CN107058321B - miR156及其前体在调控小麦分蘖数中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了miR156及其前体在调控小麦分蘖数中的应用。本发明公开的miR156或其前体来源于m1)或m2)：m1)单子叶植物或双子叶植物；m2)小麦；miR156的序列为序列表中序列1；miR156前体的序列为将序列2的第235‑754位或序列3或序列4中的T替换为U得到的序列。实验证明，将本发明的miR156前体的编码基因导入植物中后得到的转基因植物中miR156的表达水平显著上升，转基因植物的分蘖数显著高于野生型植物，表明本发明的miR156及其前体可以调控植物的株型，可以利用miR156及其前体调控植物的株型。

Description

miR156及其前体在调控小麦分蘖数中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，miR156及其前体在调控小麦分蘖数中的应用。

背景技术

小麦是世界和我国最重要的粮食作物之一，发展小麦生产对保障国家粮食安全具有重要意义。株型对作物生产潜力和产量水平有重要的作用，株型的形成决定了株高、分蘖数及分蘖角度，同时也相当大程度上决定了作物的光能吸收利用及转化效率，可以认为株型是作物高产最重要的基础。加速小麦功能基因组研究，将其成果尽快应用到生产实践对解决我国小麦生产问题具有重要意义。目前，小麦应用基础研究进展缓慢，其中主要原因之一是小麦基因组复杂，存在大量的重复基因。

理想株型的概念最早由小麦科学家提出，但近些年小麦的株型研究大大落后于水稻和玉米等作物。上世纪60年代小麦和水稻矮秆基因的利用以及半矮秆品种全球范围的推广应用，有效的避免倒伏的发生，提高了收获指数，带来了小麦和水稻产量水平的大幅度提高，成功地避免了当时的世界性粮食危机，可以说第一次“绿色革命”是作物株型改良的重大成就。等位基因Rht-B1b和Rht-D1b降低小麦株高，在“绿色革命”中曾发挥了重要作用，但这2个矮秆基因同时降低小麦胚芽鞘长度，不利于干旱条件下小麦根系的发育。但是其它类型的小麦株高调控基因及作用分子机制目前还不清楚。

分蘖是小麦重要的生物学特性之一，小麦从主茎上长出的侧枝及侧枝上的分枝均称为分蘖。小麦分蘖的时期从三叶期时开始，至拔节期结束。小麦分蘖的多少，标志着小麦群体结构的好坏，影响到小麦产量的高低。在生产上，由于种种原因，不少麦苗迟迟不分蘖，或分蘖极少，不利于培育壮苗。因此，小麦分蘖相关基因的克隆与功能验证，将为增加小麦有效分蘖奠定理论基础。

发明内容

本发明的目的是提供miR156(microRNA156)或其前体在调控植物株型中的应用。

其中，所述miR156或其前体可来源于m1)或m2)：

m1)单子叶植物或双子叶植物；

m2)小麦(Triticum aestivum L.)。

所述miR156的序列可为序列表中序列1。

所述miR156前体的序列可为将序列2的第235-754位或序列3或序列4中的T替换为U得到的序列。

与miR156相关的生物材料在调控植物株型中的应用也属于本发明的保护范围，所述生物材料为下述B1)至B7)中的任一种：

B1)编码所述miR156或其前体的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；

B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官。

上述应用中，B1)中编码所述miR156前体的核酸分子可为如下b1)-b7)中任一种：

b1)序列表中序列2的第235-754位核苷酸的cDNA分子或DNA分子；

b2)序列表中序列2的第9-983位核苷酸的cDNA分子或DNA分子；

b3)序列表中序列2的DNA分子cDNA分子或DNA分子；

b4)序列表中序列3的DNA分子cDNA分子或DNA分子；

b5)序列表中序列3的DNA分子cDNA分子或DNA分子；

b6)与b1)或b2)或b3)或b4)或b5)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述miR156或其前体的cDNA分子或基因组DNA分子；

b7)在严格条件下与b1)或b2)或b3)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述miR156或其前体的cDNA分子或基因组DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述miR156或其前体的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的所述miR156或其前体的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述miR156或其前体且具有所述miR156或其前体功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的序列1或序列2的第235-754位或序列3或序列4的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述应用中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述应用中，B2)所述的含有编码所述miR156或其前体的核酸分子的表达盒(miR156或其前体基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达所述miR156或其前体的DNA，该DNA不但可包括启动所述miR156或其前体基因转录的启动子，还可包括终止GhNAC79基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

可用现有的表达载体构建含有所述miR156或其前体基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述载体具体可为pUbi-pAHC25载体。

