CN112877344A - 一种棉花中GhHSD1基因的克隆方法 - Google Patents

一种棉花中GhHSD1基因的克隆方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112877344A
CN112877344A CN202011581758.0A CN202011581758A CN112877344A CN 112877344 A CN112877344 A CN 112877344A CN 202011581758 A CN202011581758 A CN 202011581758A CN 112877344 A CN112877344 A CN 112877344A
Authority
CN
China
Prior art keywords
yeast
ura
ghhsd1
pcr
kit
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202011581758.0A
Other languages
English (en)
Inventor
于霁雯
边盈盈
马建江
吴嫚
裴文锋
杨书贤
贾冰
宋吉坤
臧新山
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Original Assignee
Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences filed Critical Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority to CN202011581758.0A priority Critical patent/CN112877344A/zh
Publication of CN112877344A publication Critical patent/CN112877344A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种棉花中GhHSD1基因的克隆方法，在酿酒酵母中异源表达GhHSD1基因，随机挑选3个阳性克隆进行24h诱导培养，用气相色谱法对诱导培养24h后的酵母菌体进行总脂肪含量和脂肪酸各组分含量的测定，发现3个转GhHSD1酵母阳性株系与野生型酵母菌株相比总脂肪含量、肉豆蔻酸（C14:0）含量、棕榈酸（C16:0）和油酸（C18:1）含量均有所提高。

Description

一种棉花中GhHSD1基因的克隆方法
技术领域
本发明涉及棉花基因克隆方法技术领域，具体是指一种棉花中GhHSD1基因的克隆方法。
背景技术
棉花是一种重要的经济作物，并且是我国的五大油料作物之一，剥壳后的棉籽仁含油量约15％-40％(王彦霞等，2011)。棉籽含有的脂肪酸由26％的棕榈酸、2％的硬脂酸、15％的油酸和55％的亚油酸等组成。脂肪酸能提供种子萌发所需要的能量，同时也是某些信号分子的前体,在损伤防御和耐寒性等方面有重要作用(卢善发，2000)。此外,精炼后的棉籽具有较高的营养价值，含有人体所必需的脂肪酸，其中亚油酸的含量最高，占有50％以上，所以比动物油更健康(邱新棉，1999)。同时棉籽油含有多种饱和脂肪酸，可以用作起酥油和人造奶油等(杜玮，2005)。
棉籽油作为食用油，不仅有利于健康，还能增加食物风味，与花生油和芝麻油相比，有较好的热稳定性(沈端庄等，1987)。在工业上，棉籽油被用来生产油墨、甘油、肥皂等(陈金思等，2010)。棉籽油是优质的生物柴油原料(唐凤仙等，2010)，利用棉籽油生产生物柴油，能够有效缓解石油能源供需紧张的问题，从而有利于发展和应用循环经济。
油体固醇蛋白是油体中发现的一种微量蛋白，它与哺乳动物中羟基类固醇脱氢酶家族序列的相似性极高，因此也被称为羟基类固醇脱氢酶(HSD)。芝麻中的Sop2是植物中第一个被发现的HSD基因(Lin et al.,2002)。蛋白检测实验发现Sop2存在于向日葵、大豆和油菜种子的油体中(Lin et al.,2002)。研究发现在拟南芥中，AtHSD1主要是在种子中表达，随着种子发育成熟，AtHSD1的表达量急速上升，到了种子成熟后期开始下降(Baud etal.,2009)。过量表达AtHSD1的转基因拟南芥与野生型植株相比茎杆变粗，分枝变多，荚果数增多，对油菜素甾醇更敏感(Li et al.,2007)。过表达AtHSD1的转基因油菜同样出现茎秆变粗，花序变多的现象(Li et al.,2007)。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服以上技术缺陷，提供一种棉花中GhHSD1基因的克隆方法，在酿酒酵母中异源表达GhHSD1基因，随机挑选3个阳性克隆进行24h诱导培养，用气相色谱法对诱导培养24h后的酵母菌体进行总脂肪含量和脂肪酸各组分含量的测定，发现三个转GhHSD1酵母阳性株系与野生型酵母菌株相比总脂肪含量、肉豆蔻酸(C14:0)、棕榈酸(C16:0)、油酸(C18:1)含量均有所提高。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：一种棉花中GhHSD1基因的克隆方法，包括以下步骤：
步骤一：药品的选择
(1)酶及试剂盒：KOD-Plus-Neo高保真PCR扩增酶、Target Clone-Plus平末端加A酶、T4 DNA Ligase、
Figure BDA0002865250730000011
Green Realtime PCR qRT-PCR荧光定量酶、Gel ExtractionKit胶回收试剂盒、DNA Purification Kit PCR产物纯化试剂盒、PrimeScriptTM RTaseRNA反转录试剂盒、DNAMarkerIII和GelStain EB替代物、RNAprep pure植物总RNA提取试剂盒、RNAprep pure酵母总RNA提取试剂盒、大肠杆菌感受态菌体、限制性内切酶EcoRI和XbaI；
(2)其他药品：琼脂糖、蛋白胨、酵母提取物、氯仿、异戊醇、乙醇、异丙醇、氯化钠、5-溴-4-氯-3-吲哚半乳糖苷、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷、氨苄青霉素、棉子糖、半乳糖、酵母缺陷型培养基SD-Ura；
