DE60035860T2

DE60035860T2 - Rationale auswahl von mutmasslichen peptiden aus identifizierten nukleotid- beziehungsweise peptidsequenzen

Info

Publication number: DE60035860T2
Application number: DE60035860T
Authority: DE
Inventors: Jose Antonio Camara Y Ferrer; Christophe Thurieau; Jean Martinez; Gilbert Berge; Catherine Residence Ch GOZE
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Societe de Conseils de Recherches et dApplications Scientifiques SCRAS SAS
Current assignee: Ipsen Pharma SAS; Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 1999-02-25
Filing date: 2000-02-24
Publication date: 2008-04-24
Anticipated expiration: 2020-02-25
Also published as: US20020059032A1; CA2363697A1; ATE369440T1; DE60035860D1; US6507788B1; IL144986A; IL144986A0; JP2002538517A; EP1163366B1; AU2920900A; WO2000050636A1; ES2291192T3; AU781932B2; EP1163366A1

Description

DIE ERFINDUNG BETREFFENDER STAND DER TECHNIK:
(i) Bereich der Erfindung
Die Erfindung bezieht sich auf eine Methode zur Identifizierung von putativen Peptiden, die von Nucleotid- oder Peptidsequenzen unbekannter Funktion stammen, wie beispielsweise von Vorläufern von sowohl Nucleinsäuren als auch Peptiden, die ein amidiertes C-terminales Ende umfassen, und insbesondere auf eine Methode, die dadurch gekennzeichnet ist, dass die Vorläufer von putativen Peptiden ausgehend von einer genetischen Datenbank identifiziert werden.
(ii) Beschreibung des nahen Stands der Technik
Bekanntlich führen manche Kombinationen von Nucleotiden, wenn sie in einem Polynucleotid vorliegen, zu gewissen Eigenschaften in dem Polypeptid, das daraus translatiert ist. Ein Beispiel umfasst diese Nucleotide, die die Vorläufer von Polypeptidhormonen codieren, die einer posttranslationalen Amidierungsreaktion ausgesetzt werden. Ein anderes Beispiel, wie es im amerikanischen Patent Nr. 4,917,999 offenbart ist, bezieht sich auf gewisse Nucleotide, die für Polypeptide kennzeichnend sind, die eine α-Amylase-Enzymaktivität manifestieren.
Die amidierten Polypeptidhormone werden in der Form eines Vorläufers synthetisiert, die eine Reifung erfährt. Diese Reifung besteht in einer Amidierungsreaktion. Die Amidierungsreaktion des C-terminalen Endes ist eine für die ami dierten Polypeptidhormone charakteristische Reaktion. Diese Reaktion, die an dem Vorläufer eines oder mehrerer Hormone stattfindet, gestattet die Reifung des Hormons und gewährleistet auch seine biologische Stabilität in dem physiologischen Medium: die gebildete Amidgruppe ist weniger anfällig als die freie saure Funktion. Das Hormon ist infolgedessen widerstandsfähiger gegenüber Carboxypeptidasen, es bleibt in der Zelle länger aktiv und bewahrt eine optimale Affinität für seine Rezeptorstelle.
Die Amidierung wurde ausführlich beschrieben ("Peptide amidation", Alan F. Bradbury und Derek G. Smyth, TIBS 16: 112-115, März 1991 und "Functional and structural characterization of peptidylamidoglycolate lyase, the enzyme catalysing the second step in peptide amidation", A. G. Katopodis, D. S. Ping, C. E. Smith und S. W. May, Biochemistry, 30(25): 6189-6194, Juni 1991) und ihr Mechanismus ist der folgende:

1 – Spaltung der Kette des Polypeptidvorläufers des Hormons durch eine Endoprotease auf Höhe einer Sequenz von zwei basischen Aminosäuren (d.h. eine Sequenz von zwei Aminosäuren, die aus Arginin und/oder Lysin ausgewählt sind),
2 – Dann zwei Spaltungen durch die Carboxypeptidase, die zum verlängerten Glycinzwischenprodukt führt,
3 – Das Enzym PAM (Peptidyl-glycine-α-Amidating Monooxygenase) umfasst zwei verschiedene enzymatische Aktivitäten: zunächst wandelt es das verlängerte Glycinzwischenprodukt in ein α-Hydroxyglycinderivat um, wobei die Untereinheit des beteiligten Enzyms PAM die PAM ist (Peptydyl-glycine-α-Hydroxylating Monooxygenase). Das erhaltene Derivat dient als Substrat für die zweite PAM-Untereinheit (PAL ge nannt: Peptidyl-α-hydroxyglycine α-Amidating Lyase), die die Aminfunktion des Glycins an der an die N-terminale Seite unmittelbar anschließende Aminosäure bindet und Glyoxylat freisetzt.