B3)所述重组载体可含有序列2的第235-754位或序列3或序列4所示的用于编码所述miR156前体的DNA序列；进一步B3)所述重组载体具体可为pUBI-miR156-3AS。所述pUBI-miR156-3AS为将pUbi-pAHC25载体的BamHI和KpnI识别位点间的DNA序列替换为序列2的第9-983位所示的DNA序列，得到表达所述miR156前体的重组载体。

上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。

上述生物材料中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。

下述P1)或P2)的产品也属于本发明的保护范围：

P1)调控植物株型产品，含有所述miR156或其前体或所述生物材料；

P2)所述miR156或其前体或所述生物材料。

上述P1)所述调控植物株型产品，可以以所述miR156或其前体或所述生物材料作为活性成分，还可以将所述miR156或其前体或所述生物材料与其它具有相同功能的物质进行组合得到的组合物作为活性成分。

上文中，所述调控植物株型可为调控下述n1)或n2)的株型：

n1)单子叶植物或双子叶植物；

n2)小麦。

所述调控植物株型可为调控植物的分蘖数。

培育分蘖数增加植物的方法也属于本发明的保护范围，所述方法包括：增加目的植物中所述miR156或其前体的活性或含量或促进所述miR156或其前体的编码基因的表达，得到与所述目的植物相比分蘖数增加的植物。

上述方法中，所述增加目的植物中所述miR156或其前体的活性或含量可通过向所述目的植物中导入所述miR156前体的编码基因实现。

所述目的植物可为下述o1)或o2)的株型：

o1)单子叶植物或双子叶植物；

o2)小麦。

上述方法中，所述miR156前体的编码基因可为序列2的第235-754位所示的DNA分子。

在本发明的实施例中，所述miR156前体的编码基因(即序列2的第235-754位核苷酸所示的DNA分子)通过含有miR156前体基因表达盒的重组载体导入目的植物中。

所述重组载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导、基因枪等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

所述方法还包括从导入序列2的第235-754位所示的miR156前体的编码基因的植株中筛选表达miR156前体的植株，得到所述转基因植物。

上述方法中，将序列表中序列2的第235-754位核苷酸所示的DNA片段(将该片段命名为片段1)导入所述目的植物可通过pUbi-pAHC25载体实现。

本发明中，所述植物理解为不仅包含将所述miR156前体基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

实验证明，将本发明的miR156前体的编码基因导入植物中后得到的转基因植物中miR156的表达水平显著上升，转基因植物的分蘖数显著高于野生型植物，表明本发明的miR156及其前体可以调控植物的株型，可以利用miR156及其前体调控植物的株型。

附图说明

图1为tae-miR156-3AS、tae-miR156-3AS以及tae-miR156-3DS的二级结构。其中，A为tae-miR156-3AS，B为tae-miR156-3BS，C为tae-miR156-3DS。

图2为转基因小麦中miR156的表达水平。

图3位转基因小麦的表型。

图4位转基因小麦的分蘖数。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的pUbi-pAHC25载体(He,X.,Qu,B.,Li,W.,Zhao,X.,Teng,W.,Ma,W.,Ren,Y.,Li,B.,Li,Z.,and Tong,Y.(2015).The Nitrate-Inducible NACTranscription Factor TaNAC2-5A Controls Nitrate Response and Increases WheatYield.Plant Physiology 169,1991-2005.)公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的小麦品种Kenong199(KN199)(Yu,T.F.,Xu,Z.S.,Guo,J.K.,Wang,Y.X.,Abernathy,B.,Fu,J.D.,Chen,X.,Zhou,Y.B.,Chen,M.,Ye,X.G.,et al.(2017).Improved drought tolerance in wheat plants overexpressing a syntheticbacterial cold shock protein gene SeCspA.Scientific Reports 7,44050.)公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1、tae-miR156及其前体可以增加小麦的分蘖数

本实施例提供了来源于小麦的miR156及其前体在增加小麦分蘖数中的应用，其名称为tae-miR156，序列为序列表中序列1，tae-miR156的前体共有三种，分别记为tae-miR156-3AS、tae-miR156-3BS和tae-miR156-3DS。tae-miR156-3AS的前体的编码序列为序列表中序列2的第235-754位；tae-miR156-3BS的前体的编码序列为序列表中序列3；tae-miR156-3DS的前体的编码序列为序列表中序列4。其中，序列1-序列4的第1位均为相应序列的5′端。

将克隆得到的tae-miR156-3AS、tae-miR156-3AS以及tae-miR156-3DS进行二级结构分析，发现三种序列均能形成串联的茎环结构，并且成熟miR156的序列均位于茎环结构中茎的位置，符合MIRNA前体的标准特征(图1)，ΔG如图1所示。

