KR100288868B1 - 참다래궤양병균동정용프로브및프라이머와이를이용한참다래궤양병진단방법 - Google Patents

참다래궤양병균동정용프로브및프라이머와이를이용한참다래궤양병진단방법 Download PDF

Info

Publication number
KR100288868B1
KR100288868B1 KR1019980029758A KR19980029758A KR100288868B1 KR 100288868 B1 KR100288868 B1 KR 100288868B1 KR 1019980029758 A KR1019980029758 A KR 1019980029758A KR 19980029758 A KR19980029758 A KR 19980029758A KR 100288868 B1 KR100288868 B1 KR 100288868B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
ulcer
fragment
oyster
probe
actinidiae
Prior art date
Application number
KR1019980029758A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20000009387A (ko
Inventor
노일섭
고영진
Original Assignee
고영진
노일섭
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 고영진, 노일섭 filed Critical 고영진
Priority to KR1019980029758A priority Critical patent/KR100288868B1/ko
Publication of KR20000009387A publication Critical patent/KR20000009387A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100288868B1 publication Critical patent/KR100288868B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2531/00—Reactions of nucleic acids characterised by
    • C12Q2531/10—Reactions of nucleic acids characterised by the purpose being amplify/increase the copy number of target nucleic acid
    • C12Q2531/113—PCR
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2535/00—Reactions characterised by the assay type for determining the identity of a nucleotide base or a sequence of oligonucleotides
    • C12Q2535/139—Random amplification polymorphism detection [RAPD]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 참다래 궤양병균(Pseudomonas syringae Pv. actinidiae) 19균주와 속, 종 및 병원형이 상이한 유사세균 10균주들을 RAPD 분석하여 궤양병균 특이적 단편을 검출하고(약 670bp) 이 단편을 pGEM-T 벡터에 삽입하여 대장균을 형질전환시킨 후 배양하여 클로닝하므로써 단편(668bp)을 얻고 이 단편의 염기서열을 결정한 후 프로브로하여 서던 블롯 분석한 결과, 참다래 궤양병균 병원형 특이적 단편을 검출하여 참다래 궤양병균 동정용 프로브임을 확인하고 상기 클로닝한 단편의 염기서열를 기초로 제작한 전진 프라이머(forward primer) 및 역전사 프라이머(reverse primer)로 콜로니-PCR을 행한 결과, 참다래 궤양병을 조기에 간단하고 정확하게 진단하는 뛰어난 효과가 있다.

Description

참다래 궤양병균 동정용 프로브 및 프라이머와 이를 이용한 참다래 궤양병 진단방법
본 발명은 참다래 궤양병균 동정용 프로브(probe)와 프라이머(primer)에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 참다래 궤양병균 병원형 특이적 단편의 염기서열을 결정하여 이를 프로브로한 후 이 염기서열을 기초로 하여 콜로니-PCR법으로 참다래 궤양병균을 동정하기 위한 프라이머 제작 및 이를 이용한 참다래 궤양병 진단에 관한 것이다.
1980년대 초부터 우리나라에서 본격적으로 재배되기 시작한 참다래는 도입당시 병 방제가 필요없는 무병과수로 농가에 인식되었다. 그러나 최근 궤양병이 발생하여 일부 과수원을 폐원시킬 만큼 참다래 재배의 가장 큰 제한요인으로 대두되었고 시급히 조기에 방제하지 않으면 안되는 상황이 되었다. 참다래 궤양병은 감염 후 2 ~ 3년간의 잠복기를 거쳐 병징이 나타나는 특수성 때문에 감염초기에는 육안 진단이 불가능하다. 또한 발병후에는 방제가 어렵고, 병원세균의 생리, 생화학적 동정에는 몇 개월이 소요되어 방제시기를 놓치게 된다.
본 발명자들은 참다래 궤양병 병원균의 특이적인 분자 마커를 이용하여 참다래 궤양병균을 생리적으로 동정하고자 연구하였다. 참다래 궤양병균의 생리적 동정은 시간, 노력, 비용이 많이 소요되며 정확성에도 문제가 있었다. 따라서 본 발명자들은 이들 문제점을 보완하고 조기에 병원균을 동정하고자 콜로니-PCR(Colony-PCR)법을 연구하였으며 이에 사용되는 프라이머 및 프로브를 합성하였다.
본 발명의 목적은 참다래 병원균 동정을 위한 프로브와 프라이머를 제공함에 있다. 본 발명의 다른 목적은 참다래 궤양병원균 병원형 특이적 단편의 염기서열을 프로브로 제공하고 이 염기서열의 정보를 기초로하여 프라이머를 제작한 후 콜로니-PCR을 행하므로써 참다래 궤양병을 조기에 간단하고 정확하게 진단하는 방법을 제공함에 있다.
본 발명의 상기 목적은 랜덤 프라이머(random primer)를 이용한 RAPD 기술에 의하여 참다래 궤양병원균 병원형 특이적 단편을 선발하고, 클로닝한 후 염기서열을 시퀀싱하여 프로브(probe)화하고 상기 참다래 궤양병균 병원형 특이적 단편의 염기서열 정보를 기초로하여 전진 프라이머(Forward primer) 및 역전사 프라이머(Reverse primer)를 합성한 후 이들 전진프라이머 및 역전사 프라이머를 이용하여 콜로니-PCR을 수행하므로써 달성하였다.
이하 본 발명의 구성 및 작용을 상세히 설명하고자 한다.
도 1은 참다래 궤양병균 19균주와 종, 속이 다른 유사세균 10균주들을 RAPD 분석한 결과를 나타낸 사진도이다.
도 2는 약 670bp의 참다래 궤양병균 특이적 단편을 회수하여 아가로스 겔에 분획한 결과를 나타낸 사진도이다.
도 3은 참다래 궤양병균과 유사세균을 프라이머 C24를 이용하여 RAPD 분석하고 서던 블롯 분석한 결과를 나타낸다.
도 4는 참다래 궤양병균과 종명은 동일하고 병원형이 다른 균주를 프라이머 C24를 이용하여 RAPD 분석하고 서던 블롯 분석한 결과를 나타낸다.
도 5는 pGEM-T 벡터 프로모터와 복합 클로닝 염기서열을 나타낸다.
도 6은 이.콜라이(E.coli)를 형질전환시키기 위한 pGEM-T 벡터 지도를 나타낸다.
도 7은 클로닝한 단편의 염기서열을 나타낸다.
도 8은 참다래 궤양병균과 병원형 및 종이 상이한 균주의 게놈 DNA를 서던 블롯 분석한 결과를 나타낸다.
도 9는 참다래 궤양병균과 유사세균의 게놈 DNA를 본 발명의 프라이머로 PCR 실험한 결과를 나타낸다.
본 발명은 참다래 궤양병균(Pseudomonas syringae Pv. actinidiae) 19균주와 속, 종 및 병원형이 상이한 유사세균 10균주들의 게놈 DNA를 추출하는 단계; 추출한 게놈 DNA를 PCR로 증폭하고 증폭된 염기서열 단편들을 RAPD 분석에 의해 궤양병균 병원형 특이적 단편을 검출하는 단계; 상기 검출된 궤양병균 병원형 특이적 단편을 벡터에 삽입하여 대장균을 형질전환시킨 후 배양하여 클로닝한 후 염기서열을 결정하는 단계; 염기서열이 결정된 클로닝 단편을 프로브(probe)로 사용하여 참다래 궤양병균과 병원형 및 종이 상이한 균주들로부터 게놈 DNA를 서던 블롯 분석(southern blot)하여 참다래 궤양병균 병원형 특이적 프로브로서의 유용성을 검증하는 단계; 상기 클로닝 단편의 염기서열을 기초로하여 참다래 궤양병균 동정용 프라이머(primers)를 합성하고 콜로니-PCR법을 수행하여 신속, 정확하게 참다래 궤양병을 진단하는 단계로 구성된다.
이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정하는 것은 아니다.
실시예 1: 게놈 DNA 추출
참다래 궤양병균은 전남, 남해 일대에서 채집하여 20℃에서 배양하였으며 바이오로그(Biolog)로 동정하였다. 참다래 궤양병균 19균주와 병원형, 종, 속이 다른 유사세균 10균주들은 하기 표 1에 나타낸 바와 같으며 이들 게놈 DNA를 알카라인 라이시스(alkaline lysis)로 추출하였다.
참다래 궤양병균 19균주와 병원형 또는 종이 다른 유사세균 10균주
번 호 계 통 종 명
1 SUPP-319 P.s. pv. 악티니디아(actinidiae)
2 PaOA 3 P.s. pv. 악티니디아(actinidiae)
3 PaTD 1 P.s. pv. 악티니디아(actinidiae)
4 NO 12 P.s. pv. 악티니디아(actinidiae)
5 NO 20 P.s. pv. 악티니디아(actinidiae)
6 NO 26 P.s. pv. 악티니디아(actinidiae)
7 95 JSI 1 P.s. pv. 악티니디아(actinidiae)
8 95 JCR 2 P.s. pv. 악티니디아(actinidiae)
9 95 JAP 15 P.s. pv. 악티니디아(actinidiae)
10 95 JAP 40 P.s. pv. 악티니디아(actinidiae)
11 95 WH 1 P.s. pv. 시린가(syringae)
12 95 W 7 P.s. pv. 모스포루노룸(morsporunorum)
13 95 BC 5 P. 소란아세룸(solanacearum)
14 95 BC 23 P. 치코리(cichorii)
15 95 SH 24 P. 코룬가타(corrugata)
16 95 SH 16 P. 무시도렌스(mucidolens)
17 95 SH 12 P. 토라시(tolaasii)
18 95 WH 39 어르위니아 아미로보라(Erwinia amylovora)
19 95 WH 31 E. 카로토보라(carotovora)
20 95 W 1 칸토모나스 오리자(Xanthomonas oryzae)
21 SUPP-350 P.s. pv. 악티니디아(actinidiae)
22 PaIA 21 P.s. pv. 악티니디아(actinidiae)
23 PaNa 2 P.s. pv. 악티니디아(actinidiae)
24 PaIB 1 P.s. pv. 악티니디아(actinidiae)
25 NO 5 P.s. pv. 악티니디아(actinidiae)
26 NO 15 P.s. pv. 악티니디아(actinidiae)
27 95 JAP 14 P.s. pv. 악티니디아(actinidiae)
28 95 JAP 51 P.s. pv. 악티니디아(actinidiae)
29 95 JAP 61 P.s. pv. 악티니디아(actinidiae)
실시예 2: 게놈 DNA의 PCR 반응 및 RAPD 분석에 의한 궤양병균 병원형 특이적 단편 검출
상기 실시예 1에서 얻은 게놈 DNA를 PCR로 증폭하였다. 증폭조건은 94℃에서 15초간 디네츄레이션(denaturation), 45℃에서 30초간 어닐링(annealing), 72℃에서 90초간 익스텐션(extention)을 47 사이클 실시한 후 후기 익스텐션(post-extention)을 5분간 실시하였다. 이어서 40여종의 오페론 키트(operon kit) A, B와 120여종의 와코 키트(Wako kit) A, C 총 160종의 랜덤 프라이머(random primer)를 사용하여 궤양병균 병원형 특이적 DNA 단편을 검출하고 이들 단편을 유전자 클린 Ⅱ(gene clean Ⅱ kit; BIO 101사, USA)로 회수하였다. 실험결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 공시한 29균주들을 대상으로 RAPD 분석에 이용한 랜덤 프라이머(random primer) 중 프라이머 C24(waco, japan)에서 약 670bp의 참다래 궤양병균 병원형 특이적 단편이 증폭되었고 유사 세균들에서는 약 670bp의 단편이 증폭되지 않았다. 도 2에는 약 670bp의 참다래 궤양병균 병원형 특이적 단편을 유전자 클린 Ⅱ 키트로 회수하여 0.8% 아가로스 겔에 분획한 결과를 나타냈다. 회수한 단편과 반응하는 단편의 존재유무를 확인하기 위하여 회수한 산물을 DIG-라벨링(labelling)한 프로브로 이용하여 29균주들의 PCR 산물에 대하여 서던 블롯(southern blot) 분석하였다. 도 3의 A는 29공시 균주들을 프라이머 C24로 증폭한 RAPD 패턴이고 B는 서던 블롯한 결과를 나타낸 것으로 서던 블롯 상에서 참다래 궤양병균 병원형 특이적인 670bp 단편이 검출되었고 또한 RAPD 패턴에서 육안으로 식별되지 않은 약 300bp의 단편이 검출되었다. 그러나 유사세균에서는 상기 약 300bp의 단편이 검출되지 않았다. 따라서 프라이머 C24로 증폭되는 염기서열이 유사세균의 게놈상에는 없음을 알 수 있었다. 이어서 실시한 프라이머 C24로 증폭되는 염기서열이 궤양병균과 종명은 동일하고 병원형이 다른 균주를 공시하여 프라이머 C24를 이용하여 RAPD 분석하고 서던블롯 분석한 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 참다래 병원균에는 670bp와 300bp 크기의 단편이 검출되었으나 병원형이 다른 유사세균에서는 단편이 전혀 검출되지 않았다.
실시예 3: 유전자 클로닝 및 염기서열 결정
상기 실시예 2에서 참다래 궤양병균 병원형 특이적 단편임을 확인한 약 670bp 단편을 pGEM-T 벡터에 삽입하였다. 즉, 도 5의 모식도에서 보여주는 바와 같이 양쪽 가장자리에 T7 프로모터와 SP6 프로모터가 있고 그 사이에 상기 약 670bp 단편을 삽입하고 라이게이션시켜 도 6과 같은 pGEM-T 벡터를 얻었다. 이 pGEM-T 벡터로 이.콜라이(E.coli;HB101)를 형질전환시키고 배양하여 참다래 궤양병균 병원형 특이적 단편을 클로닝한 후 클로닝 단편의 염기서열을 결정하였다. 도 7은 결정된 염기서열로 총 668bp였으며 브라스트 서치(BLAST search) 결과, 상동성 있는 DNA 및 아미노산 배열은 없었다. 하기 표 2에는 결정된 염기서열의 제한효소 절단 부위 및 절단 단편수를 나타냈다.
본 실시예의 형질전환 대장균 HB101은 한국과학기술원 생명공학연구소내 유전자 은행에 1998년 7월 2일 기탁번호 KCTC 8895P로 기탁하였다.
제한효소 절단부위 및 절단 단편수
제한효소 (엔도이눌라제) 염 기 서 열 시 작 위 치 절단부위 수
AccⅡ CG!CG 340 400 2
AluI AG!CT 293 1
BbvI GCAGCNNNNNNNN! 291 396 2
BcⅡ T!GATCA 124 587 2
BstEⅡ G!GTNACC 212 1
Cfr10I R!CCGGY 81 1
DdeI C!TNAG 495 639 2
DpnI GA!TC 89 125 153 176 233 588 6
EcoPI GCTCT 21 582 2
EcoRI RRA!TYY 322 647 674 3
EcoRI* !AATT 323 1
EcoT14I C!CWWGG 669 1
Fnu4HI GC!NGC 276 291 396 3
FnuDⅡ CG!CG 340 400 2
FokI GGATGNNNNNNNNN! 529 1
HaeI WGG!CCW 34 592 2
HaeⅢ GG!CC 35 593 2
HapⅡ C!CGG 82 1
HgaI !NNNNNNNNNNGCGTC 182 1
HgiAI GWGCW!C 497 1
HhaI GCG!C 284 339 399 401 436 5
HinfI G!ANTC 226 557 674 3
HpaⅡ C!CGG 82 1
HphI GGTGANNNNNNNN! 630 1
HphI !NNNNNNNTCACC 148 207 2
MboI !GATC 89 125 153 176 233 588 6
MboⅡ GAAGANNNNNNNN! 257 1
MboⅡ !NNNNNNNTCTTC 243 1
MnlI CCTCNNNNNNN! 388 471 2
MnlI !NNNNNNNGAGG 175 203 483 3
MstI TGC!GCA 435 1
RsaI GT!AC 101 417 636 3
SacⅢ ACGT 305 1
Sau3AI !GATC 89 125 153 176 233 588 6
SstⅢ ACGT 305 1
StuI AGG!CCT 34 1
TaqI T!CGA 151 178 267 383 4
ThaI CG!CG 340 400 2
TthlllI GACN!NNGTC 16 1
실시예 4: 참다래 궤양병균 동정용 프로브 제작
상기 실시예 3에서 클로닝된 단편이 참다래 궤양병균 병원형 특이적 프로브로서의 용도를 검증하기 위하여 클로닝 단편에 DIG-labelling한 후 프로브로 사용하여 참다래 궤양병균과 병원형 및 종이 상이한 균주들로부터 게놈 DNA를 서던 블롯 분석하였다. 이때, PCR 산물 및 게놈 DNA의 서던 블롯 분석은 관행법에 따랐으며 하이브리드제이션(hybridization)은 65℃에서 실시하였고 제한효소는 카피수를 확인하기 위하여 668bp내에 절단위치가 없는 HindⅢ를 사용하였다. 실험결과, 도 8에 나타낸 바와 같이 A는 절단위치가 없는 HindⅢ로 소화한 패턴이고 B는 클로닝 단편을 프로브하여 서던 블롯한 것으로 약 9kb의 단일 단편이 참다래 궤양병균에서만 검출되었다. 따라서 클로닝된 668bp의 단편은 궤양병균 동정용 프로브로 유용하고 참다래 궤양병균 게놈상에 단일카피(single copy)로 존재함을 알 수 있었다.
실시예 5: 참다래 병원균 진단을 위한 프라이머 제작
참다래 궤양병균 병원형 특이적 단편의 염기서열을 기초로하여 참다래 궤양병균의 감염여부를 콜로니-PCR(Colony-PCR)로 진단하기 위한 진단용 전진 프라이머(Forward primer)와 역전사 프라이머(Reverse primer)를 합성하였다. 즉, 채취한 균들을 고체배지상에 접종한 후 콜로니 단계에서 PCR법을 행하여 참다래 궤양병균 감염여부를 확인하기 위한 방법에 사용가능한 프라이머를 합성하였다. 따라서 클로닝 단편의 염기서열을 기초로 하여 500bp의 산물을 얻도록 전진 프라이머(5'-CACGATACATGGGCTTATGC-3') 및 역전사 프라이머 (5'-CTTTTCATCCACACACTCCG-3')를 합성하고 참다래 궤양병균과 유사세균의 게놈 DNA를 공시하여 PCR 실험을 행하였다. 이때, PCR 조건은 실시예 3의 경우와 동일하게 하였다. 실험결과, 도 9에 나타낸 바와 같이 참다래 궤양병균에서만 500bp의 단일 밴드를 검출하였다.
상기 실시예를 통하여 설명한 바와 같이 참다래 궤양병균(Pseudomonas syringae Pv. actinidiae) 19균주와 속, 종 및 병원형이 상이한 유사세균 10균주들을 RAPD 분석하여 궤양병균 병원형 특이적 단편을 검출하였으며(약 670bp) 이 단편을 pGEM-T 벡터에 삽입하여 대장균을 형질전환시킨 후 배양하여 클로닝 단편(668bp)을 얻고 이들의 염기서열을 결정한 후 이 단편을 프로브로하여 서던 블롯 분석한 결과, 참다래 궤양병균 병원형 특이적 단편을 검출하여 참다래 궤양병균 동정용 프로브임을 확인하고 상기 클로닝한 단편의 염기서열를 기초로 제작한 전진 프라이머 및 역전사 프라이머로 콜로니-PCR을 행한 결과, 참다래 궤양병균을 동정하여 조기에 간단하고 정확하게 참다래 궤양병을 진단하는 효과가 있으므로 참다래 재배를 위한 과수농업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (5)

  1. 참다래 궤양병균을 동정하여 참다래 궤양병을 진단하기 위한 하기 (I)로 표시되는 전진 프라이머(forward primer) 및 하기 (Ⅱ)로 표시되는 역전사 프라이머(reverse primer).
    5'-CACGATACATGGGCTTATGC-3' (I)
    5'-CTTTTCATCCACACACTCCG-3' (Ⅱ)
  2. 참다래 궤양병균을 동정하기 위한 하기 염기서열의 프로브(probe).
  3. 참다래 궤양병균 특이적 단편이 삽입된 벡터 pGEM-T.
  4. 상기 3항 기재의 벡터 pGEM-T 벡터를 E.coli HB101에 도입하여 형질전환시킨 미생물 E.coli HB101/pGEM-T(KCTC 8895P).
  5. 상기 1항 기재의 프라이머를 사용하여 콜로니-PCR을 수행하므로써 참다래 궤양 병원균을 동정함을 특징으로 하는 참다래 궤양병 진단방법.
KR1019980029758A 1998-07-23 1998-07-23 참다래궤양병균동정용프로브및프라이머와이를이용한참다래궤양병진단방법 KR100288868B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1019980029758A KR100288868B1 (ko) 1998-07-23 1998-07-23 참다래궤양병균동정용프로브및프라이머와이를이용한참다래궤양병진단방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1019980029758A KR100288868B1 (ko) 1998-07-23 1998-07-23 참다래궤양병균동정용프로브및프라이머와이를이용한참다래궤양병진단방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20000009387A KR20000009387A (ko) 2000-02-15
KR100288868B1 true KR100288868B1 (ko) 2001-05-02

Family

ID=19545037

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1019980029758A KR100288868B1 (ko) 1998-07-23 1998-07-23 참다래궤양병균동정용프로브및프라이머와이를이용한참다래궤양병진단방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR100288868B1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100353506B1 (ko) * 1999-10-04 2002-09-19 제일제당주식회사 녹농균 동정 및 감염 진단용 프라이머

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101719719B1 (ko) * 2015-09-16 2017-03-24 순천대학교 산학협력단 Psa1 그룹에 속하는 참다래 궤양병균 검출용 키트
KR101719721B1 (ko) * 2017-02-20 2017-03-24 순천대학교 산학협력단 참다래 궤양병균 검출용 키트
KR101719720B1 (ko) * 2017-02-20 2017-03-24 순천대학교 산학협력단 Psa2 그룹에 속하는 참다래 궤양병균 검출용 키트
CN108192987A (zh) * 2018-02-10 2018-06-22 绵阳市农业科学研究院 定量pcr检测猕猴桃溃疡病原菌的引物及其方法和应用

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100353506B1 (ko) * 1999-10-04 2002-09-19 제일제당주식회사 녹농균 동정 및 감염 진단용 프라이머

Also Published As

Publication number Publication date
KR20000009387A (ko) 2000-02-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0620862B1 (en) Method for the identification of microorganisms by the utilization of directed and arbitrary dna amplification
Bell et al. Assignment of 30 microsatellite loci to the linkage map of Arabidopsis
US5861245A (en) Arbitrarily primed polymerase chain reaction method for fingerprinting genomes
US5574145A (en) Isolated nucleic acid molecules targeted to the region intermidiate to the 16S and 23S rRNA genes useful as probes for determining bacteria
JP4385072B2 (ja) 選択的な制限断片増幅：一般的なｄｎａフィンガプリント法
EP0610396B1 (en) Fingerprinting bacterial strains using repetitive dna sequence amplification
US5811237A (en) Nucleotide sequences coding for a protein with urease activity
WO1997009448A1 (en) Method for determining lactic acid bacterial species
JP4212648B2 (ja) 遺伝標識および大腸菌血清型―０１５７：ｈ７の検出方法
AU717453B2 (en) Extraction, amplification and sequential hybridization of fungal cell DNA and process for detection of fungal cells in clinical material
KR101047322B1 (ko) 앵귈라 뱀장어 종들의 판별을 위한 ｄｎａ 마커
CA2086136A1 (en) Dna probes for the detection of arbuscular endomycorrhizal fungi
KR100288868B1 (ko) 참다래궤양병균동정용프로브및프라이머와이를이용한참다래궤양병진단방법
US5693501A (en) Compounds and methods to determine presence of Histoplasma capsulatum
JPH0343087A (ja) ミコバクテリウム属の同定のためのｄｎａのハイブリダイゼーシヨンプローブ
CA2205547A1 (en) Materials and methods for species-specific detection of mycobacterium kansasii nucleic acids
CN114015799B (zh) 一种麦根腐平脐蠕孢的lamp检测引物组、试剂盒及lamp检测方法
Drebot et al. Differentiation of Listeria isolates by PCR amplicon profiling and sequence analysis of 16S‐23S rRNA internal transcribed spacer loci
Garcia-Chapa et al. PCR-mediated whole genome amplification of phytoplasmas
JP2006505262A (ja) 連鎖球菌属および関連する属の細菌の分子レベルの同定
JPH05276999A (ja) カンピロバクター属細菌検出用オリゴヌクレオチド、カンピロバクター属細菌の検出法及び検出用試薬キット
US6489107B1 (en) Method for identifying Escherichia coli strain DSM 6601
JP3107904B2 (ja) ラクトバチルス属細菌の検出方法
Casimiro et al. Identification of pathogenesis-related ESTs in the crucifer downy mildew oomycete Hyaloperonospora parasitica by high-throughput differential display analysis of distinct phenotypic interactions with Brassica oleracea
US5137816A (en) Rhizobial diagnostic probes and rhizobium trifolii nifH promoters

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
N231 Notification of change of applicant
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20050214

Year of fee payment: 5

LAPS Lapse due to unpaid annual fee