病小麦生物技术育种研究进展，作物杂志，2005，5：4-7)。

中间偃麦草(Thinopyrum intermedium)，高抗BYDV-PAV、-GAV、-GPV、-MAV，-RPV等株系，至少含有3个抗黄矮病基因，分别位于第7同源群染色体7X长臂(7Ai#1L)，7E长臂和第2同源染色体2Ai-2短臂，分别命名为Bdv2、Bdv3、Bdv4。通过小麦×中间偃麦草远缘杂交，育成抗黄矮病的部分双二倍体TAF46、无芒中4(中5)。分别以TAF46、中5做桥梁亲本，育成抗黄矮病的二体附加系L1与Z1、Z2、Z6。利用组织培养、中国春ph突变体诱导部分同源染色体配对等途径，成功地将L1中携带Bdv2等抗黄矮病重要基因的中间偃麦草染色体片段导入小麦，育成一批抗黄矮病的小麦-中间偃麦草易位系，包括TC5-TC10、TC14以及YW642(HW642)、YW443、YW243等(张增艳，辛志勇，抗黄矮病小麦生物技术育种研究进展，作物杂志，2005，5：4-7)。研究发现，抗黄矮病的小麦-中间偃麦草易位系YW642、YW443、YW243等，高抗BYDV-GAV、-MAV、-GPV和-PAV等株系，携带Bdv2的中间偃麦草染色体7X长臂(7Ai#1L)端部小片段易位到小麦染色体7D长臂端部(张增艳，辛志勇，马有志等，Mapping of a BYDV resistance gene from Thintermedium intermedium in wheatbackground by molecular markers，Science in China(Series C)，1999，42(6)：663～668)。研究结果还表明，抗黄矮病的小麦-中间偃麦草易位系YW642中，抗黄矮病基因作用的结果，能显著抑制BYDV的复制与运动(Xiaodong Liu，ZengYan Zhang通讯作者，Zhiyong Xin，2005，Molecular evidence of barley yellow dwarf virusreplication/movement suppressed by the resistance gene Bdv2 derived fromTh.intermedium，遗传学报(Journal of Genetic and Genomics)，32：942-947)。理论上说，YW642、YW443、YW243等应该可以做为抗黄矮病小麦育种中易于利用的抗性种质。然而，这些易位系虽然高抗黄矮病致病株系但并被没有成功地应用、育成多少抗黄矮病小麦新品种，可能是携带抗黄矮病基因Bdv2的染色体7Ai#1L片段存在着不利的连锁累赘。因此，迫切需要从抗黄矮病的小麦-中间偃麦草易位系YW642(HW642)等材料中分离克隆出Bdv2等抗黄矮病重要基因，研究其抗性作用分子机制，并应用于基因工程育种，以高效地培育抗黄矮病、高产、优质的小麦新品种。

发明人所在实验室和国外学者，以抗黄矮病小麦-中间偃麦草易位系YW642、TC14等材料，分子标记了来自小麦近缘植物中间偃麦草(Thinopyrum intermedium)的携带抗黄矮病基因Bdv2的7Ai#1L片段(张增艳等1999，2001，2004；Stoutjesdijk，P.，Kammholz，S.，Kleven，S.，Matsay，S.，Banks，P.，and Larkin，P.2001，PCR-based molecular marker for the Bdv2 Thinopyrum intermediumsource of barley yellow dwarf virus resistance in wheat.Aust.J.Agric.Res.52：383-1388；Ayala，L.，Henry，M.，Gonz，N.，Ginkel，M.，Mujeeb-Kazi，A.，Keller，B.，and Khairallah，M.(2001)A diagnostic molecular markeral lowing the study of Th.intermedium-derived resistance to BYDV in breadwheat segregating populations.Theor.Appl.Genet.102，942-949；Ayala，L.，Bariana，H.，Singh，R.，Gibson，J.，Gibson，A.，and Mechanicos，P.(2007)Trigenomic chromosomes by recombination of Thinopyrum intermedium and Th.ponticum translocations in wheat.Theor.Appl.Genet.116，63-75)。但是，由于中间偃麦草与小麦的亲缘关系非常远源，携带抗黄矮病重要基因的中间偃麦草染色体(7X)片段与小麦部分同源染色体(7D)间很难发生交换分离，因此，难以通过正常的F2群体精细定位中间偃麦草染色体(7X)片段上Bdv2等抗黄矮病重要基因与分子标记之间的遗传距离，图位克隆法不适用于分离克隆7X片段上Bdv2等抗黄矮病重要基因。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物黄矮病抗性相关蛋白及其编码基因和应用。

本发明提供的植物黄矮病抗性相关蛋白(TiNBL1)，来源于小麦-中间偃麦草易位系YW642[具体来自易位于小麦的中间偃麦草(Thinopyrum intermedium)染色体7Ai#1L片段]，是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物黄矮病抗性相关的由序列1衍生的蛋白质。

序列表中的序列1由1059个氨基酸残基组成。

为了使(a)中的TiNBL1便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签.

