KR101424141B1 - 산토모나스 베시콜라 홀시콜라 동정방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 산토모나스 베시콜라 홀시콜라(Xanthomonas vasicola pv. holicola) 동정방법에 관한 것으로 보다 상세하게는 시료로부터 분리한 23S rRNA의 염기를 확인하여 산토모나스 베시콜라 홀시콜라(Xanthomonas vasicola pv. holicola) 를 동정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 산토모나스 베시콜라 홀시콜라(Xanthomonas vasicola pv. holicola) 동정 방법 및 산토모나스 베시콜라 홀시콜라(Xanthomonas vasicola pv. holicola) 동정용 프로브를 이용할 경우, 산토모나스 속(Xanthomonas) 으로 부터 산토모나스 베시콜라 홀시콜라(Xanthomonas vasicola pv. holicola) 를 효과적으로 동정 할 수 있다.

Description

산토모나스 베시콜라 홀시콜라 동정방법{Method of identifying Xanthomonas vasicola pv. holicola}
본 발명은 산토모나스 베시콜라 홀시콜라(Xanthomonas vasicola pv. holicola) 동정방법에 관한 것으로 보다 상세하게는 시료로부터 분리한 23S rRNA의 염기를 확인하여 산토모나스 베시콜라 홀시콜라(Xanthomonas vasicola pv. holicola)를 동정하는 방법에 관한 것이다.
산토모나스 속(Xanthomonas)은 토양질소의 탈질에 관여하는 세균이다. 여기에는 병원성 세균으로서 복숭아나무 세균성구멍병, 무 검은빛썩음병, 감귤 궤양병, 벼흰빛잎마름병, 강남콩 불마름병 등을 일으키는 것도 있다.
산토모나스 베시콜라 홀시콜라(Xanthomonas vasicola pv. holicola)는 프로테오박테리아(Proteobacteria) 종(species)이다. 이 식물병원세균은 바나나에 궤양병을 유발한다.
식물 병원세균의 유전자 동정방법으로는 Dot-blot, 중합효소 연쇄반응(PCR) 등의 방법이 이용된다. 특히 PCR은 Dot-blot 방법보다 시간, 노력, 인력 등이 경제적이기 때문에 최근 널리 사용되고 있는 방법이다. PCR(중합효소 연쇄반응, polymerase chain reaction) 동정 방법은 10~20bp로 구성된 특정 DNA 단편(프라이머)을 세균의 게놈유전자(genomic DNA)에 접촉(annealing)한 후 내열성 DNA 중합효소(Taq polymerase)를 첨가하고 합성반응을 반복적으로 행하게 되면, 프라이머가 결합된 영역이 급속히 증폭하게 되며, 그 PCR 증폭산물을 아가로스 젤(agarose gel) 또는 아크릴아마이드 젤(acrylamide gel)에 전기영동하고 에티디움 브로마이드(ethidium bromide) 및 은 염색(silver stain)으로 DNA를 염색한 후 나타나는 DNA 밴드의 유무 혹은 형태의 차이와 같은 세균종의 DNA 다형성을 동정 동정하는 방법이다. 현재, 이러한 PCR에 의한 세균의 동정법은 인체나 동물의 세균성 질병을 동정에 주로 이용되나, 최근에는 식물 병원균을 동정할 수 있도록 PCR 동정법이 개발되어 병의 동정과 함께 수출입 농산물의 검역에 이용되고 있다. 또한, PCR 동정 방법은 다른 방법에 비해 소요되는 시간이 짧고, 동정에 소요되는 비용이 저렴하며 또한, 많은 샘플을 동시에 검정할 수 있어 경제적이다. 이에 최근에는 산토모나스(Xanthomonas) 동정방법 중에서 유전물질인 핵산을 증폭하는 PCR 동정 방법이 가장 선호되고 있다.
그러나 기존의 PCR 동정 방법으로는 유전적 유사도로 인한 종간 구분의 어려움이 있어서 이를 극복할 수 있는 해결책이 필요한 실정이다.
기존의 산토모나스 속 미생물 중, 벼흰잎마름병원균(Xanthomonas oryzae pv. oryzae), 세균성점무늬병원균 (Xanthomonas campestris pv. vesicatoria), 십자화과 흑부병원균(Xanthomonas campestris pv. campestris), 감귤류 궤양병 병원균(Xanthomonas axonopodis pv. citri) 및 콩불마름병원균(Xanthomonas axonopodis pv. glycines) 등 다양한 미생물의 동정에 사용되는 개별적인 PCR 프라이머에 대한 연구는 이루어졌으나, 산토모나스 속(Xanthomonas) 으로부터 산토모나스 베시콜라 홀시콜라(Xanthomonas vasicola pv. holicola) 를 동정해내는 방법에 대하여는 아직까지 연구된 바 없다. 식물병원세균간의 종 또는 병원형 특이적 염기 및 염기 조합을 통해 산토모나스 베시콜라 홀시콜라(Xanthomonas vasicola pv. holicola) 를 동정할 수 있는 방법 개발이 요구 된다.
이에 본 발명의 발명자들은 산토모나스 속(Xanthomonas) 으로부터 산토모나스 베시콜라 홀시콜라(Xanthomonas vasicola pv. holicola) 를 더 정확하고 신속하게 동정을 하기 위해 연구하던중, 산토모나스 속 세균의 23S rRNA 염기서열의 차이를 발견하여 이를 이용한 동정방법을 개발하였다.
따라서 본 발명의 목적은, (a) 시료로부터 23S rRNA를 분리하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 분리한 23S rRNA의 염기서열을 확인하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계에서 확인된 염기서열이 서열번호 1의 78번째 염기 G, 서열번호 1의 86번째 염기 C, 서열번호 1의 740번째 염기 A, 서열번호 1의 1735번째 염기 T, 서열번호 1의 2626번째 염기 C, 서열번호 1의 2649번째 염기 T, 서열번호 1의 2715번째 염기 C, 서열번호 1의 2737번째 염기 G인 경우 산토모나스 베시콜라 홀시콜라(Xanthomonas vasicola pv. holicola)로 판단하는 단계를 포함하는 산토모나스 베시콜라 홀시콜라(Xanthomonas vasicola pv. holicola) 동정방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서, 서열번호 1의 78번째 염기 G를 포함하는 20-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 1의 86번째 염기 C를 포함하는 20-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 1의 740번째 염기 A를 포함하는 20-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 1의 1735번째 염기 T를 포함하는 20-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 1의 2626번째 염기 C를 포함하는 20-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 1의 2649번째 염기 T를 포함하는 20-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 1의 2715번째 염기C를 포함하는 20-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 1의 2737번째 염기 G를 포함하는 20-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 및 이들의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 산토모나스 베시콜라 홀시콜라(Xanthomonas vasicola pv. holicola) 동정용 프로브를 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 산토모나스 베시콜라 홀시콜라(Xanthomonas vasicola pv. holicola) 동정방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 산토모나스 베시콜라 홀시콜라(Xanthomonas vasicola pv. holicola) 동정용 프로브를 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 산토모나스 산토모나스 베시콜라 홀시콜라(Xanthomonas vasicola pv. holicola) 동정방법에 관한 것이다.
즉, 본 발명은 산토모나스 속(Xanthomonas) 의 23S rRNA 유전자의 염기조합을 확보하여 산토모나스 베시콜라 홀시콜라(Xanthomonas vasicola pv. holicola) 를 동정한다.
보다 구체적으로 본 발명의 산토모나스 베시콜라 홀시콜라(Xanthomonas vasicola pv. holicola) 동정방법은 (a) 시료로부터 23S rRNA를 분리하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 분리한 23S rRNA의 염기서열을 확인하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계에서 확인된 염기서열이 서열번호 1의 78번째 염기 G, 서열번호 1의 86번째 염기 C, 서열번호 1의 740번째 염기 A, 서열번호 1의 1735번째 염기 T, 서열번호 1의 2626번째 염기 C, 서열번호 1의 2649번째 염기 T, 서열번호 1의 2715번째 염기 C, 서열번호 1의 2737번째 염기 G인 경우 산토모나스 베시콜라 홀시콜라(Xanthomonas vasicola pv. holicola) 로 판단하는 단계를 포함하는 특징이 있다.
또한 본 발명은 유전자 염기 조합으로 구성된 산토모나스 베시콜라 홀시콜라(Xanthomonas vasicola pv. holicola) 동정용 프로브를 제공한다.
즉, 본 발명은 산토모나스 속(Xanthomonas) 의 23S rRNA 유전자의 염기조합을 확보하여 산토모나스 베시콜라 홀시콜라(Xanthomonas vasicola pv. holicola) 를 동정한다.
보다 구체적으로 본 발명의 산토모나스 베시콜라 홀시콜라(Xanthomonas vasicola pv. holicola) 동정용 프로브는 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서, 서열번호 1의 78번째 염기 G를 포함하는 20-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 1의 86번째 염기 C를 포함하는 20-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 1의 740번째 염기 A를 포함하는 20-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 1의 1735번째 염기 T를 포함하는 20-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 1의 2626번째 염기 C를 포함하는 20-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 1의 2649번째 염기 T를 포함하는 20-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 1의 2715번째 염기 C를 포함하는 20-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 1의 2737번째 염기 G를 포함하는 20-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 및 이들의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것이 특징이다.
본 발명에서 상기 (a) 단계에서 핵산의 분리는 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 따라 수행될 수 있으며, 상업적으로 판매되는 추출 키트를 이용하여 수행할 수 있다.
또한 상기 (b) 단계에서 염기서열은 당업계에 공지된 자동 또는 수동의 염기서열 분석방법에 따라 수행될 수 있으며, 바람직하게는 검사체 또는 시료를 대상으로 PCR을 수행하여 23S rRNA에 상응하는 PCR 산물을 제조한 다음 이의 서열을 공지의 염기서열 분석방법에 따라서 분석하여 수행할 수 있다.
상기 (c) 단계에서는 서열번호 1을 기준으로 본 발명의 미생물에서의 판단점에 해당하는 염기서열을 확인하여 본 발명의 미생물에 해당하는지 여부를 판별할 수 있다.
한편, 본 발명은 본 발명의 프로브가 기질상에 집적되어 있는 것을 특징으로 하는 본 발명의 미생물의 검출용 마이크로어레이를 제공한다. 상기 마이크로어레이는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 마이크로어레이로 이루어지며, 마커로 사용되는 폴리뉴클레오티드를 기관 상에 고정화하여 마이크로어레이를 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 미생물의 검출용 마커로서 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 가지는 뉴클레오티드에서, 본 발명의 미생물의 판단점에 해당하는 각각의 염기가 치환된 것을 특징으로 하는 검출용 마커를 제공한다. 상기 판단점은 표 3에 기재된 바와 같다.
본 발명의 뉴클레오티드, 프로브 또는 마커는 DNA 또는 RNA일 수 있으며, RNA의 경우 서열에 기재된 티민이 우라실로 대체되는 것은 당업자에게 자명하다.
따라서, 본 발명의 산토모나스 베시콜라 홀시콜라(Xanthomonas vasicola pv. holicola) 동정 방법 및 산토모나스 베시콜라 홀시콜라(Xanthomonas vasicola pv. holicola) 동정용 프로브를 이용할 경우, 산토모나스 속(Xanthomonas) 으로 부터 산토모나스 베시콜라 홀시콜라(Xanthomonas vasicola pv. holicola) 를 효과적으로 동정 할 수 있다.
도 1은 산토모나스 켐페스트리스 켐페스트리스(Xanthomonas campestris pv. campestris), 산토모나스 베시콜라 홀시콜라(Xanthomonas vasicola pv. holicola) 의 염기서열 비교분석 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1>
X. vasicola pv . holcicola 및 그 병원종들의 23S rRNA 분석
하기 실험 방법을 통하여, Xanthomonas속 세균에 대한 동정용 프로브를 설계하였다. 본 발명에서 사용한 전체 RNA 분리 및 염기서열 증폭, 분석방법은 다음과 같다.
<1-1> 균들의 23S rRNA 증폭
X. vasicola pv. holcicola의 DNA를 분리한 후, 산토모나스(Xanthomonas) 속 세균의 23s rRNA를 분리할 수 있는 하기 [표 1]과 같은 프라이머 쌍들을 이용하여, PCR을 수행하였다.
프라이머 명칭 프라이머 서열
Xan23SF5 (전방향) 5‘-TGGTCAAGCCGCACGGATCATTAGTAT-3’
Xan23SR6 (역방향) 5‘-ACGTGGATAGCCTGCGAAAAGTGTC-3’
Xan23SF9 (전방향) 5‘-GTCAAGCCGCACGGATCATTAGTAT-3’
Xan23SR9 (역방향) 5-GTCGGGGAGCTGGCAACAAG-3'
X-23S-F7 5‘-GAGACCGCCCCAGTCAAACTAC-3’
X-23S-R7 5‘-ACCTTTTGTATAATGGGTCAACG-3’
PCR 반응은 분리한 전체 DNA 20 ng, 다운스트림 프라이머(downstream primer) 10 pmole , 업스트림프라이머(upstream primer) 10 pmole ,Taq DNA polymerase 0.2 U , 10배 중합효소연쇄반응 완충액(100 mM Tris-HCl, 500 mM KCl, 15 mM MgCl2, pH 8.3) 5 ㎕를 첨가하고 증류수를 첨가하여 반응액을 50 ㎕로 만들었다.
이 반응액을 95℃에서 5분 동안 가열 후, 95℃ 30 초, 65℃ 60 초, 72℃ 180초로 30 회 증폭시켰으며 마지막에는 72℃에서 10 분간 PCR 기계 (DNA Engine PTC-200)에서 처리하였다. 증폭 후 PCR 산물은 1× TBE 완충액과 1.5 % 아가로즈 겔을 사용하여 전기영동한 후 ethidium bromide로 염색한 후 ultraviolet lamp에서 확인하였다.
<1-2> 증폭한 23s rRNA 서열 분석
상기 실시예 <1-1>에서 얻은 PCR 산물들의 염기서열은 BioEdit Sequence Alignment Editor를 이용하여 분석하였다.
분석한 후, X. campestris pv. campestris 의 23s rRNA 염기서열과 비교해보았다. X. campestris pv. campestris 23s rRNA 염기서열은 Genbank에 게재된 정보(NC_003902.1)를 이용하였다. 본 실험에서 사용한 균들의 23s rRNA 서열들은 하기 [표 2]와 같이 서열번호로 정리하였다.
서열번호 균
1 X. campestris pv. campestris
2 X. vasicola pv. holcicola
< 실시예 2>
균들간의 23s rRNA 서열 비교 분석
상기 [표 2]의 서열번호 1 내지 2 간에 염기서열 차이를 비교해보았다. 염기서열은 BioEdit Sequence Alignment Editor를 이용하여 비교하였다.
분석 결과는 [도 1]에 기재하였고, X. campestris pv. campestris의 염기서열(서열번호 1)을 기준으로 X. vasicola pv. holcicola 과의 염기서열 차이가 있는 위치를 하기 [표 3]에 정리하였다.
서열번호에서의 위치 염기
서열번호 1의 78번째 G
서열번호 1의 86번째 C
서열번호 1의 740번째 A
서열번호 1의 1735번째 T
서열번호 1의 2626번째 C
서열번호 1의 2649번째 T
서열번호 1의 2715번째 C
서열번호 1의 2737번째 G
따라서 상기 [표 3]에 나타난 염기의 차이를 이용하여 균들을 동정할 수 있다.
이상 살펴본 바와 같이 본 발명의 산토모나스 베시콜라 홀시콜라(Xanthomonas vasicola pv. holicola) 동정 방법 및 산토모나스 베시콜라 홀시콜라(Xanthomonas vasicola pv. holicola) 동정용 프로브를 이용할 경우, 산토모나스 속(Xanthomonas) 으로 부터 산토모나스 베시콜라 홀시콜라(Xanthomonas vasicola pv. holicola) 를 효과적으로 동정 할 수 있으므로, 산업상 이용가능성이 높다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (4)

  1. (a) 산토모나스 속의 시료로부터 23S rRNA를 분리하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계에서 분리한 23S rRNA의 염기서열을 확인하는 단계; 및
    (c) 상기 (b) 단계에서 확인된 염기서열이 서열번호 1의 78번째 염기 G, 서열번호 1의 86번째 염기 C, 서열번호 1의 740번째 염기 A, 서열번호 1의 1735번째 염기 T, 서열번호 1의 2626번째 염기 C, 서열번호 1의 2649번째 염기 T, 서열번호 1의 2715번째 염기 C, 서열번호 1의 2737번째 염기 G인 경우 산토모나스 베시콜라 홀시콜라(Xanthomonas vasicola pv. holicola) 로 판단하는 단계를 포함하는 산토모나스 베시콜라 홀시콜라(Xanthomonas vasicola pv. holicola) 동정방법.
  2. 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서, 서열번호 1의 78번째 염기 G를 포함하는 20-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 1의 86번째 염기 C를 포함하는 20-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 1의 740번째 염기 A를 포함하는 20-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 1의 1735번째 염기 T를 포함하는 20-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 1의 2626번째 염기 C를 포함하는 20-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 1의 2649번째 염기 T를 포함하는 20-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 1의 2715번째 염기 C를 포함하는 20-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 1의 2737번째 염기 G를 포함하는 20-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 및 이들의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 산토모나스 베시콜라 홀시콜라(Xanthomonas vasicola pv. holicola) 동정용 프로브.
  3. 제2항의 프로브가 기질상에 집적되어 있는 것을 특징으로 하는 산토모나스 베시콜라 홀시콜라(Xanthomonas vasicola pv. holicola) 동정용 마이크로어레이.
  4. 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 가지는 뉴클레오티드에서, 서열번호 1의 78번째 염기 G, 서열번호 1의 86번째 염기 C, 서열번호 1의 740번째 염기 A, 서열번호 1의 1735번째 염기 T, 서열번호 1의 2626번째 염기 C, 서열번호 1의 2649번째 염기 T, 서열번호 1의 2715번째 염기 C, 서열번호 1의 2737번째 염기 G로 치환된 것을 특징으로 하는 산토모나스 베시콜라 홀시콜라(Xanthomonas vasicola pv. holicola) 동정용 마커.
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