(3)LB液体培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L，LB固体培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L、琼脂粉15g/L，定容至1L，LB选择培养基：在LB铺平板前，待培养基高压灭菌冷却至55℃时加入相应浓度抗生素，摇匀后铺平板；
(4)酵母筛选固体培养基SD-Ura：SD-Ura 8g，琼脂粉20g，葡萄糖20g；
(5)酵母扩增液体培养基SD-Ura：SD-Ura 8g，葡萄糖20g；
(6)酵母蛋白诱导液体培养基SD-Ura：SD-Ura 8g，半乳糖20g，棉子糖10g；
(7)主要仪器：PCR扩增仪、高速离心机、电泳设备、凝胶成像系统、荧光定量PCR仪、真空冷冻干燥仪、气相色谱仪；
步骤二：GhHSD1的电子克隆
将拟南芥的HSD1(AT5G50700.1)基因在测序得到的陆地棉(G.hirsutum,AD1)基因组数据(JGI)的gff3文件数据库中进行同源比对、搜索，找到相应目的序列后，采用Oligo 6软件设计引物，采用PCR技术从中棉所36中扩增出完整CDS序列1053bp，其中开放阅读框ORF为1053bp，编码350个氨基酸残基；
步骤三：克隆基因的过程
(1)试验材料中棉所36种植于中国农业科学院棉花研究所试验地的，按一般大田管理，所取部位有根、茎、叶、花、蕾、下胚轴、不同发育时期的胚珠和纤维，所取材料迅速投入液氮中冷冻，保存于-80℃冰箱备用，植物DNA提取采用改良的CTAB法，植物总RNA提取采用TIANGEN公司试剂盒；
(2)将200ng RNA反转录为cDNA，将反转录产物cDNA溶液稀释4倍作为PCR反应模板；以提取的各时期棉花胚珠总RNA为模板，利用的是TaKaRa的反转录试剂盒将其反转录为cDNA；
(3)进行PCR反应扩增目的基因采用Oligo6软件设计GhHSD1的引物，以反转录所得到的混合cDNA为模板对棉花GhHSD1基因进行PCR扩增；
引物序列：
GhHSD1-F:5′-ATGGATCTTATTCACAAGTTCCTCA-3′
GhHSD1-R:5′-TTAGTCAGTCTTAATCTCAGGTGAT-3′
(4)反应结束后4℃保存，用1％的琼脂糖电泳进行检测，条带大小符合预期设计则视为有效结果；
(5)对目的片段运用胶回收试剂盒进行切胶回收；
(6)将(5)中胶回收的产物连接PMD18-T载体并转化大肠杆菌；
(7)37℃过夜培养从抗性LB培养基上挑取单克隆到含有Amp的600ul LB培养基中37℃摇菌培养4h；
(8)菌液PCR验证，送含有目的基因片段大小条带的菌液测序；
步骤四：pYES2-GAL1::GhHSD1酿酒酵母表达载体的构建
(1)质粒提取及酶切
质粒提取采用质粒提取试剂盒，质粒浓度经检测为180ng/μl，琼脂糖凝胶电泳检测，没有蛋白污染，达到试验要求，内切酶选用EcoRI-XbaI进行双酶切；
(2)pYES2-GAL1::GhHSD1酿酒酵母表达载体的构建
目的基因ORF序列扩增：根据终载体pYES2的图谱设计EcoRI-XbaI为插入位点并合成引物，引物序列如下：
In-GhHSD1-F:5′-CAGTGTGCTGGAATTCATGGATCTTATTCACAAGTTCCTCA-3′(含酶切位点EcoRI)
In-GhHSD1-R:5′-GATGCGGCCCTCTAGATTAGTCAGTCTTAATCTCAGGTGA-3′(含酶切位点XbaI)
使用高保真酶扩增得到目的片段；
PCR反应程序：98℃预变性5min；循环为98℃变性10s，60℃退火30s，68℃延伸1min，共30个循环；68℃延伸5min；
电泳检测与回收：PCR产物在1.8％琼脂糖凝胶电泳，调节电压至90V，电泳1h，照相记录电泳结果，在紫外灯下观察，迅速切下目的条带，用胶回收试剂盒回收目的片段，具体方法按试剂盒说明书进行；
融合表达载体构建：
a.吸打混匀，稍微离心后加一滴矿物油；
b.16℃连接2h；
c.连接完后放入4℃冰箱中保存过夜。
连接产物的转化
a.超净工作台灭菌30min，从-70℃超低温冰箱中取出100μL的大肠杆菌DH5α感受态细胞，放于冰上，预冷10min；
b.取出一个Ep管，标上记号，置于冰上，加入80μL的感受态细胞(冰上操作)；
c.然后加入10μL的连接产物，用移液枪吸打混匀后冰浴30min；
d.冰浴结束后，放在42℃的恒温水浴锅中热激90s，然后迅速放入冰块中，冰浴2min；
e.吸500μL不含Amp的LB液体培养液到Ep管中，混匀，置于摇床中160rpm，37℃摇1h；
f.取出摇床结束的Ep管，2000～3000rpm离心5min，弃上清300μL，剩余的菌液轻柔吸打混匀后加在含Amp的LB固体培养皿中，用玻璃涂棒涂匀，涂干；
g.37℃恒温培养箱中培养16～20h；
h.随机挑取单克隆进行PCR验证结果；
所用引物序列为：
In-GhHSD1-F:5′-CAGTGTGCTGGAATTCATGGATCTTATTCACAAGTTCCTCA-3′
In-GhHSD1-R:5′-GATGCGGCCCTCTAGATTAGTCAGTCTTAATCTCAGGTGA-3′
i.对5号单克隆在含有Amp的LB培养基进行50ml扩繁，37℃条件下190rpm的摇床过夜，采用全式金公司质粒提取试剂盒提取质粒备用；
步骤五：转化酿酒酵母INVSc1
酵母筛选固体培养基SD-Ura(1L)配制如下：
(1)称取SD-Ura 8g，Agar 20g加入950mL蒸馏水中，溶解后121℃高压灭菌15-18分钟；
(2)冷却后加入50mL，40％无菌葡萄糖；
(3)在超净工作台内将培养基倒入无菌培养皿中，凝固后备用；
利用INVSc1感受态细胞进行转化，具体过程如下：
(1)取100μl冰上融化的酿酒酵母INVSc1感受态细胞，依次加入预冷的目的质粒2-5μg、Carrier DNA95-100℃，5min，快速冰浴，重复一次10μl，PEG/LiAc 500μl并吸打几次混匀，30℃水浴30min，15min时翻转6-8次混匀；
(2)将管放42℃水浴15min，7.5min时翻转6-8次混匀；
(3)5000rpm离心40s，弃上清，ddH2O 400μl重悬，离心30s，弃上清；
(4)ddH2O 50μl重悬，涂于酿酒酵母菌体繁殖平板固体培养基SD-Ura，29℃培养48-96h；
(5)同时按照上述方法将没有酶切的pYES2载体转化酿酒酵母INVSc1感受态细胞，得到转空载体酵母；
步骤六：转基因酵母阳性株的鉴定及诱导表达
酵母扩增液体培养基SD-Ura配制见如下：
(1)称取SD-Ura 8g加入950mL蒸馏水中，溶解后121℃高压灭菌15-18分钟；
(2)冷却后加入50mL，40％无菌葡萄糖，备用；
酵母蛋白诱导液体培养基SD-Ura配制见如下：
