CN111019956B - 烟草蛋白NtPBD1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于烟草基因工程领域，具体涉及一个烟草蛋白NtPBD1及其应用专利申请。该基因由615个碱基组成，其中特异性核酸片段为108‑378位碱基，具体碱基序列如SEQ ID NO.1所示。烟草蛋白NtPBD1氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其由204个氨基酸残基组成。在对烟草中生物胺类物质含量调控相关基因的研究过程中，发明人通过对特定烟草蛋白NtPBD1的研究，发现其与烟草精胺含量高度相关。进一步对基因工程验证过程中，在将该基因沉默后，烟草中精胺含量发生了明显升高。基于这一特性，可为烟草品质调控、烟草新品种培育奠定一定技术基础和提供一定参考借鉴。

Description

烟草蛋白NtPBD1及其应用

技术领域

本发明属于烟草基因工程领域，具体涉及一个烟草蛋白NtPBD1及其应用专利申请。

背景技术

烟草（Nicotiana tabacum L.）属于茄科（Solanaceae）烟草属（Nicotiana），一年生草本植物。烟草原产于美洲，经多条路线传入我国后，凭借我国优越的地理环境条件，使得我国成为烟草种植面积最大、产量最高的国家。而我国也是世界上最大的烟草生产国和消费国，产销量占世界的三分之一，由此也使得烟草的种植与产品加工业在国民经济的发展中占有十分重要的地位。

生物胺是一类具有生物活性的含氮的低分子量碱性有机化合物的总称，它们是生物体自身合成荷尔蒙、核苷酸和蛋白质的前体，可以看做是氨分子中1-3个氢原子被烷基或芳基取代后形成的低分子量生物碱。精胺（Spermine），是含有两个氨基和两个亚氨基的一种多胺类物质，在植物体内由丁二胺和S-腺苷蛋氨酸经一系列酶促反应后生成。作为生物胺中一种纯天然植物活性物质，精胺广泛存在于植物界，具有调节植物的生长发育和延缓植物细胞衰老等生理功能。当植物遭遇逆境胁迫时，植物体内多胺不仅可以通过双歧化反应直接清除活性氧，而且还可以通过提高抗氧化酶活性来减少活性氧的积累。

鉴于生物胺类物质对烟叶生长的重要作用，对其代谢途径进行深入分析显然具有十分重要的技术意义。而随着烟草基因工程深入，对于与烟草中生物胺类物质相关编码基因的深入研究和开发，则可为烟草品质调控、烟草新品种培育奠定良好的技术基础。

发明内容

基于烟草中生物胺类物质含量调控相关基因的研究，本发明目的在于提供一个烟草蛋白NtPBD1基因及其在烟草生物胺类物质含量调节方面的应用，从而为烟草抗性研究、品种选育奠定一定基础。

本申请所采取的技术方案详述如下。

烟草蛋白NtPBD1的编码基因NtPBD1，由615个碱基组成，其中特异性核酸片段为108-378位碱基，具体碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

所述编码基因NtPBD1在叶片生物胺类物质调控中的应用，利用基因沉默技术、或者基因超表达方法，通过调节烟草NtPBD1基因表达量，来调节控制烟叶中生物胺类物质含量情况，所述生物胺类物质主要为精胺。

所述编码基因NtPBD1的PCR扩增制备方法，包括如下步骤：

（1）提取（具体例如以烟草K326叶片为样品）基因组，并反转录为cDNA备用；

（2）设计PCR扩增用引物，并进行PCR扩增，具体引物序列设计如下：

NtPBD1-F：5’- GATCCTCGATTCTCACAAGC - 3’，

NtPBD1-R：5’- ATGCTGCCTTATCCACTTTA - 3’。

烟草蛋白NtPBD1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其由204个氨基酸残基组成。

所述烟草蛋白NtPBD1在叶片生物胺类物质含量调控中的应用，该蛋白与植物叶片中生物胺类物质含量相关，降低该蛋白表达后，叶片中精胺含量明显升高。

利用所述编码基因NtPBD1的烟草新品种培育方法，通过转基因技术、瞬时表达技术或基因组编辑技术，构建含有NtPBD1基因的病毒诱导沉默载体、RNAi干涉载体、超表达载体或基因组编辑载体，转化烟草，筛选获得精胺含量变化的烟草新品种；

