KR102090139B1 - 신규 ｐ２２ｐｈｏｘ 억제제 및 이를 포함하는 류마티스 관절염 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규 p22phox 억제제, 이를 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다. 본 발명에 따른 p22phox 억제제는 새로운 테트라하이드로인다졸과 티아디아졸로 구성된 새로운 아릴 프로판아마이드 파생물로서 기존 N8 펩타이드-모방체 저분자 보다 저해 농도 50(Inhibitory concentration 50)가 100배 가까이 상당한 향상된 효능을 보였다. 또한, p22phox 저해제의 처리는 류마티스 관절염의 마우스 모델에서 주목할 만한 뚜렷한 치료적 효과를 보이므로, 이를 류마티스 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물 또는 건강 기능 식품 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

신규 ｐ２２ｐｈｏｘ 억제제 및 이를 포함하는 류마티스 관절염 예방 또는 치료용 조성물{Novel p２２phox inhibitor and composition for preventing or treating rheumatoid arthritis comprising the same}

본 발명은 신규 p22phox 억제제, 이를 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다.

류마티스 관절염(rheumatoid arthritis, RA)은 윤활액의 과형성과 무릎 관절에 점진적 손상을 이끌어 내는 둘러싸인 연골과 뼈 내로 침투에 따른 만성적인 염증으로 특징되는 전신성 자가면역 질환이다. RA에 대한 질환-수정된-항 류마티스제 (disease-modifying anti-rheumatic drugs; DMARDs; 메토트렉세이트), 항-염증제 (NSAID), 스테로이드 (프리드니손). 당질코르티코이드, 면역억제제와 면역요법 (종양괴사인자-α 와 인터루킨-1 활성을 저해)와 같은 최근 치료제는 극적으로 향상된 예후를 보인다. 하지만, 환자의 일부는 최근의 치료로 실패하고 이 면역요법은 심각한 감염의 위험을 일으킨다. 그러므로, 높은 효능과 상대적으로 낮은 부작용에 대한 시급한 요구 때문에 RA 치료법에 대해 관심이 집중되고 있다.

류마티스 관절염은 산화적 스트레스와 연관되어 있는 만성적인 자가 면역질환으로 심각한 질환이다. 니토틴아마이드 아데닌 디뉴클레오티드 인산(NAP)의 환원형 (NADPH) 산화효소의 복합체(NOX)는 RA의 병태생리에 대한 주요 표시 중 하나인 활성 산소를 생성한다. 활성 산소가 RA의 병태생리에 중요한 부분을 차지함을 보여주는 연구 결과들이 증가하고 있다. 첫째, RA 환자들은 항산화 시스템이 변했기 때문에 활성 산소의 형성, 지질 과산화, 단백질 산화, DNA 손상이 눈에 띄게 증가하고 이로 인해 조직 손상과 질병의 만성이 일어나게 된다. 둘째, 활성 산소는 IgG를 산화시켜 류마티스 인자의 형성을 촉진한다. 활성 산소는 히알루론산을 분해하여 관절의 점도를 감소시키고 단백질 및 프로테아좀의 분해에 미치는 영향을 통해 T 세포의 저 반응을 유도한다. 셋째, 활성 산소의 과량 생산은 골 흡수 및 연골 손상을 유발할 수 있다. 증가된 지질 과산화는 RA 환자의 혈청, 혈장, 적혈구, 활액에서 보고되었다. 넷째, 지질 과산화 생성물의 형성, 저밀도 지질단백질의 산화 및 단백질의 카르보닐기의 증가가 RA 환자의 활액 및 조직에서 관찰되었다. 활성 산소는 연골세포, 활막에서 활성화된 대식세포 또는 활액막에서 활성화된 호중구에 의해 RA의 염증이 있는 관절에서 형성된다. NOX 유도 슈퍼 옥사이드 음이온은 RA 환자에서 관찰되는 주요 활성 산소 중 하나이다. NOX는 조절되는 소단위체인 p47phox, p40phox, p67phox 및 소 GTP가수분해효소 Rac과 함께 공통적인 막 단백질 소단위체 p22phox와 촉매 소단위체 gp90phox로 구성된다. 주목할 만하게, 활성 산소는 관절염 동물과 RA 환자에서 NF-ĸB 및 NLRP3 인플라마좀 신호 전달을 활성화하여, 염증성 사이토카인의 생성과 관절염으로 이어지는 하위 과정을 조절하는데 관여한다. 종합적으로, 활성 산소의 생산을 통제하는 것이 RA에 대한 잠재적 치료 방법이 될 수 있다. 그러나, 활성 산소는 류마티스 관절염 병태 생리에서 요구되는 것으로 연구되어 왔지만, 분자적 표적은 아직 명확하게 규명되지 않았다.

따라서, RA의 치료를 위한 NOX를 조절할 수 있는 새로운 치료적 표적의 개발이 시급하다.

본 발명자들은 이전 연구를 통해 루비콘(Run/cysteine-rich domain-containing-Beclin1-interacting autophagy protein, Rubicon)이 NOX 복합체의 필수 양성 조절제이며, 미생물 감염 시 NOX의 p22phox와 상호작용하여 이것의 안정화 및 식포 작용 수송을 촉진하여 활성 산소 폭발, 염증성 사이토카인 생성을 유도하게 되어 강력한 항균 활성을 가지는 것을 밝혔다. 또한, 최근에 p22phox로부터 유래된 N-말단의 8개 아미노산으로 이뤄진 N8 펩타이드와 인실리코 (컴퓨터 시뮬레이션과 같은 가상 환경에서의) 가상 스크리닝된 모방 화합물이 Rubicon-p22phox 상호작용을 차단하여 활성 산소 및 염증성 사이토카인 생성을 강하게 억제함으로써 맹장-묶음-방식 (Cecal-ligation-procedure; CLP)으로 마우스에서 유도한 다균 패혈증의 사망률을 급격하게 감소시킴을 보였다[특허문헌 1].

국내 특허 공개 제2017-0091040호

이에, 본 발명자들은 생체 내 p22phox가 루비콘과 상호작용하고 증가된 활성 산소 매개 RA 병인에 필요한 것으로 확인하였으며, 기존 N8 펩타이드-모방체 화합물(화학식 1로 표시되는 화합물) 보다 현저하게 향상된 효능과 선택성을 보인 새로운 p22phox 억제제(화학식 2로 표시되는 화합물)를 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 하기 화학식 2로 표시되는 화합물을 제공하는데 그 목적이 있다.

[화학식 2]

또한, 본 발명은 4,5,6,7-테트라하이드로-2H-인다졸과 3-아이오도아니솔(iodoanisole)을 반응시켜 반응식 1의 화학식 3으로 표시되는 화합물을 제조하는 단계;

제조된 화학식 3으로 표시되는 화합물과 삼브롬화붕소(Boron tribromide)을 반응시켜 반응식 1의 화학식 4로 표시되는 화합물을 제조하는 단계;

제조된 화학식 4로 표시되는 화합물과 메틸(S)-(-)-2-클로로프로피오네이트를 반응시켜 반응식 1의 화학식 5로 표시되는 화합물을 제조하는 단계;

제조된 화학식 5로 표시되는 화합물과 수산화리튬을 반응시켜 반응식 1의 화학식 6으로 표시되는 화합물을 제조하는 단계; 및

제조된 화학식 6으로 표시되는 화합물과 2-아미노-5-트리플루오로메틸-1,3,4-티아디아졸을 반응시키는 단계 (2)를 포함하는 하기 화학식 2로 표시되는 화합물의 제조방법을 제공하는데 다른 목적이 있다.

[반응식 1]

또한, 본 발명은 하기 화학식 2로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis) 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는데 또 다른 목적이 있다.

[화학식 2]

또한, 본 발명은 하기 화학식 2로 표시되는 화합물을 포함하는 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis) 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는데 또 다른 목적이 있다.

[화학식 2]

본 발명은 화학식 2로 표시되는 화합물을 제공한다.

[화학식 2]

본 발명에서 "화학식 2로 표시되는 화합물"은 (R)-2-(3-(4,5,6,7-테트라하이드로-2H-인다졸-2-일)페녹시)-N-(5-(트리플루오로메틸)-1,3,4-티아디아졸-2-일)프로판아마이드((R)-2-(3-(4,5,6,7-tetrahydro-2H-indazol-2-yl)phenoxy)-N-(5-(trifluoromethyl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl)propanamide)이며, 이하에서는 TIPTP라 명명한다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서, 본 발명에 따른 화학식 2로 표시되는 화합물은 p22phox 억제제로서 작용할 수 있다.

상기 "p22phox 억제제"는 루비콘(Rubicon)과 p22phox의 상호작용 및 ROS-매개 염증 반응(reactive oxygen species-mediated inflammation) 억제에 관여하여, 류마티스 관절염 치료제로 이용될 수 있다.

본 발명에서 용어 "p22phox" 단백질은 인간 호중구 시토크롬 b 경쇄(human neutrophil cytochrome blight chain (CYBA))로 알려진 단백질로, 막 관련 효소의 식세포(membrane-associated enzyme phagocyte) NOX(NADPH oxidase)의 필수 구성 요소이다. 상기 NOX는 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)인 과산화물음이온(superoxide anion)을 생성하기 위한 산소의 전자 환원(reduction)을 위한 전자 공여자(electron donor)로서 NADH 또는 NADPH를 사용하며, 식세포(phagocytic cell)의 항균 활성을 위해 기능적으로 중요하다. p22phox는 내피 세포(endothelial cell) 및 혈관 평활근 세포(vascular smooth muscle cell)와 같은 많은 다른 인간 세포에서도 발현되며, 하기 표 1의 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된다.

본 발명에서 용어 "루비콘(Rubicon; Run/cysteine-rich-domain-containing-Beclin1-interacting autophagy protein)"은 자가소화작용(autophagy) 관련 단백질로, TLR2(Toll-like receptor 2)의 자극에 의해 ROS 생성에 관여하는 NOX 복합체(NADPH oxidase complex)의 구성성분 중 하나인 p22phox 단백질에 결합하여 NOX의 효소활성을 증가시켜 ROS의 생성을 촉진시키고, NF-κB 신호를 활성화시켜 염증성 사이토카인의 분비를 촉진시킴으로써 염증반응을 촉진하여 파고솜(phagosome) 내로 유입된 세균(bacteria)의 증식을 억제시키는데 있어 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 한편, 루비콘(Rubicon)은 하기 표 1의 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된다.

루비콘(Rubicon) 및 p22phox의 아미노산 서열

Gene	Accession No.	Sequence	서열번호
Rubicon(Kiaa0226)	Q92622	MRPEGAGMEL GGGEERLPEE SRREHWQLLG NLKTTVEGLV STNSPNVWSK YGGLERLCRD MQSILYHGLI RDQACRRQTD YWQFVKDIRW LSPHSALHVE KFISVHENDQ SSADGASERA VAELWLQHSL QYHCLSAQLR PLLGDRQYIR KFYTDAAFLL SDAHVTAMLQ CLEAVEQNNP RLLAQIDASM FARKHESPLL VTKSQSLTAL PSSTYTPPNS YAQHSYFGSF SSLHQSVPNN GSERRSTSFP LSGPPRKPQE SRGHVSPAED QTIQAPPVSV SALARDSPLT PNEMSSSTLT SPIEASWVSS QNDSPGDASE GPEYLAIGNL DPRGRTASCQ SHSSNAESSS SNLFSSSSSQ KPDSAASSLG DQEGGGESQL SSVLRRSSFS EGQTLTVTSG AKKSHIRSHS DTSIASRGAP ESCNDKAKLR GPLPYSGQSS EVSTPSSLYM EYEGGRYLCS GEGMFRRPSE GQSLISYLSE QDFGSCADLE KENAHFSISE SLIAAIELMK CNMMSQCLEE EEVEEEDSDR EIQELKQKIR LRRQQIRTKN LLPMYQEAEH GSFRVT SSSS QFSSRDSAQL SDSGSADEVD EFEIQDADIR RNTASSSKSF VSSQSFSHCF LHSTS AEAVA MGLLKQFEGM QLPAASELEW LVPEHDAPQK LLPIPDSLPI SPDDGQHADI YKLRIRVRGN LEWAPPRPQI IFNVHPAPTR KIAVAKQNYR CAGCGIRTDP DYIKRLRYCE YLGKYFCQCC HENAQMAIPS RVLRKWDFSK YYVSNFSKDL LIKIWNDPLF NVQDINSALY RKVKLLNQVR LLRVQLCHMK NMFKTCRLAK ELLDSFDTVP GHLTEDLHLY SLNDLTATRK GELGPRLAEL TRAGATHVER CMLCQAKGFI CEFCQNEDDI IFPFELHKCR TCEECKACYH KACFKSGSCP RCERLQARRE ALARQSLESY LSDYEEEPAE ALALEAAVLE AT (굵은 글씨는 P22PHOX와 결합하는 부분임)	1
p22phox(Cyba)	P13498	MG QIEWAMWA NEQALASGLI LITGGIVATA GRFTQWYFGA YSIVAGVFVC LLEYPRGKRK KGSTMERWGQ KHMTAVVKLF GPFTRNYYVR AVLHLLLSVP AGFLLATILG TACLAIASGI YLLAAVRGEQ WTPIEPKPRE RPQIGGTIKQ PPSNPPPRPP AEARKKPSEE EAAAAAGGPP GGPQVNPIPV TDEVV (굵은 글씨는 루비콘과 결합하는 부분임)	2

또한, 본 발명은 하기 반응식 1에 나타난 바와 같이,

4,5,6,7-테트라하이드로-2H-인다졸과 3-아이오도아니솔(iodoanisole)을 반응시켜 반응식 1의 화학식 3으로 표시되는 화합물을 제조하는 단계;

제조된 화학식 3으로 표시되는 화합물과 삼브롬화붕소(Boron tribromide)을 반응시켜 반응식 1의 화학식 4로 표시되는 화합물을 제조하는 단계;

제조된 화학식 4로 표시되는 화합물과 메틸(S)-(-)-2-클로로프로피오네이트를 반응시켜 반응식 1의 화학식 5로 표시되는 화합물을 제조하는 단계;

제조된 화학식 5로 표시되는 화합물과 수산화리튬을 반응시켜 반응식 1의 화학식 6으로 표시되는 화합물을 제조하는 단계; 및

제조된 화학식 6으로 표시되는 화합물과 2-아미노-5-트리플루오로메틸-1,3,4-티아디아졸을 반응시키는 단계 (2)를 포함하는 하기 화학식 2로 표시되는 화합물의 제조방법을 제공한다.

[반응식 1]

전술한 화학식 2로 표시되는 화합물과 관련하여 중복되는 내용에 대해서는 생략하며, 제조방법은 이하 본 발명에 따른 화합물의 실시예에서 구체적으로 설명한다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 2로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis) 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어 "예방"이란, 본 발명의 약학적 조성물의 투여로 염증성 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"란, 본 발명의 약학적 조성물의 투여로 인해 이미 유발된 류마티스 관절염의 증세가 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 의미한다.

질환, 상태, 장애, 손상 또는 건강 문제의 치료 또는 예방은 부분적이거나 또는 완전할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 더 효과적인 질환의 치료 개선, 및/또는 예방을 위하여 본 발명의 화합물 이외에 1종 이상의 추가 활성 성분, 예를 들면 질환에 대하여 치료 효과가 알려진 다른 약물을 추가로 포함할 수 있으며, 다른 약제와 병용하여 투여될 수 있다. 이를 통해서 질환의 치료 효과를 더욱 증강시킬 수 있다.

상기 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 용어 "약학적으로 허용가능한"이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다. 상기 담체는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제, 기제, 부형제, 윤활제 등 당업계에 공지된 것이라면 제한없이 사용할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 나아가, 연고제, 로션제, 스프레이제, 패취제, 크림제, 산제, 현탁제, 겔제 또는 젤의 형태의 피부 외용제의 형태로 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 제니스테인에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 61(tween 61), 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

한편, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명의 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 건강상태, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

구체적으로, 본 발명에 따른 조성물에 함유된 상기 "화학식 2로 표시되는 화합물"의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 본 발명의 상기 "화학식 2로 표시되는 화합물"은 고형분을 기준으로 1일 체중 kg 당 0.001 내지 100 mg, 바람직하게는 체중 kg 당 1 내지 10 mg, 보다 바람직하게는 1 내지 5 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 "화학식 2로 표시되는 화합물"을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 류마티스 관절염을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 용어 "대상체"란, 상기 암이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함한 모든 포유 동물을 의미하고, 본 발명의 약학적 조성물을 대상체에게 투여함으로써 류마티스 관절염을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 기존의 치료제와 병행하여 투여될 수 있다.

본 발명의 용어 "투여"란, 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 자궁내 투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수도 있다. 바람직한 투여방식 및 제제는 정맥 주사제, 피하 주사제, 피내 주사제, 근육 주사제, 점적 주사제 등이다. 주사제는 생리식염액, 링겔액 등의 수성 용제, 식물유, 고급 지방산 에스테르(예, 올레인산에칠 등), 알코올 류(예, 에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콜, 글리세린 등) 등의 비수성 용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 변질 방지를 위한 안정화제(예, 아스코르빈산, 아황산수소나트륨, 피로아황산나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등), 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제(예, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알코올 등) 등의 약학적 담체를 포함할 수 있다.

또 다른 구현예로서, 본 발명은 상기 화학식 2로 표시되는 화합물을 포함하는 류마티스 관절염 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명에서 용어 "개선"은 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 조성물을 식품으로 사용하는 경우, 상기 "화학식 2로 표시되는 화합물"을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상의 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 상기 조성물은 유효성분 이외에 식품학적으로 허용가능한 식품보조첨가제를 포함할 수 있으며, 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "식품보조첨가제"란 식품에 보조적으로 첨가될 수 있는 구성요소를 의미하며, 각 제형의 건강기능식품을 제조하는데 첨가되는 것으로서 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 식품보조첨가제의 예로는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등이 포함되지만, 상기 예들에 의해 본 발명의 식품보조첨가제의 종류가 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용되는 용어 "건강기능식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 '기능성'이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조 가능하며, 상기 제조 시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 건강기능식품의 제형 또한 건강기능식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품용 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 본 발명의 건강기능식품은 류마티스 관절염의 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.

본 발명에 따른 하나의 실시예에 있어서, p22phox 억제제에 의한 p22phox-루시콘을 직접 표적으로 하는 것이 생체 내에서 활성 산소 매개 NLRP3 인플라마좀을 억제할 수 있고 건강한 사람의 단핵 세포와 RA 환자에서 얻은 활액 세포 그리고 RA 마우스 모델에서 현저한 치료 효과를 나타냄을 보였다(도 4 및 도 10).

본 발명에 따른 하나의 실시예에 있어서, 본 발명에 따른 p22phox 억제제(화합물 2)는 콜라겐 항체 유발 류마티스관절염 마우스에 p22phox 억제제(화합물 2) 처리 후, 생존율 증가를 확인하였다(도 5).

본 발명에 따른 하나의 실시예에 있어서, 본 발명에 따른 p22phox 억제제(화합물 2)는 기존 N8 펩타이드-모방체 저분자(화합물 1) 보다 저해 농도 50(Inhibitory concentration 50)가 100배 가까이 상당한 향상된 효능을 보였다[도 10].

본 발명에 따른 p22phox 억제제는 기존 생체 내 안정성, 생체 이용률 및 대사 능력 문제를 개선하였다. 특히, 이러한 소분자 화합물은 펩타이드 및 생물학적 제제 (단클론항체)에 비해 세포막을 가로 질러 쉽게 확산되고, 비용 효과적이며, 경구 투여가 가능하고 용량의 적정이 비교적 쉽고, 대부분 비면역원성인 이점을 갖는다. RA 치료를 위한 바이오시밀러를 고려할 때, 바이오시밀러 간의 고유한 차이는 임상 효능, 안전성 및 면역원성에서 차이점을 만들 수 있다. 따라서 바이오시밀러의 교체는 임상 관리의 변화로 간주되어야 한다. 이와 관련하여 p22phox 억제제는 RA 치료제로서 개발에 귀중한 자원일 수 있다.

도 1은 인간과 마우스 RA의 루비콘과 p22phox 상호 작용을 나타낸 것이다[(A) CIA(Collagen induced arthritis, 콜라겐 유도 류마티스 관절염) 모델의 도식 (상단). CIA 마우스의 활막 세포를 포함하는 활액에서 정제된 p22phox 복합체를 질량 분석기로 분석하였다. 붉은색 글자는 질량 분광법 분석으로 확인된 펩타이드를 나타낸다. (B) 각 그룹의 발목 관절의 대표적인 헤마톡신&에오신(H&E) 염색 (위). 그룹당 5마리 마우스의 임상 관절염 점수와 발의 부종 (중간) 또는 조직병리학 점수 (하단). 스케일 바, 500 μm. 결과는 평균±표준 편차 (그룹당 5 마리의 마우스)로 표현된다. (C) 표시된 시간 동안 CIA 마우스의 활막세포를 포함하는 윤활액, αp22phox 또는 αRubicon로 IP(Immunoprecipitation) 다음에 αRubicon, αp22phox, αgp91phox, αTLR4, αTRAF6, αBeclin-1 또는 αUVRAG를 표적화한 IB를 수행하였다. WCL(Whole Cell Lysate, 전체 세포 용해물)은 α Rubicon, αp22phox, αgp91phox, αTLR4, αTRAF6, αBeclin-1, αUVRAG 또는 αActin을 갖는 IB(면역블랏팅)에 사용되었다. (D) OA 및 RA 세포는 αp22phox (Alexa Fluor 488; 녹색) 및 α Rubicon (Cy3; 적색)으로 염색되었다. 핵은 DAPI로 대조 염색되었다. 세포는 공초점 현미경으로 시각화했다 (왼쪽). 중간 패널은 p22phox와 루비콘 (위)의 염색 강도와 p22phox와 루비콘 (아래) 사이의 공존 인덱스 (%)의 양적 데이터를 보여준다. 면역 조직화학적 분석을 통해 p22phox-DAB (3,3'-디아미노벤지딘)과 루비콘-AEC (3-아미노-9-에틸 카르바졸) 발현 양상 (오른쪽). 6명의 독립적인 OA 및 RA 환자의 대표 이미지를 표시함. 인세트, 윤곽선이 확대된 영역. 스케일 바 : 200 μm. 데이터는 유사한 결과 (A, C 및 D)를 갖는 5개의 독립적인 실험을 대표한다. OA와 비교한 유의한 차이 (*** P <0.001) (다중 비교를 위해 ANOVA를 사용한 student's의 t-검정)].
도 2는 루비콘 유전자 발현의 변화가 CAIA(Collagen Antibody Induced Arthritis, 콜라겐 항체 유도 류마티스 관절염) 마우스의 사망률에 영향을 줌을 확인한 것이다[(A) 콜라겐 항체 유도 RA (CAIA) 모델 (상단)의 도식. Ad-GFP, Ad-shRubicon 또는 Ad-Rubicon (1x10¹³ pfu/kg)으로 꼬리 정맥을 통해 정맥 내로 2회 주사 후 48시간 후에 CAIA 마우스 모델을 확립하였다. CAIA 생쥐의 생존을 12일 동안 모니터링하고 그룹당 n = 10마리의 마우스에 대해 사망률을 측정하였다 (하단). Ad-GFP- 주사 마우스와 비교하여 통계적 차이를 나타냈다 (로그-랭크 테스트). 루비콘 단백질 발현 확인을 위해 αRubicon 또는 DAPI로 면역 형광 염색함 (왼쪽). αRubicon, αp22phox 또는 αActin로 면역 블랏팅함. (오른쪽). 스케일 바 : 100 μm (B). 각 군의 발목 관절의 임상 관절염 점수와 발의 부종 (C), 또는 대표적인 H&E 염색을 CAIA 후 9일에서 결정하였다 (왼쪽). 그룹당 10마리의 마우스로부터의 조직 병리학 점수 (오른쪽). 스케일 바 : 200 μm. 데이터는 유사한 결과를 갖는 3개의 독립적인 실험을 대표한다 (B 및 D). 데이터는 세 번의 실험의 평균 ± 표준 편차이다 (C)].
도 3은 화합물 2가 LPS/ATP 매개 루비콘-p22phox 상호작용과 활성 산소 매개 염증을 강력하게 억제함을 나타낸 것이다 [(A) p22phox 억제제 (화합물 2)의 구조. (B) 세포 생존 능력에 대한 MTT 분석. BMDM에 표시된 시간 동안 화합물 2와 함께 항온 배양하였다 (상층). WCL(Whole Cell Lysate, 전체 세포 용해물)은 α22phox, αRubicon 또는 αActin (lower)로 IB 하였다. (C - F) LPS (100 ng/ml)-프라이밍된 BMDMs은 1시간 동안 화합물을 처리하고, 다음 30분 동안 ATP (1 mM)로 활성화하였다. (C) NOX 활성. (D) 과산화물 및 과산화수소에 대한 FACS 분석 (상단). 활성 산소의 평균 형광 강도 (MFI)의 정량 분석 (하단). (E) αRubicon을 이용한 IP와 αB22phox, αBeclin-1, αUVRAG, αRubicon를 표적하는 IB가 진행됐다. WCL은 αp22phox, αBeclin-1, αUVRAG, αRubicon 또는 αActin로 IB 진행하였다 (왼쪽). 상등액 (SN)에서 IL-1βp17, IL-18 p18 혹은 caspase-1 p10을 IB 하였고 WCL에서 pro-IL-1βpro-IL-18 또는 pro-caspase-1 p10를 IB 하였고, αActin 로딩 대조군으로 사용하였다 (오른쪽). (F) 배양 상등액을 수확하고 사이토카인을 ELISA로 분석하였다. 데이터는 유사한 결과를 갖는 3개의 독립적인 실험을 대표한다 (B 및 E). 데이터는 세 번의 실험의 평균±표준 편차이다 (B-D 및 F). LPS/ATP 단독과 비교하여 유의한 차이 (** P <0.01; *** P <0.001) (C, D, F)].
도 4는 p22phox 억제제가 CIA 마우스에서 마우스를 보호함을 확인한 것이다 [(A) p22phox 억제제 (상단)로 치료한 CIA 모델의 도식. CIA의 활막세포를 함유하는 활액에서 과산화수소와 과산화수소에 대한 FACS 분석 (하단). (B) 각 그룹의 발목 관절의 대표적인 H&E 염색은 CIA 4주에서 결정되었다 (왼쪽). 그룹당 10마리 마우스의 임상 관절염 점수와 발의 부종 (오른쪽). 스케일 바 : 500 μm. 혈청 (C)과 활액 (D)을 CIA 4주에서 수확하고 사이토카인 ELISA으로 분석하였다. (E) 활막세포를 포함하는 윤활액은 α Rubicon 또는 αp22phox로 IP 진행하였고, α Rubicon, αp22phox, αgp91phox, αTLR4, αTRAF6, αBeclin-1 또는 αUVRAG으로 IB 진행하였다. WCL은 α Rubicon, αp22phox, αgp91phox, αTLR4, αTRAF6, αBeclin-1, αUVRAG 또는 αActin으로 IB 진행되었다. 데이터는 유사한 결과를 갖는 3개의 독립적인 실험을 대표한다 (A, B 및 E). 데이터는 세 번의 실험 (B-D)의 평균 ± 표준 편차이다. RA + 공 조건(UN, un-treated 조건) (C 및 D)과 비교하여 유의한 차이 (*** P <0.001)].
도 5는 루비콘이 발현된 CAIA 마우스의 사망률을 보호하는 p22phox 억제제를 나타낸 것이다 [p22phox 억제제 (위)로 치료한 CAIA 모델의 도식. (A) CAIA 마우스의 생존을 15일 동안 관찰하고, 사망률을 그룹당 n = 10마리의 마우스에 대해 측정하였다. Ad-Rubicon + 공 조건(UN, un-treated 조건) 과 비교하여 통계적 차이를 표기한다 (로그 순위 테스트). (B) 임상 관절염 점수와 발의 부종, 또는 (C) 각 그룹의 발목 관절의 대표적인 H&E 염색은 CAIA 9일 (왼쪽)에서 결정되었다. 그룹당 10마리의 마우스로부터의 조직 병리학 점수 (오른쪽). 스케일 바 : 200 μm. 데이터는 유사한 결과를 갖는 3개의 독립적인 실험을 대표한다. 데이터는 세 번의 실험 (B)의 평균 ± 표준 편차이다].
도 6은 p22phox 억제제가 건강한 사람 또는 RA 환자의 세포에서 활성을 나타냄을 보여준다 [(A 및 B) LPS-프라이밍한 인간 단핵 세포는 30분 동안 p22phox 억제제 (0.01, 0.1, 1 μm)로 처리 후 30분 동안 ATP로 활성화시켰다. (A) αp22phox 또는 αRubicon로 IP 진행하고, 이어서 αRubicon 또는 αp22phox로 IB 진행하였다. 로딩 대조군은 αActin으로 사용되었다. (B) 배양 상등액을 수확하고 사이토카인을 측정하기 위해 ELISA 분석하였다 (왼쪽). 상등액 (SN)에서 IL-1βp17, IL-18 p18, 또는 caspase-1 p10 및 WCL에서 pro-IL-1βpro-IL-18 또는 pro-caspase-1을 IB 진행하였다. αActin을 로딩 대조군으로 사용하였다 (오른쪽). (C-E) OA 또는 RA 환자의 LPS-프라이밍된 활막 세포는 p22phox 억제제로 처리 후 ATP로 활성화되었다. (C) αp22phox 또는 αRubicon로 IP하고, 이어서 αRubicon 또는 αp22phox로 IB 진행하였다. 로딩 대조군으로 αActin이 사용되었다. RA 환자에서 얻은 활막세포는 αp22phox (Alexa Fluor 488; 녹색) 및 αRubicon (Cy3; 적색)으로 염색하였다. 핵은 DAPI로 대조 염색되었다. 공초점 현미경으로 세포를 시각화하였다. 스케일 바 : 100 μm. (E) 배양 상등액을 수확하고 사이토카인을 측정하기 위해 ELISA 분석하였다 (왼쪽). 상등액 (SN)에서 IL-1βp17, IL-18 p18, 또는 caspase-1 p10 및 WCL에서 pro-IL-1βpro-IL-18 또는 pro-caspase-1을 IB 진행하였다. αActin을 로딩 대조군으로 사용하였다 (오른쪽). 데이터는 유사한 결과를 갖는 3개의 독립적인 실험을 대표한다 (A-E). LPS/ATP와 비교한 세 가지 실험의 평균±표준 편차와 유의한 차이가 있다 (** P <0.01; *** P <0.001, B 및 E)].
도 7은 환자의 OA와 RA 간의 p22phox와 루비콘 발현의 비교한 것이다 [p22phox와 루비콘에 대한 대표 사진은 방법에서 설명한 대로 발목 관절을 염색하였다. 데이터는 유사한 결과를 갖는 다섯 개의 독립적인 실험을 대표한다. 스케일 바, 200 μm].
도 8은 1차 및 2차 스크리닝의 "히트" 흐름 차트 및 요약을 나타낸 것이다.
도 9는 TIPTP 합성 과정을 간략히 나타낸 반응식이다.
도 10은 화합물 1과 화합물 2 사이의 IC₅₀의 비교한 것이다 [(A) 293T 세포를 V5-p22phox 및 Flag-Rubicon과 함께 형질감염시켰다. 12시간 후, 세포를 화합물 1 또는 2 (0.01, 0.1, 1, 5, 10, 20 μM)로 24시간 동안 처리하고 αFlag로 IP한 다음, αV5로 IB 진행하였다. WCL은 IB을 위해 αFlag, αV5 또는 αActin을 사용되었다. (B) BMDM의 NADPH 산화 효소 활성 또는 사이토카인을 측정하기 위해 ELISA 분석을 진행하였다. 30분 또는 18시간 동안 화합물 1 또는 2의 존재 하에 LPS로 30분 동안 자극시켰다. 데이터는 3회의 실험의 평균±SD이다. 루비콘 또는 p22phox를 발현하는 Raw264.7 세포는 화합물 1 또는 2 (0.01, 0.1, 1)로 전처리되었다. 30분 동안 LPS (100 ng/ml)로 자극한 후, αFlag 또는 αV5로 IP하고, 이어서 αp22phox, αgp91phox, αBeclin-1 또는 αUVRAG, αRubicon, αp47phox, 또는 αgp67phox로 진행하였다. WCL은 IB을 위해 αFlag 또는 αActin이 함께 사용되었다. 데이터는 유사한 결과를 갖는 3개의 독립적인 실험을 대표한다 (A, C)
도 11은 활액 병리학적 및 연골 파괴에 대한 p22phox 억제제의 효과(A) 및 염증 매개 물질의 생성에 대한 p22phox 억제제의 영향(B) 확인한 것이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명이 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 이 기술분야의 통상의 기술자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.

[재료와 방법]

1. 세포

10% FBS (Invitrogen), sodium pyruvate, 비 필수 아미노산, 페니실린 G (100 IU/ml)을 함유하는 DMEM (Invitrogen)에서 마우스 대식 세포 세포주 RAW264.7 (ATCC TIB-71; American Type Culture Collection) 및 HEK293T (ATCC-11268) 및 스트렙토 마이신 (100 ㎍/㎖)이 포함된다. 일시적인 형질전환은 Lipofectamine 3000 (Invitrogen) 또는 인산 칼슘 (Clontech)을 사용하여 제조사의 지침에 따라 수행하였다. Raw264.7 안정 세포주는 2μg/ml 퓨로마이신 (puromycin)을 갖는 표준 선택 프로토콜을 사용하여 생성하였다.

2. 1차 세포 배양

C57BL/6 마우스로부터 마우스 1차 골수 유래-대식세포 (BMDM)를 분리하고 25 ng/ml의 재조합 대식세포 콜로니 자극 인자 (M-CSF, R&D Systems, 416-ML, Minneapolis, MN, USA)의 존재 하에 3-5일 동안 DMEM에서 배양하였다. Human adherent monocytes는 건강한 피험자가 기증한 PBMC로부터 준비되었다. 한양대학교 병원에서 관절면 치환술을 시행받은 환자 중 RA (n = 16, 60.5 years ± 6.0) 또는 OA (n = 10, 59.5 years ± 7.2)를 가진 모든 여성 환자에서 시냅스 조직 검체를 얻었다. 모든 환자는 정보에 입각한 동의를 하였고, 본 연구(2017-05-003)는 승인된 한양대학교 병원 윤리위원회의 승인을 받았다. 이 연구는 인간 대상의 샘플을 사용하여 연구를 감독하는 The Red Cross (서울, 대한민국) 생명 윤리위원회의 승인을 받았다.

3. 면역 형광 분석 ( Immunofluorescence ; IF )와 면역 조직 화학적 분석 (Immunohistochemistry; IHC )

활액 조직은 약 2주 동안 10% 포르말린에 고정시키고 파라핀에 내장시켰다. 조직 슬라이드(5 um 두께)를 탈파라핀화, 탈수, 단백질 분해 효소 K (abcam, ab64220) 6000)와 반응, TPE-T (0.3% Triton X-100)로 침투시키며 BLOXALL (Vector Lab, SP-1)으로 내재 탈수소효소 제거하였다. 이어서 항체 희석제 (DAKO, S3022)에서 적절한 일차 항체와 함께 4 ℃에서 밤새 배양하였다. IF을 위해 incubated 슬라이드 2차 항체를 사용하여 시각화되었다: Alexa 488-결합된 항 마우스 항체 (Invitrogen, A11001) 및 Cy3-결합된 항 토끼 항체 (잭슨 Immunoresearch, 111-165-144). 핵을 DAPI (Thermo Scientific, p36935)로 대조 염색하였다. 염색된 세포를 시각화하기 위해 공초점 현미경 (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)을 사용하였다 면역 조직화학 염색을 위해 배양한 슬라이드에는 ABC 키트 성분 (Vector Lab, PK-6102), DAB 기질 키트 (Vector Lab, sk4100), 헤마톡실린 (Merck, 1.05174.0500)으로 대조 염색한 후 Permanent mounting medium Lab, H-5000) Permanent 마운팅 용액 (Vector Lab, H-5000)으로 마운팅하였다. 염색된 세포를 시각화하기 위해 이미지를 Nikon Eclipse Ti-U 현미경으로 수집하였다.

4. 시약 및 항체

LPS (Escherichia coli O111 : B4) 및 ATP는 Sigma로부터 구입하였다. Rubicon (ab92388)에 대한 특정 항체는 Abcam으로부터 구입하였다. Beclin-1 (3738) 및 UVRAG (5320)에 대한 항체는 Cell Signaling Technology로부터 구입하였다. gp91-phox (54.1), p22-phox (CS9), p47-phox (A-7), p67-phox (H-300), TLR4 (25), TRAF6 (D-10), IL-1β IL-18 (H-173), caspase -1 (M-20), ASC (B-3), V5 (H-9), Flag (D-8) 및 액틴 (I-19) Santa Cruz Biotechnology에서 구입하였다. NLRP3 (Cryo-2)는 AdipoGen으로부터 구입하였다.

5. 류마티스 관절염의 마우스 모델

콜라겐 유도 류마티스 관절염(CIP) 마우스 모델은 D.D. Brand, K.A. Latham, E.F. Rosloniec, Collagen-induced arthritis, Nat Protoc 2(5) (2007) 1269-75.에 설명한 대로 확립되었다.

간단히 말하자면, 수컷 DBA/1J 마우스 (6-8 주령)는 베이징 Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd (중국 베이징의 Charles River Laboratories 부서)에서 입수하여 특정 병원균이 없는 상태를 유지하였다. 병아리 콜라겐 타입 II (Chondrex, Redmond, Washington, USA)를 0.05M 아세트산에 2 mg/mL의 농도로 용해시키고 완전한 Freund's 보조제 (2mg/mL 결핵균 H37Ra, Chondrex)로 유화시켰다. 실험 초기 (0일)에 유리 주사기와 25-G 주사바늘로 꼬리에 콜라겐 100 μg을 함유한 0.1 mL 에멀젼으로 마우스를 면역화시킨 콜라겐과 불완전 Freund's 보조제 (Chondrex)로 다음 21일에 부스터를 투여하였다.

콜라겐 항체 유도 류마티스 관절염 마우스(CAIP) 모델은 D.H. Kim, D.H. Lee, M.R. Jo, D.J. Son, M.H. Park, C.J. Hwang, J.H. Park, D.Y. Yuk, D.Y. Yoon, Y.S. Jung, Y. Kim, J.H. Jeong, S.B. Han, J.T. Hong, Exacerbation of collagen antibodyinduced arthritis in transgenic mice overexpressing peroxiredoxin 6, Arthritis Rheumatol 67(11) (2015) 3058-69.에 기술된 바와 같이 유도되었다.

마우스는 3일째에 항 II 형 콜라겐 항체 칵테일 (8 mg/mouse) (Arthrogen-CIA 관절염 단일 클론 항체, no. 53010, Chondrex)을 1회 정맥 주사하고 LPS 100 μg을 복강 내 주사하여 0일 후 지시된 시간 동안 모니터링하였다. 마우스를 표시된 시간 동안 마취 하에 희생시키고 무릎 관절을 분리시켰다.

모든 동물 관련 절차는 한양대학교 기관 동물 보호 및 이용위원회 (protocol 2017-0219)에 의해 검토되고 승인되었다. 모든 동물 실험은 식품 의약품 안전청 지침에 따라 수행되었다. 류마티스 관절염의 조직학, 면역 조직화학 및 조직 병리학적 분석에 대한 자세한 내용은 다음에 설명하였다.

6. TIPTP(( R )-2-(3- (4,5,6,7- tetrahydro -2 H - indazol -2- yl ) phenoxy )- N -(5-(trifluoromethyl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl)propanamide)의 합성

p22phox의 새로운 화학적 저해제를 연구하기 위해, 본 발명자들은 일반적으로 테트라하이드로인돌로부터 5 단계로 프로판 아미드 유도체를 합성하였다.

TIPTP의 합성을 위한 상세한 실험 절차는 다음에 설명하였다.

모든 반응은 아르곤(Ar) 대기 하에서 오븐 건조 유리 제품을 사용하여 수행되었다. 상업적으로 입수할 수 있는 모든 시약과 무수 용매는 Sigma Aldrich, TCI, Alfa, Junsei, Samchun, DaeJung Chemical에서 얻었으며 더 이상 정제하지 않고 사용하였다. 용제 CH₂Cl₂를 건조시키고 통상의 프로토콜에 따라 증류시켰다. 회전 증발기를 사용하여 감압 하에 유기 용매를 증발시켰다. 용제 CH₂Cl₂를 건조시키고 통상의 프로토콜에 따라 증류시켰다. 회전 증발기를 사용하여 감압 하에 유기 용매를 증발시켰다. 반응은 시각화 제제로서 열을 가한 자외선 램프 및 KMnO4 용액을 사용하는 형광 지시계가 있는 실리카 겔 60 F254를 사용하여 TLC 분석을 수행하였다. 플래쉬 크로마토그래피는 Merck 실리카 겔 60 (0.063-0.200mm) 및 Kanto 실리카 겔 60N (구형, 중성)을 사용하여 수행하였다. ¹H NMR 스펙트럼 및 ¹³C NMR 스펙트럼을 Bruker AVANCE III HD 400으로 측정하였다. ¹H NMR 화학적 이동은 백만 분율 (δ) 하강 분에서 CHCl₃ (δ = 7.26)로 표현되고, ¹³C NMR 화학적 이동은 백만 분율 (δ)로 중심 CDCl₃ 공명 (δ = 77.0)에 비례한다. 1H NMR의 커플 링 상수는 Hz 단위이다. s = singlet, d = doublet, t = triplet, q = quartet, dd = doublet의 doublet, m = multiplet 다음과 같은 약어가 다중도를 지정하는 데 사용되었다. CDCl₃를 NMR 용제로 사용하였으며 표준물질인 TMS (tetramethylsilane)는 포함하지 않았다.

1) 2-(3- 메톡시페닐 )-4,5,6,7- 테트라하이드로 -2 H - 인다졸 (화합물 3)

톨루엔 (11mL)에 4,5,6,7-tetrahydro-2H-indazole (1.00 g, 8.18 mmol)을 녹인 용액에 3-iodoanisole (1.20 mL, 9.82 mmol), trans-1,2-cyclohexanediamine (0.20 mL. 1.64 mmol), potassium carbonate (2.40 g, 17.2 mmol), copper (I) iodide (0.080 g, 0.041 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 105 ℃에서 가열하고 밤새 교반하였다. 생성된 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 물 (60 mL)을 첨가한 후, 에틸 아세테이트 (3 x 50 mL)로 추출하였다. 합쳐진 유기층을 염수로 세척하고 감압 하에 농축시켰다. 농축액을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (핵산/에틸 아세테이트 = 10 : 1)로 정제하여 표제 화합물 (1.10g, 59%)을 고체로서 수득하였다. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.59 (s, 1H), 7.27 (t, J = 8.1 Hz, 1H), 7.23 (t, J = 2.2 Hz, 1H), 7.15 (dd, J = 8.0, 1.1 Hz, 1H), 6.75 (dd, J = 8.2, 2.4 Hz, 1H), 3.84 (s, 3H), 2.76 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 2.60 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 1.86-1.75 (m, 4H).

2) 3-(4,5,6,7- 테트라하이드로 -2 H - 인다졸 -2-일)페놀 (화합물 4)

DCM (48 mL)에 2-(3-methoxyphenyl)-4,5,6,7-tetrahydro-2H-indazole(화합물 3) (1.10 g, 4.82 mmol)을 녹인 용액을 0 ℃로 냉각시키고 BBr₃ (1.0M in DCM)(9.5 mL, 9.64 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 생성된 혼합물에 물 (60 mL)을 첨가하고 다이클로로메테인(3 x 50 mL)으로 추출하였다. 합쳐진 유기층을 염수로 세척하고 감압 하에 농축시켜 표제 화합물 (0.89 g, 86%)을 고체로서 수득하고, 이를 추가 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ7.56 (s, 1H), 7.27 (br s, 1H), 7.22 (t, J = 8.1 Hz, 1H), 7.06-7.04 (m, 1H), 6.73-6.70, 1H), 2.78 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 2.60 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 1.86-1.76 (m, 4H).

3) 메틸 ( R )-2-(3-(4,5,6,7- 테트라하이드로 -2 H - 인다졸 -2-일) 페녹시 ) 프로파노에이트 (화합물 5)

DMF (2.5 mL)에 3-(4,5,6,7-tetrahydro-2H-indazol-2-yl)phenol (화합물 4) (0.10 g, 0.47 mmol)을 녹인 용액에 탄산칼륨 (0.13 g, 0.93 mmol) 및 메틸 (S)-(-)-2-클로로프로피오네이트 (0.075 mL, 0.93 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 80 ℃에서 6시간 동안 가열하였다. 생성된 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 물 (30 mL)을 첨가한 후 에틸 아세테이트 (3 x 25 mL)로 추출하였다. 합한 유기층을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (헥산/에틸 아세테이트 = 3 : 1)로 정제하여 표제 화합물 (0.060 g, 39%)을 오일로서 수득하였다. [α]_D ²¹ = + 10.9 (c = 0.5 in CH₂Cl₂). ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ(s, 1H), 7.32-7.21 (m, 3H), 6.74-6.71 (m, 1H), 4.86 (q, J = 6.8 Hz, 1H), 3.76 (s, 3H), 2.78 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 2.60 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 1.87-1.76 (m, 4H), 1.63 (d, J = 6.8 Hz,3H).

4) ( R )-2-(3-(4,5,6,7- Tetrahydro -2 H - indazol -2- yl ) phenoxy ) propanoic acid (화합물 6)

MeOH (0.9 mL)과 H₂O (0.3 mL)에 메틸 (R)-2-(3-(4,5,6,7-테트라하이드로-2H-인다졸-2-일)페녹시)프로파노에이트 (화합물 5) (55 mg, 0.18 mmol)을 녹인 용액을 0 ℃로 냉각시키고 수산화 리튬 (6.6 mg, 0.27 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에서 제거하고, 잔류물을 물 (5 mL)로 희석시켰다. 이어서, 1N HCl (1 mL)을 생성된 용액에 적가하였다. 혼합물을 DCM (3 x 15 mL)으로 추출하고, 염수로 세척하고 감압 하에 농축시켰다. 잔류 물질을 진공 하에 건조시켜 표제 화합물 (41 mg, 81%)을 고체로서 수득하고, 이를 추가 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다. [α]_D ²² = + 16.4 (c = 0.5 in CH₂Cl₂). ¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ(s, 1H), 7.39 (t, J = 8.5 Hz, 1H), 7.25-7.23 (m, 1H), 6.88 (d, J = 8.4,1H) 2.76 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.65 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 1.90-1.81 (m, 4H), 1.61 (d, J = 6.8 Hz, 3H).

5) ( R )-2-(3-(4,5,6,7- tetrahydro -2 H - indazol -2- yl ) phenoxy )- N -(5-(trifluoromethyl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl)propanamide ( TIPTP , 화합물 2)

DMF (4 mL) 에 (R)-2-(3-(4,5,6,7-tetrahydro-2H-indazol-2-yl)phenoxy)propanoic acid (화합물 6) (41 mg, 0.14 mmol)을 녹인 용액에 N,N-diisopropylethylamine (0.12 mL, 7.16 mmol), HBTU (110 mg, 0.29 mmol) 및 2-amino-5-trifluoromethyl-1,3,4-thiadiazole (24 mg, 0.14 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 60 ℃에서 3시간 동안 교반하였다. 생성된 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 물 (10 mL)을 첨가한 후 에틸 아세테이트 (3 x 15 mL)로 추출하였다. 합쳐진 유기층을 염수로 세척하고 감압하에 농축시켰다. 농축된 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (헥산/에틸 아세테이트 = 3 : 1)로 정제하여 표제 화합물 (24 mg, 39%)을 고체로서 수득하였다. [α]_D ²² = -19.6 (c = 0.5 in CH₂Cl₂). ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ(s, 1H), 7.37-7.24 (m, 3H), 6.79 (dd, J = 8.1, 2.4 Hz, 1H), 5.12 (q, J = 6.7 Hz, 1H) 2.75 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 2.61 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 1.86-1.75 (m, 4H), 1.69 (d, J = 6.8 Hz,3H). ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 207.0, 170.4, 156.8, 151.8, 141.9, 130.7, 123.8, 118.8, 112.5, 106.5, 76.7, 74.3, 30.9, 23.3, 20.6, LRMS (ESI) m/z : C₁₉H₁₈F₃N₅O₂S에 대한 [M + H] + 계산치 438.1; 실측치 438.1.

또한, 생화학적 성질 (혈장 안정성, 마이크로솜 안정성 및 CYP 억제) 및 약물 동태학적 프로파일에 대한 세부 실험 절차는 다음에 설명하였다.

7. 면역 블랏팅 및 면역 침강 분석

면역 블랏팅(Immunoblot, IB)과 면역 침강 분석(immunoprecipitation assay, IP)은 C.S. Yang, J.S. Lee, M. Rodgers, C.K. Min, J.Y. Lee, H.J. Kim, K.H. Lee, C.J. Kim, B. Oh, E. Zandi, Z. Yue, I. Kramnik, C. Liang, J.U. Jung, Autophagy protein Rubicon mediates phagocytic NADPH oxidase activation in response to microbial infection or TLR stimulation, Cell Host Microbe 11(3) (2012) 264-76; Y.R. Kim, H.J. Koh, J.S. Kim, J.S. Yun, K. Jang, J.Y. Lee, J.U. Jung, C.S. Yang, Peptide inhibition of p22phox and Rubicon interaction as a therapeutic strategy for septic shock, Biomaterials 101 (2016) 47-59.에 기술된 대로 수행되었다.

면역 침전을 위해 세포를 수확한 다음 완전한 프로테아제 억제제 칵테일 (Roche)이 첨가된 NP-40 완충액에서 용해시켰다. 4 ℃에서 1시간 동안 A/G 아가로오스 비드로 사전 제거한 후, 전체 세포 lysates 표시된 항체를 immunoprecipitation에 사용하였다. 일반적으로 1-4 μg의 항체를 1 ml의 세포 단백질에 첨가하고 4 ℃에서 8-12 시간 동안 배양하였다. 단백질 A/G 아가로오스 비드를 6시간 동안 첨가한 후, 면역 침전물을 용해 완충액으로 광범위하게 세척하고, 5분 동안 비등시킴으로써 SDS 로딩 완충액으로 용출시켰다.

면역 블랏팅을 위해, 폴리펩티드를 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)에 의해 분석하고 PVDF 막 (Bio-Rad)으로 옮겼다. 면역 검출은 특정 항체를 사용하여 진행하였다. 항체 결합을 화학 발광 (ECL, Millipore)으로 시각화하고 Vilber 화학 발광 분석기 (Fusion SL 3; Vilber Lourmat)로 검출하였다.

8. 효소 면역 분석법

TNF-α, IL-6, IL-1β 및 IL-18의 검출을 위해 BD OptEIA ELISA 세트 (BD Pharmingen)를 사용하여 세포 배양 상층액, 마우스 혈청 및 활액을 사이토카인 함량에 대해 분석하였다. 모든 분석은 제조사에서 권장한 대로 수행하였다.

9. NOX 활성에 의한 세포 내 ROS의 측정

세포 내 과산화물의 생성은 루시게닌(lucigenin, bis-N-methylacridinium nitrate)-ECL 방법으로 측정하였다. 간단히 말하면, 세포 또는 결장 용해액을 50 mM 인산 완충액 (pH 7.0), 1 mM EGTA, 150 mM 자당 및 단백질 분해 효소 억제제 혼합물을 포함하는 반응에서 37 ℃에서 30분 동안 평형을 유지시키고 전자 수용체로서 루시게닌 (5 μM) 및 전자 공여체로서 NADPH (100 μM)를 포함한 Krebs-HEPES를 첨가하였다. 값은 1 x 10⁵ 세포 당 상대 광선 단위로 표시되었다.

10. 통계 분석

독립적인 실험 (평균±표준편차)으로부터 얻은 데이터는 본 페로니 조정 (Bonferroni adjustment)과 함께 양측 스튜던트 t-검정(Student 's t-test)을 사용하여 분석하였다. 차이는 p <0.05에서 유의한 것으로 간주되었다. 생존을 위해 데이터를 그래프 분석하고 비교를 위한 로그 순위 (Mantel-Cox) 테스트 (Prism, 버전 5.0, GraphPad Software)를 사용하여 Kaplan and Meier의 제품 제한 방법으로 분석하였다.

11. CYP450 분석

모든 CYP 억제, microsomal 안정성 및 혈장 안정성 실험은 New Drug Development Center, 대구 경북 의료 혁신 재단 (DGMIF)에 의해 수행되었다.

인간 간 마이크로솜 (0.25 mg/mL)에 5개의 프로브 기질 (Phenacetin 50μM, Diclofenac 10μM, S-mephenytoin 100μM, Dextromethorphan 5μM 및 Midazolam 2.5μM)의 칵테일, 인 0.1M 인산 완충액 (pH 7.4)과 시험 화합물을 0 μM (대조군으로서) 혹은 10 μM 농도로 첨가하였다. 37 ℃에서 5분간 반응시킨 후, NADPH 생성 시스템 용액을 또한 첨가하고 37 ℃에서 15분 동안 다시 반응하였다. 반응을 종결시키기 위해, 내부 표준물질(Terfenadine)을 포함하는 아세토니트릴(acetonitrile)을 첨가하고, 용액을 5분간 원심분리시켰다 (14000 rpm, 4 ℃). 이어서, 상등액을 LC-MS/ MS 시스템에 주입하여 프로브 기질의 대사 산물을 동시에 분석하고 시험 화합물의 % CYP 저해를 평가하였다.

12. 마이크로솜 안정성 분석

인간 간 마이크로솜 (0.5 mg/mL)에 0.1 M 인산 완충액 (pH 7.4)과 시험 화합물 (1 μM)을 첨가하였다. 37 ℃에서 5분 동안 반응시킨 후, NADPH 생성 시스템 용액을 또한 첨가하고 37 ℃에서 30분 동안 다시 반응하였다. 반응을 종결시키기 위해 내부 표준물질(chloprapamide)을 포함한 아세토니트릴을 첨가하고 5분간 원심분리 (14,000 rpm, 4 ℃)하였다. 이어서, 상층액을 LC-MS/MS 시스템에 주입하여 시험 화합물의 마이크로솜 안정성을 분석하였다.

13. 플라즈마 안정성 분석

시험 화합물 (10 μM)로 처리한 각 배양 튜브 내의 사람 혈장을 37 ℃에서 각각 0, 30 및 120분 동안 배양하였다. 정해진 시간 내에, 아세토니트릴 중의 클로피로프아미드 (chlopropamide)의 내부 표준 용액을 각 배양 튜브에 첨가하고, 5분 동안 보텍스 믹서로 진탕시키고 추가 5분 동안 원심분리하였다 (14,000 rpm, 4 ℃). 이어서, 상층액을 LC-MS/MS 시스템에 주사하여 시험 화합물의 플라스마 안정성을 분석 하였다.

14. 약물 동태학 연구

수컷 ICR 마우스에게 0.5 mg/kg 및 1 mg/kg의 TIPTP(화합물 2)를 정맥 내 및 복강 내 투여하였다. 화합물 2 투여 후 0.03, 0.16, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 6 및 24시간에 경동맥을 경유하여 혈액 샘플을 수집하였다 (0시간은 대조군으로 제공). 3000 rpm에서 10분간 원심분리한 후, 13.5 μL 분취량의 혈장 시료를 분석할 때까지 -20 ℃에서 보관하였다. 약물 동력학적 매개 변수는 WinNonlin®(Pharsight Corporation, Mountain View, CA) 프로그램을 사용하여 비차별 분석에 의해 결정되었다. 시간 영(0)에서 최종 측정 시간 (AUClast)까지의 플라즈마 농도-시간 곡선 하의 총 면적은 사다리꼴 규칙-외삽법 (trapezoidal rule-extrapolation method)에 의해 계산되었다. 문헌 (M. Gibaldi, D. Perrier, Pharmacokinetics, Second ed., Marcel-Dekker, New York, 1982)의 표준 방법을 사용하여 다음 약물동력학 파라미터를 계산하였다. 시간 평균 무한대 시간 (AUC0- ∞말단 반감기, 평균 잔류 시간 (MRT), 겉보기 분배량 정상 상태 (Vss)에서 상기 샘플에서 화합물의 농도를 LC-MS/MS를 사용하여 분석하였다. 13.5 μL의 혈장 시료에 1 μg/mL의 내부 표준물질(carbamazepine)이 함유된 아세토니트릴 60 μL를 추가하였다. 혼합 및 6,000 rpm에서 15분간 원심분리한 후, 100 ㎕의 증류수에 상층액 100 ㎕를 첨가하여 LC-MS/MS 시스템에 주입하였다. LC-MS/MS 시스템은 Agilent 1200 시리즈 HPLC 시스템 (Agilent, Santa Clara, CA)과 API3200®triple-quadrupole mass spectrometer (Applied Biosystems-SCIEX, Concord, Canada)로 구성된다. HPLC 이동상은 물 (A) 및 아세토니트릴 (B) 중의 0.1% 포름산으로 구성되었다. 크로마토그래피 분리는 0.25 mL/min의 유속에서 구배 용출을 사용하여 역상 Atlantis T3 컬럼 (100 x 2.1 mm, 3 μm, Waters Corporation, Milford, MA)에서 달성되었다. 생쥐 혈장에서 화합물의 정량 하한은 9.7 ng/mL였다. 상관 계수 (R)의 값은 0.997 이상이었다.

15. 조직학 및 면역 조직화학

조직 절편의 면역 조직화학 염색을 위해 10% 포르말린에 고정시키고 파라핀에 끼웠다. 파라핀 절편 (4 μm)을 절단하고 H&E 염색하였다. 조직 병리학 점수는 기관지 내 염증 세포의 수와 분포뿐만 아니라 기관지 엽 상피 손상 및 수복의 증거와 같은 비염증성 변화를 근거로 하여 설정되었다. 위원회 인증 병리학자는 치료 그룹에 대한 사전 지식 없이 각 폐 부분에 독립적으로 점수를 매겼다. S.E.M.에 평균값을 각 처리군에 대해 계산하였다. 면역 염색을 위해 4 μm 파라핀 절편을 100, 95, 80% 에탄올, 증류수 및 PBS에 연속적으로 침지하여 탈 파라핀화 및 수화시켰다. 슬라이드를 20분간 PBS에 1.5% 정상 토끼 혈청으로 블로킹하고 루비콘(ab92388; Abcam) 또는 p22phox (CS9; Santa Cruz Biotechnology)로 염색하고, 이어서 퍼옥시다제-결합된 goat αMouse 또는 αRabbit 면역글로불린 G (H + L) (Dako, Glostrup, Denmark) 또는 2차 항체 [αMouse-Alexa Fluor®및 αRabbit-Alexa Fluor®(Jackson Immuno Research)]를 사용하여 2차 항체 및 Dako REAL EnVision Detection System으로 분석하였다. 핵을 DAPI로 1분 동안 염색하였다. 장착 후, 형광 이미지를 공초점 레이저 스캐닝 현미경으로 확인하였다 (LSM 710, Zeiss, CLSM, Jena, Germany).

16. 조직 형태 측정과 조직 병리학적 관절염의 분석

관절염 마우스는 다음과 같이 일주일에 세 번씩 질병 진행에 대해 평가되었다. 각 사지는 염증의 중증도에 따라 다음과 같이 점수를 매겼다; 0 : 발적 또는 부종의 증거가 없음, 1 : 발목 관절 또는 발목에 국한된 발적 및 약간의 부기, 2 : 발목에서 발목 관절까지의 발적 및 가벼운 부종, 3 : 발목에서 중족골 관절까지의 발적 및 중간 정도의 팽창, 4 : 발목, 발 및 손가락 또는 사지의 염증을 포함하는 심한 부종. 앞발이 강하게 눌려지면, 마우스는 케이지 상단에서 와이어를 잡을 수 없다. 뒷발은 10% 완충된 포르말린에서 48시간 동안 고정시키고 15% EDTA 중에서 석회질을 제거시켰다. 그 후, 발을 파라핀에 끼워 넣고, 전체 뒷발의 연속 5-μm 시상 단면을 절단하고 헤마톡 실린 및 에오신으로 염색하였다. 절편을 현미경 하에 놓고 염증 정도와 연골 및 뼈 파괴에 대해 2명의 관찰자가 참고문헌(Prevention　of the　onset　and　progression　of　collagen-induced arthritis　in　rats　by the　potent　p38mitogen-activated protein kinase　inhibitor　FR167653. Nishikawa M, Myoui A, Tomita T, Takahi K, Nampei A, Yoshikawa H. Arthritis　Rheum. 2003 Sep;48(9):2670-81.)에 보고된 방법에 따라 다음의 척도를 사용하여 분석하였다; 0 : 정상 활막; 1 : 활막 막 비대 및 세포 침윤; 2 : 판 누스 및 연골 침식; 3 : 연골 및 연골 하골의 주요 침식; 4 : 염증 세포가 활막으로 침투하는 정도에 따라 관절 완전성 및 강직성 상실증.

17. 단백질 정제 및 질량 분석

p22phox-결합 단백질을 확인하기 위해, 침전물을 용해 완충액으로 광범위하게 세척하였다. Bead에 결합된 단백질을 용출시키고 NuPAGE 4-12% Bis-Tris 구배 겔 (Life Technologies)상에서 분리시켰다. 은 염색법 (Life Technologies) 후, 순수 단백질을 함유하는 겔 부분을 트립신 분해시키고, Harvard Taplin Biological Mass Spectrometry facility에서 이온-트랩 질량 분광법으로 분석하고, 아미노산 서열을 탠덤 질량 분석 및 데이터베이스 검색에 의해 결정하였다. 간단히 말하면, 겔 조각으로부터 추출된 단백질 (10μg)을 100mM 암모늄 바이 카보네이트(pH 8)에 첨가하였다. 그런 다음 56 ℃에서 30분 동안 dithiothreitol (10mM)과 함께 항온 배양하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 시스테인 잔기를 요오도 아세트아미드 (50mM)를 사용하여 알킬화시켰다. 이어서 Trypsin gold (Promega, UK)를 첨가하고 샘플을 37 ℃에서 밤새 배양하였다. 분해된 펩타이드를 Ultimate 3000 HPLC 시리즈 (Dionex, USA)를 사용하여 농축하고 분리하였다. 이어서, 샘플을 Acclaim PepMap 100 C18 LC 칼럼 (5um, 100ÅA, 300um, i.d.) 상에 트랩하였다. x 5mm (Dionex, USA)로 세척한 후, Nano Series Standard Columns 75μm i.d. x 15cm. 이것을 C18 PepMap100 (Dionex, USA)으로 채우고 30분에 걸쳐 3.2%-44% (v/v) 용매 B (아세토니트릴 중 0.1% 포름산)의 구배를 사용하여 펩타이드를 분리하였다. 분해된 펩타이드는 triversa nanomate nanospray source (Advion Biosciences, USA)를 LTQ Orbitrap Elite Mass Spectrometer (ThermoFisher Scientific, Germany)에 사용하여 용리(300 nL/min)하였다. 그런 다음 Sequest 알고리즘을 사용하여 Uniprot에 대해 MS 및 MS/MS 데이터를 검색한 다음 부분 서열을 단백질 데이터베이스에서 사용 가능한 다른 유사 단백질 서열과 비교하였다.

18. 플라스미드

전체 길이의 p22phox (V5-p22phox) 및 Rubicon (Flag-Rubicon)을 인코딩한 플라스미드는 C.S. Yang, J.S. Lee, M. Rodgers, C.K. Min, J.Y. Lee, H.J. Kim, K.H. Lee, C.J. Kim, B. Oh, E. Zandi, Z. Yue, I. Kramnik, C. Liang, J.U. Jung, Autophagy protein Rubicon mediates phagocytic NADPH oxidase activation in response to microbial infection or TLR stimulation, Cell Host Microbe 11(3) (2012) 264-76.에 기술하였다.

19. 아데노바이러스 shRubicon 또는 루비콘의 구조

Rubicon 유전자에 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)를 발현하는 아데노바이러스는 AdEasy 시스템 (Stategene)을 사용하여 제작되었다.

다음은 shRNA 올리고뉴클레오타이드 서열이다.

5'-gatccc g cat att cgc tcc cac tcg g ttcaagaga g cca gca gct ccc agt tca g tttttggaaa-3'(센스 서열, 서열번호 3), 3'- gg c cga gtg gga gcg aat atg c aagttctct c tga act ggg agc tgc tgg c aaaaaaccttttcga-5'(안티센스 서열, 서열번호 4).

이 dsDNA 올리고뉴클레오타이드 마우스 U6 프로모터를 함유하는 BglII 및 HindIII 제한 부위 사이의 pSuper 벡터 (OligoEngine)로 클로닝되었다. 종결 신호를 포함하는 이중 가닥 shRNA 올리고뉴클레오타이드 마우스 U6 프로모터의 3 '말단에 삽입하고 pShuttle 벡터 (Stategene) NotI 및 HindIII 제한 부위에 서브 클로닝하였다. 제어 벡터는 루비콘 서열에 제한된 상동성을 갖는 shRNA를 발현하는 서열을 삽입함으로써 제작되었다. 루비콘 유전자의 코딩 서열에 상응하는 DNA 단편을 PCR로 증폭시키고, NotI 및 EcoRV 제한효소 부위 사이의 pShuttle-CMV 벡터 (Stategene)에 서브 클로닝하였다.

20. 아데노바이러스 생산

AdEasy 시스템 (Stategene)을 사용하여 재조합 아데노바이러스를 구축하였다: PacI가 있는 분해된 아데노바이러스 벡터를 6개 구획으로 나눠져 있는 배양 접시에서 AD-293 생산 세포로 형질 주입시키고 세포 변성 효과(CPE)가 관찰될 때까지 신선한 배지로 배양하였다. 80% CPE가 관찰되었을 때, -80 ℃에서 반복적으로 동결시키고 37 ℃에서 4번 해동시켜 재조합 아데노바이러스를 수확하였다. 세포 용해질을 25 ℃에서 30분간 2,000g으로 원심분리하고 재조합 아데노바이러스 입자를 포함한 상층액을 -80 ℃에서 보관하였다. 모든 아데노바이러스를 AD-293 세포에서 증식시키고, BD Adeno-XTM 정제 키트(BD Biosciences Clontech)에 의해 정제 및 농축시켰다. 일반적인 역가는 1.25 % SeaPlaque GTG 아가로오스 (BioWhittaker Molecular Applications) 오버레이를 사용하여 플라크 분석을 통해 결정된 바와 같이 10¹²-10¹³ 플라크 형성 단위 (pfu)/mL의 범위였다. 제어 주입 및 바이러스의 희석을 위해 멸균 캐리어 용액 [인산염 완충 식염수 (PBS)]를 사용하였다.

[결과]

RA 증식 중에 루비콘과 p22phox의 상호작용

NOX 소단위체 중 p22phox는 조직책으로서 중심적인 역할을 수행하고, 그 구조는 NOX 활성을 위한 앵커로서 고도로 조절되고 상호 작용하는 소단위체를 형성한다. RA에 대한 활막 세포 내의 치료 전략으로서 세포 내 신호 전달 경로에서 p22phox에 대한 역할을 확립하기 위해, 본 발명자들은 p22phox가 RA 진행에 관여하는 분자와 상호 작용하지는 여부를 조사했다. 이 p22phox 복합체는 CIA 마우스로부터 활막세포를 함유하는 활액에서 상호 면역침전시켰다. 정제된 p22phox 복합체는 질량 분광법 분석으로 확인된 주요 내재 단백질인 루비콘 (130K)이 검색되었다 (도 1A 및 도 1B).

내인성 상호 면역침전은 p22phox가 CIA 마우스의 활막세포를 포함하는 활액에서 RA이 진행되는 동안 내재 루비콘과 점진적이고 강하게 상호작용하지만 식균 작용에 의한 선천적 면역 (TLR4 및 TRAF6) 또는 자가 포식 복합체 (Beclin-1 및 UVRAG)과는 작용하지 않았고 그 반대의 경우도 마찬가지였다 (도 1C). 이전에 보고된 바와 같이, p22phox는 산화 스트레스 매개 질환에서 루비콘과 관련되어 있다.

관절염은 관절의 염증을 설명하는데 사용되는 포괄적 용어이다. 그러나, 관절염에는 다른 종류의 관절염이 있는데 RA과 골 관절염(OA)이 포함된다. RA와 OA는 둘 다 관절에 영향을 미치지만, 그들은 같은 넓은 조건의 매우 다른 형태이다. 류마티스 관절염은 활성 산소 매개 자가 면역질환이지만 가장 흔한 관절염인 OA은 주로 퇴행성 관절 질환이다. 따라서, 본 발명자들은 RA과 OA 환자 사이의 루비콘과 p22phox 상호작용을 더 조사하였다 (도 1D 및 도 7). 이러한 p22phox와 루비콘의 발현과 공존은 RA의 활막세포에서는 유의하게 증가하였고 강한 양성을 보였으나, OA에서는 그렇지 않았다. 이러한 결과는 활막 세포에서 루비콘과 관련된 p22phox가 인간 RA과 마우스의 CIA 모두에서 임상적으로 유의하다는 것을 보여준다.

루비콘 유전자 발현은 RA 마우스 사망률에 영향을 미친다.

루비콘의 감소 또는 발현이 생체 내 콜라겐 항체 유발 류마티스 관절염(CAIA) 마우스에 영향을 주는지 평가하기 위해, 재조합 아데노 바이러스 (Ad-vector, Ad-shRubicon 및 Ad-Rubicon)를 꼬리 정맥을 통해 ~1X10¹³ pfu/mouse로 두 번 주입하였고, 형질도입 후 2일이 지나고 CAIA를 유도하였다 (도 2의 A). Ad-vector 또는 Ad-shRubicon으로 형질도입된 마우스는 12일 이상 생존을 보였다. 그러나, Ad-Rubicon으로 형질도입된 마우스는 사망률 (중간 생존율, 11일)이 유의하게 증가했고, 생존율 (20% 생존율)이 유의하게 감소하였다 (도 2의 A 및 B).

생존율과 관련하여 관절염 임상 점수 및 발 부종은 루비콘 발현 마우스에서 현저하게 증가하였고 루비콘 감소 마우스에서 감소한 폭이 d-vector로 형질도입된 마우스에서 보다 컸다. 또한, 뒷발의 조직 병리학적 평가는 루비콘 발현 마우스의 관절에서 Ad-vector로 형질도입된 마우스 보다 큰 활막세포의 증식, 골 침식 및 연골 파괴가 나타났음을 보여준다 (도 2의 C 및 D). 이러한 결과는 RA 병태생리가 루비콘 발현의 수준에 의해 실질적으로 영향을 받음을 보여준다.

p22phox 억제제는 p22phox - 루비콘 상호 작용 및 활성 산소 매개 염증을 강하게 억제한다.

본 발명자들은 이전에 인실리코 가상 스크리닝으로 루비콘-p22phox의 상호작용을 억제하는 물질이 강하게 활성 산소와 염증성 사이토카인의 생성을 억제하여, CLP-유도 패혈증의 사망률을 크게 감소시킴을 보였다. 그러나 이들 화합물의 제한적인 효능과 독성 문제는 만성 염증성 질환의 치료제와 관련된 주요 쟁점이다. 치료제로서의 p22phox-루비콘 상호작용의 선택적 및 강력한 억제제의 개발 필요성이 RA에서 요구되었다. 따라서 본 발명자들은 p22phox-루비콘 상호작용의 억제제로서 새로운 아릴 프로판 아미드를 개발하였다.

먼저, 본 발명자들은 Y.R. Kim, H.J. Koh, J.S. Kim, J.S. Yun, K. Jang, J.Y. Lee, J.U. Jung, C.S. Yang, Peptide inhibition of p22phox and Rubicon interaction as a therapeutic strategy for septic shock, Biomaterials 101 (2016) 47-59.에 보고된 화합물(화합물 1)에 기초하여 피리딘 혹은 티아디아졸을 갖는 일렬의 무수 또는 라세믹 (테트라히드로인다졸릴) 페녹시 프로판 아미드를 합성하였다. 모든 스크리닝은 3회 반복하였고, p22phox-루비콘 상호작용에 대해 재현 가능한 저해 활성을 나타내는 화합물을 주로 선택하였다. 이들 화합물의 구조를 변형시켜, 상응하는 프로판아미드 유도체를 거울상 이성질체적으로 순수한 형태로 추가로 합성하였고, 시험관 내 평가를 수행하였다. 마지막으로 추가 연구를 위한 가장 강력한 p22phox 억제제로서 상기 화학식 2로 표시되는 화합물(화합물 2)인, (R)-2-(3-(4,5,6,7-tetrahydro-2H-indazol-2-yl)phenoxy)-N-(5-(trifluoromethyl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl)propanamide (TIPTP, M.W.437.44 : 도 3의 A, 도 8 및 도 9)를 선택하였다.

첫째, 본 발명자들은 TIPTP의 억제 효과가 세포 생존력의 저해로부터 유리된 가능성을 배제하기 위해 세포 독성을 측정하였다. 화합물 2 (p22phox 억제제)는 다양한 농도의 배양 후 BMDM의 세포 생존 능력에 어떠한 유의한 변화도 유도하지 않았다 (도 3의 B). 또한, 화합물 2는 BMDM에서 p22phox 또는 루비콘 단백질의 발현에 영향을 미치지 않았다 (도 3의 B). 다음으로, 본 발명자들은 TIPTP (화합물 2)가 N8 펩타이드 모방약물 (화합물 1) 및 생물학적 프로파일을 갖는지 여부를 시험하였다. 도 3의 C-D 및 도 10의 A 및 B에 나타낸 바와 같이, 화합물 1의 활성과 일치하여, 화합물 2는 p22phox-루비콘 상호 작용, NOX 활성 및 활성 산소(O^2- 및 H₂O₂) 생성을 농도 의존적으로 억제하였다. 주목할 만하게, 화합물 2(p22phox 억제제, IC₅₀: 0.1uM)는 화합물 1 (p22phox-루비콘 상호작용 저해, IC₅₀: 10uM)과 비교했을 때 IC₅₀이 100배 개선되었음을 보여주었다. (도 10의 A에서 빨간색 숫자가 화합물 1과 2에 의한 억제되는 농도를 비교했는데, 100배 차이가 남. B에서 두 화합물의 염증 억제 정도가 화합물 1은 10, 화합물 2는 0.1일 때 50% 정도 감소하였다.) LR4/LPS 또는 NLRP3/LPS + ATP로 자극하기 전에 1시간 동안 화합물 2로 전처리함으로써 루비콘을 발현하는 BMDM 또는 Raw464.7 세포에서 p22phox와 루비콘의 상호 작용을 억제하였다 (도 3의 E 및 도 10의 C).

NLRP3 인플라마좀 활성화는 RA 발병 기전에 기여하고 NLRP3 인플라마좀의 구성 요소는 RA 환자의 활액에서 발현된다. 본 발명자들은 화합물 2 (p22phox 억제제)가 BMDM에서 NLRP3 인플라마좀 활성화 자극에 반응하여 관찰되는 caspase-1 활성화, IL-1β 및 IL-18 성숙이 유의하게 감소시킴을 확인하였다 (도 3의 E 및 F). 그러나, 화합물 2 (p22phox 억제제)는 p22phox-루비콘 상호작용을 억제하였다.(도 10A). 이런 결과는 화합물 2 (p22phox 억제제)가 p22phox 매개 NOX 복합체 형성 및 염증을 억제함으로써 선택적이며 강력한 면역 조절을 향상시키는 것으로 나타났다.

p22phox 억제제 ( TIPTP , 화합물 2)는 신뢰할 수 있는 생화학적 성질과 약물 동태학적 특성을 보여준다.

본 발명자들은 생체 내에서 치료 가능성을 평가하기 전에 TIPTP의 생화학적 안정성과 약물 동태적인 변수를 조사했다. 하기 표 2에 나타낸 바와 같이 TIPTP는 인간 혈장에 처리한 후 97% (30분) 및 94% (2시간) 남아있음을 보여 우수한 혈장 안정성을 보였다. 그러나 본 발명자들은 그것이 사람의 간 마이크로솜 내로 쉽게 대사됨을 확인하였다. 본 발명자들은 또한 약물-약물 상호 작용(DDI)의 가능성을 평가하기 위해 세 가지 중요한 CYP 동종 효소에 대한 TIPTP의 억제 활성을 조사하였다. 그 결과, CYP2D6 동종 효소에 대한 TIPTP의 영향은 무시할 만한 수준이었고, 다른 두 CYP 동종 효소의 효소 활성은 TIPTP에 의해 유의적으로 감소하지 않았다. 따라서 TIPTP는 잠재적인 DDI를 줄이기 위해 여러 개의 CYP 효소에 의해 대사될 수 있다.

수컷 ICR 마우스에서 복막 내 및 정맥 내 투여에 대한 TIPTP의 약물 동력학적 연구를 수행하였고 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다. 두 투여 모두에서 AUC 값에 기초하여 TIPTP는 마우스 혈장 하에서 양호한 내성을 나타내었고 혈액 내에서 높은 농도로 유지되었다. 이 화합물은 혈액과 조직에 적절하게 분포되어 있었다 (V_ss = 127.94 ml/kg). IV 투여의 클리어런스 값은 TIPTP가 온건한 비율로 전신 순환계에서 제거됨을 확인하였다. 마우스의 TIPTP의 절대 생체 이용률 (F, %)은 복강 내 투여 (75.42%) 후 상당히 높았으며, 이것은 복막을 통해 흡수되어 전신 순환계로 들어간다는 것을 의미한다.

[표 2]

[표 3]

류마티스 관절염에서 마우스를 보호하는 p22phox 억제제

p22phox 억제제가 ROS 매개 RA에서 마우스를 보호하는지 여부를 확인하기 위해 본 발명자들은 대칭적인 관절의 관여, 활액막염과 연골 및 뼈 침식을 포함하여 사람 RA와 임상, 조직 및 면역학적 특징과 유사한 CIA 모델을 사용하였다. 먼저 RA에 매카니즘적으로 연결된 활성 산소 생성에 대한 p22phox 억제제의 영향을 평가하였다. 도 4의 A에 나타낸 바와 같이, p22phox 억제제는 농도-의존적인 방식으로 활막 조직의 ROS 생산을 현저하게 감소시켰다.

활액 병리학적 및 연골 파괴에 대한 p22phox 억제제의 효과를 더 평가하기 위해, 이러한 임상 평가는 조직 검사에 의해 확인되었다. 공 처리(Vehicle 처리한 군으로 PBS 처리함, UN, un-treated 조건) RA 마우스의 조혈모세포의 헤마톡실린-에오진(H&E) 염색은 활액의 심한 증식, pannus 형성 및 염증 세포의 침윤을 보였으나, p22phox 억제제 치료는 이러한 변화를 유의하게 감소시켰다 (도 4의 B). 이러한 평균 임상 파라미터, 발 두께 및 조직학의 반-정량적 점수는 p22phox 억제제(화합물 2, TIPTP) 처리 RA 마우스에서 RA의 중증도가 공 처리(UN, un-treated 조건) RA 마우스 보다 현저히 낮다는 것을 확인하였다 (도 4의 B, 오른쪽 및 도 11의 A). 종합적으로, 이 데이터는 RA에서 p22phox 억제제의 방어적인 역할을 제안한다.

활성 산소 생성 NOX 신호는 RA의 발병 기전에 기여하는 사이토카인 폭풍을 조절하는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 발명자들은 RA에 매카니즘적으로 연결된 염증 매개 물질의 생성에 대한 p22phox 억제제의 영향을 평가하였다. 활성 산소 데이터와 일치하여, TNF-α, IL-6, IL-1β 및 IL-18 염증 유발성 사이토카인의 혈청 및 활액 내 농도 및 caspase-1 활성, IL-1β 및 IL-18 성숙 수준의 활액이 p22phox 억제제 처리된 CIA 마우스에서 유의하게 약화되었다 (도 4의 C 및 D, 도 11의 B). 또한, 본 발명자들은 이 화합물이 생체 내에서 약리학적 활성을 갖는지는 시험하였다. 식세포 활동 관련 표적 단백질 결합 프로파일과 자가 포식 활성의 생체 내 검출은 염증성 질환을 치료하기 위한 치료 약물 검색을 위한 p22phox 억제제의 평가에 중요할 수 있다. 시험관 내 결과 (도 3E 및 도 10의 C)와 일치하여, p22phox 억제제를 사용한 치료는 활막 세포에서 루비콘 단백질과 p22phox의 결합 수준을 현저하게 감소시켰다 (도 4의 E). 이 결과는 p22phox-루비콘 상호 작용을 특이적으로 차단함을 보여주었다. 종합적으로 말하자면, 이러한 발견은 p22phox 억제제가 RA를 개선시키는 치료적 잠재력을 가지고 있음을 시사한다.

p22phox 억제제는 심각한 류마티스 관절염 모델에서 마우스를 보호한다.

본 발명자들은 심각한 RA 모델로, Ad-Rubicon으로 형질도입된 CAIA 마우스를 개발하였다 (도 2). 따라서 본 발명자들은 p22phox 억제제가 루비콘이 과발현된 CAIA 마우스를 보호하는지 더 조사하였다. 첫째, 본 발명자들은 마우스에서 CAIA가 유도한 사망에 대한 p22phox 억제제의 치료 효능을 시험하였다. CAIA 마우스에서 2일 마다 복강 내 주사를 이용하여 p22phox 억제제를 처리하였다: 특히 Ad-Rubicon으로 유전자 도입된 CAIA는 11일 (생존율 20%)의 중간 생존율을 보였으나, p22 억제제를 투여한 결과, 생존율 증가 (90% 생존)를 보였다 (도 5의 A). 사망률 데이터와 일치하여 p22phox 억제제를 처리한 경우, 관절염 임상 점수, 발 부종 및 조직 병리학적 평가가 루비콘 발현 vector 또는 vector CAIA 마우스 모두에서 p22phox 억제제 비 투여 마우스 보다 현저하게 감소하였다 (도 5의 B 및 C). 종합하여 볼 때, 이러한 결과는 p22phox 억제제가 RA를 개선할 수 있는 치료적 잠재력을 가지고 있음을 보여준다.

p22phox 억제제는 건강한 사람 또는 RA 환자의 세포에서 생체 외 활성을 가진다.

본 발명자들은 p22phox 억제제가 인간 세포에 효과적인지 여부를 더 조사하였다. 첫째, p22phox 억제제가 p22phox-루비콘 상호작용 및 IL-1β 및 IL-18 염증성 사이토카인 및 caspase-1 활성화, IL-1β및 IL-18 성숙 수준을 농도 의존적으로 효과적으로 억제할 수 있음을 인간 혈액 유래 단핵 세포에서 확인하였다 (도 6의 A 및 B). 따라서, 이러한 결과는 p22 억제제가 사람 세포에서 ROS 매개 염증을 예방할 수 있음을 시사한다.

본 발명자들은 p22phox 억제제가 비정상적으로 활성 산소 활성화된 RA 환자의 세포에서 사전 활성화된 ROS 생산 NOX와 루비콘에 영향을 주는지 여부를 시험하였다. 첫째, 본 발명자들은 웨스턴 블랏팅(WB) 및 공초점 영상으로부터 RA 환자 세포에서 p22phox 및 루비콘의 현저하게 증가되어 있음과 p22 억제제가 이 RA 환자 세포에서 p22phox-루비콘 상호작용을 효과적으로 억제할 수 있음을 발견하였다 (도 6의 C 및 D). 또한 예상대로, RA 환자의 활액 세포에서 분리된 활막 세포를 NLRP3 작용제를 자극하지 않고 배양했을 때에도 IL-1β및 IL-18 분비와 caspase-1 가공이 배양 상등액에서 검출될 수 있었다 (도 6의 E). 그러나, 이들 세포를 p22phox 억제제의 존재 하에 배양하였을 때는 caspase-1 활성화 및 IL-1β및 IL-18 생산은 농도 의존적으로 억제되었다 (도 6의 E). 따라서 이러한 결과는 p22phox 억제제가 RA 환자의 사전 활성화된 활성 생성 NOX와 루비콘을 억제할 수 있으며 p22phox 억제제가 임상에서 활성 산소가 유발하는 질병을 조절하는데 사용될 수 있음을 시사한다.

[토론]

이 연구의 중심적인 발견은 활성 산소 생성하는 NOX (p22phox) 및 루비콘 상호작용에 대한 현저한 억제 활성을 갖는 p22phox의 강력하고 선택적이고 직접적인 억제제가 마우스의 생체 내 및 생체 외 인간 세포의 RA로부터 활성 산소를 활성 산소를 유도한다는 것이다. p22phox 억제제는 약리학적으로 NOX 생명 작용을 조사하고 염증성 질환에서 그 역할을 연구할 수 있는 다용도 도구로 사용될 것이다. 특히, 본 발명자들은 (1) 생체 내 p22phox가 루비콘과 상호작용하고 증가된 활성 산소 매개 RA 병인에 필요하다는 것을 발견하였다. (2) p22phox와 Rubicon의 발현과 공존이 현저히 증가했고 인간 RA 환자와 마우스 CIA 모두에서 활막 세포에서의 강한 양성이 임상적으로 의미가 있다. (3) p22phox 억제제로서 화합물 2를 개발하였고 이것은 p22phox에 의한 NOX 복합체 형성을 억제하고 (4) p22hox-루비콘을 직접 표적으로 하는 것이 생체 내 활성산소가 매개하는 NLRP3 인플라마좀을 억제할 수 있고 생체 외 건강 개인에서 얻은 단핵 세포와 RA 환자에서 얻은 관절낭액과 RA 마우스에서 뛰어난 치료 효과를 나타냄으로써 RA 및 인간에서 치명적인 결과를 초래하는 “통제 불능” 염증이 관여하는 기타 활성 산소 매개 염증질환 치료에 적합한 새로운 치료 도구를 제공할 수 있다.

그러나, 활성 산소가 RA 병태생리에 중요하기 때문에, 만일 우리가 활성 산소를 조절하지 못한다면 RA 치료가 효과적이 못하다고 생각한다. 따라서, 활성 산소 생성 NOX 복합체에 대한 억제제는 RA의 치료를 위해 NLRP3를 표적으로 하는 제제 보다 더 나은 선택일 수 있다.

여기서 본 발명자들은 p22phox 억제제를 직접적으로 표적으로 하는 특정 활성 산소 억제제로서 p22phox 억제제를 기술하고 p22 억제제가 마우스 CIA 모델과 루비콘을 발현하는 CAIA에 현저한 치료 효과를 갖는다는 것을 확인했다. 따라서 우리 연구는 활성 산소 매개 RA 질환을 치료할 수 있는 직접적이고 구체적인 p22phox 억제제에 대해 기술하고 있다. RA에서 NOX 유래 활성 산소가 해로운 역할을 한다는 증거가 늘어나고 있다. 특히, RA 환자의 활성 산소 생성 및 산화 스트레스의 증가는 질병 활성에 대한 잠재적인 바이오 마커였다. 또한, 활성 산소는 관절염 동물과 RA 환자에서 염증성 사이토카인과 하위 반응을 조절하는 NF-kB와 NLRP3 인플라마좀을 활성시켜 염증, 골 흡수 및 연골 손상을 일으킨다. 종합적으로 말하자면, 이러한 데이터는 활성 산소 생성 NOX의 결정적인 중재자에 대한 특이적인 표적화가 RA에서 치료적임을 강력히 시사한다. 그러한 신호 분자의 동정은 특이적인 표적화된 치료 중재의 발전을 유도할 수 있다.

p22phox 생물학에 대한 이전 연구와 함께 본 연구에서 제시된 발견은 RA의 임상 증상에 중요한 의미를 갖는다. 본 발명자들은 RA에 대한 새로운 치료 전략으로서 p22phox와 루비콘-선천성 면역 기작 사이의 관련성을 저해하고, 새로운 면역 조절제로서 활성 산소 생산 NOX에 대한 p22phox 억제제를 제시한다. 우리의 데이터는 과도한 염증 반응의 조절을 통한 RA 치료에서의 p22phox 억제제의 잠재력과 p22phox 억제제에 의해 유도된 생물학적 효과의 임상적 평가가 수행되어야 함을 강력히 시사한다. 또한, 본 발명은 염증을 치료하기 위한 새로운 치료 약물의 설계 및 발견을 위한 새로운 기회를 제공한다.

<110> Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University ERICA Campus <120> Novel p22phox inhibitor and composition for preventing or treating rheumatoid arthritis comprising the same <130> P19U22C0568 <150> KR 10-2019-0050518 <151> 2019-04-30 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 972 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rubicon(Kiaa0226) <400> 1 Met Arg Pro Glu Gly Ala Gly Met Glu Leu Gly Gly Gly Glu Glu Arg 1 5 10 15 Leu Pro Glu Glu Ser Arg Arg Glu His Trp Gln Leu Leu Gly Asn Leu 20 25 30 Lys Thr Thr Val Glu Gly Leu Val Ser Thr Asn Ser Pro Asn Val Trp 35 40 45 Ser Lys Tyr Gly Gly Leu Glu Arg Leu Cys Arg Asp Met Gln Ser Ile 50 55 60 Leu Tyr His Gly Leu Ile Arg Asp Gln Ala Cys Arg Arg Gln Thr Asp 65 70 75 80 Tyr Trp Gln Phe Val Lys Asp Ile Arg Trp Leu Ser Pro His Ser Ala 85 90 95 Leu His Val Glu Lys Phe Ile Ser Val His Glu Asn Asp Gln Ser Ser 100 105 110 Ala Asp Gly Ala Ser Glu Arg Ala Val Ala Glu Leu Trp Leu Gln His 115 120 125 Ser Leu Gln Tyr His Cys Leu Ser Ala Gln Leu Arg Pro Leu Leu Gly 130 135 140 Asp Arg Gln Tyr Ile Arg Lys Phe Tyr Thr Asp Ala Ala Phe Leu Leu 145 150 155 160 Ser Asp Ala His Val Thr Ala Met Leu Gln Cys Leu Glu Ala Val Glu 165 170 175 Gln Asn Asn Pro Arg Leu Leu Ala Gln Ile Asp Ala Ser Met Phe Ala 180 185 190 Arg Lys His Glu Ser Pro Leu Leu Val Thr Lys Ser Gln Ser Leu Thr 195 200 205 Ala Leu Pro Ser Ser Thr Tyr Thr Pro Pro Asn Ser Tyr Ala Gln His 210 215 220 Ser Tyr Phe Gly Ser Phe Ser Ser Leu His Gln Ser Val Pro Asn Asn 225 230 235 240 Gly Ser Glu Arg Arg Ser Thr Ser Phe Pro Leu Ser Gly Pro Pro Arg 245 250 255 Lys Pro Gln Glu Ser Arg Gly His Val Ser Pro Ala Glu Asp Gln Thr 260 265 270 Ile Gln Ala Pro Pro Val Ser Val Ser Ala Leu Ala Arg Asp Ser Pro 275 280 285 Leu Thr Pro Asn Glu Met Ser Ser Ser Thr Leu Thr Ser Pro Ile Glu 290 295 300 Ala Ser Trp Val Ser Ser Gln Asn Asp Ser Pro Gly Asp Ala Ser Glu 305 310 315 320 Gly Pro Glu Tyr Leu Ala Ile Gly Asn Leu Asp Pro Arg Gly Arg Thr 325 330 335 Ala Ser Cys Gln Ser His Ser Ser Asn Ala Glu Ser Ser Ser Ser Asn 340 345 350 Leu Phe Ser Ser Ser Ser Ser Gln Lys Pro Asp Ser Ala Ala Ser Ser 355 360 365 Leu Gly Asp Gln Glu Gly Gly Gly Glu Ser Gln Leu Ser Ser Val Leu 370 375 380 Arg Arg Ser Ser Phe Ser Glu Gly Gln Thr Leu Thr Val Thr Ser Gly 385 390 395 400 Ala Lys Lys Ser His Ile Arg Ser His Ser Asp Thr Ser Ile Ala Ser 405 410 415 Arg Gly Ala Pro Glu Ser Cys Asn Asp Lys Ala Lys Leu Arg Gly Pro 420 425 430 Leu Pro Tyr Ser Gly Gln Ser Ser Glu Val Ser Thr Pro Ser Ser Leu 435 440 445 Tyr Met Glu Tyr Glu Gly Gly Arg Tyr Leu Cys Ser Gly Glu Gly Met 450 455 460 Phe Arg Arg Pro Ser Glu Gly Gln Ser Leu Ile Ser Tyr Leu Ser Glu 465 470 475 480 Gln Asp Phe Gly Ser Cys Ala Asp Leu Glu Lys Glu Asn Ala His Phe 485 490 495 Ser Ile Ser Glu Ser Leu Ile Ala Ala Ile Glu Leu Met Lys Cys Asn 500 505 510 Met Met Ser Gln Cys Leu Glu Glu Glu Glu Val Glu Glu Glu Asp Ser 515 520 525 Asp Arg Glu Ile Gln Glu Leu Lys Gln Lys Ile Arg Leu Arg Arg Gln 530 535 540 Gln Ile Arg Thr Lys Asn Leu Leu Pro Met Tyr Gln Glu Ala Glu His 545 550 555 560 Gly Ser Phe Arg Val Thr Ser Ser Ser Ser Gln Phe Ser Ser Arg Asp 565 570 575 Ser Ala Gln Leu Ser Asp Ser Gly Ser Ala Asp Glu Val Asp Glu Phe 580 585 590 Glu Ile Gln Asp Ala Asp Ile Arg Arg Asn Thr Ala Ser Ser Ser Lys 595 600 605 Ser Phe Val Ser Ser Gln Ser Phe Ser His Cys Phe Leu His Ser Thr 610 615 620 Ser Ala Glu Ala Val Ala Met Gly Leu Leu Lys Gln Phe Glu Gly Met 625 630 635 640 Gln Leu Pro Ala Ala Ser Glu Leu Glu Trp Leu Val Pro Glu His Asp 645 650 655 Ala Pro Gln Lys Leu Leu Pro Ile Pro Asp Ser Leu Pro Ile Ser Pro 660 665 670 Asp Asp Gly Gln His Ala Asp Ile Tyr Lys Leu Arg Ile Arg Val Arg 675 680 685 Gly Asn Leu Glu Trp Ala Pro Pro Arg Pro Gln Ile Ile Phe Asn Val 690 695 700 His Pro Ala Pro Thr Arg Lys Ile Ala Val Ala Lys Gln Asn Tyr Arg 705 710 715 720 Cys Ala Gly Cys Gly Ile Arg Thr Asp Pro Asp Tyr Ile Lys Arg Leu 725 730 735 Arg Tyr Cys Glu Tyr Leu Gly Lys Tyr Phe Cys Gln Cys Cys His Glu 740 745 750 Asn Ala Gln Met Ala Ile Pro Ser Arg Val Leu Arg Lys Trp Asp Phe 755 760 765 Ser Lys Tyr Tyr Val Ser Asn Phe Ser Lys Asp Leu Leu Ile Lys Ile 770 775 780 Trp Asn Asp Pro Leu Phe Asn Val Gln Asp Ile Asn Ser Ala Leu Tyr 785 790 795 800 Arg Lys Val Lys Leu Leu Asn Gln Val Arg Leu Leu Arg Val Gln Leu 805 810 815 Cys His Met Lys Asn Met Phe Lys Thr Cys Arg Leu Ala Lys Glu Leu 820 825 830 Leu Asp Ser Phe Asp Thr Val Pro Gly His Leu Thr Glu Asp Leu His 835 840 845 Leu Tyr Ser Leu Asn Asp Leu Thr Ala Thr Arg Lys Gly Glu Leu Gly 850 855 860 Pro Arg Leu Ala Glu Leu Thr Arg Ala Gly Ala Thr His Val Glu Arg 865 870 875 880 Cys Met Leu Cys Gln Ala Lys Gly Phe Ile Cys Glu Phe Cys Gln Asn 885 890 895 Glu Asp Asp Ile Ile Phe Pro Phe Glu Leu His Lys Cys Arg Thr Cys 900 905 910 Glu Glu Cys Lys Ala Cys Tyr His Lys Ala Cys Phe Lys Ser Gly Ser 915 920 925 Cys Pro Arg Cys Glu Arg Leu Gln Ala Arg Arg Glu Ala Leu Ala Arg 930 935 940 Gln Ser Leu Glu Ser Tyr Leu Ser Asp Tyr Glu Glu Glu Pro Ala Glu 945 950 955 960 Ala Leu Ala Leu Glu Ala Ala Val Leu Glu Ala Thr 965 970 <210> 2 <211> 195 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> p22phox(Cyba) <400> 2 Met Gly Gln Ile Glu Trp Ala Met Trp Ala Asn Glu Gln Ala Leu Ala 1 5 10 15 Ser Gly Leu Ile Leu Ile Thr Gly Gly Ile Val Ala Thr Ala Gly Arg 20 25 30 Phe Thr Gln Trp Tyr Phe Gly Ala Tyr Ser Ile Val Ala Gly Val Phe 35 40 45 Val Cys Leu Leu Glu Tyr Pro Arg Gly Lys Arg Lys Lys Gly Ser Thr 50 55 60 Met Glu Arg Trp Gly Gln Lys His Met Thr Ala Val Val Lys Leu Phe 65 70 75 80 Gly Pro Phe Thr Arg Asn Tyr Tyr Val Arg Ala Val Leu His Leu Leu 85 90 95 Leu Ser Val Pro Ala Gly Phe Leu Leu Ala Thr Ile Leu Gly Thr Ala 100 105 110 Cys Leu Ala Ile Ala Ser Gly Ile Tyr Leu Leu Ala Ala Val Arg Gly 115 120 125 Glu Gln Trp Thr Pro Ile Glu Pro Lys Pro Arg Glu Arg Pro Gln Ile 130 135 140 Gly Gly Thr Ile Lys Gln Pro Pro Ser Asn Pro Pro Pro Arg Pro Pro 145 150 155 160 Ala Glu Ala Arg Lys Lys Pro Ser Glu Glu Glu Ala Ala Ala Ala Ala 165 170 175 Gly Gly Pro Pro Gly Gly Pro Gln Val Asn Pro Ile Pro Val Thr Asp 180 185 190 Glu Val Val 195 <210> 3 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA oligonucleotide sense <400> 3 gatcccgcat attcgctccc actcggttca agagagccag cagctcccag ttcagttttt 60 ggaaa 65 <210> 4 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA oligonucleotide antisense <400> 4 ggccgagtgg gagcgaatat gcaagttctc tctgaactgg gagctgctgg caaaaaacct 60 tttcga 66

Claims (8)

1. 하기 화학식 2로 표시되는 화합물.
   [화학식 2]
   

   

   
   
2. 4,5,6,7-테트라하이드로-2H-인다졸과 3-아이오도아니솔(iodoanisole)을 반응시켜 반응식 1의 화학식 3으로 표시되는 화합물을 제조하는 단계;
   제조된 화학식 3으로 표시되는 화합물과 삼브롬화붕소(Boron tribromide)을 반응시켜 반응식 1의 화학식 4로 표시되는 화합물을 제조하는 단계;
   제조된 화학식 4로 표시되는 화합물과 메틸(S)-(-)-2-클로로프로피오네이트를 반응시켜 반응식 1의 화학식 5로 표시되는 화합물을 제조하는 단계;
   제조된 화학식 5로 표시되는 화합물과 수산화리튬을 반응시켜 반응식 1의 화학식 6으로 표시되는 화합물을 제조하는 단계; 및
   제조된 화학식 6으로 표시되는 화합물과 2-아미노-5-트리플루오로메틸-1,3,4-티아디아졸을 반응시키는 단계 (2)를 포함하는 하기 화학식 2로 표시되는 화합물의 제조방법:
   [반응식 1]
   

   

   
   
3. 하기 화학식 2로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis) 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   [화학식 2]
   

   

   
   
4. 제 3 항에 있어서,
   상기 유효성분은 루비콘(Rubicon)과 p22phox의 상호작용 및 ROS-매개 염증 반응(reactive oxygen species-mediated inflammation) 억제에 관여하는 것인 약학적 조성물.
   
5. 제 3 항에 있어서,
   상기 유효성분은 p22phox 억제제인 약학적 조성물.
   
6. 하기 화학식 2로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis) 예방 또는 개선용 건강기능식품.
   [화학식 2]
   

   

   
   
7. 제 6 항에 있어서,
   상기 유효성분은 루비콘(Rubicon)과 p22phox의 상호작용 및 ROS-매개 염증 반응(reactive oxygen species-mediated inflammation) 억제에 관여하는 것인 건강기능식품.
   
8. 제 6 항에 있어서,
   상기 유효성분은 p22phox 억제제인 건강기능식품.

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