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(b)中的TiNBL1可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的TiNBL1的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码上述小麦黄矮病抗性重要蛋白的基因(TiNBL1)也属于本发明的保护范围。

所述基因可为如下1)或2)或3)或4)的DNA分子：

1)其编码序列是序列表中序列2自5’端第538至3717位核苷酸所示的DNA分子；

2)序列表中序列2所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码植物黄矮病抗性相关蛋白的DNA分子；

4)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码植物黄矮病抗性相关蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

序列表中的序列2所示由4105个核苷酸组成，自5’端第538至1717位核苷酸为编码序列(3180bp)。

含有以上任一所述基因的重组表达载体也属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。

所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

所述重组表达载体可将所述基因插入pAHC25载体的多克隆位点得到。具体来说，所述重组表达载体为将所述基因(TiNBL1)取代pAHC25载体SmaI和SacI位点间的GUS基因得到的。

含有以上任一所述基因(TiNBL1)的表达盒、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。

扩增所述基因(TiNBL1)全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。

本发明所提供的培育转基因植物的方法，可将编码所述植物黄矮病抗性相关蛋白的基因TiNBL1导入目的植物(如植物细胞或组织)中，得到黄矮病抗性高于目的植物的转基因植物。具体来说，可以将所述重组表达载体导入目的植物中，得到黄矮病抗性高于目的植物的转基因植物。

利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将编码所述蛋白的基因导入植物细胞，可获得黄矮病抗性增强的转基因细胞系及转基因植株。携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：烟草、百脉根、拟南芥、水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。

本发明发现了一种植物黄矮病抗性相关蛋白(TiNBL1)及其编码基因(TiNBL1)。转入TiNBL1基因后，感病小麦的抗病性得到显著提高。本研究为开展小麦抗黄矮病作用的分子机制研究和分子育种，高效地培育抗黄矮病、高产、优质的小麦新品种奠定了坚实基础。

附图说明

图1为鉴定TiNBL1特异表达带的电泳图谱。TiO：接种前0小时的中间偃麦草的cDNA；R0：接种前0小时的抗黄矮病小麦-中间偃麦草易位系HW642的cDNA；S0：接种前0小时的感黄矮病中8601的cDNA；RY12、RY48、RY72：接种BYDV 12小时、48小时、72小时的小麦-中间偃麦草易位系HW642的cDNA；SY12、SY48、SY72：接种BYDV 12小时、48小时、72小时的中8601的cDNA

图2为3′RACE扩增电泳图谱。1-4：接种前0小时的中间偃麦草的cDNA；5-8：接种前0小时的中8601的cDNA；9-12：接种前0小时的抗黄矮病小麦-中间偃麦草易位系HW642的cDNA；1、5、9：引物P1/AUAP扩增；2、6、10：引物P2/AUAP扩增；3、7、11：引物P2扩增；4、8、12：引物AUAP扩增；M：100bp Ladder，箭头示特异扩增带。

图3为TiNBL1的第一次5′RACE扩增电泳图谱。模板为HW642的cDNA；M：100bpladder；1：引物5P2/AUAP；2：引物5P3/AUAP；3：引物5P3；4：引物AUAP；箭头示特异扩增带。

图4为TiNBL1全长cDNA序列的扩增电泳图谱；1、2：HW642的cDNA；3：中8601的cDNA；M.DL2000 marker；箭头示目标扩增带。

图5为RT-PCR分析BYDV对TiNBL1基因表达影响的电泳图谱。RY表示被BYDV毒蚜诱导的HW642叶片的cDNA，SY表示被BYDV毒蚜诱导的中8601叶片的cDNA；0、12、24、48、72表示BYDV毒蚜诱导0小时、12小时、24小时、48小时、72小时。

图6为RT-PCR分析水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)对TiNBL1基因表达影响的电泳图谱。材料为抗黄矮病小麦-中间偃麦草易位系HW642的cDNA，0、1、2、6、12、24表示BYDV毒蚜诱导0小时、1小时、2小时、6小时、12小时、24小时。

图7为实施例2(基因沉默进行功能分析)中，利用Q-RT-PCR分析不同植株中BYDV-RDRP基因的相对表达量；1-6：接种BYDV-GAV毒蚜10天的样品；1-3：实施TiNBL1基因沉默的HW642(BSMV-γ：TiNBL1-HW642)；4：接种空载体的HW642(BMSV-γ：HW642)；5：未实施BSMV的HW642；6：未实施BSMV的中8601；7-12：24天后；7-9：实施TiNBL1基因沉默的HW642(BSMV-γ：TiNBL1-HW642)；10：接种空载体的HW642(BMSV-γ：HW642)；11：未实施BSMV的HW642；12：未实施BSMV的中8601。

图8为实施例2(基因沉默进行功能分析)中接种BYDV-GAV毒蚜35天后，不同植株对BYDV-GAV反应型。

图9为实施例3中部分转化苗的PCR鉴定结果；N1：水；N2：中8601(阴性对照)；TI-T20：不同转化苗；P：pA25-TiNBL1(阳性对照)。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

中间偃麦草：Z1146，购自中国农业科学院作物科学研究所资源种质库。

小麦-中间偃麦草易位系YW642(HW642)(抗病小麦-中间偃麦草T7DS·7DL-7XL易位系)：张增艳，马有志，辛志勇等，1998，应用基因组原位杂交技术鉴定抗黄矮病小麦新种质，中国农业科学，31(3)：1-4；Zhang Z，Xin Z，Ma Y，Chen X，XuQ，Lin Z.1999，Mapping of a BYDV resi stance gene from Thinopyrum intermediumin wheat background by molecular markers.Sci China C Life Sci.42(6)：663-668.；该易位系是1991年中国农业科学院作物科学研究所辛志勇等创制，张增艳等1996年鉴定出来；中国农业科学院作物科学研究所。

