KR102683991B1 - 미토콘드리아 활성산소 수준을 감소시키는 신규 화합물 및 이의 용도 - Google Patents

미토콘드리아 활성산소 수준을 감소시키는 신규 화합물 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 미토콘드리아의 활성산소 수준을 감소시키고 그 기능을 개선시키는 등의 효과가 있는 신규 화합물과 이의 염증성 질환 예방 또는 치료 용도 등에 관한 것으로서, 본 발명의 화합물은 저농도에서도 효과적으로 미토콘드리아 외막에 루비콘(Rubicon)-p22phox의 상호자용을 차단하여 미토콘드리아 ROS 생성을 억제하고 미토콘드리아의 기능을 개선하는바, 미토콘드리아의 ROS 수준 증가에 의한 또는 이를 동반하는 염증성 질환의 예방 및 치료를 위하여 이용될 수 있으며, 세포질에서의 해당과정 작동을 감소시키고 미토콘드리아의 기능을 개선시키는 바 피로 회복 등을 위한 건강기능식품에 이용될 수 있다.

Description

미토콘드리아 활성산소 수준을 감소시키는 신규 화합물 및 이의 용도{Novel compound for reducing mitocondrial ROS leve and use thereof}
본 발명은 미토콘드리아의 활성산소 수준을 감소시키고 그 기능을 개선시키는 등의 효과가 있는 신규 화합물과 이의 염증성 질환 예방 또는 치료 용도 등에 관한 것이다. 본 발명은 경기도청의 주관의 사회맞춤형 산학협력선도대학(LINC+)육성사업 (염증성 질환 제어 미토콘드리아 항산화 물질 개발, 202100000001940)의 지원을 받아 완성되었다.
활성 산소종 (ROS)이라고 하는 산소 유래 자유 라디칼은 초산화물 및 수산화물과 같은 작고 활성이 높은 분자이다. ROS의 농도는 생리학적 및 병리학적 세포 반응 모두에서 중요한 역할을 한다. ROS의 생산은 특정 세포 하위 부분과 복잡한 세포 신호 및 음성 피드백 메커니즘에 대해 엄격하게 규제된다. 그러나 특정 조건에서 과도한 ROS 생성은 산화 스트레스를 유발하여 숙주 세포 내 시스템을 손상시킨다. 결과적으로 패혈증, 염증성 장질환(IBD), 죽상동맥경화증, 심부전, 암, 노화, 신경변성 등 다양한 질병을 유발한다.
미토콘드리아는 산화적 인산화를 통해 세포 에너지를 유지하고 다양한 대사 기능을 수행하는데 필수적인 막 결합 세포소기관이다. 미토콘드리아는 ROS의 주요 공급원이다. 또한 미토콘드리아 ROS (mtROS)는 염증 신호를 조절하는 핵심 역할을 한다. 그러나 ROS의 과잉 생산은 단백질, 막 및 DNA와 같은 세포 구성 요소에 산화적 손상을 일으켜 미토콘드리아 기능 장애를 일으킬 수 있다. 미토콘드리아의 기능 장애는 대사 장애, 노화 관련 질병 및 만성 염증 상태와 같은 다양한 질병의 발병기전의 주요 원인이다. 증가하는 연구들은 교란된 장 기능이 미토콘드리아 조절 장애에 대한 반응으로 발생할 수 있음을 보여주었다. 특히, 주로 IBD 환자에서 mtROS 수준이 증가됨을 관찰하였다. 장 면역계에서 미토콘드리아 기능의 중요성을 감안할 때, mtROS의 조절을 표적으로 하는 것은 대장염의 발병기전을 개선하기 위한 유망한 치료 전략이 될 수 있다.
IBD는 설사, 혈변, 복통 및 체중 감소와 같은 증상을 동반하는 모든 연령의 장관 및 결장 부위에 특발성, 재발성 및 만성 염증성 질병이다. IBD의 정확한 병태생리는 완전히 이해되지 않았지만 유전적 배경, 식이, 생활 습관 및 흡연과 같은 환경 요인, 장내 미생물군 및 면역 조절 장애와 같은 복합적이고 복합적인 요인에 의해 질병을 유발하는 것으로 알려져 있다. IBD는 크론병 (입에서 항문까지 위장관의 불연속적인 부분에 영향을 줄 수 있음)과 궤양성 대장염 (대장에만 영향을 줄 수 있음)의 두 가지 주요 유형으로 분류된다. 현재 IBD 치료법은 IBD의 중증도를 조절하는 다양한 치료 유형이 있지만 (예: 항염증제, 5-아미노살리실레이트 및 메살라진, 면역억제제, 코르티코스테로이드, 생물학적 및 바이오시밀러 의약품, 항체, 항사이토카인 및 항유착 분자, 대변 미생물군 이식), 정확한 치료가 없으며 상당한 비율의 환자가 치료에 반응하지 않거나 치료에 대한 반응을 잃는다. 따라서 장기 치료에 효과가 높고 정확하며 안전한 대체 염증성 장질환 치료제의 필요성이 시급히 요구되고 있다.
본 발명자들은 이전에 Rubicon이 NADPH 산화효소 복합체의 필수 양성 조절자이며 p22phox와 상호작용을 하여 미생물 감염 또는 염증 자극 시 ROS의 폭발적 생산을 유도하기 위해 안정화 및 파고좀 이동을 촉진한다는 것을 발견했다. 또한, 본 발명자들은 최근 p22phox에서 유래한 N-말단 8개 아미노산 및 N8 펩타이드 모방체인, 2-(tetrahydroindazolyl)phenoxy-N-(thiadiazolyl) propenamide 2 (TIPTP)가 Rubicon과 p22phox의 상호 작용을 통해 잠재적인 항염증 효과가 있음을 확인하였다. 이러한 억제 효과는 맹장 결찰 절차 (CLP) 및 만성 류마티스 관절염 (RA)에 의해 유발된 급성 다균성 패혈증을 앓는 마우스를 보호할 수 있다. 이전의 결과를 토대로 Rubicon-p22phox 경로 차단을 통해 염증성 장질환의 치료 타겟으로 설정하였다.
Rubicon은 p22phox와의 상호작용을 통해 세포질 ROS를 증가시키는 방아쇠로 작용하지만, 상기 상호작용이 mtROS의 생산을 조절할 수 있는지 여부는 알려져 있지 않다. 본 발명자들은 Rubicon과 p22phox 사이의 상호작용이 세포질 ROS의 폭발적 생산뿐만 아니라 mtROS에도 기여할 것으로 기대했다. 이에, 본 발명자들은 염증 상태 동안 Rubicon과 p22phox의 상호작용 위치를 확인하고 상기 상호작용에 의한 mtROS 생성 수준을 확인한 후 미토콘드리아 표적의 신규 mito-TIPTP 화합물이 mtROS 생성 감소 및 미토콘드리아 대사 회복에 기여하며 DDS 처리로 대장염을 유도한 동물모델을 보호함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
KR 10-2019-0098999
Wong, S.W.; Sil, P.; Martinez, J. Rubicon: LC3-associated phagocytosis and beyond. FEBS J. 2018, 285, 1379-1388 Yang, C.S.; Lee, J.S.; Rodgers, M.; Min, C.K.; Lee, J.Y.; Kim, H.J.; Lee, K.H.; Kim, C.J.; Oh, B.; Zandi, E.; et al. Autophagy protein Rubicon mediates phagocytic NADPH oxidase activation in response to microbial infection or TLR stimulation. Cell Host. Microbe. 2012, 11, 264-276. Forrester, S.J.; Kikuchi, D.S.; Hernandes, M.S.; Xu, Q.; Griendling, K.K. Reactive Oxygen Species in Metabolic and Inflammatory Signaling. Circ. Res. 2018, 122, 877-902. Wang, J.Y.; Li, J.Q.; Xiao, Y.M.; Fu, B.; Qin, Z.H. Triphenylphosphonium (TPP)-Based Antioxidants: A New Perspective on Antioxidant Design. ChemMedChem 2020, 15, 404-410 Schulze-Osthoff K, Bakker AC, Vanhaesebroeck B, Beyaert R, Jacob WA, Fiers W. Cytotoxic activity of tumor necrosis factor is mediated by early damage of mitochondrial functions. Evidence for the involvement of mitochondrial radical generation. J Biol Chem 1992;267:5317-23.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 저농도에서도 효과적으로 미토콘드리아 활성산소 수준을 감소시킬 수 있는 신규 화합물로서 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 제공하는 것이다.
[화학식 1]
또한, 본 발명은 상기 신규 화합물의 염증성 질환 및 괴사의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, mito-TIPTP, 을 제공한다.
[화학식 1]
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 염증성 질환은 패혈증(sepsis), 패혈성 쇼크, 염증성 장질환(Inflammatory bowel disease, IBD), 복막염, 신장염, 급성 기관지염, 만성 기관지염, 골관절염, 장질환 척추염, 만성 폐쇄성 폐질환 (chronic obstructive pulmonary disease, COPD), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 급성 폐손상 (acute lung injury) 및 기관지 폐 형성장애(broncho-pulmonary dysplasia)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 염증성 장질환은 급성 대장염, 만성 대장염, 궤양성 대장염(Ulcerative colitis, UC) 및 크론씨병(Crohns disease)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 mito-TIPTP는 Rubicon-p22phox 경로를 차단하여 세포의 ROS 수준을 감소시키는 것일 수 있으며, 미토콘드리아 외막에서 Rubicon-p22phox의 상호작용을 억제하여 mtROS 수준을 감소시키는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 괴사(necrosis)를 동반하거나 그 발생 가능성이 높은 질환에 있어서 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 괴사의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 염증성 질환의 예방 또는 치료가 필요한 개체에 상기 mito-TIPTP를 투여하는 단계를 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 괴사를 동반하거나 그 발생 가능성이 높은 질환이 발병한 개체에 상기 mito-TIPTP를 투여하는 단계를 포함하는 괴사의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 염증성 질환 예방 또는 치료 약물 제조를 위한 상기 mito-TIPTP의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명의 괴사의 예방 또는 치료 약물 제조를 위한 상기 mito-TIPTP의 용도를 제공한다.
본 발명의 mito-TIPTP 화합물은 저농도에서도 효과적으로 루비콘(Rubicon)-p22phox의 상호자용을 차단하여 미토콘드리아 ROS 생성을 억제하고 미토콘드리아의 기능을 개선하는바, 미토콘드리아의 ROS 수준 증가에 의한 또는 이를 동반하는 염증성 질환의 예방 및 치료를 위하여 이용될 수 있으며, 세포질에서의 해당과정 작동을 감소시키고 미토콘드리아의 기능을 개선시키는 바 피로 회복 등을 위한 건강기능식품에 이용될 수 있다.
도 1은 Rubicon 발현 세포와 세포 내에서 rubicon의 위치를 확인한 결과이다. 도 1a, 1c, 및 1d에 데이터는 3회 독립실험에서 유사한 결과로 나타내었고, 도 1b의 데이터는 5회 독립실험 결과의 평균 ± SD으로 나타내었다.
도 1a는 C57BL/6 정상 마우스의 다양한 조직을 분리하고 각각 균질화한 후 whole cell lysates(WCL)을 이용하여 αActin과 함께 면역블롯팅 (IB)을 수행하여 Rubicon 발현을 평가한 결과이다.
도 1b는 냉동보존된 비장세포(splenocyte) 샘플에 대하여 10 가지색 유세포 분석 패널(10-color flow cytometry panel) 및 중앙 집중식 수동 게이팅(centralized manual gating)을 이용하여 rubicon 발현 세포 빈도를 확인한 결과이다.
도 1c는 BMDM의 핵과 세포질을 분획하고 IB를 수행하여 세포질에 위치하는 Rubicon를 확인한 것이다. αTubulin은 세포질 단백질 로딩 대조군으로 검출하였고, αLamin B1은 핵 로딩 대조군으로 검출하였다.
도 1d는 WT 마우스의 BMDM을 Ad-Rubicon 또는 Ad-Vector (MOI=10)로 2일 동안 형질도입한 후 BMDM에서 세포질, 소포체 (ER), 미토콘드리아 관련 막 (MAM) 및 미토콘드리아(mito)을 분획한 후 αRubicon을 사용하여 IB을 수행한 결과이다. 칼넥신 (소포체 (ER) 및 미토콘드리아 관련 막(MAM)), 지방산 CoA 리가제 4 (FACL4, MAM) 및 전압 의존성 음이온 채널 (VDAC, 미토콘드리아) 단백질의 정도는 IB에 의해 결정되었다.
도 2는 Rubicon과 p22phox의 상호작용 및 Rubicon에 의한 p22phox의 미토콘드리아로의 이동을 확인한 것이다. 데이터는 유사한 결과를 가진 3개의 독립적인 실험 결과로 나타낸다.
도 2a: 미토콘드리아에서 Rubicon의 내재적 결합 파트너로서 p22phox를 식별한 것이다. BMDM을 Ad-Rubicon 또는 Ad-Vector (MOI=10)로 2일 동안 형질도입한 후 핵 및 세포질 분획을 분리하고 αRubicon으로 IP 수행한 결과이다(상단). 결합 파트너는 은염색 및 질량 분광 분석에 의해 확인되었다. BMDM을 분획화하고 αRubicon을 사용하여 IB를 수행하였다(중간). 세포질 단백질 로딩 대조군으로 αTubulin을 이용하였고, 핵 로딩 대조군으로 αLamin B을 이용하였다. 붉은색 문자는 질량분석에서 확인된 p22phox(CYBA) 펩타이드 서열을 나타낸다(하단).
도 2b 및 2c: BMDM을 2일 동안 Ad-Rubicon, Ad-shRubicon 또는 Ad-Vector (MOI=10)로 형질도입하거나 (도 2b) p22phox+/+ 및 p22phox-/- (도 2c)의 BMDM을 형질도입하고 LPS (100ng/ml)로 표시된 시간 동안 자극 후, αRubicon을 사용한 IP 및 αp22phox를 사용한 IB를 수행한 결과이다. WCL은 αRubicon, αp22phox, αCOX IV 및 αActin과 함께 IB를 수행하였다.
도 2d: BMDM에서 분리된 미토콘드리아는 디지토닌(digitonin) 추출을 통해 외막 분획 (outer-membrane fraction, OM)과 내막 및 매트릭스를 포함하는 분획 (IM+Matrix)을 분리했다. 상기 각 분획과 전체 미토콘드리아 (W)를 αRubicon과 함께 IB에 사용한 결과이다. 미토콘드리아 VDAC/porin (외막 단백질) 및 ABCB10 (내막 단백질).
도 3은 미토콘드리아에서 Rubicon과 p22phox의 상호작용을 확인한 것이다. 표시된 데이터는 유사한 결과를 가진 3개의 독립적인 실험을 나타낸다.
도 3a: THP-1 세포를 세포질 및 미토콘드리아로 분획하고, 각 분획을 αRubicon으로 면역침전(IB)시키고 질량분석기로 분석하여 Rubicon의 결합 단백질을 확인한 것이다.
도 3b: BMDM을 표시된 시간 동안 LPS(100ng/ml)로 자극한 다음 미토콘드리아 분리 키트로 미토콘드리아를 분획화하고 αRubicon으로 IP를 수행했다. αp22phox 및 αRubicon로 IB를 진행했다. WCL은 αRubicon, αp22phox, αCOX IV 및 αActin과 함께 IB에 사용되었다.
도 3c: Rubico의 구조(위) 및 Rubico의 미토콘드리아 표적화 도메인의 도메인 매핑(아래)이다. GST-Rubicon 또는 절단된 돌연변이체를 293T 세포에서 형질감염시키고 세포질 및 미토콘드리아에 대해 분획화한 후, αGST, α액틴 및 αVDAC로 IB를 분획화했다.
도 4는 미토콘드리아 활성 및 생합성에서 Rubicon-p22phox 상호 작용의 효과를 확인한 것이다.
도 4a 및 도 4b: BMDM을 2일 동안 Ad-Rubicon, Ad-shRubicon 또는 Ad-Vector(MOI=10)로 형질도입하고 30분 동안 LPS(100ng/ml)로 자극한 후 초산화물 (위) 및 mitoROS (아래)에 대한 FACS 분석을 통한 ROS의 평균 형광 강도의 정량적 분석 결과이다. (상자). 도 4b에 오른쪽은 p22phox 및 Rubicon 발현을 IB를 수행하여 확인한 결과이다.
도 4c: BMDM을 표시된 시간 동안 LPS (100ng/ml)로 자극하고 αNDUFA9, αNDUFA8, αSDHA, αUQCRC2, αUQCRQ, αCOX IV, αATP5A1, αRubicon 및 αActin으로 IB를 수행한 결과이다.
도 4d: 미토콘드리아 복합체 I (위쪽) 및 III (아래쪽) 활성을 확인한 것이다.
도 4e: BMDM을 표시된 시간 동안 LPS (100ng/ml)로 자극하고 αPGC-1α, αPGC-1, αNRF1, αNRF2, αTfam, αRubicon 및 αActin으로 IB를 수행한 것이다.
도 5는 BMDM를 2일 동안 Ad-Rubicon, Ad-shRubicon 또는 Ad-Vector (MOI=10)로 형질도입한 후 표시된 시간 동안 LPS (100ng/ml)로 자극하여 미토콘드리아 대사에서 Rubicon의 영향을 확인한 것이다. 표시된 데이터는 유사한 결과를 가진 7개의 독립적인 실험 결과이다.
도 5a: NAD+/NADH 비율
도 5b: 젖산 생성
도 5c: 산화대사의 지표인 올리고마이신(oligomycin), 카르보닐시아니드 4-(트리플루오로메톡시)페닐히드라존(FCCP), 로테논(rotenone)/액티노마이신 A(actinomycin A)를 순차적으로 처리하여 산소 소모율(OCR)의 실시간 측정한 결과이다(왼쪽). 포도당 산화의 지표로서 포도당, 올리고마이신 및 2-데옥시-D-글루코스(2-DG)를 순차적으로 처리하여 세포외부 산성화 속도 (ECAR)를 실시간 측정한 결과이다(오른쪽).
도 6은 Mito-TIPTP 처리에 따른 미토콘드리아 기능 향상을 확인한 것이다. Mitochondria Isolation Kit를 이용하여 BMDM에서 미토콘드리아를 분획화하였다.
도 6a: LPS (100ng/ml)-프라이밍 BMDM을 30분 동안 ATP (1mM) 또는 18시간 동안 DSS (3%)로 활성화하고 미토콘드리아 분획화하고 αRubicon으로 IP를 수행한 결과이다. αp22phox 및 αRubicon와 함께 IB를 진행하였다. WCL은 αRubicon, αp22phox, αCOX IV 및 αActin과 함께 IB에 사용되었다.
도 6b: LPS-프라이밍 BMDM을 1시간 동안 Mito-TIPTP (1, 10, 100nM)로 처리한 다음 ATP로 30분 동안 또는 DSS로 18시간 동안 활성화한 후 미토콘드리아를 분획하여 IP 및 IB를 수행한 결과이다.
도 6c: Mito-TIPTP (10nM)의 존재 또는 부재 하에 LPS/ATP로 처리된 BMDM을 면역염색 후 p22phox (Alexa Fluor 488) 또는 Rubicon (Alexa Fluor 568)에 대한 항체로 면역표지 하였다(스케일 바, 10μm).
도 6d: Mito-TIPTP (10nM), Mito-Tempo (10nM) 또는 MitoQ (10nM)의 존재 여부에 관계없이 LPS/ATP로 처리된 BMDM의 mitoROS에 대한 FACS 분석결과로 ROS의 평균 형광 강도의 정량적 분석을 의미한다.
도 6e: 산화 대사의 지표인 OCR(왼쪽) 또는 포도당 산화의 지표인 ECAR(오른쪽)의 실시간 측정 결과이다.
도 7은 Mito-TIPTP 처리로 mtROS 수준이 감소됨을 확인한 것이다.
도 7a: ATP에 의해 활성화된 LPS-프라이밍된 BMDM에서 미토콘드리아와 함께 p22phox 및 Rubicon의 공초점 이미지이다.
도 7b: mtROS의 정도는 표시된 농도의 Mito-TIPTP, Mito-Tempo 또는 MitoQ를 사용하여 LPS-프라이밍된 BMDM에서 측정되었다
도 7c: ATP (1mM) 또는 3% DSS와 Mito-TIPTP (100nM), Mito-Tempo (100nM) 또는 MitoQ (100nM)를 처리한 LPS 프라이밍 BMDM에서 mtROS에 대한 FACS 분석결과이다.
도 8은 Mito-TIPTP의 DDS 유도 급성 대장염 치료 효과를 확인한 결과이다.
도 8a: Ad-벡터 또는 Ad-shRubicon 바이러스를 마우스에 형질도입 후 Mito-TIPTP (50ng/kg)와 3% DSS를 처리한 급성 대장염 모델 제작과 실험의 모식도이다(왼쪽). 21일 동안 마우스의 생존을 모니터링했다. 그룹당 n = 15마리의 마우스에 대해 사망률을 측정했다 (오른쪽).
도 8b: 실험기간 동안 각 그룹 마우스의 체중을 측정한 것이다(n = 8).
도 8c: 실험기간 동안 각 그룹 마우스의 대장염 임상 점수이다(n = 8). 임상점수의 매개변수는 체중 감소, 대변 일관성, 및 출혈이다.
도 8d: vehicle 또는 Mito-TIPTP와 함께 3% DSS 처리 마우스의 결장 이미지 (위쪽)와 결장 길이이다 (아래쪽) (n = 8).
도 8e: 마우스로부터 분리된 결장에 대하여 IP 및 IB를 수행한 결과이다. IP 수행에는 αRubicon을 이용하였고, IB에는 αp22phox 및 αRubicon이 사용되었다. WCL은 αp22hox, αRubicon, αActin 및 αCOX IV가 있는 IB에 사용되었다.
도 8f: 각 그룹 마우스 결장에서 mtROS에 대한 FACS 분석 결과이다 (n = 8).
도 8g: 결장 균질액에서 사이토카인 및 MPO 활성 수준을 측정한 결과이다(n = 10).
도 8h: 왼쪽은 결장 조직의 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색 대표 이미징이다(n = 10)(스케일 바, 500μm). 오른쪽은 H&E 염색 이미지를 토대로 한 조직병리학 점수이다. 통계적 유의성은 vehicle과 비교하여 Bonferroni 조정(**P < 0.01; ***P < 0.001)과 함께 Student's t-test에 의해 결정되었다.
도 9는 Mito-TIPTP 처리가 DDS에 대한 민감성을 감소시킴을 확인한 것이다. 각 데이터에서 통계적 유의성은 vehicle과 비교하여 Bonferroni 조정(***P < 0.001)을 사용한 Student's t-test에 의해 결정되었다.
도 9a: vehicle 또는 Mito-TIPTP (50ng/kg)와 함께 5% DSS를 처리한 마우스의 21일 동안생존률을 확인한 것이다 (n=15).
도 9b: 실험 기간 동안 각 그룹 마우스의 체중 변화를 확인한 것이다.
도 9c: 실험 기간 동안 각 그룹 마우스의 대장염 임상 점수이다.
도 10은 DDS 처리에 대한 Mito-TIPTP의 결장 보호 효과를 확인한 것이다. 왼쪽은 Ad-Vector 또는 Ad-shRubicon을 형질도입하고 vehicle 또는 Mito-TIPTP (50ng/kg)와 함께 3% DSS를 처리한 마우스의 결장조직을 분리하고 αp22phox 및 αRubicon을 이용하여 면역조직화학 (IHC)으로 분석한 것이다. 오른쪽은 점막과 면역 세포의 Rubicon 및 p22phox의 H-score로 결장의 염색된 영역의 백분율을 염색 강도로 곱하여 계산되었다. 통계적 유의성은 vehicle과 비교하여 Bonferroni 조정(**P < 0.01; ***P < 0.001)과 함께 Student's t-test에 의해 결정되었다.
도 11은 Mito-TIPTP의 DDS 유도 만성 대장염 치료 효과를 확인한 결과이다.
도 11a: Mito-TIPTP (50ng/kg)와 함께 2.5% DSS를 처리한 만성 대장염 모델과 실험의 모식도이다.
도 11b: 마우스의 생존을 9주 동안 모니터링했다. 그룹당 n = 15마리의 마우스에 대해 사망률을 측정했다.
도 11c: vehicle 또는 Mito-TIPTP를 처리한 마우스의 실험기간 동안 체중 변화를 확인한 것이다 (n = 15).
도 11d: vehicle 또는 Mito-TIPTP와 함께 2.5% DSS 유도 만성 대장염 마우스 결장의 이미지와(위쪽) 결장의 길이이다(아래쪽).
도 11e: 왼쪽은 결장의 H&E 염색 대표 이미지(n = 8)(스케일 바, 100μm)이고, 오른쪽은 H&E 염색으로부터 조직병리학 점수이다. 통계적 유의성은 vehicle과 비교하여 Bonferroni 조정(***P < 0.001)을 사용한 Student's t-test에 의해 결정되었다.
도 12는 정상 및 궤양성 대장염 (UC) 환자의 결장 조직의 H&E 염색 이미지 및 면역조직화학 결과이다(n=10).
도 12a: 정상 및 UC 환자의 결장 조직 슬라이드를 αp22phox 및 αRubicon (왼쪽)을 사용하여 H&E 염색 및 IHC 수행했다(왼쪽). 장의 점막 및 면역 세포에서 Rubicon 및 p22phox의 H-score는 염색된 영역의 백분율을 염색 강도로 곱하여 계산하였다(오른쪽).
도 12b: 정상 및 UC 환자의 결장에서 세포질 및 미토콘드리아 분획을 분리하고 Rubicon에 대해 분석하고 αRubicon 및 αRubicon으로 IP를 수행했다. αp22phox 및 αRubicon로 IB를 수행했다. WCL은 αRubicon, αp22phox, αCOX IV 및 αActin과 함께 IB에 사용되었다. 통계적 유의성은 인간 정상과 비교하여 Bonferroni 조정(***P < 0.001)을 사용한 Student's t-test에 의해 결정되었다.
본 발명자들은 세포질 내에서 p22phox-Rubicon 경로 억제제인 TIPTP (KR 10-2019-0098999)에 미토콘드리아 표적화 성능을 부가하기 위하여 트리페닐포스포늄(Triphenyl Phosphonium, TPP)를 결합시켜 하기 화학식 1의 화합물을 제작하였다.
[화학식 1]
본 발명자들은 상기 화학식 1의 화합물을 Mito-TIPTP로 명명하였다.
본 발명자들은 Rubicon과 p22phox가 염증 상태 동안 미토콘드리아 외막 내에서 전위되고 강하게 상호 작용한다는 것을 확인했다. 또한 Rubicon은 미토콘드리아의 생합성 및 활성에 필수적인 역할을 수행함을 확인하였다. 그리고, 인지질 이중층에 들어갈 수 있고 미토콘드리아를 표적으로 하기 위해 미토콘드리아 내 전위를 유도하는 트리페닐포스포늄(TPP) 양이온과 접합된 Mito-TIPTP 처리는 mtROS 생성 감소 및 미토콘드리아 대사 회복을 통해 DSS로부터 마우스를 보호했다. 상기로부터 본 발명자들은 mito-TIPTP의 대장염 치료 효과를 확인하였다.
mito-TIPTP의 제조의 반응식은 아래와 같다:
[반응식 1]
본 발명에서 용어 "p22phox" 단백질은 인간 호중구 시토크롬 b 경쇄(human neutrophil cytochrome b light chain (CYBA))로 알려진 단백질로, 막 관련 효소의 식세포(membrane-associated enzyme phagocyte) NOX(NADPHoxidase)의 필수 구성 요소이다. 상기 NOX는 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)인 과산화물음이온 (superoxide anion)을 생성하기 위한 산소의 전자 환원(reduction)을 위한 전자 공여자(electron donor)로서 NADH 또는 NADPH를 사용하며, 식세포(phagocytic cell)의 항균 활성을 위해 기능적으로 중요하다. p22phox는 내피 세포(endothelial cell) 및 혈관 평활근 세포(vascular smooth muscle cell)와 같은 많은 다른 인간 세포에서도 발현된다.
본 발명에서 용어 "루비콘(Rubicon; Run/cysteine-rich-domain-containing-Beclin1-interacting autophagy protein)"은 자가소화작용(autophagy) 관련 단백질로, TLR2(Toll-like receptor 2)의 자극에 의해 ROS 생성에 관여하는 NOX 복합체(NADPH oxidase complex)의 구성성분 중 하나인 p22phox 단백질에 결합하여 NOX의 효소활성을 증가시켜 ROS의 생성을 촉진시키고, NF-κB 신호를 활성화시켜 염증성 사이토카인의 분비를 촉진시킴으로서 염증반응을 촉진하여 파고솜(phagosome) 내로 유입된 세균(bacteria)의 증식을 억제시키는데 있어 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서 용어 "예방"이란, 본 발명의 약학적 조성물의 투여로 염증성 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"란, 본 발명의 약학적 조성물의 투여로 인해 이미 유발된 염증성 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 의미한다.
상기 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 용어 "약학적으로 허용가능한"이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다. 상기 담체는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제, 기제, 부형제, 윤활제 등 당업계에 공지된 것이라면 제한없이 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 나아가, 연고제, 로션제, 스프레이제, 패취제, 크림제, 산제, 현탁제, 겔제 또는 젤의 형태의 피부 외용제의 형태로 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 제니스테인에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 61(tween 61), 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
한편, 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명의 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 건강상태, 암의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 조성물에 함유된 상기 "화학식 1로 표시되는 화합물"의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일 반적으로는 본 발명의 상기 "화학식 1로 표시되는 화합물"은 고형분을 기준으로 1일 체중 kg 당 0.001 내지 100 mg, 바람직하게는 체중 kg 당 1 내지 10 mg, 보다 바람직하게는 1 내지 5 mg을 매일 또는 격일 투여하 거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따 라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 Mito-TIPTP를 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 염증성 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 상기 염증성 질환은 이에 제한되지는 않으나, 패혈증(sepsis), 패혈성 쇼크, 염증성 장질환(Inflammatory bowel disease, IBD), 복막염, 신장염, 급성 기관지염, 만성 기관지염, 골관절염, 장질환 척추염, 만성 폐쇄성 폐질환 (chronic obstructive pulmonary disease, COPD), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 급성 폐손상 (acute lung injury) 및 기관지 폐 형성장애(broncho-pulmonary dysplasia)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.
상기 염증성 질환에는 괴사(necrosis)를 포함하고, 괴사와 같은 세포사멸은 미토콘드리아로부터 유래된 ROS에 의한 것으로 알려져 있다(J Biol Chem 1992;267:5317-23). 본 발명의 mito-TIPTP는 특히 미토콘드리아를 표적으로 하여 미토콘드리아 외막에서 Rubicon과 p22phox의 결합을 차단하여 mtROS의 수준을 감소시키는 바, 괴사의 예방 또는 치료를 위해 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명의 용어 "개체"란, 상기 암이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함한 모든 동물을 의미하고, 본 발 명의 약학적 조성물을 개체에게 투여함으로써 상기 염증성 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다. 본 발 명의 약학적 조성물은 기존의 치료제와 병행하여 투여될 수 있다.
본 발명의 용어 "투여"란, 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수도 있다. 바람직한 투여방식 및 제제는 정맥 주사제, 피하 주사제, 피내 주사제, 근육 주사제, 점적 주사제 등이다. 주사제는 생리식염액, 링겔액 등의 수성 용제, 식물유, 고급 지방산 에스테르(예, 올레인산에칠 등), 알코올 류(예, 에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콜, 글리세린 등) 등의 비수 성 용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 변질 방지를 위한 안정화제(예, 아스코르빈산, 아황산수소나트륨, 피로 아황산나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등), 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제 (예, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알코올 등) 등의 약학적 담체를 포함할 수 있다.
본 발명의 mito-TIPTP는 세포질에서의 해당과정 작동을 감소시키고 미토콘드리아의 ROS(mtROS) 수준을 감소시키는바, 미토콘드리아의 기능 향상 또는 개선을 위하여 식품에 첨가될 수 있다.
이에, 본 발명은 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물을 포함하는 미토콘드리아 기능 향상 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 mito-TIPTP를 포함하는 식품 조성물은 염증성 질환의 예방 또는 개선을 위한 식품 조성물로서 이용될 수 있으며, 운동능력 향상 및/또는 피로회복을 위한 식품 조성물로서 이용될 수 있다.
본 발명에서 용어 "개선"은 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모 든 행위를 의미한다
본 발명의 mito-TIPTP를 식품 조성물에 이용하는 경우, mito-TIPTP를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상의 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 상기 조성물은 유효성분 이외에 식품학적으로 허용가능한 식품보조첨가제를 포함할 수 있으며, 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "식품보조첨가제"란 식품에 보조적으로 첨가될 수 있는 구성요소를 의미하며, 각 제 형의 건강기능식품을 제조하는데 첨가되는 것으로서 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 식품보조첨가제의 예로는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진 제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등이 포함되지만, 상기 예들에 의해 본 발명의 식품보조첨가제의 종류가 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 식품 조성물에는 건강기능식품이 포함될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어 "건강기능식품"이란 인 체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 '기능성'이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 당업계에서 통상적으 로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨 가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 건강기능식품의 제형 또한 건강기능식품으로 인정되는 제형이면 제한없이 제 조될 수 있다. 본 발명의 식품용 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 본 발명의 건강기능식품은 염증성 질환의 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.
또한, 본 발명의 조성물이 사용될 수 있는 건강식품의 종류에는 제한이 없다. 아울러 본 발명의 식품 조성물은 당업자의 선택에 따라 건강기능식품에 함유될 수 있는 적절한 기타 보조 성분과 공지의 첨가제를 혼합하여 제조할 수 있다. 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 본 발명에 따른 상기 mito-TIPTP를를 주성분으로 하여 제조한 즙, 차, 젤리 및 주스 등에 첨가하여 제조할 수 있다
이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다. 그러나, 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있어서 특허출원의 권리 범위가 이러한 실시예들에 의해 제한되거나 한정되는 것은 아니다. 실시예들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물이 권리 범위에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
실시예에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
그러나, 본 발명에 따른 화합물 함유 제제는 상술된 것으로 제한되는 것은 아니며, 염증성 질환의 치료나 예방에 유용한 제제라면 어느 것이나 포함될 수 있다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
또한, 첨부 도면을 참조하여 설명함에 있어, 도면 부호에 관계없이 동일한 구성 요소는 동일한 참조부호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다. 실시예를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 실시예의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
[실험 방법 및 재료]
1. 쥐와 세포 배양
야생형 C57BL/6 쥐는 삼타코바이오코리아 (한국 경기도)에서 구입했다. 1차 골수 유래 대식세포(bone marrow derived-macrophage: BMDM)는 상기 C57BL/6 쥐에서 분리되었고 M-CSF(R&D 시스템, 416-ML)가 있는 상태에서 3~5일 동안 DMEM에서 배양되었다. C57BL/6 마우스에서 p22phox-/-의 BMDM은 이철호 박사(한국 대전 한국생명공학연구원, 연구소 동물자원센터)에게 제공받았다. 마우스 대식세포 세포주 RAW264.7 (ATCC TIB-71; American Type Culture Collection) 및 HEK293T (ATCC-11268) 세포는 10% FBS (Invitrogen), 피루브산나트륨, 비필수 아미노산, 페니실린 G (100IU/ml) 및 스트렙토마이신 (100㎍/ml)을 보충한 DMEM (Invitrogen)에서 배양되었다. 인간 THP-1 (ATCC TIB-202) 세포는 10% FBS를 보충한 RPMI 1640/글루타맥스에서 배양되었다.
2. 시약 및 항체
LPS (Escherichia coli O111:B4) 및 ATP는 Sigma-Aldrich (Burlington, MA)에서 구입했다. 덱스트란 설페이트 나트륨 염(dextran sulfate sodium salt) (36,000-50,000 MW)은 MP Biomedicals (Santa Ana, CA)에서 구입했다. Rubicon (ab92388), ABCB10 (ab231535), NDUFA9 (ab14713), NDUFA8 (ab184952), UQCRQ (ab241983), ATP5A (ab14748) 및 GST (ab138491)에 대한 특이적 항체는 Abcam에서 구입했다. VDAC1/Porin (B-6), FACL4 (N-18), Lamin B1 (B-10), Tubulin (5F131), p22phox (FL-195), SDHA (F-2), UQCRC2 (G- 10), PGC-1α (D-5), PGC-1β (E-9), NRF1 (H-4), NRF2 (G-2), Tfam (F-6) 및 액틴 (I-19)에 대한 특이적인 항체는 Santa Cruz Biotechnology에서 구입했다. Calreticulin (D3E6, 12238), COX IV(4D11-B3-E8, 11967)에 대한 항체는 Cell Signaling에서 구입했다.
3. 효소 면역 분석법 (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay: ELISA)
세포 배양 상층액 및 마우스 혈청은 TNF-α, IL-6, IL-1β 및 IL-18의 검출을 위해 BD OptEIA ELISA 세트 (BD Pharmingen)를 사용하여 사이토카인 함량에 대해 분석되었다. 모든 분석은 제조업체의 프로토콜에 따라 수행하였다.
4. GST 풀다운(pulldown), 면역침강(immunoblot, IB), 및 웨스턴 블롯(immunoprecipitation, IP)
GST 풀다운을 위하여 세포를 수확하고 프로테아제 억제제 칵테일 (Roche)이 보충된 NP-40 완충액으로 용해시켰다. 원심 분리 후, 상청액은 4 °C에서 2 시간 동안 단백질 A/G 비드로 미리 제거되었으며. 제거된 용해물을 글루타치온이 결합된 Sepharose bead (Amersham Biosciences)의 50% 슬러리와 혼합하고 결합 반응을 4 °C에서 4 시간 동안 배양하였다. 용해 완충액으로 침전물을 세척하였다. 글루타치온 비드에 결합된 단백질을 5 분 동안 끓여서 SDS 로딩 버퍼로 용리시켰다.
면역 침강을 위하여 세포를 수확한 다음 protease 억제제 칵테일 (Roche)이 보충된 NP-40 완충액에 용해시켰다. 4 ℃에서 1 시간 동안 단백질 A/G 아가로스 비드로 불순물을 제거하고, 표시된 항체로 면역침강을 위해 전 세포 용해물을 이용하였다. 일반적으로 1-4 μg의 상용 항체를 1 ml의 세포 용해물에 첨가하고 4 ℃에서 8-12 시간 동안 배양하였다. 단백질 A/G 아가로스 비드를 6 시간 동안 첨가한 후, 면역 침전물을 용해 완충액으로 세척한 후 5 분 동안 끓여서 SDS 로딩 완충액으로 용출시켰다.
웨스턴 블로팅을 위하여 폴리펩티드는 SDS- 폴리아크릴 아미드 겔 전기 영동 (PAGE)에 의해 분리되고 PVDF 막 (Bio-Rad)으로 옮겼다. 항체 결합은 chemiluminescence (ECL; Millipore)으로 시각화하였고, Vilber chemiluminescence analyzer (Fusion SL 3; Vilber Lourmat)로 검출하였다.
5. 세포 분획화 (Subcellular Fractionation)
미토콘드리아 분획 키트 (Active Motif, 40015)를 사용하거나 Yang et al., Nat. Commun. 2015, 6, 6115.의 방법에 따라서 세포에서 세포질과 미토콘드리아를 분리했다. 세포질, 소포체(endoplasmic reticulum, ER), 미토콘드리아 관련 막 (mitochondria-associated membrane, MAM) 분획 및 순수 미토콘드리아는 Endoplasmic ReticulumIsolation Kit (Sigma, St. Louis, MO, USA, ER0100)를 사용하거나 Williamson et al., Curr. Protoc. Cell Biol. 2015, 68, 3.27.1-3.27.33.의 방법에 따라서 세포에서 분리하였다. 세포내 분획화된 단백질을 2% SDS를 함유하는 완충액에서 용해시키고 SDS-PAGE용 2x 환원 샘플 완충액으로 끓였다.
6. 미토콘드리아의 분획 (Fractionation of Mitochondria)
분리된 미토콘드리아를 알칼리 추출 시약 [0.1M Na2CO3, 0.02M NaHCO3(pH 10.5)]에 재현탁하고 초음파 처리했다. 그런 다음 현탁액을 100,000 x g에서 원심분리하고 상등액을 미토콘드리아 가용성 분획으로 수집했다. 알칼리 불용성 분획인 펠렛을 미토콘드리아 막 분획으로 수집하였다. 미토콘드리아 외막과 미토플라스트(mitoplast, inner-membrane plus matrix)를 분리하기 위해 분리된 미토콘드리아를 0.15 mg/mL 디지토닌(digitonin)에 재현탁하고 10,000 x g에서 원심분리했다. 생성된 상층액을 외부 막 분획으로 수집하고 펠렛을 미토플라스트로 회수하였다 (Nishimura et al., 2014; Wieckowski et al., 2009).
7. ROS 생산의 유세포 측정 (Flow Cytometric Measurement of ROS Production)
세포 내 ROS 수준은 무혈청 배지에서 배양되고 산화환원 민감성 염료 2μM 디히드로에티듐(dihydroethidium) (O2 -의 경우 DHE; Calbiochem) 또는 1 μM MitoSox Red (mitoROS의 경우; Calbiochem)이 로딩된 세포에서 유세포 분석에 의해 측정되었다 (Yang et al., Cell Host. Microbe. 2012, 11, 264-276.). 1 × 105 BMDM 세포를 펄스 스핀으로 철저하고 신속하게 세척하고 FACSCalibur(BD Biosciences, San Jose, CA)에서 분석을 위해 즉시 획득했다. 데이터는 CellQuest 소프트웨어 (BD Biosciences)를 사용하여 그래프를 나타냈다.
8. 대사 분석 (Metabolic Assays)
배지의 젖산 정도는 제조업체의 지침에 따라 젖산 분석 키트 (Biovision)를 사용하여 결정되었다. 간단히 말해서, 세포를 표시된 기간 동안 LPS로 자극한 다음 상층액을 수집하고 -80℃에서 저장하여 젖산 탈수소효소를 비활성화시켰다. 반응 혼합물을 샘플에 첨가한 다음 마이크로플레이트 판독기 (OD570nm)에서 분석했다. NAD+/NADH 비율은 제조업체의 지침에 따라 NAD+/NADH 정량 비색 키트 (BioVision)를 사용하여 전체 세포 용출물에서 측정되었다. 세포 외 산성화율 (extracellular acidification rate, ECAR) 및 산소 소모율 (oxygen consumption rate, OCR)의 실시간 분석을 위해 XF-24 Extracellular Flux Analyzer (Seahorse Bioscience)를 사용하여 BMDM을 분석하였다. 간단히 말해서, BMDM을 XF-24 세포 배양 마이크로플레이트 (200 μL에서 2 x 105 cells/well)에 플레이팅한 다음 표시된 기간 동안 LPS로 자극했다. 표시된 시점에서 배지를 제거하고 세포를 세척하고 XF Running Buffer (완충되지 않은 RPMI, 10mM 포도당, 10% FCS, 100U/mL 페니실린/스트렙토마이신, 2mM L-글루타민 및 20 ng/mL의 GM-CSF)를 첨가하여 제조업체 지시에 따라 OCR 및 ECAR의 실시간 값을 분석하였다. 표시된 지점에서, ECAR 및/또는 OCR은 2μg/mL 올리고마이신, 1μM FCCP, 1μM 악티노마이신-A, 2μM 로테논, 10mM 포도당 및 50mM 2-DG (모두 Sigma-Aldrich에서 구입)에 대한 반응으로 분석되었다.
9. 공초점 형광 현미경 (Confocal Fluorescence Microscopy)
세포를 PBS 중 4%(w/v) 파라포름알데히드로 커버슬립에 고정한 다음 25°C에서 0.25%(v/v) Triton X-100가 첨가된 PBS를 사용하여 10분 동안 투과화했다. Rubicon 또는 p22phox는 25˚C에서 1시간 동안 1차 Ab의 1/100 희석을 사용하여 검출하였다. 세척 후, 적절한 형광 표지된 이차 Ab를 25°C에서 1시간 동안 배양했다. laser-scanning confocal microscopy (모델 LSM 800, Zeiss)을 사용하여 슬라이드를 검사했다.
10. 유세포 분석 (Flow Cytometry)
유세포 분석 데이터는 FACSCanto (BD Biosciences, San Diego, CA)에서 수집하고 FlowJo 소프트웨어(Tree Star, Ashland, OR)로 분석했다. 세포 표면 단백질의 발현을 결정하기 위해 mAb를 4°C에서 20-30분 동안 배양하고 세포를 Cytofix/Cytoperm Solution(BD Biosciences)을 사용하여 고정하고 일부 경우에 세포내 단백질을 검출하기 위해 mAb 배양을 수행했다. 다음 mAb 클론이 사용되었다: F4/80(BM8, eBioscience), Ly-6G(1A8-Ly6g, eBioscience), NK1.1(PK136, eBioscience), CD3/CD4(M2AB, 7E14, eBioscience), CD3/CD8 (M2AB, 17D8, eBioscience) 및 CD19/CD220 (771404, RA3-6B2, eBioscience).
11. 아데노바이러스 구축
전체 마우스 Rubicon을 인코딩하는 아데노바이러스와 Rubicon-특이적 shRNA 아데노바이러스는 모두 이전에 설명한 대로 구성되었다 (Kim et al., 2020b). 재조합 바이러스는 AD-293 세포에서 증폭되었고, BD Adeno-XTM 정제 키트(BD Biosciences, Clontech)로 정제 및 농축되었다. 전형적인 역가는 1.25% SeaPlaque GTG 아가로스 (BioWhittaker Molecular Applications) 오버레이를 사용하여 플라크 분석을 통해 결정하였으며 1012-1013 플라크 형성 단위 (plaque-forming units, pfu)/mL 범위였다. 대조군 주사 및 바이러스 희석을 위해 멸균 담체 용액 (PBS)을 사용하였다. 모든 아데노바이러스 관련 절차는 한양대학교 생물안전위원회 (HY-IBC-2020-05)에서 검토 및 승인되었다.
12. 마우스에서 Rubicon 감소를 위한 재조합 아데노바이러스 주입
재조합 아데노바이러스 (Ad-벡터 또는 Ad-Rubicon)를 꼬리 정맥을 통해 ~1 x 1012 pfu/마우스의 용량으로 2회 정맥 주사했다. 형질도입 2일 후, 마우스에 DSS를 처리하였다. 모든 동물 관련 절차는 한양대학교 동물병원 동물관리위원회 (프로토콜 2020-0013)에서 검토 및 승인되었다.
13. 대장염 마우스 모델
6주령 C57BL/6 암컷 마우스 (Samtako, Korea)를 이용하여 DSS 유도 급성 또는 만성 대장염 마우스 모델을 제작하였다. 급성 대장염 유도평가를 위하여 마우스는 3% 또는 5% (w/v) 덱스트란 황산 나트륨(DDS)을 용해시킨 물을 음용케하였다. DDS가 포함된 음용수는 격일로 새로 제작하여 제공하였다. 대조군은 DDS가 포함되지 않은 멸균 증류수를 음용수로 제공하였다. 동물과 관련된 모든 절차는 한양대학교 동물병원 동물관리위원회 (프로토콜 2019-0081)에서 검토 및 승인되었다.
14. 임상 점수 및 조직학적 분석
대장염의 임상 점수를 위해, 체중, 직장당 손실된 잠혈 또는 총 혈액, 및 대변 점도를 대장염 유도동안 격일로 관찰하였다. 임상 점수는 치료 그룹에 대해 블라인드 처리하여 두 명의 훈련된 조사자가 평가했다(Kim et al., Biomaterials 2016, 89, 1-13). 조직 절편의 면역조직화학을 위해, 마우스 결장을 10% 포르말린에 고정하고 파라핀에 박제했다. 파라핀 섹션(4μm)을 절단하고 헤마톡실린 및 에오신(hematoxylin and eosin, H&E)으로 염색했다. 이전에 설명한 조직병리학적 점수는 보충 정보에 설명되어 있다 (Kim et al., Biomaterials 2016, 89, 1-13).
15. 단백질 정제 및 질량 분석
Rubicon 결합 단백질을 확인하기 위해 BMDM을 모으고 complete protease inhibitor cocktail (Roche)이 보충된 NP-40 완충액 (50mM HEPES, pH 7.4, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1%(v/v) NP-40)으로 용해했다. 원심분리 후 상층액을 4℃에서 2시간 동안 단백질 A/G 비드로 미리 제거했다. 미리 제거된 용해물을 4℃에서 18시간 동안 αRubicon으로 면역침전시켰다. 침전물은 용해 완충액으로 광범위하게 세척되었다. 비드에 결합된 단백질을 용출하고 NuPAGE 4-12% Bis-Tris gradient gel (Life Technologies)에서 분리했다. 은염색법 (Life Technologies) 후, 특정 단백질 밴드를 절단하여 한국기초과학연구원 질량분석기 시설(Korea Basic Science Institute Mass Spectrometry facility)에서 이온 트랩질량 분석법으로 분석하고, 데이터베이스 검색을 통해 아미노산 서열을 결정하였다.
16. Mito-TIPTP의 합성
16-1. 에틸 (R)-5-(2-(3-(4,5,6,7-테트라하이드로-2H-인다졸-2-일)페녹시)프로판아마이도)-1,3,4-따이아다이아졸-2-카르복실레이트 (화합물 1)
다이메틸폼아마이드(5.0 mL)에 (R)-2-(3-(4,5,6,7-테트라하이드로-2H-인다졸-2-일)페녹시)프로파노익 애시드 (Kim et al., 2020b) (143 mg, 0.499 mmol)을 녹이고 N,N-다이아이소프로필에틸아민(442 μL, 2.54 mmol), HBTU(378 mg, 0.998 mmol), 에틸-5-아미노-1,3,4-따이아다이아졸-2-카르복실레이트(130 mg, 0.749 mmol)을 각각 첨가한 후, 75 ℃에서 3시간 교반하였다. 물을 첨가하여 반응을 종결시킨 후, 혼합물은 디클로로메테인을 이용하여 추출하였다. 유기층은 무수 MgSO4를 첨가한 후 여과하여 건조시켰고, 혼합물을 실리카겔 상에서 컬럼 크로마토그래피(n-헥세인 : 에틸 아세테이트 = 1 : 1)로 정제하여 주황색 분말의 화합물 1(160 mg, 73%)을 얻었다.
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 11.18 (s, 1H), 7.57 (s, 1H), 7.34 (s, 1H), 7.30 (t, J = 8.1 Hz, 1H), 7.22-7.21 (m, 1H), 6.78-6.76 (m, 1H), 5.14 (q, J = 6.5 Hz, 1H), 4.47 (q, J = 6.9 Hz, 2H), 2.79 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 2.63 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 1.88-1.76 (m, 4H), 1.68 (d, J = 6.4 Hz, 3H), 1.41 (t, J = 6.8 Hz, 3H).
16-2. (R)-N-(5-(하이드록시메틸)-1,3,4-따이아다이아졸-2-일)-2-(3-(4,5,6,7-테트라하이드로-2H-인다졸-2-일)페녹시)프로판아마이드 (화합물 2)
테트라하이드로퓨란(3.6 mL)에 화합물 1(160 mg, 0.362 mmol)을 녹이고 2.0 M 리튬 보로하이드라이드 용액(0.543 mL, 1.09 mmol)을 첨가한 후 실온에서 12시간 교반하였다. 염화 암모늄 포화 수용액을 첨가하여 교반하여서 반응을 종결시키고 혼합물은 에틸 아세테이트를 이용하여 추출하였다. 유기층은 무수 MgSO4를 첨가한 후 여과하여 건조시켰고, 혼합물을 실리카겔 상에서 컬럼 크로마토그래피(n-헥세인 : 에틸 아세테이트 = 1 : 3)로 정제하여 흰색 분말의 화합물 2(52 mg, 36%)을 얻었다.
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.52 (s, 1H), 7.27-7.25 (m, 1H), 7.23 (s, 1H), 7.13 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 6.72 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 5.11 (q, J = 6.5 Hz, 1H), 4.93 (s, 2H), 2.74 (t, J = 6.1 Hz, 2H), 2.58 (t, J = 5.9 Hz, 2H), 1.86-1.71 (m, 4H), 1.67 (d, J = 6.7 Hz, 3H).
16-3. (R,E)-N-(3-(10-브로모데실)-5-(하이드록시메틸)-1,3,4-따이아다이아졸-2(3H)-일라이덴)-2-(3-(4,5,6,7-테트라하이드로-2H-인다졸-2-일)페녹시)프로판아마이드 (화합물 3)
다이메틸폼아마이드(2.6 mL)에 화합물 2(52 mg, 0.130 mmol)를 녹이고 소듐하이드라이드(60% 미네랄 오일)(5.2 mg, 0.130 mmol)를 첨가하고 실온에서 30분 가량 교반한 후, 1,10-다이브로모데케인(15.7 μL, 0.070 mmol)을 첨가하여 실온에서 4시간 교반하였다. 물을 첨가하여 반응을 종결시킨 후 유기층은 디클로로메테인을 이용하여 추출하였다. 유기층은 무수 MgSO4를 첨가한 후 여과하여 건조시켰고, 혼합물을 실리카겔 상에서 컬럼 크로마토그래피(n-헥세인 : 에틸 아세테이트 = 1 : 1)로 정제하여 투명한 액체상태의 화합물 3(20 mg, 25%)을 얻었다.
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.54 (s, 1H), 7.21-7.18 (m, 3H), 6.73 (dd, J = 10.1Hz, 1.4 Hz, 1H), 5.04 (q, J = 6.7 Hz, 1H), 4.72 (m, 2H), 4.34 (m, 2H), 3.41 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.74 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.60 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 1.87-1.70 (m, 10H), 1.65 (d, J = 6.7 Hz, 3H), 1.44-1.36 (m, 2H), 1.25 (s, broad, 8H)
16-4. (R,E)-(10-(5-(하이드록시메틸)-2-((2-(3-(4,5,6,7-테트라하이드로-2H-인다졸-2-일)페녹시)프로파노일)이미노)-1,3,4-따이아다이아졸-3(2H)-일)데실)트라이페닐포스포늄 브로마이드 (화합물 4)
아세토나이트릴(0.32 mL)에 화합물 3(20 mg, 0.0323 mmol)을 녹이고 트라이페닐포스파인(7.0 mg, 0.0258 mmol)을 첨가한 후 75 ℃에서 reflux 콘덴서를 이용하여 12시간 교반하였다. 반응 종결후 혼합물을 진공 하에서 용매를 증발시켜 생성물을 고체화하고 n-헥세인과 다이에틸에테르를 이용하여 불순물을 여러 번 씻어 주었다. 잔류 용매를 진공 하에서 건조시킨 후 최종 화합물 4(19 mg, 67%)을 고체로서 얻었다.
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.82-7.65 (m, 15H), 7.48 (s, 1H), 7.16-7.12 (m, 3H), 6.67-6.64 (m, 1H), 5.02 (q, J = 6.7 Hz, 1H), 4.89-4.80 (m, 2H), 4.35-4.27 (m, 2H), 3.68-3.53 (m, 2H), 2.71 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 2.57 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 1.83-1.70 (m, 8H), 1.61 (d, J = 6.7 Hz, 3H), 1.24-1.13 (m, 4H), 1.03 (s, broad, 8H).
17. 통계 분석
모든 데이터는 다중 비교를 위해 Bonferroni 조정과 함께 Student's t-test를 사용하여 분석되었으며 평균 ± SD로 표시됩니다. 통계 분석은 SPSS (버전 12.0) 통계 소프트웨어 프로그램 (SPSS, Chicago, IL, USA)을 사용하여 수행되었다. 차이는 p <0.05에서 중요한 것으로 검토되었다. 생존률은 그래프 패드 프리즘 (버전 5.0, 캘리포니아, 미국)을 사용하여 비교를 위한 로그 순위 (Mantele-Cox) 테스트를 사용하여 Kaplan과 Meier의 제품 제한 방법으로 데이터를 그래프로 작성하고 분석했다.
[실험 결과]
1. Rubicon 발현 세포 및 세포 내 위치 확인
Wong et al.은 Rubicon이 조직에서 전반적으로 발현된다고 하였으나 (FEBS J. 2018, 285, 1379-1388), 본 발명자들은 Rubicon이 마우스의 비장, 폐, 간, 내장 및 림프절에서 강하게 발현된다는 것을 발견했다 (도 1a). 비장에서 Rubicon의 세포 분포를 관찰하기 위해 FACS를 사용하여 다양한 면역 세포 유형에서 Rubicon 발현 세포의 수를 분석했다. 그 결과, 대식세포와 호중구는 NK, T 및 B 세포에 비해 더 높은 Rubicon 분포를 보여주었다(도 1b).
다음으로, 대식세포에서 루비콘에 대한 연구에 집중하고, 골수 유래 대식세포(BMDM) 내부에서 루비콘의 분포를 조사했다. 세포 분획 데이터는 Rubicon이 핵이 아닌 세포질에 있는 것으로 나타났다 (도 1c). 다음으로, 세포질 분획에서 Rubicon의 상세한 위치를 확인하기 위해 세포질, 소포체 (ER), 미토콘드리아 관련 막 (MAM) 및 미토콘드리아를 포함한 4개 부분으로 세포질을 추가로 분류했다. Rubicon은 야생형 (WT) 또는 Rubicon 과발현 골수 유래 대식세포의 세포질과 미토콘드리아 모두에 위치해 있다 (도 1d). 종합적으로, Rubicon은 대식세포의 세포질과 미토콘드리아에 위치되어 있다.
2. 미토콘드리아 외막에서 Rubicon와 p22phox의 상호 작용 확인
이전의 연구를 통해서 우리는 Rubicon이 대식세포에서 세포질 ROS 수준을 향상시키는 p22phox의 결합 파트너임을 제시하였다(Cell Host. Microbe. 2012, 11, 264-276.). 이 상호작용은 대식세포의 염증 반응이나 미생물 감염 시 세포질 ROS를 증가시키는 데 필수적이다.
우리는 Rubicon이 세포질과 같이 미토콘드리아에서 p22phox와 상호 작용하는지 조사하였다. WT 또는 Rubicon 과발현된 BMDM 및 THP-1 세포를 분별하고, Rubicon과 공동 면역침전하고 질량 분석기를 사용하여 분석했다. 자가포식 관련 단백질(UVRAG, 78K), BECLIN1 (52K) 및 p22phox (cytochrome b-245 light chain, CYBA, 21K)와 같은 자가포식 관련 단백질은 대식세포의 세포질 및 미토콘드리아 분획 모두에서 직접적으로 연관되어 있다 (도 2a 및 3a).
다음으로, 우리는 LPS를 처리하고 세포질과 미토콘드리아로 분획하여 BMDM에서 Rubicon-p22phox의 세포 내 결합을 조사했다. 세포질에서 이 상호작용은 주로 15분과 30분에 확인되었고 미토콘드리아에서는 60분과 120분에 확인되었다. 또한, 우리는 Rubicon-p22phox의 상호작용이 미토콘드리아에서 8시간 동안 강하게 유지된다는 것을 확인했다 (도 2b 및 3b). 우리는 염증 자극에 따라 Rubicon-p22phox의 상호 작용이 세포질에서 미토콘드리아로 이동되었다고 가정했다. 또한 Rubicon이 과발현된 BMDM에서 Rubicon-p22phox 상호작용은 세포질과 미토콘드리아에서 향상되었지만 Rubicon-녹다운 BMDM에서는 완화되었다. 흥미롭게도, Rubicon의 녹다운은 두 분획에서 모두 p22phox의 안정성을 감소시켰고 p22phox의 미토콘드리아로의 이동도 감소시켰다 (도 2b).
또한, 우리는 p22phox의 결핍이 Rubicon-p22phox의 연관성과 Rubicon의 안정성을 조절하는지 조사했다. Rubicon은 p22phox-결핍 BMDM에서 약간 감소했지만 미토콘드리아로 이동은 여전히 확인되었다 (도 2c). 게다가, 우리는 GST-Rubicon-과발현된 293T 세포를 분별하여 Rubicon의 미토콘드리아 결합 부위를 모니터링했다. GST-Rubicon에서 505-557, 567-625 또는 625-760의 결핍은 세포질에서 미토콘드리아로의 이동을 감소시켰으며, 이는 Rubicon의 505-760 영역이 미토콘드리아로의 이동에 필수적임을 설명한다 (도 3c).
다음으로 우리는 미토콘드리아 막에서 p22phox와 Rubicon의 위치를 조사했다. 우리는 BMDM에서 미토콘드리아를 분리하고 기질, 외막과 내막을 분리하여 Rubicon과 p22phox를 조사했다. Rubicon과 p22phox는 미토콘드리아의 외막에 있었고 Rubicon의 과발현은 미토콘드리아에서 p22phox 수준을 향상시켰다 (도 d).
상기 결과를 통해, Rubicon-p22phox 상호작용은 미토콘드리아 표적화 도메인을 통해 미토콘드리아 외막으로 이동되었으며 미토콘드리아에서 p22phox의 안정성에 필수적임을 알 수 있다.
3. Rubicon-p22phox의 상호작용이 mtROS 수준, 미토콘드리아 활성 및 생활성에 미치는 영향 확인
이전의 연구를 통해서 Rubicon은 염증 반응에서 NADPH 산화효소 복합체를 유도하여 세포질 ROS의 주요 활성제임을 제시하였다. 우리는 이전에 Rubicon과 p22phox 사이의 밀접한 관계를 연구하여 상기 상호작용이 세포질 ROS 수준을 상향 조절함을 확인하였다. 또한, 우리는 도 2 및 도 3에서 Rubicon-p22phox의 상호 작용이 세포질뿐만 아니라 미토콘드리아와 관련되어 있음을 확인하였다.
다음으로, 우리는 BMDM에서 염증 상태에서 ROS 및 mtROS의 유도에 대한 Rubicon 및 p22phox의 역할을 조사했다. ROS의 정도 증가는 Rubicon 과발현된 BMDM에서 상당히 높았지만 Rubicon-넉다운 BMDM에서도 ROS 정도는 약간 증가했다 (도 4a). 또한, p22phox가 결핍된 BMDM은 WT BMDM에 비해 두 ROS 수준을 모두 감소시켰다. 또한 p22phox가 결핍된 BMDM에서 Rubicon을 과발현한 경우 ROS 정도가 증가하지 않았는 바, p22phox와 Rubicon 모두 ROS 정도를 높이는데 필요함을 알 수 있었다 (도 4b).
한편, 과도한 ROS는 산화적 인산화 (oxidative phosphorylation, OXPHOS) 시스템을 방해하여 미토콘드리아 기능과 생합성을 감소시킨다 (Circ. Res. 2018, 122, 877-902). 미토콘드리아 활성과 생합성을 조사하기 위해 OXPHOS 복합 소단위체의 발현을 확인했다. 흥미롭게도, LPS 처리에서 복합체 III의 서브유닛인 시토크롬 bc1 복합체 서브유닛 2 (cytochrome bc1 complex subunit 2, UQCRC2) 및 시토크롬 bc1 복합체 서브유닛 8 (cytochrome bc1 complex subunit 8, UQCRQ)은 Rubicon 과발현 BMDM에서 감소했지만 Rubicon 녹다운 BMDM에서는 증가했다 (도 4c). 또한, 미토콘드리아 복합체 III의 활성은 LPS 처리 BMDM에서 Rubicon의 발현에 따라 유사한 패턴을 나타내었다 (도 4d).
그리고, Rubicon이 미토콘드리아 생합성과 관련이 있는지 알아보기 위해 peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator (PGC)-1α, PGC-1β, nuclear respiratory factor 1 (NRF1), NRF2, 및 미토콘드리아 전사 인자 A (Tfam). 흥미롭게도, PGC-1α 및 PGC-1β는 유의하게 조절되었지만 NRF1, NRF2 및 Tfam은 그렇지 않았다 (도 4e). 상기 결과는 Rubicon-p22phox의 상호작용이 세포질 및 미토콘드리아에서 ROS 정도를 증가시키고 Rubicon이 미토콘드리아 복합체 III 및 PGC-1α 및 PGC-1β의 소단위의 발현을 감소시킴으로써 미토콘드리아 활성 및 생합성을 억제한다는 것을 시사한다.
4. LPS 처리 BMDM에서 Rubicon의 해당과정 촉진 및 미토콘드리아 대사 억제 활성 확인
미토콘드리아는 세포 대사의 기본적인 하위 소기관이다. 면역 세포에서 면역 반응의 활성화는 해당과정(Glycolysis)를 강화한 세포 대사와 직접관련이 있으며 염증성 사이토카인 및 케모카인 생성 증가, 염증에 대한 ROS 정도를 증가시킨다.
Rubicon이 미토콘드리아 대사에 영향을 줄 수 있다고 생각했기 때문에 LPS 처리 BMDM의 세포 대사에서 Rubicon의 역할을 조사했다. 먼저 Rubicon 과발현 또는 녹다운 BMDM에서 NAD+의 양과 NAD+/NADH의 비율을 측정했다. Rubicon은 NAD+ 수준과 NAD+/NADH 비율을 감소시켜 Rubicon이 미토콘드리아 대사를 억제하였다 (도 5a). 또한 해당과정의 증가를 확인하기 위하여 해당과정의 산물이 젖산의 수준을 세포 내부 및 외부에서 조사하였다. LPS 처리 BMDM에서 Rubicon의 증가는 내부 및 추가 젖산 생성을 모두 향상시킨 반면 Rubicon의 녹다운은 젖산 생성을 감소시켰습니다 (도 5b).
Rubicon과 대사 상태의 관계를 실시간으로 분석하기 위해 BMDM에서 세포외부 흐름 분석을 사용하였다. 올리고마이신 (Oligo), 카르보닐시아나이드-p-트리플루오로메톡시-페닐히드라존 (FCCP), 로테논/안티마이신 A (ROT/AA), 2-데옥시-D-글루코스 (2-DG) 과 같은 미토콘드리아 복합체 억제제 또는 이온통로를 처리하여 5분마다 산소 소모율 (OCR) 및 세포 외 산성화율 (ECAR) 수준을 모니터링했다. 이전 결과와 유사하게 Rubicon의 과발현은 미토콘드리아 대사를 약화시켰다. 반면에 Rubicon의 녹다운에서는 이전의 데이터와 반대 결과를 나타냈다. 또한 Rubicon 과발현된 BMDM에서 세포 외 수준의 산성화가 증가했다 (도 5c).
상기결과를 통해, Rubicon은 BMDM의 해당과정을 증가시키면서 미토콘드리아 대사를 감소시킴을 알 수 있다.
5. Mito-TIPTP의 Rubicon-p22phox 상호 작용 억제 및 미토콘드리아 기능 향상 활성 확인
대장염은 장에 심각한 염증을 일으키는 잘 알려진 염증성 질환이다. 대장염에서 과도한 ROS 생성 및 NLRP3 인플라마좀의 활성화는 인터루킨 (IL)-1β 및 IL-18의 발현의 상향 조절을 동반한다.
대장염은 NLRP3 인플라마좀의 활성화와 관련이 있기 때문에 우리는 시험관 내에서 Rubicon-p22phox의 상호 작용을 조사하기 위해 ATP 또는 DSS로 활성화된 대식세포를 사용했다. ATP 또는 DSS에 의한 LPS 프라이밍 BMDM의 활성화는 시간 의존적 방식으로 Rubicon-p22phox의 상호작용을 증가시켰다 (도 6a).
이전 연구에서 우리는 세포질 ROS 수준을 조절하여 류마티스 관절염에 대한 잠재적 치료제로 TIPTP라는 세포질 내 p22phox-Rubicon 경로 억제제를 개발했다 (KR 10-2019-0098999). 특정 미토콘드리아 표적화에 대한 TIPTP의 능력을 증가시키기 위해 우리는 주로 미토콘드리아 표적화에 사용되는 트리페닐포스포늄 (TPP)이라는 분자를 추가했다 (ChemMedChem 2020, 15, 404-410). 우리는 TIPTP에 비해 미토콘드리아를 표적으로 하는 효능이 더 높은 TIPTP를 Mito-TIPTP라고 명명했다. Rubicon-p22phox의 상호 작용에 대한 Mito-TIPTP의 효과를 조사하기 위해 ATP 또는 DSS가 처리된 LPS-프라이밍된 BMDM에서 Mito-TIPTP를 처리하였다. Mito-TIPTP는 LPS 프라이밍된 BMDM에서 용량 의존적 방식으로 Rubicon-p22phox의 결합을 감소시켰다 (도 6b). 또한, 우리는 공초점 이미징을 통해 미토콘드리아에서 Mito-TIPTP에 의한 Rubicon-p22phox의 공존의 감소를 보여주었다 (도 6c 및 7a). 또한 ATP에 의해 활성화된 LPS-프라이밍된 BMDM에서 Mito-TIPTP, mtROS의 다른 항산화제 (Mito-Tempo 및 MitoQ) 또는 세포질 ROS의 항산화제(TIPTP)로 처리할 때 mtROS의 수준을 측정했다. 저용량(1 ~ 10 nM)에서 Mito-TIPTP는 다른 억제제에 비해 mtROS 수준에서 상당한 감소를 나타내었지만 고농도에서는 그렇지 않았다 (도 6d, 7b 및 7c). 놀랍게도 Mito-TIPTP는 IC50이 5μM인 TIPTP와 비교하여 IC50이 100배 향상된 0.05μM의 IC50을 가졌다 (도 7b). 우리는 ATP에 의해 자극된 LPS-프라이밍된 BMDM에서 Mito-TIPTP가 미토콘드리아 대사를 회복하는지 여부를 세포외부 흐름 분석을 사용했다. Mito-TIPTP는 미토콘드리아 대사를 증가시키고 BMDM에서 세포 외 젖산 수준을 감소시켰다 (도 6e). 종합하면, Mito-TIPTP는 Rubicon-p22phox 경로의 억제를 통해 mtROS의 수준을 완화하고 신진대사를 회복한다.
6. 급성 및 만성 DSS 유발 대장염 마우스 모델에서 Mito-TIPTP의 치료 효과 확인
다음으로, Mito-TIPTP는 마우스에서 급성 및 만성 DSS 유발 대장염을 완화하는지 확인하고자 하였다. 아데노바이러스 감염을 통해 Rubicon-knockdown 마우스를 생산하고 DSS와 Mito-TIPTP를 12일까지 처리하였다. Mito-TIPTP는 DSS 유발 대장염에 대한 WT 생쥐의 생존율을 증가시켰지만 Ad-shRubicon 감염 생쥐에서는 그렇지 않았다. 흥미롭게도, Rubicon의 감소는 마우스의 사망률을 지연시켰고 우리는 Rubicon의 억제가 치명적인 면역 반응을 조절하는 것과 관련되어 있을 것이라고 생각했다 (도 8a 및 9a). 체중 감소는 또한 Mito-TIPTP로 처리된 WT 생쥐에서 처리되지 않은 생쥐에 비해 약 20% 감소했다. Rubicon 마우스의 녹다운에서 체중에는 차이가 없었지만 처리되지 않은 WT 마우스보다 높았다 (도 8b 및 9b). 마우스의 대장염 점수는 Mito-TIPTP가 있는 WT 마우스에서 유의하게 감소했다 (도 8c 및 9c).
또한, 10일 동안 대장염의 징후인 결장 길이를 조사했다. WT 마우스에서 결장 길이는 Mito-TIPTP 처리에 의하여 회복되었다. Ad-shRubicon에 감염된 마우스에서 결장 길이가 증가했지만 Mito-TIPTP의 처리에는 영향이 없었다 (도 8d).
그리고, 결장에서 Rubicon의 결합과 mtROS 수준을 조사했다. Rubicon-p22phox의 상호작용은 DSS 처리된 마우스 결장에서만 증가하지만 Ad-shRubicon 마우스의 경우 감소한다 (도 8e). mtROS의 수준은 Mito-TIPTP를 처리한 WT 마우스에서도 감소하지만 Ad-shRubicon 마우스에서는 Mito-TIPTP를 처리에 의한 감소를 확인할 수 없었다(도 8f).
또한 IL-1β, IL-18, TNF-α 및 IL-6을 포함한 사이토카인의 생성과 염증 활성화에 역할을 하는 골수과산화효소 (myeloperoxidase, MPO)의 활성을 추가로 측정했다 (도 8g). H&E 염색 및 면역조직화학 이미징에서 Mito-TIPTP 처리되지 않은 결장은 WT 마우스에서 DSS에 의해 파괴되었지만 Mito-TIPTP를 첨가하면 결장 장벽이 회복되었다. 또한 Rubicon의 녹다운은 Mito-TIPTP와 무관한 결장의 생존력을 증가시켰다. 결장에서 병리 점수에서 Rubicon 및 p22phox는 Mito-TIPTP가 처리되지 않은 Ad-vector 마우스에서 상향조절되었다. (도 8h 및 10).
다음으로 만성 대장염에 대한 Mito-TIPTP의 치료 효과를 조사하기 위해 DSS와 Mito-TIPTP를 66일 동안 반복적으로 치료했다 (도 11a). 급성 대장염과 유사하게 Mito-TIPTP는 생쥐의 생존율을 약 60% 증가시켰다 (도 11b). 체중은 Mito-TIPTP 처리되지 않은 마우스에서 주기적으로 감소했지만 Mito-TIPTP 처리된 마우스는 체중을 유지했다 (도 11c). 또한, Mito-TIPTP 처리된 마우스의 결장은 DSS만 처리된 마우스의 결장과 비교하여 크게 회복되었다 (도 11d). 결장에서 H&E 이미징은 Mito-TIPTP가 DSS 처리된 마우스에서 결장의 생존력을 유의하게 회복함을 보여주었다 (도 11e). 전체적으로 Mito-TIPTP는 생체 내에서 Rubicon-p22phox의 결합을 차단하여 DSS로 유발된 대장염에 대한 치료 효과를 나타냈다.
7. 궤양성 대장염(Ulcerative Colitis, UC)에서 Rubicon과 p22phox의 발현 및 상호작용 확인
이어서, 건강한 대조군과 궤양성 대장염 환자의 결장에서 Rubicon 및 p22phox 발현을 추가로 조사했다 (그림 12a). Rubicon 및 p22phox 발현은 정상 결장의 점막 세포질 및 면역 세포에서 약하게 양성이었지만, 궤양성 대장염 환자의 결장에서는 점막과 면역 세포 모두 강한 양성 (H-score > 100)을 보였다. 또한 Rubicon은 건강한 대조군이 아닌 궤양성 대장염 결장 용해물의 미토콘드리아에서 주로 p22phox와 상호작용함을 확인하였다 (그림 12b). 상기 결과는 결장에서 Rubicon과 p22phox의 발현과 상호작용이 궤양성 대장염에서 임상적으로 중요함을 의미한다.
이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기를 기초로 다양한 기술적 수정 및 변형을 적용할 수 있다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 시스템, 구조, 장치, 회로 등의 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.
그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 특허청구범위와 균등한 것들도 후술하는 청구범위의 범위에 속한다.
Rubicon: Run/cysteine-rich-domain-containing Beclin1-interacting autophagy protein
NADPH: Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate
ROS: Reactive oxygen species
mtROS: Mitochondrial ROS
LPS: Lipopolysaccharide
BMDMs: Bone marrow-derived macrophages
ATP: Adenosine triphosphate
DSS: Dextran sulfate sodium
IBDs: Inflammatory bowel diseases
TIPTP: 2-(tetrahydroindazolyl)phenoxy-N-(thiadiazolyl) propenamide 2
CLP: Cecal ligation procedure
TPP: Triphenylphosphonium
LAP: LC3-associated phagocytosis
OXPHOS: Oxidative phosphorylation
UQCRC2: Cytochrome bc1 complex subunit 2
UQCRQ: Cytochrome bc1 complex subunit 8
PGC: Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator
NRF: Nuclear respiratory factor
Tfam: Mitochondrial transcription factor A
OCR: Oxygen consumption rate
ECAR: Extracellular acidification rate
Oligo: Oligomycin
FCCP: Carbonyl cyanide-p-trifluoromethoxy-phenylhydrazone
2-DG: 2-deoxy-D-glucose
IL-1β: Interleukin-1β
TLRs: Toll-like receptors
IB: Immunoblotting
IP: Immunoprecipitation
AMPK 5′ adenosine monophosphate-activated protein kinase

Claims (9)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물:
    [화학식 1]
  2. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
    [화학식 1]
  3. 제2항에 있어서,
    상기 염증성 질환은 패혈증(sepsis), 패혈성 쇼크, 염증성 장질환(Inflammatory bowel disease, IBD), 복막염, 신장염, 급성 기관지염, 만성 기관지염, 골관절염, 장질환 척추염, 만성 폐쇄성 폐질환 (chronic obstructive pulmonary disease, COPD), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 급성 폐손상 (acute lung injury) 및 기관지 폐 형성장애(broncho-pulmonary dysplasia)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것인, 약학적 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 염증성 장질환은 급성 대장염, 만성 대장염, 궤양성 대장염(Ulcerative colitis, UC) 및 크론씨병(Crohns disease)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것인, 약학적 조성물.
  5. 제2항에 있어서,
    상기 조성물은 미토콘드리아에서 루비콘(Rubicon)과 p22phox의 상호작용을 저해하는 것인, 약학적 조성물.
  6. 제2항에 있어서,
    상기 조성물은 미토콘드리아의 활성산소 생성을 억제하는 것인, 약학적 조성물.
  7. 괴사(necrosis)를 동반하거나 그 발생 가능성이 높은 질환에 있어서 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 괴사의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물.
    [화학식 1]
  8. 하기 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 포함하는, 미토콘드리아 기능 개선용 식품 조성물.
    [화학식 1]
  9. 제8항에 있어서,
    상기 조성물은 미토콘드리아의 활성산소를 감소시키고 그 기능을 향상시키며 세포질에서 해당과정 작동을 감소시키는 것인, 식품 조성물.
KR1020220117018A 2021-10-28 2022-09-16 미토콘드리아 활성산소 수준을 감소시키는 신규 화합물 및 이의 용도 KR102683991B1 (ko)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN102167697A (zh) 2011-03-14 2011-08-31 马慧萍 新型抗缺氧损伤化合物结构、合成方法及其应用
KR102090139B1 (ko) 2019-04-30 2020-03-17 한양대학교 에리카산학협력단 신규 ｐ２２ｐｈｏｘ 억제제 및 이를 포함하는 류마티스 관절염 예방 또는 치료용 조성물

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