KR100230195B1 - cDNA로 부터의 RNA 비루스 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본발명은 피검자, 예컨대 사람에게 감염성 폴리오비루스에 대한 면역성을 부여하는데 유용한 백신을 제공하며, 본발명의 백신은 비루스를 코오딩하는 재조합 핵산 서열을 사용하여 적당한 숙주세포를 형질 전환시키고, 이어서 생산된 비루스를 분리함으로써 수득된, 피검자에게 면역성을 부여하는데 효과적인 유효량의 RNA 비루스를 함유한다.
본발명에서는 또한 상술한 백신의 적당량을 피검자에게 투여하는 것을 특징으로 하는, 사람과 같은 피검자에게 감염성 폴리오비루스에 대한 면역성을 부여하는 방법도 제공한다.
Description
[발명의 명칭]
cDNA로 부터의 RNA 비루스 제조방법
[발명의 배경]
본원 전체에 걸쳐서 각종 참고문헌들을 괄호내에 또는 괄호내에 아라비아 숫자로 표기하여 인용하고 있다.
아라비아 숫자로 표기한 이들 출판물들에 대한 전체적인 서지학적 사항들은 본원 명세서 말미의 특허청구의 범위 바로앞에 기재되어 있다.
이들 출판물들의 기술 내용들은 모두 본발명과 관계된 당해 기술분야의 상황을 보다 상세히 기술하기 위한 목적으로 본원에서 참고로 인용하고 있는 것들이다.
피코르나비리다에(Picornaviridae)과에 속하는 인체 장비루스는 단일-가닥 양성 RNA 게놈의 특성을 지니고있다.
이들 비루스과를 구성하는 것들로서는 폴리오비루스(poliovirus), 에코비루스(echoviruses), 콕사키비루스(coxsackieviruses) 및 리노비루스(rhinoviruses)를 들수있다.
이들 비루스들중 폴리오비루스가 가장 광범위하게 연구되어 왔다.
폴리오비루스는 중추신경계를 마비시키는 질환인 척수성 소아마비의 원인균으로 공지되어 있다.
상기 비루스는 세가지 안정한 혈청형--1, 2 및 3으로 존재하는 것으로 알려져있다.
25년이 넘게 상기 척수성 소아마비 질환은 세이빈(sabin)의 경구용 생(生)-약독(弱毒)백신과 살크(salk)의 사멸 비루스 백신 둘다를 사용하여 억제시켜 왔다.
세이빈 백신은 독성을 약화시킨 각각의 혈청형을 갖는 비루스들로 구성되어 있으며, 상기 비루스들중 그 어느 것도 질병을 유발할수 있는 기능은 갖고있지 않다.
백신 생산에 사용된 균주들은 각각의 세가지 야생형 균주들을 원숭이 조직에 시험관내 및 생체내에서 계대접종시켜 조합함으로써 생성된 것들이다.
경구투여시 세이빈 백신에 함유된 살아있는 비루스들이 장내에서 증식을 일으키게되며, 그리하여 전신적 및 국소적 면역성 둘다를 유도하게 된다.
사멸한 비루스(살크)백신은 근육내에 투여하게 되며, 전신적 면역성만을 유도하는 것으로 제한된다.
세이빈 백신이 안전하고 효과적으로 척수성 소아마비로 부터의 보호기능을 발휘하는 것으로 간주되기는 하나, 소수의 수혈자들에게서 백신에 기인된 질병이 발병되었다.
독성약화 및 환원에 대한 분자학적 기초를 해독하기 위한 시도로써 각각의 세가지 독성약화시킨 균주들 및 이들의 야생형 원래 균주의 상응하는 cDNAs의 뉴클레오티드 서열들을 비교한바 있다.
[에이. 노모토(A. Nomoto)등, "독성약화시킨 세이빈 1균주 게놈의 완전한 뉴클레오티드 서열(Complete Nucleotide Sequence of the Attenuated Sabin 1 Strain Genome)"Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79권, 5793-97페이지(1982년); 쥐, 스탄웨이(G. Stanway)등, "신경독성 및 독성약화시킨 타입 3폴리오비루스의 캡시드 단백질 VP1을 코오딩하는 게놈영역의 핵산서열(Nucleic Acid Sequence of the Region of the Genome Encoding Capsid Protein VP1 of Neurovirulent and Attenuated Type 3 Polioviruses)", Eur. J. Biochem. 135권, 529-33페이지(1983년); 쥐.스탄웨이(G.Stanway) 등, "신경독성 폴리오비루스 P3/Leon/37 및 그의 독성약화된 세이빈 백신 유도체 P3/Leon 12ab 게놈의 완전한 뉴클레오티드 서열비교(Comparison of the Complete Nucleotide Sequences of the Genomes of the Neurovirulent Poliovirus P3/Leon/37 and its Attenuated Sabin Vaccine Derivative P3/Leon 12ab" Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79권, 1539-43페이지(1984년); 및 에이취. 도요다(H. Toyoda)등, "세가지 모든 폴리오비루스 혈청형 게놈의 완전한 뉴클레오티드 서열(Complete Nucleotide Sequences of All Three Poliovirus Serotype Genomes", J. Mol. Biol., 174권, 561-585페이지, (1984년)].
각각의 야생형 모균주와 그로부터 생성된 독성이 약화된 균주사이의 뉴클레오티드 서열에서 관찰되는 차이점들을 보다 더 분석하여 독성약화 현상에 기인된 이들의 상관 관계를 조사하였다.
예컨대, 혈청형 3에서는 독성약화 균주와 야생형 균주가 단지 10군데 돌연변이의 차이점만을 나타내었다[쥐. 스탄웨이(G. Stanway)등, (1984년), 동일문헌].
또한, 이들 차이점들중에서 뉴클레오티드 472 및 2034 위치의 차이점만이 독성약화와 밀접한 관련이 있는 것으로 생각되었다[디. 엠. 에이. 에반스(D.M.A. Evans)등, "세이빈 타입3 폴리오비루스 게놈의 비코오딩 영역에서의 단일 뉴클레오티드 변화에 의해 증강된 신경발병력(Increased Neurovirulence Associated With A Single Nucleotide Change In A Noncoding Region of the Sabin Type 3 Poliovirus Genome", 네이춰(Nature), 314권, 548-50페이지(1985년); 쥐.디. 웨스트롭(G.D. Westrop)등, "세이빈 타입 3 경구용 폴리오비루스 백신의 독성약화와 관련된 유전학적 기초(Genetic Basis of Attenuation of the Sabin Type 3 Oral Poliovirus Vaccine)", J. Virol., 63권, 1338-44페이지(1989년)].
독성약화에 관계하는 뉴클레오티드의 특성을 규명하기에 앞서, 비루스 RNA 템플레이트로 부터 합성된 cDNA("RNA 비루스 cDNA")를 이용하여 포유류 세포의 감염후에도 생존가능한 폴리오비루스를 제조할수 있다는 사실이 입증된 바 있다[브이.알.라카니엘로(V.R.Racaniello)등, "클로닝된 폴리오비루스의 상보성 DNA가 포유류 세포내에서 감염성을 지님(cloned polivirus Complementary DNA Is Infectious In Mammalian Cells)", 사이언스(Science), 214권, 916-19페이지(1981년)].
그와 같은 연구 결과로 부터 유전공학 기술을 이용하여 개량된 폴리오 백신을 제조할수 있는 가능성이 대두되었으며, 이는 비루스의 구조적 및 기능적인 통합성을 유지시키면서 야생형 뉴클레오티드로의 환원이 최소화 되도록, 결정적인 기능을 갖는 뉴클레오티드 주변의 cDNA를 변형시킴으로써 성취될수 있었다.
RNA 비루스 cDNA를 사용하여 생존 가능한 비루스를 제조할수 있다는 사실이 밝혀지긴 하였으나, 이들 cDNA가 야생형 또는 백신 비루스내에 존재하는 비루스 RNA의 완전하고 정확한 복사체라는 사실은 입증된 바없다.
또한 어느 뉴클레오티드가 독성약화에 관계하는지를 측정하기 위한 목적으로 cDNA서열을 이용할 경우 1개 이상의 결정적인 부위들이 간과되는 결과를 야기하기도 한다.
이는 cDNA 제조에 이용되는 방법, 즉 역전사방법이 오차 발생률이 높은 것으로 알려져 있기 때문이다[아이. 엠. 베르마(I. M. Verma), "역 전사효소(Reverse Transcriptase)". In The En3ymes, 14권, 피.디.보이어(P.D. Boyer)편집. 아카데믹 프레스(Academic Press), 뉴욕(New York), 87-104 페이지(1981년)].
따라서, 백신 비루스 RNA와 완전한 상보성을 지닌 RNA 비루스, cDNAs의 제조 필요성이 여전히 대두되고 있다.
또한, 불확실한 RNA 비루스 cDNAs를 사용하는 것은, 이들 cDNAs가 폴리오백신과 같은 백신제조에 궁극적으로 사용될 경우, 독성약화가 저하되는 결과를 초래하기도 한다.
폴리오비루스 게놈은 대략 7500 뉴클레오티드 길이를 갖는 플러스-센스(plus-sense) 형태의 단일-가닥 RNA 분자이다.
폴리오비루스에 있어서 단일-가닥 RNA의 복제와 관련된 오차 빈도는 이중-가닥 DNA의 그것과 비교해볼때 특히 높다(3).
그와 같은 고유한 특성에 기인하여, 원래의 세이빈(50)균주를 비롯한 모든 폴리오비루스 제제가 불균일한 이종 유전자형을 갖는 것으로 간주되어야 한다.
배양조건(즉, 온도, 세포기질)뿐만아니라 도입 비루스의 동질성이 폴리오비루스 시료의 증폭공정에서 어느 유전자형이 우세하게 나타나는가 하는데에 영향을 미치는 경향이 있다.
따라서 OPVs의 생산을 관장하는 관계기간(즉, FDA 및 WHO)이 백신내에서 나타나는 종균의 계대접종 레벨뿐만 아니라 생산 종균의 제조와 관련하여 엄격한 지침을 설정하고 있는것은 놀라운 사실이 아니다(22, 26).
상기 규정요건들은 덜 독성약화된 변종 균주의 선별 및 증폭을 극소화시키기 위한 시도로써 효력이 발생하는 것이다.
세이빈 3 균주의 독성약화된 표현형이 타입 1 및 2 백신균주보다도 유전학적으로 덜 안정하다는 사실은 널리 입증된바있다(4, 7, 11).
과거에는, 추출된 감염성 RNA로 부터 베르베트 원숭이 신장세포 단일층에서 생산된 플라아크를 선별함으로써 원래의 세이빈 3 비루스로 부터 새로운 생산종균(RSO)이 유도되었다(19).
분리체는 원숭이 체내에서의 독성약화력 증강 뿐만아니라 연속적인 계대 접종 공정 동안에 40.3℃에서의 성장 감수성(rct 마커)의 안정성 증가를 기준으로 하여 선택되었다.
37°이상의 온도에서의 성장 감수성(rct 마커)은 백신균주의 품질을 분석하기 위한 시험관내에서의 생물학적 시험으로 아직도 이용되고 있다(13).
코하라(kohara)등이 발표한 논문(9)에서는 감염성 cDNA 클로온을 사용하여 세이빈 1 종균의 정상성과 품질을 보존시키는 것에 관하여 제안하고 있다.
유사한 접근방법을 이용하여 독성약화된 타입 3 균주에 대하여서도 동일한 효과를 거둘수있을 것으로 추론된다.
최근까지도, 문헌에서는 뉴클레오티드 위치들이 서로 다른 세이빈 3에 대한 2가지 cDNA 서열이 제시되었다.
이들 서열들간에 나타나는 차이는 cDNA 클로온을 제조하는데 있어서 실제적인 백신 비루스가 아닌 세이빈 3의 클로날 분리체 및 계대 접종 유도체들이 사용되었다는 사실에 기인하는 것으로 추론된다.
[발명의 요약]
본발명은 피검자, 예컨대 인체에 감염성 폴리오비루스에 대한 면역성을 부여하는데 유용한 백신을 제공하기 위한 것으로서, 상기 백신은 당해 비루스를 코오딩하는 재조합 핵산 서열을 사용하여 적당한 숙주세포를 형질 전환시키고; 이어서 생산된 피검자에게 면역성을 부여하는데 효과적인 비루스를 분리함으로써 수득된 유효량의 RNA 비루스를 함유하고 있다.
본발명은 또한 인체와 같은 피검자에게 감염성 폴리오비루스에 대한 면역성을 부여하는 방법도 제공하며, 이 방법은 상술한 백신의 적당량을 피검자에게 투여하는 것을 특징으로 한다.
[도면의 간단한 설명]
도면 제1도는 세파로스 CL-413 컬럼에서 수득된 폴리오비루스 균주 3 RNA로 부터 합성된 단일-가닥 cDNA의 크로마토그래피 프로파일을 나타낸 것이다.
도면 제2도는 P3/세이빈 게놈을 구성하는 cDNA 클로온들을 나타낸 것이다.
도면 제3도는 부분적인 cDNAs를 본발명에 따른 1개의, 완전한 길이를 갖는 P3/세이빈 cDNA로 복제시키는 방법을 나타내는 것이다.
도면 제4도(패널 A 및 B)및 제5도는 모두 P3/세이빈 cDNA를 변이처리하는 방법 및 본발명에 따른 진정한, 완전한 길이의 P3/세이빈 cDNA를 구조하는 방법을 도시하고 있다.
도면 제4도의 패널 C는 다음과 같은 내용을 도시한 것이다.
즉, pVR318을 완전 분석하여 도면 제6(a)도-제6(k)도에 나타낸 pLED3의 서열을 추론해낸 다음, pVR318을 구조하는데 사용된 것과 동일한 서브클로온(pLL3-271)으로 부터 분리한 Sac I/HindIII 단편과 교환시킴으로써 2493 위치를 변형시킨다.
그러나, 플라스미드 pLED3내의 전체 cDNA서열을 시퀀싱처리하여 확인해본 결과, 비루스 게놈내에서 일련의 6개 A가 존재하는 것으로 통상적으로 발견되는 영역(4133-4138위치)에서 또 다른 부가적인 A가 나타났다.
이 잘못된 A는 서브클로온 pLL3-271내에서도 또한 발견된다.
pLL3-271과 pVR318을 잘 조작하여 당해 부위에 올바른 수의 A를 함유하는 pLED3.2를 구조하였다.
올바른 수의 A를 갖는 pLED3을 다시 구조하기 위한 목적으로, 위에서 사용된 pLL3-271로 부터 분리한 Sac I/HindIII 단편을 박테리오파지 M13내에 클로닝시켜 올리고뉴클레오티드-관련 누락 변이처리를 실시하였다.
그와 같은 목적으로 뉴클레오티드 4121-4150을 차지하는 올리고뉴클레오티드를 합성하였으며, 이 뉴클레오티드는 서열: 5'-CGCCTCAGTAAATTTTTTCAACCAACTATC-3' 을 갖는다.
상기 변이처리는 "T7-GEN인 비트로 뮤타게네시스 키트(T7-GEN In Vitro Mutagenesis Kit)"(유나이티드 스테이츠 바이오케미 칼(United States Biochemical), 클리블랜드, 오하이오)를 사용하여 제조업자의 지시에 따라 수행하였다.
변이처리된 삽입물을 CB2로 명명하였으며, 서열분석 결과 상기 CB2는 2493위치에 C뿐만아니라 4132-4138 위치에 6개의 A를 갖는 것으로 입증되었다.
원래의 pLED3 구조시 사용된 바있는 pVR318의 Sac I/HindIII부분분해 단편에 상기 CB2의 Sac I/HindIII 단편을 결찰시킴으로써 완전한 길이를 갖는 보정된 구조물이 수득되었다.
상기 결찰생성물은 pLED 3.2로 명명되었으며, pLED 3.2의 전체 cDNA 서열은 도면 제6(a)도-제6(k)도에 나타낸 서열과 일치하는 것으로 입증되었다.
도면 제6도의 패널 A-K는 본발명에 따른 진정한 타입 3 폴리오비루스 백신 균주 cDNA의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 것이다.
도면 제7도의 패널 A는 완전한 길이의 LED3 cDNA 및 T7 RNA 폴리머라제 프로모터를 함유하는 폴라스미드의 구조를 도시한 것이다.
굵고 검은색 부분은 폴리오비루스 cDNA를 나타내고, 약간 개방된 부분은 T7 프로모터(pT7)및 cDNA의 시험관내에서의 양성 양극성 전사 개시 부위를 나타낸다.
최종 전사물이 합성되기전에 플라스미드를 Pvu I(도면에 부위가 나타내어져 있음)으로 절단한다.
패널 B는 정제된 T7 RNA 폴리머라제에 의해서 cDNA 클로온으로 부터 전사된 RNAs를 나타내고 있다.
실시예 13의 재료 및 방법들에서 기술하고 있는 바와같이, 전사 반응 혼합물의 일부를 취하여 0.6% 아가로스 겔중에서 전기영동을 실시하여 분석하였다.
레인 1-3은 0.75㎍, 0.50㎍ 및 0.25㎍의 7.5kb ssRNA 표지물을 각각 나타낸다.
HindIII-분해된 파아지 람다 DNA는 레인 4에 나타내어져 있다.
레인 5 및 6은 Pvu I-분해된 pLED3 및 pVR318 템플레이트를 각각 함유하는 전사 반응물을 나타내고 있다.
펠릿형 비리온으로 부터 추출된 RNA는 레인 7에 나타내어져 있다.
도면 제8도는 LED3 및 VR318 cDNA-유래 비루스들에 대한 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동 결과를 나타내고 있다.
[35S]메티오닌-표지된 시료를 제조하여 각각의 레인에 로딩(loading)시킨후, 이하에 기술하는 바와같이 전기영동을 실시하여 분석하였다.
겔을 건조시킨후, 자동방사선 사진술을 이용하여 단백질 밴드들을 육안 관찰하였다.
LED 3 비루스는 레인 "A"에 위치하고; VR 318 비류스는 레인 "B"에 위치한다.
미리 염색시킨 분자량 표지물들(킬로달톤)의 위치가 왼쪽에 나타내어져 있다.
비루스 캡시드 단백질의 위치는 오른쪽에서 확인된다.
도면 제9도는 베로(Vero)세포상에서의 레온(Leon : 야생형), VR 318 및 LED 3비루스들의 플라아크 표현형들을 나타내고 있다.
1.0% 영양 한천중, 33.5℃에서 3일간 배양시킨후, 세포들을 중성 적색 색소로 염색시켜서 플라아크들을 육안 관찰하였다.
도면 제10도는 33.5℃에서의 비루스 성장 운동학을 도시하고 있다.
베로 세포 단일층을 MOI = 4로 감염시키고, 감염처리후 지시된 시간들에서 세포외 배지를 수거한다.
실시예 13의 재료 및 방법들에서 기술하고 있는 바와같이 플라아크 분석법을 이용하여 단위 ml당 감염성 입자들의 역가를 측정하였다.
도면 제11도는 다양한 온도들에서의 LED3 및 VR 318의 열안정성을 나타내는 것이다.
약 107.3pfu/ml의 비루스 시료들을 22℃(동그라미), 37℃(네모) 및 42℃(삼각형)에서 배양한다.
주기적으로 시료들을 꺼내어 플라아크 분석법에 따라 감염성 비루스의 역가를 측정하였다.
점선은 LED 3을 나타내고; 실선은 VR 318을 나타낸다.
