CN101300362A

CN101300362A - 微生物检测用寡核苷酸及其阵列以及微生物检测器具、检测方法及检测试剂盒

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Publication number: CN101300362A
Application number: CNA200680038320XA
Authority: CN
Inventors: 儿玉由纪子; 畑中一成; 田中幸一; 中川浩子; 守屋彰悟; 小佐野薰
Original assignee: Suntory Ltd
Current assignee: Suntory Holdings Ltd
Priority date: 2005-08-16
Filing date: 2006-08-16
Publication date: 2008-11-05
Anticipated expiration: 2026-08-16
Also published as: KR101261086B1; JP5328343B2; KR20080049044A; EP2270227A1; AU2006280651B2; TW200734465A; CA2619743A1; DK2270227T3; EP2270227B1; TWI394838B; EP1926832A1; CN101300362B; CA2619743C; JP2009504134A; US20090048118A1; AU2006280651A1; US7893008B2; WO2007021027A1

Abstract

本发明提供可用简便的操作快速并且正确地判定被测样品中混入的微生物的微生物检测器具、微生物检测方法及微生物检测试剂盒。本发明所涉及的微生物检测器具是基于对微生物所属的种或属的特异性碱基序列的寡核苷酸固定于基板表面的微阵列型器具。根据由被测样品制备的探针与上述固定于基板表面的寡核苷酸有无发生杂交，可简便、快速并且正确地检测和/或鉴定被测样品中的微生物。

Description

微生物检测用寡核苷酸及其阵列以及微生物检测器具、检测方法及检测试剂盒

技术领域

本发明涉及微生物检测用寡核苷酸及其阵列、微生物检测器具、微生物检测方法以及微生物检测试剂盒。

背景技术

食品中如混入有害微生物会导致品质劣化。例如，麦芽酒精饮料中如混入有害微生物时，会产生混浊和/或风味劣化。而且，例如，啤酒中如混入酒香酵母属(德克酵母属)(Brettanomyces(Dekkera))、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、有孢汉逊酵母属(Hanseniaspora)、酿造用酵母以外的酵母属(Saccharomyces)等的非酿造用酵母时，会降低啤酒的品质，导致混浊和/或异味。作为检测上述有害微生物的方法，现在最常用的是将对象啤酒用膜过滤法过滤后在适合的培养基中培养并检测生长繁殖的菌落的方法。

并且，作为判定此菌落是否是上述有害微生物的方法，使用了如下方法，以从菌落中提取的DNA为模板，使用上述有害微生物的特异性引物进行PCR，用电泳判定是否获得了PCR产物(例如，参照日本特开平7-289295号公报)。但是，因该方法需针对每个菌种使用引物，需使用多个引物、进行多次PCR，所以，操作极为繁杂，在快速性上存在问题。且为缩短所需时间，虽可混合多个引物放入同一试管中进行扩增反应，但因可使用的引物数量有极限，所以针对微量样品进行正确的判定还很困难。

为解决上述问题，还使用了如下方法，设计引物，使各个菌种中普遍存在的基因的种特异性序列部分得到扩增，扩增后，用识别种特异性序列的限制酶切割扩增产物，由经电泳所获得的条带大小判定是哪个菌种的基因。但是，不一定存在可判别所有对象菌种的限制酶，需将所得到的扩增产物用多种限制酶分别切割后再进行电泳，这需要极为繁杂的操作，因而在快速性、简便性方面存在问题。

为更进一步地解决上述问题点，还进行了以下方法，将种特异性序列作为探针使用，通过杂交判定在被测样品的DNA或RNA中是否存在与其序列互补的序列。

发明内容

但是，即使是上述通过杂交判定的方法，也存在着频繁发生将非常近缘DNA同源性高的菌种误认为是其他种而与之杂交的交叉杂交问题，有时会难于正确鉴定菌种。

因此，希望有用于更正确且简便或快速地判定有无特定微生物存在的菌种的判别方法。

特别是需要可用于上述方法的不产生交叉杂交问题的特异性核酸探针。

本发明者为解决上述课题锐意研究的结果，在对应麦芽酒精饮料的代表性污染微生物ITS区域(微生物的18S核糖体RNA基因和25S核糖体RNA基因之间的间隔区)的碱基序列中找到了特定的属或特定的种的特异性序列，通过将基于此碱基序列的寡核苷酸作为探针使用，找到了可快速并且正确地检测和/或鉴定被测样品中目的微生物的方法，使本发明得以完成。

即本发明提供如下所示的寡核苷酸、用于检测被测样品中微生物存在的寡核苷酸阵列、具有其阵列的微生物检测器具、试剂盒及检测被测样品中微生物存在的方法。

(1)寡核苷酸，其含有SEQ ID NOs 1～64的核酸序列的任一个。

(1a)寡核苷酸，其由SEQ ID NOs 1～64的核酸序列的任一个组成。

(2)上述(1)或(1a)中所述的寡核苷酸，其作为用于检测被测样品中微生物存在的探针使用。

(2a)上述(2)中所述的寡核苷酸，其中，上述被测样品是食品。

(2b)上述(2)中所述的寡核苷酸，其中，上述被测样品是麦芽酒精饮料。

(3)寡核苷酸，其具有含有SEQ ID NOs 1～64中任一个序列的核酸序列，所述寡核苷酸可与属于从以下微生物组(i)～(vii)中选择的一组微生物核酸序列的互补序列杂交或可与每组都由选自组(i)～(vii)中的多个微生物组成的多个组中的微生物的核酸的互补链特异性杂交：

(i)属于Brettanomyces(Dekkera)bruxellensis的微生物，

(ii)属于Brettanomyces(Dekkera)anomala的微生物，

(iii)属于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomycesdiastaticus)、巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)、或贝酵母(Saccharomyces bayanus)的微生物，

(iv)属于异常毕赤酵母(Pichia anomala)的微生物，

(v)属于葡萄酒有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)或季也蒙有孢汉逊酵母(Hanseniaspora guilliermondii)的微生物，及

(vi)属于粗状假丝酵母(Candida valida)或膜醭毕赤酵母(Pichiamembranaefaciens)的微生物，及

(vii)属于Brettanomyces(Dekkera)bruxellensis或Brettanomyces(Dekkera)anomala的微生物。

(4)寡核苷酸阵列，其用于检测被测样品中微生物的存在，包含固定于支持物上、含有从SEQ ID NOs 1～64的核酸序列所组成的组中选择的任一个核酸序列的至少一个寡核苷酸。

(4a)寡核苷酸阵列，其用于检测被测样品中微生物的存在，包含固定于支持物上、由从SEQ ID NOs 1～64的核酸序列所组成的组中选择的任一个核酸序列组成的至少一个寡核苷酸。

