TWI312369B - A-isomaltosylglucosaccharide synthase,process for producing the same and use thereof - Google Patents

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TWI312369B
TWI312369B TW090118090A TW90118090A TWI312369B TW I312369 B TWI312369 B TW I312369B TW 090118090 A TW090118090 A TW 090118090A TW 90118090 A TW90118090 A TW 90118090A TW I312369 B TWI312369 B TW I312369B
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TW
Taiwan
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enzyme
cyclic tetrasaccharide
isomaltose
activity
saccharide
Prior art date
Application number
TW090118090A
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English (en)
Inventor
Michio Kubota
Keiji Tsusaki
Shigeharu Fukuda
Toshio Miyake
Original Assignee
Hayashibara Biochem Lab
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1312ig§i8〇9〇號專利申請案 中文說明書修正頁 A7 B7
Bf(. 潮97年9月“ 匕)正替換頁 五、發明説明（） 1 本發明係有關α -異麥芽糖基葡糖質生成酶與其製造 方法以及其用途，更詳而言係有關新穎之α 一異麥芽糖基 葡糖質生成酶與該酶之製造方法，使用該酶之α ~葡糖基 轉移方法，生成α —異麥芽糖基葡糖質之方法，倂用該酶 與α —異麥芽糖基轉移酶以製造具有環{ — 6 ) 一 a — D —吡喃葡糖基—（1 — 3) — a — D —吡喃葡糖基一（1 —6) — a— D -吡喃葡糖基—（1 — 3) — a— D-吡 喃葡糖基一（1 — }構造的環狀四糖之方法，以及含有此等 糖質之組成物。 以葡萄糖爲構成糖之糖質係習知者有例如澱粉之部份 分解物之直鏈澱粉，澱粉糊精，麥芽糖糊精，麥芽寡糖， 異麥牙寡糖等。此等糖質係通常在分子兩端分別具有非還 原末端與還原末端，具有還原性係爲人所知。通常澱粉部 份分解物係以葡萄糖。當量（Dexitrose Equivalen + = DE)來 表示固體單位之還原力。此値大者，通常係分子小，爲低 粘度且甜味強，但反應性高，具有極易與胺基酸或蛋白質 等具有胺基之物質引起胺基羰基反應，產生褐變或惡臭， 極易引起其品質劣化等性質亦爲人所知。爲改善此缺點， 以往均希望在不改變澱粉部份分解物之構成糖的葡萄糖下 ，減低或消滅其還原力。例如Journal of American Chemical Sodety 第 71 卷，353 〜358 頁（1949)所揭 示，有使macerans ·直鏈澱粉與之作用於澱粉，以生成6 〜8分子葡萄糖爲α — 1 ，4 —葡糖苷結合的α —，/3-或r 一環狀糊精之方法爲人所知。如今已有工業規模自澱 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 _ 4 - 1312369 A7 B7 五、發明説明（2 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 粉生產此等環狀糊精，此等環狀糊精還以其所具有之非還 原性，無味性，包含能力等特性被利用於各種用途。又， 如本案申請人所申請專利日本特開平7 — 1 4 3 8 7 6號 公報及特開平7 - 2 1 3 2 8 3號公報等揭示，使非還原 性精質生成酶及海藻糖游離酶作用於麥芽寡糖等澱粉部份 分解物，以生成二分子葡萄糖α，α -結合的海藻糖的方 法係爲人所知者。現今〇:，〇: -海藻糖已在工業上自澱粉 予以生產’以其所具有之非還原性，溫和，高品質之甘味 特性等被利用於各種用途。如上述做爲以葡萄糖爲構成糖 的非還原性糖質，葡萄糖聚合度爲2之α，α -海藻糖， 葡萄糖聚合度爲6至8之α—，万―，γ —環狀糊精，雖 然以其各具有之特性在工業上被生產，被利用，但其種類 仍受到限制，極希望能提供更多樣之非還原性糖質，或低 還原性糖質。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 另一方面，近年來已有報告提出以葡萄糖爲構成糖之 新環狀四糖類，即，「European Journal of Biochemistry」 第226卷，641〜648頁（1994)中曾揭示主 要以葡萄糖殘基爲α_1 ，3結合與α - 1 ，6結合交替 連接的，使水解酶之Alternanase作用於Alternan以生成環 { — 6) — α — D -批喃葡糖基—（1 — 3) — α - D — 吡喃葡糖基—（1 — 6 ) - α - D —吡喃葡糖基—（1 — 3 ) - α — D -吡喃葡糖基_( 1 —丨之構造的環狀四糖 (此說明書中有時將此糖質簡稱爲「環狀四糖」），使其 在一種有機溶媒之甲醇共存下晶析之內容。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（21〇X297公釐） -5- 1312369 Α7 Β7 日祕正替換頁 五、發明説明（） 3 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 環狀四糖係具有環狀構造，具有包含各種化合物之能 力，同時因其爲非還原性者，所以可以在安定化揮發性有 機物之作用或不會引起胺基羰基反應’不用擔心褐變劣化 之下，可加工利用於各種用途。惟由於做爲製造環狀四糖 之原料的alternan，或製造環狀四糖所需之酶的Alternanase 極不易取得，在現今情況下可以產生此等之微生物亦極不 容易取得。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 在這種情況下，本發明人等乃在日本專利 2 0 0 0 — 1 4 9 4 8 4號說明書及日本特專利 2 0 0 0 — 2 2 9 5 5 7號說明書中揭示，以做爲非還原 末端之結合樣式具有α_1 ，6 —葡糖苷結合，做爲此還 原末端以外之結合樣式爲具有α-l ，4 -葡糖苷結合之 葡萄糖聚合度爲3以上之糖質（在此說明書中有時簡稱爲 「α -異麥芽糖基葡糖質」）爲原料，特異性地將該糖質 之異麥芽糖基部份與其以外之葡糖質切斷，轉移此α -異 麥芽糖基部份，使可以成生環狀四糖之α -異麥芽糖基轉 移酶予以作用，而成功地生產出環狀四糖。α —異麥芽糖 基轉移酶係可以自α -異麥芽糖基葡糖質藉由α -異麥芽 糖基轉移而可生成環狀四糖之酶，係具有以下理化學性質 之酶。 (1 )作用 做爲非還原末端之結合樣式具有α - 1 ，6葡糖基結 合，做爲此非還原末端以外之結合樣式具有α — 1 ，4葡 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -6- 1312369 A7 B7 五、發明説明（4 ) 糖基結合之葡萄糖聚合度3以上糖質，藉由包含α 一異麥 牙糖基轉移之反應，生成具有環{ 一6 ) - α - D -吡喃 葡糖基一（1 — 3) — α—D -吡喃葡糖基一（1 — 6) 〜α — D -吡喃葡糖基一（1 — 3) 一 D —吡喃葡糖 基一（1 —丨構造的環狀四糖。 (2 )分子量 在SD S —凝膠電泳法中具有約8 2,0 0 0達頓至 1 3 6,0 0 0達頓範圍內之分子量。 (3 )等電點 在含有兩性電解質之電泳法中具有Ρ 1約3 . 7〜約 8 . 3範圍內之等電點。 (4 )最適溫度 在ρΗ6 0，30分鐘反應之條件下，具有約4 5 °C〜約5 0 °C範圍內之最適溫度。 (5 )最適ρ Η 3 5 °C，3 0分鐘反應之條件下具有ΡΗ約5 . 5〜 pH約6 . 5範圍之最適pH。 (6 )溫度安定性 保持於Ρ Η 6 . 0，6 0分鐘條件具有約4 5 °C以下 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -裝II (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部智慧財產苟員工消費合作社印製 -7- 1312369 Α7 Β7 五、發明説明（5 ) 之安定溫度領域。 (7 ) p Η安定性 於4 °C，保持2 4小時之條件下具有ρ η約3 . 6〜 Ρ Η約1 〇 . 〇範圍內之安定ρ η領域。 惟有關環狀四糖之原料糖質，雖希望可以自豐富且廉 價提供之澱粉予以生產，但實際上α 一異麥芽糖基轉移酶 無法直接作用於澱粉，所以必須採用預先將澱粉變換爲具 有上述特定構造之α -異麥芽糖基葡糖質，例如人參三糖 (panose，6 - α -葡萄基麥芽糖）或異麥芽糖基麥芽糖等 較低分子之異麥芽寡糖’繼而使α 一異麥芽糖基轉移酶予 以作用而生成環狀四糖的手法 另一方面’自原料生成環狀四糖的生成率觀之，使用 人參三糖時’重量單位之原料人參三糖可得約4 4 %。同 樣’使用異麥芽糖基麥芽糖時，則約爲3 1 %，與之相比 ，使用澱粉時，不但必須預先使α 一澱粉酶，切澱粉脫光 之酶、/3 -澱粉酶及-配糖酶等予以作用，生成爲人參 三糖等較低分子之異麥芽糖基寡糖，環狀四糖之生成率亦 爲約1 5% ’極爲低。 自澱粉生產生環狀四糖雖如上述生成率低，仍可具實 用，惟令人憂心的是成本高。所以在此狀況下，乃極希望 開發以極容易取得之澱粉等材料做爲原料，建立高生成率 之環狀四糖新穎製造方法。 本發明係以提供α-異麥芽糖基葡糖質生成酶與其製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ29?公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝. 訂 經濟部智慧財產笱員工消費合作社印製 -8- 1312369 Α7 Β7 五、發明説明（6 ) 造方法’使用該酶所得環狀四糖或含其之糖質，以及此等 之用途爲課題。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明人係爲解決上述課題，期望以澱粉爲原料，爲 自《粉以高收率獲得環狀四糖，廣泛地自可以生產其所用 _性能的微生物探索尋找新穎之酶。結果意外地發現，先 前申請案2000 — 149484號及申請案 2 ◦ 0 0 - 2 2 9 5 5 7號說明書所揭示，自土壤所分離 之芽孢桿菌（Bacillus)屬或節桿菌（Arthrobacter)屬所屬 微生物’具有產生α -異麥芽糖基轉移酶能力之圓孢芽孢 桿菌（Bacillus globisporus )C9株、圓孢芽孢桿菌C 11 株、圓孢芽孢桿菌N 7 5株、或球形節桿菌（Arthnobacter globiformis ) A 1 9株（以下分別簡稱爲「微生物C 9株」 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 、「微生物C11株」、「微生物N75株」及「微生物 A 1 9株」一倂具有本發明人等所期待之新穎生產α -異 麥芽糖基葡糖質生成酶能力。發現對於澱粉部份分解酶爲 主之較高分子葡萄糖質，使其與此新穎之a -異麥芽糖基 葡糖質生成酶與^ -異麥芽糖基轉移酶作用時，可以顯著 提高環狀四糖之生成率至本發明人等所期待之目標，又， 一倂明確該0： -異麥芽糖基葡糖質生成酶之各性質，同時 確立其製造方法，更確立了藉由該酶進行α 一葡萄糖基轉 移反應方法，CK -異麥芽糖基葡糖轉移酶之生成方法’以 及倂用該酶與α -異麥芽糖基轉移酶之環狀四糖，或含此 之糖質’以及其製造方法，逐而完成本發明。除此外，尙 確立了含有上述所得環狀四糖，或含其之糖質的飯食物、 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -9- 1312369 Α7 Β7 五、發明説明（7 ) 化粧品、醫藥品等組成物’完成了本發明。 圖面之簡單說明 第1圖係示來自圓芽孢桿菌c 9之藉由ct 一異麥芽糖 基轉移酶反應所得糖質施予商速液體層析時的溶離圖式。 第2圖係不來自圓牙抱桿菌C 9之由〇； -異麥芽糖基 轉移酶反應所得環狀四糖之核磁共振譜（1 Η - N M R譜） 之圖。 第3圖係示來自圓芽孢桿菌c 9之由-異麥芽糖基 轉移酶反應所得環狀四糖之核磁共振譜（1 3 C - N M R譜 )° 第4圖係表示環狀四糖之構造爲環丨一 6丨一 α - D 一吡喃葡糖基_ (1 ，3) -α — D -吡喃葡糖基一（1 ，6) —a — D —吡喃葡糖基—（1 — 3) —a—D -吡 喃葡糖基一（1-}之圖。 第5圖係表示溫度影響及本發明之圓孢芽孢桿菌（ Bacillus globisporus) C 9由來之α -異麥芽糖基葡糖質生 成酶的酶活性之圖。 第6圖係表示ρ Η影響及本發明之圓孢芽孢桿菌c 9 由來之α -異麥芽糖基葡糖質生成酶的酶活性之圖。 第7圖係表示本發明之圓孢芽孢桿菌c 9由來之α -異麥芽糖基葡糖質生成酶的溫度安定性圖。 第8圖係表示本發明之圓孢芽孢桿菌c 9由來之α -異麥芽糖基葡糖質生成酶的ρ Η安定性圖。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝.
、tT 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -10- 1312369 Α7 Β7 五、發明説明（8 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 第9圖係表示溫度影響及本發明之圓孢芽孢桿菌（ Bacillus gl obis porus ) C 9由來之α—異麥芽糖基轉移酶的 酶活性之圖。 第10圖係表示pH影響及本發明之圓孢芽孢桿菌 C 9由來之α —異麥芽糖基轉移酶的酶活性之圖。 第11圖係表示本發明之圓孢芽孢桿菌C9由來之α -異麥芽糖基轉移酶的溫度安定性圖。 第1 2圖係表示本發明之圓孢芽孢桿菌C 9由來之α -異麥芽糖基轉移酶的Ρ Η安定性圖。 第1 3圖係表示溫度影響及本發明圓孢芽孢桿菌 C 1 1由來之α -異麥芽糖基葡糖質生成酶的酶活性之圖 〇 第14圖係表示pH影響及本發明之圓孢芽孢桿菌 C 1 1由來之α -異麥芽糖基葡糖質生成酶的酶活性之圖 〇 第15圖係表示本發明之圓孢芽孢桿菌c11由來之 α -異麥芽糖基葡糖質生成酶的溫度安定性圖。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 第16圖係表示本發明之圓孢芽孢桿菌C11由來之 α -異麥芽糖基葡糖質生成酶的ρ Η安定性圖。 第1 7圖係表示溫度影響及本發明圓孢芽孢桿菌 C 1 1由來之α -異麥芽糖基轉移酶的酶活性之圖。 第18圖係表示pH影響及本發明之圓孢芽孢桿菌 C 1 1由來之α -異麥芽糖基轉移酶的酶活性之圖。 第19圖係表示本發明之圓孢芽孢桿菌c11由來之 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） -11 - 13123續90118090 號專利申請案 中文說明書修正頁 修正您3. 2 6 丑士本a年月曰 B7 民國92年3月26日呈 五、發明説明（9 ) α-異麥芽糖基轉移酶的溫度安定性圖。 第2 0圖係表示本發明之圓孢芽孢桿菌c 1 1由來之 α -異麥芽糖基轉移酶的ρ η安定性圖。 第21圖係表示溫度影響及本發明圓孢芽孢桿菌Ν75由 來之ο: -異麥芽糖基葡糖質生成酶的酶活性之圖。 第22圖係表示ΡΗ影響及本發明之圓孢芽孢桿菌Ν75 由來之a-異麥芽糖基葡糖質生成酶的酶活性之圖。 第2 3圖係表示本發明之圓孢芽孢桿菌n 7 5由來之 α -異麥芽糖基葡糖質生成酶的溫度安定性圖。 第2 4圖係表示本發明之圓孢芽孢桿菌ν 7 5由來之 α ~異麥芽糖基葡糖質生成酶的ρ Η安定性圖。 第2 5圖係表示溫度影響及本發明圓孢芽孢桿菌 Ν7 5由來之α -異麥芽糖基轉移酶的酶活性之圖。 第2 6圖係表示ρ Η影響及本發明之圓孢芽孢桿菌 Ν 7 5由來之α -異麥芽糖基轉移酶的酶活性之圖。 第2 7圖係表示本發明之圓孢芽孢桿菌Ν7 5由來之 α -異麥芽糖基轉移酶的溫度安定性圖。 第2 8圖係表示本發明之圓孢芽孢桿菌Ν7 5由來之 α -異麥芽糖基轉移酶的ρ Η安定性圖。 第2 9圖係表示溫度影響及本發明之球形節桿菌（ Arthi-obacter globiformis ) Α1 9 由來之 α —異麥芽糖基葡 糖質生成酶的酶活性之圖。 第3 0圖係表示ρ Η影響及本發明之球形節桿菌 A 1 9由來之α 一異麥芽糖基葡糖質生成酶的酶活性之圖 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1Τ φ. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 紙張尺度適細國晴（CNS )織格（刑χ297_ _ 1312369 Α7 Β7 五、發明説明（1〇 ) 〇 第3 1圖係表示本發明之球形節桿菌A 1 9由來之α -異麥芽糖基葡糖質生成酶的酶活性之溫度安定性圖。 第3 2圖係表示本發明之球形節桿菌A 1 9由來之α -異麥芽糖基葡糖質生成酶酶活性之ρ Η安定性圖。 第3 3圖係表示溫度影響及本發明之球形節桿菌（ Arthrobacter globiformis ) Α1 9 由來之 α —異麥芽糖基轉 移酶的酶活性之圖。 第3 4圖係表示ρ Η影響及本發明之球形節桿菌 A 1 9由來之〇： -異麥芽糖基轉移酶的酶活性之圖。 第3 5圖係表示本發明之球形節桿菌A 1 9由來之α -異麥芽糖基轉移酶的酶活性之溫度安定性圖。 第3 6圖係表示本發明之球形節桿菌A 1 9由來之α -異麥芽糖基轉移酶的酶活性之ρ Η安定性圖。 第3 7圖係表示溫度影響及本發明之假生林節桿菌（ Arthrobacter ramosus ) S1由來之α —異麥芽糖基轉移酶的 酶活性之圖。 第3 8圖係表示ρ Η影響及本發明之假生林節桿菌 S 1由來之α -異麥芽糖基轉移酶的酶活性之圖。 弟3 9圖係表不本發明之假生林節桿菌s 1由來之α -異麥芽糖基轉移酶的酶活性之溫度安定性圖。 桌4 0圖係表不本發明之假生林節桿菌s 1由來之α -異麥芽糖基轉移酶的酶活性之ρ Η安定性圖。 第4 1圖係示藉由本發明之α -異麥芽糖基葡糖質生 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 一裝- 訂 經濟部智慧財產局W工消費合作社印製 -13- 1312369 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（11 ) 成酶反應所得《-異麥芽糖基麥芽三糖之in-NMR譜之 圖。 第4 2圖係示藉由本發明之01 一異麥芽糖基葡糖質生 成酶反應所得α -異麥芽糖基麥芽四糖之1 Η - NMR譜之 圖。 第4 3圖係示藉由本發明之α 一異麥芽糖基葡糖質生 成酶反應得α -異麥芽糖基麥芽三糖之13C - NMR譜之 圖。 第4 4圖係示藉由本發明之α 一異麥芽糖基葡糖質生 成酶反應得α -異麥芽糖基麥芽四糖之13 C - NMR譜之 圖。 第4 5圖係在顯示器上表示本發明之由α -異麥芽糖 基轉移酶反應所得環狀四糖5〜6含水結晶狀粉末之顯微 鏡照片的中間調畫像。 第4 6圖係示以X射線繞射法分析本發明之由α -異 麥芽糖基轉移酶反應所得環狀四糖5〜6含水結晶狀粉末 時的繞射光譜圖。 第4 7圖係示以熱重量測定本發明之由α —異麥芽糖 基轉移酶反應所得環狀四糖5〜6含水結晶狀粉末時之熱 重量曲線圖。 第4 8圖係示以粉末X射線繞射分析本發明之環狀四 糖1含水結晶粉末時的繞射光譜圖。 第4 9圖係示熱重量測定本發明之環狀四糖1含水結 晶粉末時的熱重量曲線圖。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝. 訂 -14- 1312369 A7 B7 五、發明説明（12) (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 第5 0圖係示以粉末X射線繞射法分析於4 〇 ^真空 乾燥本發明之環狀四糖5〜6含水結晶粉末所得環狀四糖 無水結晶粉末時之繞射光譜圖。 第5 1圖係示以粉末X射線繞射法分析於i 2 〇 °c真 空乾燥本發明之環狀四糖5〜6含水結晶粉末所得環狀四 糖無水結晶粉末時之繞射光譜圖。 第5 2圖係示重量測定本發明之無水環狀四糖粉末時 之熱重量曲線圖。 以下示具有產生本發明之新穎α-異麥芽糖基葡糖質 生成酶能力之微生物C 9株，C 1 1株、Ν7 5株及 A 1 9株之鑑定試驗結果。該鑑定試驗係依「微生物之分 類與鑑定（長谷川武治偏，學會出版中心，1 9 8 5年） 進行者。 <微生物C 9株> < A 細胞形態> 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (1 )肉汁瓊脂培養，2 7 t 通常爲0 . 5至0 . lvmx 1 5至5 · O/zm桿 菌。無多形性。具運動性。細胞內且端形成球形孢子。形 膨潤之孢子囊。革菌氏陽性。 < B 培養性質>
(1 )肉汁瓊脂平板培養，2 7 °C 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇><297公釐） -15 - 1312369 A7 B7 五、發明説明（13) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 形狀：圓形，大小係二天即爲1至2 m m 周邊緣：全邊緣 隆起：半鏡片狀 光澤：無光 表面：平滑 色調：不透明，淺黃色 (2 )肉汁瓊脂斜面培養，2 7 °C 生育：中等程度 形狀：釋散狀 (3 )肉汁明膠穿刺培養，於2 7 t 會液化。 < C 生理學上性質> (1 ) V P試驗：陰性 (2 )生成吲哚：陰性 (3 )自硝酸生成氣體：陽性 (4 )澱粉之水解：陽性 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (5 )色素之生成：不會生成可溶性色素 (6 )脲酶：陽性 (7 )氧化酶：陽性 (8 )過氧化氫酶：陽性 (9)生育範圍：PH5 _ 5至9 . ◦，溫度1 ◦至 3 5。。 (1 0 )對氧之態度：好氣性 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -16- 1312369 A7 B7 五、發明説明（14 ) (11) 碳源之利用性 與 有無生成酸 利用性 生成酸 D -葡萄糖 可利用 陽性 甘油 可利用 陽性 蔗糖 可利用 陽性 乳糖 可利用 陽性 (12) D N A中之G C 含量：4 0 % 根據 以上菌學上 性 質，參考 Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology 第 2 卷（1 9 86年），檢討與公 知菌異同點 i。結果獲知此囷係屬於圓抱芽抱桿囷（Bacillus globisporus )之微生物， 可 以產生自澱 粉部份分解物生成α (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -異麥芽糖基葡萄糖質之α -異麥芽糖基葡糖質生成酶， 以及自該糖質經由轉移α -異麥芽糖基生成環狀四糖之α -異麥芽糖基轉移酶，具有文獻從未記載之特徵的微生物 〇 依據此等結果本發明人等乃將此菌命名爲圓孢芽孢桿 菌C9，於2000年4月25日寄存於日本通產省工業 技術院生命工學工業技術硏究所（寄存號碼F E R Μ Β Ρ - 7 1 4 3 )。 <微生物Cll> < A 細胞形態>