(1)称取SD-Ura 8g加入950ml蒸馏水中，溶解后121℃高压灭菌15-18分钟；
(2)待培养基温度降到55℃时，加入已过滤的carbon source：20％的半乳糖100ml，10％的棉子糖100ml，备用；
酵母单克隆鉴定
(1)挑取酵母克隆，在盛有1ml的扩增液体培养基SD-Ura中29℃，300rpm/min过夜培养；
(2)对转基因酵母进行PCR鉴定。用T7、CYC1 Terminator扩增产物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳检测，如果可以得到约1057bp的条带，说明GhHSD1基因已整合到酵母基因组中；
(3)对转空载体酵母进行PCR鉴定，用T7、CYC1 Terminator扩增产物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳检测，如果可以得到约155bp的条带，说明pYES2空载体已整合到酵母基因组中；
转GhHSD1酵母的诱导表达
(1)随机选取3个转GhHSD1阳性酵母菌株(200μl菌液)分别接种至含30ml扩增液体培养基SD-Ura的200ml无菌三角瓶。在摇床中30℃、300rpm/min摇床生长至OD600＝30-35(约48h)。
(2)室温5000rpm离心5min收集沉淀物，弃除上清，用60ml蛋白诱导培养基SD-Ura重悬细胞，30℃，300rpm/min摇床继续培养48h，5000g离心1min，收集菌体沉淀。
(3)放入冷冻真空干燥仪进行24h干燥；
步骤七：酵母RNA的提取以及qRT-PCR验证基因表达
(1)用酵母RNA提取试剂盒提取步骤六中诱导表达后的酵母菌体沉淀的总RNA，用全式金反转录试剂盒合成cDNA，用全式金荧光定量试剂盒进行qRT-PCR验证。
(2)同时按照上述方法将pYES2载体转化酿酒酵母INVSc1的对照菌株进行培养和RNA提取和qRT-PCR检测。
qRT-PCR反应体系为：2×TransStar Top/Tip Green qPCR SuperMix 10μl、Forward Primer(10μM)0.4μl、Reverse Primer(10μM)0.4μl、Passive Reference Dye(50×)0.4μl、Template cDNA 2μl、RNase-Free Water up to 20μl。
qRT-PCR反应程序：预变性94℃(30s)；变性94℃(5s)，退火58℃(15s)，延伸72℃(12s)，45个循环。
融解曲线分析：95℃(15s)，60℃(1min)，95℃(15s)，10℃(2min)。
荧光定量引物序列：
RT-GhHSD1F：CGACTTGTTGAGGAAACCGTGAA
RT-GhHSD1R：GCATTGTAGACGCTTGTTCTTGG
RT-18SF：TTAGTTGGTGGAGTGATTTG
RT-18SR：GGTGGCTCTGTCAGTGTAG
步骤八：转基因酵母的脂肪及脂肪酸成分含量测定
转GhHSD1酵母总脂肪含量测定
用气相色谱仪分别对步骤六中获得的各菌体的总脂肪含量进行测定；
转GhHSD1酵母脂肪酸组分测定
用气相色谱仪分别对步骤六中获得的各菌体的脂肪酸各组分含量进行测定。
本发明与现有技术相比的优点在于：在酿酒酵母中异源表达GhHSD1基因，随机挑选3个阳性克隆进行24h诱导培养。用气相色谱法对诱导培养24h后的酵母菌体进行总脂肪含量和脂肪酸各组分含量的测定，发现3个转GhHSD1酵母阳性株系与野生型酵母菌株相比总脂肪含量分别显著提高了13.16％、14.37％、21.74％；肉豆蔻酸(C14:0)含量比野生型酵母菌株分别提高了12.4％、17.0％和21.6％；棕榈酸(C16:0)含量分别提高了14.8％、15.2％和23.6％；油酸(C18:1)的含量分别提高了12.6％、14.8％和20.8％。
附图说明
图1是本发明一种棉花中GhHSD1基因的克隆方法的GhHSD1基因的克隆图。
图2是本发明一种棉花中GhHSD1基因的克隆方法的目的基因的克隆图。
图3是本发明一种棉花中GhHSD1基因的克隆方法的融合表达载体构建图。
图4是本发明一种棉花中GhHSD1基因的克隆方法的单克隆PCR验证结果图。
图5是本发明一种棉花中GhHSD1基因的克隆方法的转基因酵母单克隆PCR检测结果图。
图6是本发明一种棉花中GhHSD1基因的克隆方法的转空载体酵母单克隆PCR检测结果图。
图7是本发明一种棉花中GhHSD1基因的克隆方法的qRT-PCR结果图。
图8是本发明一种棉花中GhHSD1基因的克隆方法的酵母各株系的总脂肪含量图。
图9是本发明一种棉花中GhHSD1基因的克隆方法的酵母各株系的脂肪酸各组分含量图。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明公开一种棉花中GhHSD1基因的克隆方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一：药品的选择
(1)酶及试剂盒：KOD-Plus-Neo高保真PCR扩增酶、Target Clone-Plus平末端加A酶、T4 DNA Ligase、
Figure BDA0002865250730000061
Green Realtime PCR qRT-PCR荧光定量酶购自于TOYOBO生物公司；Gel Extraction Kit胶回收试剂盒购自于Omega生物公司；DNA Purification Kit PCR产物纯化试剂盒、PrimeScriptTM RTase RNA反转录试剂盒均购自TaKaRa生物公司；DNAMarkerIII和GelStain EB替代物购自于TransGen生物公司；RNAprep pure植物总RNA提取试剂盒购自Tiangen公司；RNAprep pure酵母总RNA提取试剂盒购自Promega公司；实验所用引物在上海生工生物公司合成；大肠杆菌感受态菌体(Escherichia coli)DH5α购自上海生工生物公司；限制性内切酶EcoRI和XbaI均够自NEB公司；
(2)其他药品：琼脂糖购买于全式金生物公司，蛋白胨、酵母提取物、氯仿、异戊醇、乙醇、异丙醇、氯化钠等为国产分析纯，5-溴-4-氯-3-吲哚半乳糖苷(X-gal)、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)、氨苄青霉素、棉子糖(D8180)、半乳糖(YZ-4117A)、酵母缺陷型培养基SD-Ura(S0620)等购自北京索莱宝科技有限公司的产品；
