JPH0343087A - ミコバクテリウム属の同定のためのｄｎａのハイブリダイゼーシヨンプローブ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ミコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ）の同定のためのＤＮＡのハイブリダイゼーショ
ンプローブに関する。

本発明は、要約すれば、次の通りである：ヒト型結核菌
（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏ
ｓｉｓ）（以後、Ｍ、ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のゲ
ノムの核酸に対して特異的な核酸配列を開示する。この
配列はＭ、ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓからのものであり
、モしてミコバクテリアの結核のコンプレックスのある
構成員、例えば、Ｍ、ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓｓ　ウ
シ型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｂｏｖｉ
ｓ）（以後、Ｍ、ｂｏｖｉｓ）およびＭ、ｔｌｏｖｉｓ
のモントリオール（Ｍｏｎｔｒｅａ＋）菌株（Ｃａｌｍ
ｅｔｔｅ　　Ｂａｃｉｌｌｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）とハイブ
リダイゼーションすることができる。本発明は、また、
Ｍ、ｔａｂ、ｅｒｃｕｌｏｓｉｓの分離された核酸配列
から誘導されたオリゴデオキシリボヌクレオチドのプラ
イマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ　ＣＲ）に
よるミコバクテリアの核酸の増幅により同定されｆ：　
Ｄ　Ｎ　Ａ断片に関する。このようにして増幅されたＤ
ＮＡ断片は、Ｍ、ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓからの核酸
と特異的にハイブリダイゼーションするであろう。

本発明は、また、核酸配列を使用する診断方法、例えば
、ハイブリダイゼーションアッセイ、およびこのアッセ
イを実施するためのキットに関する。

ミコバクテリアは、酸抵抗性のグラム陽性バクテリアの
種々の集合体であり、それらのあるものはヒトおよび動
物における重要な病気を引き起こす因子である、ブルー
ム（Ｂｌｏｏｍ）ら、Ｒｅｖ、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、
、５ニア６５−７８０　（１９８３）；チャバラス（Ｃ
ｈａｐａｒａｓ）、ＣＲＤ　　Ｒｅｖ、Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏ！、、９：１３９−１９７　（１９８２）。人間にお
いて、２つの最も普通のミコバクテリアが引き起こす病
気はらいおよび結核であり、これらは、それぞれ、らい
菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　Ｉｅｐｒａｅ）お
よびヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｔ
ｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の感染から生ずる。

他のミコバクテリア種は、結核および結核様病気を引き
起こすことができる。ワレス（Ｗａｌｌａｃｅ）、Ｒ，
Ｊ、ら、感染症の概観（Ｒｅｖｉｅｗ　　ｏｆ　　Ｉｎ
ｆｅｃｔｉｏｕｓ　　Ｄｉｓｅａｓｅ）、５　：　６５
７−６７９　（１９８４）、例えばぜ鳥型結核菌（Ｍｙ
ｃｏｂａｃｔｅｒ　ｉｕｍａｖｉｕｍ）（以後、Ｍ、ａ
ｖｉｕｍ）は、ニワトリおよび他の鳥類における結核を
引き起こす。

Ｍ、ａｖｉｕｍ−ｉｎｔｒａｃｅｌ、Ｉｕｌａｒｅ複合
体は、後天性免疫欠損症候群（ＡＩＤＳ）をもつ個体の
うちで重要な病原体となった。ＡＩＤＳをもつ個体のあ
る群は、同様によく結核の顕著に増加した発生を有する
。ピチェニク（Ｐｉｔｃｈｅｎｉｋ）、Ａ、Ｅ、、内科
学の記録（Ａｎｎａｌｓ　　ｏｆ　　Ｉｎｔｅｒｎａｌ
　　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、１０１：６４１−６４５　（
１９８５）。

ウシ型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（Ｍ。

）ｂｏｖｉｓ）は、ウシにおける結核を引き起こす種で
あり、そしてヒトおよび他の動物に伝染し、結核をまた
引き起こす。ミコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒ
ｉａｃｅａ）族の「結核コンプレックス」は、また、Ｍ
、ａｆｒｉｃａｎｕｍおよびＭ、ｍ１ｃｒｏｔｉを包含
する。パテル（Ｐａｔｅｌ）、Ｒ，Ｊ、　ら、Ｒｅｖ、
Ｉｎｆｅｃｔ。

Ｄｉｓｅａｓｅｓ、土工：５ｕｐｐ１．２Ｓ４１１−５
４１９　（１９８９）。

現在、はとんどすべての結核はＭ、ｔｕｂｅｒｃｕｌｏ
ｓｉｓの呼吸の感染により引き起こされる。感染はある
ものにおいて無症候性であるが、他の個体において、そ
れは重大な衰弱または死に導く肺の病変を生成する。

今日、結核はことに開発途上国において有意の健康の問
題である。世界中で、はぼ１１００万人はこの病気をも
ち、そして毎年約３５０万人はこの病気に新しくかかる
。米国コンブレス（Ｃｏｎｇｒｅｓｓ）、ＯＴＡ、ｒ熱
帯病についての生医学の研究および関係する技術の状勢
（Ｓ　ｔ　ａ　ｔ　ｕｓ　　ｏｆ　　Ｂｉｏｍｅｄｉｃ
ａｌ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　　ａｎｄ　　Ｒｅ１ａｔｅ
ｄ　　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　　ｆｏｒ　　Ｔｒｏｐｉ
ｃａｌ　　Ｄｉｓｅａｓ　ｅ　ｓ）　、０ＴＡ−Ｈ−２
５８、ワシントンＤ。

Ｃ，，１９８５゜ これらのミコバクテリアの病気の診断手段はめったに適
切ではない。効率よい患者の管理および伝染の抑制は、
実験室において病因学の因子の急速に同定のための技術
のにおける現在の不適切さにより危うくされる。比較的
小さい数のバチルス属は顕微鏡検査により検出すること
ができる、シューメイカ−（Ｓｈｏｅｍａｋｅ　ｒ）、
Ｓ−Ａ、　ら１Ａｍ、　　Ｒｅｓ、　　Ｒｅ５ｐｉｒ、
Ｄｉｓ、　　、　１３１エフロ０−７６３　（１９８５
）、が、ヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　
　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）は形態学単独にに基づい
て他の酸抵抗性バチルス属から弁別することができない
。

こうして、酸抵抗性微生物を含有する標本を培養して、
基準、例えば、増殖速度、コロニーの形態学、生化学的
挙動、および薬物感受性により、より明確な同定を可能
としなくてはならない。ベスタル（Ｖｅｓｔａｌ）、Ａ
、Ｌ−ＨＥＷ　　Ｐｕｂｌ、Ｎｏ、（ＣＤＣ）７７−８
２３０アトランタ、１９７５　；ベイテス（Ｂａｔｅｓ
）、Ｊ、Ｈ，、Ａｍ、Ｒｅｓ、Ｒｅ５ｐｉｒ、Ｄｉｓ、
、１３２：１３４２（１９８５）、Ｍ、ｔｕｂｅｒｃｕ
ｌｏｓｉｓは培養が困難であり、そして１５〜２０時間
の世代時間を有する。ワイン（Ｗａｙｎｅ）Ｌ、Ｇ、、
Ａｍ、Ｒｅｓ、Ｒｅ５ｐｉｒ、Ｄｉｓ。

、１２５　（Ｓｕｐｐｌ、）３１−４１　（１９８２）
、実験室の結果を得ることができる前の６週までの遅延
は異常でない。

最近、ミコバクテリアの同定についての新規なアプロー
チはこの待機期間を７〜ｌＯ日に短縮した。参照、例え
ば、グロス（Ｇｒｏｓｓ）、Ｗ。

Ｍ、およびＪ、Ｅ、ホウキンス（Ｈａｗｋ　ｉ　ｎ　ｓ
）Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、２１：５６５
−５６８　（１９８５）；キニスレイ（Ｋｎｉｓｌｅｙ
）、Ｃ，Ｖ、ら、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、
、２２ニア６１　７６７　（１９８５）。これらの方法
の大部分は、有機体が生体外で多少複製することを必要
とする。Ｍ、ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓにおけるリポソ
ームのＲＮＡ配列に対して相同性のＤＮＡプローブは、
ジエン−プローブ（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ）（カリフォル
ニア州すンジエゴ）から商業的に入手可能である。

コーン（Ｋｏｈｎｅ）　、Ｄ、Ｅ、　、ＷＯ３４０２７
２１（１９８４年７月１９日）；ホウガン（Ｈｏｇａｎ
）、ｊ、Ｊ、、ＷＯ３８０３９５７（１９８８午６月２
日）。このプローブを使用して実施する診断試験は培養
した有機体について実施しか（でけか＾九・い−か〆ｔ
？＾　デの嘴辻Ｉ→玖中ぬ標本への直接の適用について
試験されなかったからである。

Ｍ、ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの感染についての改良さ
れた診断アッセイが要求されている。

本発明は、ヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
　　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のゲノムの核酸に特異
的にハイブリダイゼーションする核酸配列に関する。と
くに、本発明は、ヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ　　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ウシ型結核菌
（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｂｏｖｉｓ）、およ
びウシ型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｂｏ
ｖｉｓ）のモントリオール（Ｍｏｎｔｒｅａｌ）菌株（
Ｂｃｉｌｌｅ　　Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｆｎ）か
らの核酸にハイブリダイゼーションするが、鳥型結核菌
（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒ、ｉｕｍ　　ａｖｉｕｍ）、ミ
コバクテリウム・イントラセールラレ（Ｍｙｃｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ　　１ｎｔｒａｃｅｌｌｕＩａｒｅ）、お
よびミコバクテリウム・スクロフう−ｈ　ｒ’７　／、
　／　ＬＪ−、−−１−−−ｈ　−−ｒｏｆｕｌａｃｅ
ｕｍ）からの核酸にハイブリダイゼーションしない、ヒ
ト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｔｕｂｅ
ｒｃｕｌｏｓｉｓ）の分離されたデオキシリボ核酸配列
に関する。本発明は、また、前述の配列から誘導された
オリゴデオキシリボヌクレオチドのプライマーを使用す
るポリメラーゼ連鎖反応によるミコバクテリアの核酸の
増幅により同定される核酸配列に関する。

本発明の核酸配列は、Ｍ、ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの
急速な同定のためのハイブリダイゼーションアッセイに
おいて、核酸プローブとして有用である。

ヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒ
ｃｕｌｏｓｉｓ）の核酸に対して特異的にハイブリダイ
ゼーションするＤＮＡ断片を分離し、そして配列決定す
る。この断片は１．０１６塩基対から戊り、そしてその
ヌクレオチド配列は第１図に記載されている。この断片
をプラスミＦｐＭＴｂＡ中にクローニングした、パテル
（Ｐａｔｅｌ）、Ｒ，Ｊ、ら、Ｒｅｖ、Ｉｎｆｅｃｔ。

Ｄｉｓｅａｓｅｓ、土工：５ｕｐｐ１．２Ｓ４１１−５
４１９　（１９８９）、その教示をここに引用によって
加える。クローニングした断片は５０７および５０９塩
基の２つのほぼ同一の断片から成る。参照、第１図およ
び例示。このＤＮＡ断片は、Ｍ、ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓ
ｉｓ、Ｍ＋　ｂｏｖｉｓ、およびＭ、ｂｏｖｉｓ　　Ｂ
ＧＣ（Ｂａｃｉｌｌｅ　　Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒ
ｉｎ）に特異的にハイブリダイゼーションする。ＤＮＡ
断片は、Ｍ、ａｖｉｕｍ、Ｍ、１ｎｔｒａｃｅｌｌｕ１
＠ｒｅ、およびＭ−ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍにハイブ
リダイゼーションしない。この核酸の断片、この断片の
一部分、またはこの断片の機能的に同等の変異型は、後
述するように、Ｍ、ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓについて
のハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用するこ
とができる。

機能的に同等の変異型は、Ｍ、ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉ
ｓへのハイブリダイゼーションに対する配列の特異性に
影響を与えないで、塩基対が欠失され、挿入されいるか
、あるいは置換されている配列を包含する。

ＤＮＡ断片は、また、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
技術によるミコバクテリアのＤＮＡ配列の増幅のための
プライマー源である。これは追加の配列特異的核酸配列
の同定を可能とする。２つの増幅すべきミコバクテリア
のゲノム（すなわち、鋳型）の領域をフランキングする
（ｆｌａｎｋ）、オリゴデオキシリボヌクレオチドのプ
ライマー一般に約１８〜２２ヌクレオチドの長さ、を使
用する。一方のプライマーは（＋）鋳型鎖に対して相補
的であり、そして他方は（−）鋳型鎖に対して相補的で
ある。一方のプライマーを変性したゲノムの鋳型の（＋
）鎖にアニーリングし、そしてＤＮＡ特異的（ｄｉｒｅ
ｃｔｅｄ）ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシヌクレオ
シドトリホスフェートで伸長する。これは標的配列のレ
プリカである（−）鎖の断片を合皮する。同時に、同様
な反応は他方のプライマーを使用して起こり、新しい（
＋）鎖をつくる。これらの新しく合皮されたＤＮＡ鎖は
、それら自体プライマーのための鋳型である。変性、ア
ニーリングおよび伸長の反復したサイクルは、プライマ
ーにより定められたミコバクテリアの標的配列を増幅す
る。このようにして、ＤＮＡ配列は増幅され、そしてハ
イブリダイゼーションアッセイにおいてＤＮＡプローブ
として使用することができる。参照、例えば、米国特許
第４．６８３．２０２号（Ｍｕｌｌｉｓ）、その開示を
ここに引用によって加える。

次いで、明確な増幅されたＤＮＡ断片をクロマトグラフ
ィーのゲルで精製することができる。増幅したＤＮＡ断
片の特異性は、増幅した断片をミコバクテリアのＤＮＡ
とハイブリダイゼーションするか、あるいはそれをＰＣ
Ｒ産生物のためのハイブリダイゼーションプローブとし
て使用することによって試験することができる。

好ましいプライマーは長さが１８〜２２ヌクレオチドで
あり、そして９ＭＴｂ４の１０１６塩基対の配列から合
皮する。これらのプライマーは、ミコバクテリアの１ｌ
ｌｆｆｉＤＮＡとのポリメラーゼ連鎖反応において使用
する。この手順は２対のオリゴヌクレオチドのプライマ
ー（第２図に示す配列：を使用して実施した。プライマ
ーをＭ、ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの６つのＡＴＣＣ菌
株およびＭ。

ａｖｉｕｍの３つの菌株の核酸にハイブリダイゼーショ
ンした。明確な断片を増幅し、そして臭化エチジウムで
染色したアガロースゲルまたはポリアクリルアミドゲル
で分割した。これらのゲルからのＤＮＡをニトロセルロ
ースのフィルターに移し、そしてＭ、ｔｕｂｅｒｃｕｌ
ｏｓｉｓのＤＮＡから誘導されたプライマーとのポリメ
ラーゼ連鎖反応により増幅したＤＮＡから成るグローブ
との配列特異性について試験した。下により詳細に記載
するように、Ｍ、ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの核酸にお
いて増幅した断片との有意なハイブリダイゼーションが
存在したが、Ｍ、ａｖｉｕｍの核酸を含有するフィルタ
ーへの検出可能なハイブリダイゼーションは存在しなか
った。ＰＣＲ増幅した配列は、Ｍ、ｔｕｂｅｒｃｕｌｏ
ｓｉｓの検出のための核酸ハイブリダイゼーションアッ
セイにおいて使用することができる。

記載する方法は一般的応用を有する：それを使用して他
の配列特異性のミコバクテリアの核酸配列同定および分
離することができる。例えば、ミコバクテリアの種から
のゲノムのＤＮＡ断片をクローニングし、そして配列決
定することができる。

配列のデータから、オリゴヌクレオチドのプライマーは
ミコバクテリアのＤＮＡのＰＣＲ増幅のために合皮する
ことができる。増幅したＤＮＡは配列特異性について試
験することができる。

本発明の核酸配列は、Ｍ、ｔｕｂｅｒｃｕｌ。

ｓｉｓを検出するためのプローブとして使用することが
できる。ハイブリダイゼーシＢンアッセイは種々の実施
態様を有することができる。一般に、試験すべき核酸の
試料を核酸グローブとともに、それがヒト型結核菌（Ｍ
ｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉ
ｓ）の核酸に特異的Ｉこハイブリダイゼーションする厳
格さの適当な条件下にインキュベーションする。インキ
ュベーション後、ハイブリダイゼーションしないプロー
ブを除去し、そして試料をヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ　　　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の核
酸の存在または量の指示として、ハイブリダイゼーショ
ンしたグローブについて分析スる。

分析すべき核酸をミコバクテリアのＪｆｌａから抽出す
る。必要に応じて、抽出したＤＮＡを制限酵素で消化し
、そして生ずるＤＮＡ断片を大きさに基づいて分離する
（例えば、ゲル電気泳動により）ＤＮＡはニトロセルロ
ースのフィルターへ結合することができる。次いで、ニ
トロセルロースに結合した断片を、標識した核酸プロー
ブでプロービングする。標識を放射性同位元素、例えば
、３２Ｐであることができる。ニトロセルロースに結合
した断片は、標識したプローブ：　ＤＮＡの複合体の発
生を明らかにする。

他の実施態様において、本発明の核酸プローブを使用し
て、試料のＤＮＡを固体の支持体上に特異的に固定化ま
たは「捕捉コする。プローブを固体の支持体、例えば、
ポリスチレンへ結合する。

プローブは、また、支持体の層または下層へ結合するこ
とができ、これは固体の支持体上へ直接被覆する。プロ
ーブは、下層へ結合することができるオリゴマーのヌク
レオチドの「ティル」を通して、下層へ添付することが
できる。適当な条件下に、プローブは試料中の標的核酸
配列にハイブリダイゼーションし、こうして相補的標的
ＤＮＡ配列んハイブリダイゼーションした捕捉プローブ
から成る複合体を形成する。固体の支持体は、必要に応
じて、試料から分離することができ、そして−船釣標識
を固体の支持体に添加する。標識のデオキシヌクレオシ
ドトリホスフェートは試料からのミコバクテリアのＤＮ
Ａの指示体として働く。

固体の支持体、下層を調製し、そしてグローブを標識す
る方法は、この分野Ｉ；おいてよく知られている。参照
、ナガタ（Ｎａｇａｔａ）ら、ＦＥＢＳ、１８３．３７
９−３８２　（１９８５）は、ポリスチレンのマイクロ
タイタープレートのウェルへ固定化したＤＮＡの使用を
記載しでいる；ポリスキー−シンキン（Ｐｏ　Ｉｙｓｋ
ｙ−ｃｙｎｋｉｎ）ら、臨床化学（ｃｌｉｎｉｃａｌ　
　’Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、３１：ｌｄｌ只−ＩＡＡ’
Ｊ　（１９８５）は、臨床的アッセイにおける固定化し
た捕捉グローブの使用を記載している；ウオルフ（Ｗｏ
ｌｆ）ら、核酸の研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ
　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、上５：２９１１−２９２６　
（１９８７）は、ラテックス被覆したポリスチレンビー
ズへのオリゴヌクレオチドの共有結合の取り付けの方法
を記載している；スタビンスキー（Ｓｔａｂｉｎｓｋｙ
）の米国特許第４゜７５１．１７７号は、ティルト（ｔ
ａｉｌｅｄ）捕捉プローブおよびオリゴ−（ｄＴ）を含
有する固体の支持体を記載している：およびソダーラン
ド（Ｓｏｄｅ　ｒ　１　ａｎｄ）の英国特許出願ＧＢ２
１６９４４０３Ａ号（１９８５）は、親和性に基づく捕
捉ハイブリダイゼーション方法を記載している。

ハイブリダイゼーションアッセイは、プローブとの接触
およびハイブリダイゼーションを起こすために十分な、
任意のバクテリアの試料について実施することができる
。試料は、細胞内の分子構造を崩壊する因子を使用して
前処理する。これらの因子または手順は、試料中に存在
する細胞を崩壊して、核酸を解放するであろう。このよ
うな因子は、一般に、細胞の分子構造を崩壊する化合物
または溶媒である、すなわち、これらの因子は、一般に
標本中に見いだされる、タンパク質、核酸および多糖類
を包含する、バイオポリマーの二次、三次および／また
は四次構造を崩壊することができる。分子構造を崩壊す
る因子の例は、次の通りである：カオトロピズムの塩類
（例えば、グアジニウムチオシアネート）、および大き
い酸性アニオンの一価の塩類（例えば、トリクロロアセ
テート、トリフルオロアセテート）、変性洗浄剤（例え
ば、ドデシル硫酸塩）、加水分解性酵素（例えば、プロ
テアーゼ）、および疎水性結合を崩壊する化合物（例え
ば、フェノール類、ジメチルホルムアミド、ジメチルス
ルホキシド、テトラメチル尿素、塩酸グアジニウム）ま
たは水素結合（例えば、尿素、ホルムアミド）。分子構
造を崩壊する物理学的または機械的手段、例えば、凍結
融解を、また、使用して試験のための試料を調製するこ
とができる。好ましい凍結−融解の技術は、ミコバクテ
リアの細胞を約−７０℃に凍結し、次いで試料を融解す
ることである。これはリゼイトを提供し、これは分離ま
たは濾過の工程を必要としないで核酸グローブとのハイ
ブリダイゼーションにおいて直接使用することができる
。分子構造を崩壊する因子は、単一にまたは種々の組み
合わせで使用してジサルファイド結果を達成することが
できる。

これらの手順により抽出されたミコバクテリアのＤＮＡ
は、それ自体、ＰＣＲ方法により増幅することができる
。もとの試料が小さい数の標的ミコバクテリアのＤＮＡ
を含有する場合、このような増幅は望ましい。この増幅
工程のために選択したＤＮＡプライマーは、検出するこ
とを意図する特定の標的ミコバクテリアがどれであるか
に依存する。

本発明のＤＮＡハイブリダイゼーションプローブは、臨
床的使用のためのキットに組み込むことができる。この
ようなキットは核酸プローブおよび、必要に応じて、グ
ローブを標識する手段を包含するであろう。プローブは
遊離の形態で使用するか、あるいは捕捉グローブとして
固体の支持体へ結合することができる。キットは、また
、細胞溶解のための溶液または他のカオトロビズム剤、
洗浄溶液および緩衝剤をアッセイの特定のフォーマット
に依存して含有することができる。

次の実施例によって、本発明をさらに説明する。

実施例 実施例１ この実施例は、Ｍ、ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓからの１
０１６塩基対のＤＮＡ配列のサブクローニングおよび配
列決定を例示する。

クローニングベクターｐＢＩｕｅｓｃｒｐｔ ＫＳ（＋、）およびＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ
　　Ｃｌｏｎｉｎｇ　　Ｓｙｓｔｅｍｓｓ　カリ７オル
ニア州ラジヨラ）を、ＨｉｎｄｌｌＩおよび５ａｌｌ　
（Ｎｅｗ　　Ｅｎｇｌａｎｄ　　ＢｉｏｌＢｂｓ、マサ
チュセッツ州ベベリイ）で消化し、そして仔つシ腸ホス
ファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　　Ｍａｎｎｈｅｉ
ｍ　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、インジアナ州インジ
アナポリス）。Ｍ。

ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの４６０ｂｐを含有するｐＢ
Ｒ３２２プラスミドを、源材料として使用した。、ペイ
チル（Ｆａｃｅｔ）ら、Ｒｅｖ、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ
ｅａｓｅｓ、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ２．５４１１−Ｓ４
１９　（１９８９）、その開示をここに引用によって加
える。ｌＯμｇのこのプラスミドを順次にＨｉｎｄＩＩ
Ｉ、５ａ１１およびｐｖｕ　Ｉ　Ｉで消化し、モしてミ
コバクテリアのインサートを含有するほぼ１．６キロ塩
基（ｋｂ）のＨｉｎｄｌＩＩ−ＳａｌＩ断片を、Ｔ４リ
ガーゼとの一夜のインキュベーションの間にｐＢＩｕｅ
ｓｃｒｉｐｔベクター中に強制的にクローニングした。

結合反応のアリコートを使用して、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ　　ｃｏｌｉ　　ＪＭ１０９を形質転換した。１０
０μｇ　／　ｍ　Ｑのアンピシリン、０．３３ミリモル
のイソプロピル−８−Ｄ−チオガラクトプラノシド（Ｉ
　ＰＴＧ、Ｓ　ｉ　ｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ　　Ｇｏ、
、ミゾリー州セントルイス）および０．００３％の５−
ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ベーターＤ−ガ
ラクトピラノシド（Ｘ−ｇａ　１．Ｓ　ｉ　ｇｍａ）を
含有するＬＢ寒天平板からのほぼ６つの白色コロニーを
、各ベクターについて不規則にピックアップし、そして
５ｍ＋２のＬＢジグロス中一夜増殖させた。１％のアガ
ロースゲルのミニ調製物の電気泳動において、すべての
コロニーは同一大きさのインサートを有することが示さ
れた。プラスミドのｐＭＴＢ４ＫＳ２およびｐＭＴｂ４
３に２を、塩化セシウムの密度遠心により精製した。

Ｂ、　配列決定についてネステッド（ｎｅｓｔｅｄ）欠
失 プラスミドｐＭＴｂ４ＫＳ２をグロトタイプとして使用
して、ネステッド欠失をつくった。プラスミドｐＭＴｂ
４ＳＫ２を順次にＫｐｎｌおよび５ａｌｔで消化し、モ
してフェノール／クロロホルムで精製し、そしてエタノ
ール沈澱させた。直線化したＤＮＡをエクソヌクレアー
ゼＩＩＩで室温において０．２．４．６．８および１０
分間消化した。各時点において、消化物のアリコートを
氷上に維持したヤエナリヌクレアーゼを含有する管に移
した。次いで、これらの管を一緒に３０°Ｃニオいて３
０分間インキュベーションした。フェノール／クロロホ
ルムの処理およびエタノール沈澱後、平滑末端のＤＮＡ
をＴ４リガーゼで一夜インキユペーションした。Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ　　ＪＭ１０９を円形化した
分子で形質転換し、そしてアンピシリン、ＩＰＴＧ、お
よびＸ−ｇａｌを含有するＬＢ寒天上に配置した。２６
の白色コロニーの原培養物を５ｍｆｆのＬＢブロスから
つくり、そして−２０℃において貯蔵した。

適当な欠失を含有するクローンを、アガロースゲル上で
展開したミニ調製物から同定した。

−末鎖ＤＮＡ　（ｓ　５ＤＮＡ）を、形質転換したＥ、
ｃｏｌｉをヘルパー７７−ジＲ４０８またはＶＯ２−Ｍ
１３と５または５０ｒｒｌの培地中で接触させることに
よって得た。プロトコルを追跡するか、あるいはＤＮＡ
ポリメラーゼのクレノー断片（Ｎｅｗ　　Ｅｎｇｌａｎ
ｄ　　Ｂｉｏｌａｂｓ）または修飾したバクテリオファ
ージＴ７ＤＮＡポリメラーゼ、セクエナーゼ（Ｓｅｑｕ
ｅｎａｓｅ）（Ｕｎｉｔｅｄ　　５ｔａｔｅｓ　　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、オハイオ州りレベランド）を使
用して、わずかに修飾してｐＭＴｂ４３に４−１．９Ｍ
Ｔｂ４ＳＫ４−２および９ＭＴｂ４ＳＫ４−３からの５
ｓＤＮＡを配列決定した。反応の各組について、バタテ
リオファージＭ１３から商業的に調製されたｓ　５ＤＮ
Ａを対照として含めた。二本鎖配列決定（Ｉｎｔｅｒｎ
ａｔｉｏｎａｌ　　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ、Ｉ
ｎｃ、、−コネチカット州ニューヘブン）をｐＭＴｂ４
ＫＳ２について実施した。

すべての配列決定反応は、３６Ｓ標識したｄＡＴＰを使
用して実施した。反応物は、変性６％のポリアクリルア
ミドゲル上の適用前に、−８０℃において貯蔵するか、
あるいは氷上で維持し、そしてプロトコルに依存して、
適用直前に２分間７０〜９５℃に加熱した。販売者の手
順における修飾は次のものを包含した２５０℃において
実施したクレノー反応：５０℃において実施した配列反
応；セクエナーゼとのより短い反応：セクエナーゼキッ
トを使用する７２℃におけるＴａｇポリメラーゼ（Ｐｅ
ｒｋｉｎ　　Ｅｌｍａｅｒ　　Ｃｅｔｕｓ。

コネチカット州ノーウオーク）：および１００℃に加熱
した直後の試料の適用。

ネステッド欠失をつくる別法は、オリゴヌクレオチドの
プライマーおよび配列を単一方向において合皮すること
であった。ｐＢＲ３２２配列はマニアチス（Ｍａｎｉａ
ｔｉｓ）ら、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ）：実験室のマニュアル（
Ａ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　　Ｍａｎｕａｌ）、コー
ルド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、コールド
・ハーバ−（Ｇｏｌｄ　　　Ｓｐｒｉｎｇ　　　Ｈａｒ
ｂｏｒ　　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、１９８２、また
はコンピュータープログラムｒＤＮＡインスベクター（
Ｉｎｓｐｅｃｔｏｒ）Ｉ　Ｉ＋Ｊ　　（Ｔｅｘｔｃｏ、
ニューハンプシャイヤー州Ｗ、レナノン）から入手した
。プライマーは、必要に応じて、破壊したｐＢＲ３２２
ＥｃｏＲＶ部位からほぼ４０塩基はなれた部位から出発
して、発生させた。ｐＭＴｂ４５に２において、５つの
プライマーを発生させて、１．１０６ヌクレオチドより
大きい配列を決定した。このＭ、ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓ
ｉｓ特異的配列は、１４ヌクレオチドの差をもつ５０７
および５０９塩基の２つのほぼ同一の断片から構成され
ている。

配列決定反応物のアリコートを、７モルの尿素および０
．５×〜１．５Ｘ）リス−ホウ酸塩−ＥＤＴＡの緩衝液
の勾配（ＴＨＥ）または８モルの尿素およびｌ　ＸＴＢ
Ｅを含有する、６％のポリアクリルアミドゲル上に適用
した。ゲルを１００ワツトで予備展開して、ゲルおよび
緩衝液室ＣＢ　ｉ　。

−Ｒａｄ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ニューヨーク
州ロックダレセンター）の温度を５５℃までにした。試
料をシャークツース（ｓｈａｒｋ’　　ｔｏｏｔｈ）で
適用し、そしてブロモフェノールブルーがゲルの底に到
達するまで、通常非勾配について２時間および勾配ゲル
について２．５時間展開した。ある場合において、反応
の他のアリコートを隣接するレーンで適用して、ゲル当
たりの読むことのできる塩基の数を増加した。

ゲルを１０％のＭ　ｅ　ＯＨ％　１０％の氷酢酸中に４
５〜６０分間浸漬し、吸取紙（Ｓｃｈｌｅｉｈｅｒ　　
＆　　５ｃｈｕｅｌ＋、ニューハングシャイヤー州ケー
ネ）に移し、そして８０℃にセットしたゲル乾燥器で４
５〜６０分間乾燥した。ゲルをコダックＸ−ＯｍａｔＡ
Ｒフィルムに一８０℃において２４〜４８時間露出した
。

結果 各向きにおいて９ＭＴｂ４からのＨｉｎｄＩｌｌ−Ｓａ
ｌｌ断片を含有する組み換えＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラ
スミドを、ｐＭＴｂ４ＫＳ２およびｐＭＴｂ４ＳＫ２と
表示した。Ｅ、ｃｏｌｉＪＭ１０９は、これらのプラス
ミドで形質転換すると、Ｊ）ＢＲ３２２またはｐＵＣベ
クターの組み換え体で形質転換したときより、非常によ
りゆっくり複製した。塩化セシウムで精製したとき、９
ＭＴｂ４３に２　　ＤＮＡの収量（５，１３６ｍｇ１５
００ｍＧの培養物）はｐＭＴｂ４ＫＳ２のそれ（０，９
４９ｍｇ１５００ｒｒｌの培養物）よりすぐれた。より
長いインキュベーシゴンはコロニーをＩＰＴＧ／Ｘ−ｇ
ａｌ寒天寒天上板上ルーに変えるため要し、そして制限
エンドヌクレアーゼを使用する消化は高い酵素濃度おい
てさえ不完全であった。

ｐＭＴｂ４ＳＫ２をプロトタイプとして使用してネステ
ッド欠失をつくった。エキンヌークレーゼ１１１、ヤエ
ナリヌクレアーゼ、およびＴ４リガーゼで処理後得られ
た２６の形質転換体のうちで、４分の時点からの３つの
クローン（ｐＭＴｂ４Ｓに４−１．ｐＭＴｂ４３に４−
２および９ＭＴｂ４ＳＫ４−３）は適当な欠失を含有す
ると思われた。まず、５ｓＤＮＡは５ｍ１２の培地中の
ヘルパー７７−ジＲ４０８との同時培養によりこれらの
３つのクローンから得た。究極的に、ヘルパー７アージ
ＶＣ５−Ｍ１３を使用して、５０ｍ＋２の培養物中でｐ
ＭＴｂ４ＫＳ２およびｐＭＴｂ４３に２から５ｓＤＮＡ
をレスキュー　（ｒｅｓｃｕｅ）　した。ｐＭＴｂ４Ｋ
Ｓ２は面倒であることが証明された。非常に少量（およ
び希釈した）の５ｓＤＮＡが、５０ｍ＋２の培養物から
でさえ、回収された。

さらに、ヘルパーファージは一本Ｍ４　ｐ　Ｍ　Ｔ　ｂ
　４　ＫＳ２よりむしろ増幅されるように思われた。

最初に、配列決定反応をクレノーポリメラーゼを使用し
て３７℃において実施し、７０℃に加熱し、そして６％
の緩衝液の勾配のポリアクリルアミドゲル上に適用して
、読むことができる塩基の数を最大にした。同定された
３つのクローンのうちで、９ＭＴｂ４ＳＫ４−２は、は
ぼ３００ヌクレオチドの最良の配列のデータを提供した
。９ＭＴｂ４ＳＫ４−３から得られた配列は、ｐＢＲ３
２２におけるＨｉｎｄｌ１１部位の近い領域のそれであ
った。配列はｐ　Ｍ　Ｔ　ｂ　４３　Ｋ　４−１から得
られなかった。９ＭＴｂ４中に存在するミコバクテリア
の配列の一部分を含有するｐＭＴｂ５（Ｐａｔｅｌ　　
ｅｔ　　ａｌ、、５ｕｐｒａ）、およびｐＭＴｂ４ＫＳ
２を使用する二本鎖の配列決定の試みは、はとんど皮切
しなかった。

必要に応じてプライマーを合皮するために、９ＭＴｂ４
ＳＫ２中のミコバクテリアの断片に沿って単一方向にお
いて「ウオーク（ｗａｌｋ）Ｊすることが可能であった
。これは欠失をつくり、モして欠失を含有するクローン
を同定する試みより効率よい。プライマーは、必要に応
じて、破壊されたｐＢＲ３２２ＥｃｏＲＶ部位から約４
０塩基はなれて出発して発生させた。最良の条件下に、
最初の１２５塩基のみをｐＭＴｂ４ＫＳ２中で決定する
ことができた。しかしながら、９ＭＴｂ４ＳＫ２におい
て、５つのプライマーを発生させ、そしてｐＭＴｂ４Ｓ
Ｋ２配列の決定に使用した。

これにより、制限エンドヌクレアーゼの消化により決定
されたｐＭＴｂ４の前に構成した地図においてＢａｍＨ
Ｉの補正を行うことができた。ペイチル（Ｐａｔｅｌ）
ら、５ｕｐｒａ、第４図、ｐ。

５４１６゜ ｐ　Ｍ　Ｔ　ｂ　ｄ中のミコバクテリアのインサートは
、２つの５０７および５０９塩基対のほぼ同一の断片か
ら構成されている（第１図）。この図面は、２つのほぼ
同一の二量体の断片の１つのみを示す。

ヌクレオチド配列はコンピュータープログラム「ＰＣＧ
ＥＮＥＪおよびＤＮＡインスベクター１１＋（Ｉｎｔｅ
ｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｉｎｃ、）を使用して分析した
。結果を組み合わせることによって、グアニン＋シトシ
ン（ＣＣ）の含量は６９％であり、これは発表された報
告と一致する。データバンクをスクリーニングして、本
質的に挿入配列との、可能な相同性をさがした。有意の
相同性は発見されなかった。

実施例２ およびＭ−ｔｕｂ／ｅｒｃｕｌｏｓｉｓ特異的プロ材料
および方法 Ａ、　オリゴヌクレオチドのプライマーの合皮ｐＭＴｂ
４ＳＫ２から決定したヌクレオチド配列から誘導しかつ
１７〜２２ヌクレオチドの範囲のｏｒｍを、ホスホルア
ミダイト化学に基づいて自動化ＤＮＡ合戊合皮（ＢＩＯ
ＳＥＡＲＣＨ８６００、カリフォルニア州すンラフェロ
）で発生させた。合成後、プライマー溶液をガラスのバ
イアルに移し、そして濃水酸化アンモニウムとともに５
０°Ｃにおいて４時間インキュベーションした。

水酸化アンモニウムをスピード−バク（Ｓｐｅｅｄ−Ｖ
ａｃ）／コンセントレーター（Ｓａｖａｎｔ　　ｉｎｓ
ｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｉｎｃ、、ニューヨーク州）中の蒸
発させ、ペレットを０．５ｍＱの無菌の脱イオン蒸留水
で２回洗浄および乾燥した。ペレットを最後に０．５ｒ
ｒｌの１０ミリモルのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８，０，１
ミリモルのＥ度を分光光度計で決定し、そしてアリコー
トをポリアクリルアミドゲルに適用して、それが劣化し
いことを評価した。

Ｂ、　ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ　ＣＲ）による増担 ＰＣＨのための反応緩衝液は５０ミリモルのＫＣｌ５１
０ミリモルのトリス−ＭＣ１％ｐＨ８゜４．１．５ミリ
モルのＭｇＣ＋、、および０．０１％のゼラチンから或
っていた。１００μａの反応混合物はＤＮＡ、１μモル
までのプライマーｌ×反応緩衝液、および０．２ミリモ
ルのプライマーに対してｄＡＴＰ、ｄＣＴＰｌｄＧＴＰ
、およびｄＴＴＰを含有した。体積を無菌の脱イオン蒸
留水で構成した。反応混合物を９５℃において第１変性
工程のためにインキユベーシーンし、管を瞬間的に遠心
し、そして直ちに氷上に配置し、その間Ｔａｇポリメラ
ーゼおよび鉱油を添加した。

アニーリング温度は３７℃または５５℃であり、モして
合成を７２℃において実施した。反応を手動であるいは
ＤＮＡの熱サイクラ−（Ｐｅｒｋｉｎ　　Ｅ　１ｍｅ　
ｒ　　Ｃｅ　ｔ　ｕ　ｓ）により進行させた。

２５サイクルの終わりにおいて、管を室温に冷却し、遠
心し、次いで鉱油のできるたけ多くを除去した。反応物
を４℃で貯蔵した。

反応物のｌ／ｌＯの体積（１０μ＜２）を４％Ｎｕｓｉ
ｅｖｅ　（ＦＭＣＢｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ。

メイン州ロックランド）、３％のＮｕＳｉｅｖｅ＋１％
のアガロース、１．８％のアガロース、または６％のポ
リアクリルアミドゲル上に適用し、そしてＩＸＴＢＥ緩
衝液で１００ボルトで２時間展開した（Ｐａｔｅｌら、
１９８９．５ｕｐｒａ）。ゲルを０．５μｇ　／　ｍ　
Ｑの臭化エチジウムで染色し、そして紫外線で可視化し
たＰＣＲ産生物をポラロイド６６７フイルムで前に記載
されたように写真に取った（Ｐａｔｅｌら、１９８９．
５ｕｐｒａ）ａ標準の手順（Ｍａｎｉａｔｉｓら、５ｕ
ｐｒａ）をサザンのトランスファー（ｔｒａｎｓ　ｆ　
ｅ　ｒ）　、ニック翻訳およびオートラジオグラフィー
について実施するかｌあるいは前に記載されたように修
飾した（Ｐａｔｅｌら、１９８９．５ｕｐｒａ）。

蔓至 ｐＭＴｂ４ＳＫ２から決定したヌクレオチド配列（第１
図）を使用して、２対のプライマー、ＡＢおよびＣＤ、
を第２図に示すように合成した。

これらのプライマーをＭ、ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓＩｓお
よびＭ、ａｖｉｕｍからのＤＮＡとのポリメラーゼ連鎖
反応において使用した。ｌｐｇのＤＮＡを使用して、多
数の断片をプライマーＡＢおよびより少ない程度にＣＤ
をもつＭ、ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのＤＮＡ中で増幅
した。ここで使用したＭ、ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの
菌株は、次の通りであった＝Ｍ、ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓ
ｉｓ　　Ｈ３７Ｒｖ　　ＡＴＣＣ２３６１８およびＡＴ
ＣＣ２５６１８；Ｍ、ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　　Ｈ
３７Ｒａ　　ＡＴＣＣ２５１７７；Ｍ。

ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　　Ｈ４Ｒａ　　ＡＴＣＣ３
５９１７；Ｍ、ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＥｒｄｍａｎ
　　ＡＴＣＣ３５８０１；Ｍ、ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉ
ｓ　　Ｉｎｄｉａｎ　　ＡＴＣＣ３５８１１およびＭ、
ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　　　Ａｏｙａｍａ　　　Ａ
ＴＣＣ３５８１３゜プライ？−ＡＢをもつＭ、ａｖｉｕ
ｍ　　ＤＮＡ中で多少の増幅が存在するが、プライマー
ＣＤでは容易には可視化されなかった。これらの手順に
おいて使用したＭ、ａｖｉｕｍ　　ＤＮＡは、Ｍ。

ａｖｉｕｍ菌株ＡＴＣＣ２５２９１，Ｍ、ａｖｉｕｍ　
　Ｐａ５ｔｅｕｒ　　８０６３、および土からの同定し
ないＭ、ａｖｉｕｍから抽出した。

これらのゲル中のＤＮＡをニトロセルロースのフィルタ
ーに移シ、次いでフィルターを［アルファー３２Ｐ］標
識したＰＣＲ産生物でプロービングしたａＭ、ｔｕｂｅ
ｒｃｕｌｏｓｉｓ　　ＤＮＡ中で増幅された断片とのハ
イブリダイゼーションは存在したが、Ｍ、ａｖｉｕｍ　
　ＤＮＡを含有するフィルターへの検出可能なハイブリ
ダイゼーションは存在しなかった。ｌｎｇ＝ｌｆｇのＭ
、ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　　ＤＮＡの１：１０希釈
の範囲をプライマーＡＢとのＰＣＨにおいて使用したと
き、明確なバンドはｌｎｇのレーンにおける臭化エチジ
ウム染色したゲルにおいて見ることができた。

第３図は、プライマーＣＤを使用してＭ、ｔｕｂｅｒｃ
ｕｌｏｓｉｓのＤＮＡを増幅した、サザンプロットの結
果を示す。主要なＰＣＲ増幅したバンドをゲルから切断
し、そして第３図部位種々のミコバクテリアのＤＮＡに
対する放射線標識したハイブリダイゼーションプローブ
として使用した。ＰＣＲ増幅したｒｃＤプローブ」はＭ
、ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに最も強くハイブリダイゼ
ーションした。それは、また、Ｍ、ｂｏｖｉｓＢＣＧに
ハイブリダイゼーションしたが、Ｍ、ａｖｉｕｍおよび
Ｍ、ｋａｎｓａｓｉｉにハイブリダイゼーションしなか
った。

プラスミドの受託 プラスミドｐＭＴｂ４はアメリカン・タイプ・カルチャ
ー・コレクション（ｔｈｅ　　Ａｍｅｒｉｃａｎ　　Ｔ
ｙｐｅ　　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　　Ｃｏ’１ｌｅｃｔｉｏｎ
）に１９８６年３月２０日にＥ、ｃ。

１ｉ　　Ｋ１２　　ＨＢＩＯＩ中でＡＴＣＣＮｏ。

６７０４５で受託された。

同等の実施態様 当業者は、ここに詳細に説明した本発明の特定の実施態
様に対して多数の同等の実施態様を認識するか、あるい
は日常の実験により確証することができるであろう。こ
のような同等の実施態様は特許請求の範囲に包含される
ことを意図する。

本発明の主な特徴および態様は、次の通りである。

１、ヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｔ
ｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のゲノムの核酸に特異的にハ
イブリダイゼーションすることを特徴とする分離された
核酸配列。

２、ヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｔ
ｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ウシ型結核菌（Ｍｙｃｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｂｏｖｉｓ）、およびウシ型結核
ｍＷ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｂｏｖｉｓ）の
モントリオール（Ｍｏｎｔｒｅａｌ）ｉ１株（Ｂａｃｉ
ｌｌｅ　　Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）からの核
酸にハイブリダイゼーションするが、鳥型結核苗（Ｍｙ
ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ａｖｉｕｍ）、ミコバクテ
リウム・イントラセルラレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、およびミコバクテ
リウム・スクロフラセウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ　　ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ）からの核酸にハイブ
リダイゼーションしないことを特徴とする、ヒト型結核
菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｔｕｂｅｒｃｕｌ
ｏｓｉｓ）の分離されたデオキシリボ核酸配列。

３、第１図のヌクレオチド配列またはその補体を有する
、上記第２項記載の核酸配列。

４、ポリメラーゼ連鎖反応によるミコバクテリアの核酸
の増幅により同定され、前記ポリメラーゼ連鎖反応は上
記第１項記載の核酸から誘導されたオリゴデオキシリボ
ヌクレオチドのプライマーの対を利用することを特徴と
する、分離されたデオキシリボ核酸配列。

５、オリゴデオキシリボヌクレオチドのプライマーの前
記対は第２図に示すヌクレオチド配列を有する、上記第
４項記載の分離されたデオキシリボ核酸配列。

６、上記第１項記載の核酸を含有するクローニングベク
ター ７、プラスミドｐＭＴｂ４、ＡＴＣＣ受は入れ番号６７
０４５゜ ８、核酸の試料をヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｔｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ　　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のゲノムの核
酸に特異的にハイブリダイゼーションする核酸プローブ
と接触させ、前記プローブおよび前記試料を、標識した
プローブが相補的ヌクレオチド配列と特異的にハイブリ
ダイゼーションすることができる条件下に、インキュベ
ーションし、ハイブリダイゼーションしないプローブを
除去し、そして前記試料を、ヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の存
在の指示として、ハイブリダイゼーションしたプローブ
について分析するからなることを特徴とする、ヒト型結
核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒ　ｉｕｍ　　ｔｕｂｅｒｃ
ｕｌｏｓｉｓ）の核酸を検出する方法。

９、前記核酸プローブは、ヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ　　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ウシ
型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｂｏｖｉｓ
）、およびウシ型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
　　ｂｏｖｉｓ）のモントリオール（Ｍｏｎｔｒｅａｌ
）菌株（ＢａｃｉｌＩｅ　　Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅ
ｒｉｎ）からの核酸にハイブリダイゼーションするが、
鳥型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ａｖｉｕ
ｍ）、ミコバクテリウム・イントラセルラレ（Ｍｙｃ。

ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　１ｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ
）、およびミコバクテリウム・スクロ７ラセウム（Ｍｙ
ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ
）からの核酸にハイブリダイゼーションしない、上記第
８項記載の方法。

１０、前記核酸プローブは第１図のヌクレオチド配列ま
たはその補体を有する、上記第９項記載の方法。

１１、前記グローブは、上記ｗｃ１項記載の核酸から誘
導されたオリゴデオキシリボヌクレオチドのプライマー
の対とのポリメラーゼ連鎖反応によるミコバクテリアの
核酸の増幅により同定されたデオキシリボ核酸配列から
なる、上記第１Ｏ項記載の方法。

１２、オリゴデオキシリボヌクレオチドのプライマーの
前記対は第２図に示すヌクレオチド配列を有する、上記
第１１項記載の方法。

１３、核酸プローブは標識されている、上記第８項記載
の方法。

１４、標識は放射性同位元素である０、上記第１３項記
載の方法。

１５、試験すべき核酸はポリメラーゼ連鎖反応技術によ
り増幅される、上記第８項記載の方法。

１６、試料はミコバクテリア細胞の凍結融解により調製
される、上記第８項記載の方法。

１７、ミコバクテリア細胞を約−７０℃に凍結し、次い
で融解する、上記第１６項記載の方法。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ｐＭＴｂ４のミコバクテリアのインサートの
ヌクレオチド配列を示す。ポリメラーゼ連鎖反応におい
て使用するオリゴヌクレオチドのプライマーの位置は、
また、示されている。「Ｎ」で表されているヌクレオチ
ドは、明瞭に決定されたものである。 第２図は、ポリメラーゼ連鎖反応において使用した２対
のプライマー、ＡＢおよびＣＤ、のヌクレオチド配列を
示す。これらのオリゴクレオチドのプライマーの位置は
、また、上の第１図に示されている。 第３図は、選択したミコバクテリアに対するプローブと
して、放射線標識したＰＣＲ増幅したハイブリダイゼー
ションアッセイを使用する、ハイブリダイゼーションア
ッセイの結果を示すサザンプロットである。ＰＣＲ増幅
した断片は、第１図および第２図のＣＤプライマーから
誘導され、そして鋳型としてＭ、ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓ
ｉｓＤＮＡを使用する。 Ｆ工ＧＵＲＥ　　２ ＧＧＧＴＣＧＧＴＧＡＣＴＣＣＧＧＧＧＧＣＴ　３’Ｃ
ＣＧＧＴＧＧＧＭＣＧＧＧＧＧＣＧＣＴ　３”ＴＡＣＧ
ＧＡＴＴＣＣＧＴＣＣＡＣＣＧＴＣＡＴ　３”ＣＡＣＣ
ＧＧＣＧＧＭＣＡＣＴＧＣＡ　３”ＦＩＧＵＲＥ ３ Ｍ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ＰＣＲＭ、○ｖｉｕ
ｍ Ｍ、　ｋｏｎｓａｓｉｉ ＣＧ Ｍ、　ｂｏｖｉｓ Ｍ、ｔｂ マー〃−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂ
   ｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のゲノムの核酸に特異的にハイブ
   リダイゼーシヨンプローブすることを特徴とする分離さ
   れた核酸配列。 ２、ヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂ
   ｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ウシ型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃ
   ｔｅｒｉｕｍｂｏｖｉｓ）、およびウシ型結核菌（Ｍｙ
   ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｏｖｉｓ）のモントリオール
   （Ｍｏｎｔｒｅａｌ）菌株（ＢａｃｉｌｌｅＣａｌｍｅ
   ｔｒｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）からの核酸にハイブリダイゼー
   シヨンするが、鳥型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕ
   ｍａｖｉｕｍ）、ミコバクテリウム・イントラセルラ（
   Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａ
   ｒｅ）、およびミコババクテリウム・スクロフラセウム
   （Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕ
   ｍ）からの核酸にハイブリダイゼーションしないことを
   特徴とする、ヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕ
   ｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の分離されたデオキシリ
   ボ核酸配列。 ３、ポリメラーゼ連鎖反応によるミコバクテリアの核酸
   の増幅により同定され、前記ポリメラーゼ連鎖反応は特
   許請求の範囲第１項記載の核酸から誘導されたオリゴデ
   オキシリボヌクレオチドのプライマーの対を利用するこ
   とを特徴とする、分離されたデオキシリボ核酸配列。 ４、特許請求の範囲第１項記載の核酸を含有するクロー
   ニングベクター。 ５、核酸の試料をヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒ
   ｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のゲノムの核酸に特
   異的にハイブリダイゼーションする核酸プローブと接触
   させ、前記プローブおよび前記試料を、標識したプロー
   ブが相補的ヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイゼ
   ーションすることができる条件下に、インキュベーショ
   ンし、ハイブリダイゼーションしないプローブを除去し
   、そして前記試料を、ヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔ
   ｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の存在の指示と
   して、ハイブリダイゼーションしたプローブについて分
   析するからなることを特徴とする、ヒト型結核菌（Ｍｙ
   ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の
   核酸を検出する方法。