1、重组载体的构建

利用tae-miR156-F(正向引物)与tae-miR156-R(反向引物)从小麦基因组DNA中扩增得到序列2所示的DNA分子，将该DNA分子利用BamHI和KpnI双酶切后与pUbi-pAHC25载体经BamHI和KpnI双酶切得到的载体骨架相连，得到重组载体，将该重组载体命名为pUBI-miR156-3AS。引物序列如下：

tae-miR156-F(正向引物)：

5'-CGGGATCCTCCCTCTCCTATAAATACCGTA-3'(下划线处为BamHI的识别序列)

tae-miR156-R(反向引物)：

5'-GGGGTACCAAGTCAGAACGACAACCTACAG-3'(下划线处为KpnI的识别序列)

其中，序列2的第235-754位为tae-miR156-3AS的编码序列，第9-234位和第755-983位分别为tae-miR156-3AS的上游和下游序列，第3-8位和第984-989位分别为BamHI和KpnI的识别序列。

2、转基因小麦的构建

利用基因枪转化法将步骤1的pUBI-miR156-3AS转化小麦品种Kenong199(KN199)的幼胚，得到稳定的转基因小麦植株(Shan,Q.,Wang,Y.,Li,J.,Zhang,Y.,Chen,K.,Liang,Z.,Zhang,K.,Liu,J.,Xi,J.J.,Qiu,J.L.,et al.(2013).Targeted genome modificationof crop plants using a CRISPR-Cas system.Nature Biotechnology 31:686-688.)。在田间种植转基因株系至T2代。

按照上述方法，将pUBI-miR156-3AS替换为pUbi-pAHC25载体，得到作为空载体对照的对照小麦。

3、转基因小麦的鉴定与表型鉴定

通过stem-loop荧光定量PCR的方法(Chen,C.,Ridzon,D.A.,Broomer,A.J.,Zhou,Z.,Lee,D.H.,Nguyen,J.T.,Barbisin,M.,Xu,N.L.,Mahuvakar,V.R.,Andersen,M.R.,etal.(2005).Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR.NucleicAcids Research 33:e179.)，鉴定了3个独立T2代转基因株系(Line 1、Line 2和Line 3)叶片中tae-miR156的表达水平。所用试剂和引物如下，利用步骤2的对照小麦和KN199作为对照：

试剂：Takara

Premix Ex Taq^TM(Tli RNaseH Plus),Cat no.RR420A

反转引物：5'GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACgtgctc 3'

定量引物：Forward 5'CCGCCCTGACAGAAGAGAGT 3'

Reverse 5'GTGCAGGGTCCGAGGT 3'

内参基因：TaU6

内参基因定量引物：Forward 5'GGGGACATCCGATAAAATTGG 3'

Reverse 5'GGACCATTTCTCGATTTGTGC 3'

结果显示，对照小麦和KN199中的tae-miR156的表达水平无显著差异，三个转基因小麦株系中，tae-miR156的表达水平均显著高于KN199，其表达水平为KN199的4-12倍(图2)。

在田间观察3个独立T2代转基因株系的表型，结果显示，对照小麦和KN199的表型无明显差异，而三个转基因小麦株系均出现了分蘖数升高的表型(图3)；统计结果也证明，对照小麦和KN199的分蘖数无显著差异，三个转基因小麦株系的分蘖数均显著高于KN199(图4)，三个转基因小麦株系的平均分蘖数分别为23个、54个和42个，KN199的分蘖数为14个。以上结果表明，tae-miR156及其前体可以提高小麦的分蘖数，进一步可以用来调控小麦分蘖数。

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> miR156及其前体在调控小麦分蘖数中的应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> RNA

<213> 小麦（Triticum aestivum L.）

<400> 1

ugacagaaga gagugagcac 20

<210> 2

<211> 991

<212> DNA

<213> 小麦（Triticum aestivum L.）

<400> 2

cgggatcctc cctctcctat aaataccgta ctatcccctt cgcaactcac catccaaata 60

aacagtaatg ttctatagag atgcaagtgc atatacatga gaagatctct cagtagacta 120

gctagctact ggagatagag agaaagtggg agagaagatt ggccggcctc ttcttcggag 180

gaaacttctt cagttcttgt ctttgttttt tgatgctggg gggaagggag tgaggtggag 240

gctgacagaa gagagtgagc acacatggtg cctttcttgc atggtgaatt aatgggggaa 300

gttcatgctt gaagctatgt gtgctcactt ctctctctat ttgtgtgtgt gtgtgtgtgt 360

gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgttgaa cttttgatga tctctttctt tgagctagct 420