Diese Reaktion setzt die Anwesenheit einer Erkennungsstelle an dem Vorläufer des Hormons oder der Hormone ein, eine Stelle, die immer die Sequenz: Glycin und zwei basische Aminosäuren (Arginin oder Lysin) umfasst. Bekanntlich umfassen die amidierten Polypeptidhormone, die außerhalb des endoplasmatischen Retikulums sekretiert werden, eine Konsensus-Signalsequenz von etwa fünfzehn bis dreißig Aminosäuren, wobei diese Sequenz am N-terminalen Ende der Polypeptidkette vorliegt. Sie wird später durch ein Enzym Signalpeptidase geschnitten, so dass sie in dem Protein nicht mehr aufgefunden werden kann, nachdem sie sekretiert wurde.
Angesichts der Bedeutung der bekannten amidierten Polypeptide in Zusammenhang mit zahlreichen biologischen Systemen hat man Methoden zur Identifizierung von zusätzlichen amidierten Polypeptiden gesucht. Leider ist heute die Entdekkung eines neuen Proteins nicht einfach.
Bisher wurden eine gewisse Anzahl von Vorgehensweisen entwickelt, mit dem Ziel, neue Proteine von potentiellem biologischen Interesse zu identifizieren.
Bei einem dieser Vorgehensweisen isoliert man neue Proteine von Interesse ausgehend von einer Quelle, indem eine spezifische Eigenschaft selektiert wird, von der der Suchende denkt, dass sie von einem oder mehreren potentiellen Proteinen von Interesse in einer Probe besessen werden kann. Gemäß dieser Vorgehensweise kann man die Proteine durch un terschiedliche Techniken isolieren und reinigen: Ausfällung am isoelektrischen Punkt, selektive Extraktion durch gewisse Lösungsmittel und dann Reinigung durch Kristallisation, Verteilung im Gegenstrom, Adsorption, Aufteilung oder Ionenaustauschchromatographie, Elektrophorese.
Die oben beschriebenen herkömmlichen Techniken zur Isolierung von Proteinen bieten nur einen begrenzten Erfolg bei der Isolierung und Identifizierung von neuen biologischen Molekülen von Interesse. Diese Vorgehensweise impliziert die Kenntnis der Eigenschaften des zu isolierenden Proteins. Bei der Durchführung der Isolierung von Proteinen durch Verwendung einer gemeinsamen Eigenschaft sieht man sich typischerweise einer der beiden nachstehenden Situationen gegenüber. In der ersten Situation ist die gemeinsame Eigenschaft meistens der biologischen Funktion der Moleküle, die dabei sind, isoliert zu werden, nicht oder nur marginal zugeordnet. Man könnte beispielsweise zwei Proteine vorsehen, die identische isoelektrische Punkte teilen, aber biologische Funktionen ohne jede Beziehung besitzen. In der zweiten Situation könnte die Trennung auf der Basis einer gemeinsamen Eigenschaft vorgenommen werden, die sehr eng der biologischen Funktion des Moleküls zugeordnet ist, das im Begriff ist, isoliert zu werden. In dieser Kategorie könnte man beispielsweise Moleküle vorsehen, die sich an dasselbe aufnehmende Molekül binden. In der ersten Situation ist die Isolierung von potentiell neuen Polypeptiden sehr wenig fokussiert, und zwar aufgrund der Wahrscheinlichkeit der Isolierung von Verbindungen mit vollständig nicht verwandter biologischer Funktion. Im Gegensatz dazu leidet die letztgenannte Situation an der genau entgegengesetzten Unzulänglichkeit insofern, als sie die Isolierung nur einer sehr begrenzten Anzahl von in biologischer Hinsicht interessanten neuen Molekülen gestattet.
Auf diese Weise stand der Fachmann, der versuchte, potentiell neue Polypeptide von Interesse über herkömmliche Techniken zur Trennung von Proteinen zu isolieren, dem Dilemma gegenüber, dass er entweder ein Durcheinander von biologisch nicht verwandten Polypeptiden erhielt oder als Ersatzlösung eine nur spezifische Gruppe von Polypeptiden erhielt.
Ein anderer ernster Mangel der herkömmlichen Techniken zur Isolierung von neuen Polypeptiden aus einer Probe ist mit der Natur der Probe selbst verbunden. Es gibt natürlich nur eine begrenzte Anzahl von Polypeptiden, die für die Isolierung und die Identifizierung in einer gegebenen biologischen Probe verfügbar sind. Außerdem ist im Fall von Proben dieser Art Sorge zu tragen, dass die biologisch aktiven Moleküle, die sich darin befinden, kontinuierlich unversehrt bleiben.
Die früheren Versuche zur Isolierung und Charakterisierung von neuen Peptiden mit einem amidierten C-terminalen Ende haben, was nicht überraschend ist, den klassischen Weg eingeschlagen, der darin besteht, dass man von einer biologischen Probe ausgeht und dass man eine Methode aus dem Arsenal der bekannten Trenntechniken für die Isolierung und die Identifizierung der Peptide auswählt. Beispielsweise wurde in dem amerikanischen Patent Nr. 5,360,727 im Namen von Matsuo et al. ein vom Schwein stammendes Enzym zur alpha-Amidierung an einem C-Terminus durch Extraktion und Reinigung des Enzyms aus Schweinevorhofstreifen isoliert, die die enzymatische Aktivität manifestieren. Im amerikanischen Patent Nr. 5,871,995 im Namen von Iida et al. wurden Enzyme, die an der Amidierung am C-Terminus beteiligt sind, aus einem biologischen Material, wie Pferdeserum, durch Affini tätschromatographie gereinigt, indem ein Peptidglycin-Additionsprodukt mit C-Terminus als Ligand verwendet wurde. Im amerikanischen Patent Nr. 4,708,934 im Namen von Gilligan et al. wurde ein alpha-amidierendes Enzym Peptidylglycin-Monooxygenase aus den Zellenlinien und Gewebeproben von medullärem Schilddrüsenkrebs extrahiert. Dort, wo die Identifizierung einer wesentlichen Anzahl von neuen zur Amidation fähigen Polypeptiden das Ziel bildet, sind klassische Isolationstechniken wie diese vollständig ungeeignet, da sie typischerweise nur die Isolierung eines einzigen Polypeptids von Interesse aus einer Quelle, die dieses Polypeptid enthalten kann, gestatten.
In der Patentanmeldung PCT WO 99/10361 hat die Inhaberin der vorliegenden Anmeldung eine Methode entwickelt, die eine große Anzahl der oben diskutierten Nachteile überwindet, da sie die schnelle Identifizierung einer großen Anzahl von putativen Peptiden, die ein amidiertes C-terminales Ende umfassen, gestattet. Im Gegensatz zu den bisherigen Techniken, die eine besondere physikalische Eigenschaft des Polypeptids benutzen, um es aus einer Quelle zu isolieren, von der man vermutet oder weiß, dass sie es enthält, beruht die von der Patentinhaberin entwickelte Methode auf einem Merkmal der Peptidsequenz des Vorläufers aller bisher bekannten amidierten Hormone, wodurch die gleichzeitige Erfassung von mehreren neuen Hormonen dieser Kategorie gestattet wird. Diese Technik beruht insbesondere auf der direkten Identifizierung der Nucleotidsequenz, die für die Vorläufer codiert, in cDNA-Banken, die aus Geweben hergestellt wurden, in denen die Vorläufer dieser Hormone synthetisiert werden können.
Die Methode der Anmeldung PCT WO 99/10361 gestattet die Identifizierung des Vorläufers mit einem amidierten C-ter minalen Ende durch die folgenden aufeinander folgenden Schritte:

1 – Herstellung einer DNA-Bank;
2 – Hybridisierung eines oder mehrerer Oligonucleotide OX mit der DNA-Bank;
3 – Identifizierung der DNA-Sequenz oder der DNA-Sequenzen der Bank, die sich mit einem Oligonucleotid OX hybridisieren;
4 – Identifizierung eines oder mehrerer Peptide mit einem möglichen amidierten C-terminalen Ende in dieser Sequenz oder in diesen Sequenzen.

OX ist ein einsträngiges Oligonucleotid, das sich unter milden Bedingungen mit einem Oligonucleotid OY der Sequenz Y1-Y2-Y3-Y4-Y5 hybridisieren kann, in der Y1 eine Nucleotidsequenz von 1 bis 12 Nucleotiden ist oder Y1 entfällt, Y2 ein TriNucleotid darstellt, das für Gly codiert, Y3 und Y4 unabhängig voneinander ein Trinucleotid darstellen, das für Arg oder Lys codiert und Y5 eine Nucleotidsequenz von 1 bis 21 Nucleotiden darstellt oder Y5 entfällt.
Die DNA-Bank ist vorzugsweise eine cDNA-Bank. Eine cDNA-Bank enthält die cDNA, die der aus einer gegebenen Zelle extrahierten Cytoplasma-mRNA entspricht. Die Bank wird komplett genannt, wenn sie mindestens einen Bakterienklon für jede Ausgangs-mRNA umfasst. Die Hybridisierung findet statt, wenn zwei Oligonucleotide im Wesentlichen komplementäre Nucleotidsequenzen besitzen und wenn sie sich über ihre ganze Länge kombinieren können, indem sie zwischen den komplementären Basen Wasserstoffbindungen ausbilden.
Es hat sich herausgestellt, dass die Suche mit Hilfe dieser Methode der Anmeldung PCT WO 99/10361 viel weniger restriktiv als die oben erwähnten klassischen Techniken der Biochemie ist, da:

– sie die Isolierung von mehreren verschiedenen Vorläufen, die im selben Gewebe vorliegen, nach demselben Prinzip durchführen kann;
– sie die Erfassung von Vorläufern, die den Hormonen entsprechen, die sehr verschiedene biochemische und biologische Eigenschaften besitzen, unter denselben technischen Bedingungen gestattet;
– sie die gleichzeitige Identifizierung aller Peptidhormone gestattet, die in demselben Vorläufer enthalten sein können.