(1 )肉汁瓊脂培養，2 7 °C 本紙伕尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -17- 1312369 A7 B7 五、發明説明（15) 通常0 . 5至1 .〇x 1 . 5至5//m桿菌。無多形 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 性。有運動性。細胞內端形成球形孢子。形成膨潤之孢子 囊。革蘭氏陽性。 < B 培養性質> (1 )肉汁瓊脂平板培養，2 7 °C 形狀：圓形，大小係2天之間爲1至2 m m 周緣：全緣 隆起：半鏡片狀 光澤：無光 表面：平滑 色調：不透明，淺黃色 (2 )肉汁瓊脂斜面培養，2 7 °C 生育：中等程度 形狀：釋散狀 (3 )肉汁明膠穿刺培養，於2 7 °C 可液化。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 < C 生理學上性質> (1 ) V P試驗：陰性 (2 )吲哚之生成：陰性 (3 )自硝酸生成氣體：陽性 (4 )澱粉之水解：陽性 (5 )色素生成：不會生成可溶性色素 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -18- 1312369 A7 B7 --- 五、發明説明（16 ) (6) 脲酶：陽性 (7) 氧化酶：陽性 (8) 過氧化氫酶：陽性 ( 9 )生 .育之範圍：P Η 5 . 5 至 9 . 〇，溫度1 〇 至 3 5 °C ( 1 0 ) 對氧之態度：好氣性 ( 1 1 ) 碳源之利用性與生成酸之有無 利用性 生成酸 D -葡萄糖 可利用 陽性 甘油 可利用 陽性 蔗糖 可利用 陽性 乳糖 可利用 陽性 ( 1 2 ) DNA中之GC含量：39% 根據 以上菌學上性質，參考 Bergey's Manual of Sy s tematic Bacteriology 第 2 卷（1 9 8 6 年），檢討與 公 知 菌 異 同點 i。結果獲知此菌‘ 係屬於圓孢芽: 孢桿菌（Bacillus globisporus)之新穎微生物， 此菌可以產生 自澱粉部份分 解 物 生 成 CL 異麥芽糖基葡糖 質之α -異麥 芽糖基葡糖質 生 成 酶 7 以及 :自該糖質轉移α -異麥芽糖基 生成爲環狀四 糖 之 a — 異麥芽糖基轉移酶， 具有文獻從未 記載之特徵的 微 生物。 依據此等結果本發明人等乃將此菌命名爲圓孢芽孢桿 菌C11 ，於2000年4月25日寄存於日本通產省工 業技術院生命工學工業技術硏究所（寄存號碼F E R Μ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 一裝. ΐτ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -19- 1312369 A7 B7 經濟部智慧財產笱員工消費合作社印製 五、發明説明（17 ) B P — 7 1 4 4 )。 <微生物N75> < A 細胞形態> (1 )肉汁瓊脂培養，2 7 °C 通常0 . 5至1 . O/zmx 1 · 5至5/zm桿菌。無 多形性。有運動性。細胞內端形成球形孢子。形成膨潤之 孢子囊。革蘭氏陽性。 < B 培養性質> (1 )肉汁瓊脂平板培養，2 7 °C 形狀：圓形，大小係2天之間爲1至2 m m 周緣：全緣 隆起：半鏡片狀 光澤：無光 表面：平滑 色調：不透明，淺黃色 (2 )肉汁瓊脂斜面培養，2 7 °C 生育：中等程度 形狀：釋散狀 (3 )肉汁明膠穿刺培養，於2 7 t 可液化。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -20- 1312369 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（18) < C 生理學上性質> (1 ) V P試驗：陰性 (2 )吲哚之生成：陰性 (3 ) 自硝 酸生成氣體 :陽性 (4 ) 澱粉 之水解：陽 性 (5 ) 色素 生成：不會 生成可 溶性色 素 (6 ) 脲酶 :陽性 (7 ) 氧化 酶：陽性 (8 ) 過氧 化氨酶·陽 性 (9 ) 生育 :之範圍·’ ] P Η 5 1 • 7至 9 . 0 > 溫 度1 0 至 3 5。。 (1 0 )對 氧之態度： 好氣性 (1 1 )碳 源之利用性 與生成 酸之有 ίκ η、、 利用性 生 成 酸 D -葡萄糖 可利用 陽 性 甘 油 可利用 陽 性 蔗 糖 可利用 陽 性 乳 糖 可利用 陽 性 (1 2 )D Ν Α中之G C含量 :4 0 % 根； 璩以 上菌學上 性質， 參考 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology 第2卷 (19 8 6 年 ) 5 檢討與 公 知菌異 同 丨點。 結果獲知此菌係屬於圓孢芽; 孢桿菌 (Bacillus globisp orus), 之新穎微生 物，又 ，此'菌 可以 產 生 白 澱粉部 份 分解酶 生 i成α 一異麥芽糖基葡萄糖質 生成 之 a — 異麥芽 糖 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -21 - 1312369 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（19 ) 基葡糖質生成酶，以及自該糖質轉移α -異麥芽糖基生成 爲環狀四糖之α -異麥芽糖基轉移酶，具有文獻從未記載 之特徵的微生物。 依據此等結果本發明人等乃將此菌命名爲圓孢芽孢桿 菌Ν75 ，於2001年5月16日寄存於日本通產省工 業技術院生命工學工業技術硏究所（寄存號碼F E R Μ Β Ρ - 7 5 9 1 )。 <微生物A 1 9株> < A 細胞形態> (1 )肉汁瓊脂培養，2 7 °C 通常 0 · 4 至 0 . 8//mx 1 . 0 至 4 · 0#ni 之桿 菌。有多形性。無運動性。無孢子。革蘭陽性。 (2 ) E Y G瓊脂培養基，2 7 °C 具桿菌-球菌之生育周期 < B 培養性質> (1 )肉汁瓊脂平板培養，2 7 t 形狀：圓形，大小係1天之間爲2至3 m m 周緣：全緣 隆起：半鏡片狀 光澤：無光 表面：平滑 本紙張尺度適用中11¾:標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐Ί ' -22- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} 一裝 訂 0. 1312369 A7 B7 經 濟 部 智 慧 財 產 局 消 費 合 再 社 印 製 五、發明説明（2〇 ) 色調：不透明，黃色 (2 )肉汁瓊脂斜面培養，2 7 °C 生育：中等程度 形狀：絲狀 (3 )肉汁明膠穿刺培養，於2 7 °C 不會液化。 < C 生理學上性質> (1 )澱粉之水解：陰性 (2 )色素生成：不會生成可溶性色素 (3 )脲酶：陽性 (4 )氧化酶：陽性 (5 )過氧化氫酶：陽性 (6 )過氧之態度；好氣性 (7 )細胞壁之主要二胺基酸：賴胺酸 (8 )細胞壁之肽多糖型：賴胺酸-丙胺酸 (9 )細胞壁之N -醯基型：乙醯基 (1 〇 )細胞壁之構成糖：半乳糖、葡萄糖 '鼠 甘露糖 (1 1 )對維他命之要求性：無 (12) DNA 中之 GC 含量：65% (1 3 ) D N A — D N A同質性一 ··假生林節桿菌(ATCC 8010)間顯示66.5%之d D N A同質性 李糖 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 一裝- 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS〉A4規格（210x297公釐） 23 1312369 A7 _ B7__ 五、發明説明（21 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 根據以上菌學上性質，參考 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology 第 2 卷（1 9 8 6 年）’檢討與公 知菌異同點。結果獲知此菌係屬於球形節桿菌（ Arthrobacter globiformis)之新穎微生物，又，此菌可以產 生自澱粉部份分解酶生成α -異麥芽糖基葡萄糖質的α -異麥芽糖基葡萄糖質生成酶，以及糖質α -異麥芽糖基生 成爲環狀四糖之本發明α -異麥芽糖基轉移酶，具有文獻 從未記載之特徵的微生物。 球形節桿菌 通產省工業 R Μ 有可產生α 除芽孢桿菌 ，此等微生 株以外之其 基葡糖質生 物篩選方法 基葡糖質轉 基葡糖質生 壤中單離之 稱爲「微生 可加以有利 依據此等結果本發明人等乃將此菌命名爲 Α19，於2001年5月16日寄存於日本 技術院生命工學工業技術硏究所（寄存號碼F Ε Β Ρ - 7 5 9 0 )。 經 濟 部 智 慧 財 產 局 員 工 消 費 合 作 社 印 製 本發明中並只限定於上述菌株，只要爲具 -異麥芽糖基葡糖質生成酶之能力的微生物， 、節桿菌屬、及屬於其以外之屬的微生物以外 物之變異株亦可適當地使用。又，篩選上述菌 他微生物的方法可以用本發明之α -異麥芽糖 成酶的理化學上性質爲指標，採用公知之微生 ，即可極輕易地篩選。 又，可在本發明中使用，自α -異麥芽糖 移^ -異麥芽糖基生成環狀四糖α -異麥芽糖 成酶，還有本發明人等自日本岡山縣岡山市土 屬於節桿菌（Arthrobacter )屬之微生物（以下 物S1株」）由來的α-異麥芽糖基轉移酶亦 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 24 1312369 A7 B7 五、發明説明（22) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 地利用。將此微生物S 1株之鑑定試驗結果示如以下。又 ，該鑑定試驗係依據「微生物之分類與鑑定」（長谷川武 治偏，學會出版中心，1 9 8 5年）進行者。 <微生物S 1株> A 細胞形態 (1 )肉汁瓊脂培養，2 7 °C 通常0 · 3至0 7#mx0 . 8至3 · 5/zm之桿 菌。有多形性。無運動性。無孢子。革蘭陽性。 (2 ) E Y G瓊脂培養基，2 7 °C 具桿菌-球菌之生育周期 B 培養性質 經濟部智葸財產局員工消費合作社印製 (1 )肉汁瓊脂平板培養，2 7 °C 形狀：圓形，大小係1天之間爲2至3 m m 周緣：全緣 隆起：半鏡片狀 光澤：無光 表面：平滑 色調：不透明，淺黃色 (2 )肉汁瓊脂斜面培養，2 7 °C 生育：中等程度 形狀：絲狀 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -25- 1312369 Α7 Β7 五、發明説明（23 ) (3 )肉汁明膠穿剌培養，於2 7 °C 不會液化。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) C 生理學上性質 (1 )澱粉之水解：陰性 (2 )色素生成：不會生成可溶性色素 (3 )脲酶：陽性 (4 )氧化酶：陽性 (5 )過氧化氫酶：陽性 (6 )過氧之態度；好氣性 (7 )細胞壁之主要二胺基酸：賴胺酸 (8 )細胞壁之肽多糖型：賴胺酸-丙胺酸 (9 )細胞壁之N —醯基型：乙醯基 (1 0 )細胞壁之構成糖：半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、 甘露糖 (11) 對維他命之要求性：無 (12) DNA 中之 GC 含量：65% 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (1 3 ) D N A — D N A同質性一：假生林節桿菌 (ATCC 13727)間顯示 84 _ 4% 之 DNA —D N A同質性。 根據以上菌學上性質，參考 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology 第 2 卷（1 9 8 6 年），檢 S寸與公 知菌異同點。結果獲知此菌係屬於假生林節桿® (Arthrobacter ramosus)之新穎微生物，可以產生自α —異麥 芽糖基葡萄糖轉質移酶的α -異麥芽糖基生成爲環狀1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） -26- 1312369 Α7 Β7 五、發明説明（24 ) 之本發明α -異麥芽糖基轉移酶，具有文獻從未記載之特 徵的微生物。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 依據此等結果本發明人等乃將此菌命名爲假生林節桿 菌S1 ，於2001年5月16日寄存於日本通產省工業 技術院生命工學工業技術硏究所（寄存號碼F E R Μ Β Ρ — 7 5 9 2 )。 本發明中係只要爲具有可產生α -異麥芽糖基葡糖質 生成酶之能力的微生物亦可使用上述微生物S 1株之變異 株。又，篩選微生物S 1之變異株的方法可以用本發明之 α -異麥芽糖基葡糖質生成酶的理化學上性質爲指標，採 用公知之微生物篩選方法，即可極輕易地篩選。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 培養本發明之微生物時所用培養基係只要該微生物可 以生長，可產生α -異麥芽糖基葡糖質生成酶之營養培養 基即可，合成培養基及天然培養基的任一均可用。碳源係 只要可利用在該微生物之生長即可，例如可適當地使用來 自植物之澱粉或植物糖原，來自動物或微生物之糖原或支 鏈澱粉，或此等之部份分解物，葡萄糖、果糖、乳糖、蔗 糖、甘露醇、山梨糖醇、糖蜜等糖質、又，檸檬酸'琥珀 酸等有機酸亦可使用。培養基中此等之碳源濃度可依碳源 之種類適當地選擇。氮源可例如使用銨鹽，硝酸鹽等無機 氮化合物、尿素、玉米漿' 酪蛋白、腺、酵母萃取物 '肉 萃取物等有機含氮物等。又，無機成份可適當地例如用鈣 鹽、鎂鹽、鉀鹽、鈉鹽、磷酸鹽、錳鹽 '鋅鹽、鐵鹽、銅 鹽、鉬鹽及鈷鹽等鹽類。更可視其需要適當地用胺基酸類 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -27- 1312369 A7 _ _B7 ___ 五、發明説明（25 ) 、維他命類等。 培養本發明之微生物係通常在4〜4 0°C，較佳在 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 20〜37°C，ρΗ4〜10 ’較佳在ρΗ5〜9中選出 之條件，好氣狀態下施行。培養時間係該微生物可開始增 殖之以上的時間，較佳係1 0〜1 5 0小時。又’培養液 之溶存氧濃度並無特別限制，通常係調節或攪拌使通氣量 爲0 . 5〜2 Op pm範圍，通氣時可適當地採用使用或 追加氧氣，或提高發酵器內之壓力等手段。又，培養方式 可分次培養或連續培養的任一。 如上述培養微生物後回收本發明之酶。α -異麥芽糖 基葡糖質生成酶活性可在包含菌體在內之全體培養物中看 到，可採取除菌液做爲粗酶液，亦可將全體培養物做爲粗 酶液使用。自培養物除去菌體之方法可採用公知之固體分 離法。例如離心分離培養物本身之方法，或使用預塗濾器 等過濾分離的方法。藉由平膜，中空線膜等膜過濾予以分 離之方法等均可適當地採用。如上述除去菌體後之培養液 可做爲粗酶液使用，通常係藉由硫酸銨鹽析法、丙酮及乙 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 醇沈澱法、平膜、中空膜等膜濃縮法予以濃縮該酶後利用 〇 如上述所得含本發明之酶的除菌液及其濃縮液，可以 直接或依公知方法固定化此等溶液中所含之該酶後使用》 其固定化方法可適當地採用與離子交換體結合之方法與樹 脂及膜等之共有結合法、吸附法、用高分子物質之包括法 等。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -28- Α7 Β7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1312369 五、發明説明（） 26 上述酶液中通常有本發明之《-異麥芽糖基葡糖質生 成酶與α —異麥芽糖基轉移酶共存於其中。可視其需要依 公知方法分離•精製本發明之α -異麥芽糖基葡糖質生成 酶加以利用。例如硫酸銨鹽析上述粗酶液或濃縮酶液，經 濃縮、透析後，依序適用使用Sepabeade FP-DA13凝膠之陰 離子交換管柱層析，繼而使用Sephacry HR S-200凝膠之親 和層析法，用Butyl-Toyopearl 650M凝膠之疏水層析，及再 用Sephacry HR S-200凝膠之親和層析予以精製，即可得電 泳上單一之本發明α -異麥芽糖基葡糖質生成酶。 本發明α -異麥芽糖基葡糖質生成酶之理化學上性質 的特徵係可以自做爲非還原末端之結合式樣具有α — 1，4 -葡糖苷結合的葡萄糖聚合度爲2以上糖質，在實質上不 增加還原力之下，藉由α -葡萄糖基轉移生成做爲非還原 末端之結合樣式具有α - 1，6葡糖苷結合，做爲此非還原 末端以外之結合樣式具有α _ 1，4葡糖苷結合之葡萄糖聚 合度爲3以上糖質，不具有葡聚糖生成能力，藉由 E D Τ Α活性可被阻斷之酶者，詳而言具有以下之理化學 上性質。另外，上述做爲非還原末端之結合樣式具有α -1,4葡糖苷結合之葡萄糖聚合度爲2以上糖質則可爲一種 或二種以上選自麥芽寡糖、麥芽糖糊精、澱粉糊精、直鏈 澱粉、支鏈澱粉、溶性澱粉、液化澱粉、糊化澱粉及糖原 之糖質。 (1 )作用 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2!OX297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本冥) 訂 -29- 1312369 A7 B7 .#換頁 五'發明説明（） 27 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 自做爲非還原末端具有α - 1 ，4葡萄搪基結合之葡 萄糖聚合度爲2以上之糖質，在實質上不增加還原力之下 藉由α —葡萄糖基轉移，即可生成做爲非還原末端具有α —1 ，6葡糖苷結合樣式，做爲此非還原末端以外之結合 式樣具有α — l ’ 4葡糖苷結合樣式之葡萄糖聚合度3以 上的糖質。 (2 ) 分子量 在S D S _凝膠電泳法，具有約7 4 , 0 〇 0至 160， 000達頓範圍內之分子量。 (3 )等電點 依含有兩性電解質之電泳法：在Ρ I約3 . 8〜 7 . 8範圍內具有等電點。 (4 )最適溫度 ρΗ6 _ ◦ ’ 6 ◦分鐘反應下，於約40°C〜50Τ： 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 範圍內具有最適溫度。 ρΗ6 . 0 ’ 60分鐘反應下’ lmMCa21存在下 ，於4 5〜5 5°C範圍內具有最適溫度。 pH8 · 4，60分鐘反應下，於6〇t具有最適溫 度，或 pH8 · 4 ’ 60分鐘反應下’於lniMCa21存在 下，於6 5 °C具有最適之溫度。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)M規格（210x 297公釐） -30- 1312369 A7 B7 五、發明説明（28) (5 )最適ρ Η 35°C，60分鐘反應下，於pH約6 . 0〜8 . 4 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 範圍內具有最適Ρ Η。 (6 )溫度安定性 保持於Ρ Η 6 · 0，6 0分鐘條件，於4 5 °C以下具 有溫度安定區域。 保持於pH6 . 0，60分鐘條件，lmMCa2 +存 在下，於約5 0 °C以下具有溫度安定區域。 保持於Ρ Η 8 . 0，6 0分鐘條件，於5 5 °C以下具 有溫度安定區域。 保持於pH8 · 0，60分鐘條件，lmMCa2 +存 在下，於約6 0 °C以下具有溫度安定區域。 (7 ) Ρ Η安定性 保持4 °C，2 4小時之條件下，Ρ Η約4 . 5〜 1 〇 · 0範圍內具有安定pH之區域。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (8 ) N末端胺基酸序列 酪胺酸-纈胺酸-絲胺酸-絲胺酸-白胺酸-甘胺酸 -天冬醯胺-白胺酸-異白胺酸、組織胺酸-纈胺酸-絲 胺酸-丙胺酸-白胺酸-甘胺酸-天冬醯胺-白胺酸-白 胺酸、或丙胺酸-脯胺酸-白胺酸-甘胺酸-纈胺酸-鞋 胺醯胺-精胺酸-丙胺酸-麩胺醯胺-苯基丙胺酸-麩胺 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐〉 -31 - 1312369 A7 B7 月/扣士正榜換頁丨 五、發明説明（） 29 醯胺-絲胺酸-甘胺酸。 本發明之α -異麥芽糖基葡糖質生成酶的基質可用澱 粉、支鏈澱粉、直鏈澱粉、糖原等含α — 1 ，4 -葡糖苷 結合之強糖、或藉由澱粉酶或酸等予以部份水解所得澱粉 糊精、麥芽糖糊精、麥芽寡糖等部分分解物。還可以隨意 使用以分支酶等糖原分支酶（EC 2.4. 1.18)處 理此等含α — 1 ，4結合之葡糖質的糖質。以澱粉酶分解 之部份分解物可用 Handbook of Amylases and Related Enzymes ' Pergamon。Press 公司（東京）（1 988 年）所記 載之α —澱粉酶（EC 3.2.1. 1)、/3 -澱粉（ E C 3·2·1.2)、麥芽三糖生成之澱粉酶（EC 3 · 2 . 1 . 116)、麥芽四糖生成之澱粉酶（EC 3 · 2 . 1 . 60)、麥芽五糖生成之澱粉酶、麥芽六糖 生成之澱粉酶（EC 3. 2 .1.98)等以澱粉酶分解 之部份分解物。更可以在隨意調製部份分解物時使支鏈澱 粉酶（pullu lanase 3 · 2 · 1 . 4 1 )、異澱粉酶（ EC 3. 2. 1.68)等澱粉脫支酶作用。 做爲基質之澱粉可爲玉米、小麥、米等縠類由來之地 上澱粉，亦可爲馬鈴薯、番薯、樹薯等地下澱粉，較佳係 用糊化及/或液化澱粉作成溶液。此澱粉之部份分解的程 度係愈低，愈能提高環狀四糖之生成率，所以D E約2 0 以下，較佳爲約1 2以下，更佳係以約5以下爲宜。 此酶之轉移受體係不但上述基質本身可成爲受體，還 可用葡萄糖、木糖、半乳糖、果糖、阿拉伯糖、岩藻糖' 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -32- 1312369 Μ Β7 五、發明説明（3〇 ) 山梨糖、及N -乙醯胺基葡萄糖等單糖類、海藻糖、異麥 芽糖、異麥芽三糖、纖維二糖、龍膽二糖、乳糖及蔗糖等 寡糖類、麥芽糖醇、L -抗壞血酸等。 基質之濃度並不特別限定，例如使用基質濃度〇 .工 % (以下在本說明書中除特別提示以外，以r %」表示「 w / w %」）之低濃度溶液，亦可進行本發明之酶反應， 丨隹工業上係以1 %以上爲宜。又’基質溶液即使爲含有未 完全溶解之不溶性基質於其中之形態的懸濁狀溶液亦無妨 。較佳係濃度4 0 %以下，更佳係3 0 %以下爲宜。 反應溫度係可進行反應之溫度，即可於6 5 °C附近之 溫度進行。較佳係3 0〜5 5 °C附近之溫度。反應之ρ η 係通常調整爲4 _ 5〜1 0範圍，較佳係調整爲ρ η約 5 . 5〜9範圍。反應時間視酶反應之進適當地選擇。 對於經此酶之反應而生成之α -異麥芽糖基葡糖質， 使α -異麥芽糖基轉移酶作用即可製造大量之環狀四糖。 α -異麥芽糖轉移酶的作用亦可在使本發明之α 一異麥芽 糖基葡糖質生成酶作用，使此酶失活後進行。較佳係倂用 α -異麥芽糖基葡糖質生成酶與-異麥芽糖基轉移酶使 其作用。例如對澱粉或其部份分解物或糖原之水溶液，使 本發明之α -異麥芽糖基葡糖質生成酶與α -異麥芽糖基 轉移酶共存予以倂用進行作用，即可以自每單位固體之澱 粉或其部份分解物，以約3 0 %以上之高生成率，糖原時 則以約8 0 %以上之高生成率得環狀四糖。此倂用α -異 麥芽糖基葡糖質生成酶與α -異麥芽糖基轉移酶予以生成 本纸悵尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（2】ΟΧ297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝. 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -33- 1312369 Α7 Β7 )正替換頁 五、發明説明（） 31 環狀四糖之機作係自二酶之反應特性推測應爲如下者。 (1 )本發明之α -異麥芽糖基葡糖質生成酶係對做 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 爲非還原末端之結合樣式具有〇；一1 ，4葡糖苷結合之葡 甸糖聚合度爲2以上之糖質’例如澱粉、糖原、或此等之 部份分解物等糖質之非還原末端之α - 1 ，4葡萄糖基作 用’將葡萄糖基分子間轉移其他之非還原末端葡萄糖基的 6位羥基、生成非還原末端具有α-異麥芽糖基之糖質 〇 (2 ) α -異麥芽糖基轉移酶係作用於非還原末端具 有異麥芽糖基之糖質’使該異麥芽糖基分子間轉移於位在 其他非還原末端’具有異麥芽糖基之糖質的非還原末端葡 萄糖基之3位羥基、生成非還原末端具有異麥芽糖基一 1 ，3 —異麥芽糖之糖質。 (3 )繼而α -異麥芽糖基轉移酶係作用於其非還原 末端具有異麥芽糖基- 1 ，3 -異麥芽糖基之糖質，藉由 分子內轉移作用自上述糖質切離異麥芽糖基- 1 ，3 -異 麥芽糖基，予以環狀化生成爲環狀四糖。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (4 )被切離之糖質係再次經由（1 )〜（3 )的反 應，生成環狀四糖，更重覆此等之反應，蓄積大量之環狀 四糖。 如以上所述，藉由倂用α —異麥芽糖基葡糖質生成酶 與α -異麥芽糖基轉移酶，如上述二酶會重覆地作用於此 等之基質，顯著地提高環狀四糖之生成率。 又，此環狀四糖生成反應之際，再倂用其他轉移酶， 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（2丨ΟΧ297公釐） -34- 1312369 Α7 Β7 五、發明説明（32 ) 還可以更有利地實施，以提高環狀四糖之生成率。即，例 如’倂用α -異麥芽糖基葡糖質生成酶與α -異麥芽糖基 轉移酶二者作用於濃度約1 5 %的澱粉部份分解物時，可 以約5 5 %之生成率得環狀四糖，但同樣之條件下倂用α -異麥芽糖基葡糖質生成酶與α -異麥芽糖基轉移酶，與 環麥芽糖糊精葡聚葡糖基轉移酶之三者予以作用時，可以 更提高約5〜1 0%之環狀四糖生成率至約6 0〜6 5% 〇 又，生成環狀四糖時亦可使用具有產生α -異麥芽糖 基葡糖質生成酶之能力，與具有可產生特異性地切斷該生 成酶生成之α -異麥芽糖基葡萄糖質的〇： -異麥芽糖基部 份與其以外之葡萄糖質部份，轉移此α -異麥芽糖基部份 的α -異麥芽糖基轉移酶能力之微生物，藉由培養方法以 製造環狀四糖。 該使用微生物以生成環狀四糖之方法中使用的培養基 可用含有非還原末端之結合樣式具有α - 1 ，4葡萄糖結 合之葡萄糖聚合度爲2以上之糖質，且該微生物可生育之 合成培養基或天然培養基的任一。其他之培養條件可採用 上述產生本發明之α -異麥芽糖基葡糖質生成酶時之條件 〇 上述經由反應或培養所得溶液可做爲環狀四糖、或含 其糖質之溶液直接使用。通常係再予精製使用。其精製方 法可適當地採用公知之方法，例如藉活性碳脫色，以Η型 、◦型離子交換樹脂脫鹽'藉離子交換管柱層析'活性碳 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公董） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本莧) -裝·
、tT 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -35- 1312369 A7 五、發明説明（33 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 管柱層析、矽膠管柱層析等管柱層析進行分餾，以醇類及 丙酮等有機溶媒的分離，以具有適度分離性能之膜予以分 離。更可以組合一種或二種以澱粉酶，例如〇： -澱粉酶、 /3—澱粉酶、葡糖澱粉酶（EC 3 · 2 . 1 _ 3)等或 α -配糖酶等酶，分解殘存之其他糖質，以酵母之發酵處 理、鹼處理等以分解除去殘存之還原性糖質的精製方法。 尤其環狀四糖之工業上大量製造方法係最適於使用離 子交換樹脂之管柱層析’例如藉由特開昭58_ 2 3 7 9 9號公報或特開昭5 8 - 7 2 5 9 8號公報等揭 示之強酸性陽離子交換樹脂之管柱層析，除去夾雜糖類， 可以有利地製造提高環狀四糖含量，或含其之糖質。這時 可隨意地採用固定床方式，移動床方式，擬似移動床方式 的任一方式。 如上述所得之環狀四糖、或含其之糖質係濃縮後做爲 糖漿狀製品。更可以隨意予以乾燥製成粉末狀製品。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 製造環狀四糖結晶時係例如在有機溶媒存在下，在助 罐中放入純度約5 0%以上、濃度約3 〇%至9 0%之高 含環狀四糖之溶液於約0·1〜20%晶種共存下，於 9 5°C以下之溫度’較佳於1 〇〜9 〇°C範圍一邊攪拌一 邊緩緩冷卻，製造含有結晶糖膏。自糖膏製造環狀四糖結 晶’或含此之含蜜結晶之方法可適當地採用例如分蜜方法 、塊狀粉碎方法、流動造粒方法，噴霧乾燥方法等公知方 法。 如上所製造之本發明環狀四糖係具有品位高且低甜味 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2〗0X2S>7&p - -36- 1312369 A7 ___ B7 五、發明説明（34 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 的非還原性之白色粉末之爲安定性糖質，與其他材料，尤 其與胺基酸、低聚肽、蛋白等含胺基酸之物質混合，加工 亦很少褐變或發生異臭，幾乎不會影響所合之其他材料。 又’本發明之環狀四糖因具有包合能力，尤其可防止 香氣成份，有效成份等之揮發、防品質劣化，具極優異之 保持安定化香氣成份、有效成份之效果。這時可視其需要 與其他環狀糖質，例如環狀糊精類 '分岐環狀糊精類、環 狀葡聚糖類、環狀果聚糖類等倂用，藉由其包合能力可以 極有利地實施強化安定性。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 另外，因實質上不會被澱粉酶或α 一配糖酶所分解， 所以既使經口攝取亦實質上不會被消化吸收，又，不易被 腸內細菌發酵，可做爲極低熱量之水溶性食物纖維被利用 。又’不易被蛀牙誘發菌所發酵，極適於利用做爲不易蛀 牙之甜味料。亦可防止粉末狀物之附著、固結。另外，因 本發明之環狀四糖本身係無毒、無害的天然甘味料，無任 何危險性、爲極安定之甘味料、結晶製品時，可以與支鏈 澱粉，羥乙基澱粉，及聚乙烯吡咯酮等結合劑倂用，利用 於錠劑或糖衣片。另外還兼具有滲透調節性、賦形性、增 光澤性 '保濕性、粘性、防止其他糖之晶析性、難發酵性 等性質。 因此本發明之環狀四糖，或含其之糖質係可直接做爲 甘味料，調味改良劑、品質改良劑、安定劑、防變色劑、 賦形劑等，有利地利用於飮食物、嗜好品、飼料、餌料、 化粧品、醫藥品等之各種組成物》 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐〉 -37- 1312369 Α7 Β7 五、發明説明（35 ) 本發明之環狀四糖或含其之糖質可直接做爲附甜味之 調味料使用。視其需要可與粉糖膏、葡萄糖、果糖、異構 化糖、砂糖、麥芽糖，海藻糖、蜂蜜、楓糖、山梨糖醇、 麥芽糖醇、二氫查耳酮、甜葉菊苷、α 一葡糖基甜葉菊苷 '羅漢果甜味物、甘草、索馬精L -天冬胺醯基- L -苯 丙胺酸甲酯、糖精、乙醯舒泛Κ、甘素、甘胺酸、丙胺酸 等其他甘味料倂用’又，可以與糊精、澱粉、乳糖等類增 量劑倂用。尤其與一種或二種以上赤蘚糖醇、木糖醇、麥 芽糖醇等低熱量甘味料或α _葡糖基甜葉菊苷、索馬精、 L -天冬胺醯基- L -苯丙胺酸甲酯、糖精、乙醯舒泛Κ 及甘素等高甜味度甘味料倂用，極適於利用做爲低熱量甘 味料或減肥甘味料等。 又，本發明之環狀四糖，或含其之糖質可直接，或視 其需要與增量劑、賦形劑、或結合劑等混合，隨意成形爲 顆粒狀、球狀、短棒狀、板狀、立體狀或錠劑等各種形狀 使用。 又，本發明之環狀四糖，或含其之糖質的甘味可以與 酸味 '鹹味、澀味、鮮味、苦味等其他具有加味之各種物 質極易調和、耐酸性、耐熱性亦大，所以可以有利地利用 於一般飮食物之增甜、加味改良，或品質改良用。例如對 醬油、粉末狀醬油、味噌、粉末狀味噌 '醪 '醃料、撒料 、美乃滋、沙拉調味品、食用醋、三杯醋、粉末壽司醋、 中式調味料、沾醬 '湯麵料、香醋、蕃茄醬、烤肉醬、咖 哩原味、燉牛肉調味料、鮮味、湯味、複合調味料 '米酣 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 袭· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -38- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1312369 __B7 _ 五、發明説明（36 ) 、新米酣、糖包、咖啡用糖包等各種調味料做爲甘味料、 更可做爲加味改良劑、品質改良劑等利用。另外，還可做 爲對例如煎餅、米菓、糯米菓、糯米點心、湯圓、豆餡點 心、米糕、餡類、羊羹、水羊羹、二色卵、果凍、蛋糕、 糖果等各種日式點心 '麵包、餅乾、鹹餅乾、小餅乾、派 、布丁、奶油、鮮奶油、泡芙、鬆餅、海棉蛋糕、甜甜圈 、巧克力、口香糖 '牛奶糖、奶油糖、糖果等各種西式點 心、冰淇淋，凍果汁露等冰類、果實糖漬物、冰糖漿等糖 漿類、花浸漬膏、花生醬、果醬等膏類、果醬、橘皮果醬 '糖漿浸漬物、糖漬果實等果實 '蔬菜的加工食品類、什 錦醬菜、麯醃漬物、千層醃漬物、藤蔷醃漬物等醃漬物類 、醃蘿蔔加味料、醃白菜加味料等醃漬加味料、火腿、小 臘腸等畜肉製品類、魚肉火腿、魚肉小蠟腸、板魚、竹輪 、炸魚漿等魚肉製品、海膽、鳥賊內臟醃製品、酸海帶、 魷魚絲、河豚米酣漬干、鳕魚、鯛魚、蝦等之肉鬆等各種 珍味類、由海苔、山菜、魷魚、小魚、貝等所製造之小菜 、煮豆、馬鈴薯沙拉、海帶捲等料理食品、乳製品、魚肉 、畜肉、果實、蔬菜之瓶裝、罐頭類、合成酒、釀造酒、 淸酒、果實酒、發泡酒、啤酒等酒類 '咖啡、可可亞、果 汁、碳酸飮料、乳酸飮料、乳酸菌飮料等淸涼飮料水、布 丁粉、鬆餅粉 '速食果汁、速泡咖啡、速食紅豆湯、杯湯 等速食食品，更可爲嬰兒副食品、病人餐、飲用劑、含肚 食品、冷凍食品等各種飲食物的加甜味 '加味改良、風味 改良或品質改良等有利地利用。又，可做爲家畜、家禽、 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 装- ,ιτ -39- 1312369 Α7 Β7 五、發明説明（37 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 及其他、蜜蜂'蠶、魚等飼養動物之飼料、餌料等提高嗜 好性等目的使用。除此外’還可做爲香煙 '牙膏、口紅、 唇霜、內服液、錠劑、舌片、肝油糖'口中淸涼劑、口中 香劑、嗽口劑等固體物、膏狀、液狀等各種形態之嗜好品 、化粧品、醫藥品等各種組成物之甘味劑、或加味改良劑 、改口味劑，更可做爲品質改良劑、安定劑等有利地利用 〇 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 做爲對品質改良劑或安定劑之用途可以有利地利用於 極易喪失各種有用成份或活性之各種生理活性物質，或含 其之健康食品及醫藥品等。例如可對干擾素α、干擾素/3 、干擾素r、腫瘤壤死因子《、腫瘤壞死因子/3、巨噬細 胞游走阻斷因子、菌落刺激因子、轉移因子、間白素I I 等含細胞分裂素液、胰島素、成長激素、催乳激素、紅血 球生成素、卵細胞刺激荷爾蒙等含激素液、B C G疫苗、 曰本腦炎疫苗、麻疹疫苗、小兒痳痺疫苗、疸苗、破傷風 類毒素、毒蛇抗毒素、人免疫球蛋白等含生物製劑液、青 黴素、紅黴素、氯黴素、四環素、金黴素、硫酸卡那黴素 等含抗生素液、硫胺、核黃素、L-抗壞血酸、肝油、類 胡蘿蔔素、麥角甾醇、生育酚等含維生素液、Ε ΡΑ、 D ΗΑ、花生四烯酸等高度不飽和脂肪酸或其酯衍生物、 脂肪酶、酯酶、尿激酶、蛋白酶、/3 -澱粉酶、異澱粉酶 、葡聚糖酶、乳糖酶等含酶液、藥用人參萃取物、鱉萃取 物、綠藻萃取物、蘆薈萃取物、蜂膠萃取物等萃取物類或 蜂王漿等各種生理活性物質，更可以在不失去病毒、乳酸 本紙張^^適用中國國家標準（〇灿）八4規格（210乂297公釐） -40- 1312369 A7 B7___ 五、發明説明（3S ) 菌、酵母等生菌膏等有效成份或活性之下，極容易製造爲 高品質之液狀、糊狀、固體狀或粉末狀之健康食品、化粧 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 品、醫藥品等。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 上述所列本發明之環狀四糖或含其之糖質可以具有防 止揮發香氣成份（保香）、防止活性成份劣化、保濕、防 止離水、防止其他糖質之晶析、防止蛋白質變性、防止脂 質劣化、安定化乳化狀態等效果，或其本身之安定性、賦 形性等，除此外與皮膚外用上通常被利用之其他成份配合 時，當然亦可發揮其效果。又，本發明之環狀四糖或含其 之糖質係與天然糖質一樣適用於皮膚時其剌激性極低，且 可以有效保持皮膚之水份，所以該糖質係配合於皮膚外用 組成物亦可有利地實施。該皮膚外用組成物中，本發明之 環狀四糖或含其之糖質係通常與可容許適用於皮膚之一種 或二種以上其他成份，例如可容許皮膚外用之一種或二種 以上選自油脂類、蠟類、碳化氫類、脂肪酸類、酯類、醇 類、界面活性劑、色素 '香料、荷爾蒙類、維生素類、植 物萃取物、動物萃取物 '微生物萃取物、鹽類、紫外線吸 收劑、感光色素、抗氧化劑、防腐、殺菌劑、制汗、除臭 劑、淸涼劑、鉗合劑 '美白劑、消炎劑、酵素、糖質、胺 基酸類、增粘劑等一起配合》該皮膚外用組成物可提供化 粧品領域中以化粧水、乳霜、乳液、凝膠、粉末、糊狀、 塊狀等形態利用於肥皂、化粧用肥皂、沐浴粉、洗面霜、 洗面泡沬霜、洗面潤絲、沐浴乳、沐浴潤絲、洗髮乳、潤 絲精、洗髮粉等淸潔用化粧品' 捲髮水、吹髮水、髮膏、 本紙張尺度適财.關家標準（€剛八4驗（2歐297公釐)' 一~~--- -41 - 1312369 A7 B7 五、發明説明（39) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 生髮水、滋養髮用料、染髮料' 頭皮用處理液、鬚髮用油 、亮髮油 '髮油、梳髮油等頭髮化粧品、化粧水、面霜、 柔髮霜、柔髮水、保養霜（凝膠狀剝落型、凝膠狀擦拭型 、糊狀沖洗型、粉末狀等）、洗面霜、冷面霜、護手霜、 護手化粧水、乳液、保濕液、刮鬍後化粧水、刮鬍水、刮 鬍前用水、刮鬍後用霜、刮鬍用泡沬、刮鬍前用面霜、化 粧用油、嬰兒用油等基礎化粧品、粉底（液狀、霜狀、固 型等）、痱子粉、嬰兒爽身粉、爽身粉、香粉、打粉底、 白粉（霜狀、糊狀、液狀、固形、粉末等）、眼影、眼霜 、睫毛霜、畫眉筆 '睫毛化粧料 '腮紅、腮化粧水等化粧 用品、香水、混捏香水、粉末香水、古龍水 '香古龍水、 中等香水等芳香化粧品、晒霜、晒化粧水、晒油、防晒霜 、防晒化粧水、防晒油、防晒化粧品、指甲油、腳指甲油 、手指甲彩色漆、指甲漆油、指甲霜、指甲化粧料等指甲 化粧品、眼線化粧品、口紅、唇霜、混捏口紅、亮光唇膏 等口唇用化粧品 '牙膏、漱口水等口腔化粧品、沐浴鹽、 沐浴油、浴用化粧料等沐浴用化粧品等用途利用。又，例 如醫藥品領域中可做爲濕布劑' 噴霧劑、塗佈劑、浴用劑 、貼劑、軟膏劑' 糊狀劑 '軟膏用劑、化粧水劑、泥膏貼 劑等形態提供。 可以與本發明之環狀四糖或含其之糖類一起配合於皮 膚外用組成物之其他成份係具體而言有如下者，油脂類有 例如酪梨油、杏仁油、橄攬油、胡麻油、紅花油、大豆油 、茶油、杏仁油、茛麻油、綿花油等植物油（常溫爲液體 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -42- 1312369 A7 B7 五、發明説明（4〇 ) )，可可油、椰子油、棕櫚油、木蠟油等植物油（常溫爲 固體）、貂油、卵黃油、龜油等動物油。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明中可利用之蠟類有例如荷荷巴油、巴西棕櫚蠟 、小燭樹蠟等植物蠟、抹香鯨油、槌鯨油、蜜蠟、鯨蠟、 棉羊油等動物性蠟、褐煤蠟等礦物性蠟。 本發明中可利用之碳化氫類係例如石蠟（另名爲「固 體石蠟」）、流動性石蠟、蠟狀菌素、微晶石蠟、凡士林 等礦物性碳化氫、三十碳烷、三十碳六烯等動物起源之碳 化氫。 本發明中可利用之脂肪酸有例如月桂酸、肉豆蔻酸、 棕櫚酸、硬脂酸、油酸、山窬酸、十一烯酸、羊毛脂肪酸 、硬質羊毛脂肪酸、軟質羊毛脂肪酸、異硬脂酸以及此等 化合物之衍生物。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本發明中可利用之醇類有例如月桂醇、鯨蠟醇、鯨蠟 硬脂醇、硬脂醇、油醇、山嵛醇、羊毛脂醇、氫化羊毛脂 醇、十六烷醇、十八烷醇、聚乙二醇等高級醇類（含多元 醇）、乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇、乙二醇、丙二醇 '甘 油等低級醇（包含多元醇）以及此等化合物之衍生物。 本發明中可利用之酯類有例如月桂酸己酯、肉豆蔻酸 異丙酯、肉豆蔻酸十四烷酯、肉豆蔻酸十六烷酯、肉豆蔻 酸十八烷酯、棕櫚酸異丙酯、硬脂酸丁酯、硬脂酸膽甾酯 、乙酸膽甾酯、正丁酸膽笛酯、己酸膽甾酯、月桂醚膽甾 酯、肉豆蔻酸膽甾酯、棕櫚酸膽甾酯、硬脂酸膽甾酯、 1 2 -羥基硬脂酸膽甾酯、油酸癸酯、油酸十八烷酯、羊 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -43- 1312369 A7 B7 五、發明説明（41 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 毛脂肪酸異丙酯、三肉豆蔻酸甘油酯、二油酸丙二醇酯、 乳酸十四烷酯、乳酸十六烷酯、乙酸羊毛脂酯、二甲基辛 烷酸十六烷酯以及此等化合物之衍生物。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本發明中可利用之界面活性劑有例如月桂酸鋅、肉豆 蔻酸鋅、棕櫚酸鋅、硬脂酸鎂、月桂基硫酸鈉、月桂基硫 酸三乙醇胺、十六烷基硫酸鈉、聚氧化乙烯月桂醚硫酸鈉 、聚氧化乙烯月桂醚硫酸三乙醇胺、聚氧化乙烯十六烷醚 磷酸、聚氧化乙烯烷基苯醚磷酸、月桂醯基肌胺酸鈉、椰 子油脂肪酸肌胺酸三乙醇胺、椰子油脂肪酸甲基牛磺酸鈉 、大豆磷脂質等陰離子性界面活性劑、氯化硬脂基三甲銨 、氯化一硬脂基一甲鏡、氯化爷院錢、氯化十六院基D比淀 、溴化烷基異喹啉鏺鹽' 溴化十二烷基二甲基2 —苯氧基 乙銨等陽離子性界面活性劑、/3 -月桂胺基丙酸鈉、月桂 基二甲基胺乙酸甜菜鹼。2 -烷基—N -羧甲基一 N -羥 乙基咪唑鏺基甜菜鹼等兩離子性界面活性劑、自行乳化型 一硬脂酸甘油、親油型一硬脂酸甘油、二油酸丙二醇、一 月桂酸山梨聚糖、一油酸山梨聚糖、蔗糖脂肪酸酯、十一 碳烯酸一乙醇醯胺、椰子油二乙醇醯胺、一油酸聚乙二醇 、乳酸十四烷酯、乳酸十六烷酯、聚氧化乙烯十六烷醚、 聚氧化乙烯辛苯醚、一月桂酸聚氧化乙烯山梨糖醇、一月 桂酸聚氧化乙烯山梨聚糖、一硬脂酸聚氧化乙烯山梨聚糖 、三油酸聚氧化乙烯山梨聚糖、四油酸聚氧化乙烯山梨聚 糖、聚氧化乙烯篦麻油、聚氧化乙烯硬化箆麻油等非離子 性界面活性劑，或以上化合物之衍生物。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）_~' -44 - 1312369 Α7 Β7 五、發明説明（42 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明中可利用之色素有莧菜紅、赤蘚紅、孟加拉玫 瑰紅、酸性紅' 色澱紅C、來蘇紅、若圓明、亮色澱紅、 曙紅Y S、ViolaminR、亮堅牢猩紅、麗春R等紅色焦油系 色素、二溴螢光黃 '永久橙、赤蘚黃NA、橙1等橙色焦 油系色素、酒石黃、晚霞黃、螢光素鈉、聯苯胺黃G、萘 酚黃S、黃- AB等黃色焦油系色素、堅牢綠FCF、茜 素花青綠F、耐曬綠S F黃、萘酚綠B等綠色焦油系色素 、亮藍FCF、館胭脂、截藍、專利藍NA、Carbathren Blue、蘇丹藍等藍色焦油系色素、間苯二酚褐色等褐色焦油 系色素、Arizulin紫、Arizulol紫等紫色焦油系色素、萘酚 藍黑等黑色焦油系色素、氧化鋅、氧化欽、氫氧化銘、氫 氧化鋁、滑石、高嶺土、雲母、膨潤土、錳紫、雲母鈦等 無機顏料、Θ -胡蘿蔔素、番茄紅素、藏花素等類胡蘿蔔 系色素、紫蘇苷、黃樟素、維生素A、槲皮酮等類黃酮系 色素、核黃素等吖啶黃系色素、胭脂紅、茜素、紫草素等 喹酮系色素或以上化合物之衍生物。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 可被利用於皮膚外用或化粧品用之香料係大體上有天 然香料之動物性香料及植物性香料以外，還有合成香料及 適當配合此等的調合香料β本發明中可利用之動物性香料 有麝香 '靈貓香、海猫香、龍涎香等。植物性香料有例如 自洋茴香果實 '羅勒之葉、藏茴香果實、肉桂樹皮、完荽 種子、薰衣草花 '肉豆蔻種子、薄荷葉、薔薇花、迷迭香 花種子或葉、百里香葉等經由水蒸汽蒸餾等所得萃取物（ 精油類）、風信子花、茉莉花、含羞草化、薔薇花、香草 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -45- 1312369 Α7 Β7 五、發明説明（43) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 種子等所得萃取物（通常依其性質、製法而被分類爲無水 類、樹脂類、油樹脂類、酊類）等。合成香料有苯乙酮、 茴香腦、苯甲醇、乙酸丁酯、樟腦、柑醛 '香茅醇、枯醛 、愛草腦、乙香草醛、乙酸香葉酯、沈香醇、薄荷醇、甲 基對甲酚、水楊酸甲酯、乙酸苯酯、香草醛以及此等化合 物之衍生物。又，本發明中還可以適當地調配上述香料成 爲調合香料利用。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本發明中可利用之荷爾蒙類有例如雌嗣、雌二醇等卵 胞荷爾蒙類、黃體酮、孕烯醇酮等黃體荷爾蒙類、可地松 、氫化可地松、去氫可的松、氫化潑尼松等副腎皮質荷爾 蒙類、維生素類之例如視黃醇、視黃酸、α -，石一及r -胡蘿蔔素、此等之衍生物等維生素A之化合物、硫胺（ 維生素B 1 )、核黃素（維生素B 2 )、吡哆辛、吡哆醛' 吡哆胺（以上均爲維生素B 6 )，此等之衍生物等屬維生素 B之化合物、L 一抗壞血酸或2 — ◦ — α - D -糖基一 L -抗壞血酸爲主之糖基- L -抗壞血酸、L -抗壞血酸或 糖基- L -抗壞血酸之醯基化衍生物（別名「脂溶性維生 素C」）、L -抗壞血酸硫酸酯等其他之L -抗壞血酸衍 生物等屬於維生素C之化合物、骨化醇、膽骨化醇，此等 之衍生物的屬維生素D之化合物、α —，/3 —、r 一及5 一生育酚、，/3 -、γ —及生育三嫌酣，此等之 衍生物等維生素Ε所屬化合物。 本發明中可被利用之植物萃取物係除上述香料可利用 之植物萃取物以外，例如有洋甘菊萃取物、鼠尾草萃取物 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -46- 1312369 A7 B7 五、發明説明（44) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、蘆會萃取物、洋蘇草萃取物、鹼草萃取物、酪梨萃取物 、尋麻萃取物、茴香萃取物 '鳥龍茶萃取物 '黃柏萃取物 、大麥萃取物 '秋葵萃取物、菖莆萃取物、海藻萃取物、 木桃萃取物、甘草萃取物、榲梓種小萃取物、椐子萃取物 、維奇氏箬竹萃取物、桂皮萃取物、紅茶萃取物、米糠萃 取物、甜菊萃取物、芹菜萃取物、當藥萃取物、大豆萃取 物、百里香萃取物、茶萃取物、茶花萃取物、當歸萃取物 '玉米萃取物 '紅蘿蔔萃取物、玫瑰萃取物、檜木萃取物 、菜瓜萃取物、紅花萃取物、松萃取物、桃萃取物、油加 利萃取物、虎耳草萃取物、蟹橙萃取物、百合萃取物、意 孩仁萃取物、艾草萃取物、藍藻萃取物、海藻萃取物、蘋 果萃取物、荔枝萃取物、生菜萃取物，還有扁柏酚、莫、 葉綠素、甘草素等自植物之單離化合物等。本發明中可利 用之動物萃取物，有例如胎盤萃取物。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本發明中可利用之微生物萃取物，有例如酵母萃取物 °該皮膚外用組成物中鹽類可以用皮膚外用通常容許使用 之鹽類’除此外，海水、海洋深層水、海水乾燥物、礦泉 鹽等天然鹽（包含溶液）亦可以有利地利用。 本發明可利用之紫外線吸收劑有例如對胺基苯甲酸乙 酯、對二甲胺基苯甲酸乙基己酯、對甲氧肉桂酸乙氧乙酯 、對甲氧肉桂酸乙基己酯、2— (2 —羥基一 5 —甲苯基 )苯并三唑、羥苯甲酮、尿刊酸、尿刊酸乙酯以及此等化 合物之衍生物，除此外還可爲5 -尿嘧啶、鳥嘌呤、胞嘧 啶等具有紫外線遮蔽能力之有機物質，感光色素有例如碘 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -47 - 1312369 A7 B7 五、發明説明（45) 化 2，2 ' —〔3 一一〔2— (3 —庚基-4 一甲基-2 -亞噻唑啉一 2 -基）亞乙基〕伸丙烯基〕雙〔3 -庚基 —4 一甲基〕噻唑啉鑷鹽（別名：Platonin )、碘化2 -〔 2— ( 3 —庚基一 4 一甲基—2 —亞噻唑啉一 2 -基）次 甲基〕—3 —庚基—4 一甲基噻唾啉鎗鹽（別名·· Pionin) 、碘化6 -〔2 —〔（5 -溴一 2 -吡啶基）胺基〕乙烯 基〕一1 一乙基—2 —甲基吡啶（別名：Takanale ) '碘化 2 -（2 —苯胺基乙煉基）一 3 ，4 一二甲基一卩惡哩琳鐵 鹽（別名：Luminexis )以及此等化合物之衍生物。 本發明中可利用之抗氧化劑係上述所舉成份中具有抗 氧化作用者，除此外還可爲沒食子酸丙酯、沒食子酸丁酯 、沒食子酸辛酯、沒食子酸十二烷酯、降二氫愈瘡木酸（ 別名：NDGA) 、丁羥基苯甲醚（別名：BHA)、二 丁羥基甲苯（別名：BHT) 、4一羥甲基1_2 ，6 -二第三丁酚以及此等化合物之衍生物。 本發明中可利用之防腐、殺菌劑係已述成份中具防腐 、殺菌作用者，除此外還有酚、對氯間甲酚、間苯二酚、 對羥基苯甲酸酯、甲酚等之酚類、苯甲酸、山梨酸、水楊 酸、硼酸等酸類（均可包含鹽之形態）、六氯紛、雙二氯 酚硫醚 '雙氯酚等鹵化雙酚類、3 ，4，4 —三氯二苯脲 、十一烯酸-乙醇醯胺等醯胺類、氯苯甲烷胺、氯化苯甲 乙氧胺 '克菌定等四級銨化合物，其他還可爲雙氯苯雙胍 己烷、1 -羥基吡啶基- 2 -硫酮、氯化溶菌酶，或以上 化合物之衍生物。 本紙張尺度適用中.國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） "' -48- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1312369 A7 ___B7 五、發明説明（46 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明中可利用之制汗、除臭劑可爲氯化銘、氯化鋅 '氯化羥基鋁、尿囊素氯化羥基鋁、尿囊素二羥基鋁、水 合氯鋁類等，淸涼劑有例如薄荷醇、薄荷油、樟腦、百里 香酚、花菊醇、水楊酸甲酯等、鉗合劑有例如乙二胺四乙 酸衍生物、三聚磷酸、六間克林酸、二氫化乙基甘胺酸、 檸檬酸、酒石酸、葡萄糖酸、糖酸。 本發明中可利用之美白劑除上述成份中具有美白作用 者以外，可爲例反義低聚核苷酸（例如對酪胺酸酶基因之 反義低聚核苷酸）等核酸、麯酸、乳酸、胺茴酸、香豆素 、苯并三唑、咪唑啉、嘧啶、二噁烷、呋喃、吡喃酮、蘇 酸酸、熊果甙、黃芩甙、黃芩元甙、及黃蓮素以及此等化 合物之衍生物、黑色素生成抑制劑、酪胺酸酶生成抑制劑 、酪胺酸酶阻斷劑。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本發明中可利用之消炎劑係已述之成份中具消炎作用 者，除此外還可爲尿囊素、尿囊素乙醯基- D L -甲硫胺 酸、尿囊素/3 -甘草亭酸、魚石脂、吲哚美辛、乙醯基水 楊酸、鹽酸苯海拉明、愈創木莫、菊葜順丁烯二酸氯苯那 敏、苯草酸、甘草亭酸、紫草萃取物等、酵素可爲枯草菌 、放線菌、酵母等微生物、或植物、動物由來之蛋白酶、 脂酶溶菌酶等。 本發明中可利用之糖質有蔗糖、麥芽糖、果糖、乳糖 、海藻糖等寡糖類、環糊精類等環狀四糖以外之環狀糖類 、麥芽糖醇、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、阿拉伯糖醇等 糖醇類、透明質酸、軟骨素硫酸、支鏈澱粉、澱粉、葡聚 本k張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X297公釐） -49- 1312369 A7 B7 五、發明説明（47 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 糖、果膠、鹿角菜、古柯膠、糖膏、阿拉伯膠、黃耆膠' 漢生膠、幾丁質等多糖類以及此等之衍生物或部份分解物 、胺基酸有甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸 、胱胺酸、天冬醯胺麩、胺醯胺、吡略烷酮羧酸、羥基脯 胺酸、哌可啉、肌胺酸、高半胱胺酸、高絲胺酸、瓜胺酸 、天冬胺酸、麩胺酸、半胱亞磺酸、精胺琥珀酸、精胺酸 、賴胺酸、組織胺酸、鳥胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸 、異白胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、脯胺酸、/3 -丙胺酸、牛磺酸、/3 -胺基丁酸、7 -胺基丁酸或以上 化合物之鹽。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本發明中可利用之增粘劑有已述成份中具有增粘作用 者，除此外還可爲榲梓種子、藻朊酸鈉、陽離子化纖維素 、羥乙基纖維素、羧甲基纖維素、羧甲基澱粉、藻朊酸丙 二醇、膠原、角朊、酪朊、白蛋白、明膠、羥丙基三甲基 銨氯醚、聚乙烯醚、聚乙烯吡咯烷酮-聚乙烯吡咯烷酮-乙酸乙烯酯共聚物、聚乙亞胺、聚丙烯酸鈉、聚乙烯甲醚 、羧乙烯基聚合物等水溶性高分子、氯化鈉、氯化鉀、硫 酸鈉等電解質，除此外可爲各種油分等。 另外，以上所例示中，可以成爲鹽之形態的成份雖無 全部例示其鹽之形態，但只要爲可容許做爲皮膚外用劑者 ，即使爲所例示以外之鹽亦可適當地利用於本發明。 如上述之各種組成物中含環狀四糖，或含其之糖質的 方法係在該製品完成前的步驟中使其含有即可，例如可適 當地選擇混溶、混揑、溶解、熔解 '浸漬、滲透、撒佈、 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Μ規格（210X297公釐） -50- 1312369 A7 B7_ 五、發明説明（48 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 塗佈、被覆、噴霧、注入、晶析、固化等公知之方法。爲 有其量係，含有〇 . 1%以上，較佳爲以上之爲宜。 以下以實驗更詳細地說明本發明。 實驗1 自培養物調製非還原性環狀糖質 在5 0 0 J容積之三角形燒瓶中放入1 0 0 4由5 W / v %澱粉部份分解物（商品名「Paindex #1」松谷化學公 司製造）、：I . 5w/v%酵母萃取物（商品名：
Asahimist，Asahi 啤酒公司製造），〇 . lw/v% 磷酸二 鉀、0 . 06w/v%磷酸一鈉· 12 水鹽、0 . 〇5w / v %硫酸鎂· 7水鹽及水所成培養基，以1 2 1 t熱壓 器殺菌2 0分鐘，冷卻後接種圓孢芽孢桿菌C 9 ( 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 FERM BP — 7143)，於 27°C、23〇rpm 旋轉振盪培養4 8小時後，經離心分離除去菌體，得培養 澄淸液。再以1 2 0 °C熱壓器熱1 5分鐘該培養上澄液， 放冷後，離心分離並除去不溶物，回收上澄液。 使用正丁醇、吡啶與水之混合液（容量比6 : 4 : 1 )做爲展開溶媒，使用鋁板「Kieselgel 60 ( 2 Ο X 2 0 c m，墨克公司製）做爲薄層板，爲調查所得上澄液中之 糖質進行展開二次之矽膠薄層層析（以下簡稱爲T L C ) ，分離上澄液中之糖質。檢測法係以硫酸一甲醇法使分離 之全糖質著色，另以二苯胺一苯胺法著色還原糖質，調查 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -51 - 1312369 A7 B7 五、發明説明（49 ) 後檢測出其R f値爲約〇 . 3 1之位置，硫酸-甲醇法中 爲陽性’且二苯胺一苯胺法爲陰性之非還原性糖質。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 將約9 0 J上澄液調製爲4 5 °C、p Η 5 · 0後，對 每1 g固體物添加1 5 0 0單位α -配糖酶（商品名「轉 葡糖苷酶L Amano、天野製藥製造」與每1 g固體物添加 7 5單位葡糖澱粉酶（Nagase生化學工業公司販售），處 理2 4小時’繼而以氫氧化鈉調整爲ρ η 1 2，煮沸2小 時，分解殘存之還原糖。過濾，除去不溶物後，使用離子 交換樹脂「DiaionPK218」與「Diaion WA3 0」（三菱 化學公司製）脫色、脫鹽，再以陽離子交換樹脂 「DIAION SK—1B」（三菱化學公司製）與陰 離子交換樹脂「I R A 4 1 1」（Organo公司製）再次 脫鹽、以活性碳脫色精密週濾後，以蒸發器濃縮，真空凍 結乾燥，得約0 . 6 g之糖質粉末。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 以高速液體層析法（以下稱爲Η P L C )調查所得糖 質之組成，結果如圖1所示，在1 〇 . 8 4分鐘溶離時間 檢測出單一巔値。獲知此糖質之純度係極高之9 9 . 9 % 以上。又，HPLC係用「Shodex KS-801管柱」（昭和電 工公司製造），於6 0°C管柱內溫度，水流速爲0.5J /分鐘，檢測係用示差折射計「R 1 - 8 0 1 2」（東曹 公司製）進行。 又’以Somogyi-Nelson索默季一納森測糖法測定其還 原力時’其還原力係在檢測界限以下，可知此標品係實質 上爲非還原性糖質。 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210X297公釐） -52- 1312369 A7 B7 五、發明説明（5〇 ) 實驗2 非還原性糖質之構造解析 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 以咼速原子衝擊法質量分析（通稱爲FA B - MS ) 實驗1之方法所得非還原性糖質，結果顯著地檢測出質量 數6 4 9之質子附加分子離子，獲知本糖質之質量數係 6 4 8 〇 又，依常法使用硫酸水解，以氣體層析法調查構成糖 ，結果只檢測出ϋ -葡萄糖，所以獲知本糖質之構成糖係 D -葡萄糖。考慮質量數時獲知本糖質係由4分子d -葡 萄糖所成環狀糖質。 另外，以核磁共振法（以下稱爲N M R )測本糖質時 得圖2所示1 H — NMR譜，圖3所示13C-NMR譜， 以此質譜與已知糖質相比較其異同，獲悉其與European
Journal of Biochemistry，641 〜648 頁（1994 年） 記載之非還原性環狀糖質環{θ6}-α-D-吡喃葡糖 基一（1^3) - D -吡喃葡糖基 一（1 — 6) —α 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 —D —吡喃葡糖基—（1 — 3) - α — D -吡喃葡糖基一 (I — )的光譜一致，獲知本糖質之構造爲如圖4所示環 狀四糖，即，環{ — 6丨一 α — D-吡喃葡糖基一（1 — 3) —a— D —吡喃葡糖基—（1^6) - α—D —吡喃 葡糖基一（1->3) - α - D -批喃葡糖基一（1—丨。 貫驗d 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -53- 1312369 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明说明（51 ) 自圓孢芽孢桿菌C 9生產α -異麥芽糖基葡糖質生成酶 在5 Ο 0,η£容積之三角形燒瓶中放入1 0 〇m£ 4 . 0 w / v %澱粉部份分解物（商品名：Paindex#4 )松 谷化學公司製造，1 . 8w/v%酵母萃取物（商品名： Asahimist，Asahi 啤酒公司製造），0 _ lw/v% 磷酸二 鉀、0 . 06w/v%磷酸一鈉· 12 水鹽、0 · 05w / v %硫酸鎂· 7水鹽及水所成培養基，以1 2 1 °C熱壓 器殺菌2 0分鐘，冷卻後接種圓孢芽孢桿菌C 9 ( F E R Μ BP — 7143)，於 27°C、23〇rpm 旋轉振盪培養4 8小時後，得種培養液。 在3 0 <容量之發酵器中放入與種培養時一樣組成之 培養基約2 0 <，加熱殺菌，冷卻後接種1 v / v %種培 養液，保持於溫度27°C、pH6 · 0〜8 · 0 ，通氣攪 拌培養4 8小時。培養後之培養液中，本發明α -異麥芽 糖葡糖質生成酶的酶活性係約0 . 4 5單位/ ，、α - 異麥芽糖基轉移酶之活性係約1 . 5單位/W，經離心分 離（10，000rpm，30分鐘）回收之約18《上 澄液之α -異麥芽糖基葡糖質生成酶係〇 . 4 5單位 之活性（總活性約8，1 1 0單位）、α -異麥芽糖基轉 移酶係約1 · 5單位/J之活性（總活性約2 6，9 0 0 單位、環狀四糖生成活性係約〇 . 9 5單位/i (總活性 約1 7，1 0 0單位）。 又，酶活性係如下測定者。即，本發明之α -異麥芽 糖基葡糖質生成酶之酶活性的測定係溶解麥芽糖三醇於 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） ' -54- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝_ 訂 1312369 A7 B7 五、發明説明（52) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) lOOmM乙酸緩衝液（PH6 . 0)使其爲2w/v% ，做爲基質溶液。在0 . 5 2該基質溶液中加入0 . 5 d 酶溶液，於3 5 °C進行6 0分鐘之酶反應。煮沸該反應液 1 0分鐘，停止反應後，以實驗1記載之Η P L C法定量 其反應液主要生成之異麥芽糖基麥芽糖與麥芽糖中之該麥 芽糖量。α -異麥芽糖基葡糖質生成酶之活性1單位係做 爲上述條件1分鐘生成1微莫耳之麥芽糖的酶量者。本說 明書中的α -異麥芽糖基葡糖質生成酶之酶活性均爲指以 如上述所測定之單位者。 又，α -異麥芽糖基轉移酶之酶活性的測定係將人參 三糖下溶解於lOOmM乙酸緩衝液（ρΗ6 . 0)使其 爲2w/v%，做爲基質溶液。在0.5W該基質溶液中 加入0 . 52酶溶液，於35 °C進行30分鐘之酶反應。 煮沸該反應液1 0分鐘，停止反應後，以葡萄糖氧化酶定 量該反應液主要生成之環狀四糖與葡萄糖中之莆萄糖量。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1單位α -異麥芽糖基轉移酶之酶活性係以上述條件下1 分鐘內生成之1 #莫耳葡萄糖的酶量來表示。本說明書中 的α -異麥芽糖基轉移酶之酶活性均爲指以如上述所測定 之單位者。 環狀四糖生成活性之測定係使澱粉部份分解物（商品 名Paindex #100、松谷化學公司製）溶解於5 〇mM乙酸緩 衝液（pH6 . 0)成爲濃度2w/v%，做爲基質液， 在0 . 5m£基質液中加入0 _ 54酶液，於3 5°C酶反應 6 0分鐘，於1 0 〇°C熱處理1 〇分鐘該反應液’停止反 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -55- 1312369 Α7 Β7 五、發明説明（53 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 應液後，再加入1含有7 0單位/ ,„£ α -配糖酶（商 品名「Tnansglucosidase L· Amano」、天野製造製造）與 2 7單位葡糖澱粉酶（長瀨生化學工業公司販賣）之 50mM乙酸緩衝液（ph5_0)，於50 〇C處理60 分鐘’於1 0 0 °C熱處理1 〇分鐘該液，失活酵素後，依 實驗1記載之HP LC法定量環狀四糖量。1單位環狀四 糖生成活性係以上述條件下1分鐘生成1 #莫耳環狀四糖 之酶量來表示。此說明書中，環狀四糖生成活性係指如上 述所測定之活性（單位）者。 實驗4 調製圓孢芽孢桿菌C9由來之酶 實驗4-1 精製圓孢芽孢桿菌C9由來之酶 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 以8 0 %飽和硫銨液鹽析約1 8 <實驗3所得培養上 澄液，於4 °C放置2 4小時後，離心分離（1 0 〇 〇 〇 r p m，3 0分鐘）該鹽析沈澱物並回收，溶解於1 〇 m Μ磷酸緩衝液（p Η 7 . 5 )後對該緩衝液透析，得約 4 0 0 2粗酶液。此粗酶液係具有8 1 1 0單位本發明之 α-異麥芽糖基葡糖質生成酶活性與24, 7〇〇單位之 a -異麥芽糖基轉移酶活性、與約1 5 , 6 0 0單位之環 狀四糖生成活性。以使用Sepabeads FP-DA13凝膠（三菱化 學公司製）的離子交換管柱層析（凝膠容量1 〇 〇 〇d) 處理此粗酶液。這時本發明之α -異麥芽糖基葡糖質生成 酶、α -異麥芽糖基轉移酶及環狀四糖。均不會被 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -56- 1312369 年 & 月 繁正'補充 Α7 Β7 五、發明説明（54) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
Sepabeads FP-DA13凝膠吸附，溶離爲非吸附餾份。以含 1M硫銨之1 OmM磷酸緩衝液（pH7 . 0)透析此酶 液’離心分離此透析液，除去不溶物，以使用Sephacrye HR S-200 凝膠（Amasham . Pharmacia · Biotech 公司製）之 親和性管柱層析（凝膠量5 0 0 2 )處理。此酶活性成份 係會吸附於Sephacryl HR S-200凝膠，以1M〜0M硫銨之 直線梯度，繼而以0 m Μ至1 〇 〇 m Μ麥芽四糖之直線梯 度溶離時，本發明之α -異麥芽糖基葡糖質生成酶與α -異麥芽糖基轉移酶係分離後溶離、α -異麥芽糖基轉移酶 活性係在硫銨之直線梯度的其濃度爲約〇 Μ附近溶離，本 發明之α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性係在麥芽四糖之 直線梯度的其濃度爲約3 0 m Μ附近溶離。在此分別收集 α -異麥芽糖基轉移酶活性餾份與本發明之α -異麥芽糖 基葡糖質生成酶活性餾份並回收。又，環狀四糖生成活性 係在此管柱層析之任一餹份均未見到，又，混合α -異麥 芽糖基葡糖質生成酶餾份與α -異麥芽糖基轉移酶餾份之 酶液係獲知示有環狀四糖生成活性，由澱粉部份分解物生 成環狀四糖之活性係獲知藉由α -異麥芽糖基轉移酶與α -異麥芽糖基葡糖質生成酶之兩種酶活性的共同作用而得 以發揮。 以下分別敘述本發明之α -異麥芽糖基葡糖質生成酶 與α -異麥芽糖基轉移酶的精製方法。 實驗4-2 α-異麥芽糖基葡糖質生成酶的精製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） -57- 1312369 A7 _B7 五、發明説明（55 ) 以含1 Μ硫銨之，1 〇 m Μ磷酸緩衝液（ρ η 7 . 0 ) 透析實驗4 一 1所得本發明之α -異麥芽糖基葡糖質生成 酶餾份，離心分離此透析液除不溶物，以使用東曹公司製 Butyl-Toyopearl 650Μ凝膠疏水層析（凝膠量3 5 ◦ J)處 理。此酶會吸附於Butyl-Toyopearl 650M凝膝，於硫錢1 Μ 至0 Μ之直線梯度溶離之結果，在硫銨濃度約〇 . 3 Μ附 近吸附之酶會溶離出，收集示有此酶活性之餾份並回收。 再以含1Μ硫銨之l〇mM磷酸緩衝液（ΡΗ7.〇)透 析此回收液，離心分離此透析液，除去不溶物，以使用 Sephacryl HR S-200凝膠之親和性層析精製。將此精製之各 步驟中α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性量，比活性，收 率示於表1。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 表 1 步驟 α -異麥芽糖基葡糖質 生成酶活性量 (單位） α -異麥芽糖基葡糖質 生成酶比活性 (單位/mg蛋白） 收率 (%) 培養上澄液 8,100 0.12 100 硫銨鹽析後之透析液 74,50 0.56 91.9 離子交換管柱溶離液 5,850 1.03 72.2 親和性管柱溶離液 4,040 8.72 49.8 疏水管柱溶離液 3,070 10.6 37.8 親和性管柱溶離液 L ----_ 1,870 13.6 23.1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) Μ規格（21GX297公褒） -58- 1312369 A 7 B7 五、發明説明（56) 以含有7 . 5w/v%v%濃度之聚丙烯醯胺的凝膠 電泳檢定精製α -異麥芽糖基葡糖質生成酶標品的酶標品 純度，結果蛋白帶係單一者，且純度高之標品。 實驗4-3 α-異麥芽糖基轉移酶之精製 以含1Μ硫銨磷酸緩衝液（ρΗ7 . 〇)透析實驗4 - 1記載之藉由親和性層析與α -異麥芽糖基葡糖質生成 酶餾份分離之α -異麥芽糖基轉移酶餾份、離心分離此透 析液、除不溶物，以使用東曹公司製Butyl-Toyopearl 650Μ 凝膠疏水層析（凝膠量3 5 02)處理。此酶會吸附於 Butyl-Toyopearl 65 0M凝膠，於硫銨1 Μ至〇 Μ之直線梯度 溶離之結果，在硫銨濃度約〇.3Μ附近吸附之酶會溶離 出，收集示有此酶活性之餾份並回收。再以含1 Μ硫銨之 1 0 m Μ磷酸緩衝液（ρ Η 7 . 0 )透析此回收液，離心 分離此透析液，除去不溶物，以使用Sephacryl HR S-200凝 膠之親和性層析精製。將此精製之各步驟中α 一異麥芽糖 基轉移酶活性量，比活性，收率示於表2。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -59- 1312369¾¾ ^ A7 B7 五、發明説明（57 表 9 -— α -異麥芽糖基轉移 酶活性量(單位） α-異麥芽糖基轉移酶比 活性(單位/mg蛋白） 收率 (%) 澄液 26,900 0.41 100 析後之透析液 24,700 1.85 91.8 換管柱溶離液 19,400 3.41 72.1 管柱溶離液 13,400 18.6 49.8 柱溶離液 10,000 21.3 37.2 親和性管柱溶離液 6,460 26.9 24.0 實驗5 異麥芽糖基葡糖質生成酶及 異麥芽糖 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 基轉移酶的性質> 實驗5-1 α-異麥芽糖基葡糖質生成酶之性質 將實驗4 - 2之方法所得精製α -異麥芽糖基葡糖質 生成酶標品供予SDS - PAGE (凝膠濃度7 . 5w/ v%) ’與同時電泳之分子量標識物（日本Bio-rad .
Lab〇ratrys公司製）比較，測定此酶標品之分子量，結果分 子量係約140，〇〇〇±20，000達爾頓。 又’以含有 / v% Ampholine(Amasham Pharmacia Biotech公司製）之等電點聚丙烯醯胺凝膠電泳法測試精製之 α -異麥牙糖基葡糖質生成酶標品後’測定蛋白帶及凝膠 之ρ Η，求本酵素標品之等電點，結果等電點（ρ丄）係 約 5 . 2 ± 0 . 5 。 依活性測定方法調查對此酶標品之酶活性會影響之溫 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） -60 - 1312369 A7 ____B7 五、發明说明（58 ) 度、p Η。又，溫度之影響係在C a 2 +非存在下與1 mM 存在下測定結果示於圖5 (溫度之影響），圖6 ( p Η影 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 響）。此酶之最適溫度係ΡΗ6 . 0，反應60分鐘爲約 4 〇 °C ’ （ C a 2 + 非存在）、約 4 5 t ( C a 2 + 1 m Μ 存在）、最適PH係35 °C，反應60分鐘爲約6 . 0〜 6 · 5。此酶之溫度安定性係保持酶溶液（2 0 m Μ乙酸 緩衝液，ρΗ6 · 0)於Ca2 +非存在下或ImM存在下 ，各溫度6 0分鐘，水冷後，測定殘存之酶活性以求得。 又，ρ Η安定性係保持酶於5 0 m Μ緩衝液中，於4 °C , 2 4小時後調整P Η爲6 _ 0，測定殘存之酶活性以求得 。結果分別示於圖7 (溫度安定性）與圖8 ( Ρ Η安定性 )。由此等圖可知，此酶的溫度安定係性係約3 5 °C爲止 (Ca2 +非存在）、約40°C爲止（Ca2+ ImM存在 )，又，之安定pH區域係約4 · 0〜約9 _ 0。 依濃度1 m Μ之各種金屬鹽存在下測定活性之方法調 查金屬離子對此酶活性之影響，結果示於表3。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4规格（210Χ297公釐） -61 - 11 13 2369 :¾. A7 B7 五、發明説明（59 表 3 由表3之結果可知，本發明酶之活性係在H g 2 +、 C u2 +、EDTA被顯著地阻斷，在B a 2 +、_s r 2 +亦 被阻斷。又獲知在C a 2 +會被活性化。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 金屬離子 相對活性（％) 金屬離子 相對活性（％) 不添加 100 Hg2 + 4 Zn2 + 92 Ba2 + 65 Mg2 + 100 Sr2 + 80 Ca2 + 115 Pb2 + 103 Co2 + 100 Fe2 + 98 Cu2 + 15 Fe3 + 97 Ni2 + 98 Mn2 + 111 Al3 + 99 EDTA 20 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 使用蛋白質序列儀（Model 473A, Aplid Biosystem公司 製造）分析此酶之N末端胺基酸序列，結果獲知具有序列 表中序列表1所示胺基酸序列酪胺酸-纈胺酸一絲胺酸一 絲胺酸_白胺酸-甘胺酸-天冬醯胺-白胺酸一異白胺酸 之N末端胺基酸序列者。 實驗5 - 2 α -異麥芽糖基轉移酶之性質 _將實驗4 - 2之方法所得精製α -異麥芽糖基轉移酶 標品供予SDS — PAGE (凝膠濃度7 . 5w/v%) -62 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0X297公釐） 1312369 Α7 Β7 五、發明説明（6〇 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ’與同時電泳之分子量標識物（日本Bio-rad . Laboratrys 公司製）比較，測定此酶標品之分子量，結果分子量係約 112, 〇00±2〇， 000 達爾頓。 又’以含有 2w / v% Ampholine(Amasham Phamacia Biotech公司製）之等電點聚丙烯醯胺凝膠電泳法測試上述精 製之-異麥芽糖基轉移酶標品後，測定凝膠中之蛋白帶 及凝膠之pH，求本酵素之等電點，結果等電點（p 1 ) 係約 5 . 5 ± ◦ . 5 。 依活性測定方法調查對此酶標品之酶活性會影響之溫 度、pH。結果示於圖9 (溫度之影響），圖10 (pH 影響）。此酶之最適溫度係pH6 . 0，反應30分鐘爲 約45°C，最適pH係3 5°C，反應30分鐘爲約6 . 0 〜6 . 5。此酶之溫度安定性係保持酶溶液（2 〇 m Μ乙 酸緩衝液，ρ Η 6 . 0 )於各溫度6 0分鐘，水冷後，測 定殘存之酶活性以求得。又，ρ Η安定性係保持酶於5 0 m Μ緩衝液中，於4 °C，2 4小時後調整ρ Η爲6 . 0， 測定殘存之酶活性以求得。結果分別示於圖1 1 (溫度安 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 定性）與圖1 2 ( ρ Η安定性）。此酶的安定溫度係性係 約4 0 °C以下，之安定ρ Η區域係約4 . 0〜約9 . 0。 依濃度1 m Μ之各種金屬鹽存在下測定活性之方法調 查金屬離子對此酶活性之影響，結果示於表4。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） -63- 1312369 A7 B7 五、發明説明（61 ) 金屬離子 相對活性（％) 金屬離子 相對法性ί* 、 311 悉加 _100 Hg2 + 1 Zn2 + -------- 88 Ba2 + 10?. Mg2 + 98 Sr2 + 101 Ca2 + 101 Pb2 + 89 Co2 + 103 Fe2 + 96 Cu2 + 57 Fe3 + 105 Ni2 + 102 Mn2 + 106 Al3 + 103 EDTA 104 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝· 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 由表4之結果可知’本發明酶之活性係在H g 2 +被顯 著地阻斷，在C U 2 +亦被阻斷。又獲知在c a 2 +不會被活 性化，亦不被E D T A阻斷。 使用蛋白質序列儀（Model 473A, Aplid Biosystem公司 製造）分析此酶之N末端胺基酸序列，結果獲知n末端胺 基酸序列係以序列表2表示，具有異白胺酸-天冬胺酸-甘胺酸-纈胺酸-酪胺酸-組織胺酸-丙胺酸一脯胺酸-天冬醯胺-甘胺酸所示胺基酸序列者。 實驗6 自圓孢芽孢桿菌C11生產α-異麥芽糖基葡糖質生成酶 在5 0 OmC容積之三角形燒瓶中放入1 〇 〇^£由 本纸張尺度適用中.國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -64 - 13 12369;赏止丨 0 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（） 62 4 . 0 w / v %澱粉部份分解物（商品名：Paindex#4) ’
1 . 8 w / v %酵母萃取物（商品名：Asahimist，Asahi啤 酒公司製造），0 · lw/v%磷酸二鉀、0 . 06w/ v%磷酸—鈉· 12水鹽、0 · 05w/v%硫酸鎂· 7 水鹽及水所成培養基，以1 2 1 °C熱壓器殺菌2 0分鐘， 經冷卻後接種圓孢芽孢桿菌C 1 1 ( C C R C 9 10 17 2)，於27°C、23〇rpm旋轉振盪培養 4 8小時後，得種培養液。 在3 0 <容量之發酵器中放入與種培養時一樣組成之 培養基約2 0 <，加熱殺菌，冷卻爲2 7 t後接種1 v / v %種培養液，於2 7 t：保持於p Η 6 . 0〜8 . 0，通 氣攪拌培養4 8小時。培養後之培養液中之此酶的活性係 約0 · 5 5單位/ 、α —異麥芽糖基轉移酶活性係約
1 · 8單位/ -£、環狀四糖生成活性係約1 . 1單位/ J ，測定以離心分離（1 0， 0 0 0 r · p . m ' 3 0分鐘 )回收之上澄液1 8 <的酶活性體，本發明之α -異麥芽 糖基葡糖質生成酶係約〇 · 5 1單位/d的活性（總活性 約9， 180單位/) 、α_異麥芽糖基轉移酶係約 1 . 7單位/4活性（總活性約3 0，0 0 0單位）、環 狀四糖生成活性係1 . 1單位/ m£活性（總活性約 1 9 , 4 ◦ 0 單位）。 實驗7 調製圓孢芽桿菌C 1 1由來之酶 本紙張尺度適用中國國家標準€ CNS ) Ad規格（Μ0〆297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) --------------0------、钉------------------ • 65 - 10 il A7 B7 五、發明説明（63 ) 實驗7_1 精製圓孢芽孢桿菌C11由來之酶 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 以8 0%飽和硫銨液鹽析約1 8 <實驗6所得培養上 澄液’於4 °C放置2 4小時後，離心分離（1 〇 〇 〇 〇 r pm，3 0分鐘）該鹽析沈澱物並回收，溶解於1 〇 mM磷酸緩衝液（pH7 . 5)後，對該緩衝液透析，得 約4162含約28， 000單位之本發明酶活性的粗酶 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 液。藉知此粗酶液中係具有8，4 4 0單位本發明之α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性，約28， 000單位之〇 -異麥芽糖基轉移酶活性，約1 7，7 0 0單位之環狀四 糖生成活性。以使用實驗4 一記載之Sepabeads FP-DA13凝 膠的離子交換管柱層析（凝膠容量1 〇 〇 〇α)處理此粗 酶液’本發明之α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性、α -異麥芽糖基轉移酶活性、環狀四糖生成活性均不會被 Sepabeads FP-DA13凝膠吸附，溶離爲非吸附餾份。以含 1M硫銨之1 〇mM磷酸緩衝液（pH7 · 0 )透析酶餾 份，離心分離此透析液，除去不溶物，以使用Sephacryl HR S-200凝膠之親和性管柱層析（凝膠量5 Ο 〇 J )處理。酶 活性會吸附於Sephacryl HR S· 200凝膠，以1M〜〇M硫銨 之直線梯度，繼而以OmM至1 〇 OmM之麥芽四糖之直 線梯度溶離時，_異麥芽糖基轉移酶與本發明之α -異 麥芽糖基葡糖質生成酶會分離後溶離、α -異麥芽糖基轉 移酶活性係在硫銨之直線梯度的其濃度爲約〇.3 Μ附近溶離 ，本發明之α —異麥芽糖基葡糖質生成酶活性係在麥芽四 糖之直線梯度的其濃度爲約3 0 m Μ附近溶離。在此分別 本紙張尺度適用中.國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0X297公釐） -66- 1312369 A7 B7 五、發明说明（64) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 收集α -異麥芽糖基轉移酶活性餾份與本發明之α -異麥 芽糖基葡糖質生成酶活性餾份並回收。又’與實驗4記載 之C 9株時一樣環狀四糖生成活性係在此管柱層析之任一 餾份均未見到，又，混合所得α -異麥芽糖基轉移酶餾份 與α -異麥芽糖基葡糖質生成酶餾份之酶液係獲知示有環 狀四糖生成活性，由澱粉部份分解物生成環狀四糖之活性 係獲知藉由本發明之α -異麥芽糖基葡糖質生成酶與α -異麥芽糖基轉移酶之兩種酶活性的共同作用而得以發揮。 以下分別敘述本發明之α -異麥芽糖基葡糖質生成酶 與α -異麥芽糖基轉移酶的精製方法。 實驗7-2 α-異麥芽糖基葡糖質生成酶的精製 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 以含1Μ硫銨之l〇mM磷酸緩衝液（ρΗ7 . 0) 透析本發明之α -異麥芽糖基葡糖質生成酶餾份，離心分 離此透析液除不溶物，以使用東曹公司製Butyl-Toyopearl 6 5 0M凝膠疏水層析（凝膠量3 5 0 d )處理。此酶會吸附 於Butyl-Toyopearl 650M凝膠，於硫銨1 Μ至0M之直線梯 度溶離之結果，在硫銨濃度約〇 . 3 Μ附近吸附之酶會溶 離出，收集示有此酶活性之餾份並回收。再以含1 Μ硫銨 之1 OmM磷酸緩衝液（ρΗ7 . 0 )透析此回收液，離 心分離此透析液，除去不溶物，以使用Sephacryl HR S-200 凝膠之親和性層析精製。將此精製之各步驟中a -異麥芽 糖基葡糖質生成酶活性量，比活性，收率示於表5。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -67- 1312369 A7 B7 五、發明説明（65 ) 表 5 步驟 α-異麥芽糖基葡_ 糖質生成酶活性量 (單位） α-異麥芽糖基葡糖質 生成酶比活性 (單位/mg蛋白） 收率 (%) 培養上澄液 9,180 0.14 100 硫銨鹽析後之透析液 8,440 0.60 91.9 離子交換管柱溶離液 6,620 1.08 72.1 親和性管柱溶離液 4,130 8.83 45.0 疏水管柱溶離液 3,310 11.0 36.1 親和性管柱溶離液 2,000 13.4 21.8 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 以含有7.5w/v%v%濃度之聚丙烯醯胺的凝膠 電泳檢定精製α -異麥芽糖基葡糖質生成酶標品的酶標品 純度，結果蛋白帶係單一者，且純度高之標品。_ 實驗7-3 α-異麥芽糖基轉移酶之精製 以含1 Μ硫銨之1 0 m Μ磷酸緩衝液（ρ Η 7 . 0 ) 透析實驗7 - 1記載之藉由親和性層析與α _異麥芽糖基 葡糖質生成酶餾份分離之α -異麥芽糖基轉移酶餾份、離 心分離此透析液、除不溶物，以使用東曹公司製Butyl-Toyopearl 650M凝膠疏水層析（凝膠量3 5 Om£)處理。此 酶會吸附於Butyl-Toyopearl 65 0M凝膠，於硫銨1 Μ至〇 Μ 之直線梯度溶離之結果，在硫銨濃度約0 . 3 Μ附近吸附 之酶會溶離出，收集示有此酶活性之餾份並回收。再以含 1 Μ硫銨之1 0 m Μ磷酸緩衝液（ρ Η 7 . 0 )透析此回 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210'〆297公釐） -68- 1312369 A7 B7 五、發明説明（66 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 收液，離心分離此透析液，除去不溶物，以使用Sephacryl HR S-200凝膠之親和性層析精製。將此精製之各步驟中α -異麥芽糖基轉移酶活性量，比活性，收率示於表6。 表 6 步驟 α —異麥芽糖基轉移_ 酶活性量(單位） 〇： -異麥芽糖基轉移酶 比活性(單位/mg蛋白） 收率 (%) 培養上澄液 30,400 0.45 100 硫銨鹽析後之透析液 28,000 1.98 92.1 離子交換管柱溶離液 21,800 3.56 71.7 親和性管柱溶離液 13,700 21.9 45.1 疏水管柱溶離液 10,300 23.4 33.9 親和性管柱溶離液 5,510 29.6 18.1 實驗8 α-異麥芽糖基葡糖質生成酶及α-異麥芽糖基 轉移酶之性質 實驗8-1 α-異麥芽糖基葡糖質生成酶之性質 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 將實驗7 - 2之方法所得精製α -異麥芽糖基葡糖質 生成酶標品供予SDS - PAGE (凝膠濃度7 . 5w/ v % )，與同時電泳之分子量標識物（日本 Bio-rad · Laboratrys公司製）比較，測定此酶標品之分子量，結果分 子量係約137, 000±20000達爾頓。 又，以含有 2w/v% Ampholine(Amasham Phamacia Biotech公司製）之等電點聚丙烯醯胺凝膠電泳法測試精製之 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -69- 1312369 Α7 Β7 五、發明説明（67) α -異麥芽糖基轉移酶標品泳動後，測定凝膠中之蛋白帶 及凝膠之Ρ Η ’求本酵素標品之等電點，結果等電點（ Ρ 1 )係約 5 · 2 ± 〇 . 5 。 依活性測定方法調查對此酶活性會影響之溫度、ρ Η 。又，溫度之影響係在C a 2 +非存在下與1 m Μ存在下測 定結果示於圖13 (溫度之影響），圖14 (pH影響） 。此酶之最適溫度係pH6 . 0，反應60分鐘爲約 45 °C，（Ca2 +非存在）、約 50°C(Ca2+ ImM 存在）、最適pH係35 °C，反應60分鐘爲約6 . 0。 此酶之溫度安定性係保持酶溶液（2 0 m Μ乙酸緩衝液， ρΗ6 · 0)於Ca2 +非存在下或ImM存在下，各溫度 6 0分鐘，水冷後，測定殘存之酶活性以求得。又，ρ η 安定性係保持酶於5 0 m Μ緩衝液中，於4 °C，2 4小時 後調整Ρ Η爲6 . 0，測定殘存之酶活性以求得。結果分 別示於圖1 5 (溫度安定性）與圖1 6 ( Ρ Η安定性）。 由此等圖可知，此酶的溫度安定係性係約4 0 °C爲止 (Ca2 +非存在）、約45°C爲止（Ca2+ ImM存在 )，又，之安定pH區域係約5 . 0〜約10 . 0。 依濃度1 m Μ之各種金屬鹽存在下測定活性之方法調 查金屬離子對此酶活性之影響，結果示於表7。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1Τ it 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -70- 1312369： 3. 10 is A7 B7 五、發明説明（68 ) 表 7 金屬離子 相對活件（) 金屬離子 相對活忤i%、 不添加 100 Hg2 + 4 Ζη2 + 91 Ba2 + 65 Mg2 + 98 Sr2 + 83 Ca2 + 109 Pb2 + 101 Co2 + 96 Fe2 + 100 Cu2 + 23 Fe3 + 102 Ni2 + 93 Mn2 + 142 Al3 + 100 EDTA 24 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 由表7之結果可知，本發明酶之活性係在η g 2 +、 C u 2 +、E D T A被顯著地阻斷，在B a 2 +、s : 2 +亦 被阻斷。又獲知在C a 2 +、Μ η 2 +會被活性化。 使用蛋白質序列儀（Model 473Α，Aplid Biosystem公司 製造）分析此酶之N末端胺基酸序列，結果獲知具有序列 表中序列表1所示胺基酸序列酪胺酸-纈胺酸一絲胺酸-絲胺酸-白胺酸一甘胺酸-天冬醯胺—白胺酸一異白胺酸 之N末端胺基酸序列者。 比較此N末端胺基酸序列結果與實驗5 - 1之由圓孢 芽孢桿菌C 9由來之a -異麥芽糖基葡糖質生成酶的N末 端序列，獲知其爲相同者，由α -異麥芽糖基葡糖質生成 酶生成酶相同之Ν末端胺基酸序列係被確認爲酪胺酸-纈 胺酸-絲胺酸-絲胺酸一白胺酸-甘胺酸-天冬醯胺-白 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（2丨ΟΧ297公釐） -71 - 1312369 A7 B7 五、發明説明（69) 胺酸-異白胺酸之N末端胺基酸序列。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 實驗8-2 α-異麥芽糖基轉移酶之性質 將實驗7 - 3之方法所得精製α -異麥芽糖基轉移酶 標品供予SDS — PAGE (凝膠濃度7 · 5w/v%) ，與同時電泳之分子量標識物（日本Bio-rad. Laboratrys 公司製）比較，測定此酶標品之分子量，結果分子量係約 102， 000±20000達爾頓。 以含有 2w / v% Ampholine(Amasham Phamacia Biotech公司製）之等電點聚丙烯醯胺凝膠電泳法測試精製之 α -異麥芽糖基轉移酶標品泳動後，測定凝膠中之蛋白帶 及凝膠之Ρ Η，求本酵素標品之等電點，結果等電點（ ρ 1 )係約 5 _ 6 ± 0 . 5。 依活性測定方法調查對此酶標品之酶活性會影響之溫 度、pH。結果不於圖17 (溫度之影響），圖18 ( pH影響）。此酶之最適溫度係PH6 . 0，反應3 0分 鐘爲約5 0°C ’最適pH係3 5°C，反應3 0分鐘爲約 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 5 . 5〜6 · 0。此酶之溫度安定性係保持酶溶液（2 0 mM乙酸緩衝液，ρΗ6 _ 0 )於各溫度6 0分鐘，水冷 後’測定殘存之酶活性以求得。又，ρ Η安定性係保持酶 於5 0 m Μ緩衝液中，於4 °C，2 4小時後調整ρ Η爲 6 . 0，測定殘存之酶活性以求得。結果分別示於圖1 9 (溫度安定性）與圖2 0 ( ρ Η安定性）。由此等圖可知 ，此酶之上述條件下的安定溫度領域係約4 0 °C以下，又 本紙張尺度適财關家標準（^：叫44祕（2獻297公釐） ' -72- 1312369 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 ________B7 五、發明説明（7〇) ’上述條件下之安定p Η區域係約4 . 5〜約9 〇。 依濃度1 m Μ之各種金屬鹽存在下測定活性之方法調 查金屬離子對此酶活性之影響，結果示於表8。 表 8 金屬離子 相對活性（％) 金屬離子 相對活性（％) 不添加 100 Hg2 + 2 Ζη2 + 83 Ba2 + 90 Mg2 + 91 Sr2 + 93 Ca2 + 91 Pb2 + 74 Co2 + 89 Fe2 + 104 Cu2 + 56 Fe3 + 88 Ni2 + 89 Mn2 + 93 Al3 + 89 EDTA 98 由表8之結果可知，此酶之活性係在H g2 +被顯著地 阻斷，在C u 2 +亦被阻斷。又獲知在C a 2 +不會被活性化 ，亦不被E D T A阻斷。 使用蛋白質序列儀（Model 473A，Aplid Biosystem公司 製造）分析此酶之N末端胺基酸序列，結果獲知N末端胺 基酸序列係以序列表3表示，具有異白胺酸-天冬胺酸-甘胺酸-纈胺酸-酪胺酸-組織胺酸-丙胺酸一脯胺酸一 酪胺酸-甘胺酸所示胺基酸序列。將此N末端胺基酸序列 之結果與實驗5 - 2的圓孢芽孢桿菌C 9由來的α -異麥 ^紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 裝 ； 訂 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -73- Ι3123ί
Α7 Β7 五、發明説明（71 ) 芽糖基轉移酶之N末端序列比較時，獲知α -異麥芽糖基 轉移酶具有相同之Ν末端胺基酸序列，其爲序列表中序列 4所示胺基酸序列的異白胺酸-天冬胺酸一甘胺酸一編胺 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 酸-酪肢酸-組織胺酸-丙胺酸-脯胺酸的ν末端胺基酸 序列。 實驗9 ^-異麥芽糖基葡糖質生成酶及^一異麥芽糖基 轉移酶的胺基酸序列 實驗9 - 1 α -異麥芽糖基葡糖質生成酶之內部部份胺 基酸序列 以1 0 m M Tris -鹽酸緩衝液（ΡΗ9 . 0)透析實 驗7 - 2之方法所得一部份之a -異麥芽糖基葡糖質生成 酶標品後，以同緩衝液稀釋使其爲約濃度。在 1 2此試料液中加入1 0 // g胰蛋白酶（和光純藥公司 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 販售），於3 0 °C，反應2 2小時予以肽化。爲單離生成 之肽進行逆相Η P L C。使用microbondapack C18管柱（ 直徑2 . lmmx長度150mm，Waters公司製），以 流速0 . 94/分鐘，室溫下，以〇 · 1%三氟化乙酸— 8%乙腈溶液至0 · 1%三氟化乙酸-4 0%乙腈溶液之 1 2 0分鐘之直線梯度條件進行。自管柱溶離之肽係經測 定波長2 1 0 n m吸光度而檢測出。分離出與其他肽充分 被分離之三個肽〔P 6 4 (保持時間約6 4分鐘）， P 8 8 (保持時間約8 8分鐘）、P 9 9 (保持時間約 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -74- ? I1312369^ 9r 3. 10 A7 B7 五、發明説明（72 ) 99分鐘）〕，分別真空乾燥後，溶解於2〇〇//1之 0.1%二氟化乙酸_50%乙腈溶液。以蛋白質序列儀 測此等肽試料’分別分析胺基酸序列至8殘基，結果得序 列表5至7所示胺基酸序列。所得內部部份胺基酸序列示 於表9。 表 9 肽名稱 內部部份胺基酸序列 P64 天冬醯胺-丙胺酸-絲胺酸一丙胺酸一天冬醯胺一 纈胺酸-蘇胺基-蘇胺酸 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 P88 色胺酸-絲胺酸-白胺酸-甘胺酸-苯丙胺酸一甲 _硫胺酸-天冬醯酸-苯丙胺酸_ P99 天冬醯酸-酪胺酸-蘇胺酸-天冬胺酸-丙胺酸- _色胺酸-甲硫胺酸-苯丙胺酸_ 實驗9 - 2 α -異麥芽糖基轉移酶之內部部份胺基酸序 列 以1 0 m M Tris -鹽酸緩衝液（ρΗ9 . 0)透析實 驗7 - 3之方法所得一部份之精製α 一異麥芽糖基轉移酶 標品後’以同緩衝液稀釋使其爲約1 mg/ J濃度。在1-£ 此試料液中加入1 0 /z g賴胺醯基肽鏈內切酶（和光純藥 公司販售），於3 0 t，反應2 2小時予以肽化。爲單離 生成之肽進ίτ逆相HPLC。使用microbondapack C18管柱（ 直徑2 . 1mm X長度15 〇mm，Waters公司製），以 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -75- 1312369 A7
7 B 五、發明説明（73 ) 以流速0 9 /分鐘，室溫下，以0 · 1 %三氟化乙酸 一 8 %乙腈溶液至0 · 1 %三氟化乙酸—4 0 %乙腈溶液 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 之1 2 0分鐘之直線梯度條件進行。自管柱溶離之肽係經 測定波長2 1 0 n m吸光度而檢測出。分離出與其他肽充 分被分離之三個肽〔P 2 2 (保持時間約2 2分鐘）， P 6 3 (保持時間約6 3分鐘）、P 7 1 (保持時間約 7 1分鐘）〕，分別真空乾燥後，溶解於200// 1之 0 . 1%三氟化乙酸一 5 0%乙腈溶液。以蛋白質序列儀 測此等肽試料，分別分析胺基酸序列至8殘基，結果得序 列表8至1 0所示胺基酸序列。所得內部部份胺基酸序列 示於表1 0。 表 ] L 0 肽名稱 內部部份胺基酸序列 P22 甘胺酸-天冬醯胺-麩胺酸-甲硫胺酸-精胺酸-天 冬醯胺-麩胺醯酸-酪胺酸 P63 異白胺酸-蘇胺酸-蘇胺酸-色胺酸-脯胺酸-異 白胺酸-麩胺酸-絲胺酸 P71 色胺酸-丙胺酸-苯丙胺酸-甘胺酸-白胺酸-色 胺酸-甲硫胺酸-絲胺酸 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 實驗1 0 自圓孢芽孢桿菌N 7 5生產α -異麥芽糖基葡糖質生成酶 在5 0 〇m«容積之三角形燒瓶中放入1 〇 本紙張尺度適用中11國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -76-
74 五'發明説明（） 4 · 〇w/v%澱粉部份分解物（商品名：Paindex#4)， 1 · 8w/v%酵母萃取物（商品名：Asahimist)， ◦ * lw/v% 磷酸二鉀、〇 . 〇6w/v% 磷酸一鈉· 12水鹽、0 · 05w/v%硫酸鎂· 7水鹽及水所成培 養基’以1 2 1 °C熱壓器殺菌2 0分鐘，經冷卻後接種圓 抱芽孢桿菌C75 (CCRC 9 10 17 3) ’於2 7 C ' 2 3 0 r p m旋轉振盪培養4 8小時後，得種培養液 〇 在3 0 <容量之發酵器中放入與種培養時一樣組成之 培養基約20 <，加熱殺菌，冷卻爲27。(：後接種lv/ v%種培養液，於27°C保持於PH6 . 0〜8 . 0，通 氣攪拌培養4 8小時。培養後之培養液中，本發明酶的酶 活性係約0 . 3 4單位/W，α -異麥芽糖基轉移酶活性 係約1 . 1單位/ 、環狀四糖生成活性係約〇 . 6 9單 位/ d、離心分離（lOOOOrpm，30分鐘）回收 之約1 8 <上澄液之酶活性，經測定之結果，本發明之α 一異麥芽糖基葡糖質生成酶係約0 . 3 3單位/d (總活 性約5，9 4 0單位）、α -異麥芽糖基轉移酶係約 1 . 1單位/4活性（總活性約1 9，8 0 0單位）、環 狀四糖生成活性係約0 . 6 7單位/4 (總活性約 1 2，1 0 0 單位）。 實驗1 1 調製圓孢芽孢桿菌Ν7 5由來之酶 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2!〇><297公釐） (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) -41- 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -77- 1312369 Α7 Β7 五、發明説明（75) 實驗1 1 - 1 精製圓孢芽孢桿菌N75由來之酶 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 以6 0 %飽和硫銨液鹽析約1 8 <實驗1 0所得培養 上澄液，於4 °C放置2 4小時後，離心分離（ 1 0，0 0 0 r p m，3 0分鐘）該鹽析沈澱物並回收， 溶解於1 0 m Μ磷酸緩衝液（p Η 8 . 3 )後對該緩衝液 透析，得約4 5 0 粗酶液。此粗酶液中係具有4 7 1 0 單位本發明之α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性，約 1 5，7 0 0單位α -異麥芽糖基轉移酶活性，約 9，590單位之環狀四糖生成活性。使用實驗4 一 1記 載之Sepabeads FP-DA13凝膠的離子交換管柱層析處理此粗 酶液。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本發明之α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性係會吸附 於Sepabeads FP DA13凝膠、α -異麥芽糖基轉移酶活性係 不會吸附於Sepabeads FP DA13凝膠，溶離爲非吸附餾份。 繼而以N a C 1濃度〇 Μ至1 Μ之直線梯度溶離時，本發 明之α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性係在N a C 1直線 梯度之濃度約0 . 2 5 Μ附近溶離。在此分別收集-異 麥芽糖基轉移酶餾份與本發明之α-異麥芽糖基葡糖質生 成酶餾份，並回收。由實驗4記載之C 9株及實驗7記載 之C 1 1株一樣，在此管柱層析之任一餾份均未見到環狀 四糖生成活性，又，混合所得之α -異麥芽糖基轉移酶餾 份與α -異麥芽糖基葡糖質生成酶餾份之酶液係獲知有環 狀四糖生成活性，亦獲知自澱粉部份分解物生成環狀四糖 之活性係可藉由本發明之α -異麥芽糖基葡糖質生成酶與 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -78- Ι312369Γ JL0錄正 補无 A7 B7 五、發明説明（76) α -異麥芽糖基轉移酶之兩種酶活性共同作用才可以發揮 者。 以下分別針對精製本發明之α -異麥芽糖基葡糖質生 成酶與α —異麥芽糖基轉移酶的方法說明如下。 實驗1 1 一 2 α -異麥芽糖基葡糖質生成酶之精製 以含1Μ硫銨之l〇mM磷酸緩衝液（ρΗ7 . 〇) 透析本發明之α -異麥芽糖基葡糖質生成酶餾份、離心分 離此透析液，除去不溶物，以使於Sepahacryl HR S-200凝 膠（Amasham . Pharmacia · Biotech公司製）之親和性層析 (凝膠5 0 0 2)處理。酶活性會吸附於Sepahacryl HR S-200凝膠，以1M〜〇M硫銨之直線梯度，再以OmM〜 1 0 OmM之麥芽四糖之直線梯度溶離時，本發明之α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性係在麥芽四糖之直線梯度， 於其濃度爲約3 0 m Μ附近溶離出吸附之酶，收集、回收 具有此酶活性之餾份。以含1 Μ硫銨之1 0 m Μ磷酸緩衝 液（Ρ Η 7 · 0 )透析此回收液、離心分離此透析液，除 去不溶物，以使用東曹公司製Butyl-Toyopearl 650Μ凝膠之 疏水層析（凝膠量3 5 0 J)處理。此酶會吸附Butyl-Toyopearl 650M凝膠，以1 Μ〜0M直線梯度之硫銨溶離時 ，於硫銨濃度約0 . 3 Μ附近溶離出吸附之酶，收集、回 收示有此酶活性之餾份。再次以含1 Μ硫銨之 1 0 m Μ磷酸緩衝液（ρ η 7 . 0 )透析此回收液、離心 分離此透析液，除去不溶物，以使用Sephacryl HR S-200凝 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) '訂 Φ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -79 - 1312369! Α7 Β7 五、發明説明（77 ) 膠之親和性層析精製。此精製之各步驟中的α —異麥芽糖 基葡糖質生成酶活性量，比活性、收率示於表1 1。 表 步驟 α-異麥芽糖基葡糖質生成 酶之活性量(單位） α-異麥芽糖基葡糖質生成酶 之比活性(單位/mg蛋白） 收率 (%) 培養上澄液 5,940 0.10 100 硫銨鹽析後之透析液 4,710 0.19 79.3 離子交換管柱溶離液 3,200 2.12 53.9 親和性管柱溶離液 2,210 7.55 37.2 疏水管柱溶離液 1,720 10.1 29.0 離子交換管柱溶離液 1,320 12.5 22.2 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 以含有7 . 5w/v%濃度之聚丙稀醯胺之SDS -聚丙烯醯胺凝膠電泳（SDS-PAGE)檢測本發明實 驗中精製之α -異麥芽糖基葡糖質生成酶標品的純度，結 果本酵素標品之蛋白帶係單一者，可知爲純度極高之標品 〇 實驗11-3 精製α -異麥芽糖基轉移酶 將實驗1 1 - 1記載之藉由離子交換層析分離α -異 麥芽糖基葡糖質生成酶餾份後之α-異麥芽糖基轉移酶餾 份，以含1Μ硫銨之10mM磷酸緩衝液（ΡΗ7 . 0) 透析，離心分離此透析液，除去不溶物，以使用Amasham • Pharmacia· Biotech 公司製之 Sep liaci. ye HR S-200 凝膠親 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（21〇乂297公釐） -80- Ι312369ΓΤ"νϋ.錄 年月Η . ν： > 補无 Α7 ----------1_Β7_ ‘五、發明説明（78 ) 和性管柱層析（凝膠量5 0 0 )處理。此酶係會吸附於 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
Sephacryl HR S-200凝膠，以1M〜0M硫銨之直線梯度溶 離時，在約0 . 3M硫銨濃度附近吸附於酶溶離，回收具 有此酶活性之餾份。另外以含1 Μ硫銨之1 0 m Μ磷酸緩 衝液（ρ Η 7 . 0 )透析此酶餾份，離心分離此透析液， 除去不溶物，以使用Butyl-Toyopearl 650Μ凝膠的疏水管柱 層析（凝膠量3 8 0 )處理。此酶係會吸附於Butyl-
Toyopearl 65 0M凝膠，以直線梯度1M〜0M硫銨溶離時， 於約0 . 3M硫銨濃度附近，吸附之酶被溶離，收集回收 具有此酶活性的餾份。以1 0 m M Tris —鹽酸緩衝液（ρ Η 8 . 0 )透析此回收液，離心分離此透析液，除去不溶 物，以使用Super Q-ToyoPearl 650C之凝膠的離子交換管柱 層析（凝膠量3 8 〇m 1 )處理。此酶係不會吸附於Super Q-Toyopearl 650凝膠，溶離爲非吸附餾份，回收所得溶離 留份，做爲最終精製酶標品。此精製之各步驟中的α -異 麥芽糖基轉移酶的活性量、比活性、收率示於表1 2。 經濟部智慧財產局8工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） -81 - 13123 啦 年 A7 B7 五、發明説明（79 ) 声_1 2__ 步驟 α-異麥芽糖基轉移 酶之活性量(單位） α-異麥芽糖基轉移酶之比 活性(單位/mg蛋白） 收率 (%) 培養上澄液 19,000 0.33 100 硫錶鹽析後之透析液 15,700 0.64 82.6 離子交換管柱溶離液 12,400 3.56 65.3 親和件管柱溶離液 8,320 11.7 43.8 疏水管柱溶離液 4,830 15.2 25.4 離子交換管柱溶離液 3,850 22.6 20.3 以含有7 _ 5w/v%濃度之聚丙烯醯胺之SDS — 聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測酶標品的純度，結果蛋白帶係單 一者，可知爲純度極高之標品。 實驗1 2 α -異麥芽糖基葡糖質生成酶及α -異麥芽糖 基轉移酶的性質 實驗12-1 α -異麥芽糖基葡糖質生成酶之性質 將實驗1 1 - 2之方法所得精製α -異麥芽糖基葡糖 質生成酶標品供予SDS — PAGE (凝膠濃度7 . 5w / v % )，與同時電泳之分子量標識物（日本Bio-rad · Laboratrys公司製）比較，測定此酶標品之分子量，結果分 子量係約136， 000±20， 000達爾頓。 又，以含有 2 w / v %Ampholine(Amasham Phamacia Biotech公司製）之等電點聚丙烯醯胺凝膠電泳法測試上述精 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ---------d----Ί--、订------Φ— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -82 1312369 Α7 Β7 五、發明説明（8〇 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 製之α -異麥芽糖基葡糖質生成酶標品後，測定凝膠中之 蛋白帶及凝膠之Ρ Η，求本酵素標品之等電點，結果等電 點（Ρ 1 )係約 7 · 3 ± 0 . 5 。 依活性測定方法調查對此酶標品之酶活性會影響之溫 度、pH。又，溫度之影響係在C a2 +非存在下與imM 存在下測定結果示於圖21(溫度之影響），圖22( PH影響）。此酶之最適溫度係pH6 . 0，反應60分 鐘爲約5 ◦ °C，（ C a 2 +非存在）、約5 5 Ό ( C a 2 + 1 m Μ存在）、最適pH係35 °C，反應60分鐘爲約 6 . 0。此酶之溫度安定性係保持酶溶液（2 0 m Μ乙酸 緩衝液，ρΗ6 . 0)於Ca2 +非存在下或ImM存在下 ’各温度6 0分鐘，水冷後，測定殘存之酶活性以求得。 又，Ρ Η安定性係保持酶於5 0 m Μ緩衝液中，於4 °C， 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 2 4小時後調整ρ Η爲6 · 0，測定殘存之酶活性以求得 。結果分別示於圖2 3 (溫度安定性）與圖2 4 ( ρ Η安 定性）。由此等圖可知，此酶的溫度安定係性係約4 5 °C 爲止（Ca2 +非存在）、約50°C爲止（Ca2+ ImM 存在），又，之安定pH區域係約5 . 0〜約9 . 0。 依濃度1 m Μ之各種金屬鹽存在下測定活性之方法調 査金屬離子對此酶活性之影響，結果示於表1 3。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS〉Α4規格（2丨0 X 297公釐） -83- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1312369 Α7 ------- Β7 五、發明説明（81 ) 表 13 金屬離子 ------------- _相對活性（％) 金屬離子 相對妖怖f 、 不添加 100 Hg2 + --1 口 l 工 V J 1 Zn2 + 82 Ba2 + 84 Mg2 + 96 Sr2 + 85 Ca2 + 108 Pb2 + 86 Co2 + 93 Fe2 + 82 Cu2 + 7 Fe3 + 93 Ni2 + 93 Mn2 + 120 Al3 + 98 EDTA 35 由表1 3之結果可知，此酶之活性係在η g 2 + '
Cu2+、EDTA被顯著地阻斷，在Ca2+、M2 +會被 活性化。 使用蛋白質序列儀（Model 473A，Aplid Biosystem公司 製造）分析此酶之N末端胺基酸序列，結果獲知具有序列 表中之序列1 1所示胺基酸序列N末端組織胺酸-纈胺酸 -絲胺酸_丙胺酸-白胺酸-甘胺酸-天冬醯胺-白胺酸 -白胺酸-之N末端胺基酸序列。 將此N末端胺基酸序列結果與實驗5 - 1之來自圓孢 芽孢桿菌C9及實驗8 - 1之圓孢芽桿菌Cl 1由來之α -異麥芽糖基葡糖質生成酶的Ν末端序列相比較’獲知雖 第1及第4、第9之胺基酸不同，但類似性極高。 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） I 裝 „ 訂 I (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -84- 1312369 Α7 Β7 五、發明説明（82) 實驗1 2 - 2 α -異麥芽糖基轉移酶之性質 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 將實驗1 1 - 3之方法所得精製α -異麥芽糖基轉移 酶標品供予S D S - P A G Ε (凝膠濃度7 . 5 w / ν % )’與同時電泳之分子量標識物（日本Bio-rad · Laboratrys 公司製）比較，測定此酶標品之分子量，結果分子量係約 112,0〇0±2〇〇00 達爾頓。 又，以含有 2w / v% Ampholine(Amasham Phamacia Biotech公司製）之等電點聚丙烯醯胺凝膠電泳法測試精製之 α -異麥芽糖基轉移酶標品，泳電後測定凝膠中之蛋白帶 及凝膠之Ρ Η，求本酵素標品之等電點，結果等電點係 Ρ 1 約 7 · 8 ± 0 . 5 。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 依活性測定方法調查對此酶標品之酶活性會影響之溫 度、pH。結果示於圖25 (溫度之影響），圖26 ( pH影響）。此酶之最適溫度係PH6 . 0，反應3 0分 鐘爲約5 0 °C，最適ρ Η係3 5 °C，反應3 0分鐘爲約 6 . 0。此酶之溫度安定性係保持酶溶液（2 0 m Μ乙酸 緩衝液，Ρ Η 6 . 0 )於各溫度6 0分鐘，水冷後，測定 殘存之酶活性以求得。又，ρ Η安定性係保持酶於各ρ Η 之5 OmM緩衝液中，於4 °C，2 4小時後調整pH爲 6 . 0，測定殘存之酶活性以求得。結果分別示於圖 2 7 (溫度安定性）與圖2 8 ( ρ Η安定性）。由此等圖 可知，此酶之上述條件下的安定溫度領域係約4 5 °C以下 ，又，上述條件下之安定ρ Η區域係約4 . 5〜約 10.0° 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） -85- 1312369 Α7 _Ξ---- 五、發明説明（83) 依濃度1 m Μ之各種金屬鹽存在下_定活性之方法調 查金屬離子對此酶活性之影響，結果示於表1 4。 表 14 金屬離子 相對活性（％) -----****" 金屬離_ 相對活性（％) 不添加 100 Hg2t 一_ 0.5 Ζη2 + 75 Ba2+ __ 102 Mg2 + 95 Sr2 + 91 Ca2 + 100 Pb2 + 69 Co2 + 92 Fe2 + 97 Cu2 + 15 Fe3 + 90 Ni2 + 91 Mn2 + 101 Al3 + 94 EDTA 92 --------^裝-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、11 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 由表1 4之結果可知，此酶之活性係在H g 2 +被顯著 地阻斷，在C u 2 +亦被阻斷。又獲知在C a 2 +不會被活性 化，亦不被E D T A阻斷。 使用蛋白質序列儀（Model 473A，Aplid Biosystem公司 製造）分析此酶之N末端胺基酸序列，結果獲知爲序列3 所示胺基酸序列之異白胺酸-天冬胺酸-甘胺酸-纈胺酸 -酪胺酸-組織胺酸-丙胺酸-脯胺酸-酪胺酸-甘胺酸 之N末端胺基酸序列，與實驗5 - 2之圓孢芽孢桿菌C 9 由來及實驗8 - 2之圓孢芽孢桿菌C 1 1由來之α -異麥 芽糖基轉移酶的Ν末端序列相比較，獲知α -異麥芽糖基 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） -86- 1312369 A7 B7 五、發明説明（84) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 轉移酶之共同的N末端胺基酸序列係序列表4所示胺基酸 序列之異白胺酸-天冬胺酸-甘胺酸-纈胺酸一酪胺酸-組織胺酸-丙胺酸-脯胺酸的N末端胺基酸序列。 實驗13 α-異麥芽糖基葡糖質生成酶及α—異麥芽糖 基轉移酶之胺基酸序列 實驗1 3 - 1 α -異麥芽糖基葡糖質生成酶之內部部份 胺基酸序列 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 以1 〇 m M Tris -鹽酸緩衝液（ρΗ9 . 0)透析實 驗1 1之方法所得一部份之精製《 -異麥芽糖基葡糖質生 成酶標品後，以同緩衝液稀釋使其爲約1 m g /J濃度。 在12此試料液中加入2 0 // g賴胺醯基肽鏈內切酶（和 光純藥公司販售），於30 °C，反應24小時予以肽化。 爲單離生成之肽進行逆相Η P L C。使用microbondapack C18管柱（直徑3 . 9mmx長度1 5 〇mm，Waters公司 製），以流速0 . 9 2/分鐘，室溫下，以0 . 1 %三氟 化乙酸—8%乙腈溶液至〇.1%三氟化乙酸一36%乙 腈溶液之1 2 0分鐘之直線梯度條件進行。自管柱溶離之 肽係經測定波長2 1 0 n m吸光度而檢測出。分離出與其 他肽充分被分離之三個肽〔pN5 9 (保持時間約5 9分 鐘），DN67(保持時間約67分鐘）、P87(保持 時間約8 7分鐘）〕’分別真空乾燥後，溶解於2 0 0 /Z 1之0 . 1%三氟化乙酸一5 0%乙腈溶液。以蛋白質 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -87- 13123
3. 10 月R 咳1匕 痛无 A7 B7 ，五、發明説明（85) 序列儀 '測此等肽試料，分別分析胺基酸序列至8殘基，結 ¥彳辱序列表1 2至1 4所示胺基酸序列。所得內部部份胺 基酸序列示於表1 5。 表 5 肽名稱 內部部份胺基酸序列 PN59 天冬胺酸-苯丙胺酸-絲胺酸-天冬醯胺一天冬醯 _酸_ -脯胺酸-蘇胺酸-纈胺酸 PN67 酪胺酸-蘇胺酸-纈胺酸-丙胺酸一脯胺酸-丙胺 酸-丙胺酸 PN87 酪胺酸-麩胺酸-丙胺酸-麩胺酸一絲胺酸一丙胺 酸一麩胺酸-白胺酸 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 實驗1 3 - 2 α -異麥芽糖基轉移酶之內部部份胺基酸 序列 以1 0 Tris —鹽酸緩衝液（pH9 . 0)透析實 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 驗1 1 - 3之方法所得一部份之精製α -異麥芽糖基轉移酶 標品後’以同緩衝液稀釋使其爲約1 mg/ α濃度。在1 J 此試料液中加入20 /Ζ g賴胺醯基肽鏈內切酶（和光純藥公 司販售）’於3 0 °C，反應2 4小時予以肽化。爲單離生 成之肽進行逆相HPLC。使用microbondapack C18管柱（直 徑3· 9mmx長度150mm，Waters公司製），以流 速〇·9J/分鐘，室溫下，以〇·1%三氟化乙酸一4 %乙腈溶液至〇 . 1%三氟化乙酸—42 . 4%乙腈溶液 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -88- 1312369 ^充 I %
五、發明説明（86) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 之9 0分鐘之直線梯度條件進行。自管柱溶離之肽係經測 定波長2 1 0 n m吸光度而檢測出。分離出與其他肽充分 被分離之三個肽〔PN2 1 (保持時間約2 1分鐘），P N 3 8 (保持時間約3 8分鐘）、P N 6 9 (保持時間約 69分鐘）〕，分別真空乾燥後，溶解於200;/ 1之0 • 1 %三氟化乙酸一 5 0 %乙腈溶液。以蛋白質序列儀測 此等肽試料，分別分析胺基酸序列至8殘基（惟P N 2 1 係至6殘基），結果得序列表1 5至1 7所示胺基酸序列 。所得內部部份胺基酸序列示於表1 6。 表 6 肽名稱 內 部 部 份 胺 基酸 序列 ΡΝ21 天 冬 醯 胺 — 色胺 酸一 色胺 酸- 甲 硫 胺 酸 —.絲 胺 酸一 賴 胺 酸 ΡΝ38 蘇 胺 酸 — 天 冬胺 酸一 甘胺 酸一 甘 胺 酸 — 麩胺 酸 -甲 硫 胺 酸 — 纈 胺酸 -色j 按酸 ΡΝ69 天 冬 醯 胺 — 異白 胺酸 一酪 胺酸 — 白 胺 酸 一脯 胺 酸一 麩 胺 酸 — 甘 胺酸 —天 多胺酸 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 實驗1 4 自球形節桿菌A19生產α -異麥芽糖基葡糖質生成酶 在5 0 02容積之三角形燒瓶中放入1 〇 0J由 4 . 〇w/v%源粉部份分解物（商品名：Paindex#4)， 1 · 酵母萃取物 Asahimist) ，〇 _ lw/v% -89- 本紙張尺度適用中國國家標準（cns )Α4規格（210x 297公釐）
五、發明説明（87) 磷酸二鉀、〇 · 06w/v%磷酸一鈉· 12水鹽、 〇.〇5w/v%硫酸鎂.7水鹽及水所成培養基，以 1 2 1 t熱壓器殺菌2 0分鐘，冷卻後接種球形節桿菌 A19 (寄存號碼 CCRC 9 10 17 5) ’於 27°C 、2 3 〇 r p m旋轉振盪培養4 8小時後，得種培養液。 ,?τ 在3 0 <容量之發酵器中放入與種培養時一樣組成之 培養基約2 0 <，加熱殺菌，冷卻爲2 7 °C後接種1 v / v %種培養液，保持於溫度2 7 °C、p Η 6 . 0〜9 . 0 ’通氣攪拌培養4 8小時。培養後之培養液中，此酶的酶 活性係約1.1單位/ m£，α -異麥芽糖基轉移酶活性係約1 • 7單位/ 、環狀四糖生成活性係約〇 · 3 5單位/ me MW. 、低離心分離（10，000 r pm，30分鐘）回收之 上澄液1 8 <的酶活性經測定之結果，本發明之α —異麥 芽糖基葡糖質生成酶係約1 . 0 6單位/W (總活性約 19，100單位）、α -異麥芽糖基轉移酶係約1.6 單位/ (總活性約2 8 , 8 0 0單位）、環狀四糖生成 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 酶活性係約0 · 2 7單位/ m£ (總活性約4，8 6 0單位 )° 又此球形節桿菌A 1 9由來之α -異麥芽糖基葡糖質 生成酶之活性係測定時做爲基質用緩衝液，使用i 〇 〇 mM甘胺酸一 NaOH緩衝液（pH8.4)，除此外， 其他均與實驗3之方法一樣。 實驗1 5 調製來自球形節桿菌A 1 9之酶 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -90- 1312369 Α7 Β7 五、發明説明（88) 實驗1 5 - 1 精製來自球形節桿菌A 1 9之酶 以6 0 %飽和硫銨液鹽析約1 8彡實驗1 4所得培_ 上澄液，於4 °C放置2 4小時後，離心分離（ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產笱員工消費合作社印製 1 0，0 0 0 r p m ’ 3 0分鐘）該鹽析沈澱物並回收， 溶解於1 0 m Μ磷酸緩衝液（p Η 7 . 0 )後對該緩衝液 透析，得約8 5 0 J粗酶液。此粗酶液係具有8，2 1 〇 單位本發明之α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性、與 15，7 0 0單位之α -異麥芽糖基轉移酶活性、與約 2，0 9 0單位之環狀四糖生成活性。以使用東曹公司製 之D E A Ε — Toyopeaii 650S凝膠之離子交換管柱層析（凝 膠量3 8 0 ^ )處理此粗酶液。結果此酶會吸附於 D E A Ε — Toyopearl 65 0S 凝膠，以自 〇 Μ 至 〇 . 5 Μ N a C 1濃度之直線梯度溶離，結果本發明之α -異麥芽 糖基葡糖質生成酶與α -異麥芽糖基轉移酶係分離後溶離 ，本發明之α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性係在 N a C 1之直線梯度下於其濃度約0 . 2 Μ附近溶離，α -異麥芽糖基轉移酶活性係在N C 1之直線梯度下於其濃 度約0 · 3 Μ附近溶離。在此分別收集、回收本發明之α -異麥芽糖基葡糖質生成酶餾份與α -異麥芽糖基轉移酶 餾份。又，環狀四糖生成活性係在此管柱層析之任一餾份 均未見到，又，所得混合α -異麥芽糖基葡糖質生成酶飽 份與α _異麥芽糖基轉移酶之酶液係獲知示有環狀四糖生 成活性，亦獲知自澱粉部份分解酶生成環狀四糖的活性係 藉由α -異麥芽糖基轉移酶與α -異麥芽糖基葡糖質生成 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（21 〇 X 297公釐） -91 - 13123^^ 年月i A7 B7 五、發明説明（89) 酶間之兩種酶活性的共同作用而得以發揮者。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 以下分別敘述精製本發明之α -異麥芽糖基葡糖質生 成酶與α -異麥芽糖基轉移酶的方法。 實驗1 5 - 2 精製α -異麥芽糖基葡糖質生成酶 以含1Μ硫銨之1 OmM磷酸緩液（ρ Η 7 . 0 )透 析本發明之α -異麥芽糖基葡糖質生成酶餾份，離心分離 此透析液除去不溶物後，以使用Sephacryl HR S-200凝膠之 親水性管柱層析（凝膠量5 0 0 J )處理。此酶會吸附於 Sephacryl HR S-200凝膠，以1M至0M硫酸銨之直線梯度 溶離’本發明之^ 一異麥芽糖基葡糖質生成酶係在硫酸錢 之直線梯度下其濃度爲約〇 . 2 Μ附近會被吸附，溶離出 酶’收集示存有此酶活性之餾份，得最終精製標品。此精 製之各步驟中的α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性量，比 活性、收率示如表1 7。 表 17 步驟 _ α-異麥芽糖基葡糖質生成 酶之活性量(單位） α-_異麥芽糖基葡糖質生成酶 之比活性(單位/mg蛋白） 收率 (%) 培養上澄液 19,120 0.11 100 硫銨鹽析後之锈析湳 8,210 0.48 43.0 Ρ子交換管柱溶出液 6,890 4.18 36.1 11¾管柱溶離液 5,220 35.1 27.3 經濟部智慧財產局員Η消費合作社印製 以含有7 . 5 w/ v %濃度之聚丙烯醯胺的凝膠電泳 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4^格（210Χ297公釐） -92- 雖 1Χ 13 7 Β 五、發明説明（9Q) 檢定精製。α -異麥芽糖基葡糖質生成酶標品純度，結果 蛋白帶係單一，且純度高之標品。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 實驗1 5 - 3 α -異麥芽糖基轉移酶之部份精製 以含1Μ硫銨之l〇mM磷酸緩液（ρΗ7 . 0)透 析實驗1 5 - 1記載之離子交換層析與α-異麥芽糖基葡 糖質生成酶餾分分離之α -異麥芽糖基轉移酶餾份，離心 分離此透析液以除去不溶物後，以使用Sephacryl HR S-200 凝膠之親和性管柱層析（凝膠量5 0 〇m£)處理。此酶會 吸附於Sephacryl HR S-200凝膠，以1 Μ至〇M硫酸銨之直 線梯度溶離此酶，結果在硫酸銨濃度約0 Μ附近溶離出所 吸附的酶，回收顯示此酶活性的餾份，做爲部份精製酶標 品。此精製之步驟中的α _異麥芽糖基轉移酶活·性量，比 活性、收率示於表1 8。 表 18 步驟 α-異麥芽糖基轉移酶 之活性量(單位） α-異麥芽糖基轉移酶之比 活性(單位/mg蛋白） 收率 (%) 培養上澄液 28,8〇〇 0.18 100 硫銨鹽析後之透析液 15,700 0.97 54.5 離子交換管柱溶出液 7,130 4.01 24.8 親和性管柱溶離液 1,800 11.9 6.3 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 以含有7 . 4 w/ ν %濃度之聚丙燦醯胺的凝膠電泳 定部份精製α -異麥芽糖基轉移標品的酶標品純度，結果 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） -93- 1312369 A7 B7 五、發明説明（91 ) 除主要蛋白以外，尙看到三種次要之蛋白帶。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 實驗1 6 α -異麥芽糖基葡糖質生成酶及α —異麥芽糖 基轉移酶之性質 實驗16-1 〇: -異麥芽糖基葡糖質生成酶之性質 將實驗1 5- 2之方法所得精製α —異麥芽糖基葡糖 質生成酶標品供予SDS — PAGE (凝膠濃度7 . 5w / v % )，與同時電泳之分子量標識物（日本 Bio-rad · Laboratrys公司製）比較，測定此酶標品之分子量，結果分 子量係約94, 00〇±2〇，000達爾頓。 又，以含有 2 w / v %Ampholine(Amasham Phamacia Biotech公司製）之等電點聚丙烯醯胺凝膠電泳法_試上述精 製之α -異麥芽糖基葡糖質生成酶標品後，測定凝膠中之 蛋白帶及凝膠之pH，求本酵素標品之等電點，結果等電 點（P 1 )係約 4 . 3 ± 0 . 5。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 依活性測定方法調査對此酶標品之酶活性會影響之溫 度、p Η。又，溫度之影響係在C a2 +非存在下與ImM 存在下測定結果示於圖2 9 (溫度之影響），圖3 0 ( pH影響）。此酶之最適溫度係pH8 . 4，反應60分 鐘爲約6 0 t：， （ C a 2十非存在）、約6 5 〇C ( C a 2 +
ImM存在）、最適pH係3 5 ，反應6 0分鐘爲約 8 . 4。此酶之溫度安定性係保持酶溶液（2 0 m Μ甘胺 酸—Na〇H緩衝液，ρΗ8 · ◦)於Ca2 +非存在下或 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -94- 經濟部智#財產局員工消費合作杜印製 1312369 A7 ___B7 五、發明説明（92 ) 1 m Μ存在下，各溫度6 0分鐘，水冷後，測定殘存之酶 活性以求得。又，ρ Η安定性係保持酶於5 0 m Μ緩衝液 中’於4 °C，2 4小時後調整ρ Η爲8 . 0，測定殘存之 酶活性以求得。結果分別示於圖3 1 (溫度安定性）與圖 3 2 ( ρ Η安定性）。由此等圖可知，此酶的溫度安定係 性係約5 5 °C爲止（C a 2 +非存在）、約6 0 °C爲止（ Ca2+ ImM存在），又，之安定pH區域係約5·〇 〜約9 . 0 〇 依濃度1 m Μ之各種金屬鹽存在下測定活性之方法調 查金屬離子對此酶活性之影響，結果示於表1 9。 表 19 金屬離子 相對活性（％) 金屬離子 ----~~-1 相對活忤rq 不添加 100 Hg2 + 9 Zn2 + 56 Ba2 + 99 Mg2 + 97 Sr2 + 102 Ca2 + 106 Pb2 + 43 Co2 + 93 Fe2 + 36 Cu2 + 0 Fe3 + 35 Ni2 + 46 Mn2 + ~~~----- 98 Al3 + 37 EDTA 2 由表1 9之結果可知，本發明酶之活性係在η g 2 +、 C u 2 +、E D T A顯著地阻斷。 本紙張尺度適用巾酬家縣（CNS ) A4規格（21GX297公釐) -- -95- (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 1312369 A7 B7 五、發明説明（93 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 使用蛋白質序列儀（Model 473A, Aplid Biosystem公司 製造）分析此酶之N末端胺基酸序列，結果獲知具有序列 表中序列表1 8所示胺基酸序列N末端丙胺酸-脯胺酸一 白胺酸-甘胺酸-纈胺酸-麩胺酸-精胺酸-丙胺酸-麩 胺醯胺-苯丙胺酸-麩胺醯胺-絲胺酸-甘胺酸之N末端 胺基酸序列者。 實驗16-2 α-異麥芽糖基轉移酶之性質 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 使用實驗1 5 - 3之方法所得部份精製α -異麥芽糖 基轉移酶標品調查對此酶標品之酶活性會影響之溫度、 pH。結果示於圖33(溫度之影響），圖34 (pH影 響）。此酶之最適溫度係ρ Η 6 . 0，反應3 0分鐘爲約 50°C，最適pH係35°C，反應30分鐘爲約6 . 5。 此酶之溫度安定性係保持酶溶液（2 0 m Μ乙酸緩衝液， ΡΗ6 . 0)於各溫度6 0分鐘，水冷後，測定殘存之酶 活性以求得。又，ρ Η安定性係保持酶於5 0 m Μ緩衝液 中，於4 °C，2 4小時後調整ρ Η爲6 0，測定殘存之 酶活性以求得。結果分別示於圖3 5 (溫度安定性）與圖 3 6 ( ρ Η安定性）。由此等圖可知，此酶之上述條件下 的安定溫度領域係約4 5 °C爲止，ρ Η安定性係約4 . 5 〜至約9 . 0。 實驗1 7 自假生林節桿菌S 1生產α -異麥芽糖基轉移酶 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） -96-
五、發明説明（） 94 在5 0 〇m£容積之三角形燒瓶中放入1 〇 〇„£由 4 . ο Λν / V %澱粉部份分解物（商品名：paindex#4)， 1 · 8 w / v %酵母萃取物（商品名：Asahimist，Asahi啤 酒公司製造）’ 〇 _ 磷酸二鉀、〇 . 〇6w/ v%磷酸一鈉· 1 2水鹽、〇 · 〇5w/v%硫酸鎂· 7 水鹽及水所成培養基，以1 2 1 t：熱壓器殺菌2 0分鐘， 冷卻後接種假生林節桿菌S 1 (CCRC 9 10 17 4 )’於2 7 °C、2 3 0 r p m旋轉振盪培養4 8小時後， 得種培養液。 在3 0 <容量之發酵器中放入與種培養時一樣組成之 培養基約2 0 <，加熱殺菌，冷卻爲2 7 °C後接種1 v/ v %種培養液，於2 7 t保持於p Η 6 . 0〜8 · 0，通 氣攪拌培養4 8小時。培養後之培養液中，本發明之酶的 酶活性係約0 . 4 5單位/ me，經離心分離（ 1〇，000rpm，30分鐘）回收之約18《上澄液 之本酵素性係約〇 . 4 4單位/d (總活性約7， 9 2 0 單位）。 實驗1 8 精製自假生林節桿菌S1之α-異麥芽糖基轉移酶 以8 0 %飽和硫銨液鹽析約1 8 (實驗1 7所得培養 上澄液，於4 °C放置2 4小時後，離心分離（ 1 0，000 r pm，30分鐘）該鹽析沈澱物並回收， 溶解於1 0 m Μ磷酸緩衝液（p Η 7 · 0 )後對該緩衝液 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