[발명의 상세한 설명]
본발명은 (a)RNA 공급원 비루스로 부터 게놈 RNA를 분리하고; (b)RNA 시퀀싱 방법을 이용하여 분리된 게놈 RNA 영역의 뉴클레오티드 서열을 측정하고; (c)cDNA 합성방법을 이용하여 분리된 게놈 RNA로 부터 이중-가닥 cDNA를 제조하고; (d)DNA 시퀀싱 방법을 이용하여 단계(b)에서 시퀀싱 처리된 RNA 영역과 상응하는 cDNA 영역의 뉴클레오티드 서열을 측정하고; (e)시퀀싱 처리된 cDNA와 시퀀싱 처리된 RNA를 비교하여 뉴클레오티드 서열내의 실제적인 차이점들을 측정하고; 이어서 (f)cDNA내의 실제적인 차이점들을 변형시킴으로써 진정한 RNA 비루스 cDNA를 제조하는 단계들로 구성되는, 진정한 RNA비루스 cDNA의 제조방법을 제공한다.
본발명은 또한 a)RNA 공급원 비루스로 부터 게놈 RNA를 분리하고, b)RNA 시퀀싱 방법을 이용하여 상기 분리된 게놈 RNA 영역의 뉴클레오티드 서열을 측정하고, c)cDNA 합성방법을 이용하여 상기 분리된 게놈 RNA로 부터 이중-가닥 cDNA를 제조하고, d)DNA 시퀀싱 방법을 이용하여 단계 b)에서 시퀀싱 처리된 상기 RNA의 영역과 상응하는 상기 cDNA 영역의 뉴클레오티드 서열을 측정하고, e)상기 시퀀싱 처리된 cDNA와 상기 시퀀싱 처리된 RNA를 비교하여 뉴클레오티드 서열내의 실제적인 차이점들을 측정하고, 이어서 상기 cDNA내의 실제적인 차이점들을 변형시킴으로써 RNA 비루스 cDNA를 제조하는 단계들로 구성되는, RNA 비루스 cDNA의 제조방법도 제공한다.
본발명은 상술한 방법들에 있어서 RNA 공급원 비루스가 백신 균주 3 폴리오비루스와 같은 피코르나비루스인 방법들도 또한 제공한다.
본발명의 한가지 구체예에 있어서는, 단계 (b)에서 시퀀싱처리된 RNA 영역이 백신균주 3 폴리오비루스의 뉴클레오티드 2493을 포함하고 있다.
상기 구체예의 또 다른 일면에서는 RNA가 약 100내지 200개의 뉴클레오티드로 구성되어 있다.
또는, 분리된 전체 비루스 RNA의 뉴클레오티드 서열이 단계 (b)에서 측정되기도 한다.
본발명은 또한 상술한 방법들에 의해서 제조된 진정한 RNA 비루스 cDNA 또는 RNA 비루스 cDNA도 제공한다.
예를들면, 진정한 RNA 비루스 cDNA 또는 RNA 비루스 cDNA는 백신 균주3 폴리오비루스로 부터 유래되어 생산되며, cDNA는 각각 pLED3.2 또는 pLED3으로 명명된 신규한 플라스미드내에 함유된 것 또는 pLED3.2 또는 pLED3 각각에 의한 형질발현을 코오딩하는 폴리펩티드의 형질발현을 코오딩하는 cDNA로 부터 선택되고, 그로부터 재조합 DNA 분자가 제조된다.
재조합 DNA 분자는 RNA 전사 프로모터와 기능적으로 결합될수 있다.
알맞은 프로모터로서는 T7 프로모터를 들수있으며, 이것만으로만 제한되지는 아니한다.
전술한 재조합 DNA 분자를 사용하여 형질 전환시킨 숙주도 또한 본발명에 의해서 제공되며, 숙주는 이.콜리, 이스트 및 다른 진균류와 같은 세균, 곤충세포 및 동물세포로 구성된 군으로 부터 선택된다.
적당한 동물세포로서는 베로(Vero)세포, HeLa세포, COS세포, CV-1세포 및 영장류 원숭이 신장세포를 들수있으며, 반드시 이들로만 제한되지도 아니한다.
나아가 본발명은 (a)전술한 숙주를 생존 가능한 RNA 비루스가 생산될수 있도록 하는 조건들하에서 배양하고; 이어서 (b)숙주세포 배양물로 부터 생존 가능한 RNA 비루스를 수거하는 단계들로 구성되는 생존 가능한 RNA 비루스의 제조방법을 제공한다.
본발명은 (a)시험관내에서의 전사방법을 이용하여 상술한 재조합 DNA 분자로 부터 RNA를 제조하고; (b)상기 RNA를 분리하고; (c)분리된 RNA를 사용하여 숙주를 감염시키고, 이때 숙주는 동물세포이며; (d)생존가능한 RNA 비루스가 생산될수 있도록하는 조건들하에서 숙주를 배양하고; 이어서 (e)숙주세포 배양물로 부터 생존가능한 RNA 비루스를 수거하는 단계들로 구성되는, 생존 가능한 RNA 비루스의 제조방법을 제공한다.
예로서, 백신균주3 폴리오비루스가 사용 가능하며, 숙주로서는 영장류 원숭이 신장세포를 사용할수 있다.
본발명은 또한 (a)숙주를 RNA 비루스 cDNA로 감염시키고, 이때 cDNA는 플라스미드 pLED3 또는 pLED3.2내에 함유된 것 또는 pLED3 또는 pLED3.2에 의한 형질 발현을 코오딩하는 폴리펩티드의 형질발현을 코오딩하는 cDNAs로 부터 선택되며, 또한 상기 숙주는 동물세포이고; (b)상기 숙주 세포 배양물로 부터 생존가능한 RNA 비루스가 생산될수 있도록 하는 조건들하에서 상기 숙주를 배양하는 단계들로 구성되는, 생존가능한 RNA 비루스의 제조방법도 제공한다.
나아가, 본발명은 비루스를 코오딩하는 재조합 핵산서열을 사용하여 적당한 숙주 세포를 형질전환시키고; 비루스가 생산될수 있도록 하는 조건들하에서 숙주세포를 배양하고; 이어서 생상된 비루스를 분리함으로써 수득되는 RNA 비루스도 제공한다.
본발명의 한가지 구체예를 들면, RNA 비루스는 백신 균주3 폴리오비루스이고 재조합 핵산서열은 비루스를 코오딩하는 완전한 길이의 감염성 재조합 핵산서열로서, 이때 비루스가 생산될수 있도록 하는 조건들하에서 숙주세포를 배양하고; 이어서 생산된 비루스를 분리한다.
본발명의 또 다른 구체예에서는, RNA 비루스가 백신균주3 폴리오비루스이고, 재조합 핵산서열은 백신균주3 폴리오비루스를 코오딩하는 완전할 길이의 감염성 재조합 핵산 서열이다.
본발명은 (a)폴리오비루스로 부터 게놈 RNA를 분리하고; (b)RNA 시퀀싱방법을 이용하여 2493 위치의 뉴클레오티드를 측정하는 단계들로 구성되는, 균주3 폴리오비루스의 변종을 선별하는 방법도 또한 제공한다.
본발명은 또한 RNA 비루스 cDNA가 코오딩하는 균주3 폴리오비루스의 독성 약화력을 증강시키는 방법도 제공하며, 이때 상기 cDNA는 2492-2494 위치에 뉴클레오티드 서열 ATT를 함유하는 것으로서 본발명의 방법은 뉴클레오티드 2493 위치에 존재하는 T가 C로 변화되도록 cDNA를 변이 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본발명의 한가지 구체예로서, 상술한 방법은 뉴클레오티드 2494 위치에 존재하는 T가 A, C 및 G로 구성된 군으로 부터 선택된 뉴클레오티드로 변화되도록 cDNA를 변이처리하는 단계도 또한 포함할수 있다.
본발명은 비루스를 코오딩하는 재조합 핵산 서열을 사용하여 적당한 숙주 세포를 형질전환시키고, 이어서 피검자에게 면역성을 부여하는데 유효한 생산된 비루스를 분리함으로써 수득된, 유효량의 RNA 비루스와 적당한 담체를 함유하는, 피검자, 예컨대 사람에게 감염성 폴리오비루스에 대한 면역성을 부여하는데 유용한 백신을 제공한다.
상기 RNA 비루스로서 백신균주3 폴리오비루스를 사용할수도 있으며, 이때 재조합 핵산 서열은 백신 균주3 폴리오비루스를 코오딩하는 완전한 길이의 감염성 핵산서열이다.
RNA 비루스를 코오딩하는 재조합 핵산서열은 DNA 서열 또는 RNA 서열이어도 무방하며, 본발명의 바람직한 구체예에 따르면 재조합 핵산서열은 cDNA서열이다.
적당한 cDNAs는 백신균주3 폴리오비루스를 코오딩하는 cDNA 핵산 서열에 결합된 프로모터를 함유하는, 각각 pLED3.2 또는 pLED3으로 명명된 플라스미드이다.
플라스미드 pLED3은 특허절차를 목적으로 하는 미생물 기탁과 관련된 국제적 승인에 따른 부다페스트 협약 규정하에 미합중국 메릴랜드 20852 록크빌 파크로운 드라이브 12301에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉숀(ATCC : American Type Culture Collection)에 기탁되어 있으며, 상기 플라스미드 pLED3은 수탁번호 40789로 지정되었다. 플라스미드 pLED 3.2도 또한 부다페스트 협약에 따른 규정하에 ATCC에 기탁되어 있으며, 수탁번호로 지정되었다.
숙주세포로서는 이.콜리, 이스트 및 다른 진균류와 같은 세균, 곤충세포 및 동물세포가 적합하며, 반드시 이들로만 제한되지는 아니한다.
적당한 동물세포로서는 베로(Vero)세포, HeLa 세포, COS세포, CV-1세포 및 영장류 원숭이 신장세포를 들수있으며, 이들로만 제한되는 것은 아니다.
담체로서는 예컨대 덱스트로오스 및 락토오스와 같은 안정화제 또는 기타 다른 비독성 물질들을 함유하는 알린(aline)과 같은, 생리학적으로 균형을 이루고 있는 배양 배지가 적당하다.
또한, 백신을 명반과 같은 알맞은 보조제와 함께 조제할수도 있다.
백신의 제조방법들에 관하여는 제이.아이.두피(J. I. Duffy)의 백신 제조기술(Vaccine Preparation Techniques, 노예스 데이타 코오포레이숀(Noyes Data Corporation)(1980년)) 및 쥐. 더블유. 와르(G.W.Warr)의 "항원의 제조 및 면역성 원리(Preparation of Antigens and Principles of Immunization)" [제이.제이.마르칼로니스(J.J.Marchalonis) 및 쥐.더블유.와르(G.W.Warr)편집, 안티바디 에즈 어 투울-디 어플리케이숀즈 오브 이뮤노케미스트리(Antibody As A Tool-The Applications of Immunochemistry), 21-58페이지, 죤 월리 앤드 썬즈(John Wiley Sons (1982년)]를 참고하기 바란다.
RNA 비루스는 또한, 예컨대 저장목적으로 동결 건조시키거나 또는 후속적으로 액채 백신 형태로 조제하기 위한 목적으로 건조시킬수도 있다.
또한 본발명은 상술한 백신의 적당량을 피검자에게 투여하는 것을 특징으로 하는 사람과 같은 피검자에게 감염성 폴리오비루스에 대한 면역성을 부여하는 방법도 제공한다.
알맞은 백신의 투여 방법들은 당해 기술분야의 통상적인 기술을 지닌 이들에게 널리 알려져 있다.
그러나, 예컨대 근육내, 정맥내, 피하, 기관내 또는 비강내 투여방법을 들수 있으며, 이러한 방법들로만 제한받지 않는다.
부가적으로, 유효한 면역성 부여량은 피검자에게서 항체가 생성되어, 피검자를 감염성 폴리오비루스 또는 척수성소아마비로 부터 보호하는데 필요한 양을 뜻한다.
본원 전체에 걸쳐서 cDNA 분자내의 특정한 뉴클레오티드들에 관한 기술내용은 cDNA의 코오딩가닥, 즉 RNA 비루스에 위치하는 RNA 가닥과 동등한 서열을 갖는 가닥상에 존재하는 뉴클레오티드들에 관하여 언급하는 것이다.
균주3 폴리오비루스내에 존재하는 특정한 뉴클레오티드의 위치번호에 관한 기술은 쥐.스탄웨이(G.Stanway)등이 제안한 뉴클레오티드 넘버링 시스템["신경독성 폴리오비루스 P3/Leon/37 및 그의 독성약화된 세이빈 백신 유도체 P3/Leon/12alb게놈의 완전한 뉴클레오티드 서열 비교(Comparison of the Complete Nucleotide Sequences of the Genomes of the Neurovirulent Poliovirus P3/Leon/37 and its Attenuated Sabie Vaccine Derivative P3/Leon 12alb)" Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81권 1539-43페이지(1984년)]에 따른 것이다.
본원 명세서 및 특허청구의 범위 전체에 걸쳐서 특정한 뉴클레오티드들을 나타내기 위한 목적으로 다음과 같은 표준약어들을 사용하였다.
C-시토신 A-아데노신
T-티미딘 G-구아노신 U-우라실
본원에서 사용하는 용어 "공급원 비루스"는 cDNA를 제조하기 위한 템플레이트로서 RNA가 분리 및 사용되는 RNA 비루스를 의미한다.
또한 용어 "독성약화력 증강"은 전반적으로 종래의 백신 비루스 균주들과 비교할때 신경독성 표현형으로의 전환율이 보다 감소되었다는 뜻으로 사용된 것이다.
본원에서 사용하는 용어 "진정한 비루스 cDNA"란 공급원 비루스와 유사한 표현형을 갖는 생존 가능한 RNA 비루스의 제조에 관여하는 cDNA를 일컫는다.
따라서, 본발명은 과잉된 유전암호에 기인하여 공급원 비루스 RNA의 그것과는 다른 뉴클레오티드 서열을 갖는다는 특징으로 지니나 공급원 비루스 RNA가 코오딩하는 것들과 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코오딩하는 cDNA 분자들도 포함한다.
본발명은 또한 공급원 비루스 폴리펩티드의 그것들과는 다른 아미노산 서열을 코오딩하나 표현형적으로는 변화를 나타내지 않는 cDNAs도 포함한다.
이하에서는, 이들 변형된, 그러나 표현형적으로는 동등한 아미노산 서열들을 "동등한 아미노산 서열"로 기재하기로 한다.
또한 본발명은 공급원 비루스와 비교해볼때, 비-코오딩 영역들내에 변화된 특성을 가지나 자체로 부터 생산된 RNA 비루스의 표현형이 변화되지 않은 cDNA 분자들도 포함한다.
생산된 비루스에게서 표현형적 차이점들을 초래하는 RNA 비루스 cDNA의 뉴클레오티드 서열과 공급원 비루스 RNA 사이의 차이점들을 이하에서는 "실제적인 차이점"으로 기재하기로 한다.
본발명은 (a)RNA 공급원 비루스로 부터 게놈 RNA를 분리하고, (b)RNA 시퀀싱 방법을 이용하여 분리된 게놈 RNA 영역의 뉴클레오티드 서열을 측정하고, (c)cDNA 합성방법을 이용하여 분리된 게놈 RNA로 부터 이중-가닥 cDNA를 생산하고, (d)DNA 시퀀싱 방법을 이용하여 cDNA영역의 뉴클레오티드 서열을 측정하고, 이때 cDNA영역은 단계 (b)에서 시퀀싱처리된 RNA영역과 상응하며, (e)시퀀싱 처리된 cDNA와 시퀀싱 처리된 RNA를 비교하여 뉴클레오티드 서열내의 실제적인 차이점들을 알아내고, 이어서 (f) cDNA내부의 실제적인 차이점들을 변화시켜 RNA 비루스 cDNA를 생산하는 단계들로 구성되는, RNA 비루스 cDNA의 제조방법을 제공한다.
본발명의 한가지 구체예에서는 RNA 비루스가 진정한 RNA 비루스이고, 본발명의 또다른 구체예에서는 RNA 비루스가 "표현형적으로 동등한" 비루스이다.
본발명의 한가지 구체예를 들면, RNA 공급원 비루스가 피코르나비루스, 예컨대 백신 균주3 폴리오비루스이다.
본발명은 또한 상술한 방법에서 단계(b)에서 시퀀싱 처리된 RNA 영역이 백신 균주3 폴리오비루스의 뉴클레오티드 2493을 포함하는 방법, 또는 바람직하게는, RNA가 약 100-200개의 뉴클레오티드로 구성되어 있는 방법도 제공한다.
본발명의 또다른 구체예로서, 상술한 방법에서 전체 분리된 비루스 RNA의 뉴클레오티드 서열을 단계 (b)에서 측정하는 방법도 들수있다.
본발명의 방법을 이용하여 폴리오비루스 게놈의 다양한 부분들에 위치하는 뉴클레오티드들을 변형시킴으로써 RNA 비루스 cDNA를 제조할수도 있으며, 예컨대 타입 1 마호니(Mahoney)폴리오비루스의 VP1 아미노 말단을 코오딩하는 부분에서 발생된 변이를 수정하기위한 목적으로 본발명의 방법을 이용할수도 있다[케이. 키르케가아드(K. Kirkegaard), "비루스 RNA의 캡슐화 및 방출둘다에 특이적으로 영향을 미치는 폴리오비루스의 VP1내에서의 변이처리(Mutations in VP1 of poliovirus Secifically Affect Both encapsulation and Release of Viral RNA)" J. Virology, 64권, 195-206페이지 (1990년)].
본발명에서는 또한 전술한 것들중 임의의 방법에 의해서 제조된 RNA 비루스 cDNA도 제공하며, 예로서 백신균주 3 폴리오비루스로 부터 유래된 RNA 비루스 cDNA, pLED3 또는 pLED3.2로 구성된 군으로 부터 선택된 cDNA 및 pLED3 또는 pLED3.2에 의한 형질발현을 코오딩하는 폴리펩티드의 형질발현을 코오딩하는 cDNAs를 들수있으며, 이들로만 제한되지는 아니한다.
본발명은 또한 상술한 RNA 비루스 cDNA를 함유하는 재조합 DNA 분자를 제공하고, 예컨대 RNA 비루스 cDNA가 T7 프로모터와 같은 RNA 전사 프로모터와 기능적으로 결합되어있는 재조합 DNA 분자를 들수있으며, 본발명의 재조합 DNA 분자가 위의 물질로만 제한되지는 아니한다.
상술한 재조합 DNA 분자를 사용하여 형질 전환시킨 숙주도 또한 제공되며, 이때 숙주는 세균, 이스트 및 기타 다른 진균류, 곤충세포 및 동물세포로 구성된 군으로 부터 선택된다.
본발명의 바람직한 구체예에서는 숙주가 베로(Vero)세포, HeLa 세포, COS세포, CV-1 세포 및 영장류 원숭이 신장세포로 구성된 군으로부터 선택된 동물세포이다.
또다른 구체예에서는 숙주가 이.콜리이다.
본발명은 생존 가능한 RNA 비루스가 생산될수 있도록 하는 조건들하에서 상술한 숙주를 배양하고, 이어서 숙주세포 배양물로 부터 생존 가능한 RNA를 수거하는 단계들로 구성되는, 생존 가능한 RNA 비루스의 제조방법도 또한 제공한다.