Infolgedessen gestattet die in der Anmeldung PCT WO 99/10361 formulierte Selektionstechnik eine nicht vernachlässigbare Einsparung an Zeit und Geld in einem Sektor, in dem die Kosten für Forschung und Entwicklung einen sehr hohen Anteil des Umsatzes darstellen.
Indem mit ihr eine große Anzahl von in therapeutischer Hinsicht potentiell nützlichen Polypeptiden erhalten werden kann, gestattet die entwickelte Technik die pharmakologische Untersuchung der Substanzen, die eine grundlegende physiologische Rolle im Organismus von Säugern spielen:
Hormone und insbesondere amidierte polypeptidische Neurohormone. Angesichts der erstmaligen Verfügbarkeit von zu aktiven Substanzen entsprechender cDNA ist es jetzt möglich, einen klonierten Vektor gentechnisch einzuführen, um mit Hilfe von Mikroorganismen zur Synthese von Hormonen mit einer therapeutischen Verwendung zu führen.
Obwohl sich zahlreiche signifikante Vorteile hinsichtlich der Fähigkeit ergeben, schnell eine große Anzahl von putativen Kandidaten-Peptidmolekülen zu erhalten, die als Vorläufer für die Peptide mit einem amidierten C-terminalen Ende dienen, bleiben noch gewisse Schwierigkeiten, die mit der Verwendung einer cDNA-Bank zur Ausführung der Auswahl durch „Screening" verbunden sind. Wie früher diskutiert wurde, leitet sich die cDNA-Bank typischerweise von einer einzigen Zelle ab und enthält infolgedessen nur die Polypeptide die in dieser Zelle exprimiert sind. Dies bedeutet, dass die Selektionsmethode ein putatives Peptid, selbst wenn es in dem Genom der Zelle vorliegt, nicht erfasst, wenn dieses Peptid in dieser Zelle nicht exprimiert ist. Selbst wenn ein Polypeptid von Interesse in der Zelle exprimiert ist, ist die Selektionstechnik außerdem notwendigerweise auf die Polypeptide beschränkt, die durch diese spezielle Zelle und damit durch die spezielle Lebensspezies, von der die Zelle abgeleitet ist, exprimiert werden. Dies macht die Selektion der beträchtlichen Anzahl von putativen Peptiden, die von Interesse sind, schwierig.
Die Methode der Anmeldung PCT WO 99/10361 hat auf diese Weise eine sehr starke Einschränkung bei der Identifizierung von putativen Peptiden gelöst, die als Vorläufer von Peptiden mit einem amidierten C-terminalen Ende dienen. Genauer gesagt: die Methode der Anmeldung PCT WO 99/10361 liefert zwar die Mittel, mit deren Hilfe man eine cDNA-Bank auf der Suche nach allen möglichen Sequenzen mit der gewünschten Eigenschaft der posttranslatorischen Amidierung sondieren kann, aber ihre Anwendung war auf die gefundenen cDNA beschränkt, die in der cDNA-Bank vorhanden waren.
Vor kurzem hat man sich mit der Verwendung der verfügbaren Datenbanken beschäftigt, die beträchtliche Anzahlen von Nucleotidsequenzen enthalten, um beispielsweise eine Sequenz von Interesse mit bekannten Sequenzen zu vergleichen.
In dem amerikanischen Patent Nr. 5,706,498 wird beispielsweise ein System zur Extraktion von Daten aus einer Bank offenbart, um eine Gensequenz zu erhalten, die eine Sequenz besitzt, die einer von einer Gendatenbank kommenden Sequenzinformation ähnlich ist. Die Gendatenbank speichert die Sequenzdaten von Genen deren Strukturen oder Sequenzen bereits analysiert und identifiziert wurden. Das System umfasst eine Operationseinheit zur dynamischen Programmierung, um den Grad der Ähnlichkeit zwischen den Zieldaten und den Schlüsseldaten zu bestimmen, indem die von der Gendatenbank kommenden Daten der Basensequenzen des Gens als Zieldaten und die Daten der Basensequenzen als Schlüssel für die Extraktion verwendet werden, und eine zentrale Verarbeitungseinheit, um den Prozess des Zugangs zu den Daten durchzuführen, damit der Zugang zur Gendatenbank parallel zu dem Operationsprozess gestattet wird, um den Ähnlichkeitsgrad zu bestimmen, indem die Sequenzdaten der Basen der Gendatenbank kontinuierlich nacheinander zur Operationseinheit zur dynamischen Programmierung als Zieldaten übertragen werden, indem die Gendatenbank und die Operationseinheit zur dynamischen Programmierung kontrolliert werden.
Das amerikanische Patent Nr. 5,873,082 offenbart eine Methode zur Suche in einer Gendatenbank, die dadurch gekennzeichnet ist, dass eine zu einer gegebenen Sequenz homologe Sequenz Gegenstand einer Suche in der Gendatenbank ist und dass die Ergebnisse in Form von Ausgängen, die in einer Folge von zunehmender Homologie klassifiziert sind, formuliert sind. Gemäß diesem Patent kann man auf eine wirksame Weise eine Vielzahl von Listen vergleichen, die Ähnlichkeiten und Unterschiede besitzen. Im Fall der Suchergebnisse der Gendatenbank kann man schnell eine große Anzahl von Listen einschließlich einer umfangreichen Anzahl von Sequenzennamen vergleichen.
Das amerikanische Patent Nr. 5,577,249 offenbart eine Methode zur Lokalisierung einer Bezugssequenz in einer Datenbank. Die am meisten bevorzugte Ausführungsform hat eine spezifische Anwendung auf die Suche des Genoms von lebenden Organismen, insbesondere des menschlichen Genoms, um die Standorte und die Nutzen der Nucleotidsequenzen und anderer biologischer Informationen zu finden, die man über DNA-Sequenzen findet. Die Methode verwendet im Handel erhältliche Datenbanken des menschlichen Genoms, die Untersequenzen der DNA-Ketten besitzen, die in Token-Nucleotidsequenzen zerlegt sind. Hierbei wird ein einziger dem originalen DNA-Strang zugeordneter Originalindex erzeugt. Eine Bezugsnucleotidsequenz wird selektiert. Der Bezugsindex und der Ursprungsindex werden verglichen. Die Methode wurde auf die Zuordnung der Bezugssequenzen von Nucleotiden für das Genom von E. coli angewandt, das annähernd 4 Millionen Nucleotide enthält.
Das amerikanische Patent Nr. 5,701,256 offenbart eine Methode und eine Vorrichtung, die zum Vergleichen von Sequenzen bestimmt sind, dadurch gekennzeichnet, dass man neue Proteinsequenzen mit bekannten Sequenzen vergleicht, die beispielsweise von einer Sequenzdatenbank kommen, um typischerweise zu bestimmen, welches Ähnlichkeitsniveau den Proteinen hinsichtlich strukturaler und funktioneller Merkmale gemeinsam ist.
Das amerikanische Patent Nr. 5,523,208 offenbart eine Methode zum Screenen von Datenbanken von Nucleotiden oder DNA-Sequenzen, um die genetischen Regionen oder die Gene zu identifizieren, die für Proteine codieren, die in biologischer Hinsicht in Wechselwirkung treten. Insbesondere liefert die Methode ein Mittel zum Screenen von Datenbanken, die sich aus kloniertem genetischen Material zusammensetzen, einschließlich, jedoch ohne darauf beschränkt zu sein, der DNA, der RNA, der mRNA, der tRNA und der Nucleotidfragmente, um die genetische Funktion des genetischen Materials unbekannter Funktion zu identifizieren. Die Methode erzeugt im Fall der Verwendung an DNA-Fragmenten von unbekanntem Codierungspotential eine Liste von Genfragmenten, die für Proteine codieren, die das Potential der Bildung von komplexen oder multimeren Konfigurationen mit dem unbekannten Protein haben.
Die Schrift Nevill-Manning C. G. et al.: "Highly specific Protein sequence motifs for genome anlysis", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 95, 1998, Seiten 5865-5871, beschreibt eine Methode, um durch Screenen von Datenbanken auf der Suche eines gegebenen Sequenzalignment neu sequenzierten Genen eine Funktion zuzuweisen. Dieses Screenen von Datenbanken wird ausgehend von einem Proteinsequenzmotiv durchgeführt, das nach Transduktion von neuen identifizierten Genen erhalten wird, und umfasst außerdem die Überprüfung des Vorhandenseins eines offenen Leserahmens (OLR).
Wie die vorstehende Diskussion zeigt, ist eine der Hauptanwendungen der informatisierten Methoden zur Datenbanksuche von genetischen Informationen der Vergleich einer neu gefundenen Sequenz von unbekannter Funktion mit einer Sequenzdatenbank von bekannter Funktion. Das Ziel von Metho den dieser Art ist es natürlich, die Funktion des unbekannten Proteins zu ermitteln, indem es hinsichtlich Struktur ähnlichen Proteinen mit bekannter Funktion angenähert wird. Eine andere Anwendung der informatisierten Methoden ist es, in einer Datenbank die Sequenzen zu finden, die hinsichtlich der Struktur verbunden sind. Andere Methoden sind auf das Auffinden von Sequenzen gerichtet, die mit einer bekannten Sequenz Komplexe bilden. Der zentrale Punkt aller dieser Methoden ist im Allgemeinen der Vergleich einer Sequenz mit einer anderen Sequenz, wobei es mehr darum geht, zu bestimmen, welche Sequenzen hinsichtlich Struktur ähnlich sind, als zu bestimmen, welche von einer großen Gendatenbank kommenden Gene eine gegebene biologische Eigenschaft besitzen, selbst wenn Gene dieser Art nicht hinsichtlich der Struktur streng ähnlich sind.
ZUSAMMENFASSUNG UND ZIELE DER ERFINDUNG:
Primäres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, die Nachteile bezüglich der Verfahren des Stands der Technik zu überwinden, die auf die Identifizierung von in biologischer Hinsicht interessanten Molekülen gerichtet sind, und die aus einer großen Gruppe von Kandidatenmolekülen ausgewählt sind. Dieses Ziel wird durch Schaffung eines Verfahrens gemäß Anspruch 1 zur Identifizierung der putativen Peptide von einer gegebenen Funktion erreicht, die aus Nucleotidsequenzen oder Peptidsequenzen unbekannter Funktion durch Screenen einer Datenbank auf der Suche nach dem Vorhandensein einer besonderen, für die Peptide von gegebener Funktion kennzeichnenden Kombination von Nucleotiden oder Aminosäuren ausgewählt werden.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Identifizierung eines putativen Peptids von einer gegebenen Funk tion zur Verfügung, das nicht auf diese in einer besonderen biologischen Quelle exprimierten Peptide beschränkt ist, beispielsweise weil das Protein in dieser Quelle nicht exprimiert ist.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Identifikation eines putativen Peptids von einer gegebenen Funktion zur Verfügung, das bei der Identifizierung nicht von den physikalischen Eigenschaften des Peptids, wie dem isoelektrischen Punkt oder der Löslichkeit, abhängt.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Identifizierung eines putativen Peptids von einer gegebenen Funktion zur Verfügung, das auf die Proteine anwendbar ist, die ferner in ihren physikalischen Eigenschaften nicht verwandt sind.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Identifizierung eines putativen Peptids einer gegebenen Funktion zur Verfügung, das aus Kandidatenpolypeptiden ausgewählt ist, die einen sehr niedrigen Homologiegrad miteinander manifestieren.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Identifizierung eines putativen Peptids von einer gegebenen Funktion zur Verfügung, das die pharmakologische Untersuchung von aktiven Substanzen erleichtert, die eine grundlegende physiologische Rolle in einem Organismus spielen, wie die Hormone und insbesondere die amidierten Polypeptidhormone.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Identifizierung eines putativen Peptids von einer gegebenen Funktion zur Verfügung, das mit Hilfe von verfügbaren geneti schen Datenbanken und verfügbarer Software ausgeführt werden kann.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Identifizierung eines Vorläufers eines Peptids zur Verfügung, das ein amidiertes C-terminales Ende umfasst, umfassend die folgenden Schritte:

(i) Herstellung einer Datenbank von Polynucleotiden oder Polypeptiden;
(ii) Screenen der Datenbank auf der Suche nach dem Vorliegen einer Kombination von Nucleotiden oder Aminosäuren, die für den Vorläufer des das amidierte C-terminale Ende umfassenden Peptids kennzeichnend ist;
(iii) Identifizierung der Polynucleotid- oder Polypeptidsequenzen, die die Kombination von Nucleotiden oder Aminosäuren umfassen, die für den Vorläufer des das amidierte C-terminale Ende umfassenden Peptids kennzeichnend ist.

Die Datenbank umfasst vorzugsweise Polynucleotidsequenzen und/oder Polypeptidsequenzen, die den Polynucleotidsequenzen entsprechen, und optionsweise Zugangsnummern für die Polynucleotidsequenzen. Wenn die Polypeptidsequenzen in der Datenbank nicht verfügbar sind, können sie durch Transduktion der Polynucleotidsequenzen in der Datenbank erhalten werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden drei verschiedene Polypeptidsequenzen erhalten, die der Transduktion von drei verschiedenen Leserahmen dieser Polynucleotidsequenzen entsprechen.
Die Datenbank kann außerdem eine sich auf die Polypeptidsequenzen oder auf die Polynucleotidsequenzen beziehende An notationsinformation umfassen, wie mindestens eine Information, die aus dem Ursprung, der Quelle, den Kennzeichen und den Bezugszeichen für die Sequenzen ausgewählt ist.
Bei der Siebung der Datenbank bevorzugt man zunächst, das Startcodon AUG in einer Polynucleotidsequenz zu lokalisieren, und die Tatsache zu überprüfen, ob kein Stopcodon zwischen diesem Startcodon AUG und der Nucleotidkombination, die für den Vorläufer des das amidierte C-terminale Ende umfassenden Peptids kennzeichnend ist.
Nach der Durchführung des Schritts der Identifizierung der Nucleotid- oder Polypeptidsequenzen können die identifizierten Sequenzen mit Sequenzen von bekannter biologischer Funktion und mit den identifizierten Sequenzen, deren biologische Funktion unbekannt ist, verglichen werden.
Alternativ kann nach der Durchführung des Schritts der Identifizierung der Nucleotidsequenzen oder Polypeptidsequenzen die Ähnlichkeit der selektierten Sequenzen von unbekannter biologischer Aktivität mit den Sequenzen von bekannter Funktion verglichen werden und, wenn keine ähnliche Sequenz gefunden wird, kann die Sequenz von unbekannter biologischer Aktivität zum Zweck einer weiteren Untersuchung selektiert werden. Wenn eine ähnliche Sequenz gefunden wird, kann die Sequenz von unbekannter biologischer Aktivität als Kandidatensequenz, die die putative Funktion der bekannten ähnlichen Sequenz manifestiert, selektiert werden.
Bei einer Ausführungsform kann die identifizierte Polypeptidsequenz erhalten werden und können die Eigenschaften der Polypeptidsequenz ermittelt werden.
Die Kombination der Nucleotide umfasst die Sequenz Y1-Y2-Y3-Y4-Y5, in der Y1 eine Nucleotidsequenz von 1 bis 12 Nucleotiden ist oder entfällt, Y2 ein Codon für Gly ist, Y3 und Y4 unabhängig voneinander Codons für Arg oder Lys sind und Y5 eine Nucleotidsequenz von 1 bis 21 Nucleotiden ist oder Y5 entfällt.
Hinsichtlich der vorstehenden Ausführungen sowie anderer Ziele, Merkmale und Vorteile der Erfindung, die aus dem Nachstehenden hervorgehen, kann die Erfindung unter Bezugnahme auf die ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen und des beiliegenden Anspruchs besser verstanden werden.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN:
Unter "putativen Peptiden von einer gegebenen Funktion" versteht man Polypeptide, die von einer besonderen Oligonucleotidsequenz kommen, die für eine besondere Funktion kennzeichnend ist, die von einer großen Anzahl von Proteinen aus einer einzigen Spezies und/oder aus verschiedenen Spezies geteilt wird. Insbesondere hat sich herausgestellt, dass gewisse Oligonucleotidsequenzen gewissen Typen von Proteinen zugeordnet sind, wie Hormonen der C-terminalen Amidierung oder Amylasen. Die Erfindung ist jedes Mal anwendbar, wenn eine Oligonucleotidsequenz existiert, die für eine Funktion dieser Art kennzeichnend ist.
Unter "Vorläufer eines ein amidiertes C-terminales Ende umfassenden Peptids" versteht man jedes beliebige Vorläuferprotein, das eine Amidierungsreaktion am C-terminalen Ende erfährt, wie beispielsweise bei Bradbury et al. beschrieben wird.
Unter "Datenbank von Polynucleotiden und Polypeptiden" versteht man eine beliebige der öffentlich verfügbaren Datenbanken, wie FASTA, GENBANK, EMBL und SP-TREMBL, PIR, REBASE, PROSITE oder SWISS-PROT, die typischerweise Daten von Polynucleotidsequenzen und/oder Polypeptidsequenzen umfassen. Die Daten von Nucleotidsequenzen sind beispielsweise bei den Einrichtungen EMBL, GENBANK und an anderen Stellen, wie EXPASY, erhältlich. Die Daten dieser Art umfassen häufig auch ACCESSION-Nummern.
Wenn die Peptidsequenzen einer gegebenen ACCESSION-Nummer (beispielsweise in SWISS-PROT) entsprechen, ist diese "validierte" Sequenz in die Datenbank eingeschlossen. Im entgegengesetzten Fall wird die Nucleotidsequenz vorzugsweise durch Verwendung von technisch verfügbaren Programmen wie Translate übersetzt. Die Übersetzung wird unter Verwendung der der Nucleotidsequenz zugeordneten Daten (Ende 3' oder 5') und drei verschiedenen Leserahmen (N, N + 1, N + 2) durchgeführt. Wenn diese Information nicht verfügbar ist, wird die Übersetzung durchgeführt, indem gleichzeitig die verfügbare Nucleotidsequenz und ihre komplementäre Sequenz (sechs putative Peptide bei einer einzigen Nucleotidsequenz) verwendet werden.