BSMV-γ(BMSV病毒的γ载体)：Burch-Smith T M，Anderson J C，Martin GB，Dinesh-Kumar S P.Applications and advantages of virus-induced genesilencing for gene function studies in plants.The Plant Journal，2004，39：734-746；中国农业科学院作物科学研究所。

大麦黄矮病病毒(BYDV-GAV株系)：购自中国农业科学院植物保护研究所。

中8601(感病小麦)：购自中国农业科学院作物科学研究所。

杨麦12(感病小麦)：购自江苏里下河地区农业科学研究所。

植物表达载体pAHC25：Christensen and Quail，1996；Ubiquitinpromoter-based vectors for high-level expression of selectable and/orscreenable marker genes in monocotyledonous plants.Transgenic Research，5，213-218.；中国农业科学院作物科学研究所。

抗病性鉴定采用小麦黄矮病严重度的国内标准分级，即IT的标准，见表2，参考文献：“李光博，曾士迈，李振歧主编.小麦病虫草鼠害综合治理[M].北京：中国农业科技出版社，1990”。

表2小麦黄矮病严重度分级标准

级别(级值)	国内标准(11法级)
		0	健株
1	部分叶尖黄化
		2	旗叶下1片叶黄化
3	旗叶下2片叶黄化
		4	旗叶黄化1/4，旗叶下1片叶黄化
5	旗叶黄化1/4，旗叶下2片叶黄化
		6	旗叶黄化
7	旗叶黄化，旗叶下1片叶黄化
		8	旗叶和旗叶下2片叶黄化
9	植株矮化，但能抽穗
		10	植株矮化显著，不抽穗

实施例1、TiNBL1基因的发现

一、TiNBL1特异表达带的发现

利用cDNA-AFLP技术，从256对引物组合中筛选出1对引物，可以在抗黄矮病的中间偃麦草(TiO)、小麦-中间偃麦草易位系HW642(RY)中扩增出特异的表达带，而感黄矮病的小麦轮回亲本中8601(SY)中无此表达带(图1；0、12、48、72表示BYDV毒蚜诱导0小时、12小时、48小时、72小时).克隆、测序分析小麦-中间偃麦草易位系HW642中特异表达带，发现此特异表达带(292bp；抗病功能基因TiNBL1标记片段)与水稻中1个NBS-LRR蛋白的LRR区段同源.特异表达带的核苷酸序列为序列表的序列2自5’末端第2988至3279位核苷酸序列.

二、TiNBL1编码基因全长cDNA序列的获得

在特异表达带(292bp)的基础上，经过一次3′-RACE(扩增电泳图见图2)、五次5′RACE反应(第一次5′RACE的扩增电泳图见图3)、克隆、测序分析及拼接，获得TiNBL1的全长cDNA序列(见序列表的序列2)。据全长cDNA序列设计一对引物，以HW642的cDNA为模板，进行PCR(HW642的扩增产物的电泳图见图4)，回收目标片段、克隆到pMD-T18(购自大连宝生物工程有限公司)载体上，测序分析。比对发现，扩增的cDNA序列与拼接的cDNA序列完全一致，TiNBL1全长cDNA序列为4105bp(见序列表的序列2)，开放阅读框为3180bp，编码由1059个氨基酸残基组成的NBS-LRR类蛋白(见序列表的序列1)。

将由序列1所示氨基酸残基组成的蛋白命名为TiNBL1蛋白，将TiNBL1蛋白的编码基因命名为TiNBL1基因。

三、TiNBL1编码基因的转录特点

利用RT-PCR技术分析TiNBL1基因的转录特点。在抗黄矮病小麦易位系HW642(R)叶片中有TiNBL1基因的表达，在感黄矮病小麦亲本中8601(S)叶片中没有TiNBL1基因的表达(见图5)。TiNBL1基因在抗黄矮病小麦易位系HW642叶片中组成型表达，SA、JA对TiNBL1基因转录的影响不大(图6)，也说明TiNBL1基因位于这些激素信号的上游。

实施例2、TiNBL1基因的抗黄矮病功能分析(病毒介导的基因沉默技术)

一、沉默HW642中的TiNBL1基因

1、制备两边分别带有PacI和NotI酶切位点的TiNBL1基因的特异表达带(见序列表的序列3)。PacI和NotI酶切后，将TiNBL1基因的特异表达带(292bp)以反向插入法插入到BSMV-γ(BMSV病毒的γ载体)上的PacI和NotI酶切位点之间，使TiNBL1基因被γ载体的T7启动子驱动，得到重组载体BSMV-γ：TiNBL1；

2、用重组载体BSMV-γ：TiNBL1转化小麦-中间偃麦草易位系HW642的2叶期幼苗的叶片，具体步骤如下：

(1)采用摩擦法接种重组载体BSMV-γ：TiNBL1(或BSMV-γ)到第二片叶完全伸展的抗病品种HW642的第一、二片叶上。接种时，用未接种手固定小麦幼苗的基部，接种手的拇指和食指压住叶片，沿着叶片伸展的方向，从叶底部连续摩擦到叶尖，一、二两片叶子同时接种。