본발명은 시험관내에서의 전사방법을 이용하여 전술한 바있는 재조합 DNA 분자로 부터 RNA를 제조하고, RNA를 분리한후, 분리된 RNA를 사용하여 동물세포인 숙주를 감염시키고, 상기 숙주를 생존가능한 RNA 비루스가 생산될수 있도록 하는 조건들하에서 배양한 다음, 숙주 세포 배양물로 부터 생존 가능한 RNA 비루스를 수거하는 단계들로 구성되는, 생존 가능한 RNA 비루스의 제조방법도 제공한다.
본발명의 바람직한 구체예에 따르면, RNA 비루스는 백신균주3 폴리오비루스이고 숙주는 영장류 원숭이 신장 세포이다.
본발명에서는 균주3 폴리오비루스의 변종을 선별하는 방법도 제공하며, 본발명의 선별방법은 폴리오비루스로 부터 게놈 RNA를 분리하고, 이어서 RNA 시퀀싱 방법을 이용하여 2493 위치에 존재하는 뉴클레오티드를 측정하는 단계들로 구성된다.
본발명은 또한 RNA 비루스 cDNA가 코오딩하는 균주 3 폴리오비루스의 독성약화력을 증강시키는 방법도 제공하며, 이때 cDNA는 2493-2494 위치에 뉴클레오티드 서열 ATT를 포함하고 있고, 본발명의 방법은 뉴클레오티드 2493에 위치하는 T가 C로 변화되도록 cDNA를 변이처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본발명의 방법은 또한 뉴클레오티드 2494에 위치하는 T가 A, C 및 G로 구성된 군으로 부터 선택된 뉴클레오티드로 변화되도록 cDNA를 변이처리하는 단계도 포함할수있다.
표현형적 차이점들을 측정하기 위한 목적으로 당해 기술분야에 주지되어있는 여러방법들을 수행할수있다.
이때, 독성약화된 균주 3 폴리오비루스의 진정한 RNA 비루스 cDNA가 공급원 비루스와 동일한 독성약화력을 갖는 비루스를 코오딩하는 것이 바람직하다.
특성이 널리 알려져있는 여러가지 표지물들을 사용하여 폴리오비루스 균주내의 표현형적 변화를 알아낼수 있다.
상기 표지물의 예로서 산 조건들하에서의 비루스의 성장 기능을 조절하는 "α" 표지물[엠. 보그트(M.Vogt)등, "산배지내에서의 저하된 플레이팅 효율 및 감소된 뉴로패쏘게니시티를 갖는 척수성소아마비 비루스의 변이주(Mutants of Poliomyelitis Viruses with Reduced Efficiency if Plating in Acid Medium and Reduced Neuropathogenicity)" Virology, 4권, 141-55페이지(1957년)]; 및 고온에서 비루스의 성장기능을 조절하는 "rct40" 표지물[에이.로우프(A. Lwoff), "세포단계에서 및 생물체내에서 비루스 질환의 진화에 영향을 미치는 요인(Factors Influencing the Evolution of Viral Diseases at the Cellular Level and in the Organism)" Bact. Rev., 23권, 109-24페이지 (1959년)]을 들수있다.
독성약화된 균주3 공급원 폴리오비루스와 그의 진정한 RNA 비루스 cDNA로 부터 제조된 비루스 사이의 표현형적 변화를 측정하는 가장 바람직한 방법은 신경발병력(neurovirulence)을 비교하는 것이며, 신경 발병력을 평가하기 위한 각종 프로토콜들이 당해 기술분야에 공지되어있다[코오드 오브 페더럴 레귤레이숀즈(Code of Federal Regulations, 표제 21, 1장, 91-93페이지(1987년 4월 1일 편집)].
[진정한 RNA 비루스 cDNA의 제조]
한가지 구체예에 따르면, 본발명은 진정한 RNA 비루스 cDNA의 제조방법에 관한 것이다.
본발명에 따른 진정한 RNA 비루스 cDNA의 제조방법에서는 임의의 모든 RNA 공급원 비루스--양성단일-가닥, 음성단일-가닥, 또는 이중-가닥--비루스를 사용할수 있다.
이들중 바람직한 공급원 비루스로서는 양성 단일-가닥 비루스를 들수있다.
보다 바람직한 비루스는 피코르나비리다에과에 속하는 인체 장비루스이며, 가장 바람직한 것은 독성약화된 타입 3 백신 균주 폴리오비루스("P3/세이빈"으로 기재하기도함)이다.
[A. 비루스의 증식 및 분리]
진정한 RNA 비루스 cDNA를 제조하기 위한 최초의 단계는 공급원 비루스를 증식 및 정제시키고, 이어서 그로부터 RNA를 분리하는 과정이다.
비루스를 증식 및 분리하는 기술은 당해 기술분야에 주지되어있다[알. 제이. 쿠클러(R. J. Kuchler), "세포배양 및 비루스학에서의 생화학적 방법들(Biochemical Methods in Cell Culture and Virology)" 도우덴, 후친슨 앤드 로스 인코오포레이티드(Dowden, Hutchinson and Ross, Inc.), 스트라우스버그, 펜실바니아(1977년)].
숙주세포의 선택을 비롯한 비루스의 성장방법, 성장배지의 선택 및 성장 조건들은 특정한 공급원 비루스에 따라 달라진다는 것을 밝혀두는 바이다.
바람직한 구체예에 따르면, 독성약화된 균주3 폴리오비루스를 공지의 방법들에 따라 영장류 원숭이 신장세포내에서 증식시킨다[에이. 세이빈(A. Sabin)등, "척수성소아마비 비루스의 변종들에 대한 연구(Studies on Variants of Poliomyelitis Virus)," J. Exp. Med., 99권, 551-76페이지(1954년)].
임의의 폴리오비루스 균주에 대하여 이하의 공정을 적용할수 있다.
그러나 이들 공정에서 다른 RNA 공급원 비루스를 사용하는 경우에는 당해 기술분야의 숙련된 이들에게 공지되어 있는, 특정한 비루스에 대하여 특이적인 변형 요건들을 충족시켜줄 필요가 있다.
RNA 비루스의 비루스 증식공정은 RNA를 분리하기 위한 충분량의 비루스를 수거할수 있을때까지 진행시킨다.
이이서 공급원 비루스를 함유하는 배양배지를 수거하여 세포파쇄물을, 바람직하게는 비루스가 작은 알갱이의 펠릿형태로 되지않는 속도로 원심분리하여 제거한다.
통상적으로 상기 원심분리는 약 2.500rpm으로 약 20분간 실시한다.
이어서 비루스 입자들보다도 더 큰 세공크기를 갖는 필터를 사용하여 한외여과법을 실시하여 상층액을 보다 더 정제한다.
이때, 약 0.22μM의 필터를 사용하는 것이 바람직하다.
여과시킨후, 원심분리 또는 보다 바람직하게는 약 70,000rpm에서의 고속 원심분리를 실시하고, 이어서 폴리에틸렌 글리콜 침전법을 이용하여 비루스 입자들을 수거한다.
이어서 비루스 입자들을 소량의 완충액, 바람직하게는 TNE(10mM 트리서-Hcl, 100mM Nacl, 1mM EDTA, pH7.4)중에 재현탁시킨다.
임의의 오염물질들을 용해시키기 위한 목적으로 상기 비루스입자 현탁액에 비-이온계 계면 활성제를 임의로 첨가할수도 있다.
고속 비루스 펠릿이 비루스 RNA의 공급원으로 사용되기에 충분히 순수한 상태이기는 하나, 임의로 수크로오스 밀도구배 원심분리를 이용하여 비루스 현탁액을 보다 더 정제할수도 있다.
밀도구배 원심분리를 실시할 경우, 밀도구배차로 분획들을 수거하여 공급원 비루스의 존재여부를 분석한다.
공급원 비루스-특이성 단백질들을 검출하는 임의의 통상적인 분석수단들을 이용하여도 무방하다.
그와같은 분석수단의 예로서는 웨스턴 블롯, 엘리사법(ELISA), 방사능 면역분석법, 또는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법 및 표준 공급원 비루스와의 비교방법을 들수있으며, 마지막 비교 방법이 가장 경제성을 지닌다는 측면에서 가장 바람직하다.
[B. 비루스 RNA의 분리 및 시퀀싱]
전술한 바와같이 비루스를 정제한후에 비루스 RNA를 분리할수 있다.
비루스 RNA를 분리하기위해서는 먼저 계면활성제, 바람직하기로는 최종농도 0.5%의 소듐 도데실 설페이트("SDS")로 처리하여 비루스 캡시드 단백질을 해리시킨다.
이어서 시료를 유기용매들로 처리하여 해리된 단백질을 추출한다.
이때, 페놀 : 클로로포름 : 이소아밀 알코올 혼합물을 사용하여 추출하는 것이 바람직하다.
이어서 당해분야에 주지되어있는 임의의 방법을 이용하여 수상내에 존재하는 RNA를 분리할수있다[티. 마니아티스(T.Maniatis, "더 모레큘라 가이드 투 클로닝(The Molecular Guide To Cloning)", 콜드 스프링 하버 프레스(Cold Spring Harbor Press)(1983년)].
바람직하기로는, -20℃에서 0.5배 부피의 7.5M 암모늄아세테이트 및 2.5배 부피의 에탄올을 사용하여 비루스 RNA를 침전시킨다.
비루스의 정량분석 및 보전상태는 아가로스 겔 전기영동에 의해서 측정가능하다.
분자생물학 분야에서 주지되어있는 바와같이, 우세하게 존재하는 RN아제에 기인하여 RNA 시료의 제조 및 취급에 있어서 상당한 주위가 요한다는 사실을 밝혀두는 바이다.
RNA 제조시 사용하는 용기들 및 시약들내에 존재 가능한 RN야제를 불활성화시키는 방법들은 널리 알려져있다[티. 마이나티스(T. Maniatis), 동일문헌].
공급원 비루스 RNA를 분리한후에는, RNA에 대한 변형요건들[디.씨. 드보르데(D.C. Deborde)등, "말단 데옥시뉴클레오티딜 전이효소를 이용한 통상적인 RNA 시퀀싱 부정확성의 해결방법(Resolution of A Common RNA Sequencing Ambiguity By, Terminal Deoxynucleotidyl Transferase)" Anal, Biochem. 157권, 275-82페이지(1986년)]을 채택하여 디데옥시 뉴클레오티드 시퀀싱[에프. 생거(F.sanger)등, "사슬 종결 억제제들을 사용한 DNA 시퀀싱(DNA Sequencing with Chain-Terminating Inhibitors)", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74권 : 5463-67페이지(1977년)]을 실시한다.
본발명의 바람직한 구체예에 따르면, 비루스의 전체 RNA 게놈을 시퀀싱처리하여 이하에 기술하는 방법으로 cDNA 서열과 비교한다.
그와같은 본발명의 구체예에 있어서, 공급원 비루스로서는 독성약화된 타입3 백신균주 폴리오비루스가 가장 바람직하다.
[C. RNA 비루스 cDNA 라이브러리의 합성 및 선별]
RNA의 시퀀싱처리후, 공급원 비루스 RNA는 완전한 길이의 이중-가닥 cDNA를 합성하기 위한 템플레이트로서 사용된다.
임의의 주지되어있는 방법 또는 시판되고있는 cDNA 합성키트를 이용하여 cDNA를 합성한다.
바람직하기로는, 브이. 알, 라카니엘로(V.R. Racaniello)등이 "폴리오비루스 cDNA의 분자클로닝 및 비루스 게놈의 완전한 뉴클레오티드 서열측정(Molecular Cloning of Poliovirus cDNA And Determination of the Complete Nucleotide Sequence of the Viral Genome)"이란 표제로 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78권, 4887-91페이지(1981년)에 발표한 방법을 이용하여 cDNA를 합성한다.
검출을 용이하게 하기위해, cDNA 합성공정중에 방사성 뉴클레오티드를 사용하여 cDNA의 첫번째 가닥을 임의로 방사능 표지시킬수도 있다.
일단 합성된후에는, 단일-가닥 cDNA에 대하여, 바람직하기로는 아가로스 겔 전기영동 또는, 보다 바람직하기로는 겔 크로마토그래피를 실시하여 크기-분별공정을 수행한다.
보다 큰 cDNAs를 분리하여 두번째-가닥을 합성하기 위한 템플레이트로서 사용한다.
이어서 이중-가닥 cDNA에 대하여 전술한 바있는 크기-분별공정을 실시하고, 가장 큰 분자를 사용하여 공급원 비루스 cDNA 라이브러리를 제조한다.
이어서 올리오(olio)dG/dC 방법을 이용하거나 또는 제한효소 링커들을 첨가하여 cDNA를 테일링(tailing)처리하고, 적당한 벡타내에 클로닝 처리한다.
벡타는 라이브러리를 선별하는데 이용하고자 하는 기술을 고려하여 선택된다.
예컨대 면역스크리닝 기술을 이용하고자 할 경우에는 람다 gt11(ATCC 수탁번호 37194)과 같은 형질발현 벡타내에 cDNA를 삽입시킨다.
하이브리드화 스크리닝 방법을 이용하는 경우에 있어서는 바람직하기로는, 올리오(olio)dG/dC 방법을 이용하여 cDNA를 테일링 처리한후 pBR 322의 Pst I 부위내에 클로닝시킨다.
일단 RNA 비루스 cDNA 라이브러리가 생성되면, 상기 라이브러리에 대하여 완전한 길이의 cDNA 클로온을 선별한다.
이때에는 항체 스크리닝 또는 표지된 탐침과의 하이브리드형성과 같은 주지의 스크리닝방법들을 이용하여 실시한다.
가장 바람직하기로는, 공지의 뉴클레오티드 서열 또는 비루스의 아미노산 서열을 기초로하여 비루스-특이성 cDNA 탐침을 이용한 콜로니 하이브리드화 방법[엠. 그룬스타인(M. Grunstein)등, "콜로니 하이브리다이제이숀 : 특이성 유전자를 함유하는 클로닝된 DNAs의 분리방법(Colony Hybridization : A Method for the Isolation of Cloned DNAs that Contain A Specific Gene)", Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 72권, 3961-65페이지(1975년)]을 실시하여 라이브러리를 선별한다.
RNA 비루스 cDNA를 함유하는 클로온을 확인 및 분리한후, 벡타로 부터 꺼내어 완전한-길이의 RNA 비루스 cDNA를 나타내는지 여부를 측정하기 위해 분석한다.
본발명의 바람직한 구체예에 따르면, Pst I으로 분해시켜 Pst I 절단된, dG-테일드(tailed) 벡타로 부터 dC-테일드(tailed)cDNA를 분리한다.
라이브러리에 대하여 재탐침 처리를 실시하기 위한 목적으로 및 보다긴 또는 완전한 길이의 cDNA를 위치시키기 위한 목적으로 부분적인 cDNAs를 사용할수도 있다.
완전한 길이의 cDNA가 검출되지 않을 경우에는, 전체적인 공급원 비루스 게놈을 나타내는 여러가지 겹치는 부분적인 cDNAs를 통상적인 제한효소 부위들에서 함께 결찰시켜 완전한 길이의 cDNA를 제조한다.
[브이. 알. 라카니엘로(V.R.Racaniello)등, "클로닝된 폴리오비루스 cDNA가 포유류 세포내에서 감염을 유발함(Cloned Poliovirus cDNA Is Infections In Mammalian Cells)", 사이언스(Science), 214권, 916-19페이지(1981년)].
분리된 cDNA에 의해서 나타나지 않는 임의의 비루스 게놈 영역을 표준 올리고뉴클레오티드 합성기술을 이용하여 합성한후, 그의 적당한 위치내에 결찰시킴으로써 완전한 길이의 cDNA를 수득한다.
[D. 공급원 비루스 RNA와 상응하도록 하는 cDNA의 시퀀싱 및 변형]
시퀀싱처리된 공급원 비루스 RNA의 영역과 상응하는 완전한 길이의 cDNA 영역들을 표준 DNA 시퀀싱방법을 이용하여 시퀀싱처리한다.
이어서, 시퀀싱처리된 비루스 RNA 부분과 RNA 비루스 cDNA를 비교한다.
이론적으로는, cDNA가 그의 템플레이트로서의 역활을 수행하는 RNA와 정확하게 상응하여야 한다.
그러나 RNA를 부터 cDNA가 전사되는 과정에서 역 전사효소가 오류를 발생시킬수 있다는 사실이 공지되어있다[아이. 엠. 베르마(I.M. Verma), "역전사효소(Reverse Transcriptase)" In the Enzymes, 14권, 피. 디. 보이어(P. D. Boyer)편집, 아카데믹 프레스(Academic Press), 뉴욕, 87-104페이지(1981년)].
따라서, 본발명의 방법에 따르면, 시퀀싱처리된 RNA와 상응하게 되도록 cDNA의 뉴클레오티드 서열을 변형시킬 필요가 있다.
본발명에서는 표현형적 변화에 관여하는 부위들에 위치하는 cDNA 서열을 변형시키는 것을 목적으로 한다.
따라서 공급원 비루스 RNA가 코오딩하는 것들과 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코오딩하는 cDNA영역들은 변형시킬 필요가 없다.
바람직하기로는, 비루스 생산 또는 비루스의 폴리펩티드 합성에 강력하게 영향을 미치는 임의의 cDNA 뉴클레오티드 변이처리를 실시하여 공급원 비루스 RNA와 상응하게 되도록 변형시킨다.
cDNA 분자의 뉴클레오티드 서열을 변형시키는 방법들은 당해 기술분야에 공지되어있으며, 예로서 부위-관련 변이처리를 들수있다[씨.에이.후친슨(C.A. Hutchinson), III 등, "DNA 서열내의 특정한 위치에서의 변이처리(Mutagenesis At A Specific Position In A DNA Sequence)", J. Bio. Chem, 253권, 6551-60페이지(1978년); 에이. 라진(A. Razin)등, "화학합성된 DNA를 이용한 변이의 효과적인 보정법(Efficient Correction of A Mutation By Use of A Chemically Synthesized DNA)", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75권, 4268페이지(1978년)].
또는, 목적하는 서열을 함유하는 부분적인 cDNA 클로온을 cDNA 라이브러리 및 그의 DNA, 또는 자체의 일부분으로 부터 분리하여 변형시키고자 하는 서열을 나타내는 완전한 길이의 클로온내에 치환시킨다.
cDNA 서열을 변형시킨후 본발명의 다른 구체예에서 사용한다.
본발명의 또다른 구체예에 따르면, 진정한 RNA 비루스 cDNA를 적당한 벡타내에 삽입시켜 적당한 숙주를 형질 전환시키기 위한 목적으로 이용할수도 있다.
상기 벡타의 선택은 궁극적으로 의도하는 cDNA의 용도에 좌우된다.
마찬가지로, 숙주의 선택도 선택된 벡타 및 궁극적인 형질전환 목적에 좌우된다.
예컨대, 단순히 cDNA를 저장하고, 그를 생성 및 무제한적으로 공급하는 것만을 목적으로 하는 경우에 있어서는, cDNA를 세균, 이스트 또는 다른 진균류, 동물세포 또는 곤충세포와 같은 단세포 생물체를 형질전환시킬 수있는 벡타내에 삽입한다.
본발명의 한가지 구체예에 따르면, cDNA가 pBR322의 Pst I 부위내에 삽입되고, 형질전환시키고자 하는 숙주는 이.콜리이다.
본발명의 또다른 구체예에 따르면, 진정한 RNA 비루스 cDNA가 전사프로모터와 기능적으로 결합되어 있을수도 있다.
본원에서 사용하는 용어 "기능적으로 결합되어 있다"는 것은 프로모터가 진정한 비루스 cDNA와 떨어져있는 RNA의 전사에 관여하는 방식으로 위치하고 있다는 것을 의미한다.
그와 같은 프로모터로서는 SP6, T4 및 T7을 예시할수 있으며, 가장 바람직한 프로모터는 T7 프로모터이다[제이. 제이. 둔(J. J. Dunn)등, "박테리오파지 T7 DNA의 완전한 뉴클레오티드 서열 및 T7 유전 원소들의 위치(Complete Nucleotide Sequence of Bacteriophage T7 DNA and the Locations of T7 Genetic Elements)", J. Mol. Biol. 166권, 477-535페이지(1983년)].
프로모터 및 자체내에 삽입된 DNA 단편이 상기 프로모터와 기능적으로 결합되어 있는 클로닝 부위 둘다를 함유하는 벡타들이 당해 기술분야에 주지되어 있다.
바람직하기로는, 이들 벡타들이 시험관내에서 RNA를 전사시킬수 있다.
그와같은 벡타의 예로서 pGEM 계열의 것들을 들수있다[프로메가 바이오텍(Promega Biotec, 매디슨, 위스콘신].
또다른 구체예에 따르면, 본발명은 생존 가능한 양성 가닥 RNA 비루스의 제조방법에 관한것으로서, 본발명의 방법은 적당한 숙주를 진정한 RNA 비루스 cDNA로 감염시킴으로써 수행된다.
DNA를 사용하여 동물세포를 감염시키는 임의의 표준방법을 이용할수있다[에프.엠.아우스벨(F.M. Ausubel)등, "분자 생물학에서의 현행 프로토콜(Current Protocols in Molecular Biology)", 그리인 퍼블리싱 어소시에이츠 앤드 윌리 인터사이언시즈(Greene Publishing Associates Wiley Intersciences)(1987년)].
이어서 RNA 비루스가 생성되도록 유도하는 조건들하에서 숙주를 배양한다.
그와같은 조건들은 당해 기술분야에 주지되어 있으며, 생성시키고자 하는 비루스에 따라 달라진다.
마찬가지로, 숙주세포도 비루스와의 적합성을 지닌 것으로 선택되어야 하며, 배양중인 영장류의 세포가 바람직하다.
본발명의 바람직한 구체예에서는 진정한 RNA 비루스 cDNA가 독성약화된 균주3 폴리오비루스를 코오딩하며, 숙주는 베로(Vero)세포, HeLa세포, COS세포, CV-1세포, WI-38 및 MRC5와 같은 인체 배수 염색체 세포주 및 영장류 원숭이 신장세포로 구성된 군으로 부터 선택된다.
가장 바람직한 숙주는 원숭이 신장 세포이다.
세포가 목적하는 정도의 비루스를 생산하게 되면, 표준 프로토콜에 따라 세포 배양물로 부터 비루스를 수거한다.
본발명의 또 다른 구체예에 따르면, 본발명에 따른 진정한 RNA비루스 cDNA의 시험관 내에서의 전사에 의해서 생성된 비루스 RNA를 생존가능한 RNA 비루스를 제조하기 위한 방법에서 사용할수도 있다.
시험관내에서 전사된 RNA를 표준방법으로 분리하여 적당한 숙주를 감염시키는데 사용한다.
세포를 감염시키기 위안 목적으로 RNA를 사용하는 것은 당해 기술분야에 공지되어있다[에스. 반 데르 웨르포(S. Van der Werf)등, "정제된 T7 RNA 폴리머라제를 이용한 감염성 폴리오비루스 RNA의 합성(synthesis of Infectious Poliovirus RNA by Purified T7 RNA Polymerase)", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83권, 2330-34페이지(1986년)].
세포를 감염시킨후에는 표준 프로토콜에 따라 상기 세포들을 성장시키고 이어서 비루스를 수거한다.
또다른 구체예에 따르면, 본발명은 균주 3 폴리오비루스의 변종들을 선별하는 방법에 관한것이다.
RNA 시퀀싱처리에 의해서 상기 폴리오비루스의 뉴클레오티드 위치 2493에 존재하는 C가 독성약화된 균주 3 유전자형에 결합되어 있는 것으로 밝혀졌다.
상기 균주에 대한 종래의 분석에서는 2가지 요인 : 야생형과 독성약화된 균주3 폴리오비루스의 서열을 게놈 RNA 레벨이 아닌 cDNA레벨로 비교하였다는 점; 및 이들 cDNAs의 일부가 원래 비루스 시료의 플라아크 분리물들로 부터 제조된 것이라는 점이 복합적으로 작용하여 상기 위치가 독성약화에 미치는 중요성이 인지되지 못하였다[스탄웨이(stanway)등, "신경독성 폴리오비루스, P3/Leon/37 및 그의 독성약화된 세이빈 백신 유도체 P#/Leon12alb 게놈의 완전한 뉴클레오티드 서열비교(Comparison of the Complete Nucleotide Sequences of the Genomes of the Neurovirulent Poliovirus P3/Leon/37 및 its Attenuated Sabin Vaccine Derivative P3/Leon 12alb) "Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81권, 1539-43페이지(1984년); 에이취. 도요다(H. Toyoda)등, "세가지 모든 폴리오비루스 혈청형 게놈의 완전한 뉴클레오티드 서열(Complete Nucleotide Sequences of All Three Poliovirus Serotype Genomes)", J. Mol. Biol., 174권, 561-85페이지(1984년)].
역전사공정에서의 잘못 또는 비루스계대 접종으로 부터 야기된 변이로 인하여 종래에 생산된 cDNAs는 2493위치에 T를 함유하였다.
따라서, 폴리오비루스의 타입3 백신균주의 RNA가 야생형 균주내에 존재하는 동일한 뉴클레오티드인 U를 상기 2493위치에 함유하는 것으로 잘못 추론되어 왔다[스탄웨이(stanway)등, 동일문헌; 에이취. 도요다(H. Toyocta)등, 동일문헌].
따라서 위치 249301 폴리오비루스 균주3 게놈의 독성약화에 관여하는 것으로 결코 생각된 바 없었다.
따라서, 본발명에 따른, 균주3 폴리오비루스의 변종 선별방법은 비루스의 RNA를 시퀀싱처리하고, 이어서 2493위치의 뉴클레오티드를 측정하는 단계들로 구성된다.
시퀀싱 처리하고자 하는 RNA 영역이 뉴클레오티드 2493을 포함하여 약 100-200개 뉴클레오티드로 구성되어져 있는 것이 가장 바람직하다.
본발명의 방법은 2493위치에 존재하는 C가 비루스 게놈내에서 유지될수 있도록 공급원 비루스의 증폭공정(즉, 백신생산)에서 이용될수 있다.
본발명은 또한 진정한 RNA 비루스 cDNA로 부터 생산된 균주3 폴리오비루스의 독성약화력을 증강시키는 방법과도 관련된 것으로서, 상기 cDNA는 2492-2494위치에 ATT 서열을 포함한다.
본발명의 방법은 2493위치에 존재하는 뉴클레오티드 T를 C로 변이처리하고, 이어서 변이처리된 cDNA를 이용하여 생존 가능한 비루스를 제조한다.
균주3 폴리오비루스 RNA의 위치 2493에 U대신 C가 존재함으로써 비루스 캡시드 단백질 VP1의 6번째 아미노산이 유전코오드를 근거로 하여, 이소로아신으로 부터 트레오닌으로 변형될 것으로 예상된다.
상기 아미노산을 코오딩하는 코오돈은 뉴클레오티드 2492-2494에 위치한다.
따라서, 본발명에 따른 균주3 폴리오비루스의 독성약화력을 증강시키는 방법에서는 뉴클레오티드 2494에 위치하는 T를 A, C 또는 G로 변이처리하는 것도 또한 포함한다.
이상 서술한 본발명이 보다 잘 이해될수 있도록, 이하에는 실시예들을 기술하기로 한다.
이들 실시예들은 단지 본발명을 구체적으로 예시하기 위한 목적의 것들로서, 어떠한 방식으로든지 본발명을 제한하는 것으로 해석하여서는 아니된다는 것을 밝혀두는 바이다.
[실시예 1]
[균주3 폴리오비루스의 정제]
이하에 기술되는 방법들에서 사용하는 모든 유리제품은 RN아제를 제거하기 위한 목적으로 멸균처리 또는 디에틸 피로카르보네이트(DEP)로 처리한 것들이다.
시약들은 모두, 사용하기에 앞서 DEP로 처리한 물을 사용하여 제조된 것들이다.
낮은 감염 다중도("MOI")로 "오리뮨(ORI-MUNE)" 백신(레데를 레보러토리즈(Lederle Laboratories), 퍼얼 리버(Pearl River), 뉴욕으로 부터 플라아크 정제공정을 실시하여 분리된 독성약화된 균주 3 폴리오비루스를 사용하여 영장류 원숭이 신장세포를 감염시킨다.
감염시킨 배양물을, 세포 단일층이 파괴될때까지(+4 세포독성 효능("CPE"), 변형시킨 얼스 락티알 메인티난스 배지(Earle's lacteal maintenance mediun, pH 7.3)에서 온도 34℃로 유지시킨다.
배양배지(120ml)를 수거한후, 2,500rpm으로 20분간 원심분리하여 모든 세포 파쇄물들을 제거한다.
이어서 상층액을 0.22μM 밀렉스(Millex) GV 디스크 필터에 여과시킨다.
여액을 신속하게 밀봉되는 고속 원심분리 튜브내에 넣고 70.1 Ti 로타내에서 70,000rpm으로 4℃에서 1시간동안 회전시킨다.
수득된 비루스 펠릿을 RN아제-유리 TNE(10mM 트리스-Hcl, 100mM Nacl, 1mM EDTA, pH7.4)4ml중에 재현탁시키고, 이 현탁액을 15ml 폴리프로필렌 튜브로 옮긴다.
이어서 RN아제-유리 SDS를 최종 농도 0.5%로 첨가하여 비루스 캡시드를 해리시킨다.
[실시예 2]
[비루스 RNA의 분리 및 시퀀싱]
실시예 1에서 제조된 용해시킨 상태의 캡시드를 동일한 부피의 페놀 : 클로로포름 : 이소아밀 알코올(25 : 24 : 1)로 추출하여 비루스 RNA를 분리한다.
수층을 분리한후, 동일한 유기용액을 사용하여 다시 추출한다.
수성 추출물에 1.5배 부피의 7.5M 암모늄 아세테이트 및 2.5배 부피의 100% 에탄올을 첨가하고, -20℃에서 적어도 30분동안 RNA를 침전시킨다.
이어서 12,000rpm으로 30분간 원심분리하여 RNA를 펠릿상태로 얻고, 이 RNA 펠릿을 빙-냉 70% 에탄올로 2회 세정한후, 진공중에서 건조시키고, 20μM의 수중에 재현탁시킨다.
RNA의 보전상태 및 농도를 아가로스 겔 전기영동으로 측정한다.
이어서 드보르데의 방법[디.씨.드보르데(D.C. Deborde)등, Anal. Biochem. 157권, 275-82페이지(1986년)]을 주로 이용하여 비루스 RNA를 시퀀싱 처리한다.
상기 문헌의 기술 내용을 참고로 본원에서도 인용하기로 한다.
시퀀싱 처리에 관한 상세한 내용은 이하에서 기술하기로 한다.
정제시킨 비루스 RNA 약 500mg을 200mM 트리스-Hcl(pH 8.3), 200mM Hcl, 20mM MgCl2, 10mM DTT중에서 100℃에서 3분간 열변성처리한후, 얼음배드내에 침지시켜 재빨리 냉각시킨다.
프라이머, dATP 및 효소들을 드보르데(Deborde)등이 기술하고 있는 바와같이 RNA와 함께 혼합한다.
2.5㎕의 프라이머-RNA 혼합물을 동일한 부피의 각종 반응 혼합물들과 각기 다른 튜브내에서 다음과 같은 성분 농도로 합한다.
튜브 A : 50mM 트리스-HCl, pH 8.3, 50mM KCl, 5mM MgCl, 10mM DTT, 각각 100μM의 dCTP, dGTP 및 dTTP, 5μCi(35S)-dATP, 1.25μM ddATP, 100ng RNA, 15ng 프라이머 및 2.5유닛의 역전사효소;
튜브 C : 20μM dCTP, 2.5μMdd(TP를 함유하며 ddATP는 함유하지 않는 것을 제외하고는, 튜브 A에서와 동일함.
튜브 G : 20μM dGTP, 3.0μM ddGTP를 함유하며 ddATP는 함유하지 않는 것을 제외하고는, 튜브 A에서와 동일함.
튜브 T : 20μM dTTP, 7.5μMddTTP를 함유하며 ddATP는 함유하지 않는것을 제외하고는, 튜브 A에서와 동일함.
튜브 N : ddATP를 함유하지 않는것을 제외하고는, 튜브 A에서와 동일함.
각각의 튜브를 42℃에서 20분간 배양한다.
배양후, 1μM의 체이스용액(각각 1mM의 dATP, dCTP, dGTP및 dTTP 및 2유닛의 말단데옥시뉴클레오티딜 전이효소)을 각각의 튜브에 첨가하고, 튜브를 다시 37℃에서 30분간 배양한다.
-20℃로 동결시켜 반응을 종결시키고, 전기영동을 실시하기에 앞서 각각의 튜브에 5μl의 포름아미드 염료 혼합물을 첨가한다.
이어서 시료를 100℃로 3분간 가열하고, 각각의 시료 5μl을 취하여 각각의 겔 레인에 로오딩처리한다.
시퀀싱 겔(35cm × 13cm × 0.1mm)은 TBE(89mM 트리스, 89mM 봉산, 2mM EDTA)중 7M 우레아를 함유하는 6% 폴리아크릴아미드(38 : 2 ; 아크릴아미드 : 비스-아크릴아미드)이다.
독성약화된 균주3 폴리오비루스 RNA 게놈의 완전한 서열을 공표된 P3/세이빈 cDNA서열[스탄웨이(stanway)등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81권, 1539-43페이지(1984년)]과 비교해본 결과, 2개의 뉴클레오티드가 차이를 나타내는 것으로 관찰되었으며, 그들중 1개는 아미노산의 변화를 유발하였다.
결과는 아래의 표에 나타나있다:
2493위치에서 관찰하는 차이점은 여러가지면에서 매우 중요하다.
먼저, 비루스 캡시드 단백질 VP1내에서의 중요한 아미노산 변화를 코오딩한다는 사실이다.
또한, 야생형 균주3 폴리오비루스는 당해 위치에 U(cDNA에서는 T)를 갖기때문에, 독성약화된 균주3 폴리오비루스 cDNA의 2493 위치에 T가 존재한다는 공표된 사실이 야생형과 독성약화된 게놈 사이의 중요한 차이점을 간과하도록 하고있다는 점이다.
[실시예 3]
[완전한 길이를 갖는 폴리오비루스 cDNA의 합성]
브이.알.라카니엘로(V.R. Racaniello)등이 "폴리오비루스 cDNA의 분자클로닝 및 비루스 게놈의 완전한 뉴클레오티드서열(Molecular Cloning of Poliovirus cDNA And Determination of The Complete Nucleotide Sequence of the Viral Genome)"이란 표제로 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78권, 4887-91페이지(1981년)에 발표한 방법을 이용하여 앞의 실시예에서 수득된 비루스 RNA를 이중-가닥 cDNA를 합성하기 위한 템플레이트로 사용한다.
구체적으로 설명하면, 50mM 트리스-HCl, pH 8.3, 10mM MgCl2, 50mM KCl, 각각 0.5mM의 dATP, dTTP, dGTP 및 dCTP, 0.4mM DTE, 30㎍/ml 올리오(olio)dT(12-18 뉴클레오티드길이), 4mM 소듐 피로포스페이트, 10μCi/μl[α-32P]-dATP, 1unit/μl RNasin 및 2 units/μl 역전사효소[뵈링거-맨하임(Boehringer-Mannheim), 인디애나 폴리스, IN]를 함유하는 반응을 100μl 중에서 2.5㎍의 비루스 RNA를 사용하여 cDNA의 첫번째 가닥을 제조한다.
반응물을 42℃에서 60분간 배양한다.
EDTA를 최종농도 50μM로 첨가하여 반응을 중지시킨다.
이어서 용액을 페놀추출하고, 수층을 5 × 0.7cm 세파로스(sepharose)CL-45 컬럼에 가한다음 0.3M NaCl, 10mM 트리스-HCl, pH 8.0, 1mM EDTA를 사용하여 컬럼을 전개시킨다.
그로부터 수득된 프로파일이 첨부하는 도면 제1도에 도시되어 있다.
컬럼으로부터 분획 5-13을 모아서, 여기에 20㎍의 글리코겐을 첨가한다.
이어서 2.5배 부피의 에탄올을 첨가하여 -20℃에서 cDNA를 침전시키고, 원심분리하여 펠릿형태로 얻은다음, 두번째 가닥을 합성하는데 사용하기 위한 목적으로 25μl의 10mM 트리스-HCl, pH 8.0, 1mM EDTA(TE)중에 재현탁시킨다.
두번째 가닥의 합성공정은 단일-가닥 cDNA, 20mM 트리스-HCl, pH7.4, 7mM MgCl2, 0.1M KCl, 50㎍/ml 소혈청 알부민(BSA), 각각 0.1mM의 dNTP, 150μM β-NAD, 5㎍/ml 이.콜리 DNA 리가아제, 250units/ml 이.콜리 DNA 폴리머라제 I 및 90units/ml RN아제 H를 함유하는 100μl 반응물중에서 실시한다.
혼합물을 15℃에서 60분간, 이어서 실온에서 90분간 배양한다.
이어서 cDNA를 페놀추출하고 상술한 세파로스 CL-4B에 크로마토그래피처리한다.
공극부피의 분획들을 모아서, 에탄올로 침전시킨후, 전술한 바와같이 25μl TE중에 재현탁시킨다.
140mM K-카코딜레이트, pH 7.2, 30mM 트리스-HCl, 1mM CoCl2, 1mM DTT, 50㎍/ml BSA, 150μM dCTP 및 800 units/ml 말단 데옥시뉴클레오티딜 전이효소를 함유하는 100μl반응물중에서 데옥시시티딘(dC)을 사용하여 생성된 이중-가닥 cDNA를 테일링(tailing) 처리한다.
반응물을 37℃에서 60분간 배양하고, 용액을 페놀추출한다.
수층을 취하여 에테르 추출한후, 20㎍ 글리코겐을 함유하는 에탄올을 사용하여 테일링처리된 cDNA를 침전시킨다.
생성된 펠릿을 10mM 트리스-HCl, pH 7.5, 100mM NaCl, 1mM EDTA(NTE) 50μl중에 현탁시킨다.
[실시예 4]
[폴리오비루스 cDNA 라이브러리의 제조]
실시예 3에서 제조된 dC-테일드(tailed), 이중-가닥 cDNA의 양을 증량(1, 2, 5, 10μl)시키면서 NTE중에서 10ng의 Pst I-절단된 dG-테일드 pUC9(파마시아(Pharmacia), 피스카타웨이, 뉴저어지)에, 상기 혼합물을 워터배드내에서 68℃로 5분간 가열하고, 이 혼합물을 42℃의 워터 배드내에서 냉각시킨 다음, 워터배드에 뚜껑을 덮고 밤새 실온으로 온도를 강하시킴으로써, 어닐링처리한다.
