CN117210481A - NfADH2抗逆基因及其编码氨基酸在提高大肠杆菌渗透胁迫耐受性中的应用 - Google Patents
NfADH2抗逆基因及其编码氨基酸在提高大肠杆菌渗透胁迫耐受性中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117210481A CN117210481A CN202211358375.6A CN202211358375A CN117210481A CN 117210481 A CN117210481 A CN 117210481A CN 202211358375 A CN202211358375 A CN 202211358375A CN 117210481 A CN117210481 A CN 117210481A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- nfadh2
- stress
- seq
- gene
- nucleotide sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 77
- 230000035882 stress Effects 0.000 title claims abstract description 50
- 230000008723 osmotic stress Effects 0.000 title claims abstract description 20
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims abstract description 16
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 title abstract description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 27
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 27
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 24
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 14
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 8
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims description 7
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims description 5
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 4
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 abstract description 33
- 241000692932 Nostoc flagelliforme Species 0.000 abstract description 21
- 235000021529 Nostoc flagelliforme Nutrition 0.000 abstract description 21
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 abstract description 17
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 abstract description 15
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 abstract description 15
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 13
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 abstract description 5
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 abstract description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 abstract description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 3
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 abstract 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 20
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 16
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 12
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 11
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 11
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 9
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 6
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 241000209094 Oryza Species 0.000 description 5
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 5
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- -1 Tris saturated phenol Chemical class 0.000 description 2
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 101150028074 2 gene Proteins 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000009084 Cold Injury Diseases 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000012271 agricultural production Methods 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000009412 basement excavation Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002595 cold damage Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 239000013505 freshwater Substances 0.000 description 1
- 238000011223 gene expression profiling Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000003546 nucleic acid damage Effects 0.000 description 1
- 235000018343 nutrient deficiency Nutrition 0.000 description 1
- 235000013824 polyphenols Nutrition 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000011222 transcriptome analysis Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及基因工程技术领域，具体提供NfADH2抗逆基因及其编码氨基酸在提高大肠杆菌渗透胁迫耐受性中的应用。本发明所提供的NfADH2抗逆基因来源于发状念珠藻，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明实验证实了，通过分离和应用发状念珠藻中包含NfADH2抗逆基因的DNA片段，将携带上述NfADH2抗逆基因的表达载体使用常规生物技术方法导入原核细菌细胞中，可以增强大肠杆菌在山梨醇和氯化钠处理下的渗透胁迫耐受能力。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及NfADH2抗逆基因及其编码氨基酸在提高大肠杆菌渗透胁迫耐受性中的应用。
背景技术
发状念珠藻(Nostoc flagelliforme)主要分布在北半球的干旱或半干旱的荒漠地区，经常受到极度干旱、较大温差、高浓度盐碱、营养缺乏、UV-B辐射等非生物因素的胁迫。胁迫因子可能会对细胞产生一系列的损伤，包括核酸损伤、蛋白质损伤、膜脂损伤等，从而扰乱正常的细胞代谢。经过长期的环境选择和自身结构功能的适应，发状念珠藻已经进化出一系列的生理生态和分子的机制来抵抗各种逆境。因此，发状念珠藻已经成为研究逆境适应机制和发掘抗逆基因的最佳材料之一。
乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase，ADH)是一种重要的含锌酶，是脱氢酶/还原酶(Dehydrogenase/reductase，MDR)蛋白基因超家族成员之一。ADH基因广泛存在于各种物种中，包括原核生物、真菌、植物和动物。1971年，Schwartz首次报道了玉米内核和花药中ADH酶的活性。近年来，科研工作者研究了在正常和各种胁迫处理条件下ADH酶的活性以及基因的表达。ADH酶在植物抵抗涝害、冷害、干旱等胁迫环境中起着非常重要的作用(刘晓忠等,1991；Jarillo et al.,1994；de Bruxelles et al.,1996；Judith Strommer，2011)。
农业生产经常遭受干旱而造成粮食减产，水稻是重要的粮食作物之一，其生产消耗掉的淡水资源较多，提高水稻等农作物的节水抗旱性能，是保障粮食安全和生态安全，保障农业可持续发展的重大需求(Luo，2010)。目前转基因技术已被广泛应用到抗旱水稻的培育中，所采用的策略就是在水稻中表达干旱诱导或抗旱相关基因。因此，对发状念珠藻抗逆基因的克隆和挖掘，并应用在生物基因工程上具有非常重要意义。
发明内容
本发明发现一种来源于发状念珠藻的NfADH2抗逆基因，基于发状念珠藻失水胁迫转录得到，其在失水胁迫下表达量明显上升(图2)。鉴于此，本发明的目的是提供NfADH2抗逆基因在提高渗透胁迫耐受性及抗旱性中的应用。
本发明的上述目的通过以下技术方案实现：
第一方面，本发明提供NfADH2抗逆基因在增强微生物渗透胁迫耐受能力中的应用，所述NfADH2抗逆基因的核苷酸序列为以下任一所示：
(1)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列及其互补序列；
