CN112730353B

CN112730353B - 一种通过专利蓝v钙检测糖原的方法

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Publication number: CN112730353B
Application number: CN202011450038.0A
Authority: CN
Inventors: 陈志俊; 聂俊莲
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2020-12-09
Filing date: 2020-12-09
Publication date: 2021-11-02
Anticipated expiration: 2040-12-09
Also published as: CN112730353A

Abstract

本发明涉及化学检测技术领域，提供了一种通过专利蓝V钙检测糖原的方法，本发明提供的方法仅需先构建以糖原溶液的浓度为横坐标，各标准样在675nm处峰高的相对强度为纵坐标的标准工作曲线，然后将待测液与专利蓝V钙进行超分子组装后进行荧光检测，即可实现待测液中糖原的检测，操作简单，对糖原具有优异的选择性。实验结果表明，本发明提供的方法对糖原的检测具有较好的选择性，能够适用于复杂环境中糖原的检测。并且，本发明提供的方法不需要价格昂贵的原料，克服了抗体检测法需要高质量的复杂、昂贵的抗体，价格过于昂贵的缺陷，检测成本较低。

Description

一种通过专利蓝V钙检测糖原的方法

技术领域

本发明涉及化学检测技术领域，尤其涉及一种通过专利蓝V钙检测糖原的方法。

背景技术

糖原是由多个葡萄糖组成的带分支的大分子多糖，大多存储在动物体内的肝脏和骨骼肌中，肝脏中的糖原用于维持血糖平衡，骨骼肌中的糖原主要用于肌肉伸缩运动提供能量。如果糖原的储存和分解不正常，将影响人的身体健康，会出现糖原蓄积症等疾病。基于各种糖原累积症和神经性疾病等糖原相关疾病，各种针对糖原的检测手段开始出现。

目前，常用的针对糖原的检测的手段包括：(1)Periodic Acid-Schiff(PAS)染色法，该法主要原理是用过碘酸将糖原的乙醇基氧化为乙醛基，利用碱性品红制成Schiff试剂，醛基与Schiff试剂反应可以由无色变为紫红色，根据染色的深浅来确定糖原的含量。虽然PAS染色法应用较为广泛，但是此方法需要先将糖原的乙醇基氧化为乙醛基，不能直接对糖原进行检测，操作较为复杂。(2)邻甲苯胺比色法，该方法需要将糖原转化为葡萄糖，通过在热的醋酸溶液中葡萄糖与邻甲苯胺反应形成的混合物在645nm处有吸收，根据颜色深浅确定糖原含量。此方法需先将糖原转化为葡萄糖，不能直接对糖原进行检测。(3)蒽酮法，该方法利用糖原在浓硫酸的作用下脱水生成糖醛衍生物，其与蒽酮作用形成蓝色化合物。这类方以及其他光吸收法或荧光检测方法，基本都需要先用强酸或水解酶将糖原分解为葡萄糖，然后通过检测葡萄糖间接定量糖原。(4)抗体检测法，该方法通过特异性抗体与抗原结合而定量分析糖原，其中需要高质量的复杂、昂贵的抗体，价格过于昂贵。

因此，现有的针对糖原进行检测的方法操作较为复杂，不能直接对糖原进行检测；而可与直接对糖原检测的方法价格过于昂贵，检测成本高。此外，上述检测方法需要对糖原进行处理，不适用于对体内环境的糖原的直接检测。而体内环境较为复杂，若实现直接对体内复杂环境中糖原的检测，还需要提供一种成本低的、操作简单、对糖原具有优异选择性的检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种通过专利蓝V钙检测糖原的方法，本发明提供的方法检测成本低、操作简单、对糖原具有优异的选择性。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种通过专利蓝V钙检测糖原的方法，包括以下步骤：

(1)提供不同浓度的糖原溶液；

(2)将所述步骤(1)中不同浓度的糖原溶液分别与专利蓝V钙混合，进行超分子组装，得到不同浓度的糖原溶液对应的标准样；

对所述各标准样分别进行荧光检测，得到荧光光谱图；

以各糖原溶液的浓度为横坐标，以各糖原溶液对应的标准样在675nm处峰高的相对强度为纵坐标，绘制工作曲线；

(3)按照所述步骤(2)中获得荧光光谱图的方法对待测液进行处理，得到待测液对应的荧光光谱图；

根据所述待测液对应的荧光光谱图中675nm处峰高的相对强度，和所述步骤(2)绘制的工作曲线得到待测液中糖原的浓度C_样。

优选地，所述步骤(1)中糖原溶液中的糖原包括牛肝糖原、兔肝糖原和牡蛎糖原中的一种或多种。

优选地，所述步骤(1)中的糖原溶液的浓度分布为1μM～2mM。

优选地，所述步骤(2)各标准样中专利蓝V钙的浓度为10μM～50μM。

优选地，所述步骤(2)中超分子组装的温度为4～85℃。

优选地，所述步骤(3)中待测液中含有包括细胞提取物或血清。

优选地，所述步骤(2)中荧光检测的激发波长为570nm～620nm。

优选地，所述步骤(2)中荧光检测时氙灯的功率为150W。

本发明提供了一种通过专利蓝V钙检测糖原的方法，包括以下步骤：提供不同浓度的糖原溶液；将所述不同浓度的糖原溶液分别与专利蓝V钙混合，进行超分子组装，得到不同浓度的糖原溶液对应的标准样；对所述各标准样分别进行荧光检测，得到荧光光谱图；以各糖原溶液的浓度为横坐标，以各糖原溶液对应的标准样在675nm处峰高的相对强度为纵坐标，绘制工作曲线；按照上述步骤获得荧光光谱图的方法对待测液进行处理，得到待测溶对应的荧光光谱图；根据所述待测液对应的荧光光谱图中675nm处峰高的相对强度为纵坐标，和绘制的工作曲线得到待测液中糖原的浓度C_样。本发明利用专利蓝V钙与糖原之间的超分子组装得到的产物在675nm处具有较高的荧光强度，先将不同浓度的糖原溶液与专利蓝V钙混合进行超分子组装，构建以各糖原溶液的浓度为横坐标，各标准样在675nm处峰高的相对强度为纵坐标的标准工作曲线；然后将待测液与专利蓝V钙进行超分子组装后进行荧光检测，得到其在675nm处峰高的相对强度，再根据工作曲线得到待测液中的糖原浓度。本发明利用糖原与专利蓝V钙之间的超分子组装的产物具有在675nm处具有较高荧光强度的性质，使得此检测方法对糖原具有优异的选择性。实验结果表明，本发明提供的方法对糖原的检测具有较好的选择性，能够适用于复杂环境中糖原的检测。

本发明提供的方法仅需先构建以各糖原溶液的初始浓度为横坐标，各标准样在675nm处峰高的相对强度为纵坐标的标准工作曲线，然后将待测液与专利蓝V钙进行超分子组装后进行荧光检测，即可实现待测液中糖原的检测，操作简单。并且，本发明提供的方法不需要价格昂贵的原料，克服了抗体检测法需要高质量的复杂、昂贵的抗体，价格过于昂贵的缺陷，检测成本较低。

附图说明

图1为本发明实施例1标准样的荧光光谱图；

图2为本发明实施例1绘制的工作曲线；

图3为本发明实施例1中PBV与牡蛎糖原之间的结合作用图；

图4为本发明实施例1待测液的荧光光谱图；

图5为本发明实施例2标准样的荧光光谱图；

图6为本发明实施例2绘制的工作曲线；

图7为本发明实施例2中PBV与牛肝糖原之间的结合作用图；

图8为本发明实施例2待测液的荧光光谱图；

图9为本发明实施例3标准样的荧光光谱图；

图10为本发明实施例3绘制的工作曲线；

图11为本发明实施例3中PBV与兔肝糖原之间的结合作用图；

图12为本发明实施例3待测液的荧光光谱图；

图13为本发明实施例4～6离子干扰性实验的柱状图；

图14为本发明实施例7糖原的选择性实验的柱状图；

图15为发明实施例8葡萄糖对糖原检测影响的干扰实验的荧光光谱图；

图16为发明实施例9～11中PBV检测糖原的耐酸碱性的柱状图；

图17为发明实施例12～14中PBV检测糖原的耐高低温性的柱状图。

具体实施方式

(1)提供不同浓度的糖原溶液；

对所述各标准样分别进行荧光检测，得到荧光光谱图；

本发明提供不同浓度的糖原溶液。在本发明中，所述糖原溶液中的糖原优选包括牛肝糖原、兔肝糖原和牡蛎糖原中的一种或多种。本发明对所述糖原的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的市售产品即可。在本发明中，所述糖原的来源优选购为北京鼎国长生生物技术公司。

在本发明中，所述糖原溶液的浓度分布优选为1μM～2mM，更优选为1.5μM～1.5mM。在本发明中，所述糖原溶液的浓度分布为上述范围时，可以得到相应范围内的糖原浓度与荧光光谱衍射峰强度的对应关系，有利于进一步提高检测的准确性。

本发明对所述不同浓度的糖原溶液的数量没有特殊限定，根据所需要标准样的数量进行设置即可。在本发明中，所述不同浓度的糖原溶液的数量优选为4～12个，更优选为5～11个。

在本发明中，所述不同浓度的糖原溶液的数量优选为11个时，各所述不同浓度的糖原溶液的浓度优选分别为：0.7～1μM、1～2μM、2～5μM、5～10μM、10～20μM、20～50μM、50～100μM、100～200μM、200～500μM、500～1000μM和1000～2000μM；更优选分别为1μM、2μM、5μM、10μM、20μM、50μM、100μM、500μM、1mM和2mM。

在本发明中，所述糖原溶液的溶剂优选为蒸馏水。本发明对所述蒸馏水的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的市售产品即可。

得到不同浓度的糖原溶液后，本发明将所述不同浓度的糖原溶液分别与专利蓝V钙混合，进行超分子组装，得到不同浓度的糖原溶液对应的标准样。

在本发明中，所述各不同浓度的糖原溶液对应的标准样中，专利蓝V钙的浓度优选为10μM～50μM，更优选为10μM～20μM。在本发明中，所述各标准样中专利蓝V钙的浓度均相同。在本发明中，由于专利蓝V钙在620nm处具有一定的自身荧光，所述各标准样中专利蓝V钙的浓度均相同能够防止在对各标准样进行荧光检测时专利蓝V钙含量的不同对专利蓝V钙和糖原超分子组装形成的产物的荧光强度造成影响，进而可进一步提高检测结果的准确度。本发明对所述专利蓝V钙的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的市售产品即可。在本发明中，所述专利蓝V钙的来源优选为上海如吉生物科技发展有限公司。

在本发明中，所述超分子组装的温度优选为4～85℃，更优选为室温，最优选为20～25℃。本发明对所述超分子组装的时间没有特殊限定，在本发明中，由于糖原与专利蓝V钙反应速度较快，不同浓度的糖原溶液分别与专利蓝V钙混合即可实现超分子组装。在本发明中，所述超分子组装的温度为上述范围时更有利于促进糖原与专利蓝V钙进行超分子组装。

得到不同浓度的糖原溶液对应的标准样后，本发明对所述各标准样分别进行荧光检测，得到荧光光谱图。本发明对所述标准样进行荧光检测的操作没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的荧光检测的操作即可。在本发明中，所述荧光检测时使用的比色皿优选为石英材质的比色皿。本发明对所述比色皿的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的市售产品即可。

在本发明中，所述荧光检测的激发波长优选为570～620nm，更优选为600～620nm；所述荧光检测时氙灯的功率优选为150W。在本发明中，当所述荧光检测的参数为上述范围时，糖原与专利蓝V钙超分子组装后得到的产物在荧光检测时具有较强的荧光强度，更利于提高检测结果的准确度。

得到荧光光谱图后，本发明根据得到的荧光光谱图，以所述糖原溶液的浓度为横坐标，以各标准样在675nm处峰高的相对强度为纵坐标，绘制工作曲线。在本发明中，所述糖原溶液中的糖原与专利蓝V钙进行超分子组装后得到的产物在675nm处具有较强的荧光，选择675nm处的峰的峰高的相对强度为纵坐标，可以反映出糖原溶液的浓度的高低。

得到工作曲线后，本发明按照上述技术方案所述获得荧光光谱图的方法对待测液进行处理，得到待测液对应的荧光光谱图。

在本发明中，所述待测液优选含有包括细胞提取物或血清，更优选为细胞提取物。在本发明中，所述细胞提取物的制备方法优选为：将大肠杆菌在37℃的摇床里培育12～16h，OD＝3.5～4，得到菌液；取10mL所述菌液，稀释5～10倍，在控温为60～80℃，9～15s开9～15关，共超声10～15min的超声条件下破碎细胞，然后在离心力10000～15000g，离心60min，取上清液即为细胞提取物。

本发明优选将所述细胞提取物用蒸馏水进行稀释，得到待测液。在本发明中，所述细胞提取物的质量优选为蒸馏水质量的1％～5％，更优选为2％～4％。

得到待测液对应的荧光光谱图后，本发明根据所述待测液对应的荧光光谱图中675nm处峰高的相对强度，和所述工作曲线得到待测液中糖原的浓度C_样。

本发明先用不同浓度的糖原溶液与专利蓝V钙混合进行超分子组装，利用专利蓝V钙与糖原之间的超分子组装得到的产物在675nm处具有较高的荧光强度，构建以糖原溶液的浓度为横坐标，各标准样在675nm处峰高的相对强度为纵坐标的标准工作曲线。然后将待测溶液与专利蓝V钙进行超分子组装后进行荧光检测，得到其在675nm处峰高的相对强度，再根据工作曲线得到待测溶液中的糖原浓度。本发明利用糖原与专利蓝V钙之间的超分子组装的产物具有在675nm处具有较高荧光强度的性质，使得此检测方法对糖原具有优异的选择性。本发明提供的方法操作简单。并且，本发明提供的方法不需要价格昂贵的原料，克服了抗体检测法需要高质量的复杂、昂贵的抗体，价格过于昂贵的缺陷，检测成本较低。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

(1)提供不同浓度的牡蛎糖原溶液：牡蛎糖原的浓度分布为1μM～2mM

取11个石英材质的比色皿，分别向11个比色皿中依次添加牡蛎糖原，牡蛎糖原的浓度分别为的1μM、2μM、5μM、10μM、20μM、50μM、100μM、500μM、1mM和2mM。

(2)向上述11个比色皿中分别加入专利蓝V钙(以下简称PBV)，使各比色皿中的样品在荧光检测时PBV的浓度为20μM，将上述标准样在25℃下进行超分子组装，得到标准样。

对各标准样进行荧光检测，荧光检测的参数为：氙灯的功率为150W、激发波长为620nm，得到的荧光光谱，如图1所示。由图1可以看出，随着牡蛎糖原浓度的增加，在675nm处峰高的相对强度逐渐增高。

以上述标准样中对应的糖原溶液的初始浓度为横坐标，以各标准样在675nm处峰高的相对强度为纵坐标，绘制工作曲线，如图2所示。由图2可以看出，PBV和牡蛎糖原在1μM～2mM这个浓度范围内线性相关性很大，从线性相关方程式可以得出PBV检测牡蛎糖原的检出限为0.7μM。

采用ITC检测PBV与牡蛎糖原之间的结合作用，结果如图3所示。由图3可以看出，PBV与牡蛎糖原的反应焓变为ΔH-1456±1961cal/mol，根据热力学定律ΔG＝ΔH-TΔS，可以算出PBV与牡蛎糖原的ΔG小于0，说明PBV与牡蛎糖原的结合是自发进行的反应。

(3)提供待测液：将大肠杆菌在37℃的摇床里过夜培育14h，OD＝3.5，取10mL菌液，稀释5倍，在控温为60℃，10s开10s关，共超声10min的超声条件下破碎细胞，然后在离心力14000g，离心60min，取上清液用蒸馏水稀释，即为待测液。

依次向5个比色皿中加入占蒸馏水质量的1％、2％、3％、4％、5％的上清液作为待测液，此5个比色皿中的样品在荧光检测时PBV的浓度为20μM。为了作为对比，另取2个比色皿添加对比溶液，一对比溶液为浓度为20μM的PBV，二对比溶液为浓度为1mM的牡蛎糖原溶液，此对比样在测定时PBV的浓度20μM。

将上述比色皿在25℃下进行超分子组装，然后进行荧光检测，荧光检测的参数为：氙灯的功率为150W、激发波长为620nm。得到的荧光光谱，如图4所示。由图4可以看出，随着细胞提取物浓度的增加，PBV检测糖原的荧光强度基本保持一致，与不存在细胞提取物的情况下荧光强度基本相同。并且，根据图2所示的工作曲线可以得到细胞提取物中糖原的浓度为1mM。

实施例2

(1)提供不同浓度的糖原溶液：糖原的浓度分布为1μM～2mM

本步骤与实施例1步骤(1)不同之处在于将牡蛎糖原替换为牛肝糖原，其余的制备方法与实施例1相同。

(2)本步骤与实施例1步骤(2)相同。得到的荧光光谱，如图5所示。

由图5可以看出，随着牛肝糖浓度的增加，在675nm处峰高的相对强度逐渐增高。

采用ITC检测PBV与牛肝糖原之间的结合作用，结果如图6所示。由图6可以看出，PBV与牛肝糖原的反应焓变为ΔH-1.352*109±3.1771013cal/mol，根据热力学定律ΔG＝ΔH-TΔS，可以算出PBV与牛肝糖原的ΔG小于0，所以可以说明PBV与牛肝糖原的结合是自发进行的反应。

以上述标准样中对应的糖原溶液的初始浓度为横坐标，以各标准样在675nm处峰高的相对强度为纵坐标，绘制工作曲线，如图7所示。由图7可以看出，PBV和牛肝糖原在1μM～2mM这个浓度范围内线性相关性很大，从线性相关方程式可以得出PBV检测牛肝糖原的检出限为1.4μM。

(3)本步骤与实施例1步骤(3)相同，将上述比色皿在25℃下进行超分子组装，然后进行荧光检测，荧光检测的参数为：氙灯的功率为150W、激发波长为620nm。得到的荧光光谱，如图8所示。

由图8可以看出，随着细胞提取物浓度的增加，PBV检测糖原的荧光强度基本保持一致，与不存在细胞提取物的情况下荧光强度基本相同。并且，根据图7所示的工作曲线可以得到细胞提取物中糖原的浓度为1mM。

实施例3

(1)提供不同浓度的糖原溶液：糖原的浓度分布为1μM～2mM

本步骤与实施例1步骤(1)不同之处在于将牡蛎糖原替换为兔肝糖原，其余的制备方法与实施例1相同。

(2)本步骤与实施例1步骤(2)相同。得到的荧光光谱，如图9所示。由图9可以看出，随着兔肝糖原浓度的增加，在675nm处峰高的相对强度逐渐增高。

采用ITC检测PBV与兔肝糖原之间的结合作用，结果如图10所示。由图10可以看出，PBV与兔肝糖原的反应焓变为ΔH-195.0±122.1cal/mol，根据热力学定律ΔG＝ΔH-TΔS，可以算出PBV与兔肝糖原的ΔG小于0，所以可以说明PBV与牛肝糖原的结合是自发进行的反应。

以上述标准样中对应的糖原溶液的初始浓度为横坐标，以各标准样在675nm处峰高的相对强度为纵坐标，绘制工作曲线，如图11所示。由图11可以看出，PBV和兔肝糖原在1μM～2mM这个浓度范围内线性相关性很大，从线性相关方程式可以得出PBV检测兔肝糖原的检出限为1.2μM。

(3)本步骤与实施例1步骤(3)相同，将上述比色皿在25℃下进行超分子组装，然后进行荧光检测，荧光检测的参数为：氙灯的功率为150W、激发波长为620nm。得到的荧光光谱，如图12所示。由图12可以看出，随着细胞提取物浓度的增加，PBV检测糖原的荧光强度基本保持一致，与不存在细胞提取物的情况下荧光强度基本相同。并且，根据图11所示的工作曲线可以得到细胞提取物中糖原的浓度为1mM。

实施例4

为了验证PBV检测糖原的选择性，实现在体内的检测，本实施例测试了在更复杂环境中PBV检测糖原的情况，即离子干扰性实验。

(1)取11个比色皿，依次向比色皿中分别添加K⁺，Ca²⁺，Na⁺，Mg²⁺，Fe²⁺，Fe³⁺，Cu²⁺，Zn² ⁺，Ni²⁺，Co²⁺，Mn²⁺，编号依次为1～11；另取一个比色皿，添加等量的蒸馏水，编号为12。

(2)向上述12个比色皿中分别添加PBV(20μM)检测牡蛎糖原(1mM)，在25℃下进行超分子组装，然后进行荧光检测，荧光检测的参数为：氙灯的功率为150W、激发波长为620nm。得到的荧光光谱，根据荧光光谱图在675nm处峰高的相对强度为纵坐标，以上述12个比色皿的标号为横坐标做柱状图，得到离子干扰性实验的柱状图，如图13所示。

由图13可以看出，添加各种离子后样品的荧光均略有增强，但是与不加的情况相比，这些增值均在实验误差允许范围内。可见，在这些离子存在的情况下均不影响PBV检测牡蛎糖原。

实施例5

本实施例与实施例4的不同之处在于将牡蛎糖原替换为了牛肝糖原，得到了荧光光谱，根据荧光光谱图在675nm处峰高的相对强度为纵坐标，以上述12个比色皿的标号为横坐标做柱状图，如图13所示。

由图13可以看出，添加各种离子后的样品的荧光均略有增强，但是与不加的情况相比，这些增值均在实验误差允许范围内。可见，在这些离子的存在下均不影响PBV检测牛肝糖原。

实施例6

本实施例与实施例4的不同指出在于将牡蛎糖原替换为了兔肝糖原，得到了荧光光谱，根据荧光光谱图在675nm处峰高的相对强度为纵坐标，以上述12个比色皿的标号为横坐标做柱状图，如图13所示。

由图13可以看出，添加各种离子后样品荧光均略有增强，但是与不加的情况相比，这些增值均在实验误差允许范围内。可见，在这些离子的存在下均不影响PBV检测兔肝糖原。

实施例7

本实施例考察糖原的选择性实验。

取11个比色皿，分别在每个比色皿中加入1mM的糖类，其中对比物质为：葡萄糖、岩藻糖、唾液酸、蔗糖、麦芽糖、牡蛎糖原、牛肝糖原、兔肝糖原、菊糖、琼脂和肝素，每个比色皿中在进行荧光检测时PBV的浓度均为20μM。在25℃下进行超分子组装，之后分别对每个样品进行荧光检测，荧光检测的参数为：氙灯的功率为150W、激发波长为620nm。根据得到的荧光光谱，以各样品在675nm处峰高的相对强度为纵坐标，以各糖类的名称为横坐标，做柱状图，得到糖原的选择性实验的柱状图，如图14所示。

由图14可以看出，牡蛎糖原、牛肝糖原和兔肝糖原这三种糖原对PBV都有明显的荧光增强的作用，其他的糖类对PBV的荧光增强或者降低的效果都不明显。因此，PBV对糖原具有优异的选择性。

实施例8

本实施例考察葡萄糖对糖原检测影响的干扰实验。

取10个比色皿，依次向比色皿中加入浓度为1μM、2μM、5μM、10μM、20μM、50μM、100μM、200μM、500μM、1000μM的葡萄糖溶液，每个比色皿的葡萄糖溶液中加入PBV溶液，使在荧光检测时PBV的浓度均为(20μM)；另取一个比色皿加入浓度均为(20μM)的PBV溶液。

将上述样品在25℃下进行超分子组装，然后进行荧光检测。荧光检测的参数为：氙灯的功率为150W、激发波长为620nm。得到的荧光光谱，如图15所示。

由图15可以看出，无论葡萄糖的浓度多大，PBV的荧光强度都与自身的背景强度基本相同，说明PBV对葡萄糖没有识别作用，不会对PBV识别糖原产生干扰。而在体内的糖原主要是通过转化为葡萄糖来实现提供能量的作用，本发明提供的方法葡萄糖对检测糖原的干扰性较小，使得本发明提供的方法可以适用于体内环境的糖原的直接检测。

实施例9

本实施例为PBV检测牡蛎糖原的耐酸碱性。

取8个比色皿，每个比色皿中分别添加1mM的牡蛎糖原，和PBV溶液，使得在进行荧光检测时每个比色皿中PBV的浓度均为20μM。然后用HCl溶液或者NaOH溶液将每个比色皿中的样品的pH值分别调节至3、4、5、6、7、8、9、10。将上述八个样品在25℃下进行超分子组装，然后进行荧光检测，荧光检测的参数为：氙灯的功率为150W、激发波长为620nm。根据得到的荧光光谱图，以各样品在各标准样在675nm处峰高的相对强度为纵坐标，每个样品中的pH值为横坐标做柱状图，如图16所示，在图16中，从左到右依次为：牡蛎糖原-牛肝糖原-兔肝糖原。

由图16可以看出，随着pH的增加，PBV对牡蛎糖原的检测结果波动幅度很小，说明PBV检测糖原对酸碱性的环境要求低，使用范围较广，也进一步说明PBV检测糖原的稳定性很高。

实施例10

本实施例为PBV检测牛肝糖原的耐酸碱性。

本实施例与实施例9的不同之处在于将牡蛎糖原替换为了牛肝糖原，其余与实施例9相同。根据得到的荧光光谱图，以各样品在各标准样在675nm处峰高的相对强度为纵坐标，每个样品中的pH值为横坐标做柱状图，如图16所示，在图16中，从左到右依次为：牡蛎糖原-牛肝糖原-兔肝糖原。

由图16可以看出，随着pH的增加，PBV对牛肝糖原的检测结果波动幅度很小，说明PBV检测糖原对酸碱性的环境要求低，使用范围较广，也进一步说明PBV检测糖原的稳定性很高。

实施例11

本实施例为PBV检测兔肝糖原的耐酸碱性。

本实施例与实施例9的不同之处在于将牡蛎糖原替换为了兔肝糖原，其余与实施例9相同。根据得到的荧光光谱图，以各样品在各标准样在675nm处峰高的相对强度为纵坐标，每个样品中的pH值为横坐标做柱状图，如图16所示，在图16中，从左到右依次为：牡蛎糖原-牛肝糖原-兔肝糖原。

由图16可以看出，随着pH的增加，PBV对兔肝糖原的检测结果波动幅度很小，说明PBV检测糖原对酸碱性的环境要求低，使用范围较广，也进一步说明PBV检测糖原的稳定性很高。

实施例12

本实施例为PBV检测牡蛎糖原的抗高低温性。

取6个比色皿，每个比色皿中分别添加1mM的牡蛎糖原，和PBV溶液，使得在进行荧光检测时每个比色皿中PBV的浓度均为20μM。然后将每个比色皿中的样品的温度分别调节至4℃、25℃、37℃、45℃、65℃、85℃。将上述6个样品在相应的温度条件下进行超分子组装，然后进行荧光检测，荧光检测的参数为：氙灯的功率为150W、激发波长为620nm。根据得到的荧光光谱图，以各样品在675nm处峰高的相对强度为纵坐标，每个样品中的温度为横坐标做柱状图，如图17所示，在图17中，从左到右依次为：牡蛎糖原-牛肝糖原-兔肝糖原。

由图17可以看出，随着温度的增加，PBV对牡蛎糖原的检测结果波动幅度很小，说明PBV检测糖原对温度的环境要求低，使用范围较广，也进一步说明PBV检测糖原的稳定性很高。

实施例13

本实施例为PBV检测牛肝糖原的耐高低温性。

本实施例与实施例12的不同之处在于将牡蛎糖原替换为了牛肝糖原，其余与实施例12相同。根据得到的荧光光谱图，以各样品在各标准样在675nm处峰高的相对强度为纵坐标，每个样品中的温度为横坐标做柱状图，如图17所示，在图17中，从左到右依次为：牡蛎糖原-牛肝糖原-兔肝糖原。

由图17可以看出，随着温度的增加，PBV对牛肝糖原的检测结果波动幅度很小，说明PBV检测糖原对温度的环境要求低，使用范围较广，也进一步说明PBV检测糖原的稳定性很高。

实施例14

本实施例为PBV检测兔肝糖原的耐高低温性。

本实施例与实施例12的不同之处在于将牡蛎糖原替换为了兔肝糖原，其余与实施例12相同。根据得到的荧光光谱图，以各样品在各标准样在675nm处峰高的相对强度为纵坐标，每个样品中的温度为横坐标做柱状图，如图17所示，在图17中，从左到右依次为：牡蛎糖原-牛肝糖原-兔肝糖原。

由图17可以看出，随着温度的增加，PBV对兔肝糖原的检测结果波动幅度很小，说明PBV检测糖原对温度的环境要求低，这也进一步说明PBV检测糖原的稳定性很高。

由上述实施例可以看出，本发明提供的方法在多种离子存在、葡萄糖的存在等复杂的干扰物质存在的情况下对糖原的检测具有优异的选择性。并且对酸碱度和温度的环境要求低，适用范围较广，更适用于不同环境中糖原的检测。

本发明提供的方法仅需先构建以糖原溶液的浓度为横坐标，各标准样在675nm处峰高的相对强度为纵坐标的标准工作曲线，然后将待测溶液与专利蓝V钙进行超分子组装后进行荧光检测，即可实现待测溶液中糖原的检测，操作简单。

本发明提供的方法不需要价格昂贵的原料，克服了抗体检测法需要高质量的复杂、昂贵的抗体，价格过于昂贵的缺陷，检测成本较低。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种通过专利蓝V钙检测糖原的方法，包括以下步骤：

(1)提供不同浓度的糖原溶液；

对所述各标准样分别进行荧光检测，得到荧光光谱图；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中糖原溶液中的糖原包括牛肝糖原、兔肝糖原和牡蛎糖原中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的糖原溶液的浓度分布为1μM～2mM。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)各标准样中专利蓝V钙的浓度为10μM～50μM。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中超分子组装的温度为4～85℃。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中待测液中含有包括细胞提取物或血清。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中荧光检测的激发波长为570nm～620nm。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中荧光检测时氙灯的功率为150W。