위와같은 공정은 cDNA상의 dC 테일과 pUC9상의 dCT 테일간의 최적 하이브리드 형성 요건을 충족시켜 준다.
이어서 어닐링된 혼합물을 사용하여 표준공정에 따라 이.콜리 DH 5α세포(베데스다 리서어치 랩스(Bethesda Research Labs, 게티스버어그, 메릴랜드)를 형질전환시키고, 선별처리하여 암피실린-내성콜로니를 선택한다.
[실시예 5]
[폴리오비루스 클로온의 분리]
세균 콜로니를 격자모양의 플레이트위에 올려놓은 다음, 선형화시킨 플라스미드 pOLIO(세이빈)을 탐침으로 사용하여[제이. 더블유. 아몬드(J. W. Almond)등, "세이빈 폴리오비루스 타입-3 백신의 독성약화 및 신경발병력의 환원(Attenuation and Reversion to Neurovirulence of the sabin Poliovirus Type-3 Vaccine)", In Vaccines, 85권, 콜드 스프링 하버 레보러토리(Cold Spring Harbor Laboratory), 콜드 스프링 하버, 뉴욕, 271-77페이지(1985년)]콜로니 하이브리드화 방법에 의해서 선별한다.
상기 플라스미드 pOLIO(세이빈)는 P3/Leon 12alb로 부터 유리된 완전한 길이의 cDNA를 함유하는 플라스미드이다[쥐.스탄웨이(G.stanway)등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81권, 1539-43페이지(1984년)].
하이브리드화방법에 의해서 선별된 600개의 콜로니들중에서, 140개가 양성 하이브리드형성 시그날을 나타냈다.
이들 양성 클로온들 각각을 소규모의 배양체(5ml : LB 배지 + 암피실린)로 만들어 래피드 보일링 방법을 이용하여 플라스미드 DNA를 분리한다[티. 마니아티스(T. Maniatis)등, 모레큘라 클로닝 : 에이 레보러토리 매뉴얼(Molecular Cloning : A Laboratory Manual), 콜드스프링 하버 레보러토리(Cold Spring Harbor Laboratory)(1982년)].
클로닝된 삽입물을 절개할것으로 예상되는 Pst I을 사용하여 분리된 플라스미드를 절단시킨다.
이와같은 방법으로 분석한 140개의 콜로니중에서 거의 대부분이 작은 삽입물들(＜1kb)을 함유하거나 또는 Pst I 에 의한 절단시 삽입물들을 방출시키지 않았다.
그러나 P3/세이빈 게놈의 3가지 cDNA 클로온들(pLL 3-51, 69 및 82, 도면 제2도 참고)을 확인하고 위치를 알아낼수 있었다.
5'-쪽 747 뉴클레오티드를 함유하는 pOLIO(세이빈) cDNA의 ECORI 단편을 탐침으로 사용하여 콜로니 하이브리드화 방법에 의해서 800개의 콜로니를 선별한다.
탐침과 하이브리드를 형성한 33개의 콜로니중에서 5개의 cDNAs가 P2/세이빈의 뉴클레오티드 85-779를 나타내며, 이들 cDNA 클로온이 어디서 유래되었는지는 알려져 있지않다.
이어서, 또 다른 cDNA를 pUC9에 어닐링처리한후, DH 5α세포내에 형질 전환시킨다.
완전한 길이의 pOLIO(세이빈)cDNA를 탐침으로 사용하여 콜로니 하이브리드화 방법에 의해서 800개의 콜로니를 선별한다.
제한효소를 사용하여 절단시킴으로써 29개의 양성 콜로니가 분석된다.
cDNA 삽입물을 함유하는 8개의 양성 콜로니에 대하여 삽입된 DNA의 양쪽 말단중 어느 한쪽 말단으로 부터 뉴클레오티드 시퀀싱 공정을 수행한다.
이들 콜로니들중 5개(pLL3-239, 251, 253, 254 및 255)가 P3/세이빈 게놈의 3'-말단에 위치하는 cDNAs를 함유한다(도면 제2도).
도면 제2도에서 도시하고 있는 바와같이(흰색 막대들), 5개의 분리 및 분석된 cDNA 클로온들이 P3/세이빈 비루스 RNA 게놈과 3'-말단으로 부터 뉴클레오티드 3630까지를 나타낸다.
부가적인 5'-cDNA 클로온을 수득하기 위해서, 뉴클레오티드 4317-4334(도면 제2도의 검은색 막대참고, pLL3-253)로 부터 염기들을 확장시켜 상보성을 지닌 올리고뉴클레오티드를 합성한다.
이 올리고뉴클레오티드를 사용하여 실시예 3에 기술한 cDNA 합성방법에 따라 실시예 2에서 분리된 P3/세이빈 비루스 RNA에 대한 cDNA 합성시 프라임 처리를 행한다.
생성된 cDNA를 dC-테일링 처리하고, Pst I-절단된, dG-테일드 pUC9내에 클로닝시킨다.
이어서 생성된 플라스미드를 사용하여 DH5α 세포를 형질전환시킨다.
pOLIO(세이빈 3)와의 하이브리드화 방법에 의해서 형질 전환체들을 선별한다.
11개의 양성 cDNA 클로온을 분리하여 제한효소 분해법으로 분석한후, 시퀀싱 처리한다(도면 제2도, 검은색 막대들).
이들 11개의 클로온은 P3/세이빈 비루스 RNA의 뉴클레오티드 6-4329와 상응한다.
P3/세이빈 게놈의 첫번째 5개 뉴클레오티드를 제외하고는 모두를 나타내는 cDNA클로온이 확인되었으나, 적당한 제한효소 부위들이 결핍되어 있음에 기인하여 여러개의 5'-cDNAs를 단일 cDNA로 함께 결찰시키고자 하는것은 곤란한 것으로 나타났다.
따라서, 대략 뉴클레오티드 1로 부터 1900까지를 나타내는 단일 cDNA 클로온을 수득하고자 하는 시도로써 한가지의 최종적인 cDNA 클로닝 방법이 채택되었다.
염기 1904-1922에 대하여 상보성을 지닌 올리고 뉴클레오티드를 합성하여 P3/세이빈 RNA에 대한 cDNA 합성시 프라임처리 목적으로 사용한다.
이어서 cDNA를 dC-테일링 처리하고, dG-테일드, Pst I-절단된 pUC9내에 삽입하고, 생성된 플라스미드를 사용하여 DH5α세포를 형질전환시킨다.
pOLIO(세이빈3)를 사용하여 형질 전환체들을 다시 선별한다.
생성된 cDNA 클로온중 1개가 비루스 RNA의 뉴클레오티드 9-1900을 함유하는 것으로 확인되었다(도면 제2도, pLL3-307).
이로써, P3/세이빈 게놈의 cDNA 클로닝이 완결되었다.
[실시예 6]
[완전한 길이를 갖는 폴리오비루스 cDNA의 구조]
P3/세이빈 cDNAs를 1개의 완전한 길이를 갖는 cDNA로 복제하는 방법이 첨부하는 도면 제3도에 도시되어있다.
먼저, 클로온 pLL3-253과 pLL3-271을 뉴클레오티드 4241 위치에 존재하는 통상적인 HinoIII 부위를 이용하여 1개의 단일 클로온으로 복제한다.
게놈의 3'-폴리(A)로 부터 뉴클레오티드 1500 위치까지를 나타내는, 생성된 cDNA클로온을 pLL3-I로 명명하였다.
이어서 cDNA pLL3-277에서 누락되어 있는, P3/세이빈 비루스 게놈의 첫번째 5개 뉴클레오티드를 합성한다.
이 공정은 자동 올리고뉴클레오티드 합성기를 사용하여 상보성을 지닌 2개의 올리고뉴클레오티드를 합성한 다음 이들 올리고 뉴클레오티드를 서로 어닐링 처리함으로써 수행된다.
5' 으로 부터 3' 방향으로 Pst I 부위, P3/세이빈 cDNA의 1-34 뉴클레오티드 및 Bge I 점착성 말단을 포함하는, 생성된 이중-가닥 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 pLL3- 277의 5'-쪽 Pst I/Bgl I 단편을 치환시킨다.
결과로서 뉴클레오티드 1-1085를 나타내는 cDNA 클로온이 생성되며, 이 클로온을 pLL3 - II로 명명하였다.
최종단계는 뉴클레오티드 1-747, 747-1895 및 1895로 부터 3'-말단까지를 나타내는 3개의 Sac I 단편들을 결찰시켜 완전한 길이의 P3/세이빈 cDNA(pLL3-FL로 명명하였음)를 얻는 것이다.
이와같은 구조 공정은 알맞은 cDNA 삽입물들을 사용하여 pLL3-II, pLL3-307 및 pLL3-I로 부터 여러가지 별도의 단계들을 거쳐서 수행된다.
[실시예 7]
[P3/세이빈 cDNA의 서열분석]
완전한 길이의 cDNA를 구조하는데 사용된 P3/세이빈 cDNAs의 서열을 세가지 접근 방법으로 분석하였다.
첫번째 방법에서는 cDNA를 M13 벡타내에 서브클로닝시킨다.
엑소 뉴클레아제 III 및 멍빈(mung bean)뉴클레아제를 사용하여 서브클로닝된 cDNA의 일군의 누락체들[이. 오즈카이낙(E. Ozkaynak)등, "에이 유니디렉쇼날 딜리숀 테크닉 포 더 제너레이숀 오브 클로온즈 포 시퀀싱(A Unidirectional Deletion Technique for the Generation of Clones for Sequencing)", 바이도테크닉스(Biotechniques) 5권, 770-73페이지(1987년)]을 분리한후, 이들의 뉴클레오티드 서열을 측정한다.
두번째 방법에서는, cDNAs를 분리하여 Rsa I으로 분해시킨다.
이어서 생성된 단편들을 M13내에 "강제적으로" 삽입시켜 서열을 분석한다.
마지막 방법에서는 클로온으로 부터 분리된 cDNA 단편들을 사용하여 이들을 M13내에 서브클로닝시킨 다음 서열을 분석한다.
전체 P3/세이빈 cDNA 클로온을 뉴클레오티드 시퀀싱처리하는 과정에서, cDNA 서열과 RNA 서열을 비교해보면 3가지 차이점들이 발견된다.
이들 차이점들을 이하의 표에 요약해 놓았다.
cDNA내의 198위치에서의 뉴클레오티드 변화는 상기 뉴클레오티드가 게놈의 5'-번역되지않는 부분에 위치하므로, 상기 부분의 기능이 알려지지 않고있다.
cDNA의 4466위치에 C가 아닌 T가 존재한다는 것은 2C 단백질인 118번째 잔기를 히스티딘으로부터 티로신으로 변화시키는 결과를 초래한다.
2C 단백질의 기능이 알려지지는 않고있으나, 예상되는 아미노산 변화는 매우 심각한 것으로 추론된다.
6334 위치에서의 뉴클레오티드 변화는 폴리머라제 유전자내에 존재하는 것이긴하나, 아미노산의 변화는 일으키지 않는다.
폴리오비루스 RNA 서열과 완전하게 상응하는, 완전한 길이의 cDNA 클로온을 얻기위한 목적으로, 첨부하는 도면 제4도, 패널 A 및 B에 도시한 프로토콜을 실시하였다.
구체적으로 설명하면, 이하에 기술하는 바대로 뉴클레오티드 198위치에서 G가 A로 변화되는 올리고뉴클레오티드-관련변이가 일어나도록 P3/세이빈 cDNA 삽입물 pLL3-II를 박테리오파지 M13의 Pst I 부위내에 서브클로닝시킨다.
그와같은 목적으로, 뉴클레오티드 190-206을 차지하면 198위치에 A를 함유하는 올리고뉴클레오티드를 합성한다.
이 올리고 뉴클레오티드는 3'-GGCGTATCTGACAAGGG-5'의 서열을 갖는다.
변이처리는 "T7-GEN인 비트로 뮤타게네시스 키트"(유나이티드 스테이츠 바이오케미칼(United States Biochemical), 클리블랜드, 오하이오)를 사용하여 제조업자의 지시에 따라 수행한다.
변이처리된 삽입물은 pLL3-II(A)로 명명하였다.
변이처리후, pLL3-II(A)를 시퀀싱 처리하여 198위치에서의 A의 존재를 확인한다.
이어서 Pst I을 사용하여 pLL3-II(A)를 M13으로 부터 꺼내고, Sac I으로 분해시킴으로써 뉴클레오티드 747 위치가 절단된다.
뉴클레오티드 1-747을 차지하는 단편을 사용하여 pLL3-FL내의 상응하는 단편을 치환시킨다.
생성된, 198위치에 변이처리된 뉴클레오티드를 함유하는 완전한 길이의 cDNA를 pLL3-FL(A)로 명명하였다.
이어서 pLL3-FL(A)를 Pst I으로 분해한후, 뉴클레오티드 1-2604를 차지하는 단편을 분리한다.
pLL3-FL(A)의 분리된 Pst I 단편영역--뉴클레오티드 1-1922-에 대하여 다음과 같은 2개의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하여 폴리머라제 사슬반응(PCR)을 수행한다:
상기 올리고뉴클레오티드 1은, 5'-으로 부터 -3' 방향으로, Pst I부위, T7 프로모터 및 P3/세이빈 cDNA 양성가닥의 뉴클레오티드 1-20을 나타낸다.
올리고뉴클레오티드2는 P3/세이빈 cDNA음성기탁의 뉴클레오티드 1904-1922를 나타낸다.
PCR은 퍼킨-엘머 세투스(Perkin-Elmer Cetus)로 부터 입수한 Gene AMp 키트를 사용하여 수행하였다.
이어서, PCR에 의해서 생성된 이중-가닥 DNA를 EcoR I으로 분해시킴으로써 P3/세이빈 cDNA의 뉴클레오티드 784 위치가 절단된다.
생성된 T7 프로모터 및 P3/세이빈 cDNA의 5' 말단을 나타내는 0.8kb 단편을 분리하여 SSp I/EcoR I-절단된 pBR322내에 서브클로닝시킨다.
pVR 309로 명명된, 생성된 플라스미드는 T7 프로모터 및 P3/세이빈 cDNA의 뉴클레오티드 1-784를 함유하는 것으로 확인되었다.
pLL3-FL을 EcoR I으로 분해시켜 뉴클레오티드 784 및 2867 위치를 절단시킨다.
이들 뉴클레오티드를 차지하는 단편을 분리하여 EcoR I 절단된 PVR 309에 결찰시킨다.
생성된 플라스미드 pVR 312는 P3/세이빈 cDNA의 첫번째 2867개 뉴클레오티드를 함유한다.
비루스 RNA 서열과 상응하게 되도록 4466 및 6334 위치의 뉴클레오티드를 변화시키기 위해서, 전술한 바와같이 올리고뉴클레오티드-관련 변이처리를 실시한다.
삽입을 pLL3-253을 M13의 Pst I 부위내에 서브클로닝 시킨다.
올리고뉴클레오티드 3'-CTCGTTTGT-GGCATAAC-5'를 사용하여 4466위치의 뉴클레오티드를 T로 부터 C로 변화시킨다.
올리고뉴클레오티드 3'-CCCATGGGGATGCACCG-5' 를 사용하여 6334위치의 뉴클레오티드를 T로 부터 C로 변화시킨다.
이어서 뉴클레오티드 시퀀싱 처리를 행하여 변이처리된 뉴클레오티드를 확인한다.
생성된, 보정된 cDNA 단편을 pLL3-253(C)로 명명하였다.
이어서, pLL3-253(C) 및 pLL3-271을 각각 Hind III로 절단한후, 생성된 거대 단편들을 함께 결찰시킴으로써 한개의 단일 클로온으로 복제한다.
생성된 DNA를 pLL3-I (C)로 명명하기로 하며, 상기 DNA는 P3/세이빈의 3-폴리(A) 말단으로 부터 1500개 뉴클레오티드를 나타낸다.
이어서 Pst I 부분 분해를 실시하여 pLL3-I (C)의 완전한 cDNA 삽입물을 분리한다.
위와같은 부분 분해 공정은 뉴클레오티드 2604 위치에도 Pst I부위가 존재하기 때문에 요청된다.
이어서 pLL3-I (C)를 Pst I 절단된 pBR322에 결찰시킨다.
Sma I/Nru I으로 분해시킴으로써 상기 삽입물 영역을 pBR322로 부터 꺼내낸다.
절개된 단편은 cDNA의 3'-말단으로 부터 2766개 뉴클레오티드를 차지한다.
Sma I/Nru I 단편도 또한 pVR312로 부터 꺼내낸다.
이 DNA는 pBR 322내의 Nru I 부위로 부터 T7 프로모터 및 P3/세이빈 cDNA의 5'-말단 및 뉴클레오티드 2766에 위치하는 Sma I 부위까지의 서열을 나타낸다.
생성된 플라스미드는 pVR 318로 명명하였다.
pVR318내에 완전한 길이를 갖는 삽입물이 존재한다는 것을 제한효소 분석법을 이용하여 확인하였다.
그러나, pVR318을 시퀀싱 처리한 결과, 2493 위치에 C가 아닌 T를 갖는 것으로 나타났다.
2493 위치의 뉴클레오티드를 C로 전환시키기 위한 목적으로, pVR318로 부터 얻은 뉴클레오티드 1895로 부터 4241까지를 차지하는 Sac I/Hind III 제한 단편을 제거하고, 서브클로온 pLL3-271로 부터 얻은 상응하는 단편으로 치환시킨다.
이 공정은 첨부하는 도면 제5도에 도시되어있다.
구체적으로 설명하면, Sac I 및 Hind III를 사용하여 pLL3-271을 분해하고, 뉴클레오티드 1895로 부터 4241을 차지하는 2346kb 단편을 아가로스 겔 전기영동에 의해서 분리한다.
이어서 Sac I 및 Hind III로 플라스미드 pVR 318을 부분 분해하여 뉴클레오티드 1895와 4241사이의 2346kb 단편을 제거한다.
아가로스 겔 전기영동을 실시하여 남아있는 10,007kb 단편을 분리한후, pLL3-271로 부터 얻는 Sac I/HindIII 단편과 결찰시킨다.
생성된 결찰 생성을 pLED3은 완전한 길이를 갖는 진정한 타입3 폴리오비루스 백신균주 cDNA를 나타낸다.
pLED3의 서열은 첨부하는 도면 제6도의 패널 A-J에 도시되어있다.
[실시예 8]
[폴리오비루스 P3/세이빈 cDNA를 사용한 세포의 감염]
영장류 원숭이 신장세포를 25㎠ 이중 플라스크내 행크스 균형염(Hank's balanced salt)용액, 0.35% 중탄산염 및 10% 송아치 혈청을 함유하는 이글스 기본배지(BME : Eagle's basal mediun)중에서 80%의 융합율로 성장시킨다.
배양물의 온도를 37℃로 유지시킨다.
이어서 배지를 제거하고, HEPES-완충 식염수중의 인산칼슘 침전을 형태로 첨가한 pLED3(실시예 7에서 제조)으로 세포를 감염시킨다.
실온에서 20분 경과후, 얼스 락티알 메인티난스 배지(Earle's lacteal maintenance mediun)로 세포를 덮고 37℃에서 4시간 동안 배양한다.
이어서 배지를 제거하고, 새로운 가온배지로 세포를 1회 세정한다.
HEPES-완충 식염수중의 15% 글리세롤 2ml를 세포에 첨가하고, 37℃에서 3, 5분간 배양을 계속한다.
글리세롤을 제거하고, 새로운 배지로 세포를 다시 1회 세정한다.