(2)所述的核苷酸序列为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸，表达相同功能的蛋白质的核苷酸序列；
(3)所述NfADH2抗逆基因的核苷酸序列为在严格条件下与SEQ ID NO.1所示序列杂交的核苷酸序列；
(4)与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的序列，其编码蛋白具有调控微生物渗透胁迫耐受能力的功能。
本发明所提供的NfADH2抗逆基因及其编码氨基酸在提高大肠杆菌渗透胁迫耐受性中的应用，所述NfADH2抗逆基因编码蛋白的氨基酸序列为以下任一所示：
1)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；
2)与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列，且具有调控大肠杆菌渗透胁迫耐受能力的功能；或
3)在SEQ ID NO.2所示的序列中取代和/或缺失和/或增加一个或多个氨基酸残基所得的具有调控微生物渗透胁迫耐受能力的氨基酸序列。
本发明所提供的NfADH2抗逆基因及其编码氨基酸在提高大肠杆菌渗透胁迫耐受性中的应用，所述微生物为大肠杆菌，所述渗透胁迫为失水胁迫。
具体地，NfADH2抗逆基因，来源于发状念珠藻，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，序列长度为1170bp，具体为：
ATGAAAGCAGTTTGCTGGCATGGAGCAAACGATGTGCGGGTTGATACAGTTCCCGATCCCAAAATTATCAACCCACGCGATGCCATTGTTAAAATTACTTCCACAGCAATTTGTGGTTCAGATTTGCATATTTATGACGGCTACATTCCCACCATGCAAAAGGGCGATATCCTTGGTCATGAATTCATGGGGGAAGTCGTAGAACTTGGAAGCGCGGTTAAAAATGTGAAGGTAGGCGATCGCGTCGTTGTTCCTTTCACTATATCTTGCGGTAGCTGCTTTTTCTGCAATCGAGATTTATGGTCACTGTGCGATAACTCTAACCCCAATGCTTGGTTAGTAGAAAAGCAAATGGGCCATTCCCCAGCAGGTTTATTTGGCTACTCTCATTTATTCGGCGGTTATGCTGGTGGTCAAGCAGAGTATGCACGAGTACCATTTGCCGATGTCGGCTTGTTCAAAATCCCCGATGGTTTAACGGATGAGCAAGTGCTATTTTTAACAGATATTTTTCCCACTGGCTACATGGCAGCAGAAAATTGCAACATCAAACCCGGTGATATTGTCGCTGTTTGGGGTTGTGGCCCAGTTGGACAATTCGCCATCAGAAGCGCATATATGCTAGGTGCGGAACGTGTAATTGCCTTTGACCGTATTCCCGAACGTCTGCAAATGGCTAAAGAATACGGCAAAGCTGAAGTTCTCAACTACGAAGAAGTGAATATAGGCGAAGCACTCAAAGAAATGACTGGCGGCCGTGGCCCCGATGCTTGCATAGATGCAGTGGGAATGGAAGCACACGGCACAGACTTTATGGCCTTTTACGACCAGGTAAAGCAAGCAGTACGTCTAGAAACAGACCGTCCGACGGCATTACGGCAAGTAATAGTATCTGCTGCTAAAGGTGGTCACGTATCGCTTGCGGGTGTGTACGGTGGCTTTTTAGATAAAATCCCGATGGGTGCTGCCATGAACAAGGGATTAACCTTCAAAATGGGACAAACGCACGTCCATAAGTATTTACGACCCTTGTTAAAGCGGATTCAAAACGGTGAAATCGATCCAACCTTTATCATCACCCATACTTTACCTCTAGAACAAGCGCCCCACGGCTACGAAATTTTTAAGCACAAGAAAGATCACTGCATCAAAGTTGTACTTAAACCTTAG。
其编码的氨基酸序列为389个，如SEQ ID NO.2所示，具体为：
MKAVCWHGANDVRVDTVPDPKIINPRDAIVKITSTAICGSDLHIYDGYIPTMQKGDILGHEFMGEVVELGSAVKNVKVGDRVVVPFTISCGSCFFCNRDLWSLCDNSNPNAWLVEKQMGHSPAGLFGYSHLFGGYAGGQAEYARVPFADVGLFKIPDGLTDEQVLFLTDIFPTGYMAAENCNIKPGDIVAVWGCGPVGQFAIRSAYMLGAERVIAFDRIPERLQMAKEYGKAEVLNYEEVNIGEALKEMTGGRGPDACIDAVGMEAHGTDFMAFYDQVKQAVRLETDRPTALRQVIVSAAKGGHVSLAGVYGGFLDKIPMGAAMNKGLTFKMGQTHVHKYLRPLLKRIQNGEIDPTFIITHTLPLEQAPHGYEIFKHKKDHCIKVVLKP。
第二方面，本发明提供扩增NfADH2抗逆基因的引物对，所述引物对的序列为ATGAAAGCAGTTTGCTGGCA(SEQ ID NO.3)和CCCTACTAAGGTTTAAGTAC(SEQ ID NO.4)。
第三方面，本发明提供荧光定量PCR检测NfADH2抗逆基因的引物对，所述引物对的序列为AGTGAATATAGGCGAAGC(SEQ ID NO.5)和GGTGATGATAAAGGTTGG(SEQ ID NO.6)。