(3)溶液的配制：本文中提到的但未列出的各种试剂均按《分子克隆实验指南》第三版上的方法配制，生化试剂为分析纯或以上级；
(4)LB液体培养基：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L、酵母提取物(Yeast extract)5g/L、氯化钠(NaCl)10g/L；LB固体培养基：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L、酵母提取物(Yeastextract)5g/L、氯化钠(NaCl)10g/L、琼脂粉15g/L，定容至1L；LB选择培养基：在LB铺平板前，待培养基高压灭菌冷却至55℃时加入相应浓度抗生素，摇匀后铺平板；
(5)酵母筛选固体培养基SD-Ura(1L)：SD-Ura 8g，琼脂粉20g，葡萄糖20g；
(6)酵母扩增液体培养基SD-Ura(1L)：SD-Ura 8g，葡萄糖20g；
(7)酵母蛋白诱导液体培养基SD-Ura(1L)：SD-Ura 8g，半乳糖20g，棉子糖10g；
(8)主要仪器：PCR扩增仪(BIO-RAD)、高速离心机(Hettich MIKRO 200R)、电泳设备(BIO-RAD)、凝胶成像系统(BIO-RAD)、荧光定量PCR仪(ABI7500)、真空冷冻干燥仪(ALPHAI-5)、气相色谱仪(岛津-2030)；
步骤二：GhHSD1的电子克隆
将拟南芥的HSD1(AT5G50700.1)基因在测序得到的陆地棉(G.hirsutum,AD1)基因组数据(JGI)的gff3文件数据库中进行同源比对、搜索，找到相应目的序列后，采用Oligo 6软件设计引物，采用PCR技术从中棉所36中扩增出完整CDS序列1053bp，其中开放阅读框ORF为1053bp，编码350个氨基酸残基；
步骤三：克隆基因的过程
(1)试验材料中棉所36种植于中国农业科学院棉花研究所试验地的，按一般大田管理，所取部位有根、茎、叶、花、蕾、下胚轴、不同发育时期的胚珠和纤维，所取材料迅速投入液氮中冷冻，保存于-80℃冰箱备用，植物DNA提取采用改良的CTAB法，植物总RNA提取采用TIANGEN公司试剂盒；
(2)将200ng RNA反转录为cDNA，将反转录产物cDNA溶液稀释4倍作为PCR反应模板；以提取的各时期棉花胚珠总RNA为模板，利用的是TaKaRa的反转录试剂盒将其反转录为cDNA，反应体系见表2-1：
表2-1反应体系
Figure BDA0002865250730000071
Figure BDA0002865250730000081
备注：反应过程在PCR仪器内先37℃温育15min，然后85℃5s最后-20℃保存备用；
(3)进行PCR反应扩增目的基因采用Oligo6软件设计GhHSD1的引物，以反转录所得到的混合cDNA为模板对棉花GhHSD1基因进行PCR扩增，反应体系如表2-2：
表2-2目的基因扩增体系
Figure BDA0002865250730000082
PCR反应所需条件设置为：
Figure BDA0002865250730000083
引物序列：
GhHSD1-F:5′-ATGGATCTTATTCACAAGTTCCTCA-3′
GhHSD1-R:5′-TTAGTCAGTCTTAATCTCAGGTGAT-3′
(4)反应结束后4℃保存，用1％的琼脂糖电泳进行检测，条带大小符合预期设计则视为有效结果见说明书附图1；
(5)对目的片段运用胶回收试剂盒进行切胶回收；
(6)将(5)中胶回收的产物连接PMD18-T载体并转化大肠杆菌；
(7)37℃过夜培养从抗性LB培养基上挑取单克隆到含有Amp的600ul LB培养基中37℃摇菌培养4h；
(8)菌液PCR验证，送含有目的基因片段大小条带的菌液测序；
步骤四：pYES2-GAL1::GhHSD1酿酒酵母表达载体的构建
(1)质粒提取及酶切
质粒提取采用OMEGA公司质粒提取试剂盒，质粒浓度经检测为180ng/μl，琼脂糖凝胶电泳检测，没有蛋白污染，达到试验要求，内切酶选用EcoRI-XbaI进行双酶切；
(2)pYES2-GAL1::GhHSD1酿酒酵母表达载体的构建
目的基因ORF序列扩增：根据终载体pYES2的图谱设计EcoRI-XbaI为插入位点并合成引物，引物序列如下：
In-GhHSD1-F:5′-CAGTGTGCTGGAATTCATGGATCTTATTCACAAGTTCCTCA-3′(含酶切位点EcoRI)
In-GhHSD1-R:5′-GATGCGGCCCTCTAGATTAGTCAGTCTTAATCTCAGGTGA-3′(含酶切位点XbaI)
使用高保真酶扩增得到目的片段；
表3-1目的基因扩增体系
Figure BDA0002865250730000091
PCR反应程序：98℃预变性5min；循环为98℃变性10s，60℃退火30s，68℃延伸1min，共30个循环；68℃延伸5min；
电泳检测与回收：PCR产物在1.8％琼脂糖凝胶电泳，调节电压至90V，电泳1h，照相记录电泳结果，如说明书附图2所示：lane 1为目的片段；M:MarkerⅢ，在紫外灯下观察，迅速切下目的条带，用胶回收试剂盒回收目的片段，具体方法按试剂盒说明书进行；
融合表达载体构建：
如说明书附图3所示，将EcoRI-XbaI酶切的质粒pYES2与目的基因GhHSD1进行体外连接；
连接体系见表3-2
表3-2目的基因与pYES2重组质粒连接体系
Figure BDA0002865250730000101
a.吸打混匀，稍微离心后加一滴矿物油；
b.16℃连接2h；
c.连接完后放入4℃冰箱中保存过夜。
连接产物的转化
a.超净工作台灭菌30min，从-70℃超低温冰箱中取出100μL的大肠杆菌DH5α感受态细胞，放于冰上，预冷10min；
b.取出一个Ep管，标上记号，置于冰上，加入80μL的感受态细胞(冰上操作)；
c.然后加入10μL的连接产物，用移液枪吸打混匀后冰浴30min；
d.冰浴结束后，放在42℃的恒温水浴锅中热激90s，然后迅速放入冰块中，冰浴2min；
e.吸500μL不含Amp的LB液体培养液到Ep管中，混匀，置于摇床中160rpm，37℃摇1h；
f.取出摇床结束的Ep管，2000～3000rpm离心5min，弃上清300μL，剩余的菌液轻柔吸打混匀后加在含Amp的LB固体培养皿中，用玻璃涂棒涂匀，涂干；
g.37℃恒温培养箱中培养16～20h；
h.随机挑取单克隆进行PCR验证结果如说明书附图4所示：lane 4、lane5、lane7、lane8、lane9有目的片段；M:MarkerⅢ；
所用引物序列为：