(2)接种完成后，向小麦幼苗喷施DEPC水，保鲜膜覆盖保湿24h，之后移去保鲜膜，每隔1-2h喷施一次DEPC水。

(3)接种第5天取叶片，提取RNA，采用Q-RT-PCR检测基因沉默情况(YZ-F：5’-CAATGTCCCTCGTGTCGT-3’，YZ-R：5’-CCAGCCGCAGCTCTTCTA-3’)。

结果表明：导入BSMV-γ：TiNBL1的小麦-中间偃麦草易位系HW642(BSMV-γ：TiNBL1-HW642)中，TiNBL1基因5天即被沉默，且沉默一直维持到收获，得到实施TiNBL1基因沉默的HW642(BSMV-γ：TiNBL1-HW642)；导入BSMV-γ的小麦-中间偃麦草易位系HW642(BMSV-γ-HW642)中，TiNBL1基因的表达量没有显著变化。

二、被沉默植株的抗病性鉴定

接种重组载体BSMV-γ：TiNBL1(或BSMV-γ)后第7天，对步骤一制备的BSMV-γ：TiNBL1-HW642、BMSV-γ：HW642和HW642(Mock1)、中8601(Mock2)(每个植株设7-8个重复)，接种黄矮病病毒(BYDV-GAV株系)。镊取带BYDV-GAV蚜虫的病叶小片置于三叶期小麦植株叶腋间，在笼罩条件下强迫蚜虫爬至小麦植株上取食，每株接种10-15头蚜虫，4-7d后药剂杀灭毒蚜。

接种BYDV-GAV毒蚜第10天和第24天，分别提取HW642(MOCK1)、中8601(MOCK2)、BMSV-γ：HW642和BSMV-γ：TiNBL1-HW642植株的RNA，进行Q-RT-PCR分析，检测BYDV-GAV的RdRp基因(大麦黄矮病病毒携带的基因)的表达量，以HW642中RdRp基因表达量为1，计算相对表达量。Q-RT-PCR所用的引物为：RdRp-DF：5’-CTTTACAGAGGTCAAGAAGGTGG-3’；RdRp-DR：5’-GATGGTGGCGAGAGACAGTT-3’。结果表明：接种BYDV-GAV毒蚜10、24天后，TiNBL1基因被沉默的HW642植株中BYDV-GAV相对浓度均远高于正常HW642(R)叶片，接近中8601叶片中BYDV-GAV相对浓度的2/3、3/4(图7)；转空载体的HW642对照植株中BYDV-GAV相对浓度和正常HW642无显著差别。

接种BYDV-GAV毒蚜35天后，进行抗病性鉴定。结果表明：中8601叶片表现感病症状(IT 7-8)；TiNBL1基因沉默的HW642也显示感病症状(IT 5-6)；而HW642高抗BYDV-GAV(IT 0)；转空载体的HW642对照植株与正常HW642无显著差别，无感病症状。部分植株照片见图8。说明TiNBL1基因是抗黄矮病重要基因。

实施例3、转基因植物的获得和抗病性鉴定

一、重组表达载体pA25-TiNBL1的构建

pAHC25含有2个表达盒；第1个表达盒具有玉米Ubiquitin启动子、Exon、Intron、GUS、Nos终止子，GUS两端具有SmaI和SacI酶切位点；第2个表达盒具有玉米Ubiquitin启动子、Exon、Intron、Bar、Nos终止子。

以HW642的cDNA为模板，进行PCR扩增。

PCR扩增引物：

TiNBL1-TQSMAI：

5’-CCCGGG ATGAAAGCTGCCGAGTCTGCATCA-3’；引入SmaI酶切位点；

TiNBL1-TQSACI：

5’-GAGCTCTC TCAACTCTGCCAATGTTGTGTCGTG-3’；引入SacI酶切位点。

PCR反应程序为：先95℃预变性5min；然后95℃30s，56℃1min，72℃1min，35个循环；最后72℃，10min补平末端，获得该基因全长ORF；回收扩增产物，与用SmaI和EcoRCRI酶切(EcoRCRI酶和SacI酶具有相同的识别位点)的pAHC25大片段连接，形成重组载体。经过测序鉴定，重组载体中，含有TiNBL1基因的全长ORF(序列表的序列2自5’末端第538至3717位核苷酸)构建到单子叶植物表达载体pAHC25的SmaI和EcoRCRI位点之间，将该重组载体命名为pA25-TiNBL1。

二、转基因植物的获得

1、用基因枪法分别将pA25-TiNBL1轰击到小麦品种中8601、杨麦12幼胚的愈伤组织(对于每个小麦品种，轰击30枪，每枪40个愈伤组织，共计1200个愈伤组织块)(基因枪法参见文献：徐惠君，Steinbiss，H.H.，Sohn，A.，等，云南大学学报，1999，21：26-27)。

2、轰击后的愈伤组织在渗透压培养基上后处理16h。将愈伤组织转移到SD2(MS培养基的无机盐成分中添加VB₁ 1mg/L，天冬门酰胺150mg/L，2，4-D 2mg/L)，26℃，暗培养，恢复培养2周。

3、将恢复培养后的愈伤组织转移到分化筛选培养基中(1/2MS培养基附加：NAA 1mg/L、KT 1mg/L、Bialaphos 2-5mg/L)，24-26光照培养14d。

4、将愈伤组织分化小苗后转移到生长筛选培养基中(1/2MS培养基附加：Bialaphos 2-3mg/L)，24-26光照培养。

5、经过2-3次Bialaphos筛选的转化小苗转移到壮苗培养基(1/2MS培养基附加：0.5mg/L NAA)上，将苗高7-8cm且根系发达的转化苗移栽到花盆，在温室生长发育。

用植物表达载体pAHC25转化中8601，方法同上，得到转空载体对照植株甲；用植物表达载体pAHC25转化杨麦12，方法同上，得到转空载体对照植株乙。

在三叶期，每株转化苗取1个叶片提取基因组DNA进行PCR鉴定(NBL1-TF：5’-GCTCTGCCTTCATACGCTAT-3；NBL1-TR2：5’-GGTATTTACTAATGGCTTGTGC-3’)。结果表明，得到了转TiNBL1基因中8601阳性植株51株，转TiNBL1基因杨麦12阳性植株53株。PCR检测转TiNBL1基因中8601部分植株及其对照的电泳图见图9。

对PCR鉴定阳性的51株转TiNBL1基因中8601阳性植株、53株转TiNBL1基因杨麦12阳性植株、HW642、中8601、杨麦12、转空载体对照植株甲和转空载体对照植株乙接种BYDV-GAV株系，进行抗病性鉴定。抗病性鉴定方法同实施例2的步骤二。每种植株设置三个重复。

接种6周后开始进行抗病鉴定。

结果表明：有26株过表达的转TiNBL1基因小麦中8601对BYDV-GAV表现抗性(IT 0-2)；有20株过表达的转TiNBL1基因小麦杨麦12对BYDV-GAV表现抗性(IT0-2)；中8601叶片表现感病症状(IT 7-8)；杨麦12叶片表现感病症状(IT 7-8)；转空载体对照植株甲表现感病症状(IT 7-8)；转空载体对照植株乙表现感病症状(IT 7-8)；HW642高抗BYDV-GAV(IT 0)。再次说明TiNBL1基因是1个抗黄矮病重要基因。

序列表

<110>中国农业科学院作物科学研究所

<120>一种植物黄矮病抗性相关蛋白及其编码基因和应用

<130>CGGNARY92666

<160>3

<210>1

<211>1059

<212>PRT

<213>小麦-中间偃麦草易位系YW642

<400>1

Met Lys Ala Ala Glu Ser Ala Ser Tyr Ser Arg Ile Ser Asn His Met

1               5                   10                  15

Asn Ser Ser Ile Asn Ser Ser Gln Trp Ser Asp Val Ile Ser Cys Gly

            20                  25                  30

Ser Gly Asn Lys Ser Ser Ile Ala Glu Glu Val Glu Glu Lys Leu His

        35                  40                  45

Gln Ile Arg Asp Arg Gln Lys Lys Lys Arg Glu Arg Ser Val Glu Gln

    50                  55                  60

Pro Ser Val Leu Ser Phe Phe Pro Glu Lys Glu Val Glu Lys Pro Tyr

65                  70                  75                  80

Glu Ile Glu Tyr Arg Asn Lys Lys Ile Lys Tyr Leu Glu Glu Arg Val

                85                  90                  95

His Lys Pro Leu Val Asn Thr Arg Tyr Val Arg Lys Asp Gly Ala Ser

            100                 105                 110

Thr Pro Leu Lys His Arg Thr Gln Ser Ala Asn Leu Val Thr Gly Ala

        115                 120                 125

Phe Ser Ser Leu Leu Pro Lys Ile Leu Glu Leu Leu Asn Asp Lys Tyr

    130                 135                 140

Asp Leu Arg Met Asp Ile Lys Lys Asn Ile Glu Ser Leu Tyr Lys Glu

145                 150                 155                 160

Leu Glu Gly Met Gln Ala Val Leu His Asp Leu Ala Arg Arg Glu Gln

                165                 170                 175

Ala Gln Leu Asp Ala Val Val Met Ile Trp Ala Lys Glu Val Arg Asp

            180                 185                 190

Leu Ser Tyr Asn Val Glu Asp Met Ile Asp Ser Leu Thr Gly Glu Glu

        195                 200                 205

Ile Arg Gly Leu Ser Glu Lys Thr Pro Phe Phe Phe Leu Val Asn Asp

    210                 215                 220

Thr Asp Phe Ile Tyr Glu Asn Arg Glu Lys Val Ile Asn Glu Ile Arg

225                 230                 235                 240

Glu Lys Val Lys Gly Val Ala Ser Arg Arg Glu Lys Tyr Lys Val Asp

                245                 250                 255

Asp Arg Ile Val Ala Ala Tyr Pro Lys Ala Thr Asp Asn Val Asp Pro

            260                 265                 270

Pro Leu Leu Asp Leu Phe Gln Glu Ser Glu Glu Val Ile Gly Ile Glu

        275                 280                 285

Ala Gln Val Glu Glu Val Ile Arg Gln Leu Lys Gly His Asp Trp Asp

    290                 295                 300

Asn Asn Asn Asn Lys Leu Lys Ile Val Ser Ile Val Gly Met Ala Gly

305                 310                 315                 320

Ser Gly Lys Thr Thr Leu Ala Lys Ala Ile Ala Lys Ala Val Pro Lys

                325                 330                 335

Glu Val Leu His Asp Thr Val Phe Val Ser Val Ser Gln Asp Pro Asn

            340                 345                 350

Met Lys Arg Val Leu Met Asp Ile Leu Leu Gln Ile Asp Glu Arg Glu

        355                 360                 365

Tyr Arg Ser Leu Thr Gly Ser Thr Phe Asp Ala Lys Leu Leu Ile Asn

    370                 375                 380

Ile Ile Arg Arg Val Ile Gly Ser Lys Gly Tyr Phe Ile Val Ile Asp

385                 390                 395                 400

Asp Ile Trp Asp Val Lys Ser Trp Lys Phe Ile Lys Asp Ala Leu Asp

                405                 410                 415

Thr Arg Cys Gly Ser Arg Val Val Ile Thr Thr Arg Leu Leu Glu Val

            420                 425                 430

Ala Val Asn Ala Gly Asp Val Tyr Lys Leu Lys Ala Leu Ser His Ser

        435                 440                 445

His Ser Gly Glu Leu Phe Asn Thr Arg Leu Phe Gly Gly Lys Asp Asn

    450                 455                 460

Val Pro Arg Val Val Pro Glu Val Pro Glu Lys Leu Leu Gln Lys Cys

465                 470                 475                 480

Gly Gly Val Pro Leu Ala Ile Ile Thr Met Ala Ser Leu Phe Ala Arg

                485                 490                 495

Lys Pro Arg Asn Tyr Cys Ser Lys Val His Thr Asn Val Ser Phe Gly

            500                 505                 510

Ser Ala Val Gly Gly Asn Arg Asp Val Asp Glu Thr Arg Arg Ile Leu

        515                 520                 525

Leu Ser Ser Tyr Tyr Asn Leu Pro Tyr His Leu Arg Ala Cys Leu Leu

    530                 535                 540

His Leu Gln Val Phe Pro Glu Asp Tyr Leu Ile Thr Glu Glu Thr Leu

545                 550                 555                 560

Ile Trp Lys Trp Ala Ala Glu Gly Leu Ile Val Glu Glu Pro Gly Arg

                565                 570                 575

Gly Leu Phe Glu Ile Gly Asp Gly Tyr Phe Lys Glu Leu Ile Asp Ser

            580                 585                 590

Ser Val Val Met Pro Val Glu Asp Asp Ser Asp Tyr Gly Thr Ile Val

        595                 600                 605

Gly Cys Arg Val His Tyr Leu Val Phe Asp Met Ile Cys Ser Leu Ser

    610                 615                 620