第四方面，本发明提供一种生物材料，在所述生物材料中导入SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；所述生物材料为重组载体、细胞、微生物。
第五方面，本发明提供制备上述生物材料的方法，以SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列为模板，用前引物TTCCAGGGGCCCCTGGGA TCCATGAAAGCAGTTTGCTGGCA(SEQ ID NO.7)，后引物TCA CGATGCGGCCGCTCGAGCCCTACTAAGGTTTAAGTAC(SEQ IDNO.8)，进行PCR扩增，通过OneStep Cloning Kit重组反应，将扩增产物片段克隆到载体上。
第七方面，本发明提供NfADH2抗逆基因及其编码蛋白在提升植物抗旱性中的应用，所述NfADH2抗逆基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明提供的NfADH2抗逆基因及其编码蛋白在提升植物抗旱性中的应用，将所述NfADH2抗逆基因在植物中表达，增加植物的抗旱能力。
本发明的有益效果：
本发明首次发现了与大肠杆菌渗透胁迫耐受能力，以及植物抗旱能力有关的NfADH2抗逆基因及其编码的氨基酸序列。
本发明根据所述NfADH2抗逆基因序列，可以直接采用PCR(Polymerase ChainReaction)技术，从基因组、mRNA和cDNA中扩增得到所述NfADH2抗逆基因或与其同源的一段DNA。
本发明通过实验验证了，通过分离和应用发状念珠藻中包含NfADH2抗逆基因的DNA片段，将携带上述NfADH2抗逆基因的表达载体可通过使用常规生物技术方法导入到原核细菌细胞中，可以使大肠杆菌在山梨醇和氯化钠处理下的渗透胁迫能力增强。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是实施例1中NfADH2基因在发菜基因组中克隆的琼脂糖水平电泳胶图，其中L1泳道就是目标基因NfADH2的片段大小。
图2是实施例1中NfADH2基因在发菜失水转录组中的表达情况，其中D1、D2、D3、D4、D5分别表示失水10％、30％、50％、70％、90％。
图3是实施例2中NfADH2基因在发菜胁迫条件下的表达谱分析，胁迫包括0.2M氯化钠处理1h、3h、6h，失水10％、30％、50％、70％、90％，0.4M山梨醇处理1h、3h。
图4是NfADH2构建原核表达的载体pGEX-6P-1示意图。
图5是实施例3中NfADH2基因的原核表达SDS-PAGE电泳结果图，其中，A为不同IPTG浓度条件下蛋白表达，诱导试剂IPTG浓度从左至右依次为0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mM，诱导时间均为5h，B为IPTG不同诱导时间条件下蛋白表达，诱导时间从左至右依次为0、1、2、3、5、7、10h，IPTG诱导浓度均为0.2mM。
图6是实施例4中原核表达NfADH2大肠杆菌山梨醇胁迫条件下生长折线图。pGEX-6P-1为空载体，pGEX-6P-1::NfADH2为重组质粒。其中A为正常培养对照条件下实验结果图，B为IPTG诱导条件下实验结果图，C为添加山梨醇条件下实验结果图，D为同时添加IPTG和山梨醇条件下实验结果。其中诱导试剂IPTG浓度为0.2mM，山梨醇浓度为0.6M。
图7是实施例4中原核表达NfADH2大肠杆菌菌液在氯化钠胁迫条件下生长折线图。pGEX-6P-1为空载体，pGEX-6P-1::NfADH2为重组质粒。其中A为正常培养对照条件下实验结果图，B为IPTG诱导条件下实验结果图，C为添加氯化钠条件下实验结果图，D为同时添加IPTG和氯化钠条件下实验结果。其中诱导试剂IPTG浓度为0.2mM，氯化钠浓度为0.3M。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1发状念珠藻NfADH2基因的克隆
(1)发状念珠藻的培养
液体培养的发状念珠藻(天然野生样品采样于内蒙古自治区苏尼特左旗)。接种前用玻璃匀浆器搅匀藻种使藻丝分散，然后接种到300ml BG11培养基中进行无菌培养，培养温度25℃，光强20±2μmol photons m-2s-1(24h连续光照)，每天早中晚各摇藻一次，使藻细胞悬浮、均匀接受光照。
(2)DNA提取
将步骤(1)中培养的发状念珠藻样品在液氮中研磨，分装到1.5ml离心管中，加入1mL提取液(100mmol/L的Tris-HCl，500mmol/L的NaCl，50mmol/L的EDTA，PH 8.0)，100μL20％SDS，10μL10mg/mL蛋白酶K，充分混匀；37℃裂解30min，每5min混匀一次；12000rpm离心10min，取上清加入等体积Tris饱和酚，充分混匀，室温静置2min；12000rpm离心10min，取上清加入等体积氯仿/异戊醇，充分混匀，室温静置2min；12000rpm离心10min，取上清加入等体积氯仿，充分混匀，室温静置2min；12000rpm离心10min，取上清加入等体积异丙醇，加入1/10体积的3M NaAc，充分混匀，可见白色丝状物；用10uL吸头挑取白色丝状沉淀，转入75％乙醇洗2次；空气中晾干，加入30uL Buffer EB溶解。
(3)NfADH2全长序列的扩增
在发状念珠藻失水转录组分析中，在失水10％、失水30％、失水50％、失水70％、失水90％的条件下，NfADH2基因的表达都显著升高。通过转录组测序获得NfADH2基因的全长序列，根据序列信息设计上下游引物(NfADH2F1:5-ATGAAAGCAGTTTGCTGGCA-3，NfADH2R1：5-CCCTACTAAGGTTTAAGTAC-3)，如序列表SE Q ID NO.3-4所示。
从发状念珠藻基因组DNA中克隆获得了NfADH2基因，琼脂糖水平电泳胶图见图1，通过测序验证，扩增产物是本发明SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列(1-1170bp)。