In-GhHSD1-F:5′-CAGTGTGCTGGAATTCATGGATCTTATTCACAAGTTCCTCA-3′
In-GhHSD1-R:5′-GATGCGGCCCTCTAGATTAGTCAGTCTTAATCTCAGGTGA-3′
i.对5号单克隆在含有Amp的LB培养基进行50ml扩繁，37℃条件下190rpm的摇床过夜，采用全式金公司质粒提取试剂盒提取质粒备用；
步骤五：转化酿酒酵母INVSc1
酵母筛选固体培养基SD-Ura(1L)配制如下：
(1)称取SD-Ura 8g，Agar 20g加入950mL蒸馏水中，溶解后121℃高压灭菌15-18分钟；
(2)冷却后加入50mL，40％无菌葡萄糖；
(3)在超净工作台内将培养基倒入无菌培养皿中，凝固后备用；
利用INVSc1感受态细胞进行转化，具体过程如下：
(1)取100μl冰上融化的酿酒酵母INVSc1感受态细胞，依次加入预冷的目的质粒2-5μg、Carrier DNA95-100℃，5min，快速冰浴，重复一次10μl，PEG/LiAc 500μl并吸打几次混匀，30℃水浴30min，15min时翻转6-8次混匀；
(2)将管放42℃水浴15min，7.5min时翻转6-8次混匀；
(3)5000rpm离心40s，弃上清，ddH2O 400μl重悬，离心30s，弃上清；
(4)ddH2O50μl重悬，涂于酿酒酵母菌体繁殖平板固体培养基SD-Ura，29℃培养48-96h；
(5)同时按照上述方法将没有酶切的pYES2载体转化酿酒酵母INVSc1感受态细胞，得到转空载体酵母；
步骤六：转基因酵母阳性株的鉴定及诱导表达
酵母扩增液体培养基SD-Ura(1L)配制见如下：
(1)称取SD-Ura 8g加入950mL蒸馏水中，溶解后121℃高压灭菌15-18分钟；
(2)冷却后加入50mL，40％无菌葡萄糖，备用；
酵母蛋白诱导液体培养基SD-Ura(1L)配制见如下：
(1)称取SD-Ura 8g加入950ml蒸馏水中，溶解后121℃高压灭菌15-18分钟；
(2)待培养基温度降到55℃时，加入已过滤的carbon source：20％的半乳糖100ml，10％的棉子糖100ml，备用。
酵母单克隆鉴定
(1)挑取酵母克隆，在盛有1ml的扩增液体培养基SD-Ura中29℃，300rpm/min过夜培养；
(2)对转基因酵母进行PCR鉴定。用T7、CYC1 Terminator扩增产物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳检测，如果可以得到约1057bp的条带，说明GhHSD1基因已整合到酵母基因组中，结果如说明书附图5所示(引物：T7 5’+CYC1 Terminator 3’)；
lane 1～lane10有目的片段；M:MarkerⅢ
酵母阳性株筛选引物序列：T7引物：5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'
CYC1 Terminator引物：5'-GTGACATAACTAATTACATGATG-3'
从说明书附图5中能够看出，一共获得除11、12号单克隆外的10个转基因酵母阳性株系；
(3)对转空载体酵母进行PCR鉴定，用T7、CYC1 Terminator扩增产物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳检测，如果可以得到约155bp的条带，说明pYES2空载体已整合到酵母基因组中，如说明书附图6所示(引物：T7 5’+CYC1 Terminator 3’)；
lane 1～lane12有目的片段；M:MarkerⅢ
转空载体酵母筛选引物序列：T7引物：5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'
CYC1 Terminator引物：5'-GTGACATAACTAATTACATGATG-3'
转GhHSD1酵母的诱导表达
(1)随机选取3个转GhHSD1阳性酵母菌株(200μl菌液)分别接种至含30ml扩增培养基SD-Ura的200ml无菌三角瓶。在摇床中30℃、300rpm/min摇床生长至OD600＝30-35(约48h)。
(2)室温5000rpm离心5min收集沉淀物，弃除上清，用60ml蛋白诱导培养基SD-Ura重悬细胞，30℃，300rpm/min摇床继续培养48h，5000g离心1min，收集菌体沉淀。
(3)放入冷冻真空干燥仪进行24h干燥。
步骤七：酵母RNA的提取以及qRT-PCR验证基因表达
(1)用酵母RNA提取试剂盒提取步骤六中诱导表达后的酵母菌体沉淀的总RNA，用全式金反转录试剂盒合成cDNA，用全式金荧光定量试剂盒进行qRT-PCR验证。
(2)同时按照上述方法将pYES2载体转化酿酒酵母INVSc1的对照菌株进行培养和RNA提取和qRT-PCR检测。
qRT-PCR反应体系为：2×TransStar Top/Tip Green qPCR SuperMix 10μl、Forward Primer(10μM)0.4μl、Reverse Primer(10μM)0.4μl、Passive Reference Dye(50×)0.4μl、Template cDNA 2μl、RNase-Free Water up to 20μl。
qRT-PCR反应程序：预变性94℃(30s)；变性94℃(5s)，退火58℃(15s)，延伸72℃(12s)，45个循环。
融解曲线分析：95℃(15s)，60℃(1min)，95℃(15s)，10℃(2min)。
荧光定量引物序列：
RT-GhHSD1F：CGACTTGTTGAGGAAACCGTGAA
RT-GhHSD1R：GCATTGTAGACGCTTGTTCTTGG
RT-18SF：TTAGTTGGTGGAGTGATTTG
RT-18SR：GGTGGCTCTGTCAGTGTAG
结果如说明书附图7所示：3个转GhHSD1基因阳性酵母株系中的GhHSD1基因表达量极显著高于转空载体对照(p<0.001)，并将这3个阳性酵母株系分别命名为转GhHSD1酵母阳性株系1、转GhHSD1酵母阳性株系2和转GhHSD1酵母阳性株系3，用于下述脂肪含量测定。
步骤八：转基因酵母的脂肪及脂肪酸成分含量测定
转GhHSD1酵母总脂肪含量测定
用岛津-2030气相色谱仪分别对步骤六中获得的各菌体的总脂肪含量进行测定，结果如说明书附图8所示：转pYES2空载体对照株系的总脂肪含量分别为285.6.0mg/mL，而三个转GhHSD1酵母阳性株系1、株系2和株系3的总脂肪含量分别为323.2mg/mL、326.7.5mg/mL和347.7mg/mL。三个转GhHSD1酵母阳性株系1、株系2和株系3与对照株系相比总脂肪含量分别显著提高了13.16％、14.37％、21.74％；
