JP5328343B2 - 微生物検出用オリゴヌクレオチドおよびそのアレイ、微生物検出器具、微生物検出方法ならびに微生物検出キット - Google Patents
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Description
(1)配列番号1〜64の核酸配列のいずれかを含んでなるオリゴヌクレオチド。
(1a)配列番号1〜64の核酸配列のいずれかからなるオリゴヌクレオチド。
(2)被検試料中の微生物の存在を検出するためのプローブとして用いる、上記(1)または(1a)に記載のオリゴヌクレオチド。
(2a)上記被検試料が食品である、上記(2)に記載のオリゴヌクレオチド。
(2b)上記被検試料が麦芽アルコール飲料である、上記(2)に記載のオリゴヌクレオチド。
(3)核酸配列が配列番号1〜64の配列のうちのいずれかを含有し、以下の微生物のグループ(i)〜(vii):
(i)ブレタノマイセス(デッケラ)・ブリュクセレンシス(Brettanomyces (Dekkera) bruxellensis)に属する微生物、
(ii)ブレタノマイセス(デッケラ)・アノマラ(Brettanomyces (Dekkera) anomala)に属する微生物、
(iii)サッカロマイセス・セレヴィシエ((Saccharomyces cerevisiae)、サッカロマイセス・ディアスタティカス(Saccharomyces diastaticus)サッカロマイセス・パストリアヌス(Saccharomyces pastorianus)、もしくはサッカロマイセス・バイヤヌス(Saccharomyces bayanus)に属する微生物、
(iv)ピキア・アノマラ(Pichia anomala)に属する微生物、
(v)ハンセニアスポウバウムウバラム(Hanseniaspora uvarum)もしくはハンセニアスポラ・グイリアモンディ(Hanseniaspora guilliermondii)に属する微生物、および
(vi)キャンディダ・バリダ(Candida valida)もしくはピキア・メンブラナエファシエンス(Pichia membranaefaciens)に属する微生物、および
(vii)ブレタノマイセス(デッケラ)・ブリュクセレンシス(Brettanomyces (Dekkera) bruxellensis)もしくはブレタノマイセス(デッケラ)・アノマラ(Brettanomyces (Dekkera) anomala)に属する微生物、
の中から選択された1つのグループに属する微生物の核酸の相補鎖に対して特異的にハイブリダイズし得る、またはグループ(i)〜(vii)から選択された複数のグループのそれぞれに属する微生物の核酸の相補鎖に対して特異的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド。
支持体に固定された、配列番号1〜64の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列を含んでなる少なくとも1つのオリゴヌクレオチドを含む、
オリゴヌクレオチドアレイ。
(4a)被検試料中の微生物の存在を検出するためのオリゴヌクレオチドアレイであって、
支持体に固定された、配列番号1〜64の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列からなる少なくとも1つのオリゴヌクレオチドを含む、
オリゴヌクレオチドアレイ。
(5)被検試料中の微生物の存在を検出するためのオリゴヌクレオチドアレイであって、支持体に固定された、以下の(A)〜(G):
(A)配列番号1〜6、8、および10〜14の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列を含んでなる少なくとも1つのオリゴヌクレオチド、
(B)配列番号15〜22、および25〜29の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列を含んでなる少なくとも1つのオリゴヌクレオチド、
(C)配列番号30〜43の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列を含んでなる少なくとも1つのオリゴヌクレオチド、
(D)配列番号44〜52の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列を含んでなる少なくとも1つのオリゴヌクレオチド、
(E)配列番号53〜56の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列を含んでなる少なくとも1つのオリゴヌクレオチド、
(F)配列番号57〜64の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列を含んでなる少なくとも1つのオリゴヌクレオチド、もしくは
(G)配列番号7、9、23、および24の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列を含んでなる少なくとも1つのオリゴヌクレオチド、
のいずれか、またはこれらの任意の組み合わせを含む、オリゴヌクレオチドアレイ。
(5a)被検試料中の微生物の存在を検出するためのオリゴヌクレオチドアレイであって、支持体に固定された、以下の(A)〜(G):
(A)配列番号1〜6、8、および10〜14の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列からなる少なくとも1つのオリゴヌクレオチド、