实施例2发状念珠藻NfADH2在不同胁迫条件下的基因表达谱分析
将固体发菜浸泡在BG11培养基中，2天后达到完全饱和，并开始不同胁迫处理。其中失水处理为在失水0％、失水10％、失水30％、失水50％、失水70％和失水90％6个时间点取样；0.4M山梨醇处理1、3h取样；0.2M氯化钠处理1、3、6h取样，所有样品可先放-80℃冰箱待用或置液氮中研磨进行RNA提取。使用TIANGEN公司的RNAprep Pure多酚多糖植物总RNA提取试剂盒(目录号：DP441)提取发菜的总RNA，电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。
逆转录合成第一链cDNA，反转录之前需用DNaseI消化所提取RNA样品，反应体系如表1。
表1反应体系
37℃反应15min后，加入0.25μL 0.1M EDTA(保证终浓度>2mM)，70℃温育10min终止反应，短暂离心后置于冰上备用。
第一链cDNA的合成参照Promega反转录系统A3500操作手册，具体步骤如下：
DNaseI消化过的样品中依次加入下列各试剂配制20μL的反应体系见表2。
表2反应体系
将上反应体系于42℃温育15min；然后95℃加热5min，使AMV反转录酶失活并阻止其与DNA结合；4℃或冰上放置5min。制备好的cDNA可以立即使用或存放于-20℃备用。
基因表达的定量分析使用Takara公司的Premix Ex TaqTM(Pe rfect Real Time)试剂盒和美国ABI 7000定量PCR仪进行。根据NfADH2序列设计定量引物(NfADH2QF：5-AGTGAATATAGGCGAA GC-3；NfADH2QR:5-GGTGATGATAAAGGTTGG-3，引物序列如序列表SEQ IDNO.5-6所示)。以16S RNA为参照基因，根据其cDN A序列设计引物。20μl反应体系见表3。
表3反应体系
反应条件为：95℃30s，然后在95℃5s，60℃31s，循环40次，并增设DissociationStage。设定在每个循环中60℃31s时收集数据，其它具体操作按仪器使用说明书进行。计算目的基因与参照基因的平均CT值以及△CT值，利用2-ΔΔCT法进行结果分析，最后将数据导入GraphPad Prism 8.0做出目的基因的相对表达量柱状图，见图3。
实施例3发状念珠藻NfADH2蛋白的原核表达
利用One Step Cloning Kit重组技术构建NfADH2的原核表达载体。以实施例1中已获得NfADH2基因为模板，用前引物NfADH2F2：5-TTCCAGGGGCCCCTGGGATCCATGAAAGCAGTTTGCTGGC A-3，后引物NfADH2R2：5-GTC ACGATGCGGCCGCTCGAGCCCT ACTAAGGTTTAAGTAC-3，引物如序列表SEQ ID NO.7-8所示，进行PCR扩增，产物经回收纯化后，通过One Step CloningKit重组反应，将扩增产物片段克隆到载体pGEX-6P-14984上。具体过程如下：
(1)PCR扩增，20μL反应体系如表4。
表4反应体系
扩增程序：94℃预变性3min，94℃1min，50℃45sec，72℃1min20sec，35个循环，72℃7min，10℃保存。反应结束后取5μL电泳检测。
(2)PCR产物的回收
采用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根生化科技有限公司)进行纯化回收。
(3)重组反应
采用南京诺唯赞生物科技有限公司的One Step Cloning Kit试剂盒进行重组反应。具体如下：
将2μg环状pGEX-6P-14984质粒(质粒图谱见图4)加入到20μl酶切反应体系中，37℃酶切2h。限制性内切酶使用量为BamHI和XhoI各1μl。酶切完成后，将酶切产物置于65℃加热20min，失活内切酶。于冰水浴中配制如下反应体系，见表5。
表5反应体系
体系配制完成后，用移液器上下轻轻吹打几次混匀各组分，置于37℃反应30min。待反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却5min。然后取20μl冷却反应液，加入到100μl表达感受态BL21细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30min。42℃热激45秒，冰水浴孵育2min。加入900μl LB培养基，37℃孵育10min充分复苏。37℃摇菌45min。取100μl菌液均匀涂布在含有抗生素Amp+的平板上。将平板倒置，于37℃过夜培养，测序获得含NfADH2的重组质粒pGEX-NfADH2。
(4)NfADH2蛋白的表达
将含NfADH2重组质粒的菌株单克隆置于2ml LB(含Amp+50μg/ml)中37℃过夜培养。按1∶50比例稀释过夜菌，37℃震荡培养至OD600≌0.6，取部分液体作为未诱导的对照组，余下的加入IPTG诱导剂至终浓度0.2mM作为实验组，两组继续37℃震荡培养3h。分别取菌体1ml，离心12000g×30s收获沉淀，用100μL 1％PBS重悬，混匀，100℃10min。离心12000g×1min，取上清作为样品，SDS-PAGE电泳检测，具体结果如图5所示。
实施例4发状念珠藻NfADH2基因在大肠杆菌中胁迫处理
