CN103937870B

CN103937870B - 一种连续检测胰岛素敏感性的方法

Info

Publication number: CN103937870B
Application number: CN201410171872.4A
Authority: CN
Inventors: 张星; 高峰
Original assignee: Fourth Military Medical University FMMU
Current assignee: Fourth Military Medical University FMMU
Priority date: 2014-04-25
Filing date: 2014-04-25
Publication date: 2016-05-25
Anticipated expiration: 2034-04-25
Also published as: CN103937870A

Abstract

本发明公开了一种连续检测胰岛素敏感性的方法，主要利用微量外源性葡萄糖类似物示踪血液中葡萄糖摄取水平的动态变化，通过构建胰岛素效力的数学模型计算出胰岛素敏感性。本发明可以实现胰岛素敏感性的量化和连续检测，并具有非状态依赖性的特点。本发明提供的方法能够在一定程度上解决现有技术存在的问题，提高胰岛素敏感性测量的准确性、可行性和安全性。

Description

一种连续检测胰岛素敏感性的方法

技术领域

本发明属于胰岛素敏感性检测技术领域，涉及一种连续检测胰岛素敏感性的方法。

背景技术

1)胰岛素敏感性的定义及意义

胰岛素是一种由胰岛β细胞分泌的激素，主要作用于肝脏、脂肪和骨骼肌等组织促进组织对葡萄糖的吸收，维持血糖的稳定，同时参与调控碳水化合物和脂肪代谢。葡萄糖是机体最重要的代谢底物，为机体提供能量以维持生命活动。当胰岛素对葡萄糖的作用降低时出现胰岛素抵抗(胰岛素敏感性降低)的现象。胰岛素抵抗是包括2型糖尿病、肥胖、冠心病和高血压在内的很多慢性疾病的共同病理基础。胰岛素抵抗最显著的结果是高血糖和代谢紊乱，而高血糖和代谢紊乱会影响全身各个组织和器官的功能。高峰等研究发现胰岛素会激活细胞内的PI3K-Akt-eNOS生存信号(survivalsignaling)，促进细胞的生存(Circulation2002)。胰岛素信号受损是很多器官损伤的重要因素。另外，高峰等还发现在一些包括烧伤、外伤在内的急性损伤中，也存在胰岛素抵抗(急性胰岛素抵抗)，并且胰岛素敏感性和损伤程度以及预后密切相关(CritCareMed2014)。最新的研究发现胰岛素抵抗具有器官特异性。因此，检测胰岛素敏感性在生物学或医学基础研究中常用于评价器官的损伤程度，器官功能以及代谢状态。

2)现有测量方法及存在的问题

现有测量离体器官或组织胰岛素敏感性的方法主要有(PLoSOne2013,AmJPhysiolEndocrinolMetab2008)：①观察离体组织或者器官对放射性标记的外源性葡萄糖的摄取水平；②观察胰岛素下游信号分子Akt、GSK3β、eNOS等分子的磷酸化水平；③观察葡萄糖转运体4向细胞膜上转位的水平。

方法①中使用放射性标记的外源性葡萄糖，由于放射性污染而受到很大的限制(JBiolChem1998)。其次，该方法无法实现胰岛素敏感性测量的量化和连续检测。方法②和③测量的都是胰岛素下游信号被激活的水平，众所周知，这些下游信号受到很多因素的调控，因此，该方法只能间接反映胰岛素的敏感性。同样，该方法也不能实现胰岛素敏感性测量的量化和连续检测。发明内容

本发明解决的问题在于提供一种连续检测胰岛素敏感性的方法，可以实现离体器官或组织胰岛素敏感性测量的量化和连续检测。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种连续检测胰岛素敏感性的方法，包括以下操作：

1)在离体组织或者器官处于稳定的环境状态下，向离体组织或者器官循环灌流含有胰岛素和外源性葡萄糖的细胞外液；

2)循环灌流期间定期采集细胞外液样本，并测量各时间点所采集样本中总的葡萄糖水平、外源性葡萄糖的水平和胰岛素水平，按照下式计算胰岛素敏感性：

{IS}_{t} = \frac{{dG}_{u}}{dt} \times \frac{1}{I_{m}} &cong; \frac{G_{m} \times \frac{G_{e 1} - G_{e 2}}{G_{e 1}}}{I_{m} \times (t_{2} - t_{1})}

其中，IS_t为单位时间胰岛素敏感性，t₁为第一采集时间点，t₂为第二采集时间点，G_u为葡萄糖消耗的水平，I_m为间隔时间点内的平均胰岛素水平，G_m为间隔时间点内的总的葡萄糖平均水平，G_e1为第一采集时间点所测的外源性葡萄糖水平，G_e2为第二采集时间点所测的外源性葡萄糖水平。

所述的外源性葡萄糖为荧光标记的2-脱氧葡萄糖，通过荧光酶标检测法来进行检测。

总的葡萄糖水平采用血糖试纸进行测量，胰岛素水平采用ELISA方法测量；

G_m＝(G₁+G₂)/2，G₁、G₂分别是第一采集时间点、第二采集时间点所测的总的葡萄糖水平；

I_m＝(I₁+I₂)/2，I₁、I₂分别是第一采集时间点、第二采集时间点所测的胰岛素水平。

所述在灌流开始后20～120分钟内采集样本，间隔1～10min采样一次样本。

所述还通过增加采样频率实现胰岛素敏感性的连续测量。

所述还根据不同时间点所测量的IS_t绘制连续时间内胰岛素敏感性变化曲线。

一种基于胰岛素效力模型的胰岛素敏感性的测量方法，包括以下操作：

1)在数据处理器上构建如下胰岛素效力模型：

①待测对象所涉及的葡萄糖水平：

G=f(g)

G_e-f(e)

其中，G为总的葡萄糖水平，G_e为外源性葡萄糖的水平；

②待测对象所涉及的葡萄糖消耗的水平：

G_{u} = f (g) \times \frac{\frac{df (e)}{dt}}{f (e)} &cong; G_{m} \times \frac{Δ G_{e}}{Ge}

其中，G_u为葡萄糖消耗的水平，G_m为两个测量时间点内的平均血糖水平；△G_e为两个测量时间点内的G_e之差；

③单位时间胰岛素效力IE_t：表示总的胰岛素每分钟促进IE_tmM的葡萄糖进入细胞；

{IE}_{t} = \frac{{dG}_{u}}{dt} = \frac{d (f (g) \times \frac{\frac{df (e)}{dt}}{f (e)})}{dt} &cong; \frac{G_{m} \times \frac{G_{e 1} - G_{e 2}}{G_{e 1}}}{t_{2} - t_{1}}

其中，t₁为第一采集时间点，t₂为第二采集时间点，G_e1为第一采集时间点的外源性葡萄糖水平，G_e2为第二采集时间点的外源性葡萄糖水平；

④单位时间胰岛素敏感性IS_t：表示1单位胰岛素每分钟促进IS_tmol葡萄糖进入细胞；

{IS}_{t} = \frac{{dG}_{u}}{dt} \times \frac{1}{I_{m}} &cong; \frac{G_{m} \times \frac{G_{e 1} - G_{e 2}}{G_{e 1}}}{I_{m} \times (t_{2} - t_{1})}

其中，I_m为间隔时间内的平均胰岛素水平；

2)向数据处理器输入在各时间点的待测对象血液样本或培养液样本的以下检测结果：样本中总的葡萄糖水平、外源性葡萄糖的水平和胰岛素水平，将检测结果代入到胰岛素效力模型中，数据处理器经过运算获得胰岛素敏感性测量结果并输出。

所述的外源性葡萄糖的水平为荧光标记的2-脱氧葡萄糖，通过荧光酶标检测法来进行检测。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明提供的连续检测胰岛素敏感性的方法，主要利用微量外源性葡萄糖类似物(比如荧光标记的葡萄糖)示踪血液中葡萄糖摄取水平的动态变化，通过构建胰岛素效力的数学模型计算出胰岛素敏感性。首先，微量外源性葡萄糖类似物将把测量过程本身对器官或组织代谢的扰动降低到最小，并且可以直接反映器官或组织对葡萄糖的摄取水平，而非葡萄糖本身的变化水平。其次，对微量外源性葡萄糖类似物循环水平的体外检测保证了检测的灵敏度和检测过程的可行性。最后，该方法突破了现有技术的瓶颈，可以实现胰岛素敏感性的量化和连续检测，并具有非状态依赖性的特点。本发明提供的方法能够在一定程度上解决现有技术存在的问题，提高胰岛素敏感性测量的准确性、可行性和安全性。

本发明提供的连续检测胰岛素敏感性的方法，可以直接测量葡萄糖摄取水平：因为外源性葡萄糖只有摄取一种消耗途径，而且没有来源上的变化，因此该技术可以直接测量葡萄糖的摄取水平，更准确的反映胰岛素敏感性。

本发明提供的连续检测胰岛素敏感性的方法，可以实现量化和连续检测：由于可以直接测量胰岛素引起的葡萄糖摄取水平和胰岛素水平，故可以量化胰岛素的敏感性，并能够通过多次采样或者连续采样实现连续检测胰岛素敏感性。

本发明提供的连续检测胰岛素敏感性的方法，其灵敏度高：体外荧光检测可以保证足够的灵敏度(<10nM)。

本发明提供的连续检测胰岛素敏感性的方法，可行性高：外源性荧光标记的葡萄糖具有很好的稳定性，可以商品化，并批量生产；检测容易，需要的设备为可以检测荧光的酶标仪，通量高，实现容易；技术简单，易于普及和推广；安全性高，毒副作用小。

附图说明

图1为对离体心脏的灌流来进行连续测量胰岛素敏感性的测量的示意图；

图2为离体心脏灌流时外源性葡萄糖的水平变化曲线；横坐标为Time:时间，纵坐标为G_efluorescence:外源性葡萄糖荧光值；

图3为肥胖小鼠心脏胰岛素敏感性检测结果。纵坐标为Insulinsensitivity：胰岛素敏感性；Control：正常小鼠心脏；Obesity：肥胖小鼠心脏。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

本发明首先提供如下胰岛素效力模型：

①待测对象所涉及的葡萄糖水平：

G=f(g)

G_e=f(e)

其中，G为总的葡萄糖水平，G_e为外源性葡萄糖的水平；

②待测对象所涉及的葡萄糖消耗的水平：

G_{u} = f (g) \times \frac{\frac{df (e)}{dt}}{f (e)} &cong; G_{m} \times \frac{Δ G_{e}}{Ge}

{IE}_{t} = \frac{{dG}_{u}}{dt} = \frac{d (f (g) \times \frac{\frac{df (e)}{dt}}{f (e)})}{dt} &cong; \frac{G_{m} \times \frac{G_{e 1} - G_{e 2}}{G_{e 1}}}{t_{2} - t_{1}}

{IS}_{t} = \frac{{dG}_{u}}{dt} \times \frac{1}{I_{m}} &cong; \frac{G_{m} \times \frac{G_{e 1} - G_{e 2}}{G_{e 1}}}{I_{m} \times (t_{2} - t_{1})}

其中，I_m为间隔时间内的平均胰岛素水平。

在上述胰岛素效力模型的基础上，提出离体情况下连续检测胰岛素敏感性的方法(参见图1)，包括以下操作：

(1)分离离体组织或者器官，正常细胞外液(如Tyrode溶液)灌流5min，保证离体组织或者器官在体外环境状态的稳定。

(2)离体组织或者器官循环灌流含有胰岛素(按照不同目的确定胰岛素的水平)和NBD(2-[N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino])标记的2-脱氧葡萄糖(2-deoxyglucose,2-DG)的细胞外液，即含胰岛素和2-NBDG(10μM)的细胞外液。

(3)循环灌流期间间隔时间点采集细胞外液样本，间隔的时间点根据不同的目的而定，通常情况下，间隔10min采样一次，共采样3-5次，可以选择在灌流后20-120分钟内采集样本。

(4)测量采集样本中总的葡萄糖、外源性标记的葡萄糖和胰岛素的水平，按照下式计算胰岛素敏感性：

{IS}_{t} = \frac{{dG}_{u}}{dt} \times \frac{1}{I_{m}} &cong; \frac{G_{m} \times \frac{G_{e 1} - G_{e 2}}{G_{e 1}}}{I_{m} \times (t_{2} - t_{1})}

具体的，总的葡萄糖水平采用血糖试纸测量，外源性葡萄糖采用荧光测量法测量，胰岛素水平采用ELISA方法测量。由于荧光标记的2-脱氧葡萄糖具有荧光，而内源性葡萄糖没有荧光，因此可以区分出来内源性和外源性葡萄糖水平；而荧光标记的2-脱氧葡萄糖被代谢降解之后，其荧光消失，所以测量得到的荧光值与荧光标记的2-脱氧葡萄糖呈线性关系，这样通过荧光酶标仪进行荧光检测再经换算而得到代谢后剩余的外源性葡萄糖水平。

增加采样频率可以实现胰岛素敏感性的连续测量。

具体的按照上述方法，在小鼠离体心脏上进行大量的实验，结果表明这种方法简便、可靠，适用于胰岛素敏感性的量化和连续检测。主要结果如下图2、图3所示；

其中，图2为离体心脏灌流时外源性葡萄糖的水平保持非常好的线性衰减，说明离体心脏对葡萄糖的摄取水平维持在一个恒定的水平，并且利用该技术所获得的测量时间窗非常长(>100min)；图3是肥胖小鼠心脏胰岛素敏感性检测结果，结果表明该方法可以很好反映胰岛素的敏感性，可以测量到肥胖小鼠心脏胰岛素敏感性降低；

在离体组织或器官的基础上，提出基于胰岛素效力模型的胰岛素敏感性的测量方法，包括以下操作：

1)在数据处理器上构建所述的胰岛素效力模型：

这样通过各个时间采样，每个采样标本测量3种检测值就可以得到胰岛素敏感性；而且还可以依赖数据处理器的技术操作，方便的输出各种结果，包括输出胰岛素敏感性曲线。

本发明提供的胰岛素敏感性的测量方法，具有以下优势：

①该方法安全可靠、灵敏度高、检测方便，可以量化胰岛素敏感性；

②测量时间窗长，可以在灌流后30-130min内测量，该测量时间窗内葡萄糖的代谢呈现很好的线性衰减，表明该技术在该时间窗内测量会得到一致的结果；

③对胰岛素敏感性反应灵敏，该技术能够检测到胰岛素敏感性的微小变化，测量到肥胖小鼠离体心脏胰岛素敏感性的下降，这和之前的研究结果相同。

Claims

1.一种胰岛素敏感性变化曲线的制作方法，其特征在于，包括以下操作：

2)在灌流开始后20～120分钟内采集样本，间隔1～10min采样一次样本，并测量各时间点所采集样本中总的葡萄糖水平、外源性葡萄糖的水平和胰岛素水平，按照下式计算胰岛素敏感性：

{IS}_{t} = \frac{{dG}_{u}}{d t} \times \frac{1}{I_{m}} \tilde{=} \frac{G_{m} \times \frac{G_{e 1} - G_{e 2}}{G_{e 1}}}{I_{m} \times (t_{2} - t_{1})}

其中，IS_t为单位时间胰岛素敏感性，t₁为第一采集时间点，t₂为第二采集时间点，G_u为葡萄糖消耗的水平，I_m为间隔时间点内的平均胰岛素水平，G_m为间隔时间点内的总的葡萄糖平均水平，G_e1为第一采集时间点所测的外源性葡萄糖水平，G_e2为第二采集时间点所测的外源性葡萄糖水平；

最后，根据不同时间点所测量的IS_t绘制连续时间内胰岛素敏感性变化曲线；

其中，总的葡萄糖水平采用血糖试纸进行测量，胰岛素水平采用ELISA方法测量；

2.如权利要求1所述的胰岛素敏感性变化曲线的制作方法，其特征在于，所述的外源性葡萄糖为荧光标记的2-脱氧葡萄糖，通过荧光酶标检测法来进行检测。

3.如权利要求1所述的胰岛素敏感性变化曲线的制作方法，其特征在于，还通过增加采样频率实现胰岛素敏感性的连续测量。