Optionsweise umfassen die Datenbanken dieser Art außerdem Annotationen, die alle Informationen enthalten, die für eine besondere Sequenz verfügbar sind, wie ORIGIN [URSPRUNG], SOURCE [QUELLE], FEATURES [KENNZEICHEN], zugeordnete REFERENCES [BEZUGSZEICHEN] und der Sequenz zugeordnete COMMENTS [KOMMENTARE]. Dies erleichtert eine ergänzende Extraktion der Datenbank. Ein Beispiel der für die Annotation verfügbaren Information ist im Nachstehenden gegeben:
"Kombination von Nucleotiden oder Aminosäuren, die für den Vorläufer des das amidierte C-terminale Ende umfassenden Peptids kennzeichnend ist" soll vorzugsweise die Sequenz Y1-Y2-Y3-Y4-Y5 bedeuten, in der Y1 eine Nucleotidsequenz mit 1 bis 12 Nucleotiden ist oder entfällt, Y2 ein Codon für Gly ist, Y3 und Y4 unabhängig voneinander Codons für Arg oder Lys sind und Y5 eine Nucleotidsequenz mit 1 bis 21 Nucleotiden ist oder Y5 entfällt. Die besondere Kombination ist ausführlich in der Anmeldung PCT WO 99/10361 formuliert, deren Offenbarung hier als durch Bezug aufgenommen gilt.
Bei der bevorzugten Ausführungsform erhält man die zu screenende Datenbank, indem man das dem folgenden Skript ähnliche Skript SQL/plus benutzt:
Natürlich kann die Anzahl und die Größe der einzelnen Felder von ORACLE so eingestellt werden, dass sie sich an die Anzahl und an die Größe der Daten anpassen, die in die Tabellen importiert werden. Wenn ein anderer Informationstyp zu den öffentlichen Datenbasen hinzugefügt werden müsste, würde auf entsprechende Weise in ORACLE ein neues Feld erzeugt.
Beispielsweise enthalten die Felder SOLOCUS, SODEFINITION, SOACCESSION, SOORGANISM, SONID, SOKEYWORDS, SOSOURCE, SOREFERENCE, SOCOMMENT, SOFEATURES, SOBASECOUNT, SOSEQUENCE in Oracle jeweils die Eingaben LOCUS, DEFINITION, ACCESSION, ORGANISM, NID, KEYWORDS, SOURCE, REFERENCE, COMMENT, FEATURES, BASECOUNT, SEQUENCE der Datendateien der Genbank.
SOSPHASE enthält den Leserahmen (0, +1, +2), wenn die Peptidsequenz durch Verwendung des DNA-Übersetzers IHB erzeugt wird, SOPEPTIDE enthält die einer gegebenen SOACCESSION entsprechende Peptidsequenz, SOPEPTIDEORIGIN gibt schließlich an, wie die Peptidsequenz erhalten wurde (IHB's ADN Translator, GENBANK, SWISS-PROT, usw.).
Wenn eine FASIA-formatierte Datei (siehe unten) an der Stelle einer Genbank-formatierten Datei verwendet wird, wird die Kopfzeile im Feld SODEFINITION gespeichert, wenn es um eine Nucleotidsequenz geht und wenn die Nucleotidsequenz selbst in dem Fall SOSEQUENCE gespeichert ist. Wenn die Information, die im Begriff der Insertion in die Datenbank ist, eine Peptidsequenz ist, wird die Kopfzeile in SOPEPDEFINITION gespeichert und die Peptidsequenz wird in dem Feld SOPEPTIDE gespeichert, SOPEPTIDEORIGIN gibt wieder an, woher die Peptidsequenz kommt (GENBANK, SWISS-PROT, usw.).
Bei der Kompilation der Datenbank zum Zweck der Siebung nimmt man die Lesung und die Manipulation der Standarddateiformate vor, die verwendet werden, um die Programme "High Throughput Sequencing" [Sequenzierung mit hohem Durchsatz] und andere Programme "Genom" (beispielsweise FASTA, GENBANK) zu sichern. Die Datenabschnitte, die bezüglich des Screeningsschritts pertinent sind, beispielsweise die Annotationsdaten, werden nun identifiziert. Die gebildeten Felder werden in Oracle eingeführt. Wenn die Nucleotidsequenz ein 5'-Ende ist, wird die Sequenz direkt in eine Peptidsequenz übersetzt, wenn es sich um ein 3'-Ende handelt, wird die komplementäre Sequenz der gegebenen Sequenz erzeugt und für die Übersetzung verwendet (die Übersetzungsphase berücksichtigt die drei möglichen Leserahmen, um die Peptidsequenz zu erzeugen). Der letzte Schritt führt die Vorhersage der sekundären Struktur des Peptids ein, die auf der Informationstheorie beruhen kann, wie dem Programm, das von J. Garnier, D. Osguthorpe und B. Robson entwickelt wurde. Die Software verwendet alle Zuordnungsfrequenzen in einem Fenster von 17 Aminosäureresten. Nach einer Gegenvalidierung auf einer Datenbank von 267 Proteinen hat die Vorhersage eine mittlere Genauigkeit von 64,4 % bei einer Vorhersage in drei Zuständen (Helix, Beta-Strang und aufgerollt). Das Programm erzeugt zwei Datenausgänge, der eine gibt die Sequenz und die vorhergesagte sekundäre Struktur an, der andere gibt die Werte der Wahrscheinlichkeiten für jede sekundäre Struktur bei jeder Aminosäurenposition an. Die vorhergesagte sekundäre Struktur ist diejenige der höchsten Wahrscheinlichkeit, die mit einem Helixsegment von mindestens vier Resten und einem gestreckten Segment (beta-Strang) von mindestens zwei Resten kompatibel ist.
Wenn die von der Datenbank kommenden pertinenten Daten gesammelt sind, kann man eine Datenbank dieser Art auf der Suche nach dem Vorhandensein einer Kombination von Nucleotiden oder Aminosäuren screenen, die für den Vorläufer des Peptids, vorzugsweise von denjenigen, die das amidierte C- terminale umfassen, kennzeichnend ist. Das Ziel dieses Schritts ist es natürlich, die enorme Menge an nicht sortierten Daten in eine begrenzte Anzahl von putativen Peptiden von pharmazeutischem Interesse (Hormone oder potentielle Hormonfragmente oder endogene Rezeptorliganden und ähnliche Produkte) umzuwandeln. Auf die allgemeine Beschreibung des Prozesses folgt eine Anwendung auf eine Suche nach potentiellen amidierten Peptiden in der Datenbank Expressed Sequence Tags.
Der allgemeine Prozess kann insbesondere folgendermaßen ablaufen:

– Extraktion von automatisierten Sequenzen aus einer öffentlichen Quelle wie dem Internet (EMBL, GENBANK, SWISS-PROT, PDB, usw.)
– Analyse der Dateien und Import der Daten in ORACLE
– Selektion der Sequenzen aus einer Untermenge (beispielsweise GENBANK EST) oder aus der gesamten Datenbank
– Suche nach allen Sequenzen, die ein spezifisches Motiv von Interesse manifestieren, wie die Vorläufer eines ein amidiertes C-terminales Ende umfassenden Peptids
– Überprüfung des Fehlens von jedem STOP-Codon zwischen dem den Beginn des Leserahmens angebenden Codons AUG und dem gesuchten Motiv
– Selektion der Sequenzen von unbekannter biologischer Funktion
– Überprüfung, ob das Motiv, wenn man es findet, ein offener Leserahmen ist (Kozak-Konsensus-Sequenz)
– Vergleich der Umgebung des Standorts des Motivs mit derjenigen, die erforderlich ist (beispielsweise sekundäre Strukturen, die um eine Reifungsstelle, wie die Nähe von alpha-Helices oder beta-Faltblättern, erforderlich sind)
– Überprüfung des Vorhandenseins einer Ähnlichkeit der Sequenzen und anderer bekannter Sequenzen (Feld DEFINITION)
– Verwendung von Techniken der "sukzessiven Filtration" [English "threading"], um Sequenzen zu suchen, die eine ähnliche sekundäre Struktur manifestieren, wenn in der Datenbank keine ähnliche Struktur definiert ist
– Wenn man keine ähnliche Sequenz findet, Selektion der Sequenz, deren Funktion bestimmt werden soll, als synthetischer Kandidat
– Wenn ähnliche Sequenzen von bekannter Funktion gefunden werden, können die Sequenzen als synthetischer Kandidat selektiert werden, dessen putative Funktion diejenige der ähnlichen Sequenz ist

Die folgenden Beispiele dienen zur Veranschaulichung und dürfen nicht als Begrenzung des offenbarten und beanspruchten behandelten Materials interpretiert werden.
Beispiele

Unter Verwendung der oben beschriebenen Methode hat man die folgenden Peptide identifiziert.

Nummer	Sequenz	Ursprung
1	H-GQDSIEPVPGQK-NH2	DbEST
2	H-YARVQVVA-NH2	Prä-Pro-Bradykinin
3	H-YFKIDNVKKARVQVVA-NH2	Prä-Pro-Bradykinin
4	H-PLEPSGG-NH2	Gen HYAA
5	H-ELGRGPGPPLPERGA-NH2	Gen HYA22
6	H-YERNRQAAAANPENSRGK-NH2	Neurotropher Faktor, abgeleitet von der Gliazellenlinie
7	H-SLLSKVSQ-NH2	DNA reparierendes Protein (XP-C-Zellen)
8	H-VTQDPKLQM-NH2	Vorläufer des Glycoproteins CD4 (T-Zellen-Oberfläche)
9	H-DFPEEVAIVEEL-NH2	Vorläufer des Glucagon
10	H-MDVGGLSDPYVKVHLLQG-NH2	Synaptotagmin V
11	H-DPSLPVASSSSSSSKR-NH2	Die DNA reparierendes und die XP-C-Zellen ergänzendes Protein
12	H-PLLGSTLFIPI-NH2	Vorläufer von D-β-Hydroxybutyratdehydrogenase
13	H-DSGFQMNQLR-NH2	Vorläufer von Serotransferrin (Siderophilin)
14	H-LQLEETMPSPY-NH2	β-Isozym von DNA-Topoisomerase II
15	H-FSIATLRDFGV-NH2
16	H-FSVTTMRDFGM-NH2	Cytochrom P450 (durch Phenobarbital induzierbar)
17	H-DSSHAFTLDELR-NH2	Vorläufer von Melanotransferrin
18	H-DMVVFLDGGQLGTLV-NH2
19	H-LHISHDMTGPD-NH2
20	H-SLEGIFDDIVPD-NH2	Die Invasion von T-Lymphomen und Metastasen induzierendes Protein 1
21	H-SNYFMPFSA-NH2	Cytochrom P450 (Mephenytoin-4-dehydroxylase
22	H-SDAFVPFSI-NH2	Cytochrom P450
23	H-RTGALVLSRG-NH2	Vorläufer von Leukosialin (Sialoglycoprotein der Leucozyten)
24	H-ESSFQPEAGF-NH2
25	H-GGPISFSSSRS-NH2	Schwere Kette von Myosin (Typ B nicht muskulär)
26	H-IEKEAAQLQ-NH2
27	H-SDTSLTWNSVK-NH2	Vorläufer von Lactotransferrin (Lactoferrin)
28	H-FSLMTLRNFGM-NH2	Cytochrom P450 (S-Mephenytoin-4-hydroxylase)
29	H-FQLPLDKGN-NH2
30	H-SFSILGDFQN-NH2	Vorläufer des Von-Willebrand-Faktors
31	H-ALEKLDTEVN-NH2	Prä-mRNA Spleißfaktor SRP75
32	H-VAEIQGHAG-NH2	Vorläufer des knochenmorphogenetischen Proteins 4
33	H-LHNILGVETGGPG-NH
34	2H-SASDLTWDNLK-NH2	Vorläufer von Serotransferrin
35	I-ISELFTLE-NH2	DNA-Polymerase ε (katalytische Untereinheit A)
36	H-GGPGGPPGPLMEQMG-NH2	Protein der Bindung an die RNA
37	H-ALEWLGADRNE-NH2	dem FBKP-Rapamycin zugeordnetes Protein
38	H-DVDFEGTDEPIF-NH2	Hypothetisches Proteinfragment
39	H-GATPGKALVATP-NH2	Nucleolin
40	H-MKGPEVMAFIEQ-NH2	Protein Tyrosin Kinase
41	H-ESKLERTPQKNVQ-NH2	Untereinheit des Aktivators 1
42	H-PRATTPKTVRS-NH2	Histon H1T
43	H-MKTRQNKDSMSMRS-NH2	Ribosomales Protein S18
44	H-ERMGHHDDYYSRLR-NH2	Hilfsfaktor des kurzen nuklearen Ribonucleoproteins
45	H-LVEHYPEFI-NH2
46	H-FSVSTLRNLGL-NH2
47	H-SGTLIKIFQAS-NH2
48	H-FAEQDAKEEANKAM-NH2	Bindendes Protein FK506 (Peptidyl-prolyl-cis/trans-deisomerase)
49	H-ETKHGGHKN-NH2	Aspartyl/Asparaginyl β-Hydroxylase
50	H-LQEALSKAA-NH2	Hypothetisches Protein
51	H-PWTAVDTSVD-NH2	Vorläufer des kationenunabhängigen Mannose-6-Phosphat-Rezeptors
52	H-VIQYFASIAAIGDR-NH2	Schwere Kette von Myosin (Isoform α, Herzmuskel)
53	H-GYIGVVNRSQKDID-NH2	Dynamin-1
54	H-QLWDVAHSVKEKF-NH2	Glycogensynthase (Leber)
55	H-GNETSFVPSRRSG-NH2	Schwere Kette des Myosins (Isoform der glat
		ten Muskeln)
56	H-TDIFGVEETAI-NH2	Dem Spliceosom zugeordnetes Protein 114
57	H-QTAVTAVEKPAPK-NH2
58	H-EVAMDDHKLSLDEL-NH2	Kette α-2 der Natrium und Kalium transportierenden ATPase
59	H-TVTPAKAVTTP-NH2	Nucleolin
60	H-MEAETGSSVET-NH2
61	H-QWAQFKIQWNQRW-NH2
62	H-DYSKGITVTKND-NH2	Hypothetisches Protein
63	H-VIQYLAHVASSHK-NH2	Schwere Kette des Myosins (Typ B nicht muskulär)
64	H-YPKPQQFFGLM-NH2
65	H-EPPKEETAQLTGPEA-NH2	Großes prolinreiches Protein BAT-2
66	H-YMHGHRAPG-NH2
67	H-MGKWHVG-NH2
68	H-SSSHSLSHK-NH2
69	H-HVGLLRIK-NH2

Pharmakologische Eigenschaften der identifizierten Peptide:
1) Methoden:
Bindungstest: Alternatives Protokoll von Skatron.
Die experimentellen Bedingungen sind bei allen Bindungstestsprotokollen identisch, abgesehen davon, dass:

i) das Volumen R im Betrieb 200 µl beträgt;
ii) der Test in Falcon-Platten mit 96 Vertiefungen durchgeführt wird;
iii) die Reaktion direkt durch Filtration auf einer Vorrichtung filterMat (Typ 11734) Skatron gestoppt wird und die dem Filtrat zugeordnete Radioaktivität ermittelt wird: – entweder direkt mit Hilfe eines γ-Zählers bei den mit Iod 124 markierten Peptiden; – oder mit Hilfe eines γ-Zählers in Gegenwart von 5 µl Szintillationsflüssigkeit.

Meerschweinchenhirnmembran-Präparate und Bindungstest:
Die Meerschweinchen werden durch Bruch ihrer Halswirbel getötet, geköpft und das Hirn wird sehr schnell entnommen und in einen Puffer Saccharose-Tris-HCl (0,32 M Saccharose; 5 mM Tris-HCl; 0,1 g/l Bacitracin) von 4°C eingebracht (etwa 10 ml Puffer pro Hirn). Die Hirne werden dann mit Hilfe einer Pottervorrichtung homogenisiert und das Homogenisat wird während 30 Minuten bei 37°C unter Rühren zur Inkubation gebracht und dann in zwei Durchgängen während 35 Minuten mit 100 000 × g bei 4°C zentrifugiert. Der Proteingehalt der Membranpräparate wird gemäß der Methode Bradford (Bio-Rad, gemäß dem Protokoll des Herstellers) ermittelt.
Bindung von mit dem Meerschweinchenhirnmembran-Präparat markierten Agonisten
Die Membranen werden in einen Puffer (50 mM Tris-HCl, 5 mM MgCl₂ und 0,1 g/l Bacitracin) mit der gewünschten Protein konzentration eingebracht (Bindung von iodiertem CCK: 0,1 mg Protein/ml; Bindung von iodiertem Gastrin: 0,5 mg Protein/ml). Sie werden dann in Gegenwart eines markierten Liganden in einem Gesamtvolumen von 500 µl (etwa 10 pM bei iodiertem CCK₈, 20 pM bei iodiertem Gastrin₁₃) während 50-80 Minuten bei 25°C und in Gegenwart oder in Abwesenheit von kalten Agonisten inkubiert. Die Reaktion wird mit Hilfe von 3 ml mit BSA ergänztem Puffer (20 g/l) mit 4°C gestoppt, die Röhrchen werden mit 10 000 g × zentrifugiert, der Überstand wird abgesaugt und die dem Niederschlag zugeordnete Radioaktivität wird mit Hilfe eines γ-Zählers ermittelt.
Bindung von radiomarkierten Agonisten an Jurkat T-Zellen:
Kulturbedingungen der Zellen der menschlichen Jurkat T-Lymphozytenlinie:
Die Jurkat-Zellen werden in einem Medium RPMI 1640, das mit Kalbsfötusserum (10 % Volumen/Volumen) und Antibiotika (50 U/ml Penicillin und 50 µg/ml Streptomycin) ergänzt ist, in einem feuchten Inkubator bei 37°C unter einer Atmosphäre von 5 % CO₂ in Luft kultiviert.
Bindungstest:
Die Zellen werden durch Zentrifugation (514 g, 5 Minuten) erhalten und werden dann in zwei Durchgängen in einem Standardmedium gewaschen, das enthält: 98 mM NaCl; 6 mM KCl; 2,5 mM NaH₂PO₄; 1,5 mM CaCl₂; 1 mM MgCl₂; 5 mM Na-Pyruvat; 5 mM Na-Fumarat; 5 mM Na-Glutamat; 2 mM Glutamin; 11,5 mM Glucose,; 24,5 mM Hepes (N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N'-[2-ethansulfon]säure); 0,5 g/l Bacitracin; 0,1 g/l Sojatrypsin hemmendes Mittel, pH 7,4.
Die Tests der Bindungen von mit Iod 125 (etwa 50 Pikomol) markierten Agonisten werden bei 37°C unter Rühren während 45-60 Minuten in einem Endvolumen von 0,5 ml Standardmedium, das 2 × 10⁶ Zellen (4 × 10⁶ Zellen/ml) enthält, und in Gegenwart oder in Abwesenheit von Kompetitoren durchgeführt. Die nicht spezifische Bindung wird in Gegenwart einer mikromolaren Konzentration von kaltem homologen Peptid ermittelt.
Membranpräparate von verschiedenen Geweben und Organen der Ratte:

1) Die Ratten werden durch Bruch ihrer Halswirbel getötet und die verschiedenen Gewebe werden entnommen und in mehreren Durchgängen in einem großen Volumen mit 9 Promille NaCl gewaschen. Die folgenden Schritte werden alle bei 4°C durchgeführt.
2) Die Gewebe und die Organe werden, weiterhin getrennt, in einem Saccharosepuffer übertragen, der enthält: – 0,25 M Saccharose – 25 mM TRIS-HCl, pH 7,4 – 0,2 mM PMSF – 0,1 mM 1-10 Phenantrolin – 100 µg/ml STI Dann werden sie sorgfältig mit Hilfe von feinen Scheren gedünnt und mit Ultraturax zerkleinert.
3) Die Gewebe und die Organe werden schließlich unter Verwendung einer Pottervorrichtung gemahlen (10 Hin- und Herbewegungen Minimum bei 1000 Umdrehungen pro Minute).
4) Das Mahlgut wird mit 500 g und während 10 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Die Überstände werden aufbewahrt, die Rückstände werden in einem Saccharosepuffer aufgenommen und unter denselben Bedingungen wieder zentrifugiert.
5) Die beiden Überstände werden nun gemischt und mit 100 000 × g während 30 Minuten bei 4°C zentrifugiert.
6) Die Überstände werden entfernt und die Rückstände werden wieder in einem Saccharosepuffer für eine zweite Zentrifugation mit 100 000 × g während 30 Minuten bei 4°C aufgenommen.
7) Die Überstände werden entfernt und die Rückstände werden in einem Einding-Puffer aufgenommen, der 50 mM Puffer TRIS-HCl (pH 7,4) und 5 mM MgCl₂ enthält.
8) Der Proteingehalt der Membransuspensionen wird mit Hilfe einer Bradforddosierung ermittelt (BioRad, gemäß dem Protokoll des Herstellers). Sie werden in Teilmengen geteilt und in flüssigem Stickstoff oder bei –80°C gelagert.