Ala Ile Glu Asn Phe Val Thr Ile Glu Asp Gly Ser Ser Gln Tyr Ser

625                 630                 635                 640

Leu Ile Glu Ser Lys Gln Ala Arg Arg Leu Gly Ile Gln Lys Trp Thr

                645                 650                 655

Thr Glu Asn Gly Asp Pro Leu Ala Asn Ile Gly Ser Arg Ser Leu Arg

            660                 665                 670

Ser Phe Asn Thr Thr Gly Cys Arg Phe Ser Val Glu Leu Ser Leu Ser

        675                 680                 685

Arg Phe Lys Leu Leu Arg Val Ile Ala Ile Glu Glu Cys Thr Leu Leu

    690                 695                 700

Asp Gly Asp Leu Ser Pro Leu Gly Lys Leu Ile Leu Leu Arg Tyr Leu

705                 710                 715                 720

Gly Leu Tyr His Thr Leu Ile Lys Lys Leu Pro Glu Asp Ile Gly Glu

                725                 730                 735

Leu Ile Tyr Leu Gln Thr Leu Asp Leu Arg Gly Thr Arg Val His Gly

            740                 745                 750

Leu Pro Trp Glu Val Thr Gln Ile Ser Gln Leu Lys Cys Leu Arg Ala

        755                 760                 765

Asp Gly Asp Thr Ala Met Pro Tyr Gly Met Gly Lys Leu Thr Ser Leu

    770                 775                 780

Glu Glu Leu Arg Leu Gly Ala Ile Asp Thr Ser Ala Asp Phe Val Asp

785                 790                 795                 800

Gly Leu Gly Arg Leu Thr Glu Leu Arg Glu Leu Glu Ile Arg Ile Asn

                805                 810                 815

Gln Leu Asp Val Asn Glu Ala Gly Ala Leu Val Gln Ser Leu Lys Lys

            820                 825                 830

Leu Glu Lys Ile Gln Val Leu Arg Leu Val Gly Phe Pro Trp Pro Pro

        835                 840                 845

Ser Arg Val Asp Glu Leu Asn Trp Gly Asn Phe Asp Pro Pro Gln Gln

    850                 855                 860

Leu Arg Glu Leu His Leu Ser Ile Pro Ser Thr Arg Pro Pro Ala Trp

865                 870                 875                 880

Val His Val Ser Arg Val Pro Met Leu Ser His Leu Val Val Ser Leu

                885                 890                 895

Lys Ser Lys Glu Asp Gln Asp Leu Asp Ile Leu Gly Ala Leu Pro Glu

            900                 905                 910

Leu Ser Ser Leu Gln Leu Val Leu Pro Ser Lys Val Val Leu Ser Ile

        915                 920                 925

Thr Gly Arg Ser Gly Ala Phe Pro Arg Leu Arg Tyr Phe Arg Thr Ser

    930                 935                 940

Val Pro Ala Lys Phe Leu Arg Gly Ala Met Pro Thr Leu Glu Phe Leu

945                 950                 955                 960

His Phe Asp Ala Asn Phe Asp Phe Asp Pro Asp Phe Ala Ala Ser Thr

                965                 970                 975

Leu Gly Asn Leu Pro Ser Leu Gln Lys Val Glu Val Glu Ile Thr Ser

            980                 985                 990

Asn Ala Leu Ser Phe Glu Ser Met  Asn Glu Val Met Lys  Arg Ala Val

        995                 1000                 1005

Asp Gln  His Arg Asn His Pro  Ser Leu Arg Val Ile  Lys Val Asp

    1010                 1015                 1020

His Val  His Ala Gly Phe Leu  Glu Gln Phe Lys Trp  Pro Ala Thr

    1025                 1030                 1035

Arg His  Ile Ala Val Ile Leu  Gly Gly Ser Ser Ser  Arg Val Thr

    1040                 1045                 1050

Thr Gln  His Trp Gln Ser

    1055

<210>2

<211>4105

<212>DNA

<213>小麦-中间偃麦草易位系YW642

<400>2

gggcttatta ggccacgctg gcaaagatgt tcagcgatag tggtagcagg ttccagttca    60

gacgtgtaaa cgacggccag tgcagctgca tgctgcagtc gacgatggca ggttcgacta   120

tacgcgggag agggggacga tcaccattct gagatgcatc gtcatgacag gggggtcagc   180

actcacgtac tcagttcatg tgcgctgaac catgcctgtt tttgtacaag gagcaatgcc   240

cagagtccaa aagctcgtga tagggttcaa ttcaagcaaa tggaaaccac atacctttgg   300

aactgctggc ttctgtcact taacaggcct tacagaggtc tctgtaaaac ttggggcctg   360

gggtactgat gaattggaca ttaacgatgc cgagtctaaa ttggtgaccg cagttagcaa   420

tcacacgaat tctcctataa gcagagtaca attcgtagat atgatttcct atggtgtgga   480

tgataagaga actgcgactg aagaaaaacg tggggggggg gtgttgataa attcggcatg   540

aaagctgccg agtctgcatc atactctcgc ataagcaatc acatgaactc ttcaataaac   600

agttcacaat ggtctgatgt gatttcttgt ggcagtggga ataagagtag catagctgaa   660

gaagtggagg aaaagctaca ccagattcga gaccgacaga aaaagaagag ggaaagatcg   720

gtggaacagc catctgttct atcttttttt cctgaaaaag aagttgaaaa gccatatgaa   780

attgaatatc gcaataaaaa gatcaaatat ttggaggaac gcgtgcacaa gccattagta   840

aataccagat atgtgagaaa agatggtgct tccactcctc tgaagcatcg cacacaatca   900

gccaaccttg tgacgggtgc ctttagctcc ctcctcccca agatcctgga gctcctcaat   960

gacaagtacg atctgcggat ggacataaaa aaaaacatcg agtccctcta caaggagctg  1020

gagggtatgc aagctgtcct ccatgacttg gcgaggaggg aacaggctca actggatgct  1080

gtggtcatga tctgggccaa ggaagtaaga gacctctcgt ataatgtgga ggatatgatc  1140

gattccttaa caggggaaga gataagaggc ttgtccgaga agaccccgtt cttcttcctc  1200

gtgaacgaca ctgacttcat ctatgagaac agggaaaagg tcatcaatga gatcagggaa  1260