(5)寡核苷酸阵列，其用于检测被测样品中微生物的存在，包含固定于支持物上的以下(A)～(G)中的任一个或这些的任意组合：

(A)含有从SEQ ID NOs 1～6、8及10～14的核酸序列所组成的组中选择的任一个核酸序列的至少一个寡核苷酸，

(B)含有从SEQ ID NOs 15～22及25～29的核酸序列所组成的组中选择的任一个核酸序列的至少一个寡核苷酸，

(C)含有从SEQ ID NOs 30～43的核酸序列所组成的组中选择的任一个核酸序列的至少一个寡核苷酸，

(D)含有从SEQ ID NOs 44～52的核酸序列所组成的组中选择的任一个核酸序列的至少一个寡核苷酸，

(E)含有从SEQ ID NOs 53～56的核酸序列所组成的组中选择的任一个核酸序列的至少一个寡核苷酸，

(F)含有从SEQ ID NOs 57～64的核酸序列所组成的组中选择的任一个核酸序列的至少一个寡核苷酸，或

(G)含有从SEQ ID NO 7、9、23及24的核酸序列所组成的组中选择的任一个核酸序列的至少一个寡核苷酸。

(5a)寡核苷酸阵列，其用于检测被测样品中微生物的存在，由固定于支持物上的以下(A)～(G)中的任一个或这些的任意组合组成：

(A)由从SEQ ID NOs 1～6、8及10～14的核酸序列所组成的组中选择的任一个核酸序列组成的至少一个寡核苷酸，

(B)由从SEQ ID NOs 15～22及25～29的核酸序列所组成的组中选择的任一个核酸序列组成的至少一个寡核苷酸，

(C)由从SEQ ID NOs 30～43的核酸序列所组成的组中选择的任一个核酸序列组成的至少一个寡核苷酸，

(D)由从SEQ ID NOs 44～52的核酸序列所组成的组中选择的任一个核酸序列组成的至少一个寡核苷酸，

(E)由从SEQ ID NOs 53～56的核酸序列所组成的组中选择的任一个核酸序列组成的至少一个寡核苷酸，

(F)由从SEQ ID NOs 57～64的核酸序列所组成的组中选择的任一个核酸序列组成的至少一个寡核苷酸，或

(G)由从SEQ ID NO 7、9、23及24的核酸序列所组成的组中选择的任一个核酸序列组成的至少一个寡核苷酸。

(6)上述(5)中所述的寡核苷酸阵列，其包含至少上述(A)的寡核苷酸。

(7)上述(6)中所述的寡核苷酸阵列，其中，上述微生物属于Brettanomyces(Dekkera)bruxellensis。

(8)上述(5)中所述的寡核苷酸阵列，其包含至少上述(B)的寡核苷酸。

(9)上述(8)中所述的寡核苷酸阵列，其中，上述微生物属于Brettanomyces(Dekkera)anomala。

(10)上述(5)中所述的寡核苷酸阵列，其中，包含至少上述(C)的寡核苷酸。

(11)上述(10)中所述的寡核苷酸阵列，其中，上述微生物属于酿酒酵母、糖化酵母、巴斯德酵母或贝酵母。

(12)上述(5)中所述的寡核苷酸阵列，其包含至少上述(D)的寡核苷酸。

(13)上述(12)中所述的寡核苷酸阵列，其中，上述微生物属于异常毕赤酵母。

(14)上述(5)中所述的寡核苷酸阵列，其包含至少上述(E)的寡核苷酸。

(15)上述(14)中所述的寡核苷酸阵列，其中，上述微生物属于葡萄酒有孢汉逊酵母或季也蒙有孢汉逊酵母。

(16)上述(5)中所述的寡核苷酸阵列，其包含至少上述(F)的寡核苷酸。

(17)上述(16)中所述的寡核苷酸阵列，其中，上述微生物属于粗状假丝酵母或膜醭毕赤酵母的微生物。

(18)上述(5)中所述的寡核苷酸阵列，其至少包含上述(G)的寡核苷酸。

(19)上述(18)中所述的寡核苷酸阵列，其中，上述微生物至少是属于Brettanomyces(Dekkera)bruxellensis的微生物或Brettanomyces(Dekkera)anomala的微生物的任一个。

(20)上述(4)～(19)中任一项所述的阵列，其中，上述被测样品是食品。

(20a)上述(4)～(19)中任一项所述的阵列，其中，上述被测样品是麦芽酒精饮料。

(21)器具，其用于检测及/或鉴定被测样品中微生物是从以下微生物组(i)～(vii)中选择的一个组的微生物或多个组中的任一组微生物：

(i)属于Brettanomyces(Dekkera)bruxellensis的微生物，

(ii)属于Brettanomyces(Dekkera)anomala的微生物，

(iii)属于酿酒酵母、糖化酵母、巴斯德酵母或贝酵母中的任一种微生物，

(iv)属于异常毕赤酵母的微生物，

(v)属于葡萄酒有孢汉逊酵母或季也蒙有孢汉逊酵母中的任一种微生物，及

(vi)属于粗状假丝酵母或膜醭毕赤酵母中的任一种微生物，及

(vii)属于Brettanomyces(Dekkera)bruxellensis或Brettanomyces(Dekkera)anomala中的微生物，

其具有固定可与属于所选择的一组微生物核酸的互补链特异性杂交的至少1个寡核苷酸、或可与属于所选择的多组中的各个组微生物核酸的互补链特异性杂交的至少2个寡核苷酸的支持物。

(22)上述(21)中所述的器具，其中，可与属于上述组(i)的微生物核酸的互补链特异性杂交的寡核苷酸是含有从SEQ ID NOs 1～6、8及10～14的核酸序列所组成的组中选择的任一个核酸序列的寡核苷酸。

(22a)上述(21)中所述的器具，其中，可与属于上述组(i)的微生物核酸的互补链特异性杂交的寡核苷酸是由从SEQ ID NOs 1～6、8及10～14的核酸序列所组成的组中选择的任一个核酸序列组成的寡核苷酸。

(23)上述(21)中所述的器具，其中，可与属于上述组(ii)的微生物核酸的互补链特异性杂交的寡核苷酸是含有从SEQ ID NOs 15～22及25～29的核酸序列所组成的组中选择的任一个核酸序列的寡核苷酸。

(23a)上述(21)中所述的器具，其中，可与属于上述组(ii)的微生物核酸的互补链特异性杂交的寡核苷酸是由从SEQ ID NOs 15～22及25～29的核酸序列所组成的组中选择的任一个核酸序列组成的寡核苷酸。

(24)上述(21)中所述的器具，其中，可与属于上述组(iii)的微生物核酸的互补链特异性杂交的寡核苷酸是含有从SEQ ID NOs 30～43的核酸序列所组成的组中选择的任一个核酸序列的寡核苷酸。

(24a)上述(21)中所述的器具，其中，可与属于上述组(iii)的微生物核酸的互补链特异性杂交的寡核苷酸是由从SEQ ID NOs 30～43的核酸序列所组成的组中选择的任一个核酸序列组成的寡核苷酸。

(25)上述(21)中所述的器具，其中，可与属于上述组(iv)的微生物核酸的互补链特异性杂交的寡核苷酸是含有从SEQ ID NOs 44～52的核酸序列所组成的组中选择的任一个核酸序列的寡核苷酸。

(25a)上述(21)中所述的器具，其中，可与属于上述组(iv)的微生物核酸的互补链特异性杂交的寡核苷酸是由从SEQ ID NOs 44～52的核酸序列所组成的组中选择的任一个核酸序列组成的寡核苷酸。

(26)上述(21)中所述的器具，其中，可与属于上述组(v)的微生物核酸的互补链特异性杂交的寡核苷酸是含有从SEQ ID NOs 53～56的核酸序列所组成的组中选择的任一个核酸序列的寡核苷酸。

(26a)上述(21)中所述的器具，其中，可与属于上述组(v)的微生物核酸的互补链特异性杂交的寡核苷酸是由从SEQ ID NOs 53～56的核酸序列所组成的组中选择的任一个核酸序列组成的寡核苷酸。

(27)上述(21)中所述的器具，其中，可与属于上述组(vi)的微生物核酸的互补链特异性杂交的寡核苷酸是含有从SEQ ID NOs 57～64的核酸序列所组成的组中选择的任一个核酸序列的寡核苷酸。

(27a)上述(21)中所述的器具，其中，可与属于上述组(vi)的微生物核酸的互补链特异性杂交的寡核苷酸是由从SEQ ID NOs 57～64的核酸序列所组成的组中选择的任一个核酸序列组成的寡核苷酸。

(28)上述(21)中所述的器具，其中，可与属于上述组(vii)的微生物核酸的互补链特异性杂交的寡核苷酸是含有从SEQ ID NO 7、9、23及24的核酸序列所组成的组中选择的任一个核酸序列的寡核苷酸。

(28a)上述(21)中所述的器具，其中，可与属于上述组(vii)的微生物核酸的互补链特异性杂交的寡核苷酸是由从SEQ ID NO 7、9、23及24的核酸序列所组成的组中选择的任一个核酸序列组成的寡核苷酸。

(29)上述(21)～(28a)中任一项所述的器具，其特征在于，在上述支持物表面具有碳二亚胺基或异氰酸酯基(isocyanate group)，通过该碳二亚胺基或异氰酸酯基与上述寡核苷酸或寡核苷酸末端附加的接头反应形成共价键，使上述寡核苷酸固定在支持物上。

(30)方法，其是用于进行被测样品中微生物的检测、被测样品中微生物所属组的鉴定或被测样品中微生物的检测和该微生物所属组的鉴定的方法，包括：

制备被测样品中微生物核酸的核酸制备工序，

以该核酸为模板制备标记探针的探针制备工序，

使用上述(1)～(3)中任一项所述的寡核苷酸、上述(4)～(20)中任一项所述的寡核苷酸阵列或上述(21)～(29)中任一项所述的器具，使固定于支持物表面的寡核苷酸与上述标记探针进行杂交的杂交工序，以及

检测杂交信号的信号检测工序。

(31)上述(30)中所述的方法，其中，上述被测样品是食品。

(31a)上述(30)中所述的方法，其中，上述被测样品是麦芽酒精饮料。

(32)试剂盒，其是用于实施上述(30)～(31a)中任一项所述方法的微生物检测试剂盒，其包括上述(1)～(3)中任一项所述的寡核苷酸、上述(4)～(20)中任一项所述的阵列或上述(21)～(29)中任一项所述的器具。

(33)上述(32)中所述的试剂盒，其进一步包括上述杂交工序及信号检测工序中使用的试剂。

(34)上述(32)或(33)中所述的试剂盒，其进一步包括上述探针制备工序及/或上述核酸制备工序中使用的试剂。

通过本发明，可提供检测及/或鉴定被测样品中微生物的方法中可最小限度地控制交叉杂交问题的寡核苷酸探针。

根据本发明所涉及的微生物检测用寡核苷酸阵列或微生物检测器具，通过使用基于对象微生物所属的种或属的特异性碱基序列的寡核苷酸、使该寡核苷酸与来自被测样品的核酸进行杂交来检测及/或鉴定被测样品中的微生物，所以可正确且简便地进行微生物的检测及/或鉴定。

另外，通过使用基板表面上包含基于多数微生物种或属的特异性碱基序列的寡核苷酸的阵列，可进行全面式检查。

而且，本发明所涉及的微生物检测试剂盒，因包含上述微生物检测寡核苷酸阵列或微生物检测器具及必要的试剂，所以可提高操作性，可比以往更加简便地进行微生物的检测及/或鉴定。

附图说明

图1表示实施例中使用的固定于本发明所涉及的微生物检测器具的基板上的寡核苷酸的排列(A)、以及使用本发明所涉及的微生物检测器具检测Brettanomyces(Dekkera)bruxellensis的结果(B)。

具体实施方式

本发明的一个方式，提供含有SEQ ID NOs 1～64核酸序列中的任一个的寡核苷酸(参照表1-1及表1-2)。这些寡核苷酸可作为用于检测被测样品中微生物存在的探针使用。上述被测样品优选是食品，更优选是麦芽酒精饮料。

可使用本发明的寡核苷酸检测的被测样品中的微生物，是(i)属于Brettanomyces(Dekkera)bruxellensis的微生物，(ii)属于Brettanomyces(Dekkera)anomala的微生物，(iii)属于酿酒酵母、糖化酵母、巴斯德酵母或贝酵母的任一个的微生物，(iv)属于异常毕赤酵母的微生物，(v)属于葡萄酒有孢汉逊酵母或季也蒙有孢汉逊酵母的任一个的微生物，(vi)属于粗状假丝酵母或膜醭毕赤酵母的任一个的微生物及(vii)属于Brettanomyces(Dekkera)bruxellensis或Brettanomyces(Dekkera)anomala的任一个的微生物。

且本发明在另一方式中，提供用于检测被测样品中微生物存在的寡核苷酸阵列。此寡核苷酸阵列包含固定于支持物上、含有从SEQ ID NOs 1～64的核酸序列所组成的组中选择的任一个核酸序列的至少一个寡核苷酸。

本发明中，作为用于检测及/或鉴定被测样品中微生物的探针使用的寡核苷酸，可由以下所示根据种或属分组。本发明所涉及的微生物检测用寡核苷酸阵列或微生物检测器具中，这些寡核苷酸的至少1个以上固定于支持物表面。

(A)寡核苷酸，其是基于对应属于Brettanomyces(Dekkera)bruxellensis的微生物ITS区域的碱基序列中该种的特异性序列的寡核苷酸，含有SEQ IDNOs 1～6、8及10～14中所示的碱基序列。

(B)寡核苷酸，其是基于对应属于Brettanomyces(Dekkera)anomala的微生物ITS区域的碱基序列中该种的特异性序列的寡核苷酸，含有SEQ IDNOs 15～22及25～29中所示的碱基序列。

(C)寡核苷酸，其是基于对应属于酿酒酵母、糖化酵母、巴斯德酵母、贝酵母的微生物ITS区域的碱基序列中该种的特异性序列的寡核苷酸，含有SEQ ID NOs 30～43中所示的碱基序列。

(D)寡核苷酸，其是基于对应异常毕赤酵母ITS区域的碱基序列中该种的特异性序列的寡核苷酸，含有SEQ ID NOs 44～52中所示的碱基序列。

(E)寡核苷酸，其是基于对应葡萄酒有孢汉逊酵母或季也蒙有孢汉逊酵母ITS区域的碱基序列中该种的特异性序列的寡核苷酸，含有SEQ ID NOs53～56中所示的碱基序列。

(F)寡核苷酸，其是基于对应粗状假丝酵母或膜醭毕赤酵母ITS区域的碱基序列中该种的特异性序列的寡核苷酸，含有SEQ ID NOs 57～64中所示的碱基序列。

通过使用将上述(A)～(F)中所述的寡核苷酸固定于支持物(例如，基板)表面的本发明的微生物检测用寡核苷酸阵列或微生物检测器具，可全面地检测及/或鉴定食品中的污染菌、特别是麦芽酒精饮料(啤酒)、杂酒(发泡酒(low-alcoholic beverages))、利口酒类(liqueur)、低酒精饮料(例如，酒精成分低于1％的麦芽发酵饮料、啤酒味饮料)中的污染菌。

而且，除上述寡核苷酸以外，还可使用将下述(G)中所述的寡核苷酸固定于上述基板表面的本发明的寡核苷酸阵列或微生物检测器具，全面地检测及/或鉴定食品中的污染菌。

(G)寡核苷酸，其是基于对应Brettanomyces(Dekkera)bruxellensis或Brettanomyces(Dekkera)anomala ITS区域的碱基序列中这些种的特异性序列的寡核苷酸，含有SEQ ID NOs 7、9、23及24中所示的碱基序列。

表1-1及表1-2中记有SEQ ID NOs 1～64的序列及根据与之对应的微生物命名的寡核苷酸(oligo)名。且如以下详述，表1-3表示本发明中使用的对照寡核苷酸等的序列。

(表1-1)

(表1-2)

44	Pano1	ACACACATTGTCTAGTT
44	Pano1	ACACACATTGTCTAGTT	45	Pano3	TATTGACTTAGCAAGAG
46	Pano4	CTAATAAGCAGTCTTTC	45	Pano3	TATTGACTTAGCAAGAG
46	Pano4	CTAATAAGCAGTCTTTC	47	Pano4-2	CAGTCTTTCTGAAATAATG
48	Pano4-3	CTAATAAGCAGTCTTTCT	47	Pano4-2	CAGTCTTTCTGAAATAATG
48	Pano4-3	CTAATAAGCAGTCTTTCT	49	Pano5	GTTAAAACCTTTAACCA
50	Pano6	TAGGCAGGTTTAGAAGT	49	Pano5	GTTAAAACCTTTAACCA
50	Pano6	TAGGCAGGTTTAGAAGT	51	Pano6-2	ATATCAGCTAGGCAGG
52	Pano7	GGCTCGGCTTAACAACA	51	Pano6-2	ATATCAGCTAGGCAGG
52	Pano7	GGCTCGGCTTAACAACA	53	HuvHgu1	AGATCTTTTACAATAATGTGTA
54	HuvHgu2	CGAAAGGTTCAAGGCAAA	53	HuvHgu1	AGATCTTTTACAATAATGTGTA
54	HuvHgu2	CGAAAGGTTCAAGGCAAA	55	HuvHgu3	CGTTTTACTTTACAAGG
56	HuvHgu5	AGGCAAAGGGTTGCTTT	55	HuvHgu3	CGTTTTACTTTACAAGG
56	HuvHgu5	AGGCAAAGGGTTGCTTT	57	CvaPme1	CCAACACCACACTGTGTG
58	CvaPme2	CACACGTCAACAAAAGA	57	CvaPme1	CCAACACCACACTGTGTG
58	CvaPme2	CACACGTCAACAAAAGA	59	CvaPme2-2	GTCAACAAAAGATCTAAAAG
60	CvaPme3	TGCGCAGAGCTGGCCG	59	CvaPme2-2	GTCAACAAAAGATCTAAAAG
60	CvaPme3	TGCGCAGAGCTGGCCG	61	CvaPme4	AAACGTTGCGGACGAAG
62	CvaPme4-2	ACGTTGCGGACGAAG	61	CvaPme4	AAACGTTGCGGACGAAG
62	CvaPme4-2	ACGTTGCGGACGAAG	63	CvaPme4-3	GCCGAAAAGAAACGTTG
64	CvaPme5	TACATCGGGACGCTTTG	63	CvaPme4-3	GCCGAAAAGAAACGTTG

(表1-3)

SEQID NO	寡核苷酸名	序列	备注
SEQID NO	寡核苷酸名	序列	备注	65	阴性对照	cctaatcggcttagcgtagg	针对对照探针的阴性对照捕捉寡核苷酸
66	ITS18S16	TTGATTACGTCCCTGCCCTTTG	引物	65	阴性对照	cctaatcggcttagcgtagg	针对对照探针的阴性对照捕捉寡核苷酸
66	ITS18S16	TTGATTACGTCCCTGCCCTTTG	引物	67	ITS46	GATATGCTTAAGTTCAGCGG	引物
68	阳性对照模板	ttgattacgtccctgccctttggacgaacgctggccctacctaatcgcgatagcgtaggagccacggctaactacgtgcccgctgaacttaagcatatc	对照探针	67	ITS46	GATATGCTTAAGTTCAGCGG	引物
68	阳性对照模板		对照探针	69	阳性对照	cctaatcgcgatagcgtagg	针对对照探针的阳性对照捕捉寡核苷酸

本发明还提供检测及/或鉴定被测样品中微生物的方法，此方法包括制备被测样品中微生物核酸的核酸制备工序、以该核酸为模板制备标记探针的探针制备工序、使用上述本发明所涉及的微生物检测用寡核苷酸阵列或微生物检测器具使固定于支持物表面的寡核苷酸与上述标记探针进行杂交的杂交工序和检测杂交信号的信号检测工序。

本发明所涉及的微生物检测方法中的被测样品，优选食品，其中最优选麦芽酒精饮料等的饮料。

本发明还提供微生物检测试剂盒，此试剂盒的代表性用途是用于实施上述本发明所涉及的微生物检测方法，包含上述本发明所涉及的微生物检测器具。其还优选包括杂交工序、信号检测工序、探针制备工序、核酸制备工序中使用的试剂。

以下，进一步详细说明本发明的实施方式。且本发明不限于这些实施方式。

(1)本发明所涉及的微生物检测用寡核苷酸阵列或微生物检测器具

本发明所涉及的用于检测及/或鉴定被测样品中微生物的寡核苷酸阵列或器具中，基于对象微生物所属的种或属的特异性碱基序列的寡核苷酸固定于基板等的支持物表面，通过该寡核苷酸与来自被测样品的核酸之间的杂交来检测及/或鉴定被测样品中的微生物。

〔支持物〕

本发明所涉及的微生物检测器具中使用的支持物，只要能稳定地固定寡核苷酸即可。例如，可为用聚碳酸酯、塑料等的合成树脂、玻璃等制成的基板，但不限于此。支持物的形态虽无特别限定，但可优选使用例如板状、薄膜状等的基板。

此外，在支持物上结合寡核苷酸的方法，可使用本领域技术人员共知的方法(例如，可参照日本特许公表2003-530861；日本特许公表2004-526402等中记载的方法)。本发明所涉及的微生物检测用寡核苷酸阵列或微生物检测器具中，优选上述支持物表面具有碳二亚胺基或异氰酸酯基(isocyanategroup)，通过该碳二亚胺基或异氰酸酯基与上述寡核苷酸或寡核苷酸末端附加的接头反应形成共价键。

〔固定于支持物表面的寡核苷酸〕

本发明所涉及的固定于寡核苷酸阵列或微生物检测器具的支持物表面的寡核苷酸，只要是基于检测对象微生物所属的种或属的特异性碱基序列的寡核苷酸即可。通过该寡核苷酸与来自被测样品的核酸之间发生杂交，即可检测出被测样品中所含有的属于目的种或属的微生物。且将基于上述检测对象微生物所属的种或属的特异性碱基序列的寡核苷酸，在以下适当称为“捕捉寡核苷酸(Capture Oligo)”。

上述特异性碱基序列，可从检测对象微生物的基因组碱基序列中找出属或种特异性碱基序列，优选从对应检测对象微生物的核糖体RNA基因的碱基序列中找出。其中，已知微生物的18S核糖体RNA基因和25S核糖体RNA基因之间的间隔区(ITS区域)大量含有属或种特异性碱基序列，所以特别优选从对应ITS区域的DNA序列中找出属或种特异性碱基序列。ITS区域的碱基序列可从GenBank、EMBL、DDBJ等数据库等获取。

捕捉寡核苷酸，可基于上述属或种特异性碱基序列设计。因此，可以是上述属或种特异性碱基序列本身，只要能与由检测对象微生物制备的核酸进行特异性杂交，例如，也可包含多个碱基的取代、缺失、插入及/或附加等的突变。突变的位置无特别限定。

捕捉寡核苷酸的长度(碱基数)无特别限定，但过短时杂交的检测会产生困难，过长时会发生非特异性杂交。发明者对捕捉寡核苷酸的最佳长度进行了反复探讨，将标准长度定为12～24个碱基，更优选为13～22个碱基，但不限于此，例如，也可以比此范围的长度短数个碱基(例如8碱基、9碱基、10碱基、11碱基)或长数个碱基(例如25碱基、26碱基、27碱基、28碱基)等。碱基长主要依赖于序列特性(特定的碱基含有率，同一碱基的重复)，结合性好的即使是短链也可进行特异性杂交，其已由发明者证实。

捕捉寡核苷酸具有阻碍与来自被测样品的核酸杂交的发夹结构、茎环结构或其以外的立体结构时，可通过将组成捕捉寡核苷酸的1个或1个以上的核苷酸用肌苷或与任一个核苷酸均不联会的核酸取代，以解除其立体结构。

捕捉寡核苷酸的合成法无特别限定，可通过公知的方法[例如，Maniatis，T.et al.，Molecular Cloning A Laboratory Manual，Second Edition，Cold SpringHarbor Laboratory Press(1989)中记载的方法等]合成。一般可使用市售的DNA合成仪进行化学合成。

本发明所涉及的寡核苷酸阵列或微生物检测器具中，不只将基于上述检测对象微生物所属的种或属的特异性碱基序列的寡核苷酸固定于支持物表面，除此之外还优选将所谓的对照捕捉寡核苷酸固定于支持物表面。对照捕捉寡核苷酸中，包含阳性对照捕捉寡核苷酸及阴性对照捕捉寡核苷酸(参照表1-3)。阳性对照捕捉寡核苷酸，用于判定在后述的探针制备过程中扩增反应是否顺利、杂交是否顺利进行。阴性对照捕捉寡核苷酸，用于确认未发生非特异性杂交即未产生假阳性杂交信号。本发明中也包括在支持物表面固定有这些阳性对照·捕捉寡核苷酸及阴性对照捕捉寡核苷酸的微生物检测用阵列或器具。

阳性对照捕捉寡核苷酸，只要根据由检测对象微生物制备的探针中所含有的碱基序列设计即可。对多个检测对象微生物同时使用同一微生物检测器具检测时，可针对各检测对象微生物设计阳性对照捕捉寡核苷酸，也可根据由多个检测对象微生物制备的探针的共有碱基序列设计。没有由所有的检测对象微生物制备的探针的共有碱基序列时，也可分成各个组设计阳性对照捕捉寡核苷酸。或者也可设计引物序列部分相同、与对象微生物的序列不同的人工序列，将此序列的一部分作为阳性对照·捕捉寡核苷酸。通过以上述人工序列为模板制备探针(本说明书中，将此种探针称为对照探针)，添加到由被测样品制备的探针中，可检验杂交的特异性。上述探针如后所述。

阴性对照·捕捉寡核苷酸优选设计为在阳性对照·捕捉寡核苷酸的碱基序列中具有在1个碱基以上、且低于该序列所具有的碱基数的20％的范围内包含人为的碱基置换的碱基序列。进行碱基置换的碱基数，由与杂交条件的关系决定，可选择来自检测对象微生物的探针不发生杂交的碱基数。

检测对象微生物无特别限定，可适当选择希望从目的被测样品中检测出的微生物。例如，可为混入食品中可能污染该食品的微生物。食品中混入有害微生物是公共卫生上非常严重的问题。而且在以啤酒、发泡酒为代表的麦芽酒精饮料中混入有害微生物时，会导致混浊、风味劣化等品质劣化，所以，特别强烈希望开发出快速并且正确地检测及/或鉴定这些有害微生物的方法。

污染包括麦芽酒精饮料在内的食品的微生物，特别是真菌，可列举为属于酒香酵母属(德克酵母属)、假丝酵母属、毕赤酵母属、有孢汉逊酵母属、酿造用酵母以外的酵母属的微生物。且属于酒香酵母属(德克酵母属)的真菌种，可列举为Brettanomyces(Dekkera)bruxellensis、Brettanomyces(Dekkera)anomala。另外，属于酿造用酵母以外的酵母属的真菌种，可列举为酿酒酵母或糖化酵母、贝酵母。

且污染食品的真菌除上述以外可列举为异常毕赤酵母、葡萄酒有孢汉逊酵母、季也蒙有孢汉逊酵母、粗状假丝酵母、膜醭毕赤酵母。但是检测对象微生物不限于这些。

用于检测和/或鉴定上述例示的微生物的捕捉寡核苷酸，可为基于来自Brettanomyces(Dekkera)bruxellensis、Brettanomyces(Dekkera)anomala、酿酒酵母、糖化酵母、巴斯德酵母、贝酵母、异常毕赤酵母、葡萄酒有孢汉逊酵母、季也蒙有孢汉逊酵母、粗状假丝酵母、膜醭毕赤酵母的寡核苷酸中各微生物种的特异性序列的寡核苷酸。具体地说，可为含有SEQ ID NOs 1～64中所示的任一个碱基序列的寡核苷酸，但不限于此。

本发明所涉及的固定于微生物检测器具的支持物(例如，基板)表面的捕捉寡核苷酸，只要能与由对象微生物制备的探针进行杂交，无特别限定。因此，本发明的寡核苷酸可以只由SEQ ID NOs 1～64中所示的任一个碱基序列组成，也可包含SEQ ID NOs 1～64中所示的任一个碱基序列以外的序列。包含SEQ ID NOs 1～64中所示的任一个碱基序列以外的序列的捕捉寡核苷酸，可为在SEQ ID NOs 1～64中所示的各碱基序列的5’末端或3’末端或其双方，具有基于各自ITS区域的碱基序列延长的碱基序列的寡核苷酸，将该种寡核苷酸固定于支持物表面的微生物检测器具也包含于本发明。

固定于1个支持物上的捕捉寡核苷酸可至少为1种以上，无特别上限。一般来说，检测混入样品中的微生物时，可用1个基板全面检测被测样品中可检测出的微生物的方式，从操作简便性及检查快速性的观点来看可谓优选。因此，本发明所涉及的微生物检测器具最为优选的是，在1个支持物上将对应目的微生物种或属的捕捉寡核苷酸多数固定，即制成所谓的微阵列型器具。例如，将麦芽酒精饮料作为被测样品时，优选将对应属于酒香酵母属(德克酵母属)、糖化酵母等的微生物的捕捉寡核苷酸固定于支持物表面。

〔寡核苷酸(捕捉寡核苷酸)的固定〕

寡核苷酸向支持物(例如，基板)表面固定的方法无特别限定，可适当选择使用公知的方法。例如，可利用物理吸附、电偶联或分子共价键等一般的杂交法中使用的方法。本发明所涉及的微生物检测器具中，优选使用表面具有碳二亚胺基或异氰酸酯基的基材(美国专利：US5,908,746、日本特开平8-23975号)进行固定。寡核苷酸可在支持物上以阵列状或矩阵状点样。

将寡核苷酸点样时，如寡核苷酸的点样量过少，则不能充分确保寡核苷酸与探针之间的反应性，给检测带来困难。除上述技术问题外，高密度的点样(high integration spotting)还有成本问题，且使用了探针的荧光标记、化学发光的检测，还需要更精密、高昂的检测装置例如扫描仪。因此，优选寡核苷酸在基板表面以直径为10～1,000μm固定。寡核苷酸向基板上点样的方法无特别限定，例如，可通过使用点样仪将寡核苷酸溶液在基板上进行点样。因此，寡核苷酸溶液点样时，通常近似为圆形。捕捉寡核苷酸向支持物固定的方法，还可参照例如日本特开2002-65274号(例如，段落[0062]-[0066]中的记载)等。

(2)本发明所涉及的微生物检测方法

本发明所涉及的微生物检测方法，是包括制备被测样品中微生物核酸的核酸制备工序、以该核酸为模板制备标记探针的探针制备工序、基于对象微生物所属的种或属的特异性序列的寡核苷酸与上述标记探针进行杂交的杂交工序和检测杂交信号的信号检测工序的用于检测和/或鉴定被测样品中微生物的方法。本检测方法的杂交工序中，可使用本发明所涉及的由SEQ ID NOs 1～64的任一个核酸序列组成(或含有该核酸序列)的1个以上的寡核苷酸、微生物检测用寡核苷酸阵列或微生物检测器具。通过使用本发明的寡核苷酸、寡核苷酸阵列或微生物检测器具，可简便、快速并且正确地进行全面式的检测及/或鉴定。此外，本检测方法中的被测样品优选是食品。以下分成各工序详细说明。

〔核酸制备工序〕

是制备被测样品中微生物核酸的工序。被测样品中的核酸的制备法可适当选择使用公知的核酸制备法，例如，DNA的制备可按照R-F.Wang介绍的方法提取(Molecular and Cellular Probes(2000)14，1-5)。此方法是标准的制备方法，但也有很多代替法，可采用任一种方法，此点不必赘述。此外，还可使用市售的试剂盒。

〔探针制备工序〕

是以上述核酸制备工序中制备的核酸为模板制备标记探针的工序。探针例如可通过核酸扩增制备，其中需含有捕捉寡核苷酸及阳性对照捕捉寡核苷酸的碱基序列。核酸扩增的方法，例如可列举为通过PCR扩增DNA的方法或通过体外转录(in vitro transcription)法扩增RNA的方法，但不限于此。

例如，通过PCR制备标记探针时，用于PCR的引物设计为探针需含有与捕捉寡核苷酸及阳性对照捕捉寡核苷酸互补的碱基序列。且只要可进行杂交，探针比捕捉寡核苷酸或阳性对照捕捉寡核苷酸长或短均可。为获得标记探针，可将PCR中使用的引物预先标记，也可通过标记PCR的底物(如脱氧核苷三磷酸)获得标记探针，或者也可在PCR结束后标记探针。标记物质无特别限定，例如，可使用荧光物质、半抗原、放射性物质等与用于通常杂交的探针同样的标记物质。具体地说，荧光物质可列举为异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明(Rodamine)、藻红蛋白(PE)、德州红(Texas Red)、花青素苷类荧光色素等，半抗原可列举为生物素(BIOTIN)、地高辛(Dig)、二硝基苯(DNP)、异硫氰酸荧光素等。

〔杂交工序〕

杂交工序是基于对象微生物所属的种或属的特异性序列的寡核苷酸(例如，由SEQ ID NOs 1～64的任一个核酸序列组成(或含有该核酸序列)的1个以上的寡核苷酸)与上述标记探针进行杂交的工序。杂交可在固定有上述寡核苷酸的膜上等进行。或也可使用本发明所涉及的微生物检测用寡核苷酸阵列或微生物检测器具。通过使用该微生物检测用阵列或器具，可简便、快速并且正确地进行全面式的检测和/或鉴定。杂交工序中使用的方法无特别限定，可适当选择使用公知的核酸杂交方法。以下举例表示具体的杂交方法。

在由SSC(标准柠檬酸盐溶液(Standard Saline Citrate))等的盐溶液、十二烷基硫酸钠(SDS)、牛血清白蛋白(BSA)等的封闭溶液及用于促进融合反应的添加剂组成的融合液中加入标记探针。探针为双链时通过加热等使其变性。在基板上添加数μL标记探针液后，进行数小时加热操作(通常37～50℃)，使固定于基板上的寡核苷酸与标记探针之间形成杂交体。其后，在基板上加入5×SSC或3M四甲基氯化铵后加热(通常37～50℃)，使未形成特异性杂交体的标记探针从基板上剥离，只在基板上选择性保留特异性杂交体。

为了不产生交叉杂交，优选在严格杂交条件下进行杂交。“严格杂交条件”，是指在此条件下，探针与其目标部分序列杂交，但与其他序列、或鉴定出有差异的其他序列不发生实质上杂交的条件。严格条件有序列依赖性、因周围条件的不同而不同。序列越长，越可在更高温度下进行特异性杂交。严格条件一般选择在规定的离子强度和pH值下，比特定序列的热解链温度(Tm)约低5℃的条件。Tm是在规定的离子强度、pH值及核酸浓度下，与靶序列互补的探针的50％可以平衡状态与靶序列杂交的温度。一般来说，因靶序列过剩存在，所以，Tm下，探针的50％以平衡状态被靶序列占有。通常，严格条件是pH7.0～8.3，Na或其他盐的浓度至少约为0.01～1.0M，且温度在短探针(例如，10～50核苷酸)的情况下约为30℃的条件。严格条件还可通过添加甲酰胺等的不稳定药剂来达成。

本说明书中，“特异性杂交”或“可特异性杂交”的术语，是指其序列在DNA或RNA的复合物混合物中存在时，在严格条件下，其分子能与特定的核苷酸序列或序列组发生实质上的结合、形成双链或杂交或只与其结合、形成双链或杂交。一般来说，已知核酸变性可通过升高温度或通过减少含有其核酸的缓冲液的盐浓度来达成。在低严格条件(例如，低温度和/或高盐浓度)下，即使在逐渐冷却条件下，再次联会的序列不完全互补时也能形成杂交体双链(例如，DNA：DNA、RNA：RNA或RNA：DNA)。因此，杂交特异性在低严格条件下降低。相反，在高严格条件下(例如，高温度或低盐浓度)，为使杂交成功进行，应尽量减少错配。

本领域技术人员可理解为，杂交条件可选择任意的严格度。在举例所示的方式之一中，杂交在低严格条件下，例如，6×SSPE-T、37℃下(0.005％曲拉通(Triton)X-100)实施时，杂交也可确实进行。且其后，为继续除去错配杂交体双链，洗涤在高严格条件下(例如，1×SSPE-T、37℃)实施。到获得所需的杂交特异性水平为止，可将连续洗涤在逐渐增高的严格性下进行(例如，0.25×SSPE-T、37℃～50℃)。严格性还可通过添加甲酰胺等的药剂来提高。杂交特异性，可通过与可存在的各种对照(例如，表达水平对照、标准化对照、错配对照及其他)的杂交和与试验探针(Test Probe)的杂交进行比较来评价。

有关使杂交条件最佳化的各种方法为本领域技术人员所共知(例如，参照P.Tiissen编《生物化学和分子生物学中的实验室技术》第24卷“通过核酸探针的杂交”(Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology.Vol.24；Hybridization With Nucleic Acid Probes)、1993年、Elsevier社刊、N.Y.)。

〔信号检测工序〕

信号检测工序是判定上述杂交工序中有无发生杂交的工序，通常与上述杂交工序连续进行。

杂交体检测工序中使用的方法，依赖于导入上述探针制备工序中制备的探针的标记物质。即杂交体的检测中，使用导入探针的荧光物质、半抗原等的标记物质。因此，可适当选择使用用于检测导入所使用的探针中的标记物质的公知方法。

例如，使用半抗原时，在基板上加入含有识别半抗原的蛋白(i)或与半抗原结合的蛋白和碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶(ii)等的结合体(偶联酶)的溶液，室温反应数10分钟。且在进行此半抗原与偶联酶的结合反应之前，通过将固定了寡核苷酸区域以外的基板区域用酪蛋白等的蛋白完全覆盖，可阻止偶联酶与基板的非特异性吸附反应。该反应可通过在固定了寡核苷酸后的基板上加入酪蛋白等的蛋白溶液，室温放置数10分钟来进行。偶联酶与探针中半抗原的结合反应结束后，将未与半抗原结合的偶联酶用含有表面活性剂的适当的缓冲液洗涤排除。由此，在基板上只保留了与探针中的半抗原结合的偶联酶。

为使杂交体可视化，可添加只在半抗原和偶联酶结合体存在时才能形成不溶性化合物等的化合物。其不溶性化合物的生成是通过酶促反应增加而可视化。对于添加的化合物，当偶联酶中的酶是碱性磷酸酶时，使用氯化硝基四氮唑蓝(NBT)和BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸-p甲苯胺盐)，当酶是辣根过氧化物酶时，使用TMB(3，3′，5，5′四甲基联苯胺)等。

通过观察在固定捕捉寡核苷酸的位置上杂交体的色素沉着或荧光显色等的杂交信号，判定被测样品中所含有的微生物种。即检测出杂交信号时，对应于在该信号所在位置上被点样的寡核苷酸的微生物存在于被测样品中。而且，如在阳性对照·捕捉寡核苷酸的位置上有信号存在，可说明本试验正常进行，如在阴性对照·捕捉寡核苷酸的位置上无信号存在，则可说明杂交在适当的条件下进行。

(3)本发明所涉及的微生物检测试剂盒

本发明所涉及的微生物检测试剂盒，是用于实施上述本发明所涉及的微生物检测方法的试剂盒。因此，只要可实施本发明所涉及的微生物检测方法，试剂盒中包含的组成无特别限定。

本发明的微生物检测试剂盒，其代表性组成包括由本发明的SEQ ID NOs1～64的任一个核酸序列组成(或含有该核酸序列)的1个以上的寡核苷酸、本发明所涉及的微生物检测用寡核苷酸阵列或微生物检测器具。通过制成包括这些的试剂盒，即可简便、快速并且正确地进行全面式的检测和/或鉴定。另外，本微生物检测试剂盒中优选包含上述杂交工序及信号检测工序中使用的试剂。杂交工序中使用的试剂，例如可为SSC(Standard Saline Citrate)等的盐溶液、十二烷基硫酸钠(SDS)、牛血清白蛋白(BSA)等的封闭溶液、用于促进融合反应的添加剂等，信号检测工序中使用的试剂，例如可为识别半抗原的蛋白与酶的结合体(偶联酶)、NBT、BCIP、TMB等的显色底物等，但不限于此，只要符合目的需要，可选择适合的试剂作为试剂盒的组成。

本发明的微生物检测试剂盒，优选包括上述探针制备工序中使用的试剂，且还进一步优选包括上述核酸制备工序中使用的试剂。探针制备工序中使用的试剂，例如可列举PCR用缓冲液、耐热性DNA合成酶、脱氧核苷三磷酸混合液等，核酸制备工序中使用的试剂，可列举溶菌用缓冲液、DNA回收用色谱柱、DNA提取用缓冲液等，但不限于此，只要符合目的需要，可选择适合的试剂作为试剂盒的组成。

通过使用本发明所涉及的试剂盒(例如，包括本发明所涉及的微生物检测用阵列或器具及各工序中使用的试剂的试剂盒)，能在收到被测样品后约6小时即可检测和/或鉴定被测样品中所含有的微生物。

(4)本发明的用途

本发明的寡核苷酸，可作为用于检测及/或鉴定被测样品中的微生物的探针使用。对象微生物包括属于(1)Brettanomyces(Dekkera)bruxellensis、(2)Brettanomyces(Dekkera)anomala、(3)酿酒酵母或糖化酵母、巴斯德酵母或贝酵母的微生物。

且本发明的检测对象微生物，还包括属于(4)异常毕赤酵母、(5)葡萄酒有孢汉逊酵母或季也蒙有孢汉逊酵母或(6)粗状假丝酵母或膜醭毕赤酵母的微生物。

本发明所涉及的微生物检测用寡核苷酸、微生物检测用寡核苷酸阵列、微生物检测器具、微生物检测方法及微生物检测试剂盒的用途，只要是需要判定微生物的用途，无特别限定，可全部使用。具体地说，例如，在因微生物污染对品质造成巨大影响的各种工业产品的制造工序中，需要快速并且正确地检测和/或鉴定从该工业产品、其制造环境等中分离出的微生物时，可优选使用。

成为判定对象的被判定微生物的来源的上述工业产品，代表性的可列举食品、饮料、医药品、试剂、医药保健品、一次性医疗器具等，但无特别限定。本发明在上述示例的工业产品中优选应用于食品。更具体地说，食品可列举面包、各类点心(包括冷点心等)、副食品、乳制品、谷类早餐食品、豆腐、油炸豆腐、面条类、盒饭类、调料、小麦粉、肉食等的农产加工品、营养补助食品(营养补充品等)、保存食品(罐头、冷冻食品、软罐头食品(retort-packedfood)等)等，但无特别限定。

在上述例示的食品中，本发明特别列举啤酒、发泡酒、利口酒类、低酒精饮料(例如，酒精成分低于1％的麦芽发酵饮料、啤酒味饮料)等的饮料，但无特别限定。

本发明不限于上述各种实施方式，可在权利要求所示的范围内进行种种变更，对于适当组合不同的实施方式中分别公开的技术手段后所得到的实施方式，也包括在本发明的技术范围内。

尽管本发明容许各种修改和选择形式，但在下文中仅通过实施例参考附图对某特定实施方案进行了详细的说明。然而，应该理解，其并不意欲将本发明限制于公开的特定形式，而是相反，本发明涵盖了落于如附加的权利要求说定义的本发明的范围内的所有修改、等同或选择形式。

实施例

〔寡核苷酸的合成〕

根据规定方法，使用寡核苷酸合成仪(Perkin-elmer AppliedBiosystems公司制)合成寡核苷酸，进行脱保护后使其干燥。将此寡核苷酸干燥体用10mM Tris-HCl(pH7.5)·1mM EDTA缓冲液溶解，制备100pmol/μL的寡核苷酸溶液。本实施例中使用的所有的寡核苷酸均用此方法合成。合成的寡核苷酸的碱基序列如SEQ ID NOs 1～69所示。其中，SEQ ID NOs 1～64是捕捉寡核苷酸，SEQ ID NO 65是阴性对照捕捉寡核苷酸，SEQ ID NOs66～67是引物，SEQ ID NO 68是对照探针，SEQ ID NO 69是针对对照探针的阳性对照捕捉寡核苷酸。捕捉寡核苷酸(Capture nucleotide)使用上述合成仪，使5’末端结合氨基，引物5’末端结合生物素。

〔在基板上的捕捉寡核苷酸的点样〕

在10μL的5’末端有氨基的寡核苷酸溶液中混合10μL微点样(microspotting)溶液(Telechem International Inc.制)，分注于微孔板(GreinerLaboratory Inc.制)。在点样仪的规定位置排列碳化二亚胺树脂处理的载玻片Carbostation(日清纺绩株式会公司制)，开动点样仪。点样结束后，用热水的蒸气薰载玻片数秒，其后照射600mJ紫外线。再次暴露于蒸汽中数秒后，将载玻片放在加热板上以除去水分。将载玻片在含有3％BSA(牛血清白蛋白)的100mM Tris-HCl(pH7.5)·100mM NaCl·0.1％Triton X-100中室温浸入30分钟进行封闭。然后用10mM Tris-HCl(pH7.5)·1mM EDTA缓冲液洗涤。使载玻片在室温干燥，在使用之前保存在干燥状态的冷暗处。图1(A)表示本实施例中实际使用的微生物检测器具的基板上所固定的寡核苷酸的排列。

〔核酸制备工序〕

作为样品使用的微生物是酒香酵母属2种、酵母属4种、假丝酵母属2种、毕赤酵母属2种、有孢汉逊酵母属2种的共计11种的微生物。作为样品使用的微生物如表2所示。

(表2)

Brettanomyces(Dekkera)bruxellensis
Brettanomyces(Dekkera)bruxellensis	Brettanomyces(Dekkera)anomala
酿酒酵母	Brettanomyces(Dekkera)anomala
酿酒酵母	糖化酵母
巴斯德酵母	糖化酵母
巴斯德酵母	贝酵母
异常毕赤酵母	贝酵母
异常毕赤酵母	葡萄酒有孢汉逊酵母
季也蒙有孢汉逊酵母	葡萄酒有孢汉逊酵母
季也蒙有孢汉逊酵母	粗状假丝酵母
膜醭毕赤酵母	粗状假丝酵母

从在上述各微生物的最适培养条件下培养的菌液中，使用Genomic DNAPurif.Kit(EdgeBioSystems制、Cat.No.#85171)，分别制备各微生物的基因组DNA。

〔探针制备工序〕

以所得到的各微生物的DNA为模板，通过PCR制备探针核酸。PCR反应液的组成是在1个单位的Taq聚合酶、各10pmol生物素化引物(SEQ IDNOs 66及67)、5μL反应用缓冲液(10×)、各10nmol的dNTP、100ng模板DNA中加入灭菌蒸馏水，使总量为50μL。使用基因扩增仪，95℃预变性3分钟后，进行95℃30秒、55℃15秒、72℃1分钟的反应循环30次，72℃延伸5分钟后结束反应。

此外设计引物序列部分相同而与对象微生物的序列不同的人工序列，将其作为对照探针。以其为模板进行PCR，制备生物素化对照探针。PCR反应液的组成为，除去模板DNA为1ng这一点不同以外，其他与上述相同。且反应温度及循环数与上述相同。探针不进行纯化，将PCR反应液直接作为探针溶液用于以下的杂交工序。

(杂交工序及信号检测工序〕

加入3μL上述探针核酸溶液、1μL生物素化对照探针溶液和16μL ArrayItUnihyb Hybridization Solution(TeleChem International Inc.制)混合，100℃加热处理1分钟后，浸入冰中5分钟。取此探针核酸溶液总量，置于固定有捕捉寡核苷酸的基板上，在其上盖上盖玻片。将其放入恒湿箱，在设定为37℃的恒温器中静置120分钟。取出基板，在室温下迅速浸入2×SSC溶液(2×SSC：0.033M NaCl、0.033M柠檬酸钠)中，去除盖玻片，在37℃保温的2×SSC中浸入5分钟。

将基板从2×SSC中取出，放入离心机(Beckman公司制)，用2,000rpm离心1分钟。之后使用VECTASTAIN Elite ABC kit(VECTOR公司制)，制备卵白素-生物素过氧化物酶复合物，在基板上滴下1.4ml，室温静置30分钟。其后，在PBS(10mM磷酸钠(pH7.5)、0.9％氯化钠)中洗涤。使用TMBsubstrate kit for peroxidase(VECTOR公司)配制显色溶液，在基板上滴下1.4mL，室温静置30分钟。将基板用蒸馏水洗涤，终止显色反应。

〔判定〕

使用EPSON公司制扫描仪GT-8700F及其透射稿扫瞄单元(TransparencyUnit)，将进行杂交的区域用600dpi扫描，通过目视扫描图像确认其有无显色。图1(B)是扫描图像的例子之一，表示Dekkera bruxellensis的扫描图像。图1(A)表示基板上寡核苷酸的排列。

〔结果〕

作为样品使用的11种各微生物的结果如表3～13所示。各表中，“○”表示确认出显色的点样点，“-”表示未确认出显色的点样点。表3～13明确表示，在全部情况下，针对对照探针的阳性对照捕捉寡核苷酸(SEQ ID NO 69)显色，而阴性对照捕捉寡核苷酸不显色，可确认出扩增及杂交工序均正常进行。由此也可确认由微生物制备的核酸进行了扩增。且在以下结果的说明中，均不包括阳性对照捕捉寡核苷酸(SEQ ID NO 69)的显色。

表3表示Brettanomyces(Dekkera)bruxellensis的结果。确认出对于Brettanomyces(Dekkera)bruxellensis，只有16处的Brettanomyces(Dekkera)bruxellensis检测用捕捉寡核苷酸(SEQ ID NOs 1～14、及23、24)显色(参照图1)。同样，表4表示Brettanomyces(Dekkera)anomala的结果。确认出对于Brettanomyces(Dekkera)anomala，只有17处的Brettanomyces(Dekkera)anomala检测用捕捉寡核苷酸(SEQ ID NOs 7，9及15～29)显色。表5表示酿酒酵母的结果。确认出对于酿酒酵母，只有14处的酵母属检测用捕捉寡核苷酸(SEQ ID NOs 30～43)显色。表6表示糖化酵母的结果。确认出对于糖化酵母，只有14处的酵母属检测用捕捉寡核苷酸(SEQ ID NOs 30～43)显色。表7表示巴斯德酵母的结果。确认出对于巴斯德酵母，14处的酵母属检测用捕捉寡核苷酸(SEQ ID NOs 30～43)的至少5处以上显色。表8表示贝酵母的结果。确认出对于贝酵母，14处的酵母属检测用捕捉寡核苷酸(SEQ ID NOs30～43)的至少5处以上显色。表9表示异常毕赤酵母的结果。确认出对于异常毕赤酵母，只有9处的异常毕赤酵母检测用捕捉寡核苷酸(SEQ ID NOs 44～52)显色。表10表示葡萄酒有孢汉逊酵母的结果。确认出对于葡萄酒有孢汉逊酵母，只有4处的葡萄酒有孢汉逊酵母及季也蒙有孢汉逊酵母检测用捕捉寡核苷酸(SEQ ID NOs 53～56)显色。表11表示季也蒙有孢汉逊酵母的结果。确认出对于季也蒙有孢汉逊酵母，只有4处的葡萄酒有孢汉逊酵母及季也蒙有孢汉逊酵母检测用捕捉寡核苷酸(SEQ ID NOs 53～56)显色。表12表示粗状假丝酵母的结果。确认出对于粗状假丝酵母，只有8处的粗状假丝酵母及膜醭毕赤酵母检测用捕捉寡核苷酸(SEQ ID NOs 57～64)显色。表13表示膜醭毕赤酵母的结果。确认出对于膜醭毕赤酵母，只有8处的粗状假丝酵母及膜醭毕赤酵母检测用捕捉寡核苷酸(SEQ ID NOs 57～64)显色。

(表3)

被测微生物：Brettanomyces(Dekkera)bruxellensis

(表4)

被测微生物：Brettanomyces(Dekkera)anomala

(表5)

被测微生物：酿酒酵母

(表6)

被测微生物：糖化酵母

(表7)

被测微生物：巴斯德酵母

(表8)

被测微生物：贝酵母

(表9)

被测微生物：异常毕赤酵母

(表10)

被测微生物：葡萄酒有孢汉逊酵母

(表11)

被测微生物：季也蒙有孢汉逊酵母

(表12)

被测微生物：粗状假丝酵母

(表13)

被测微生物：膜醭毕赤酵母

以上结果表明，在作为样品使用的各微生物中，只有在固定了各微生物的特异性捕捉寡核苷酸的点样处显色，非特异性显色则完全不存在。因此可说明，本实施例中制备的微生物检测器具是可种特异性检测表2所示的微生物的微生物检测器具。

工业实用性

本发明提供可用简便的操作、快速并且正确地判定被测样品中混入的微生物的微生物检测器具、微生物检测方法及微生物检测试剂盒。因此，本发明可用于食品制造业、饮食行业、药品行业等中的卫生管理、过程管理、品质管理。

序列表

<110>三得利株式会社(Suntory Ltd.)

日清纺织株式会社(Nisshinbo Industries Inc.)

大阪大学(Osaka University)

<120>微生物检测用寡核苷酸及其阵列以及微生物检测器具、检测方法以及检测试剂盒(0ligonucleotides，arrays thereof for detecting microorganisms，and an apparatus，a method and a kit for detecting microorganisms)

<130>PCT06-0053

<150>JP2005-236174

<151>2005-08-16

<160>69

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>探针(Probe)

<400>1

aaggataaaa atacattaaa tt 22

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>探针(Probe)

<400>2

ggataaaaat acattaaatt 20

<210>3

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>探针(Probe)

<400>3

Gcagacacg tggataag 17

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>探针(Probe)

<400>4

ggataatgat ttaaggtttc 20

<210>5

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>探针(Probe)

<400>5

tgatttaagg tttcgg 16

<210>6

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>探针(Probe)

<400>6

tgaggggata atgattt 17

<210>7

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>探针(Probe)

<400>7

ggtttcggcc gttcatt 17

<210>8

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>探针(Probe)

<400>8

gtttcggccg ttcatt 16

<210>9

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>探针(Probe)

<400>9

ggtttcggcc gttcat 16

<210>10

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>探针(Probe)

<400>10

acacgagggt gttttct 17

<210>11

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>探针(Probe)

<400>11

cacgagggtg ttttct 16

<210>12

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>探针(Probe)

<400>12

acacgagggt gttttc 16

<210>13

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>探针(Probe)

<400>13

ccttctcact atttagtg 18

<210>14

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>探针(Probe)

<400>14

ccttctcact atttagt 17

<210>15

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>探针(Probe)

<400>15

agaaacacat gtatgagg 18

<210>16

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>探针(Probe)

<400>16

gaggaaatta tagggag 17

<210>17

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>探针(Probe)

<400>17

taaaacacgc aaaatata 18

<210>18

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>探针(Probe)

<400>18

ccatataaaa cacgcaa 17

<210>19

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>探针(Probe)

<400>19

ctcacttctc tggagtg 17

<210>20

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>探针(Probe)

<400>20

ctggagtggt tatgaga 17

<210>21

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>探针(Probe)

<400>21

cggtagtgtt ttcttga 17

<210>22

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列(A而ficial)

<220>

<223>探针(Probe)

<400>22

gcggtagtgt tttcttgaa 19

<210>23

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>探针(Probe)

<400>23

acaaggtttc ggccg 15

<210>24

<211>14

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>探针(Probe)

<400>24

acaaggtttc ggcc 14

<210>25

<211>13

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>探针(Probe)

<400>25

acaaggtttc ggc 13

<210>26

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>探针(Probe)

<400>26

acaaggtttc gg 12

<210>27

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>探针(Probe)

<400>27

gggagtatac tgggagg 17

<210>28

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>探针(Probe)

<400>28

cggtggggag tatactg 17

<210>29

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>探针(Probe)

<400>29

gggagtatac tgggag 16

<210>30

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>探针(Probe)

<400>30

tattccaaac ggtgaga 17

<210>31

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>探针(Probe)

<400>31

gtgagagatt tctgtgct 18

<210>32

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>探针(Probe)

<400>32

tgtggagttt tcatatc 17

<210>33

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>探针(Probe)

<400>33

tttcatatct ttgcaac 17

<210>34

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>探针(Probe)

<400>34

tttgggcatt cgagca 16

<210>35

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>探针(Probe)

<400>35

ctttgggcat tcgag 15

<210>36

<211>13

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>探针(Probe)

<400>36

gggcattcga gca 13

<210>37

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>探针(Probe)

<400>37

gcattcgagc aatcg 15

<210>38

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>探针(Probe)

<400>38

ggcattcgag caatc 15

<210>39

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>探针(Probe)

<400>39

acacactgtg gagtttt 17

<210>40

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>探针(Probe)

<400>40

aaaaccgttt caataca 17

<210>41

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>探针(Probe)

<400>41

gcaacttttt ctttggg 17

<210>42

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>探针(Probe)

<400>42

tcattaaatt tttgtcaa 18

<210>43

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>探针(Probe)

<400>43

gtcaaaaaca agaatttt 18

<210>44

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>探针(Probe)

<400>44

acacacattg tctagtt 17

<210>45

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>探针(Probe)

<400>45

tattgactta gcaagag 17

<210>46

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>探针(Probe)

<400>46

ctaataagca gtctttc 17

<210>47

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>探针(Probe)

<400>47

cagtctttct gaaataatg 19

<210>48

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>探针(Probe)

<400>48

ctaataagca gtctttct 18

<210>49

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>探针(Probe)

<400>49

gttaaaacct ttaacca 17

<210>50

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>探针(Probe)

<400>50

taggcaggtt tagaagt 17

<210>51

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>探针(Probe)

<400>51

atatcagcta ggcagg 16

<210>52

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>探针(Probe)

<400>52

ggctcggctt aacaaca 17

<210>53

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>探针(Probe)

<400>53

agatctttta caataatgtg ta 22

<210>54

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>探针(Probe)

<400>54

cgaaaggttc aaggcaaa 18

<210>55

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>探针(Probe)

<400>55

cgttttactt tacaagg 17

<210>56

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>探针(Probe)

<400>56

aggcaaaggg ttgcttt 17

<210>57

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>探针(Probe)

<400>57

ccaacaccac actgtgtg 18

<210>58

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>探针(Probe)

<400>58

cacacgtcaa caaaaga 17

<210>59

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>探针(Probe)

<400>59

gtcaacaaaa gatctaaaag 20

<210>60

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>探针(Probe)

<400>60

tgcgcagagc tggccg 16

<210>61

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>探针(Probe)

<400>61

aaacgttgcg gacgaag 17

<210>62

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>探针(Probe)

<400>62

acgttgcgga cgaag 15

<210>63

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>探针(Probe)

<400>63

gccgaaaaga aacgttg 17

<210>64

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>探针(Probe)

<400>64

tacatcggga cgctttg 17

<210>65

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>探针(Probe)

<400>65

cctaatcggc ttagcgtagg 20

<210>66

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>引物(Primer)

<400>66

ttgattacgt ccctgccctt tg 22

<210>67

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>引物(Primer)

<400>67

gatatgctta agttcagcgg 20

<210>68

<211>99

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>探针(Probe)

<400>68

ttgattacgt ccctgccctt tggacgaacg ctggccctac ctaatcgcga tagcgtagga 60

gccacggcta actacgtgcc cgctgaactt aagcatatc 99

<210>69

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>探针(Probe)

<400>69

cctaatcgcg atagcgtagg 20

Claims

1、寡核苷酸，其含有SEQ ID NOs 1～64的核酸序列中的任一个。

2、根据权利要求1所述的寡核苷酸，其作为用于检测被测样品中微生物存在的探针使用。

3、寡核苷酸，其具有含有SEQ ID NOs 1～64中任一个序列的核酸序列，所述寡核苷酸可与属于从以下微生物组(i)～(vii)中选择的一组微生物核酸序列的互补序列杂交或可与每组都由选自组(i)～(vii)中的多个微生物组成的多个组中的微生物的核酸的互补链特异性杂交：

(i)属于Brettanomyces(Dekkera)bruxellensis的微生物，

(ii)属于Brettanomyces(Dekkera)anomala的微生物，

(iii)属于酿酒酵母、糖化酵母、巴斯德酵母或贝酵母的微生物，

(iv)属于异常毕赤酵母的微生物，

(v)属于葡萄酒有孢汉逊酵母或季也蒙有孢汉逊酵母的微生物，及

(vi)属于粗状假丝酵母或膜醭毕赤酵母的微生物，以及

4、寡核苷酸阵列，其用于检测被测样品中微生物的存在，具有固定于支持物上、含有从SEQ ID NOs 1～64的核酸序列所组成的组中选择的任一个核酸序列的至少一个寡核苷酸。

5、寡核苷酸阵列，其用于检测被测样品中微生物的存在，具有固定于支持物上的以下(A)～(G)中的任一个或(A)～(G)中的任意组合：

(G)含有从SEQ ID NOs 7、9、23及24的核酸序列所组成的组中选择的任一个核酸序列的至少一个寡核苷酸。

6、根据权利要求5所述的寡核苷酸阵列，其具有至少所述(A)的寡核苷酸。

7、根据权利要求6所述的寡核苷酸阵列，其中，所述微生物属于Brettanomyces(Dekkera)bruxellensis。

8、根据权利要求5所述的寡核苷酸阵列，其具有至少所述(B)的寡核苷酸。

9、根据权利要求8所述的寡核苷酸阵列，其中，所述微生物属于Brettanomyces(Dekkera)anomala。

10、根据权利要求5所述的寡核苷酸阵列，其具有至少所述(C)的寡核苷酸。

11、根据权利要求10所述的寡核苷酸阵列，其中，所述微生物属于酿酒酵母、糖化酵母、巴斯德酵母或贝酵母。

12、根据权利要求5所述的寡核苷酸阵列，其具有至少所述(D)的寡核苷酸。

13、根据权利要求12所述的寡核苷酸阵列，其中，所述微生物属于异常毕赤酵母。

14、根据权利要求5所述的寡核苷酸阵列，其具有至少所述(E)的寡核苷酸。

15、根据权利要求14所述的寡核苷酸阵列，其中，所述微生物属于葡萄酒有孢汉逊酵母或季也蒙有孢汉逊酵母。

16、根据权利要求5所述的寡核苷酸阵列，其具有至少所述(F)的寡核苷酸。

17、根据权利要求16所述的寡核苷酸阵列，其中，所述微生物属于粗状假丝酵母或膜醭毕赤酵母。

18、根据权利要求5所述的寡核苷酸阵列，其具有至少所述(G)的寡核苷酸。

19、根据权利要求18所述的寡核苷酸阵列，其中，所述微生物属于Brettanomyces(Dekkera)bruxellensis或属于Brettanomyces(Dekkera)anomala。

20、根据权利要求4～19中任一项所述的寡核苷酸阵列，其中，所述被测样品是食品。

21、器具，其用于检测和/或鉴定被测样品中的微生物是从以下的微生物组(i)～(vii)中选择的任一组中的微生物或多个组中的微生物：

(i)属于Brettanomyces(Dekkera)bruxellensis的微生物，

(ii)属于Brettanomyces(Dekkera)anomala的微生物，

(iv)属于异常毕赤酵母的微生物，

(vi)属于粗状假丝酵母或膜醭毕赤酵母的微生物，及

(vii)属于Brettanomyces(Dekkera)bruxellensis或Brettanomyces(Dekkera)anomala的微生物，

其中所述的器具具有将可与属于所选择的一组的微生物核酸的互补链特异性杂交的至少1个寡核苷酸或可与属于所选择的多组中的任一组的微生物核酸的互补链特异性杂交的至少2个寡核苷酸固定的支持物。

22、根据权利要求21所述的器具，其中，可与属于所述组(i)的微生物核酸的互补链特异性杂交的寡核苷酸是含有从SEQ ID NOs 1～6、8及10～14的核酸序列所组成的组中选择的任一个核酸序列的寡核苷酸。

23、根据权利要求21所述的器具，其中，可与属于所述组(ii)的微生物核酸的互补链特异性杂交的寡核苷酸是含有从SEQ ID NOs 15～22及25～29的核酸序列所组成的组中选择的任一个核酸序列的寡核苷酸。

24、根据权利要求21所述的器具，其中，可与属于所述组(iii)的微生物核酸的互补链特异性杂交的寡核苷酸是含有从SEQ ID NOs 30～43的核酸序列所组成的组中选择的任一个核酸序列的寡核苷酸。

25、根据权利要求21所述的器具，其中，可与属于所述组(iv)的微生物核酸的互补链特异性杂交的寡核苷酸是含有从SEQ ID NOs 44～52的核酸序列所组成的组中选择的任一个核酸序列的寡核苷酸。

26、根据权利要求21所述的器具，其中，可与属于所述组(v)的微生物核酸的互补链特异性杂交的寡核苷酸是含有从SEQ ID NOs 53～56的核酸序列所组成的组中选择的任一个核酸序列的寡核苷酸。

27、根据权利要求21所述的器具，其中，可与属于所述组(vi)的微生物核酸的互补链特异性杂交的寡核苷酸是含有从SEQ ID NOs 57～64的核酸序列所组成的组中选择的任一个核酸序列的寡核苷酸。

28、根据权利要求21所述的器具，其中，可与属于所述组(vii)的微生物核酸的互补链特异性杂交的寡核苷酸是含有从SEQ ID NOs 7、9、23及24的核酸序列所组成的组中选择的任一个核酸序列的寡核苷酸。

29、根据权利要求21～28中任一项所述的器具，其中所述支持物表面具有碳二亚胺基或异氰酸酯基，所述器具的特征在于，通过该碳二亚胺基或异氰酸酯基与所述寡核苷酸或寡核苷酸末端附加的接头反应形成共价键，将所述寡核苷酸固定于所述支持物上。

30、方法，其是用于进行被测样品中微生物的检测、被测样品中微生物所属组的鉴定、或被测样品中微生物的检测和该微生物所属组的鉴定的方法，包括：

制备被测样品中微生物核酸的核酸制备工序，

以该核酸为模板制备标记探针的探针制备工序，

使用权利要求1～3中任一项所述的寡核苷酸、权利要求4～20中任一项所述的寡核苷酸阵列或权利要求21～29中任一项所述的器具，使固定于支持物表面的寡核苷酸与所述标记探针进行杂交的杂交工序，以及

检测杂交信号的信号检测工序。

31、根据权利要求30所述的方法，其中所述被测样品是食品。

32、试剂盒，其是用于实施权利要求30或31所述方法的微生物检测试剂盒，其包含权利要求1～3中任一项所述的寡核苷酸、权利要求4～20中任一项所述的阵列或权利要求21～29中任一项所述的器具。

33、根据权利要求32所述的试剂盒，其进一步包含所述杂交工序及信号检测工序中使用的试剂。

34、根据权利要求32或33所述的试剂盒，其进一步包含所述探针制备工序和/或所述核酸制备工序中使用的试剂。