转GhHSD1酵母脂肪酸组分测定
用岛津-2030气相色谱仪分别对步骤六中获得的各菌体的脂肪酸各组分含量进行测定，结果如说明书附图9所示：通过分析3个转基因酵母阳性株系各脂肪酸组分，发现肉豆蔻酸(C14:0)含量比非转基因对照菌株pYES2分别提高了12.4％、17.0％和21.6％；棕榈酸(C16:0)含量分别提高了14.8％、15.2％和23.6％；油酸(C18:1)的含量分别提高了12.6％、14.8％和20.8％。
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。
Figure BDA0002865250730000141
Figure BDA0002865250730000151
Figure BDA0002865250730000161
Figure BDA0002865250730000171
Figure BDA0002865250730000181

Claims (1)

1.一种棉花中GhHSD1基因的克隆方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一：药品的选择
(1)酶及试剂盒：KOD-Plus-Neo高保真PCR扩增酶、Target Clone-Plus平末端加A酶、T4DNA Ligase、
Figure FDA0002865250720000011
Green Realtime PCR qRT-PCR荧光定量酶、Gel Extraction Kit胶回收试剂盒、DNA Purification Kit PCR产物纯化试剂盒、PrimeScriptTM RTase RNA反转录试剂盒、DNAMarkerIII和GelStain EB替代物、RNAprep pure植物总RNA提取试剂盒、RNAprep pure酵母总RNA提取试剂盒、大肠杆菌感受态菌体、限制性内切酶EcoRI和XbaI；
(2)其他药品：琼脂糖、蛋白胨、酵母提取物、氯仿、异戊醇、乙醇、异丙醇、氯化钠、5-溴-4-氯-3-吲哚半乳糖苷、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷、氨苄青霉素、棉子糖、半乳糖、酵母缺陷型培养基SD-Ura；
(3)LB液体培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L，LB固体培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L、琼脂粉15g/L，定容至1L，LB选择培养基：在LB铺平板前，待培养基高压灭菌冷却至55℃时加入相应浓度抗生素，摇匀后铺平板；
(4)酵母筛选固体培养基SD-Ura：SD-Ura 8g，琼脂粉20g，葡萄糖20g；
(5)酵母扩增液体培养基SD-Ura：SD-Ura 8g，葡萄糖20g；
(6)酵母蛋白诱导液体培养基SD-Ura：SD-Ura 8g，半乳糖20g，棉子糖10g；
(7)主要仪器：PCR扩增仪、高速离心机、电泳设备、凝胶成像系统、荧光定量PCR仪、真空冷冻干燥仪、气相色谱仪；
步骤二：GhHSD1的电子克隆
将拟南芥的HSD1(AT5G50700.1)基因在测序得到的陆地棉(G.hirsutum,AD1)基因组数据(JGI)的gff3文件数据库中进行同源比对、搜索，找到相应目的序列后，采用Oligo 6软件设计引物，采用PCR技术从中棉所36中扩增出完整CDS序列1053bp，其中开放阅读框ORF为1053bp，编码350个氨基酸残基；
步骤三：克隆基因的过程
(1)试验材料中棉所36种植于中国农业科学院棉花研究所试验地的，按一般大田管理，所取部位有根、茎、叶、花、蕾、下胚轴、不同发育时期的胚珠和纤维，所取材料迅速投入液氮中冷冻，保存于-80℃冰箱备用，植物DNA提取采用改良的CTAB法，植物总RNA提取采用TIANGEN公司试剂盒；
(2)将200ng RNA反转录为cDNA，将反转录产物cDNA溶液稀释4倍作为PCR反应模板；以提取的各时期棉花胚珠总RNA为模板，利用的是TaKaRa的反转录试剂盒将其反转录为cDNA；
(3)进行PCR反应扩增目的基因采用Oligo6软件设计GhHSD1的引物，以反转录所得到的混合cDNA为模板对棉花GhHSD1基因进行PCR扩增；
引物序列：
GhHSD1-F:5′-ATGGATCTTATTCACAAGTTCCTCA-3′
GhHSD1-R:5′-TTAGTCAGTCTTAATCTCAGGTGAT-3′
(4)反应结束后4℃保存，用1％的琼脂糖电泳进行检测，条带大小符合预期设计则视为有效结果；
(5)对目的片段运用胶回收试剂盒进行切胶回收；
(6)将(5)中胶回收的产物连接PMD18-T载体并转化大肠杆菌；
(7)37℃过夜培养从抗性LB培养基上挑取单克隆到含有Amp的600ul LB培养基中37℃摇菌培养4h；
(8)菌液PCR验证，送含有目的基因片段大小条带的菌液测序；
步骤四：pYES2-GAL1::GhHSD1酿酒酵母表达载体的构建
(1)质粒提取及酶切
质粒提取采用质粒提取试剂盒，质粒浓度经检测为180ng/μl，琼脂糖凝胶电泳检测，没有蛋白污染，达到试验要求，内切酶选用EcoRI-XbaI进行双酶切；
(2)pYES2-GAL1::GhHSD1酿酒酵母表达载体的构建
目的基因ORF序列扩增：根据终载体pYES2的图谱设计EcoRI-XbaI为插入位点并合成引物，引物序列如下：
In-GhHSD1-F:5′-CAGTGTGCTGGAATTCATGGATCTTATTCACAAGTTCCTCA-3′(含酶切位点EcoRI)
In-GhHSD1-R:5′-GATGCGGCCCTCTAGATTAGTCAGTCTTAATCTCAGGTGA-3′(含酶切位点XbaI)
使用高保真酶扩增得到目的片段；
PCR反应程序：98℃预变性5min；循环为98℃变性10s，60℃退火30s，68℃延伸1min，共30个循环；68℃延伸5min；
电泳检测与回收：PCR产物在1.8％琼脂糖凝胶电泳，调节电压至90V，电泳1h，照相记录电泳结果，在紫外灯下观察，迅速切下目的条带，用胶回收试剂盒回收目的片段，具体方法按试剂盒说明书进行；
融合表达载体构建：
a.吸打混匀，稍微离心后加一滴矿物油；
b.16℃连接2h；
c.连接完后放入4℃冰箱中保存过夜。
连接产物的转化
a.超净工作台灭菌30min，从-70℃超低温冰箱中取出100μL的大肠杆菌DH5α感受态细胞，放于冰上，预冷10min；
b.取出一个Ep管，标上记号，置于冰上，加入80μL的感受态细胞(冰上操作)；
c.然后加入10μL的连接产物，用移液枪吸打混匀后冰浴30min；
d.冰浴结束后，放在42℃的恒温水浴锅中热激90s，然后迅速放入冰块中，冰浴2min；
e.吸500μL不含Amp的LB液体培养液到Ep管中，混匀，置于摇床中160rpm，37℃摇1h；
f.取出摇床结束的Ep管，2000～3000rpm离心5min，弃上清300μL，剩余的菌液轻柔吸打混匀后加在含Amp的LB固体培养皿中，用玻璃涂棒涂匀，涂干；
g.37℃恒温培养箱中培养16～20h；
h.随机挑取单克隆进行PCR验证结果；
所用引物序列为：
In-GhHSD1-F:5′-CAGTGTGCTGGAATTCATGGATCTTATTCACAAGTTCCTCA-3′
In-GhHSD1-R:5′-GATGCGGCCCTCTAGATTAGTCAGTCTTAATCTCAGGTGA-3′
i.对5号单克隆在含有Amp的LB培养基进行50ml扩繁，37℃条件下190rpm的摇床过夜，采用全式金公司质粒提取试剂盒提取质粒备用；
步骤五：转化酿酒酵母INVSc1
酵母筛选固体培养基SD-Ura(1L)配制如下：
(1)称取SD-Ura 8g，Agar 20g加入950mL蒸馏水中，溶解后121℃高压灭菌15-18分钟；
(2)冷却后加入50mL，40％无菌葡萄糖；
(3)在超净工作台内将培养基倒入无菌培养皿中，凝固后备用；
利用INVSc1感受态细胞进行转化，具体过程如下：
(1)取100μl冰上融化的酿酒酵母INVSc1感受态细胞，依次加入预冷的目的质粒2-5μg、Carrier DNA95-100℃，5min，快速冰浴，重复一次10μl，PEG/LiAc 500μl并吸打几次混匀，30℃水浴30min，15min时翻转6-8次混匀；
(2)将管放42℃水浴15min，7.5min时翻转6-8次混匀；
(3)5000rpm离心40s，弃上清，ddH2O 400μl重悬，离心30s，弃上清；
(4)ddH2O 50μl重悬，涂于酿酒酵母菌体繁殖平板固体培养基SD-Ura，29℃培养48-96h；
(5)同时按照上述方法将没有酶切的pYES2载体转化酿酒酵母INVSc1感受态细胞，得到转空载体酵母；
步骤六：转基因酵母阳性株的鉴定及诱导表达
酵母扩增液体培养基SD-Ura配制见如下：
(1)称取SD-Ura 8g加入950mL蒸馏水中，溶解后121℃高压灭菌15-18分钟；
(2)冷却后加入50mL，40％无菌葡萄糖，备用；
酵母蛋白诱导液体培养基SD-Ura配制见如下：
(1)称取SD-Ura 8g加入950mL蒸馏水中，溶解后121℃高压灭菌15-18分钟；
(2)待培养基温度降到55℃时，加入已过滤的carbon source：20％的半乳糖100ml，10％的棉子糖100ml，备用；
酵母单克隆鉴定
(1)挑取酵母克隆，在盛有1ml的扩增液体培养基SD-Ura中29℃，300rpm/min过夜培养；
(2)对转基因酵母进行PCR鉴定。用T7、CYC1 Terminator扩增产物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳检测，如果可以得到约1057bp的条带，说明GhHSD1基因已整合到酵母基因组中；
(3)对转空载体酵母进行PCR鉴定，用T7、CYC1 Terminator扩增产物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳检测，如果可以得到约155bp的条带，说明pYES2空载体已整合到酵母基因组中；
转GhHSD1酵母的诱导表达
(1)随机选取3个转GhHSD1阳性酵母菌株(200μl菌液)分别接种至含30ml扩增液体培养基SD-Ura的200ml无菌三角瓶。在摇床中30℃、300rpm/min摇床生长至OD600＝30-35(约48h)。
(2)室温5000rpm离心5min收集沉淀物，弃除上清，用60ml蛋白诱导培养基SD-Ura重悬细胞，30℃，300rpm/min摇床继续培养48h，5000g离心1min，收集菌体沉淀。
(3)放入冷冻真空干燥仪进行24h干燥；
步骤七：酵母RNA的提取以及qRT-PCR验证基因表达
(1)用酵母RNA提取试剂盒提取步骤六中诱导表达后的酵母菌体沉淀的总RNA，用全式金反转录试剂盒合成cDNA，用全式金荧光定量试剂盒进行qRT-PCR验证。
(2)同时按照上述方法将pYES2载体转化酿酒酵母INVSc1的对照菌株进行培养和RNA提取和qRT-PCR检测。
qRT-PCR反应体系为：2×TransStar Top/Tip Green qPCR SuperMix 10μl、ForwardPrimer(10μM)0.4μl、Reverse Primer(10μM)0.4μl、Passive Reference Dye(50×)0.4μl、Template cDNA 2μl、RNase-Free Water up to 20μl。
qRT-PCR反应程序：预变性94℃(30s)；变性94℃(5s)，退火58℃(15s)，延伸72℃(12s)，45个循环。
融解曲线分析：95℃(15s)，60℃(1min)，95℃(15s)，10℃(2min)。
荧光定量引物序列：
RT-GhHSD1F：CGACTTGTTGAGGAAACCGTGAA
RT-GhHSD1R：GCATTGTAGACGCTTGTTCTTGG
RT-18SF：TTAGTTGGTGGAGTGATTTG
RT-18SR：GGTGGCTCTGTCAGTGTAG
步骤八：转基因酵母的脂肪及脂肪酸成分含量测定
转GhHSD1酵母总脂肪含量测定
用气相色谱仪分别对步骤六中获得的各菌体的总脂肪含量进行测定；
转GhHSD1酵母脂肪酸组分测定
用气相色谱仪分别对步骤六中获得的各菌体的脂肪酸各组分含量进行测定。
CN202011581758.0A 2020-12-28 2020-12-28 一种棉花中GhHSD1基因的克隆方法 Pending CN112877344A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011581758.0A CN112877344A (zh) 2020-12-28 2020-12-28 一种棉花中GhHSD1基因的克隆方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011581758.0A CN112877344A (zh) 2020-12-28 2020-12-28 一种棉花中GhHSD1基因的克隆方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112877344A true CN112877344A (zh) 2021-06-01