具体例如：利用病毒诱导的基因沉默（VIGS）的技术，干扰NtPBD1基因的表达使其沉默，NtPBD1基因沉默植株中精胺含量显著提高，进而获得精胺含量上升的植物新品种。

换言之，一种培育高生物胺含量烟草新品种培育方法，利用病毒诱导的基因沉默（VIGS）的技术，干扰NtPBD1基因的表达使其沉默，NtPBD1基因沉默的新烟草品种植株中生物胺、尤其是精胺物质含量显著升高。

在对烟草中生物胺类物质含量调控相关基因的研究过程中，发明人通过对特定烟草蛋白NtPBD1的研究，发现其与烟草精胺含量高度相关。进一步对基因工程验证过程中，在将该基因沉默后，烟草中精胺含量发生了明显升高。基于这一特性，可为烟草品质调控、烟草新品种培育奠定一定技术基础和提供一定参考借鉴。

附图说明

图1 为与对照植株相比，NtPBD1基因沉默植株中该基因的相对表达量；

图2 为病毒诱导基因沉默的烟叶及对照烟叶中的精胺含量比较。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中具体实验背景资料情况简要介绍如下。

生物材料：

本氏烟草，一种常用烟草材料，下述实施例中烟草种植于郑州烟草院种植基地，育苗钵中育苗，待发芽后两周进行分苗，种于塑料钵（10cm×10cm）中，22℃、16h光/8h暗条件下进行日常肥水管理等；

下述实施例中所采用的VIGS载体是一种来自烟草脆裂病毒的病毒载体（tobaccorattle virus，TRV)，所具体利用的TRV2（一种常用载体），其带有卡那筛选标记和35S启动子，同时TRV2带有EcoR I和BamH I等多克隆位点，可以用来携带和转化外源基因；

实验试剂：

LB液体培养基，1L含量中含有：10 g细菌蛋白胨（bacteriological peptone）；10g氯化钠（NaCl）；5 g酵母抽提物（yeast extract），高温高压灭菌；

YEB液体培养基，1L含量中含有：5g 牛肉浸膏（beef extract）；5 g细菌蛋白胨（bacteriological peptone）；5 g 蔗糖（sucrose）；1 g酵母抽提物（yeast extract）；2 mL1M硫酸镁（MgSO₄），高温高压灭菌；

1M 2-(N-吗啉)乙磺酸（MES）储备液：ddH₂O溶解，过滤灭菌，-20℃储存备用；

200 mM乙酰丁香酮（Acetosyringone，As）储备液：二甲基亚砜（DSMO）溶解，-20℃储存备用；

MMA（100 mL）：1 mL（1 M）MgCl2；1 mL（1 M,pH5.6）MES；75 μL（200 mM）As。

实施例1

本实施例就烟草NtPBD1基因克隆及沉默载体的构建过程简要介绍如下。

（1）烟草NtPBD1基因克隆

根据前期对于烟草基因组及相关NtPBD1基因研究，选择特异编码序列为目标片段，设计PCR扩增用引物序列如下：

NtPBD1-F：5’- GATCCTCGATTCTCACAAGC - 3’，

NtPBD1-R：5’- ATGCTGCCTTATCCACTTTA - 3’；

以烟草K326叶片的cDNA为模板，进行PCR扩增获得NtPBD1基因；

PCR扩增程序为：95℃预变性3 min；95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s，34个循环后，72℃彻底延伸 5min；

对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并回收电泳产物备用。

（2）构建重组TRV2- NtPBD1载体

将步骤（1）中的PCR扩增产物进行EcoRI、BamHI双酶切，同时对空载体TRV2进行EcoRI、BamHI双酶切，分别回收酶切产物，利用T4 DNA连接酶进行连接；

将连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α，转化操作结束后将转化产物涂布在含50mg/L Kan的LB固体培养基上，在37℃过培养夜；

挑选阳性单菌落扩增后进一步进行PCR鉴定， 并结合测序验证，确保获得构建正确的重组载体TRV2- NtPBD1。

需要说明的是，

烟草NtPBD1基因，包括615个碱基，碱基序列如SEQ ID NO.1所示，具体碱基序列为：

ATGGAGTGCGTGTTCGGGATGGTGGGCAATGGATTTGCACTGGTGGTGGCGGATTCATCCGCGGTGCACAGTATACTGGTTCACAAATCCAACGAAGATAAAATCATGATCCTCGATTCTCACAAGCTCATGGGAGCGAGCGGTGAAGCCGGCGACAGAGCTCAGTTCACTGAGTATGTACAAAAAAATGTGGCGTTGTACCAGTTCCGTAATGGTATTCCGTTGACTACGGCTGCTGCGGCTAATTTTACAAGAGGCGAGCTTGCTACAGCCTTACGAAAGAATCCTTACATGGTGAACATTATCCTGGCTGGCTATGACAAAGAGACTGGCCCTTCTCTTTATTACGTTGATTATATTGCTACTCTTCATAAAGTGGATAAGGCAGCATTTGGTTATGGCTCGTATTTCTCTCTCGCCATGATGGATAGGCACTACCGGAAGGACATGACAGTAGAAGAGGCTGTCGATTTAGCTGATAAGTGCATCATGGAGATCCGATCTAGGTTGGTGGTTGCCCCACCAAACTTTGTGATTAAAATTGTTGACAAGGATGGAGCTAGGGAATATGCTTGGCGCCAGTCTGTCAAAGATGCCCCTGTTTCCGACTCTTGA。

烟草蛋白NtPBD1，包括204个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体氨基酸序列为：

MECVFGMVGNGFALVVADSSAVHSILVHKSNEDKIMILDSHKLMGASGEAGDRAQFTEYVQKNVALYQFRNGIPLTTAAAANFTRGELATALRKNPYMVNIILAGYDKETGPSLYYVDYI

ATLHKVDKAAFGYGSYFSLAMMDRHYRKDMTVEEAVDLADKCIMEIRSRLVVAPPNFVIKIVDKDGAREYAWRQSVKDAPVSDS。

实施例2

在实施例1基础上，利用农杆菌介导的VIGS技术，发明人进一步将所构建的重组TRV2- NtPBD1载体转化了烟草植株，并就相关植物表型变化情况做了验证分析，具体实验过程简介如下。

（1）转化农杆菌

需要说明的是，参考实施例1操作及现有技术，发明人同时制备了TRV2-PDS重组载体作为对照，具体转化过程为：

将TRV2（载体对照）、TRV2-PDS（VIGS效率对照）及TRV2-NtPBD1的阳性克隆质粒，分别通过电击转化方式转化进入农杆菌GV3101感受态细胞中，利用含50mg/L Kan 和50mg/LRif的YEB平板进行培养筛选，在28℃倒置培养2d后，利用菌落PCR筛选带有目的基因的农杆菌。

（2）制备转染用菌液

将步骤（1）中筛选所得阳性农杆菌克隆在5 mL的YEB液体培养基（含50 mg/L Kan和50 mg/L Rif）中，28℃、250 rpm条件下培养过夜；

取50uL 过夜培养物接种至50 mL的YEB液体培养基（含50 mg/L Kan）中，培养至OD₆₀₀ =1.0 ~ 1.5左右，然后4000g 离心5 min，收集菌体，再用MMA(1 mL（1 M）MgCl2；1 mL（1 M, pH5.6）MES；75 μL（200 mM）As)重悬，调节OD₆₀₀ =1.0 左右；

最后室温放置3 h左右后，作为转染用菌液。

（3）瞬时转化

以3~4 w（周）苗龄的本氏烟草叶片为实验材料，利用1 mL规格注射器，将步骤（2）中所制备转染用菌液注射至烟草叶片中，注射后的烟草继续在人工培养箱内培养，观察表型变化。

进一步通过qRT-PCR对NtPBD1基因表达情况进行了检测，结果如图1所示，可以看出，TRV2- NtPBD1的侵染植株中，NtPBD1的表达量显著降低。

进一步地，发明人对实验组（TRV2- NtPBD1浸染植株）和对照组（TRV2-GFP浸染植株）中的精胺含量情况进行了检测，结果如图2所示：

从图2结果可以看出，实验组中精胺含量与对照组相比均有显著上升，这进一步表明，通过沉默NtPBD1基因，可对烟草叶片中生物胺类成分的含量进行调控，进而可为烟叶育种、品质调控奠定一定技术基础。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国烟草总公司郑州烟草研究院

<120> 烟草蛋白NtPBD1及其应用

<130> none

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 615

<212> DNA

<213> Nicotiana tabacum

<400> 1

atggagtgcg tgttcgggat ggtgggcaat ggatttgcac tggtggtggc ggattcatcc 60

gcggtgcaca gtatactggt tcacaaatcc aacgaagata aaatcatgat cctcgattct 120

cacaagctca tgggagcgag cggtgaagcc ggcgacagag ctcagttcac tgagtatgta 180

caaaaaaatg tggcgttgta ccagttccgt aatggtattc cgttgactac ggctgctgcg 240

gctaatttta caagaggcga gcttgctaca gccttacgaa agaatcctta catggtgaac 300

attatcctgg ctggctatga caaagagact ggcccttctc tttattacgt tgattatatt 360

gctactcttc ataaagtgga taaggcagca tttggttatg gctcgtattt ctctctcgcc 420

atgatggata ggcactaccg gaaggacatg acagtagaag aggctgtcga tttagctgat 480

aagtgcatca tggagatccg atctaggttg gtggttgccc caccaaactt tgtgattaaa 540

attgttgaca aggatggagc tagggaatat gcttggcgcc agtctgtcaa agatgcccct 600

gtttccgact cttga 615

<210> 2

<211> 204

<212> PRT

<213> Nicotiana tabacum

<400> 2

Met Glu Cys Val Phe Gly Met Val Gly Asn Gly Phe Ala Leu Val Val

1 5 10 15

Ala Asp Ser Ser Ala Val His Ser Ile Leu Val His Lys Ser Asn Glu

20 25 30

Asp Lys Ile Met Ile Leu Asp Ser His Lys Leu Met Gly Ala Ser Gly

35 40 45

Glu Ala Gly Asp Arg Ala Gln Phe Thr Glu Tyr Val Gln Lys Asn Val

50 55 60

Ala Leu Tyr Gln Phe Arg Asn Gly Ile Pro Leu Thr Thr Ala Ala Ala

65 70 75 80

Ala Asn Phe Thr Arg Gly Glu Leu Ala Thr Ala Leu Arg Lys Asn Pro

85 90 95

Tyr Met Val Asn Ile Ile Leu Ala Gly Tyr Asp Lys Glu Thr Gly Pro

100 105 110

Ser Leu Tyr Tyr Val Asp Tyr Ile Ala Thr Leu His Lys Val Asp Lys

115 120 125

Ala Ala Phe Gly Tyr Gly Ser Tyr Phe Ser Leu Ala Met Met Asp Arg

130 135 140

His Tyr Arg Lys Asp Met Thr Val Glu Glu Ala Val Asp Leu Ala Asp

145 150 155 160

Lys Cys Ile Met Glu Ile Arg Ser Arg Leu Val Val Ala Pro Pro Asn

165 170 175

Phe Val Ile Lys Ile Val Asp Lys Asp Gly Ala Arg Glu Tyr Ala Trp

180 185 190

Arg Gln Ser Val Lys Asp Ala Pro Val Ser Asp Ser

195 200

Claims (4)

1.烟草蛋白NtPBD1的编码基因NtPBD1在烟草叶片生物胺类物质调控中的应用，其特征在于，利用基因沉默技术，通过下调烟草NtPBD1基因表达量，来提高烟叶中生物胺类物质含量；

所述生物胺类物质为精胺；

所述烟草蛋白NtPBD1的编码基因NtPBD1，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

2.烟草蛋白NtPBD1在烟草叶片生物胺类物质含量调控中的应用，其特征在于，该蛋白与烟草叶片中生物胺类物质含量相关，降低该蛋白表达后，叶片中生物胺类物质含量明显升高；

所述生物胺类物质为精胺；

所述烟草蛋白NtPBD1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.利用烟草蛋白NtPBD1的编码基因NtPBD1的烟草新品种培育方法，其特征在于，通过利用病毒诱导的基因沉默VIGS的技术，构建含有NtPBD1基因的病毒诱导沉默载体，干扰NtPBD1基因的表达使其沉默，进而获得精胺含量上升的烟草新品种；

所述NtPBD1基因，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

4.如权利要求3所述烟草新品种培育方法，其特征在于，构建含有NtPBD1基因的病毒诱导沉默载体过程中，PCR扩增制备NtPBD1基因时，按照如下步骤：

（1）以烟草K326叶片为样品，提取基因组，并反转录为cDNA备用；

（2）设计PCR扩增用引物，并进行PCR扩增，具体引物序列设计如下：

NtPBD1-F：5’- GATCCTCGATTCTCACAAGC - 3’，

NtPBD1-R：5’- ATGCTGCCTTATCCACTTTA - 3’。

Images