aaggtcaaag gtgtggccag ccgacgtgag aagtacaagg ttgatgaccg gattgttgct  1320

gcttatccaa aagccacaga taacgttgat cctcccctgt tggatctgtt ccaagagtcg  1380

gaagaagtta ttggcatcga agctcaagtg gaagaggtga taaggcagct gaaaggacac  1440

gattgggaca acaacaataa caagctgaag atagtctcca tagttggaat ggcaggatcg  1500

ggcaagacaa ctcttgcgaa agcaattgcc aaagcagttc ccaaagaagt gcttcatgat    1560

acggttttcg tttccgtatc tcaggatccc aacatgaaga gagttctcat ggacatcctc    1620

cttcaaattg acgagcggga gtacaggagt ctcactggat caacgttcga tgcaaagctg    1680

cttataaata taatccggag agtaattggg agcaaggggt acttcattgt tattgatgat    1740

atatgggatg tgaagtcatg gaaatttata aaggatgctt tagatactcg atgtggaagt    1800

agagtagtca taaccacaag gcttttggaa gttgctgtca atgctggtga tgtttacaag    1860

ctaaaagcac tttctcattc gcactctgga gaattgttta atacaagatt atttggtggc    1920

aaagacaatg tccctcgtgt cgtgccggag gtacctgaaa agcttttaca gaaatgtggt    1980

ggtgtaccat tagctatcat cacaatggct agtttgtttg cgaggaaacc aaggaactat    2040

tgctctaagg tgcacaccaa tgttagtttt gggtctgcag ttggaggcaa tagagatgtc    2100

gatgaaacac ggaggatact attgtctagc tattataatc tgccttatca tctgagggca    2160

tgtttattgc atctgcaggt ttttccggag gactatttaa taacggaaga aactttgatc    2220

tggaagtggg cagccgaagg tttaattgtt gaggaaccag gaagagggtt atttgagatt    2280

ggagatggat acttcaagga actcatagat agcagcgtgg tcatgccagt ggaggatgac    2340

tcagattatg ggacaattgt tggttgccgt gtccattact tggtttttga tatgatctgt    2400

tccttatcag ctatagaaaa ttttgttacc atagaggatg gaagcagtca atactctctt    2460

attgaaagca agcaggctcg caggttaggt atccaaaagt ggaccacgga gaacggcgac    2520

cctctggcta acattggctc gagaagtctg aggtcattta ataccacggg gtgtcgtttt    2580

agtgtggaac tatcactttc aaggtttaag ctcttgcgtg tcattgctat cgaagaatgc    2640

acattgcttg atggcgatct ttctcctctg gggaagttaa ttttgttgag gtacctcgga    2700

ctatatcaca cacttatcaa gaagctaccg gaagacattg gtgagctaat ttatttgcag    2760

acactggacc tgagggggac cagggtccat ggattgccct gggaagttac tcagataagt    2820

cagctcaagt gcctgcgagc tgatggagac acagcaatgc cttacgggat gggaaaactt    2880

acatccttag aagagctgcg gctgggcgcg attgacacgt cggcagactt tgtggatggg    2940

ttgggcagac tgacagagct gagggagctc gagattcgga ttaaccagtt ggatgtgaac    3000

gaggcgggag ctttggtgca gtctctgaaa aaactagaga aaatccaagt cctaagactt    3060

gtgggatttc cttggccacc atctcgtgtt gacgagctca actggggaaa ctttgatccg    3120

cctcaacaac tccgtgagtt gcatctaagc atcccatcca ctcggccgcc ggcgtgggtt    3180

cacgtctccc gtgttccaat gctctcacac ttagttgtga gcctcaagtc caaggaggat    3240

caggatttgg atattcttgg tgctttgcca gagctcagta gtctgcagct ggtgctgccg    3300

tcgaaagtgg tcctcagcat cactggtcgt tccggtgcat tcccgaggtt gaggtacttt  3360

cgcacgtctg taccagccaa gtttctaaga ggcgctatgc ccacactgga attccttcac  3420

tttgatgcca attttgactt tgatcctgac tttgctgcat caacgttggg gaacctgcct  3480

tcacttcaga aagtggaagt ggaaataaca tccaatgctc tctcctttga gtcgatgaat  3540

gaggtgatga agcgtgcagt ggaccaacat cgaaaccatc ccagccttcg tgtcatcaaa  3600

gtagatcatg tgcatgcagg gtttttagaa caattcaagt ggcccgccac ccggcacata  3660

gcggtgatcc tgggaggcag ctcatcacga gtcacgacac aacattggca gagttgacac  3720

ggacatgaaa ccatggccaa agttgcgccc cgaggctggc aaagatggga gccgacggcg  3780

caatccaagc tcacagccgc tgcgcgcgat cgccaccatg atgcttacca gctcgtcccg  3840

cccgaaggac atcataactc cggaagaaca ccggaattat gatgtctccc acagggtgaa  3900

ggcgaagcag accccggaat ttcaaattca aagtcacctc gtataccgat ggatttggcg  3960

atttggtgtg ttttgctact tttagtacta catttgtgaa tgggtgatct tatatggagg  4020

atgcgtgcgc tgcactcaaa cttgtctcag actttgactc gtagtaacat gctagtgctg  4080

acgtgataaa aaaaaaaaaa aaaaa                                        4105

<210>3

<211>308

<212>DNA

<213>小麦-中间偃麦草易位系YW642

<400>3

ttaattaagt tggatgtgaa cgaggcggga gctttggtgc agtctctgaa aaaactagag    60

aaaatccaag tcctaagact tgtgggattt ccttggccac catctcgtgt tgacgagctc   120

aactggggaa actttgatcc gcctcaacaa ctccgtgagt tgcatctaag catcccatcc   180

actcggctgc cggcgtgggt tcacgtctcc cgtgttccaa tgctctcaca cttagttgta   240

agcctcaagt ctaaggagga tcaggatttg gatattcttg gtgctttgcc agagctcagt   300

gcggccgc                                                            308

Claims (10)

1.一种蛋白质，是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物黄矮病抗性相关的由序列1衍生的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因是如下1)或2)或3)或4)的DNA分子：

1)其编码序列是序列表中序列2自5’端第538至3717位核苷酸所示的DNA分子；

2)序列表中序列2所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码植物黄矮病抗性相关蛋白的DNA分子；

4)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码植物黄矮病抗性相关蛋白的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体是将权利要求2或3所述基因插入pAHC25载体的多克隆位点得到的。

6.扩增权利要求2或3所述基因的全长及其任意片段的引物对。

7.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述基因导入目的植物中，得到黄矮病抗性高于目的植物的转基因植物。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：权利要求2或3所述基因通过权利要求4或5所述重组表达载体导入目的植物中；所述目的植物为小麦。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述目的植物为小麦品种中8601或小麦品种杨麦12。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于：所述黄矮病是由黄矮病病毒BYDV-GAV株系引发的。

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