aattcaatat gtgatgtgca caagagaggt gggtgctgtg tgtggaagtt gacagaagag 480

agtgagcacc catggtgttt ccttagcatc aaggggcatg ccagggagct atgcgtgctc 540

actgctctat ctgtcagcca ctgatcagac cccgtttctt gcatgtaatc acatatccta 600

actagggttt atgcaggtct ccatgatcgg cagcagaggg agggagctgg gctttggagg 660

tctgacagaa gagagtgagc acacgcggtg gtttcctagc atgcgagcgc catgctggga 720

gctgcgcgtg ctcaccctct ctctgtcagc cattcaccat gctcatctct cttctatctg 780

ctgccaatca atcgacgaac aaccaaagag ggcactgaga tccatggtca gtaaatttct 840

ttcccagacc tcatgtttca ttgctactag tatatgcctc ttatgtttgc actacaatac 900

tactgcacct tgatttcctc ctgattgatc catgctcttt tcagtaatat atgcagggaa 960

actgtaggtt gtcgttctga cttggtaccc c 991

<210> 3

<211> 526

<212> DNA

<213> 小麦（Triticum aestivum L.）

<400> 3

gtggaggctg acagaagaga gtgagcacac atggtgcctt tcttgcatgg tgaattaatg 60

ggagagagtt catgcttgaa gctatgtgtg ctcacttctc tctctgtcag ccattataac 120

tctctctctc tctctctatt tgtgtgtgcg tgttgaactt ttgatgatct ctttctttga 180

gctacctaat tacatacata tgtgatgtgc agaagagagg tgggtgctgt gtgtggaagt 240

tgacagaaga gagtgagcac ccatggtgtt tccttagcat caaggggcat gccagggaac 300

tatgcgtgct cactgctcta tctgtcagcc actgatcaga ccccatttct tgcatgcaat 360

cacatatcct aactagggcg tatgcaggtt tccatgatcg gcggcagagg gaggggagct 420

gggctttgga ggtctgacag aagagagtga gcacacgcgg tggtttccta gcatgcgagc 480

gccatgcttg gagctgcgcg tgctcaccct ctctctgtca gccatt 526

<210> 4

<211> 534

<212> DNA

<213> 小麦（Triticum aestivum L.）

<400> 4

gtggaggctg acagaagaga gtgagcacac atggtgcctt tcttgcatgg tgaattaatg 60

ggagaagttc atgcttgaag ctatgtgtgc tcacttctct ctctgtcagc cattataact 120

ctctctctct ctctcactct gtgtgtgtgt gtgcgcgcgc gcgcgcgtga acttttgatg 180

atctctttct ttgagctacc taattacata catatgtgat ctgcagaaga gaggtgggtg 240

ctgtgtgtgg aagttgacag aagagagtga gcacccatgg tgtttcctta gcatcaaggg 300

gcatgccagg gagctatgcg tgctcactgc tctatctgtc agccactgat cagacccatt 360

tcttgcatgc aatcacatat cccagggttt atgcagtttc catgatcggc ggcagaggga 420

ggtgagctgg gctttggagg tctgacagaa gagagtgagc acacgcggtg gtttcctagc 480

atgcgagcgc catgctggga gctgcgcgtg ctcaccctct ctctgtcagc catt 534

Claims (5)

1.如下任一所述在提高小麦分蘖数中的应用；

B1)miR156前体，其序列为将序列2的第235-754位中的T替换为U得到的序列；

B2)编码B1)所述miR156前体的核酸分子；

B3)含有B2)所述核酸分子的表达盒；

B4)含有B2)所述核酸分子的重组载体、或含有B3)所述表达盒的重组载体；

B5)含有B2)所述核酸分子的重组微生物、或含有B3)所述表达盒的重组微生物、或含有B4)所述重组载体的重组微生物；

B6)含有B2)所述核酸分子的转基因小麦细胞系、或含有B3)所述表达盒的转基因小麦细胞系；

B7)含有B2)所述核酸分子的转基因小麦组织、或含有B3)所述表达盒的转基因小麦组织；

B8)含有B2)所述核酸分子的转基因小麦器官、或含有B3)所述表达盒的转基因小麦器官。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：B2)中编码所述miR156前体的核酸分子为b1)或b2)或b3)：

b1)序列表中序列2的第235-754位核苷酸的cDNA分子或DNA分子；

b2)序列表中序列2的第9-983位核苷酸的cDNA分子或DNA分子；

b3)序列表中序列2所示的cDNA分子或DNA分子。

3.培育分蘖数增加小麦的方法，包括：增加目的小麦中权利要求1所述miR156前体的含量，得到与所述目的小麦相比分蘖数增加的小麦。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述增加目的小麦中所述miR156前体的含量通过向所述目的小麦中导入所述miR156前体的编码基因实现。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述miR156前体的编码基因为序列2的第235-754位所示的DNA分子。

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