Family

ID=76043977

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011581758.0A Pending CN112877344A (zh) 2020-12-28 2020-12-28 一种棉花中GhHSD1基因的克隆方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112877344A (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110028566A (zh) * 2019-04-17 2019-07-19 中国农业科学院棉花研究所 GhPRXR1蛋白及其编码基因在调控棉籽含油量中的应用
CN111349651A (zh) * 2020-03-18 2020-06-30 山东师范大学 一种拟南芥hsd1/2/3/4/5/6六突变体及其构建方法和应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110028566A (zh) * 2019-04-17 2019-07-19 中国农业科学院棉花研究所 GhPRXR1蛋白及其编码基因在调控棉籽含油量中的应用
AU2020100579A4 (en) * 2019-04-17 2020-08-06 Institute Of Cotton Research Of The Chinese Academy Of Agricultural Sciences APPLICATION OF GhPRXR1 PROTEIN AND CODING GENE THEREOF IN REGULATING AND CONTROLLING OIL CONTENT OF COTTONSEED
CN111349651A (zh) * 2020-03-18 2020-06-30 山东师范大学 一种拟南芥hsd1/2/3/4/5/6六突变体及其构建方法和应用

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GENBANK: "PREDICTED: Gossypium hirsutum 11-beta-hydroxysteroid dehydrogenase 1B-like (LOC107949608), mRNA，XM_016884327.1", 《GENBANK》 *
SÉBASTIEN BAUD ET AL.: "Regulation of HSD1 in Seeds of Arabidopsis thaliana", 《PLANT CELL PHYSIOL》 *
ZHE ZHANG ET AL.: "OsHSD1, a hydroxysteroid dehydrogenase, is involved in cuticle formation and lipid homeostasis in rice", 《PLANT SCIENCE》 *
和小燕 等: "花生籽仁不同发育时期的转录组测序分析", 《分子植物育种》 *
张哲: "水稻叶片蜡质基因OsHSD1的克隆与功能分析", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(博士) 农业科技辑》 *
边盈盈: "陆海回交自交系群体油分含量QTL定位及候选基因GhHSD1的功能初步分析", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士) 农业科技辑》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109182373B (zh) 一种利用基因编辑技术获得高油酸油菜的方法
CN110028566B (zh) GhPRXR1蛋白及其编码基因在调控棉籽含油量中的应用
CN111560371B (zh) 一种基于CRISPR/Cas9的甘蓝型油菜基因编辑材料
CN107723294B (zh) 一种甘蔗糖转运蛋白ShSWEET2基因及其应用
CN114736916B (zh) 紫苏PfLPAT2-3基因在提高植物总脂含量中的应用
CN109266647B (zh) 水稻二化螟为害诱导型启动子及其应用
CN107400671A (zh) 梨果实糖转运蛋白基因PbTMT4及其应用
CN114990153B (zh) 水稻脂质转移蛋白在提高稻米脂肪酸含量和降低稻米垩白度中的应用
CN112877344A (zh) 一种棉花中GhHSD1基因的克隆方法
CN103044534A (zh) 紫花苜蓿抗旱相关基因及其编码的蛋白和应用
CN102533804B (zh) 白沙蒿Δ12脂肪酸脱氢酶(As FAD2)基因及用途
CN112266974B (zh) 一种用于鉴定龙须菜性别的引物及鉴定方法
CN109207486B (zh) 马铃薯cisr2基因及其在抗低温糖化中的应用
CN109706150B (zh) 一种花生种子特异表达启动子ahssp29及其应用
CN108034666B (zh) 沙棘gpd1基因
CN112694523A (zh) 白菜型油菜Bra014815基因在调控分枝数和株型上的应用
CN115838744B (zh) 一种山桐子1，2rhat基因及应用
CN115094084B (zh) 水稻OsRS基因在选育高种子活性水稻中的应用
CN118127042B (zh) GhBC1基因及其相关生物材料在调控植物油脂积累中的应用
CN118109508B (zh) 一种GhGPAT10基因在调控植物油脂积累中的应用
CN114621962B (zh) 花生AhBI-1基因VIGS沉默体系
CN117304288B (zh) 一种水稻分蘖角度相关蛋白OsITAND及其编码基因及应用
CN108165566B (zh) 沙棘gpd1基因的构建方法
CN112626096A (zh) 一种创建高棕榈酸和多叶片转基因植株的方法及应用
CN118561976A (zh) GmABI3蛋白在提高大豆蛋白质含量或降低大豆油分含量中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination