CN115494041A - 一种通过伊文思蓝染料检测糖原的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明适用于糖原检测技术领域，提供了一种通过伊文思蓝染料检测糖原的方法，包括以下步骤：步骤（1）配置一定量的伊文思蓝母液以及糖原母液；步骤（2）取比色皿，在比色皿中加入一定浓度的糖原母液，然后加入一定浓度的伊文思蓝母液，在室温下加水构成1mL检测体系；步骤（3）在荧光光谱仪中测试其荧光强度。本发明提供的一种通过伊文思蓝染料检测糖原的方法，相对于传统的检测方法，伊文思蓝染料检测糖原快速简单、成本低廉，并且在复杂环境下也能实现对糖原的检测。
Description
技术领域
本发明属于糖原检测技术领域，尤其涉及一种通过伊文思蓝染料检测糖原的方法。
背景技术
糖原是一种高度支化的多糖，存在于大多数生物体中，是细胞能量机制的重要组成部分。当糖原的储存或者降解受到影响，会引起有关糖原的储存疾病(GSDs)，损害人们的身体健康。针对出现各种糖原的相关疾病，出现了越来越多的糖原检测手段。
目前有关糖原检测的方法：(1)电镜法：各种组织和细胞均可以使用电镜法观察糖原颗粒。电镜检查对糖原累积症的诊断与鉴别具有的重要临床价值，但是此方法步骤繁琐，消耗时间长，对操作者要求高。(2)荧光测定法：淀粉葡萄糖苷酶将脑糖原的糖苷键水解成葡萄糖，分别测出二者的差值即为糖原分解得到的葡萄糖，通过检测葡萄糖来间接定量糖原的含量，但是此方法影响了结果的精确度。(3)试剂盒法：糖原在浓碱溶液中比较稳定，在显色前将组织放入浓碱中加热，其他成分被破坏而糖原能够保留。然而这种方法前期准备工作较多，并且不能直接测定糖原的含量。(4)免疫组化法：利用抗原抗体特异性结合的原理测出荧光强度从而计算出糖原的含量，但是由于抗体并未商品化，而且价格昂贵，大大的限制了其应用。(5)PAS(Periodic Acid Schiff)：过碘酸把糖类相邻两个碳上的羟基氧化成醛基，再用Schiff试剂和醛基反应使呈现紫红色。主要用来检测组织学上的糖类。虽然它是应用最广泛的，但是它的特异性不高，而且步骤十分繁琐。
因此，市面上被开发出来的检测糖原的方法都存在一些不可忽略的缺点，比如直接测定糖原的方法价格昂贵，成本较高，而间接法测定糖原会导致测试结果精度不够，并且需要对糖原进行前期的预处理，此过程步骤繁琐，耗费时间。
因此我们需要提供一种快速、耗时短并且能够特异性识别糖原的一种新方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种通过伊文思蓝染料检测糖原的方法，旨在解决市面上被开发出来的检测糖原的方法都存在价格昂贵，成本较高或者测试过程步骤繁琐，耗费时间的问题。
本发明是这样实现的，一种通过伊文思蓝染料检测糖原的方法，包括以下步骤：
步骤(1)：配置一定量的伊文思蓝母液以及糖原母液；
步骤(2)：取比色皿，在比色皿中加入一定浓度的糖原母液，然后加入一定浓度的伊文思蓝母液，在室温下加水构成1mL检测体系；
步骤(3)：在荧光光谱仪中测试其荧光强度。
进一步的技术方案，在步骤(2)中，伊文思蓝母液与糖原母液的浓度比为1：200。
进一步的技术方案，在步骤(3)中，加水后，用搅拌器将混合溶液搅拌均匀。
进一步的技术方案，所述糖原母液为兔肝糖原、牡蛎糖原和牛肝糖原。
相较于现有技术，本发明的有益效果如下：
本发明提供的一种通过伊文思蓝染料检测糖原的方法，相对于传统的检测方法，伊文思蓝染料检测糖原快速简单、成本低廉，并且在复杂环境下也能实现对糖原的检测。
附图说明
图1为实施例1中伊文思蓝(EB)对不同浓度兔肝糖原的荧光响应；图2和图3为实施例1中EB对不同浓度的牡蛎糖原和牛肝糖原的荧光响应。图1-3的激发波长均为600nm，发射波长均为为675nm。
图4为实施例2中EB对兔肝糖原识别(荧光响应)的检出限；图5和图6是实施例2中EB对牡蛎糖原和牛肝糖原识别的检出限。
图7为实施例3中EB对兔肝糖原的检测性能的分析结果：其中曲线1为EB+兔肝糖原，曲线2为EB，曲线3为兔肝糖原；图8为实施例3中EB对牡蛎糖原的检测性能的分析结果：曲线4为EB+牡蛎糖原、曲线5为牡蛎糖原；图9为实施例3中EB对牛肝糖原的检测性能的分析结果：曲线6为EB+牛肝糖原，曲线7为牛肝糖原。
图10为实施例4中糖原的选择性实验的柱状图。
图11为实施例5中兔肝糖原关于离子干扰性实验的柱状图；图12和图13为实施例5中牡蛎糖原和牛肝糖原关于离子干扰性实验的柱状图。
图14为实施例6中葡萄糖对糖原检测影响的干扰性实验的荧光光谱图。
图15为实施例7中EB检测兔肝糖原的耐酸碱性的柱状图；图16和17为实施例7中EB检测牡蛎糖原和牛肝糖原的耐酸碱性的柱状图。
图18为实施例8中EB检测兔肝糖原的耐高低温性的柱状图；图19和图20为实施例8中EB检测牡蛎糖原和牛肝糖原的耐高低温性的柱状图。
图21为实施例9中EB与兔肝糖原混合进行超分子组装后关于时间与荧光强度的柱状图；图22和图23为EB与牡蛎糖原和牛肝糖原混合进行超分子组装后关于时间与荧光强度的柱状图。
图24为实施例9中兔肝糖原与EB结合后的产物；图25和图26为实施例9中牡蛎糖原和牛肝糖原分别与EB结合后的产物，每隔固定时间点取样进行荧光测试，统计分析后荧光随时间变化的相关柱状图。
图27为本发明实施例3中EB与兔肝糖原之间的结合作用图；图28和图29为本发明实施例3中EB与牡蛎糖原和牛肝糖原之间的结合作用图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供的一种通过伊文思蓝染料检测糖原的方法，包括以下步骤：
步骤(1)：配置一定量的伊文思蓝母液以及糖原母液；
步骤(2)：取比色皿，在比色皿中加入一定浓度的糖原母液，然后加入一定浓度的伊文思蓝母液，在室温下加水构成1mL检测体系；
步骤(3)：在荧光光谱仪中测试其荧光强度。
本发明提供了一种通过伊文思蓝染料检测糖原的方法。本发明中，所用伊文思蓝(EB)为蓝色粉末，易溶于水，所述伊文思蓝的结构式如式1所示：
本发明中，所述伊文思蓝染料能够检测糖原，相对于之前出现的相关检测方法，伊文思蓝测试糖原直接、快速并且能特异性识别糖原。
以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述：
实施例1
伊文思蓝与糖原结合后的荧光光谱分析
1.试剂：
配置1mM伊文思蓝母液，配置10mM的兔肝糖原、牡蛎糖原和牛肝糖原母液。
2.方法：
设计三组实验，第一组糖原溶液为兔肝糖原，第二组糖原溶液为牡蛎糖原，第三组糖原溶液为牛肝糖原，每组实验各取11个比色皿，在每组11个比色皿中加入浓度为1μM、2μM、5μM、10μM、20μM、50μM、100μM、200μM、500μM、1mM、2mM的糖原溶液，然后每个比色皿都加入20μM的伊文思蓝溶液，在室温下加水快速混合均匀构成1mL检测体系，将上述的比色皿溶液分别在荧光光谱仪中测试其荧光强度，激发波长为600nm，其结果显示随着糖原浓度的增大，荧光强度都逐渐增强，并且在1μM～2mM范围内伊文思蓝分别对兔肝糖原、牡蛎糖原和牛肝糖原的响应都呈线性关系，结果如图所示，图1为EB与不同浓度的兔肝糖原结合的荧光光谱图；图2和图3为EB与不同浓度的牡蛎糖原和牛肝糖原结合的荧光光谱图。
实施例2
将实施例1中每个样品平行测定3次，线性拟合后绘图。结果参见图，图4为EB对兔肝糖原的检出限；图5和图6为EB对牡蛎糖原和牛肝糖原的检出限，经公式计算出EB检测兔肝糖原的检出限为1.01μM；检测牡蛎糖原的检出限别为2.67μM；检测牛肝糖原的检出限2.74μM。
实施例3
将伊文思蓝(20μM)分别加入到兔肝糖原、牡蛎糖原和牛肝糖原溶液中，糖原的浓度都为2mM，室温快速混合后，分别测定图7中EB+兔肝糖原(曲线1)、EB(曲线2),兔肝糖原(曲线3)；图8中EB+牡蛎糖原(曲线4)，牡蛎糖原(曲线5)；图9中EB+牛肝糖原(曲线6)、牛肝糖原(曲线7)的荧光强度，可以看出，混合后溶液的荧光全都增强，说明伊文思蓝分别对兔肝糖原、牡蛎糖原和牛肝糖原有很好的识别作用。
实施例4
取14比色皿，分别在每个比色皿中加入2mM的糖类，其中糖分别为：壳聚糖、肝素、麦芽糖、乳糖、半乳糖、阿拉伯糖、蔗糖、葡萄糖、海藻糖、核糖、甘露糖、木糖、琼脂、兔肝糖原，依次编号为1～14，每个比色皿中在进行荧光检测时EB的浓度均为20μM，在25℃下进行超分子组装，之后分别对每个样品进行荧光检测,我们还将牡蛎糖原、牛肝糖原同时进行荧光测试，编号为15和16。荧光检测的参数为：氙灯的功率为150W、激发波长为600nm。根据得到的荧光光谱，以各样品在675nm处峰高的相对强度为纵坐标，以上述16个比色皿的标号为横坐标做柱状图，样品平行测定3次，得到糖原的选择性实验的柱状图，如图10所示。
由图10可以看出，兔肝糖原对EB有明显的荧光增强的效果，并且EB同时也能够识别牡蛎糖原、牛肝糖原。而其他的糖类对EB的荧光增强效果都不明显。因此，说明EB对糖原具有优异的选择性。
实施例5
设计三组实验，第一组糖原溶液为兔肝糖原，第二组糖原溶液为牡蛎糖原，第三组糖原溶液为牛肝糖原，而且糖原浓度都为2mM，每组实验分别取9个比色皿，向每组中的9个比色皿分别添加0.5mM的K+、Mn2+、Co2+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Na+、Ni2+、Fe2+；另取三个比色皿，添加等量的蒸馏水，作为每组的空白对照，然后每个比色皿中都加入20μM的伊文思蓝母液，进行超分子组装后进行荧光检测得到了荧光光谱，根据荧光光谱图在675nm处峰高的相对强度为纵坐标，各种离子为横坐标做柱状图，每个样品做3个平行样，得到离子干扰性实验的柱状图，从图可以看出，兔肝糖原(图11)、牡蛎糖原(图12)和牛肝糖原(图13)在添加各种离子后样品的荧光均略有增强，但是与空白样品对照，这些增值均在实验误差允许的范围内。说明，在这些离子的存在下不影响EB检测糖原。
实施例6
分别向10个比色皿中加入2μM、5μM、10μM、20μM、50μM、100μM、200μM、500μM、1mM、2mM的葡萄糖溶液，然后再向每个比色皿中加入20μM的EB溶液，另取一个比色皿只加入20μM的EB溶液作为空白对照，构成1mL检测体系，进行荧光检测，检测结果如图14所示，由图14可以看出，加入不同浓度的葡萄糖溶液后，产物的荧光强度都与EB自身的背景强度基本保持相同，说明EB不能识别葡萄糖，不会对EB识别糖原时产生干扰。说明本发明提供的方法对检测糖原时的干扰性较小，因此EB方法适用于体内环境糖原的直接检测。
实施例7
设计三组实验，第一组糖原溶液为兔肝糖原，第二组糖原溶液为牡蛎糖原，第三组糖原溶液为牛肝糖原，而且糖原浓度都为2mM，每组实验分别取8个比色皿，向每组的8个比色皿中都加入20μM的EB溶液，用HCl或者NaOH将每组溶液的pH值分别调到3、4、5、6、7、8、9、10，在室温下进行超分子组装，测试荧光光谱，平行测定3次，横坐标为溶液的pH值，纵坐标为荧光光谱在675nm处峰高的相对强度，从图可以看出虽然pH在不断变化，但EB对兔肝糖原(图15)、牡蛎糖原(图16)和牛肝糖原(图17)的荧光强度影响波动幅度都很小，说明EB检测糖原对酸碱性的环境要求低，使用范围较广，也进一步说明EB检测糖原的稳定性很高。
实施例8
设计三组实验，第一组糖原溶液为兔肝糖原，第二组糖原溶液为牡蛎糖原，第三组糖原溶液为牛肝糖原，而且糖原浓度都为2mM，每组实验分别取6个比色皿，向每组的6个比色皿中加入20μM的EB溶液，将每组溶液的温度调整为4℃、25℃、37℃、45℃、65℃、85℃，在不同温度下测试荧光。如图所示，虽然温度在不断改变，EB检测兔肝糖原(图18)、牡蛎糖原(图19)和牛肝糖原(图20)的荧光强度并没有太大变化，说明EB检测糖原对温度的要求低，也说明EB测试糖原具有良好的稳定性。
实施例9
取20μM的EB溶液分别与2mM的兔肝糖原、牡蛎糖原和牛肝糖原溶液快速混合后按照时间(s)取样，绘制柱状图，从图21-23可以看出，EB和糖原之间的识别的速度特别快，在6s内混合溶液的荧光显著增强，表明EB检测兔肝糖原(图21)、牡蛎糖原(图22)和牛肝糖原(图23)快速灵敏，耗费时间短。
实施例10
将实施例9中的混合产物继续进行孵育，测试其荧光强度，结果表明在300min内，兔肝糖原(图24)、牡蛎糖原(图25)和牛肝糖原(图26)与伊文思蓝的结合产物的荧光强度几乎保持不变，说明此检测方法稳定有效。
实施例11
采用等温滴定量热仪测试EB与糖原之间的结合作用，结果如图所示：图27为EB与兔肝糖原的反应结果：△H＝-1.475E4±2138joules/mol，△S＝30.9joules/mol/deg，K＝1.57E4±3.81E3M-1；图28为EB与牡蛎糖原的反应结果：△H＝-1171±65.46joules/mol,△S＝85.7joules/mol/deg,K＝4.80E4±1.16E4M-1；图29为EB与牛肝糖原的反应结果：△H＝-1489±68.64joules/mol,△S＝86.1joules/mol/deg,K＝5.69E4±1.33E4M-1。根据热力学定律ΔG＝ΔH-TΔS，计算出它们的ΔG全部都小于0，证明EB与兔肝糖原、牡蛎糖原和牛肝糖原的结合全是自发进行的反应。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (3)
1.一种通过伊文思蓝染料检测糖原的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤（1）：配置一定量的伊文思蓝母液以及糖原母液；
步骤（2）：取比色皿，在比色皿中加入一定浓度的糖原母液，然后加入一定浓度的伊文思蓝母液，在室温下加水构成1mL检测体系；
步骤（3）：在荧光光谱仪中测试其荧光强度。
2.根据权利要求1所述的通过伊文思蓝染料检测糖原的方法，其特征在于，在步骤（2）中，伊文思蓝母液与糖原母液的浓度比为1：200。
3.根据权利要求1所述的通过伊文思蓝染料检测糖原的方法，其特征在于，在步骤（3）中，加水后，用搅拌器将混合溶液搅拌均匀。
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