Die Bindungstests werden gemäß einem Protokoll durchgeführt, das mit dem für die Meerschweinchenhirnmembranen verwendeten Protokoll identisch ist.
Bindungstests von markierten Agonisten an der Zellenlinie HeLa
Die Zellen werden in einem Medium DMEM kultiviert, das mit Kalbsfötusserum (10 %), 0,5 % Antibiotika (Penicillin/Streptomycin) und 0,5 % Glutamin versetzt ist.
24 bis 48 Stunden vor dem Test nimmt man die Replikation der Zelle auf Platten mit 24 Vertiefungen mit etwa 100.000 Zellen pro Vertiefung und pro ml vor.

Die Bindungstests werden mit einem Puffer BindH durchgeführt.

NaCl	98 mM	5,72 g/l
KCl	6 mM	0,45 g/l
NaH₂PO₄	2,5 mM	0,3 g/l
Na-Pyruvat	5 mM	0,55 g/l
Na-Fumarat	5 mM	0,58 g/l
Na-Glutamat	5 mM	0,84 g/l
CaCl₂	1,5 mM	0,22 g/l
MgCl₂	1 mM	0,20 g/l
HEPES	25 mM	6,07 g/l
Glucose	11,5 mM	2,07 g/l
Glutamin	2 mM	0,22 g/l
STI		0,1 g/l

Für den Test wird das Medium entfernt und die Zellen werden in zwei Durchgängen mit Hilfe von 1 ml Puffer gewaschen. Das den markierten Agonisten enthaltende Reaktionsmedium (500 µl) wird in jeder Vertiefung in Gegenwart oder in Abwesenheit des kalten homologen Agonisten zugesetzt und die Platten werden während einer Stunde bei 37°C inkubiert.
Die Reaktion wird durch Absaugen des Reaktionsvolumens beendet und die Vertiefungen werden in zwei Durchgängen mit Hilfe von 1 ml Puffer BindH zu 20 % BSA gespült.
Die Zellen werden mit Hilfe von 500 µl Soda 1 N während 20 Minuten bei Umgebungstemperatur lysiert und die dem Ly sat zugeordnete Radioaktivität wird mit Hilfe eines Gammazählers gemessen.
2). Ergebnisse:

Die auf diese Weise identifizierten Peptide wurden nach den oben beschriebenen Protokollen getestet. Die bei den Peptiden 1 bis 6 erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle angeführt.

Beispiel	Bindungstest mit	Ergebnisse
1	Mehrschweinchenhirnmembranen	positiv (IC₅₀ = 100 µM)
	Membranen von verschiedenen	negativ
	Organen der Ratte
	HeLa-Zellen	positiv (IC₅₀ = 100 µM)
	Jurkat T-Zellen	negativ
2	Mehrschweinchenhirnmembranen	positiv (IC₅₀ = 100 µM)
	Membranen von verschiedenen	positiv (IC₅₀ = 100 µM)
	Organen der Ratte
	HeLa-Zellen	positiv (IC₅₀ = 100 µM)
	Jurkat T-Zellen	positiv (IC₅₀ = 100 µM)
3	Mehrschweinchenhirnmembranen	positiv (IC₅₀ = 100 µM)
	Membranen des Hirns/der Leber und von verschiedenen	positiv (IC₅₀ = 100 µM)
	Organen der Ratte
	HeLa-Zellen	positiv (IC₅₀ = 2 µm)
	Jurkat T-Zellen	positiv (IC₅₀ = 50 µM)
4	Mehrschweinchenhirnmembranen	positiv (IC₅₀ = 100 µM)
	Membranen von verschiedenen	negativ
	Organen der Ratte
	HeLa-Zellen	positiv (IC₅₀ = 100 µM)
	Jurkat T-Zellen	positiv (IC₅₀ = 100 µM)
5	Mehrschweinchenhirnmembranen	positiv (IC₅₀ = 100 µM)
	Rattenhirnmembranen	positiv (IC₅₀ = 90 µM)
	Membranen von verschiedenen	positiv (IC₅₀ = 100 µM)
	Organen der Ratte
	Jurkat T-Zellen	negativ
6	Mehrschweinchenhirnmembranen	positiv (IC₅₀ = 100 µM)
	Rattenhirnmembranen	positiv (IC₅₀ = 90 µM)
	Membranen von verschiedenen	positiv (IC₅₀ = 100 µM)
	Organen der Ratte
	Jurkat T-Zellen	negativ

Abgesehen von den Peptiden 1 bis 6 wurden die folgenden Peptide erhalten und an Meerschweinchenhirnmembranen getestet:

Beispiel	IC₅₀ (µM)	Beispiel	IC₅₀ (µM)
7	0,43	16	0,08
8	4,2	17	0,68
9	0,22	18	0,8
10	0,03	19	0,7
11	0,27	20	0,35
12	0,02	21	0,16
13	0,09	22	2,8
14	0,86	23	1,3
15	0,36	24	0,23
25	0,31	48	1,47
26	0,7 bis 22	49	0,33
27	0,68	50	1
28	0,4	51	0,14
29	0,01	52	7
30	27	53	0,01 bis 1
31	0,02 bis 2	54	0,3
32	0,2	55	0,004 bis 1
33	0,1	56	0,73
34	1	57	0,06
35	5,6	58	0,86
36	2,9	59	0,41
37	0,8	60	< 0,1 bis 4
38	0,5	61	1,11
39	0,4	62	0,67
40	0,13	63	0,02
41	0,25	64	0,001
42	0,56	65	4
43	0,05	66	0,002
44	0,1	67	0,16
45	0,7	68	0,025
46	0,1	69	0,037
47	0,3

Claims

Verfahren zur Identifizierung von Vorläufern eines Peptids mit einem amidierten C-terminalen Ende, umfassend die folgenden Schritte: – Extraktion von automatisierten Sequenzen aus einer öffentlichen Quelle; – Analyse der Dateien und Import der Daten in ORACLE^TM; – Selektion der Sequenzen aus einer Untermenge oder aus der gesamten Datenbank; – Suche der Vorläufer eines Peptids mit einem amidierten C-terminalen Ende unter Verwendung der Sequenz Y1-Y2-Y3-Y4-Y5, in der Y1 eine Nucleotidsequenz von 1 bis 12 Nucleotiden ist oder Y1 entfällt, Y2 ein Codon für Gly ist, Y3 und Y4 unabhängig voneinander Codons für Arg oder Lys sind und Y5 eine Nucleotidsequenz von 1 bis 21 Nucleotiden ist oder Y5 entfällt; – Überprüfung der Abwesenheit jedes STOP-Codons zwischen dem den Anfang des Leserahmens angebenden Codon AUG und dem gesuchten Motiv; und Identifizierung solcher Sequenzen; – Überprüfung, ob das Motiv, wenn man es findet, ein offener Leserahmen vom Typ Kozak-Konsensus-Sequenz ist; – Vergleich der Umgebung des Standorts des Motivs mit derjenigen, die erforderlich ist, durch Suche nach erforderlichen sekundären Strukturen um eine Reifungsstelle herum wie die Nähe von alpha-Helices oder beta-Faltblättern; Überprüfung des Vorliegens einer Ähnlichkeit der Sequenzen und anderer bekannter Sequenzen.