摇菌待OD600处于0.4至0.6之间，pGEX空载体作为对照，调节各管的初始OD600一致，然后取同等量扩繁的菌液加入各种处理的含Amp+LB中，其中山梨醇处理为不加任何额外的试剂、加入诱导剂(IPTG)、加入山梨醇(Sorbitol)、加入IPTG与山梨醇试剂；氯化钠处理为不加任何额外的试剂、加入诱导剂(IPTG)、加入氯化钠(NaCl)、加入IPTG与氯化钠试剂。每隔一段时间用分光光度计测定菌液OD600(每隔1h测定)，每种处理各时间点至少取3个生物学重复，统计结果绘制折线图。结果显示在未加IPTG诱导条件下，重组质粒和空载体对照菌长势没有差别，而诱导后，重组质粒pGEX-NfADH2在山梨醇胁迫下长势更好，具体结果如图6所示，其中图6的A为正常培养对照条件下实验结果图，图6的B为添加诱导剂IPTG条件下实验结果图，图6的C为添加山梨醇的实验结果图，图6的D为同时添加IPTG和山梨醇的实验结果图。同样在添加诱导剂后，重组质粒pGEX-NfADH2在氯化钠胁迫下长势更好，具体结果如图7所示，其中图7的A为正常培养对照条件下实验结果图，图7的B为添加诱导剂IPTG条件下实验结果图，图7的C为添加氯化钠的实验结果图，图7的D为同时添加IPTG和氯化钠的实验结果图。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (9)
1.NfADH2抗逆基因在增强微生物渗透胁迫耐受能力中的应用，其特征在于，所述NfADH2抗逆基因的核苷酸序列为以下任一所示：
(1)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列及其互补序列；
(2)所述的核苷酸序列为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸，表达相同功能的蛋白质的核苷酸序列；
(3)所述NfADH2抗逆基因的核苷酸序列为在严格条件下与SEQ ID NO.1所示序列杂交的核苷酸序列；
(4)与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的序列，其编码蛋白具有调控微生物渗透胁迫耐受能力的功能。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述NfADH2抗逆基因编码蛋白的氨基酸序列为以下任一所示：
1)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；
2)与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列，且具有调控大肠杆菌渗透胁迫耐受能力的功能；或
3)在SEQ ID NO.2所示的序列中取代和/或缺失和/或增加一个或多个氨基酸残基所得的具有调控微生物渗透胁迫耐受能力的氨基酸序列。
3.根据权利要求1-2任一项所述的应用，其特征在于，所述微生物为大肠杆菌，所述渗透胁迫为失水胁迫。
4.扩增NfADH2抗逆基因的引物对，其特征在于，所述引物对的序列为ATGAAAGCAGTTTGCTGGCA和CCCTACTAAGGTTTAAGTAC。
5.荧光定量PCR检测NfADH2抗逆基因的引物对，其特征在于，所述引物对的序列为AGTGAATATAGGCGAAGC和GGTGATGATAAAGGTTGG。
6.一种生物材料，其特征在于，在所述生物材料中导入SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；所述生物材料为重组载体、细胞、微生物。
7.制备权利要求6所述生物材料的方法，其特征在于，以SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列为模板，用前引物TTCCAGGGGCCCCTGGGATCCATGAAAGCAGTTTGCTGGCA，后引物TCACGATGCGGCCGCTCGAGCCCTACTAAGGTTTAAGTAC，进行PCR扩增，通过One Step Cloning Kit重组反应，将扩增产物片段克隆到载体上。
8.NfADH2抗逆基因及其编码蛋白在提升植物抗旱性中的应用，所述NfADH2抗逆基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，将所述NfADH2抗逆基因在植物中表达，增加植物的抗旱能力。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211358375.6A CN117210481A (zh) | 2022-11-01 | 2022-11-01 | NfADH2抗逆基因及其编码氨基酸在提高大肠杆菌渗透胁迫耐受性中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211358375.6A CN117210481A (zh) | 2022-11-01 | 2022-11-01 | NfADH2抗逆基因及其编码氨基酸在提高大肠杆菌渗透胁迫耐受性中的应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117210481A true CN117210481A (zh) | 2023-12-12 |
Family
ID=89041301
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211358375.6A Pending CN117210481A (zh) | 2022-11-01 | 2022-11-01 | NfADH2抗逆基因及其编码氨基酸在提高大肠杆菌渗透胁迫耐受性中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117210481A (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20120266325A1 (en) * | 2009-10-20 | 2012-10-18 | Shouyi Chen | Plant Stress Tolerance Related Protein GmSIK1 and Encoding Gene and Use Thereof |
| US20140044677A1 (en) * | 2012-08-07 | 2014-02-13 | TopGeniX, Inc. | Topical composition comprising transformed bacteria expressing a compound of interest |
| CN109295075A (zh) * | 2018-10-31 | 2019-02-01 | 上海市农业生物基因中心 | NfOCP1抗旱基因、其编码的氨基酸序列及其在提高植物抗旱性中的用途 |
| CN112867784A (zh) * | 2018-09-21 | 2021-05-28 | 皮沃特生物股份有限公司 | 用于改善磷酸盐增溶的方法和组合物 |
-
2022
- 2022-11-01 CN CN202211358375.6A patent/CN117210481A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20120266325A1 (en) * | 2009-10-20 | 2012-10-18 | Shouyi Chen | Plant Stress Tolerance Related Protein GmSIK1 and Encoding Gene and Use Thereof |
| US20140044677A1 (en) * | 2012-08-07 | 2014-02-13 | TopGeniX, Inc. | Topical composition comprising transformed bacteria expressing a compound of interest |
| CN112867784A (zh) * | 2018-09-21 | 2021-05-28 | 皮沃特生物股份有限公司 | 用于改善磷酸盐增溶的方法和组合物 |
| CN109295075A (zh) * | 2018-10-31 | 2019-02-01 | 上海市农业生物基因中心 | NfOCP1抗旱基因、其编码的氨基酸序列及其在提高植物抗旱性中的用途 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ""Nostoc flagelliforme CCNUN1 chromosome, complete genome，GenBank: CP024785.1", GENBANK, 28 September 2021 (2021-09-28) * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN113337520B (zh) | 陆地棉GhA0749和GhD0744转录因子及其调控开花方面的应用 | |
| CN110004156A (zh) | 与黄萎病抗性相关的GhCML20基因及其应用 | |
| CN109295075B (zh) | NfOCP1抗旱基因、其编码的氨基酸序列及其在提高植物抗旱性中的用途 | |
| CN108707614B (zh) | 一种花生抗逆性基因及其应用 | |
| CN108610405B (zh) | 蛋白质TaNRT2.5在调控植物根系发育中的应用 | |
| CN115073573B (zh) | 甘薯抗逆相关蛋白IbNAC087及其编码基因与应用 | |
| CN117210481A (zh) | NfADH2抗逆基因及其编码氨基酸在提高大肠杆菌渗透胁迫耐受性中的应用 | |
| CN107602675B (zh) | 发状念珠藻Nfcupin1抗旱基因及其氨基酸序列和应用 | |
| CN117070483A (zh) | NfADH1抗逆基因及其编码氨基酸序列在提高大肠杆菌渗透胁迫耐受性中的应用 | |
| CN113201558B (zh) | 大豆GmHDA12基因和蛋白及其应用 | |
| CN110272904A (zh) | 水稻氮高效利用基因OsNLP4及其编码蛋白的应用 | |
| CN110791503B (zh) | 一种低磷诱导型启动子及其应用 | |
| CN110144360B (zh) | 一种二化螟SDR基因及其编码的蛋白质和应用、dsRNA及其扩增的引物对和应用 | |
| CN109207490B (zh) | Nfgdh抗旱基因、其编码的氨基酸序列及其在提高植物抗旱性中的用途 | |
| CN107287169A (zh) | 一种茄子细胞色素P450基因StCYP84A及其获得方法和应用 | |
| CN109112117B (zh) | 一种分离的二化螟cyp15c1基因及其编码蛋白 | |
| CN107058321B (zh) | miR156及其前体在调控小麦分蘖数中的应用 | |
| CN109337917B (zh) | Nfdirp抗旱基因、其编码的氨基酸序列及其在提高植物抗旱性中的用途 | |
| CN112920260B (zh) | 葡萄耐热相关VvWRKY4蛋白及其编码基因与应用 | |
| CN107603989B (zh) | 发状念珠藻NfgalE抗旱基因及其氨基酸序列和应用 | |
| CN108276481A (zh) | 陆地棉GhLEA3基因及其在抗低温胁迫方面的应用 | |
| CN114350675B (zh) | 一种调控亚麻次生壁合成的LuNAC基因及其应用 | |
| CN117164686B (zh) | 抗逆相关蛋白IbRCD1及其相关生物材料与应用 | |
| WO2022057780A1 (zh) | 一个调控植物氮素利用效率和产量的蛋白质及其应用 | |
| CN108409845B (zh) | 蛋白质TaNRT2.5在调控植物对氮肥利用效率中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |