ES2302605A1 - Metodo para la deteccion de glucogeno por fluorescencia. - Google Patents
Metodo para la deteccion de glucogeno por fluorescencia. Download PDFInfo
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Abstract
Método para la detección de glucógeno por fluorescencia. Se basa en la incorporación de un indicador fluorescente de glucosa al glucógeno. Se puede realizar en homogenizados de tejidos o en células vivas obtenidas a partir de órganos o de cultivos celulares. Consiste en varias etapas de rápida ejecución. 1) Preparación de la muestra 2) Marcaje fluorescente del glucógeno 3) Registro de la fluorescencia. Cuanto mayor es la intensidad de la fluorescencia más elevado es el contenido de glucógeno. Tiene aplicación científico-sanitaria, como evaluación de fármacos.
Description
Método para la detección de glucógeno por
fluorescencia.
El método se basa en la incorporación de un
derivado fluorescente de la glucosa al glucógeno mediante la acción
de las enzimas celulares. Es de aplicación en farmacología, química
y medicina, y permite valorar el efecto de diversos fármacos sobre
el glucógeno, evaluar patologías, etc.
El glucógeno constituye un almacén de grandes
cantidades de glucosa que pueden ser movilizadas de manera muy
rápida (Ferrer et al. 2003, FEBS Lett 546,
127-132). Se acumula en el cuerpo de los mamíferos
en las células del músculo esquelético y del hígado; en otras
células se almacena en bajas cantidades.
El glucógeno es un polímero ramificado de
\alpha-D-glucosa que puede llegar
a tener una masa molecular de 10^{8} Da. Se almacena en gránulos
citoplásmicos denominados glicosomas que contienen la mayoría de
las enzimas necesarias para su síntesis y degradación.
La síntesis del glucógeno ocurre en el
citoplasma, y requiere de energía proporcionada por el adenosina
trifostato (ATP), para la fosforilación de la glucosa y del uridin
trifosfato (UTP) (Alonso et al. 1995, FASEB J. 8,
1126-1137). La
\alpha-D-glucosa unida a uridin
difosfato (UDP) es la fuente de todos los residuos de glucosa que
se agregarán a la molécula de glucógeno. La
UDP-glucosa es sintetizada a partir de glucosa
1-fosfato y UTP por la UDP-glucosa
pirofosforilasa. Al igual que para otras vías del metabolismo de los
carbohidratos, la glucosa-6-fosfato
en esta vía es isomerizada a
glucosa-1-fosfato por la
fosfoglucomutasa. En el glucógeno, los enlaces glucosídicos
principales son \alpha-1,4 que son generados por
la glucógeno sintetasa. Cada intervalo de entre 8 y 10 residuos con
enlaces \alpha-1,4, hay uno enlazado en posición
\alpha-1,6, a esto se le conoce como una
ramificación. Las ramificaciones se obtienen por la acción de la
enzima ramificante o
amilo-(\alpha-1,4-a1,6)
transglucosidasa, comúnmente llamada glucosil
\alpha-4,6 transferasa.
La vía degradativa que moviliza al glucógeno
almacenado en el hígado y músculo esquelético involucra a un juego
de enzimas dando como producto primario la
glucosa-1-fosfato que se obtiene por
la fractura de los enlaces alfa1-4; cuando la
ramificación que se rompe es la alfa1-6, se libera
glucosa libre directamente (Bollen, M., et al. 1998. Biochem
J 336: 19-31).
La glucógeno fosforilasa rompe los enlaces
glucosídicos alfa1-4 entre los residuos que están
en los extremos no reductores por simple fosforólisis hasta que
quedan sólo cuatro residuos de glucosa en la ramificación. La
glucosa-1-fosfato producida por la
glucógeno fosforilasa es convertida en
glucosa-6-fosfato por la
fosfoglucomutasa.
La síntesis del glucógeno es estimulada cuando
los niveles de energía y sustratos son elevados. Así el glucógeno
del hígado se incrementa durante el estado de buena alimentación
debido a que la glucógeno sintetasa es activada alostéricamente por
glucosa-6-fosfato, mientras que la
glucógeno fosforilasa es inhibida alostéricamente por la
glucosa-6-fosfato, así como por el
ATP. Por el contrario, la degradación del glucógeno ocurre en
condiciones de demanda energética, por ejemplo durante el ayuno.
Tanto la síntesis como la degradación de glucógeno son procesos
concomitantes, y determinan los niveles de glucógeno almacenado
(Ainscow and Brand 1999, Eur. J. Biochem. 265,
1043-1055). La detección de las fluctuaciones de
glucógeno en las células ayuda a la identificación de
alteraciones
metabólicas.
metabólicas.
La inadecuada utilización de glucosa para su
incorporación al glucógeno parece ser un defecto metabólico común
en ambos tipos de diabetes mellitus (Tipo I y Tipo II) (Bogardus
and Lillioja 1990, N. Engl. J. Med. 322, 262-263;
Vaag et al. 1992, Diabetes 41, 174-182).
Además, existe un grupo de enfermedades debidas a anomalías
genéticas que provocan un defecto en alguna enzima requerida para
la síntesis o degradación del glucógeno (se clasifican en
enfermedades tipo O, IA, IB, II-VII). Los síntomas
son causados por: a.- formación de glucógeno con una estructura
anormal o, b.- la acumulación de grandes cantidades de glucógeno
normal en tejidos específicos (Van Hoof et al. 1972,
Biochimie 54, 745-752). La severidad de las
enfermedades va desde fatal en la infancia hasta desórdenes
moderados que no afectan tan drásticamente la vida. A pesar de que
ya se han utilizado algunos fármacos con éxito para tratar estas
enfermedades, sigue existiendo la necesidad de nuevos compuestos que
incrementen la utilización de glucosa regulando la síntesis de
glucógeno. Asimismo, se necesitan sistemas de detección de la
síntesis y degradación de glucógeno.
En la actualidad hay algunos métodos para medir
el glucógeno en tejidos y células de mamíferos.
El método del yodo. Se basa en que el
glucógeno reacciona con una mezcla yodada, yodo y cloruro cálcico,
formando un pigmento ámbar en solución ácida que tiene una absorción
lineal en un rango específico. El glucógeno debe ser extraído de
los tejidos con sistemas que emplean reactivos químicos agresivos
(ácido perclórico, hidróxido potásico, etanol o cloruro de amonio)
y requieren mucho tiempo.
Tinción Schiff-Ácido Periódico (P.A.S.).
Se trata de una reacción histoquímica en la cuál el ácido periódico
oxida las uniones entre carbonos formando aldehídos que reaccionan
al ácido sulfuroso-fucsina dando color magenta. La
tinción PAS es comúnmente utilizada para la detección de glucógeno
en tejidos seccionados y fijados (Schaart et al. 2004,
Histochem. Cell. Biol. 122, 161-169), pero no se
puede emplear en células vivas.
Existen otros tipos de técnicas de marcaje de
glucógeno basados en tinciones histológicas como la técnica del
ácido crómico de Bauer o la tinción con Best's carmina, que han
quedado obsoletas o son poco usadas (Graf and Klenssen 1981,
Histochemistry 73, 225-232).
Métodos de hidrólisis enzimática del
glucógeno. El principio de estos métodos consiste en que el
glucógeno se hidroliza a glucosa, y ésta se puede medir por diversas
técnicas que cuantifican la glucosa libre. El método de la
aminoglucosidasa de Dreiling et al. (Carr and Neff 1984,
Comp. Biochem. Physiol B 77, 447-449) es uno de
ellos, aunque se pueden utilizar también otras enzimas. En este
caso también es necesario homogenizar el tejido con reactivos
agresivos como el ácido perclórico, siendo inútil para
determinaciones de glucógeno in vivo.
Detección mediante inmunocitoquímica.
Este sistema de detección de glucógeno implica un doble marcaje
mediante un anticuerpo que reconoce específicamente moléculas de
glucógeno (desarrollado por O. Baba) al que se une a su vez
un segundo anticuerpo específico que lleva asociado un fluoróforo,
lo que permite que todo el complejo sea detectable mediante
fluorescencia. Este método requiere que las células estén
previamente fijadas y permeabilizadas (Garcia-Rocha
et al. 2001, Biochem. J. 357, 17-24), de
forma que no se puede marcar el glucógeno in vivo.
Marcaje radiactivo de glucógeno. Basado
en poner a disposición de la célula D-glucosa,
precursor de la molécula de glucógeno, marcada con isótopos
radiactivos, como puede ser el C^{14}. Se obtiene glucógeno
marcado con radiactividad, siendo ésta una técnica que requiere
medidas especiales debido al uso de radioisótopos y sus efectos
nocivos (Fernandez-Novell et al. 1997,
Biochem. J. 321, 227-231;
Fernandez-Novell et al. 2002, FEBS Lett
531,
222-228).
222-228).
Todos los métodos anteriores presentan
inconvenientes como:
a) no se detecta el glucógeno sino sus
metabolitos, requiriendo por tanto la destrucción del mismo.
b) no se puede detectar el glucógeno en tejidos
o células vivas puesto que el método requiere la fijación del
tejido o la permeabilización celular.
c) se emplean reactivos agresivos, nocivos o que
requieren medidas especiales debido al uso de radiactividad.
Por el contrario, la presente invención permite
una determinación dinámica y a tiempo real del glucógeno puesto que
no implica su destrucción. Se puede determinar el glucógeno en
células vivas procedentes de tejidos o cultivos celulares ya que se
emplean derivados fluorescentes de la glucosa. Estos marcadores
fluorescentes no son agresivos y son captados por las propias
células sin alterar su fisiología ni su morfología. Debido a estas
características los derivados fluorescentes de glucosa, como el
2-NBDG, se consideran buenos indicadores de
viabilidad celular (Yoshioka et al. 1996, Appl. Microbiol.
Biotechnol. 46, 400-404; Yamada et al. 2000
J. Biol. Chem. 275, 22278-22283). Así en la patente
US6207136 (Matsuoka 2001) se describe un método específicamente en
tejido vivo que se ha empleado para evaluar la captación de
sacáridos en base a que el 2-NBDG penetra en las
células por las mismas vías que la glucosa (Leira et al.
2002, Toxicol in vitro 16, 267-273; Louzao
et al 2003, J. Receptor Signal Tr. R. 23,
211-224; Louzao et al. 2005 Mini Rev. Med.
Chem. 5, 207-215). En este sentido, la patente
WO0177140 (Friederichs et al. 2001) establece la utilización
del 2-NBDG para medir la absorción celular de
nutrientes. En la patente US20040106163 (J.J. Workman and Ch.R.
Lambert 2004) se proponen técnicas no invasivas para la
determinación in vivo de la concentración de glucosa en
sangre basada en la medida de algunos parámetros en la piel, y
entre los marcadores se sugiere el
2-NBDG.
2-NBDG.
En la presente invención partimos del hecho
ampliamente documentado de que los derivados fluorescentes de la
glucosa entran en la célula como lo haría la propia glucosa. La
novedad es que comprobamos que estos derivados se incorporan
estructuralmente al glucógeno mediante un enlace glucosídico
transformando al glucógeno en fluorescente y haciendo que sea un
novedoso y eficaz método de detección.
\newpage
La presente invención describe un método para la
detección de glucógeno por fluorescencia. Consiste en la
administración a:
a) homogeneizados de tejidos o células, o
b) células vivas obtenidas a partir de un tejido
o de cultivos celulares,
de un derivado fluorescente de
glucosa que gracias al sistema enzimático celular se incorpora
mediante un enlace glucosídico para formar el glucógeno
fluorescente. Es un método no agresivo para las células o los
tejidos ya que no implica la utilización de material radiactivo ni
reactivos destructivos. Además, debido a que no interfiere en la
actividad normal del sistema enzimático celular y que no requiere
la destrucción del carbohidrato permite muestrear e identificar
procesos o compuestos que aumenten o disminuyan la síntesis de
glucógeno.
El método de detección de glucógeno propuesto es
específico puesto que se fundamenta en la síntesis y degradación
del oligosacárido que sucede en el citoplasma. Por esta razón es
selectivo dado que solamente se marca con fluorescencia el
glucógeno.
El método para la detección de glucógeno por
fluorescencia comprende, en general, varias etapas de rápida
ejecución:
1) Obtención y preparación de la muestra.
Las células vivas se aislan a partir de órganos o tejidos, o se
obtienen de cultivos celulares. Los sistemas libres de células se
consiguen homogenizando los órganos o tejidos, o realizando una
lisis por sonicación de células procedentes de cultivos.
2) Marcaje fluorescente del glucógeno. Se
basa en la incorporación al glucógeno celular de un derivado
fluorescente de la D-glucosa, como el
2-NBDG. Tanto los sistemas libres de células como
las células vivas se incuban con el derivado fluorescente de la
glucosa a 37ºC. En primer lugar, el derivado fluorescente de la
D-glucosa se transforma en el derivado fluorescente
de la glucosa-6-fosfato por acción
de la enzima hexoquinasa en presencia de ATP. El derivado
fluorescente de la glucosa-6-fosfato
es isomerizado a derivado fluorescente de la
glucosa-1-fosfato por la enzima
fosfoglucomutasa. A partir de esta glucosa 1-fosfato
fluorescente y de UTP por la UDP-glucosa
pirofosforilasa se sintetiza el derivado fluorescente de la
UDP-glucosa. Por último, este derivado se agrega a
la molécula de glucógeno como una UDP-glucosa más.
De esta forma el glucógeno se hace fluorescente. (Figura 1).
3) Registro de la fluorescencia. La
detección del glucógeno fluorescente en los sistemas libres de
células se realiza en un lector de placas de fluorescencia. En este
caso, finalizada la incubación con el derivado fluorescente de la
glucosa, el homogenizado celular se filtra para que el glucógeno
fluorescente formado quede retenido en filtros que se depositan en
placas de fluorescencia. El glucógeno fluorescente formado en las
células vivas se detecta utilizando un microscopio de fluorescencia
o confocal. En ambos casos, la intensidad de la fluorescencia
aumentará a medida que se incorporen más moléculas del
2-NBDG inicial al glucógeno, es decir al ir
sintetizándose más oligosacárido. Esto se comprueba cuando se
registra la fluorescencia obtenida al incubar homogenizados
celulares con 2-NBDG a distintos tiempos. (Figura
2). Asimismo, el glucógeno tendrá una intensidad de fluorescencia
que irá disminuyendo a medida que se fragmente y pierda residuos
que inicialmente eran 2-NBDG. La vía degradativa
que moviliza al glucógeno almacenado involucra a un juego de enzimas
dando como producto primario la
glucosa-1-fosfato que se obtiene por
la fractura de los enlaces alfa1-4; cuando la
ramificación que se rompe es la alfa1-6, se libera
glucosa libre directamente. Si partimos de glucógeno fluorescente
la molécula liberada será el derivado fluorescente de la glucosa
(Figura 3). El 2-NBDG que no se incorpora al
glucógeno sigue la ruta de la glucolisis perdiendo su fluorescencia
(Figura 4).
La presente invención proporciona un rápido,
específico y sensible método de detección de glucógeno de
aplicación científico-sanitaria. Con esta
metodología se pueden detectar alteraciones metabólicas que afecten
al glucógeno, pero también evaluar la eficacia de algunos
tratamientos en enfermedades relacionadas con este oligosacárido. En
este sentido, aquellos fármacos, como la insulina, que incrementen
la síntesis de glucógeno, producirán un aumento de la fluorescencia
del oligosacárido (Figura 5). Por el contrario, los fármacos que
favorezcan la degradación del glucógeno, co-
mo la adrenalina, salbutamol o glucagón provocarán una disminución de la fluorescencia del oligosacárido (Figura 5).
mo la adrenalina, salbutamol o glucagón provocarán una disminución de la fluorescencia del oligosacárido (Figura 5).
La presente invención describe un método para la
detección de glucógeno caracterizado por la utilización de un
marcador fluorescente de la glucosa que se incorpora al polisacárido
por un enlace glucosídico y que se puede realizar en tejidos o
células vivas. El registro de la fluorescencia se lleva a cabo en
un detector de fluorescencia o en un microscopio de fluorescencia o
confocal.
El método de detección de glucógeno fluorescente
se puede desarrollar: 1) en un sistema libre de células,
homogenizado celular o tisular, o; 2) en células vivas obtenidas a
partir de tejidos o cultivos celulares. Se aporta un ejemplo de
cada caso.
El procedimiento comprende varias etapas.
1) Obtención de las células. Se parte de
hepatocitos de rata de la línea Clone 9. El cultivo de estas
células se realiza en frascos con medio de cultivo situados en una
cámara de incubación a 37ºC y con una atmósfera humidificada que
contiene 5% de CO_{2}. Una vez alcanzada la confluencia en los
frascos de cultivo se retiran las células en una solución tampón
mediante arrastramiento con un raspador. Al final se recoge en un
tubo una suspensión de 1 mL de solución tampón en la que irán las
células correspondientes a 2 frascos de cultivo (unos 6x10^{6} en
total).
2) Lisis celular. Las células recogidas
en el tubo se mantienen en frío (en un baño de hielo) y se someten
a la acción de un ultrasonidos durante un ciclo de 30 s. Este
proceso desencadena la rotura celular y no altera la maquinaria
intracelular de los hepatocitos. Cada mL de este lisado celular se
reparte en 2 tubos (500 \muL/tubo).
3) Marcaje fluorescente. Se incuba cada
tubo de lisado celular con 500 \muM del indicador fluorescente
2-[N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino]-2-desoxi-D-glucosa
(2-NBDG) en un agitador termostatizado a 100
U/minuto de agitación durante 150 minutos a 37ºC. En este tiempo el
derivado fluorescente de la glucosa se incorpora al glucógeno
convirtiéndolo en fluorescente.
4) Filtración. Finalizada la incubación
se pasan 250 \muL del lisado celular a través de un filtro con
capacidad para retener partículas de 1,2 \mum de diámetro que
posteriormente se lava con 40 mL de etanol al 70% en un baño de
hielo. En este filtro queda retenido el glucógeno mientras que el
2-NBDG libre se lava con el etanol.
5) Registro de fluorescencia. Cada filtro
conteniendo el glucógeno fluorescente se deposita en un pocillo de
una placa de 12. La lectura de la fluorescencia de cada pocillo se
realiza en un lector de fluorescencia de placas a una \lambda de
excitación de 480 nm y \lambda de emisión de 530 nm. Cuanto mayor
es la fluorescencia más elevado es el contenido de glucógeno en las
muestras.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento comprende varias etapas.
1) Preparación de las células. Se parte
de hepatocitos de rata de la línea Clone 9. El cultivo de estas
células se realiza en frascos con medio de cultivo situados en una
cámara de incubación a 37ºC y con una atmósfera humidificada que
contiene 5% de CO_{2}. A partir de estos cultivos las células se
pasan a cubreobjetos, situados en pocillos de una placa de 8
conteniendo medio de cultivo, y se mantienen en una cámara de
incubación a 37ºC con una atmósfera humidificada que contiene 5% de
CO_{2}. Una vez alcanzada la confluencia se retira el medio de
cultivo de las células. Se añade la solución tampón en un volumen de
800 \muL.
2) Marcaje fluorescente. Se añade el
derivado fluorescente de la glucosa (2-NBDG) a los
pocillos que contienen el cubreobjetos con las células. En cada
pocillo se incuban los hepatocitos con 500 \muM de
2-NBDG durante 150 minutos a 37ºC. En este tiempo
las células captan el derivado fluorescente de la glucosa y lo
incorporan al glucógeno transformándolo en fluorescente.
3) Registro de la fluorescencia. Se
registra la fluorescencia de las células que contienen el glucógeno
marcado con el 2-NBDG mediante un microscopio
confocal utilizando un láser de Argón (\lambda 488 nm). A mayor
fluorescencia, mayor contenido de glucógeno. En este caso además se
consiguen imágenes que permiten visualizar la localización de los
depósitos de glucógeno.
Figura 1. Esquema de la síntesis de glucógeno
fluorescente. El derivado fluorescente de la glucosa
2-NBDG es el primer compuesto del esquema.
Estructuralmente es una molécula de glucosa con un radical
fluorescente situado en el carbono 2. El 2-NBDG
sigue la ruta de formación de glucógeno como lo haría la glucosa.
Atendiendo especialmente a la localización del radical
fluorescente, se observa que el carbono 2 no se ve afectado en
ninguna de las reacciones de la ruta, por lo tanto el radical se
mantiene formando parte del 2-NBDG hasta la
formación de glucógeno fluorescente.
Figura 2: Representación gráfica de la
fluorescencia obtenida cuando los lisados de células hepáticas son
incubados a 37ºC con 2-NBDG durante distintos
periodos de tiempo. Los valores de fluorescencia son más elevados a
medida que aumenta la cantidad de glucógeno fluorescente
formado.
Figura 3. Esquema de la degradación del
glucógeno fluorescente. Partiendo del glucógeno marcado con el
2-NBDG se representa la vía metabólica de
glucogenolisis. Se observa que al final de la ruta se obtienen
moléculas de 2-NBDG de la misma forma que en
condiciones metabólicas normales se liberaría glucosa.
Figura 4. Esquema de Glucólisis. Tal y como
ocurriría en la célula con la glucosa, las moléculas de
2-NBDG que no se incorporan al glucógeno serían
lisados. En esta ruta es particularmente importante la reacción de
la aldolasa. Siguiendo la trayectoria del carbono 2 del
2-NBDG original se comprueba la lisis del compuesto
y la pérdida del radical fluorescente.
Figura 5: Diagrama de barras que representa el
efecto de fármacos que aumentan los niveles de glucógeno como la
insulina y fármacos que los disminuyen como la adrenalina, el
glucagón o el salbutamol. Los lisados de células hepáticas se
incuban a 37ºC con 2-NBDG durante 150 minutos para
obtener glucógeno fluorescente. Posteriormente se añaden los
fármacos y se deja que actúen durante 30 minutos. Los valores de
fluorescencia se presentan en forma de porcentaje respecto al
control (lisado de células hepáticas sin tratamiento
farmacológico).
Claims (6)
1. Método para la detección de glucógeno por
fluorescencia en homogenizados de tejidos o células vivas que
comprende las siguientes etapas:
1) Obtención y preparación de la muestra de
tejidos o células,
2) Marcaje del glucógeno con el indicador
fluorescente, y
3) Registro de la fluorescencia en un
fluorímetro.
2. Método, según la reivindicación 1,
caracterizado porque según el apartado 1) la obtención de la
muestra se consigue homogeneizando los órganos o tejidos, o
realizando una lisis por sonicación de células procedentes de
cultivos.
3. Método, según la reivindicación 1, porque
según el apartado 2) el marcaje fluorescente está
caracterizado por la incorporación al glucógeno celular de un
derivado fluorescente de la D-glucosa, como el
2-NBDG.
4. Método, según la reivindicación 1
caracterizado porque según el apartado 3) la detección del
glucógeno fluorescente en los sistemas libres de células se realiza
en un lector de placas de fluorescencia.
5. Método, según la reivindicación 1
caracterizado porque según el apartado 3) la detección del
glucógeno fluorescente formado en las células vivas se realiza
utilizando un microscopio de fluorescencia o confocal.
6. Uso del método, según las reivindicaciones 1
a 5 en aplicaciones científico-sanitarias, como
sistema de evaluación de fármacos o para detectar alteraciones
metabólicas que impliquen al glucógeno.
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|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|
| ES200600668A ES2302605B2 (es) | 2006-03-02 | 2006-03-02 | Metodo para la deteccion de glucogeno por fluorescencia. |
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