(B)配列番号15〜22、および25〜29の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列からなる少なくとも1つのオリゴヌクレオチド、
(C)配列番号30〜43の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列からなるオリゴヌクレオチド、
(D)配列番号44〜52の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列からなる少なくとも1つのオリゴヌクレオチド、
(E)配列番号53〜56の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列からなる少なくとも1つのオリゴヌクレオチド、
(F)配列番号57〜64の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列からなる少なくとも1つのオリゴヌクレオチド、もしくは
(G)配列番号7、9、23、および24の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列からなる少なくとも1つのオリゴヌクレオチド、
のいずれか、またはこれらの任意の組み合わせからなる、オリゴヌクレオチドアレイ。
(6)少なくとも上記(A)のオリゴヌクレオチドを含む、上記(5)に記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
(7)上記微生物が、少なくともブレタノマイセス(デッケラ)・ブリュクセレンシス(Brettanomyces (Dekkera) bruxellensis)に属する微生物である、上記(6)に記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
(8)少なくとも上記(B)のオリゴヌクレオチドを含む、上記(5)に記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
(9)上記微生物が、少なくともブレタノマイセス(デッケラ)・アノマラ(Brettanomyces (Dekkera) anomala)に属する微生物である、上記(8)に記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
(10)少なくとも上記(C)のオリゴヌクレオチドを含む、上記(5)に記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
(11)上記微生物が、少なくともサッカロマイセス・セレヴィシエ((Saccharomyces cerevisiae)、サッカロマイセス・ディアスタティカス(Saccharomyces diastaticus)サッカロマイセス・パストリアヌス(Saccharomyces pastorianus)、もしくはサッカロマイセス・バイヤヌス(Saccharomyces bayanus)に属する微生物である、上記(10)に記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
(12)少なくとも上記(D)のオリゴヌクレオチドを含む、上記(5)に記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
(13)上記微生物が、少なくともピキア・アノマラ(Pichia anomala)に属する微生物である、上記(12)に記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
(14)少なくとも上記(E)のオリゴヌクレオチドを含む、上記(5)に記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
(15)上記微生物が、少なくともハンセニアスポラ・ウバラム(Hanseniaspora uvarum)もしくはハンセニアスポラ・グイリアモンディ(Hanseniaspora guilliermondii)に属する微生物である、上記(14)に記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
(16)少なくとも上記(F)のオリゴヌクレオチドを含む、上記(5)に記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
(17)上記微生物が、少なくともキャンディダ・バリダ(Candida valida)もしくはピキア・メンブラナエファシエンス(Pichia membranaefaciens)に属する微生物である、上記(16)に記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
(18)少なくとも上記(G)のオリゴヌクレオチドを含む、上記(5)に記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
(19)上記微生物が、少なくともブレタノマイセス(デッケラ)・ブリュクセレンシス(Brettanomyces (Dekkera) bruxellensis)に属する微生物、またはブレタノマイセス(デッケラ)・アノマラ(Brettanomyces (Dekkera) anomala)に属する微生物のいずれかである、上記(18)に記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
(20)上記被検試料が食品である、上記(4)〜(19)のいずれかに記載のアレイ。
(20a)上記被検試料が麦芽アルコール飲料である、上記(4)〜(19)のいずれかに記載のアレイ。
(i)ブレタノマイセス(デッケラ)・ブリュクセレンシス(Brettanomyces (Dekkera) bruxellensis)に属する微生物、
(ii)ブレタノマイセス(デッケラ)・アノマラ(Brettanomyces (Dekkera) anomala)に属する微生物、
(iii)サッカロマイセス・セレヴィシエ((Saccharomyces cerevisiae)、サッカロマイセス・ディアスタティカス(Saccharomyces diastaticus)サッカロマイセス・パストリアヌス(Saccharomyces pastorianus)、もしくはサッカロマイセス・バイヤヌス(Saccharomyces bayanus)のいずれかに属する微生物、
(iv)ピキア・アノマラ(Pichia anomala)に属する微生物、
(v)ハンセニアスポラ・ウバラム(Hanseniaspora uvarum)もしくはハンセニアスポラ・グイリアモンディ(Hanseniaspora guilliermondii)のいずれかに属する微生物、および
(vi)キャンディダ・バリダ(Candida valida)もしくはピキア・メンブラナエファシエンス(Pichia membranaefaciens)のいずれかに属する微生物、および
(vii)ブレタノマイセス(デッケラ)・ブリュクセレンシス(Brettanomyces (Dekkera) bruxellensis)もしくはブレタノマイセス(デッケラ)・アノマラ(Brettanomyces (Dekkera) anomala)のいずれかに属する微生物、
の中から選択される1つのグループの微生物であること、または複数のグループのうちのいずれかのグループの微生物であることを検出および/または同定するための器具であって、
選択された1つのグループに属する微生物の核酸の相補鎖に対して特異的にハイブリダイズし得る少なくとも1つのオリゴヌクレオチド、または選択された複数のグループのそれぞれに属する微生物の核酸の相補鎖に対して特異的にハイブリダイズし得る少なくとも2つのオリゴヌクレオチドを固定した支持体を備える、器具。
(22)上記グループ(i)に属する微生物の核酸の相補鎖に対して特異的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドが、配列番号1〜6、8、および10〜14の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列を含んでなるオリゴヌクレオチドである、上記(21)に記載の器具。
(22a)上記グループ(i)に属する微生物の核酸の相補鎖に対して特異的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドが、配列番号1〜6、8、および10〜14の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列からなるオリゴヌクレオチドである、上記(21)に記載の器具。
(23)上記グループ(ii)に属する微生物の核酸の相補鎖に対して特異的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドが、配列番号15〜22、および25〜29の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列を含んでなるオリゴヌクレオチドである、上記(21)に記載の器具。
(23a)上記グループ(ii)に属する微生物の核酸の相補鎖に対して特異的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドが、配列番号15〜22、および25〜29の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列からなるオリゴヌクレオチドである、上記(21)に記載の器具。
(24)上記グループ(iii)に属する微生物の核酸の相補鎖に対して特異的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドが、配列番号30〜43の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列を含んでなるオリゴヌクレオチドである、上記(21)に記載の器具。
(24a)上記グループ(iii)に属する微生物の核酸の相補鎖に対して特異的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドが、配列番号30〜43の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列からなるオリゴヌクレオチドである、上記(21)に記載の器具。
(25)上記グループ(iv)に属する微生物の核酸の相補鎖に対して特異的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドが、配列番号44〜52の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列を含んでなるオリゴヌクレオチドである、上記(21)に記載の器具。
(25a)上記グループ(iv)に属する微生物の核酸の相補鎖に対して特異的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドが、配列番号44〜52の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列からなるオリゴヌクレオチドである、上記(21)に記載の器具。
(26)上記グループ(v)に属する微生物の核酸の相補鎖に対して特異的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドが、配列番号53〜56の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列を含んでなるオリゴヌクレオチドである、上記(21)に記載の器具。
(26a)上記グループ(v)に属する微生物の核酸の相補鎖に対して特異的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドが、配列番号53〜56の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列からなるオリゴヌクレオチドである、上記(21)に記載の器具。
(27)上記グループ(vi)に属する微生物の核酸の相補鎖に対して特異的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドが、配列番号57〜64の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列を含んでなるオリゴヌクレオチドである、上記(21)に記載の器具。
(27a)上記グループ(vi)に属する微生物の核酸の相補鎖に対して特異的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドが、配列番号57〜64の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列からなるオリゴヌクレオチドである、上記(21)に記載の器具。
(28)上記グループ(vii)に属する微生物の核酸の相補鎖に対して特異的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドが、配列番号7、9、23、および24の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列を含んでなるオリゴヌクレオチドである、上記(21)に記載の器具。
(28a)上記グループ(vii)に属する微生物の核酸の相補鎖に対して特異的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドが、配列番号7、9、23、および24の核酸配列からなる群から選択されるいずれか核酸配列からなるオリゴヌクレオチドである、上記(21)に記載の器具。
(29)上記支持体表面にカルボジイミド基またはイソシアネート基を有し、当該カルボジイミド基またはイソシアネート基と上記オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド末端に付加されたリンカーとの反応により共有結合が形成されることにより、上記オリゴヌクレオチドが支持体に固定されていることを特徴とする、上記(21)〜(28a)のいずれか1項に記載の器具。
被検試料中の微生物の核酸を調製する核酸調製工程と、
当該核酸を鋳型として標識プローブを調製するプローブ調製工程と、
上記(1)〜(3)のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、上記(4)〜(20)のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドアレイ、または上記(21)〜(29)のいずれか1項に記載の器具を用いて、支持体表面に固定されたオリゴヌクレオチドと上記標識プローブとのハイブリダイゼーションを行うハイブリダイゼーション工程と、
ハイブリダイゼーションシグナルを検出するシグナル検出工程と、
を含むことを特徴とする、方法。
(31)上記被検試料が食品であることを特徴とする、上記(30)に記載の方法。
(31a)上記被検試料が麦芽アルコール飲料であることを特徴とする、上記(30)に記載の方法。
上記(1)〜(3)のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、上記(4)〜(20)のいずれか1項に記載のアレイ、または上記(21)〜(29)のいずれか1項に記載の器具を含む、
キット。
(33)さらに、上記ハイブリダイゼーション工程およびシグナル検出工程で用いる試薬を含む、
上記(32)に記載のキット。
(34)さらに、上記プローブ調製工程および/または上記核酸調製工程で用いる試薬を含む、上記(32)または(33)に記載のキット。
本発明に係る被検試料中の微生物を検出および/または同定するためのオリゴヌクレオチドアレイまたは器具においては、対象となる微生物が属する種または属に特異的な塩基配列に基づくオリゴヌクレオチドが基板のような支持体表面に固定化されており、当該オリゴヌクレオチドと被検試料に由来する核酸とのハイブリダイゼーションにより被検試料中の微生物が検出および/または同定される。
本発明に係る微生物検出器具に用いる支持体としては、オリゴヌクレオチドを安定して固定化することができるものであればよい。例えば、ポリカーボネートやプラスチックなどの合成樹脂、ガラス等でできた基板を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。支持体の形態も特に限定されるものではないが、例えば、板状、フィルム状等の基板を好適に用いることができる。
本発明に係るオリゴヌクレオチドアレイまたは微生物検出器具の支持体表面に固定化されるオリゴヌクレオチドは、検出対象微生物が属する種または属に特異的な塩基配列に基づくオリゴヌクレオチドであればよい。当該オリゴヌクレオチドと被検試料由来の核酸との間にハイブリダイゼーションが成立することにより、被検試料中に含まれている目的の種または属に属する微生物を検出することが可能となる。なお、上記検出対象微生物が属する種または属に特異的な塩基配列に基づくオリゴヌクレオチドを、以下適宜「キャプチャーオリゴ」と称する。
オリゴヌクレオチドの支持体(例えば、基板)表面への固定化法は特に限定されるものではなく、公知の方法を適宜選択して用いればよい。例えば、物理的吸着、電気的結合または分子共有結合などの一般的なハイブリダイゼーション法に用いられる手法が利用可能である。本発明に係る微生物検出器具においては、表面にカルボジイミド基またはイソシアネート基を有する基材を使用し(米国特許:US5,908,746、特開平8−23975号)、固定化することが好ましい。オリゴヌクレオチドは、支持体上に、アレイ状またはマトリクス状にスポットされ得る。
本発明に係る微生物検出方法は、被検試料中の微生物の核酸を調製する核酸調製工程と、当該核酸を鋳型として標識プローブを調製するプローブ調製工程と、対象となる微生物が属する種または属に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドと上記標識プローブとのハイブリダイゼーションを行うハイブリダイゼーション工程と、ハイブリダイゼーションシグナルを検出するシグナル検出工程とを含む、被検試料中の微生物を検出および/または同定するための方法である。本検出方法のハイブリダイゼーション工程においては、本発明に係る、配列番号1〜64のいずれかの核酸配列からなる(またはそれを含んでなる)1つ以上のオリゴヌクレオチド、微生物検出用オリゴヌクレオチドアレイ、または微生物検出器具を用いることができる。本発明のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドアレイまたは微生物検出器具を用いることにより、簡便、迅速かつ正確に網羅的な検出および/または同定を行うことが可能となる。また、本検出方法の被検試料としては、食品であることが好ましい。以下各工程に分けて詳細に説明する。
被検試料中の微生物の核酸を調製する工程である。被検試料からの核酸の調製法は、公知の核酸の調製法を適宜選択して用いることができる。例えば、DNAの調製は、R−F.Wangが紹介する方法に従って抽出することができる(Molecular and Cellular Probes(2000) 14,1−5)。この方法は標準的な調製法であるが、多くの代替法があり、いずれを採用してもよいことはいうまでもない。また、市販のキットを使用してもよい。
上記核酸調製工程で調製した核酸を鋳型として標識プローブを調製する工程である。プローブは、例えば、キャプチャーオリゴおよび陽性コントロール・キャプチャーオリゴの塩基配列を含むよう核酸増幅により作製することができる。核酸増幅の方法としては、例えば、PCRによりDNAとして増幅する方法、あるいはインビトロ・トランスクリプション(in vitro transcription)法によりRNAとして増幅する方法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
ハイブリダイゼーション工程は、対象となる微生物が属する種または属に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチド(例えば、配列番号1〜64のいずれかの核酸配列からなる(またはそれを含んでなる)1つ以上のオリゴヌクレオチド)と上記標識プローブとのハイブリダイゼーションを行う工程である。ハイブリダイゼーションは上記オリゴヌクレオチドを固定化したメンブレン上等で行うことができる。あるいは、本発明に係る微生物検出用オリゴヌクレオチドアレイまたは微生物検出器具を用いることができる。当該微生物検出用アレイまたは器具を用いることにより、簡便、迅速かつ正確に網羅的な検出および/または同定を行うことが可能となる。ハイブリダイゼーション工程に用いる方法は特に限定されるものではなく、公知の核酸ハイブリダイゼーション方法を適宜選択して用いることができる。以下に、具体的なハイブリダイゼーション方法の一例を示す。
シグナル検出工程は、上記ハイブリダイゼーション工程においてハイブリダイゼーションの成立の有無を判定する工程であり、通常上記ハイブリダイゼーション工程と連続的に行われる。
本発明に係る微生物検出キットは、上述の本発明に係る微生物検出方法を実施するためのキットである。したがって、本発明に係る微生物検出方法を実施できるものであれば、キットに含まれる構成は特に限定されるものではない。
本発明のオリゴヌクレオチドは、被検試料中の微生物を検出および/または同定するためのプローブとして使用され得る。対象となる微生物は、(1)ブレタノマイセス(デッケラ)・ブリュクセレンシス(Brettanomyces (Dekkera) bruxellensis)、(2)ブレタノマイセス(デッケラ)・アノマラ(Brettanomyces (Dekkera) anomala)、(3)サッカロマイセス・セレヴィシエ((Saccharomyces cerevisiae)もしくはサッカロマイセス・ディアスタティカス(Saccharomyces diastaticus)サッカロマイセス・パストリアヌス(Saccharomyces pastorianus)、もしくはサッカロマイセス・バイヤヌス(Saccharomyces bayanus)に属する微生物が含まれる。
定法に従い、オリゴヌクレオチド合成機(Perkin−elmer Applied biosystems 社製)を用いてオリゴヌクレオチドを合成し、脱保護を施した後乾燥させた。このオリゴヌクレオチド乾燥体を、10mM Tris−HCl(pH7.5)・1mM EDTA緩衝液を用いて溶解し、100pmol/μLのオリゴヌクレオチド溶液を調製した。本実施例に使用したすべてのオリゴヌクレオチドはこの方法で合成した。合成したオリゴヌクレオチドの塩基配列を配列番号1〜69に示した。これらのうち、配列番号1〜64がキャプチャーオリゴであり、配列番号65が陰性コントロール・キャプチャーオリゴであり、配列番号66〜67がプライマーであり、配列番号68がコントロールプローブであり、配列番号69がコントロールプローブに対する陽性コントロール・キャプチャーオリゴある。キャプチャーオリゴヌクレオチドについては上記合成機を用いて5’末端にアミノ基を結合させ、プライマーは5’末端にビオチンを結合させた。
5’末端にアミノ基を有するオリゴヌクレオチド溶液10μLに対してマイクロスポッティング溶液(TeleChem International Inc.製)を10μL混合し、マイクロタイタープレート(Greiner Laboratory Inc.製)上に分注した。スポッティングマシンの所定の位置にカルボジイミド樹脂処理スライドグラスCarbostation(日清紡績株式会社製)を配置し、スポッティングマシンを作動させた。スポッティング終了後、スライドグラスに熱水からの蒸気を数秒間あて、その後紫外線を600mJ照射した。再度蒸気に数秒間曝露した後、ホットプレート上にスライドグラスを置いて水分を除去した。スライドグラスを3% BSA(ウシ血清アルブミン)を含む100mM Tris−HCl(pH7.5)・100mM NaCl・0.1% Triton X−100に室温で30分間浸し、ブロッキングした。その後、10mM Tris−HCl(pH7.5)・1mM EDTA緩衝液で洗浄した。スライドグラスを室温で乾燥させ、使用まで乾燥状態で冷暗所にて保存した。図1(A)に、本実施例で実際に使用した微生物検出器具の基板上に固定化されているオリゴヌクレオチドの配置を示した。
検体として用いた微生物はブレタノマイセス属2種、サッカロマイセス属4種、キャンディダ属2種、ピキア属2種、ハンセニアスポラ属2種の合計11種類の微生物である。検体として用いた微生物を表2に示した。
得られた各微生物のDNAを鋳型としてPCRによりプローブ核酸を調製した。PCR反応液の組成は、Taqポリメラーゼ:1unit、ビオチン化プライマー(配列番号66および67):各10 pmol、反応用緩衝液(10×):5μL、dNTP:各10 nmol、鋳型DNA:100ngに滅菌蒸留水を加えて総量50μLとした。サーマルサイクラーを用いて、95℃で3分間保持した後、95℃:30秒間、55℃:15秒間、72℃:1分間の反応を30サイクル行い、72℃で5分間保持して反応を終了した。
上記プローブ核酸溶液3μLと、ビオチン化コントロールプローブ溶液1μLと、ArrayIt Unihyb Hybridization Solution(TeleChem International Inc.製)16μL とを加えて混合し、100℃で1分間加熱処理を行った後、氷中に5分間浸した。このプローブ核酸溶液を全量とり、キャプチャーオリゴヌクレオチドを固定化した基板に載せ、その上にカバーグラスを載せた。これを保湿箱に入れ、37℃に設定した恒温器中に120分間静置した。基板を取り出し、すばやく室温下で2×SSC溶液(2×SSC:0.033M NaCl、0.033Mクエン酸ナトリウム)に浸してカバーグラスを除去し、37℃に保温した2×SSC中に5分間浸した。
EPSON社製スキャナーGT−8700Fおよびその透過型ユニットを用いてハイブリダイゼーションを行った領域を600dpiにてスキャンし、スキャン画像を目視により発色の有無を確認した。図1(B)にスキャン画像の一例として、Dekkera bruxellensisのスキャン画像を示した。なお、図1(A)は基板上のオリゴヌクレオチドの配置を示している。
検体として用いた11種類の各微生物についての結果を表3〜13に示した。各表とも○印が発色の確認されたスポットを表し、−印が発色の確認されなかったスポットを表す。表3〜13から明らかなように全ての場合、コントロールプローブではそれに対する陽性コントロール・キャプチャーオリゴ(配列番号69)に発色が見られ、また、陰性コントロール・キャプチャーオリゴでは発色が認められず、増幅およびハイブリダイゼーションの工程が共に正常に機能していることが確認された。このことより微生物より調整した核酸が増幅されていることも確認された。なお、以下の結果の説明においては陽性コントロール・キャプチャーオリゴ(配列番号69)の発色は含めないものとする。
Claims (20)
- 被検試料中の微生物の存在を検出するためのオリゴヌクレオチドアレイであって、
(A)配列番号1〜6、8、および10〜14の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列からなる少なくとも1つのオリゴヌクレオチド、及び
(B)配列番号15〜22、および25〜29の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列からなる少なくとも1つのオリゴヌクレオチドを含み、
該オリゴヌクレオチドが支持体に固定されているオリゴヌクレオチドアレイ。 - 被検試料中の微生物の存在を検出するためのオリゴヌクレオチドアレイであって、さらに、支持体に固定された、以下の(C)〜(G):
(C)配列番号30〜43の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列からなる少なくとも1つのオリゴヌクレオチド、
(D)配列番号44〜52の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列からなる少なくとも1つのオリゴヌクレオチド、
(E)配列番号53〜56の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列からなる少なくとも1つのオリゴヌクレオチド、
(F)配列番号57〜64の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列からなる少なくとも1つのオリゴヌクレオチド、もしくは
(G)配列番号7、9、23、および24の核酸配列からなる群から選択されるいずれかの核酸配列からなる少なくとも1つのオリゴヌクレオチド、
のいずれか、またはこれらの任意の組み合わせを備える、請求項1に記載のオリゴヌクレオチドアレイ。 - 前記微生物が、少なくともブレタノマイセス(デッケラ)・ブリュクセレンシス(Brettanomyces(Dekkera)bruxellensis)に属する微生物である、請求項1に記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
- 前記微生物が、少なくともブレタノマイセス(デッケラ)・アノマラ(Brettanomyces(Dekkera)anomala)に属する微生物である、請求項1に記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
- 少なくとも前記(C)のオリゴヌクレオチドを備える、請求項2に記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
- 前記微生物が、少なくともサッカロマイセス・セレヴィシエ((Saccharomycescerevisiae)、サッカロマイセス・ディアスタティカス(Saccharomycesdiastaticus)サッカロマイセス・パストリアヌス(Saccharomycespastorianus)、もしくはサッカロマイセス・バイヤヌス(Saccharomycesbayanus)に属する微生物である、請求項5に記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
- 少なくとも前記(D)のオリゴヌクレオチドを備える、請求項2に記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
- 前記微生物が、少なくともピキア・アノマラ(Pichiaanomala)に属する微生物である、請求項7に記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
- 少なくとも前記(E)のオリゴヌクレオチドを備える、請求項2に記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
- 前記微生物が、少なくともハンセニアスポラ・ウバラム(Hanseniasporauvarum)もしくはハンセニアスポラ・グイリアモンディ(Hanseniasporaguilliermondii)に属する微生物である、請求項9に記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
- 少なくとも前記(F)のオリゴヌクレオチドを備える、請求項2に記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
- 前記微生物が、少なくともキャンディダ・バリダ(Candidavalida)もしくはピキア・メンブラナエファシエンス(Pichiamembranaefaciens)に属する微生物である、請求項11に記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
- 少なくとも前記(G)のオリゴヌクレオチドを備える、請求項2に記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
- 前記微生物が、少なくともブレタノマイセス(デッケラ)・ブリュクセレンシス(Brettanomyces(Dekkera)bruxellensis)に属する微生物、またはブレタノマイセス(デッケラ)・アノマラ(Brettanomyces(Dekkera)anomala)に属する微生物のいずれかである、請求項13に記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
- 前記被検試料が食品である、請求項1〜14のいずれか1項に記載のアレイ。
- 被検試料中の微生物の検出、被検試料中の微生物が属するグループの同定、または被検試料中の微生物の検出と該微生物が属するグループの同定とを行うための方法であって、
被検試料中の微生物の核酸を調製する核酸調製工程と、
当該核酸を鋳型として標識プローブを調製するプローブ調製工程と、
請求項1〜15のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドアレイを用いて、支持体表面に固定されたオリゴヌクレオチドと前記標識プローブとのハイブリダイゼーションを行うハイブリダイゼーション工程と、
ハイブリダイゼーションシグナルを検出するシグナル検出工程と、
を含むことを特徴とする方法。 - 前記被検試料が食品であることを特徴とする、請求項16に記載の方法。
- 請求項16又は17に記載の方法を実施するための微生物検出キットであって、
請求項1〜15のいずれか1項に記載のアレイを含むキット。 - さらに、前記ハイブリダイゼーション工程およびシグナル検出工程で用いる試薬を含む、請求項18に記載のキット。
- さらに、前記プローブ調製工程および/または前記核酸調製工程で用いる試薬を含む、請求項18又は19に記載のキット。
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