이중 배양물중 1개에 1% 노블 한천(디프코(Difco) 디트로이트, 미시간)을 함유하는 가온배지를 덮어주고, 다른 1개에는 한천-유리배지를 덮어준다.
이들 배양물을 34℃에서 1-5일간 배양한다.
이어서 0.01% 중성 적색 색소로 세포를 염색하여 플라아크를 육안관찰한다.
액체 배양물로 부터 얻은 배지에 대하여 베로(Vero)세포에 대한 플라아크 적정을 실시하여 감염성 폴리오비루스의 존재여부를 분석한다.
[실시예 9]
[P3/세이빈 cDNA의 시험관내에서의 전사]
시험관내에서의 전사공정은 반 데르 웨르프(van der werf)등이 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83권, 2330-34페이지(1986년)에 발표한 방법에 따라 실시하였다.
T7 프로모터-P3 세이빈 구조물을 함유하는 pLED3을 폴리오비루스 서열 외부의 적당한 제한효소 부위에서 선형화시킨후, 페놀 추출 및 에탄올 침전 처리를 하여 정제시킨다.
20mM 인산나트륨, pH 7.7, 8mM MgCl2, 10mM DTT, 1mM 스페르미딘-HCl, 58mM Nacl 및 각각 1mM의 dATP, dCTP, dGTP 및 dUTP를 함유하는 혼합물에 상기 템플레이트 DNA를 첨가한다.
선형화시킨 템플레이트 1㎍당 10-15 units의 T7 RNA 폴리머라제를 첨가하여 RNA합성 반응을 개시시킨후, 37℃에서 30분간 지속시켰다.
RNA 합성후, Dnase I을 사용하여 DNA 템플레이트를 분해시킨다.
2.5M 암모늄 아세테이트 존재하에 페놀 추출 및 에탄올 침전처리를 행하여 남아있는 RNA를 정제한다.
UV 분광측광법을 이용하여 정제된 RNA를 정량한다.
[실시예 10]
[시험관내에서 전사된 P3/세이빈 RNA를 사용한 세포의 감염]
영장류 원숭이 신장세포의 반-융합 단일층을 실시예 8에 기술한 바와같이 제조한다.
에이. 바헤리(A, Vaheri)등이 "인펙시어스 폴리오비루스 알엔에이 : 에이 센서티브 메쏘드 오브 어쎄이(Infectious Poliovirus RNA : A Sensitive Method of Assay)"라는 표제로 비롤로지(Virology), 27권, 434-36페이지(1965년)에 발표한 방법을 이용하여 실시예 9에서 제조된 RNA로 세포를 감염시킨다.
구체적으로 설명하면, 세포 단일층으로 등장성 인산염-완충 식염수(PBS)로 세정한다.
15분후, 흡입처리하여 PBS를 완전히 제거한다.
이어서, PBS중에 RNA 및 500㎍/ml DEAE-덱스트란(시그마(Sigma), 센트루이스, 미죠리 ; 500,000MW)을 함유하는 접종물 0.25ml를 단일층위에 피복한다.
감염시킨 단일층을 실온에서 15분간 그대로 방치한후, 얼스 락티알 메인티난스 배지로 1회 세정하고, 배지에 실시예 8에 기술한 바대로 1% 한천을 함유하는 배지 또는 새로운 배지를 덮어준다.
34℃에서 4-5일 경과후, 플라아크 형성여부(한천을 함유하는 배양물중)또는 세포독성 효능을 기준으로 하여 비루스를 검출한다.
이어서 비루스를 분리 및 정제한다.
전술한 기술을 실사하여 비루스 RNA를 분리한다.
분리된 RNA를 시퀀싱 처리한 결과, 2493위치의 뉴클레오티드가 원래의 공급원 비루스에서와 동일한 시토신인 것으로 확인되었다.
[실시예 11]
[뉴클레오티드 2493이 균주3 폴리오비루스의 독성약화에 미치는 효능평가]
뉴클레오티드 2493에 C대신 T를 함유하는, pVR318과 같은 독성약화된 균주3 폴리오비루스 cDNA의 유도체를 구조한다.
실시예 8 및 10에서와 같이 2493위치에 T 또는 C를 갖는 cDNAs로 부터 비루스들을 제조한다.
이어서 생성된 비루스에 대하여 표준 프로토콜에 따라 원숭이에 대한 신경발병력을 시험한다.
[실시예 12]
[균주3 폴리오비루스의 독성약화력 증강]
2493위치에 T를 함유하는 균주3 폴리오비루스 cDNA에 대하여 부위-관련 변이처리를 실시하여 T를 C로 변화시킨다.
예컨대, pLED3을 Pst I으로 분해하여 폴리오비루스 코오딩 서열을 제거한다.
상기 폴리오비루스 cDNA는 뉴클레오티드 2604위치에 1개의 내부 Pst I부위를 함유한다.
따라서, Pst I 분해결과 5'-2.6kb 비루스 cDNA 단편과 3'-4.8kb 비루스 cDNA 단편이 생성된다.
표준 기술을 이용하여 2.6kb 단편을 분리한후, 벡타 M13mp18의 단일 Pst I 부위내에 서브클로닝시킨다.
이어서, "T7-GEN인 비트로 뮤타게네시스 키트"(유나이티드 스테이츠 바이오케미칼(united states Biochemical), 클리블랜드, 오하이오)를 사용하여 제조업자의 지시에 따라 부위-관련 변이처리를 실시함으로써 뉴클레오티드 2493은 T로 부터 C로 변형시킨다.
변이처리후, 2.6kb의 비루스 cDNA 단편을 벡타로 부터 분리하고, 비루스 cDNA의 3' 단편에 재결찰시킨 다음 온전한 cDNA를 pBR 322내에 클로닝시킨다.
변이처리된 cDNA 및 원래의 cDNA 둘다를 사용하여 실시예 8에서와 같이 생존 가능한 폴리오비루스를 제조한다.
생성된 비루스에 대하여 표준 프로토콜에 따라 독성약화력을 분석한다.
뉴클레오티드 2493에 C를 함유하는 cDNA에 의해 생산된 변이 처리된 비루스는 원래의 비루스보다도 독성약화력이 증강될 것으로 예견된다.
플라스미드 pLED3내의 전제 cDNA 서열에 대하여 확증적인 시퀀싱 처리를 실시한 결과, 비루스 게놈내에서 일련의 6개 A가 통상적으로 발견되는 영역내에서 또다른 부가적인 A(아데노신)가 존재하는 것으로 나타났다.
이하의 단계들에서는 pLED3으로 부터 pLED 3.2를 유도하는 방법을 기술한다.
[잘못된 pLED3 서열의 분리 및 변이처리]
정제한 pLED3 플라스미드 DNA를 출발 물질로 사용하여, 제한효소 Sac I 및 Hind III로 상기 DNA를 완전히 분해한다.
선택적인 방법(즉, 겔 전기영동, HPLC)을 이용하여 cDNA 뉴클레오티드 1895-424)을 나타내는 2.346 염기 Sac I/HindIII 단편을 정제한다.
정제된 제한효소 단편을 박테리오파지 M13내에 서브클로닝 처리하여 올리고-관련 누락 변이가 일어나도록 한다.
그와같은 목적으로 뉴클레오티드 4121-4150을 차지하는 DNA 올리고뉴클레오티드를 합성한다.
상기 올리고머의 서열은 5'-CGCCTCAGTAAATTTTTTCAACCAACTATC-3' 이다.
상기 변이처리는 "T7-GEN인 비트로 뮤타게네시스 키트"(유나이티드 스테이츠 바이오케미칼(United States Biochemical), 클리블랜드, 오하이오)를 사용하여 제조업자의 지시에 따라 실시한다.
서열 분석결과, 변이처리된 삽입물은 4133-4138위치에 7개 대신 6개의 A를 갖는것으로 확인되었다.
전술한 바와같이, 상기 제한효소 단편이 결손된 플라스미드 봉입체내에 결찰시키기 위한 목적으로 제조하고자할 경우에는 변형된 Sac I/HindIII 단편을 겔 정제한다.
[pLED3 플라스미드로 부터 pLED 3.2의 제조]
정제된 pLED3 플라스미드 DNA를 출발 물질로 사용하여, 제한효소 Sac I/HindIII로 상기 DNA를 부분 분해시킨다.
전술한 바와같이 2346 염기쌍 Sac I/HindIII 단편이 누락된 플라스미드와 상응하는 10,007 염기쌍 Sac I/HindIII 단편을 정제한다.
[pLED 3.2의 구조]
정제된 플라스미드 봉입체 및 변이처리된 2346 염기쌍 단편을 함께 결찰시킨다.
결찰 생성물을 사용하여 적합한 이.콜리 DH 5α 세포를 형질 전환시키고, 테트라사이클린 내성 콜로니를 선별한다.
4133-4138에 위치하는 6개의 A를 확인함으로써 pLED 3.2임을 확인한다.
[원숭이 NV 시험에서 사용되는 LED3 및 VR318 비루스]
비루스 단백질 2C, 3A, 3B, 3C 및 3D에 대한 리딩 프레임(reading frame)내에서 전술한 바있는 또 하나의 부가적인 A가 이동한다 하더라도 pLED3내의 완전한 길이를 갖는 cDNA(보정시키지 않은 상태)는 감염성을 지닌다.
직접적인 서열 분석에서 측정된 바와같이, T7 RNA 폴리머라제를 이용한 pLED3 cDNA의 시험관내에서의 전사공정에서 잘못된 7개의 A를 갖는 RNAs가 제조된다.
이들 전사물을 사용하여 원숭이 신장세포를 감염시킬 경우, 비루스는 당해부위에 올바른 수의 A를 갖게끔 원상복구된다.
pLED3 및 pVR 318내의 cDNAs가 2493위치의 뉴클레오티드 조성 및 4130-4136에 존재하는 A의 수 측면에서 서로 다르기는 하나, 2493위치의 변이가 이들 cDNAs를 사용하여 생성시킨 비루스들을 구별하는데 이용되는 유일한 차이점이다.
이들 cDNA-유래 비루스들을 이용하여 2493 위치에서 일어나는 변이의 중요성을 평가하는 조사를 실시하였다(현재 검토중인 인쇄원고에서 있음).
폴리머라제는 1개의 단일 뉴클레오티드가 여러번 반복되는 영역들을 복제하는데 있어서 문제점을 갖는 것으로 공지되어 있다.
본발명자들은 T7 RNA 폴리머라제가 pLED3으로 부터 일련의 7개 A를 전사시키는 과정에서 7개가 아닌 6개의 A를 함유하는 잘못된 RNAs를 생성시키기도 한다는 것을 주장한바있다.
6개의 A를 갖는 전사물들만이 세포감염시 비루스를 생산할수있다.
이와같은 주장은 T-파지 폴리머라제에 대하여 연구하는 과학자들에게 있어서 상당한 설득력을 지닌것으로 추론된다.
본발명에 따른 방법들에 의해서 제조된 재조합 DNA는 특허 절차를 목적으로 하는 미생물 기탁과 관련된 국제적 승인에 따른 부다페스트 협약 규정하에 미합중국 메릴랜드 20852 록크빌 파크로운 드라이브 12301에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉숀(American Type Culture Collection)에 기탁된 시료로서 예시한바있다.
상기 시료는 1990년 4월 17일에 기탁되어있으며, 백신 균주 세이빈 3의 완전한 길이를 갖는 감염성 복사체를 함유하는 플라스미드인 것으로 확인되었고, pLED3으로 명명되었다.
상기 기탁물은 ATCC 수탁번호 40789로 지정되었다.
[실시예 13]
[실험방법들]
VP1의 N-말단 영역내에서의 세이빈 3-특이성 변이처리가 독성약화력을 유발한다.
CDNA 클로온의 제조 : 전술한 바대로(20)펠릿처리 및 SDS 파쇄처리후에 세이빈 3 백신 비루스(레더를-프락시스 바이올로지칼스(Lederle-Praxis Biologicals, 뉴욕)로 부터 비루스 RNA를 추출한다.
역전사효소 및 다른곳에 기술한 방법(12)을 이용하여 비루스 RNA 템플레이트로 부터 cDNA 라이브러리를 제조한다.
이.콜리 CJ 236내에서 성장시킨 M13내에 서브클로닝시킨 DNAs에 대하여 올리고뉴클레오티드-관련 변이처리를 실시하여 단일 염기 위치들에 존재하는 cDNA 서열을 변화시킨다(16).
그와같은 목적으로 서열의 중앙에 표적 뉴클레오티드가 위치하는 안티센스(antisense) 올리고뉴클레오티드(17-mers)를 합성한다.
통상적인 제한효소 절단 부위들(EcoR I, HindIII, Sac I, Sma I)을 이용하여 완전한 길이의 cDNA 클로온을 구조한다.
상기 완전한 길이의 cDNAs(7, 459bp)는 벡타 pBR 322내에서 구조되며, 이.콜리 DH5α(베데스다 리서어치 레보러토리즈(Bethesde Research Laboratories)를 사용하여 선별 및 증폭시킨다.
세 포 : 베로(Vero)세포는 0.11% 중탄산염 및 10% 태내 송아지 혈청을 보충시킨 얼스(Earle's)염과 함께 이글스(Eagle's) MEM중에서 단일층으로 증식시킨다.
0.035% 중탄산염 및 10% 혈청을 함유하는 행크스(Hank's)염과 함에 BME중에 영장류 아프리카 녹색 원숭이 신장세포(PCMK)를 집어넣는다.
70% 융합율에서, 5% 혈청을 함유하는 BME(얼스염)를 세포에 다시 가한다.
폴리오비루스 감염공정 동안에, 모든 배양물들은 혈청을 함유하지 않는 변형시킨 얼스(Earle's) 락트알부민 가수분해물 유지배지(LMM : pH 7.34)중에 유지시킨다.
비루스 : 재유도된(RSO + 1) 생산 종균을 PCMK 세포내에서 1회 계대접종시킴으로써 세이빈 3 백신 비루스(RSO + 2 ; 레더를-프락시스 바이올로지 칼스(Lederle-Praxis Biologicals), 퍼얼리버, 뉴욕)를 제조한다.
실험목적으로, 동일한 종균을 사용하여 베로세포내에서 RSO + 2 백신을 생산한다.
비루스 NC1은 원래의 (SO + 1)생산 종균으로 부터 PCMK 세포내에서 생산된 백신(SO+2)을 나타낸다.
pLED3 또는 pVR 318의 T7 RNA 폴리머라제 전사물을 사용하여 감염시킨 베로세포로 부터 회수한 cDNA-유래 비루스들을 LED 3 + 1 및 VR 318 + 1로 명명하였다.
이들 "종균" 비루스를 33.5 ± 0.5°에서 0.1의 감염다중도(MOI)로 베로세포내에서 한번 더 증폭시킴으로써 비루스주 LED 3 + 2 및 VR 318 + 2가 생성된다.
상기 LED 3 + 2 및 VR 318 + 2 비루스 시료의 제조시, 실제 백신에서와 흡사한 방식으로 각별한 주의(즉, 계대접종 레벨 및 배양조건들)가 요한다.
이들 최종 비루스주를 사용하여 특성연구를 실시하였다.
비루스의 역가측정 : 시료내의 감염성 비루스의 역가는 통상적으로 HEp-2세포에 대한 미세적정법에 의해서 측정되며, 그 값은 단위 ml당 조직 배양물의 감염량(TCID)50으로서 나타내어진다(1).
일부 경우에 있어서는, 감염성 역가를 베로세포 단일층에 대한 플라아크 적정법을 실시하여 측정하기도 하며, 따라서 이때에는 단위 ml당 플라아크-형성단위(pfu)로서 나타내어진다.
LMM중에서 제조된 비루스의 연속 10배 희석액을 사용하여 25㎠ 융합 단일층에 접종하고, 22℃에서 흡착되도록 방치한다.
상기 세포에 2%, 태내 송아지 혈청을 보충한 MEM(Hank's)중 1.0% 노블 한천(디프코 레보러 토리즈(Difco Laboratories))을 덮어주고, 33.5 ± 0.5℃에서 배양한다.
3일후, 중성 적색색소(0.01% 용액)를 사용하여 세포를 염색시키고, 플라아크들을 육안관찰하여 계수한다.
주어진 사료에 대하여 상술한 2가지 방법을 이용하여 측정된 절대수치에 있어서 통상적으로 0.6로그차가 나타나며; TCID50값이 항상 더크다.
뉴클레오티드 서열 측정 : 전술한 바와같이 합성 올리고뉴클레오티드 및 디데옥시뉴클레오티드 사슬 종결법을 이용하여 RNA 서열을 측정한다(20).
클로닝된 cDNAs의 시퀀싱 처리는 시쿼나제 DNA 시퀀싱 키트(Sequenase DNA Sequencing Kit : 유. 에스. 바이오케미칼(U. S. Biochemical))를 사용하여 수행한다.
시험관내에서의 RNA 합성 및 감염 : 플라스미드 DNA를 Pvc I 제한효소로 완전히 분해시킨후 페놀 및 에탄올 침전처리를 하여 DNA 템플레이트를 제조한다.
모스(Moss)등이 발표한 바에 따라 1㎍의 DNA 템플레이트를 함유하는 전사반응 혼합물을 제조한다(12).
30units의 정제한 T7 RNA 폴리머라제(파마시아)를 첨가함으로써 RNA 합성반응을 개시시키고, 상기 반응을 37℃에서 90분간 배양한다.
에티듐 브로마이드로 염색시킨 아가로스 겔내에서 전기영동을 실시한후, 공지의 표준량에 따라 알맞게 조정한 밴드들의 강도를 비교함으로써 DNA 템플레이트와 완전한 길이의 전사 생성물을 정량한다.
박테리오파지 람다 DNA의 9.0kb HindIII 단편을 표준 템플레이트로 사용하고; 전사목적으로 7.5kb 단일-가닥 RNA 표지물(베데스다 리서어치 레보러토리즈(Bethesde Research Laboratories)이 사용된다.
겔을 사진찍은 음화에 대하여 사진 농도를 측정하여 수치를 얻는다.
완전한 길이의 전사물 25㎍을 함유하는 전사반응 혼합물의 분취량을 사용하여 반 데르 웨르프(van der werf)가 발표한 공정(23)에 따라 베로(Vero)세포 단일층(25㎠)을 감염시킨다.
상기 세포 단일층이 완전히 파괴되면 (+4 CPE), cDNA-유래 비루스를 수거한다.
비루스의 동위원소 라벨링 및 PAGE : 베로 세포(6.5 × 106)를 16pfu/세포의 MOI로 감염시킨다.
비루스가 흡착되도록 1시간동안 방치한후, 세포를 LMM으로 2회 세정 및 덮어주고, 33.5℃에서 배양한다.
4, 5시간 경과후, 배지를 메티오닌-유리 MEM(슬렉트 아민키트(Select Amine Kit), GIBCO)으로 교환해준다.
1시간후, 최종 농도 600μCi/ml로 [35S]메티오닌(비활성 ＞ 1000Ci/밀리몰; 아머샴(Amersham))을 보충한 새로운 배지를 세포에 다시 공급한다.
+4 CPE(24시간이내)에서, 먼저 저속 원심부리(2500rpm, 20분, 4℃)를 실시하고, 이어서 미세여과(0.22㎛ 밀렉스(Millex)-GV;밀리포어)를 실시하여 비루스를 함유하는 배지를 투명하게 만든다.
베크만(Beckman) 70.1 Ti로타를 사용한 한외원심분리(70K, 1시간, 4℃)를 실시하여 비루스를 펠릿형태로 얻고, 라에물리(Laemmli)시료 완충액(10)중에 재현탁시켜 끓인다.
이어서 시료에 대하여 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 실시하고, 자동 방사선 사진술을 이용하여 단백질을 육안 관찰한다.
비루스 열안정성 곡선 : 여러개의 3.0ml 비루스 시료(약 107.3pfu/ml, LMM중)를 실온(22℃)또는 37℃ 또는 42℃의 워터배드내에서 배양시킨다.
5일동안 24시간 간격으로, 각각의 배양세트에서 1개의 시료를 꺼내어 -20℃로 동결시킨다.
모든 시료의 배양이 완결되면, 베로(Vero)세포 단일층에 대하여 플라아크 적정법을 실시함으로써 각각의 시료의 비루스 역가를 측정한다.
비루스 성장곡선 : 베로 세포 단일층(107세포/25㎠ 플라스크)을 4pfu/세포로 감염시키고, 전술한 바와같이 유지시킨다.
감염처리후 지시된 시간들내에서, 개개의 배양물로 부터 배지를 회수하여 70℃에서 보관한다.
신경발병력 시험 : 2가지 공정을 채택하여, 비루스 시료들에 대하여 마카 물라토(Macca mulatto)원숭이에 대한 신경발병력을 시험하였다.
유나이티드 스테이츠 코오드 오브 패더럴 레귤레이숀즈(United States Code of Federal Regulations)(22)에서 기술하고 있는 바와같이, 각각의 시험에서 최소한 107.6TCID50/ml를 함유하는 비루스 시료 0.2ml 또는 0.5ml를 원숭이의 각각의 뇌반구의 시상부위(IT) 또는 척수(IS)내에 주사한다.
WHO 시험(26)에서는 0.1ml의 비루스(역가 : 106.5-107.5TCID50/ml)를 원숭이의 척수내에 주사한다.
주사후, 시험동물들에게서 나타나는 척수성 소아마비의 임상학적 징후를 17-21일간 관찰한다.
이어서 시험동물들을 죽이고 뇌와 척수의 폴리오비루스 병변을 조직 검사한다.
관찰되는 신경손상의 정도를 기준으로 하여 1(손상이 적은것)내지 4(손상이 심한것)로 등급을 매기는 방법으로 각각의 원숭이로 부터 떼어낸 신경조직을 평가한다.
평균 병변 점수는 일군의 원숭이들에 대하여 채점된 점수들의 평균치이다.
통계학적 분석 : 평균범위 시험에서 사용되는 최소 점수 측정법과 함께 분산분석(ANOVA)모델을 채택하여 평균 병변점수들의 차이들을 분석한다.
시상내에 주사한 원숭이에게서 나타나는 반응성 빈도를 치-스퀘어(Chi-square) 시험을 이용하여 그 중요성을 시험한다.
[결과]
진정한 LED3 cDNA의 구조 : 제한효소 분석 및 뉴클레오티드 시퀀싱 처리를 실시하여 cDNA 라이브러리를 스크리닝한 결과, 세이빈 3게놈의 5'-6개 뉴클레오티드를 제외하고는 모두를 나타내는 4개의 cDNA 클로온이 확인되었다.
폴리머라제 사슬반응을 이용하여 합성 DNA 올리고뉴클레오티드[5'-CTGCAGTAATACGACTCACTATAGGTTAAAACAGCTCTGGGGTTTG-3']를 배합함으로써 박테리오파지 T7 프로모터의 통제하에 세이빈 3cDNA의 첫번째 6개 뉴클레오티드가 재구조 및 위치되도록 5'-쪽 cDNA 클로온을 변형시킨다.
프로모터를 일정 방향으로 향하게 함으로써 클로닝된 cDNA의 양성-센스 RNA 전사물들이 합성될수 있다.
4개의 cDNA 서브클로온들의 완전한 뉴클레오티드 서열을 LED3 RNA 서열(24)과 비교해본 결과, 4개의 뉴클레오티드가 차이나는 것으로 확인되었다.
그와같은 뉴클레오티드 차이가 역전사과정에서 야기된 잘못을 나타내는 것인지 또는 백신 비루스 시료내에서 극히 일부가 증식을 일으킴으로써 초래된 서열의 변화를 나타내는 것인지는 명확히 알수없다.
그러나, 비루스 또는 CPE가 상기 cDNA로 만들어진 T7-유래 전사물들을 사용하여 세포를 감염시킴으로써 생성된 것이기 때문에, 상기 보정시키지 않은 완전한 길이의 cDNA는 감염성을 지니지 않는다.
위에서 언급한 차이나는 위치들중 세군데에서 올리고뉴클레오티드-관련 변이처리(실시예 13, 재료 및 방법 참고)를 실시하여 서열을 보정한다:
198(G→A), 4466(T→C) 및 6334(T→C).
마지막으로 잘못된, 2493위치에 C대신 V가 존재하는 것을 뜻밖에도 당해 위치에서 레온(Leon)-형 뉴클레오티드를 나타내므로, 이것은 pVR318내의 완전한 길이를 갖는 cDNA 내부에 그대로 방지한다.
이 클로온은 n2493에서만 LED3 RNA 서열과 차이를 나타낸다.
진정한 LED3 cDNA(pLED 3.2)를 제조하는 최종 단계는 2493 위치에 C를 갖는것으로 발견된 백신 cDNA 서브클로온과 pVR318 사이에서 cDNA 단편을 교환(n1895에서 Sac I-n4241에서 HindIII)해줌으로써 완결된다.
클로닝 벡타 pBR322내에서 완전한 길이를 갖는 LED 3 cDNA 구조물이 첨부하는 도면 제7도, 패널 A에 도시되어 있다.
세이빈3 cDNA의 3' 말단과 플라스미드 pBR322간의 접합점으로 부터 뉴클레오티드 서열을 분석해본 결과 27개의 A로 구성된 폴리-A 테일이 나타났다.
이 폴리-A테일 바로 다음에는 cDNA 클로닝 단계로 부터 유래된 15개 C가 연속해서 위치한다.
[pLED3 및 pVR 318내에 존재하는 cDNAs의 시험관내에서의 전사]
플라스미드 DNAs를 Pvu I로 분해시켜 1)T7 RNA 폴리머라제에 의한 전사목적의 완전한 폴리오비루스 cDNA을 함유하는 선형 DNA 템플레이트를 생성시키고, 아울러 2)cDNA의 3' 말단뒤에 가장 짧은 길이의 외생 벡타서열을 갖는 템플레이트를 생성시킨다.
Pvu I은 cDNA내에 존재하지 않는 cDNA의 3' 말단뒤에 위치하는 첫번째 제한효소부위(정확히 126bp)와 상응한다.
pLED3 및 pVR318로 부터 2개의 Pvu I 단편들(4.4kb 및 8.1kb)이 생성되었으나, 서열분석결과 8.1kb 단편만이 T7 프로모터를 함유하였다(도면 제7(a)도 참고).
첨부하는 도면 제7도의 패널 B는, Pvu I-제한된 pLED3 및 pVR318로 부터 T7 RNA 폴리머라제에 의해서 RNAs가 효율적으로 합성되며 또한 그들의 크기가 8.1kb 단편으로 부터 얻는 최종 전사물에 대하여 예상되던 것과 일치한다는 사실을 입증하고 있다.
레인 5 및 6에서, 2개의 상부밴드(낮은 강도)가 플라스미드 DNAs을 Pvu I으로 분해시킴으로써 생성된 8.1kb 및 4.4kb 단편들과 상응하는 것이다.
레인 4는 ds DNA 크기를 참고하기 위한 Hind III/람다 DNA를 함유한다.
전사생성물(레인 5 및 6에서 가장 강도가 강한 밴드)은 완전한 길이(7585뉴클레오티드)의 RNAs와 일치하는 7.5kb ssRNA 표지물(레인 1-3)과 교묘하게 같이 이동한다.
비리온 RNA(레인7)와 비교해볼때, 폴리오비루스 cDNA의 시험관내 전사물들은, 추론컨대 공유 결합된 VPg 단백질의 부재에 기인하여, 약간 더 빨리 이동하는 것으로 나타났다.
1μl의 템플레이트를 함유하는 전사 반응물에서 완전한 길이의 전사물 20-25㎍이 재생적으로 생산되었다.
여기에서 나타나는 바와같이, 50μl 반응혼합물(레인 5 또는 6)중 1㎍에서와 상응하는 밴드가 7.5kb ssRNA 300mg(레인2)을 나타내는 밴드와 거의 동일한 강도를 갖는다.
이들 전사물을 직접적으로 서열 분석한 결과, 첫번째 폴리오비루스 뉴클레오티드 바로앞의 5' 말단에 2개의 과외 구아닌이 존재하는 것으로 측정되었으며 또한 폴리-A, 폴리-C 테일뒤의 3' 말단에 126bp의 외생 pBR322 서열이 존재하는 것으로 확인되었다.
베로(Vero)세포를 전술한 RNAs를 사용하여 감염시킬 경우, 폴리오비루스 감염과 일치하는 세포독성 효과가 24시간이내에 관찰되었으며, 48-72 시간내에 비루스가 수거되었다(+4 CPE).
전사물들의 비감염성은 백신 RNA가 갖는 그것의 약 3%인 1-2 × 102pfu/㎍인것으로 나타났다.
시퀀싱처리에 의해서 측정해본 결과, 수거된 비루스들로부터 얻는 RNA는 3' 말단에 외생 pBR 322서열이 결손되어있었다.
또한, 이들 비루스의 게놈이 472(U), 2034(U) 및 6061(U)위치에 독성약화된 뉴클레오티드를 갖는 것으로 입증되었으며; 뉴클레오티드 2493이 LED3(2493-C)과 VR 318(2493-U)간에 유일하게 알수있는 차이점이었다.
[n2493에서의 변이는 VP1의 원동성 변화와 상관관계를 지닌다]
세이빈3백신 비루스와 일치하는 게놈 내부의 2493위치에서 확인된 변이는 VP1 내에서 Ile-6 → Thr으로 치환시킬 것으로 예상된다(24).
그와같은 아미노산 치환으로 인해서 VP1의 생화학적 특성들이 변화되는지를 알아보기위해서, LED3의 VP1 단백질을 상기 아미노산 치환과 동일하게 변형시키고, LED3과 VR318의 VP1 단백질을 비교하였다.
결과로서, LED3의 VP1은 6번째 잔기에 트레오닌을 함유하고 있는 반면에 VR 318은 당해부위에 이소로이신을 갖는것으로 나타났다.
이들 아미노산간의 분자량 차이는 극미하나, 이들 비루스로 부터 얻는 VP1 단백질들은 SDS-PAGE에 의해서 구별 가능하였다(제8도 참고).
그와같은 VP1의 이등에서 관찰되는 차이점은, Thr 측쇄가 수소 결합을 형성할수 있는 히드록시기를 갖는 반면에 Ile 측쇄는 소수성을 띈다는 사실로 부터 설명이 가능하다.
결과로서, Ile-6을 갖는 VR 318비루스의 VP1은 보다 잘 SDS와 결합할수 있고, 따라서 LED3의 VP1보다도 더 빨리 이동하는 것이다.
이들 데이타는 2493 변이와 관련된, 적어도 한가지의 생물리학적 변화로서 간주된다.
그와같은 VP1의 변화가 비리온의 3D 구조에 영향을 미치는지의 여부는 아직 검토중이다.
LED3 및 VR 318 비루스의 열안정성 : 폴리오비루스의 3차 구조에 있어서, VP1의 N-말단 영역은 다른 캡시드 단백질의 말단 영역들과 밀접하게 천연 비리온의 내부에 묻혀있다(6).
2493 변이가 비리온의 안정성을 변화시키는지 여부를 평가하기 위한 시도로서, LED3 및 VR318 비루스에 대하여 여러온도에서의 열불활성화에 대한 감수성을 비교하였다.
첨부하는 도면 제9도에서 예시하고 있는 바와같이, 실온(22℃)에서는 5일간에 걸쳐서 어느쪽 비루스 시료에서도 역가손실이 관찰되지 않았다.
37° 및 42℃에서는 두가지 비루스 시료의 역가가 모두 유사하게 감소되었다.
열처리에도 불구하고, LED3 및 VR 318 비루스 사이에서 플라아크 형태학적 측면의 차이점은 보존되었다(이하의 내용 참고).
n2493이 표현형 표지물에 미치는 영향: 독성약화된 백신균주를 독성 균주로 부터 구별짓는데 있어서 통상적으로 폴리아크의 작은 크기가 이용된다.
베로(Vero)세포 단일층에 대하여 cDNA-유래 비루스의 간단한 플라아크 적정을 실시하는데 있어서, VR 318 비루스가 LED3 비루스 보다도 확실히 더 큰 플라아크들을 생성하는 것으로 명확히 나타난다.
병원성 모 레온(leon)균주와 비교하였을때에는, VR 318 플라아크들이 중간 크기를 갖는것으로 명확히 관찰된다(도면 제10도 참고).
이들 데이타는 LED3(C)과 VR 318(U)간에 위치 2493에서 관찰되는 유일한 뉴클레오티드 차이가, LED3과 비교하여서 VR 318에 의해서 생성되는 플라아크의 크기를 보다 증가시키는데에도 관여한다는 사실을 뒷받침한다.
LED3 및 VR 318 비루스의 통상적인 온도-감수성(rct 140℃)및 "α"표지물 표현형도 또한 조사하였다.
이들 시험들중 그 어느것에서도 위의 두가지 비루스들이 차이점을 나타내지는 않았으나, 레온(Leon)비루스와 비교하여서는 둘다 독성약화된 표현형은 나타내었다(데이타는 기재하지 않음).
LED3 및 VR 318의 성장곡선 : LED3과 VR 318의 복제를 비교하기 위하여, 독성약화된 폴리오비루스에 대하여 허용되는 것으로 알려져있는 조건들(즉, 저온, 높은 pH)하에서, 베로세포내에서의 이들 비루스의 성장 운동학을 비교하였다.
첨부하는 도면 제11도에서는 LED3 및 VR 318로 감염시킨 베로(Vero) 세포로 부터의 비루스 방출 운동학들사이에 있어서 커다란 차이가 없는것으로 예시하고 있다.
감염시키고 24시간후에 측정된 역가(108pfu/ml)는, 이들 비루스들중 그 어는것도 상술한 조건들하에서 심하게 약화되지 않는다는 것을 나타낸다.
감염시킨후 8내지 12시간 사이에, VR 318이 LED3 보다 더 빨리 복제되는 기능을 가질수도 있다는 것을 뒷받침하는, 희미하기는 하나 일정한 차이가 역가의 배수증가에서 관찰되었다.
상기 시간동안에 LED3의 역가가 단지 30배 증가된 것과 비교할때 VR 318의 역가는 200배 증가되었다.
배양 조건들을 변형시킴으로써(즉, 보다 낮은 pH)LED3 및 VR 318성장 운동학들 사이에서 관찰되는 차이점들이 보다 증대되는지의 여부에 대하여서는 현재 검토중이다.
원숭이 체내에서의 LED3 및 VR 318의 신경발병력 : 완전한 길이의 세이빈3 및 레온(Leon)cDNAs로 부터 유래된 재조합 비루스의 구조 및 신경발병력 시험으로 부터, 웨스트롭(Westrop)등(25)은 세이빈3의 독성약화된 표현형과 472 및 2034위치에서의 포인트(point)변이 사이에 상관관계가 있다는 것을 발표한바 있다.
본출원인이 2493 위치에서 세이빈 3-특이성 포인트변이가 일어난다는 것을 확인함으로써 그와같은 변이가 독성약화의 결정인자로서도 또한 작용하는가하는 의문이 제기되었다.
백신로트의 허용성에 관하여 WHO 또는 미합중국 CFR요건에서 규정하고 있는 방법들에 따라 원숭이를 대상으로 신경발병력이 적절하게 억제되는지를 시험하여 cDNA-유래 비루스들인 LED3과 VR318을 비교하였다(실시예 13의 재료 및 방법들 참고).
상술한 방법들간의 차이점으로서는 시료의 주사량(용량 및 역가)뿐만아니라 접종경로(시상내 + 척수내 : 척수내)를 들수있다.
이하의 표 1A는, LED3 및 318을 동시에 사용하여 영장류 원숭이 신장세포(PCMK)에서 생산된 실제적인 백신(RSO + 2)의 시험결과들을 비교한, CFR 척수내(IS)시험으로 부터 수득된 신경발병력 평가결과이다.
RSO + 2(베로)백신 시험에서는, 전술한 바와같이 베로세포를 사용하여 백신을 제조하는것이 독성약화에 아무런 영향도 미치지 않는 것으로 입증되었다.
RSO + 2(PCMK), RSO+2(Vero)및 LED 3 + 2(Vero)에 의해서 수득된 평균 병변점수는 각각 0.52, 0.36 및 0.34 이었다.
이들 데이타는 LED 3이 현재 사용되고있는 백신 비루스보다도 신경독성이 더 강하지 않다는 사실을 입증한다.
재미있는 것은, VR 318을 투여한 원숭이의 평균 병변 점수가 다른 비루스들에 의해서 수득되는 점수들보다도 현저히 더 높은 (p ＜ 0.01) 1.31이었다는 것이다.
이러한 데이타는 VR 318 비루스가 현재 사용되고있는 RSO + 2백신과 동등한 것이 아니며, 뉴클레오티드 2493 위치에 U(VR 318)대신에 C(LED 3 및 RSO + 2)가 존재함으로서 독성약화에 영향을 미친다는 사실을 뒷받침한다.
전술한 바와같이, 시상내 경로로 원숭이 체내에 주입시킨후 나타나는 LED3 및 VR318의 신경발병력을 현재 사용되고 있는 RSO + 2백신을 사용한 네가지 완전시험들로 부터 수득된 데이타와 비교한다(표 1B).
뇌조직은 척수조직보다도 폴리오비루스 감염에 대하여 덜 민감하므로, 위의 방법을 이용한 신경발병력은 어느쪽이 육안 관찰 가능한지 여부 및 병변점수보다는 원숭이의 비율을 기준으로 하여 평가된다.
실제적인 RSO + 2백신에 의해서 입증되는 바와같이, 1군의 원숭이들에게 있어서 보다 낮은 반응성 레벨을 나타내는 것이 전형적이며 또한 바람직하다.
LED3을 투여한 10마리의 원숭이들중에서는 아무에게서도 병변이 나타나지 않았다.
그러나, VR 318은 10마리의 시험동물중 2마리(20%)에게서 병변을 생성시켰다.
완전한 IT 시험에서는 1군 30마리의 원숭이가 요구되며, VR318군에서 양성 원숭이의 비율(%)이 증가되는 경우는 극히 드물고, VR 318이 결과를 나타내지 못할 것으로 예상되기는 하나, CFR IT 데이타는, 현재 사용되고 있는 RSO + 2 백신과 비교해볼때 LED 3비루스는 동등한 신경발병력을 가지며 VR 318은 보다 강한 신경발병력을 갖는 것으로 나타내고 있다.
WHO 시험방법을 이용하여, LED 3및 VR 318을 독성약화시킨 타입3 WHO 시험 대조물질과 동등한 것인 비루스 NC1과 함에 평가하였다.
표 2에 기재된 바와같이, LED 3 및 VR 318에 대한 평균 병변점수는 각각 0.21 및 1.51이었다.
세가지 다른 방법들로 확인해본 결과, LED3이 VR 318보다 더 증강된 독성약화력을 갖는다는것이 명확히 입증되었다.
WHO 시험 데이타를 해석하는데에는 다소 어려운 점이 있으나, 독성약화시킨 대조물질인 NC 1의 성능을 이용하여 해석이 가능하다.
이 시험에서는, NC 1이 1.08의 평균병변점수를 나타내었으며, 이 값은 LED3 및 VR 318에 대하여 계산된 값들 사이에 속하는 수치이다.
상기 시험 대조물질에 있어서 평균 점수 1.08은 높은 값이나, NC1, LED3 및 VR318사이의 반응성 비교는 이들 물질을 동시에 시험하여 나타난 결과이므로 확실한 것이다.
생성된 점수들을 통계학적으로 비교해본 결과, 상술한 시험방법에 의해서는 VR318을 독성약화시킨 대조물질과 구별할수가 없다는 사실이 지적된다.
그와같은 예비 데이타를 기초로 하여, 1군 24마리의 원숭이를 포함하는 완전한 WHO 시험에서 VR318이 결과를 나타내지 못한 것인지의 여부는 명확하지가 않다.
다른 한편으로, LED3에 의한 병변 점수는 VR318 또는 NC1 대조물질 그 어느것보다도 현저히 낮은 (p ＜ 0.01)것으로 나타났다.
재미있는것은, NC1 대조용 비루스가 재유도된 세이빈 오리지날(RSO)종균이 아닌, 세이빈 오리지날(SO)을 사용하여 제조된 백신물질을 나타낸다는 것이다.
SO + 2백신(레더를(Lederle); NC 1에서와 동일함)의 2493 위치의 뉴클레오티드 서열을 측정한 결과, C와 변종 U가 1 : 1 혼합상태로 존재하는 것으로 나타났다.
현재 사용되고 있는 RSO + 2백신(레드를)에 대하여서도 유사한 평가를 실시한 결과 당해위치에 C만이 존재하는 것으로 증명되었으며, 이는 RSO종균이 SO균주의 정제된 유도체라는 사실을 뒷받침한다(24).
RNA 서열 측정결과를 놓고볼때 시료 LED3, VR 318 및 NC1이 뉴클레오티드 조성면에서 차이를 나타내지는 않으므로, WHO 방법에서 LED3과 비교하여 NC1에 의해서 나타나는 증강된 신경발병력 레벨도 마찬가지로 비루스의 NC1 푸울(pool)내에 존재하는 2493-U 변종의 아집단으로 부터 유래되는 것이다.
VP1의 6번째 아미노산을 이소로이신으로 부터 트레오닌으로 변화시켜 코오딩하는 2493 위치에서의 새로운 세이빈 3-특이성 변이를 확인함으로써, 그것이 독성약화의 결정인자일 것으로 추론하는 바이다.
종래에 다른 이들에 의해서 세이빈3 폴리오비루스의 독성약화력과 472 및 2034 위치에서의 포인트 변이가 상관관계를 갖는것으로 발표된바 있다.
2493 변이가 미치는 영향을 평가하기 위한 목적으로, 완전히 확인된 백신 cDNA(LED3)를 이용하여 비루스를 생산시킨후, 당해 위치에 C대신 레온(Leon)형 뉴클레오티드(U)를 갖는다는 것을 제외하고는 동일한 유도체 VR318과 비교하였다.
결과로서, 상술한 LED3내에서의 또 다른 부가적인 변이는 원숭이 체내에서의 신경발병력 감소 뿐만아니라 보다 작은 플라아크 크기와도 상관성을 지닌것으로 나타났다.
이상과 같은, 본원에서 제시하고 있는 데이타는 세이빈3 백신균주의 독성약화와 관련된 생물학적 특성들이 LED3내에서 보존된다는 것을 입증하고 있다.
세이빈3 cDNA-유래 종균 균주를 사용할 경우 많은 이점들이 따른다.
오리지날과 재유래된 세이빈 종류 둘다, SO 및 RSO 각각의 저장용량이, 이들이 비루스 플라아크 분리물이라는 사실에 기인하여, 제한받고있다.
종균들을 클로닝 처리되고, 유전학적으로 특성이 규명된 cDNA 형태로 저장할 경우, 종균 공급에 수반되는 제한 요건들이 제거되며; 또한 그와같은 종균들은 무제한적으로 보존시킬수 있다.
종균공급에 수반되는 제한 요건들이 제거될 경우, 감염 다중도(MOI)측면에서 융통성이 증대되며, 이를 이용하여 백신을 제조할수있다.
보다 높은 MOI'S에서 채택된 생산종균을 사용하여 생산된 비루스 시료가 유전학적으로 보다 균질하다는 것을 윅스-레비(Weeks-Levy)등(24)이 발표한바있다.
RNA 비루스는 본래 DNA 비루스보다도 상당히 높은 빈도로 변종들을 생성하므로, 클로닝처리되고 유전학적으로 특성이 규명된 DNA 형태로 제조된 RNA 비루스 종균은 가장 균질한 특성을 지닌다.
이와같은 방법으로 계대 접종중에 선택적으로 증폭될수있는 바람직하지 못한 변종들의 양을 최소화시켜왔으며, 그리하여 유전학적 안정성을 증대시켰다.
세이빈3 백신을 생산하는 다른 생산 종균들과 비교하여 LED3이 유전학적으로 보다 안정한 종균을 생산하는지의 여부를 평가하기위한 계대 접종 연구가 현재 진행중이다.
측정된 뉴클레오티드 서열을 놓고볼때, 시험관내에서의 계대 접종중에 2493에 U를 갖는 세이빈3 변종들이 472에 C를 갖는 변종들보다도 더 빨리 축적되는 것으로 나타났다(24).
동일한 시험에서, 서로 다른 OPVs의 세이빈3 성분은 2493 위치에 존재하는 C와 U의 비율이 크게 다른것으로 나타났다.
본원에서 제시하고 있는 데이타가 백신 로트의 허용성에 어떻게 영향을 미치는지는 설명할수없으나, 비루스 LED3(2493-C)과 VR 318(2493-U)을 비교한 데이타에 따르면 앞서 이들 비루스를 평가하는데 이용한 신경발병력 시험방법에 좌우되어 결과가 나타난다는 것을 뒷받침하고 있다.
특히 중요한 것으로서 CFR시상내 시험방법에서 LED3과 VR 318이 구별될수 있다는 것이다.
LED3 또는 RSO + 2백신과 비교하였을때 VR 318이 뇌안에서 특이적으로 높은 반응성을 갖는다는 것은 비루스가 2493위치에 U를 가질경우 비루스와 뇌조직 사이의 상호작용이 증강된다는 사실을 뒷받침한다.
WHO 시험방법에서는 시상내 접종경로를 이용하여 백신을 평가하지는 않으므로, 본출원인이 얻어낸 자료에 따르면, 상기 방법을 이용하여 백신로트내에서 2493-U 비루스 아집단을 검출하는 것은 덜 적합할 것으로 추론된다.
최근에 츄마코프(Chumakov)등(2)에 의해서 폴리머라제 사슬 반응을 병행시킨 검출방법이 실시되었으며, 그 결과 전체 비루스의 1.17% 이상을 구성하는 472-C 변종들을 함유하는 백신 로트가 WHO 신경발병력 시험에서 결과를 나타내지 않는 것으로 측정되었다.
LED3 및 VR318의 472 위치의 동일성은 비루스 RNA에 대한 서열분석을 기초로 하여 측정되었다.
이 방법을 이용한 변종 아집단의 검출한계는 10%인 것으로 나타났다(20).
보다 민감한 PCR 방법을 이용하여 LED3 및 VR 318 비루스 제제내에 존재하는 472-C 아집단을 검출하는 것도 가능하다.
그러나, LED3 및 VR 318이 클로닝된 cDNA로 부터의 동등한 계대접종 레벨을 지니며 또한 동일한 조건들하에서 생성되기 때문에, 이들 비루스 시료가 서로 다른 비율의 472-C 변종을 갖지는 않을것으로 추론된다.
상기 PCR 방법을 이용하여 472-C 변종을 검출하기 위한 목적으로 LED3 및 VR318을 예비분석한 결과, 이들 시료들의 차이점을 발견할수 없었다.
시험관내에서 뿐만아니라 생체내에서 2493 위치에 U를 갖는 세이빈3 변종이 제공하는 선택적인 이점을 뒷받침하는 여러측면의 자료들이 발표된바 있다.
백신 접종하고 5일 경과후에 수거한 대변 분리물 KW4는 3가지 위치들에서 투여한 백신균주와 다르다는 사실이 종래에 밝혀진바 있다: 472=C, 2493=U 및 6061=U/C(20).
여기에 나타난 자료를 기초로할때, 위시험에서 관찰된 KW4의 중간적인 신경발병력 레벨은 472 뿐만아니라 2493 위치의 변이와도 관련된 것으로 볼수있다.
윅스-레비(Weeks-Levy)등(24)은 독성약화시킨 대조용 비루스 NC1을 척수내에 주사한 원숭이들의 신경조직(뇌 또는 척수)으로 부터 수거된 세가지 비루스 분리물중 두가지가 2493 위치에 U를 갖는다는 사실을 밝혀냈다.
472에 존재하는 독성약화된 U가 소실됨이 없이 2493 위치에 U를 갖는 상기 분리물 NC1-679B는 이 비루스가 뇌안에서 증식 및 복제되는 방법과 특이적인 관련이 있을것으로 추론된다.
그와같은 데이타는 CFR 시상내 방법을 이용하여 시험하였을때 LED3과 비교하여 VR318의 신경발병력이 증강되었다는 관찰과 일치하는 것이다.
2493 위치의 U가 C로 변화됨으로써 LED3의 독성약화력이 VR318의 그것보다 증강되는 메카니즘은 확실치가 않다.
위와같은 변이에 의해서 캡시드 단백질 VP1의 6번째 아미노산이 바뀌게 된다.
폴리오비루스의 3차 구조내에서, 호글(Hogle)등(6)은 VP1의 당해 부위가 천연 비리온 내부에 묻혀있다고 밝혀냈다.
보다 최근에 프릭스(Fricks)및 호글(Hogle)(5)이 입증한 바에 따르면, 감수성 세포들에 결합하게 되면 비리온이 형태적 변화를 일으켜서 캡시드 단백질 VP4가 방출되고 VP1의 아미노말단이 구체적으로 드러나게 된다.
상기 학자들은 또한, VP1의 아미노말단을 노출시키기 위해서는 리포솜과의 결합이 요구된다는 사실을 밝혀내었고, 그와같은 과정들이 세포진입 메카니즘에서 일어난다는 것을 주장하였다.
위의 관찰결과들과 일치하는 것으로서, 키르케가아드(Kirkegaard)(8)는 정상적인 감염과정에서 캡시드로 부터 비루스 RNA가 물리적으로 방출될때 결손되는 6개 잔기의 양쪽중 한쪽 측면과 접하고있는, VP1의 아미노말단 영역내에 서로 다른 작은 누락체를 갖는 2개의 폴리오비루스 변이주에 관하여 발표하였다.
이들 누락 변이주들은 둘다 작은 플라아크 표현형을 나타내었다.
이러한 자료들로 부터, 세이빈3의 2493 위치에서의 변이가 비루스 탈피(uncoating)에도 또한 영향을 미친다는 것을 용이하게 추론할수 있다.
세이빈3의 VP3(2034)에서 일어나는 변이외에도, 세이빈2와 밀접한 관련을 갖는 타입 2균주(P2/712) 및 세이빈1내의 캡시드 단백질들에도 독성약화력을 좌우하는 결정인자들이 존재하여 왔다.
이들 다른 변이들도 캡시드 단백질 VP1내에서 일어나기는 하나, 본원에서 기술하고 있는 구조적 변이에 관한 내용은 VP1의 아미노말단 영역에 위치하는 첫번째 변이에 관한것이다.
이상과 같이 본발명의 많은 구체예들을 기술하였으나, 본발명에 따른 방법들, 재조합 DNA 분자, cDNA 분자 및 형질 전환된 숙주를 이용하는 다론 구체예들을 얻기위한 목적으로 위에 기술한 구체예들의 기본적인 구성들을 변형시킬수도 있다.
따라서, 본발명의 범위는 실시예로서 앞서 제시한바 있는 특정 구체예들이 아닌, 본원에 첨부되어있는 특허청구의 범위에 의해서 한정된다는 것을 밝혀두는 바이다.
[표 1]
[표 2]
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Claims (16)
- (a) 백신 균주3 폴리오비루스로부터 게놈 RNA를 분리하고; (b) RNA 시퀀싱 방법을 이용하여 상기 분리된 게놈 RNA 영역의 뉴클레오티드 서열을 측정하고; (c) cDNA 합성방법을 이용하여 상기 분리된 게놈 RNA로부터 이중-가닥 cDNA를 제조하고; (d) DNA 시퀀싱 방법을 이용하여 상기 cDNA 영역의 뉴클레오티드 서열을 측정하고, 이때 상기 cDNA 영역은 단계(b)에서 시퀀싱 처리된 RNA 영역과 상응하는 것이며; (e) 상기 시퀀싱 처리된 cDNA와 상기 시퀀싱 처리된 RNA를 비교하여 뉴클레오티드 서열내에서의 실제적인 차이점들을 측정하고, 이때 상기 cDNA와 비교되는 RNA 영역은 백신 균주3 폴리오비루스의 2493 위치를 포함하는 영역이며 ; 및 (f) 상기 cDNA 내부의 실제적인 차이점들을 변형시켜 진정한 RNA 비루스 cDNA를 제조하는 단계들로 구성되는, 진정한 RNA 비루스 cDNA의 제조방법.
- 제1항의 방법에 의해서 제조된 진정한 RNA 비루스 cDNA.
- (a) pLED 3. 2; 및 (b) pLED 3. 2에 의한 형질발현을 코오딩하는 폴리펩티드에 대한 형질발현을 코오딩하는 cDNAs로 구성된 군으로부터 선택되는, 백신 균주3 폴리오비루스로부터 유래된 진정한 RNA 비루스 cDNA.
- (a) 백신 균주3 폴리오비루스로부터 게놈 RNA를 분리하고; (b) RNA 시퀀싱 방법을 이용하여 상기 분리된 게놈 RNA 영역의 뉴클레오티드 서열을 측정하고; (c) cDNA 합성방법을 이용하여 상기 분리된 게놈 RNA로부터 이중-가닥 cDNA를 제조하고; (d) DNA 시퀀싱 방법을 이용하여 상기 cDNA 영역의 뉴클레오티드 서열을 측정하고, 이때 상기 cDNA 영역은 단계(b)에서 시퀀싱 처리된 RNA 영역과 상응하는 것이며; (e) 상기 시퀀싱 처리된 cDNA와 상기 시퀀싱 처리된 RNA를 비교하여 뉴클레오티드 서열내에서의 실제적인 차이점들을 측정하고, 이때 상기 cDNA와 비교되는 RNA 영역은 백신 균주3 폴리오비루스의 2493 위치를 포함하는 영역이며 ; 및 (f) 상기 cDNA 내부의 실제적인 차이점들을 변형시켜 RNA 비루스 cDNA를 제조하는 단계들로 구성되는, RNA 비루스 cDNA의 제조방법.
- 제4항의 방법에 의해서 제조된 RNA 비루스 cDNA.
- (a) pLED3; 및 (b) pLED3에 의한 형질발현을 코오딩하는 폴리펩티드에 대한 형질발현을 코오딩하는 cDNAs로 구성된 군으로부터 선택되는, 백신 균주3 폴리오비루스로부터 유래된 RNA 비루스 cDNA.
- 제3항, 제4항, 제5항 및 제6항 중 어느 한 항에서 정의하고 있는 RNA 비루스 cDNA를 포함하는 재조합 DNA 분자.
- 세균, 이스트 및 다른 진균류, 곤충세포 및 동물세포들로 구성된 군으로부터 선택되는, 제7항에서 정의한 재조합 DNA 분자를 사용하여 형질전환시킨 숙주.
- (a) 생존 가능한 RNA 비루스가 생산될 수 있도록 하는 조건들 하에서 제8항에서 정의한 숙주를 배양하고; 및 (b) 상기 숙주세포 배양물로부터 생존 가능한 RNA 비루스를 수거하는 단계들로 구성되는, 생존 가능한 RNA 비루스의 제조방법.
- (a) 폴리오비루스로부터 게놈 RNA를 분리하고; 및 (b) RNA 시퀀싱 방법을 이용하여 2493 위치의 뉴클레오티드를 측정하는 단계들로 구성되는, 균주3 폴리오비루스의 변종을 선별하는 방법.
- RNA 비루스 cDNA에 의해서 코오딩하는 균주3 폴리오비루스의 독성약화력을 증강시키는 방법에 있어서, 상기 cDNA가 2492-2494 위치에 뉴클레오티드 서열 ATT를 포함하며, 상기 방법이 뉴클레오티드 2493 위치에 존재하는 T가 C로 변화되도록 상기 cDNA를 변이처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- (a) 제3항 또는 제6항에서 정의한 RNA 비루스 cDNA를 사용하여 숙주를 감염시키고, 이때 상기 숙주는 동물세포이며; (b) 생존 가능한 RNA 비루스가 생산될 수 있도록 하는 조건들 하에서 상기 숙주를 배양하고; 및 (c) 상기 숙주 세포 배양물로부터 생존 가능한 RNA 비루스를 수거하는 단계들로 구성되는, 생존 가능한 RNA 비루스의 제조방법.
- (a) 생존 가능한 RNA 비루스가 생산될 수 있도록 하는 조건들 하에서 제8항에서 정의한 숙주를 배양하고; 및 (b) 상기 숙주 세포 배양물로부터 생존 가능한 RNA 비루스를 수거하는 단계들에 의해서 제조된 생존 가능한 RNA 비루스.
- (a) 시험관내 전사방법을 이용하여 제7항에서 정의한 재조합 DNA 분자로부터 RNA를 제조하고; (b) 상기 RNA를 분리하고; (c) 상기 분리된 RNA를 사용하여 숙주를 감염시키고, 이때 상기 숙주는 동물세포이며 ; (d) 생존 가능한 RNA 비루스가 생산될 수 있도록 하는 조건들 하에서 상기 숙주를 배양하고; 및 (e) 상기 숙주 세포 배양물로부터 생존 가능한 RNA 비루스를 수거하는 단계들에 의해서 제조된 생존 가능한 RNA 비루스.
- (a) 제3항 또는 제6항에서 정의한 진정한 RNA 비루스 cDNA를 사용하여 숙주를 감염시키고, 이때 상기 숙주는 동물세포이며; (b) 생존 가능한 RNA 비루스가 생산될 수 있도록 하는 조건들 하에서 상기 숙주를 배양하고; 및 (c) 상기 숙주 세포 배양물로부터 생존 가능한 RNA 비루스를 수거하는 단계들에 의해서 제조된 생존 가능한 RNA 비루스.
- (a) 피검자에게 면역성을 부여하는 데 효과적인 비루스를 코오딩하는 재조합 핵산 서열을 사용하여 적당한 숙주 세포를 형질 전환시키고, (b) 비루스가 생산될 수 있도록 하는 조건들 하에서 숙주 세포를 배양하고, 및 (c) 생산된 비루스를 분리함으로써 제조되며, 뉴클레오티드의 2493 위치가 C인 유효량의 RNA 비루스와; 알맞은 담체를 포함하는, 피검자에게 감염성 폴리오비루스에 대한 면역성을 부여하는 데 유용한 백신.
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