----------------------IX -97- A7 B7 五、發明说明（95) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 透析，得約3 8 0 ni含約6，0 0 0單位之本發明酶活性 的粗酶液，以含1 Μ硫酸銨之1 0 m Μ磷酸緩衝液（p Η 7 . 0 )透析此粗酶液，離心分離此透析液以除去不溶物 後，以使用Sephacryl HR S-200凝膠之親水性管柱層析（凝 膠量5 0 0 J )處理。此酶活性成份會吸附於Sephacryl HR S-200凝膠，以1 Μ至Ο Μ硫酸銨之直線梯度，繼而以〇 w /v%至5w/v%麥芽四糖四醇之直線梯度溶離時，在 麥芽四糖濃度約2 w/ v %附近之麥芽糖會有吸附之酶會 溶離，回收示有此酶活性之餾份。另外，再以含1 Μ硫酸 銨之1 0 m Μ磷酸緩衝液（ρ Η 7 . 0 )透析、離心分離 ，除去不溶物，以使用Butyl-Toyopearl 650Μ凝膠的疏水管 柱層析（凝膠量3〆0 2 )處理。結果此酶會吸附於Butyl-Toyopeal 650M 凝膠 ，以 1M至 0M硫 酸銨之直線梯度溶離 ，結果在硫酸銨濃度約0.3M附近溶離出吸附於凝膠的 酶，回收示有本酵素活性之餾份，做爲精製標品。在表 2 0示此精製之各步驟中的a -異麥芽糖基轉移酶的活性 量、比活性、收率。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印契 表 2 0 步驟 A-異麥芽糖基轉移酶 之活性量(單位） α-異麥芽糖基轉移酶之比 活性(單位/mg蛋白） 收率 (%) 培養上澄液 7,920 0.47 10 硫銨鹽析後之透析液 6,000 3.36 75.8 親和性管柱溶離液 5,270 29.9 66.5 疏水管柱溶離液 4,430 31.1 55.9 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -98- 1312369 A7 B7 五、發明説明（96 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 藉由含7 . 5w/v%濃度之聚丙烯醯胺的SDS — P A G E，檢定在此實驗中精製之α -異麥芽糖基轉移酶 ，標品純度，結果此酶標品之蛋白帶係單一，獲知爲極高 純度之標品。 實驗1 9 α -異麥芽糖基轉移酶之性質 將實驗1 8之方法所得精製α -異麥芽糖基轉移酶標 品供予SDS — PAGE (凝膠濃度7 · 5w/v%)， 與同時電泳之分子量標識物（日本Bio-rad · Laboratrys公 司製）比較，測定此酶標品之分子量，結果分子量係約 116, 000±20，〇00達爾頓。 又，以含有 2 w / v %Ampholine(Amasham Phamacia Biotech公司製）之等電點聚丙烯醯胺凝膠電泳法測試上述精 製之α -異麥芽糖基轉移酶標品泳動後，測定凝膠中之蛋 白帶及凝膠之Ρ Η，求本酵素標品之等電點，結果等電點 (ρ I )係約 4 · 2 ± 0 · 5 。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 依活性測定方法調査對此酶標品之酶活性會影響之溫 度、pH。結果示於圖37 (溫度之影響），圖38 ( pH影響）。此酶之最適溫度係PH6 . 0，反應3 0分 鐘爲約5 0 °C，最適ρ Η係3 5 °C，反應3 0分鐘爲約 6 · 0。此酶之溫度安定性係保持酶溶液（2 0 m Μ乙酸 緩衝液，ρ Η 6 · 0 )於各溫度6 0分鐘，水冷後，測定 殘存之酶活性以求得。又，ρ Η安定性係保持酶於不同 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -99- 1312369 A7 B7 五 、發明説明（97 ) p Η之5 〇 m Μ緩衝液中，於4 t，2 4小時後調整p Η (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 爲6 · 〇，測定殘存之酶活性以求得。結果分別示於圖 3 9 (溫度安定性）與圖4 0 ( ρ Η安定性）。由此等圖 可知，此酶之上述條件下的安定溫度領域係約4 5 °C以下 ’又，上述條件下之安定pH區域係約3 . 6〜約9 . 0。 依濃度1 m Μ之各種金屬鹽存在下測定活性之方法調 查金屬離子對此酶活性之影響，結果示於表2 1。 表 1屬離子 相對活性（％) 金屬離子 相對活性（％) 不添加 100 Hgi + 0.1 Zn2 + 78 Ba2 + 97 Mg2 + 99 Sr2 + 101 Ca2 + 103 Pb2 + 85 Co2 + 91 Fe2+ 105 Cu2 + 2 Fe3 + 75 Ni2 + 87 Mn2 + 98 Al3 + 93 EDTA 91 經濟部智慧財產局8工消費合作社印製 由表2 1之結果可知，本發明酶之活性係在H g 2 +被 顯著地阻斷，在C u 2+亦被阻斷。又獲知在C a 2 +不會被 活性化，亦不被E D T A阻斷。 使用蛋白質序列儀（Model 473A, Aplid Biosystem公司 製造）分析此酶之N末端胺基酸序列，結果獲知N末端胺 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -100- 1312369 A7 B7 _ 五、發明説明（98) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 基酸序列係以序列表中序列8表示，係爲天冬胺酸一蘇胺 酸-白胺酸-絲胺酸一甘胺酸一纈胺酸一苯丙胺酸一組織 胺酸-甘胺酸-脯胺酸所示序列。 實驗2 0 對各種糖質之作用 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 使用各種糖質試驗是否可成爲本發明之α -異麥芽糖 基葡糖質生成酶之基質。調製麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四 糖、麥芽五糖、麥芽六糖、麥芽七糖、異麥芽糖、異麥芽 三糖、人參三糖（6 _ α -葡萄基麥芽糖、異人參三糖、 海藻糖、麴二糖、黑麹糖 '新海藻糖 '纖維二糖' 龍膽二 糖 '麥芽糖醇、麥芽三醇、乳糖、蔗糖、erlose、selaginose 麥芽糖基糖苷、異麥芽糖基糖苷之溶液。對此等溶液之每 1 g基質固體分別添加2單位實驗4 - 2之方法所得來自 圓孢芽孢桿菌C 9之精製α -異麥芽糖基葡糖質生成酶標 品，實驗7 - 2之方法所得來自圓孢芽孢桿菌C 1 1之精 製之α -異麥芽糖基葡糖質生成酶標品’實驗1 1 - 2之 方法所得來自圓孢芽孢桿菌Ν7 5之精製α -異麥芽糖基 葡糖質生成酶標品，實驗1 5 - 2之方法所得來自球形節 桿菌A 1 9的精製α -異麥芽糖基轉移酶標品的任一，調 製爲2w/v%基質濃度，於30°C，ρΗ6 · 0 (球形 節桿菌A 1 9由來之酶係PH8 · 4)反應2 4小時。以 實驗1記載之T L C法分析酶反應前後之反應液，確認對 各糖質有無酶作用，結果如表2 2所示。 I紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ' — 1312369 A7
7 B 五、發明説明（"） 5___ 2 2 基 質 酵素作用 C9酵素 C11酵素 N75酵素 A19酵素 麥芽糖 + + + + 麥芽三糖 十+ 十+ + + 十十 麥芽四糖 十+ + + + + + + + + + + 麥芽五糖 + + + + + + + + + + + + 麥芽六糖 + + + + + + + + + + + + 麥芽七糖 + + + + + + + + + + + + 異麥芽糖 — — — _ 異麥芽三糖 — — _ _ 人參三糖 — — — — 異人參三糖 + + + + + + + + i藻糖 — — — — 麴二糖 + + + + 黑麹糖 + + + + 新海藻糖 + + + + 纖維二糖 — — — — 龍膽二糖 — — — ' — 麥芽糖醇 — — — — 麥芽糖三醇 + + + + 乳糖 — — — — 蔗糖 — — — — erlose + + + + selaginose — — — — 麥芽糖基糖苷 + + + + + + + + 異麥芽糖基糖苷 — — — — (註）「-」表耶未變化、 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 +」表示反應後基質斑點度不多，確認有其他生成物 + +」表示質斑點已顯著減少，確認有其生成物 + + +」係表不基質斑點已完全消失，確g忍有其他生成物 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -102- 1312369 A7 B7 五、發明説明（100) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 由表2 2之結果可知，本發明之a —異麥芽糖基葡糖 質生成酶可以對試驗之各種糖質中的葡萄糖聚合度3以上 ，非還原末端具有麥芽糖構造之糖質充分地作用。又，對 葡萄糖聚合度爲2之糖質則獲知亦可稍作用於麥芽糖、麴 二糖、黑麹糖、新海藻糖、麥芽糖三醇、erl〇se。 實驗21 自麥芽寡糖之生成物 實驗2 1 - 1 調製生成物 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 對濃度1 %之麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五 糖，分別以每1 g固體單位加入2單位（麥芽糖及麥芽三 糖）、0 . 2單位（麥芽四糖）、0 1單位（麥芽五糖 )之實驗7 - 2之方法所得精製 α -異麥芽糖基葡糖質 生成酶於3 5°C、ρΗ6 . 0作用8小時，保持於1 〇 〇 °C 1 0分鐘停止反應。使用Η P L C法測定此酶反應液 之糖組成。HPLC係用YMC Pack 0 D S -AQ303管柱（Y.M.C公司製造），在管溫度40 °C，流速〇 . 5 /分鐘之條件下進行，檢測係使用示差 折射法R I - 8 0 1 2 (東曹公司製造）進行。結果示於 表2 3 。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0 X 297公釐） -103 - 1312369 A7 B7 五、發明説明（101) 表 2 3 反應後生成之糖質 基質 種類 麥芽糖 麥芽三糖 麥芽四糖 麥芽五糖 葡葡糖 8.5 0.1 0.0 0.0 麥芽糖 78.0 17.9 0.3 0.0 麥芽三糖 0.8 45.3 22.7 1.9 麥芽四糖 0.0 1.8 35.1 19.2 麥芽五糖 0.0 0.0 3.5 34.4 麥芽六糖 0.0 0.0 0.0 4.6 異麥芽糖 0.5 0.0 0.0 0.0 葡萄糖基麥芽糖 8.2 1.2 0.0 0.0 葡葡糖基麥芽三糖 2.4 31.5 6.8 0.0 X 0.0 2.1 30.0 11.4 Υ 0.0 0.0 1.4 26.8 Ζ 0.0 0.0 0.0 1.7 其他 0.6 0.1 0.2 0.0 表中 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 C 準 標 家 國 國 中 用 適 度 尺 張 紙 本 葡萄糖基麥芽糖係α -異麥芽糖基葡萄糖（別名，6 2 -◦-α-葡萄糖基麥芽糖、人參三糖）、 葡萄糖基麥芽三糖係指α -異麥芽糖基麥芽三糖（別名 ，63 - ◦一 α -葡萄糖基麥芽三糖）、 X係實驗1 1 - 2記載之α -異麥芽糖基麥芽三糖（別 名，64 - 〇 - α -葡萄糖基麥芽四糖）、 Υ係實驗1 1 - 2記載之α -異麥芽糖基麥芽四糖（別 (210X 297公釐） -104- 1312369 A7 B7 五、發明説明（102) 名，65 - 0 - a -葡萄糖基麥芽五糖）、 Z係未鑑定之糖質。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 由表2 3可知，此酶之作用結果，自基質麥芽糖主要 可生成葡萄糖與α -異麥芽糖基葡萄糖（別名，62 - 0 -α-葡萄基麥芽糖、人參三糖），自基質麥芽三糖主要可 生成麥芽糖與α -異麥芽糖基葡萄糖（別名，63 - 0 - α -葡萄糖基麥芽三糖）、少量生成葡萄糖、麥芽四糖、α -異麥芽糖基葡萄糖（別名，62 - 〇 - α -葡萄糖基麥芽 糖）、生成物又，獲知自基質麥芽四糖主要可生成麥芽三 糖與生成物X，少量之麥芽糖、麥芽五糖、α -異麥芽糖 基葡萄糖（別名，63 - 〇 - α -葡萄糖基麥芽四糖）、生 成物Υ。自基質麥芽五糖主要生成麥芽四糖與生成物Υ、 少量之麥芽三糖、麥芽六糖、主成物X、生成物Ζ。 單離、精製自基質麥芽四糖之生成物的生成物X、以 及自基質麥芽五糖之主生成物的生成物Υ。使用分離用 HPLC 管柱 YMC — Pack 〇DS— A R355 — 15S— 15 12A(Y.M.C公司製），自上述麥 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 芽四糖之反應物，自麥芽五糖之反應物分別以固體物收率 約8 . 3 %單離純度9 9 . 9 %以上之生成物X標品，以 固體物收率約11·5%單位純度99.9%以上之生成 物Y。 實驗2 1 - 2 生成物之構造分析 使用實驗2 1 - 1之方法所得生成物X及生成物Y ’ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -105- 1312369
7 7 A B 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（103) 依常法進行甲基化分析與N M R分析。甲基化分析之結果 示於表2 4。NMR分析之結果係iH — NMR譜示於第 4 1圖（生成物X)、第42圖（生成物Y)、 13C — NMR譜示於第43圖（生成物X)、第44圖（ 生成物Y)，將生成物X、Y之歸屬示於表2 5。 表2 4 分析甲基化物之種類 組成比 生成物X 生成物Y 2,3,4-三甲基化物 1.00 1.00 2,3,6-三甲基化物 3.05 3.98 2,3,4,6-四甲基化物 0.82 0.85 由此等結果可知，本發明之α -異麥芽糖基葡糖質生 成酶之自麥芽四糖的生成物X係在麥芽四糖之非還原末端 葡萄糖之6位經基有葡萄糖基予以α結合的五糖’可用構 造式1所示之^一異麥芽糖基麥芽四糖（別名，64 — ◦一 α-葡萄糖基麥芽四糖）。 構造式.1 :
一 D — G 1 c P — ( 1 —6 ) 一 CL 一 D - G 1 c P 4 ) 一 CL 一 D - G 1 C ρ 一 (1 -> 4 ) 一 QL 一 D -Glcp - (1^4) 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2〗〇χ297公釐） ---------------IT-------0 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -106- 1312369 Α7 Β7 五、發明説明（104) 又，獲知自麥芽五糖之生成物Y係麥芽五糖之非還原 末端葡萄糖之6位羥基上有葡萄糖基予以α結合的六糖’ 以構造式2所示α -異麥芽糖基麥芽四糖（別名，6 5-0 - α -葡萄糖基麥芽五糖）者。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 構造式2 :
a D — G 1 c ρ - ( 1 —6 ) — a -D - G 1 c p ( 1 —> 4 ) — a —D — G 1 c .p — ( 1 -4 ) — a 一 D G 1 C P — ( 1 —4 ) — a -D - G 1 c p — ( 1 —4 — D —— G 1 C P 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -107- 1312369 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五 、發明説明（105) 表2 5 葡萄糖號碼 碳號碼 NMR化學轉移値（ppm) 生成物X 生成物Υ a la 100.8 100.8 2a 74.2 74.2 3a 75.8 75.7 4a 72.2 72.2 5a 74.5 74.5 6a 63.2 63.1 b lb 102.6 102.6 2b 74.2 74.2 3b 75.8 Ί5.1 4b 72.1 72.1 5b 74.0 74.0 6b 68.6 68.6 C 1 c 102.3 102.3 2c 74.2 ΙΑ.2 3c 76.0 76.0 4c 79.6 79.5 5 c 73.9 73.9 6c 63.2 63.1 d Id 102.2 102.3 2d 74.0( a ),74.4( /3 ) 74.2 3d 76.0 76.0 4d 79.8 79.5 5d 73.9 73.9 6d 63.2 63.1 e 1 e 94.6( a ),98.5( /3 ) 102.1 2e 74.2( α ),76.7( /3 ) 74.0( α ),74.4( /3 ) 3e 75.9( α ),78.9( /3 ) 76.0 4e 79.6( α ),79.4( /3 ) 79.8 5e 72.6( α ),77.2( /S ) 73.9 6e 63.4(α ),63.4(β ) 63.1 F If 94.6( α ),98.5( /9 ) 2f 74.2( ο: ),76.7( /3 ) 3f 76.0( α ),78.9( /3 ) 4f 79.6(α ),79.4(β ) 5f 72.6( α ),77.2( /3 ) 6f 63.4( α ),63.4( /3 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） -108- 1312369 A7 B7 五、發明説明（106) 由以上可知，本發明之α 一異麥芽糖基葡糖質生成酶 對於麥芽寡糖之作用係如以下者。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) (1 )此酵素係做爲基質作用於由α - 1 ，4結合成 葡萄糖聚合度爲2以上之麥芽寡糖，具有會觸媒將該非還 原末端之葡萄糖殘基轉移至其他分子之非還原末端葡萄殘 基的6位之作用的分子間6 -葡萄糖基轉移，生成非還原 末端上具有6 - 0 - α -葡萄糖基之葡萄糖聚合度爲增加 1之<2 -異麥牙糖基葡甸糖質（別名6 - 0 - α葡萄糖基 麥芽寡糖）、與葡萄聚合度減少1之麥芽寡糖。 (2 )此酵素可稍作爲觸媒進行4 一葡萄糖基轉移， 可以稍生成葡萄糖聚合度增加1之麥芽寡糖、與葡萄糖聚 合度減少1之麥芽寡糖。 實驗2 2 還原力生成試驗 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 爲調查本發明之a -異麥芽糖基葡糖質生成酶是否具 有還原力生成能力進行以下試驗。濃度1 %之麥芽四糖水 溶液中，對每1 g基質固體添加〇 . 2 5單位實驗4 - 2 之方法所得來自圓孢芽孢桿菌C 9之精製α -異麥芽糖基 葡糖質生成酶標品，實驗7 - 2之方法所得來自圓孢芽孢 桿菌C 1 1之精製〇： -異麥芽糖基葡糖質生成酶，實驗 1 1 一 2之方法所得來自圓孢芽孢桿菌Ν7 5之精製α -異麥芽糖基葡糖質生成酶及實驗1 5 - 2之方法所得來自 球形節桿菌A 1 9的精製〇： -異麥芽糖基葡糖質生成酶， 於3 5 °C，p Η 6 . 0 (球形節桿菌A 1 9由來之酶時係 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210x297公釐） -109 - 131231¾
A7 B7 五、發明説明（107) Ρ Η 8 . 0 )作用，經一段時間採取—部份該反應液，保 持於1 0 0°C 1 0分鐘停止反應，測定反應液之還原力 。即以Somogyi-Nelson法測定此酶反應前之溶液還原糖量 。另外’同時又用蒽酮法測定反應前後之溶液之全糖量。 還原力生成率（％)係使用如下所示計算式算出，結果一 倂示於表26。 計算式 還原力生成率（％)=[运座「反應前之還原糖量1 1ΠΠ 顾後之全繼 之全糖量]χ 100 (請先閣讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部智慧財產局員工消費合作社印¾ 表 2 6 反應時間 還原力率（％) (小時） C9酵素 C11酵素 N75酵素 A19酵素 0 0.0 0.0 0.0 0.0 1 0.0 0.1 0.1 0.0 2 0.1 0.0 0.0 0.1 4 0.1 0.1 0.0 0.0 8 0.0 0.0 0.1 0.1 由表2 6之結果可知，本發明之^ —異麥芽糖基葡糖 質生成酶係以麥芽四糖爲基質其作用時實質上不會增加反 應物之還原力即獲知該〇： 一異麥芽糖基葡糖質生成酶不會 具有水解作用，或僅爲無法檢測出之少量者。 本纸張尺度適用中國國家德進C ΓΜ.ς、Δ/U目ϋ 訂 —0- -110 1312369 Α7 Β7 五、發明説明（1〇8) 實驗2 3 生成葡聚糖試驗 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 爲調查本發明之α -異麥芽糖基葡糖質生成酶是否具 有生成葡聚糖之作用，依照Bioscience Biotech nology and Biochemistry 第 5 6 卷，1 6 9 至 1 7 3 ( 1 9 9 2 年）記 載之方法進行試驗。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 濃度1%之麥芽四糖水溶液中，對每1 g基質固體添 加0 · 5單位實驗4 - 2之方法所得來自圓孢芽孢桿菌 C 9之精製α -異麥芽糖基葡糖質生成酶及實驗7 - 2之 方法所得來自圓孢芽孢桿菌C11之精製α-異麥芽糖基 葡糖質生成酶，實驗1 1 - 2之方法所得來自圓孢芽孢桿 菌Ν7 5之精製α -異麥芽糖基葡糖質生成酶，實驗1 5 - 2之方法所得來自球形節桿菌A 1 9的精製α —異麥芽 糖基葡糖質生成酶標品，於3 5 °C、ρ Η 6 . 0 (球形節 桿菌A 1 9酶時係ρ Η 8 . 0 )作用4小時及8小時後保 持於1 0 0 °C 1 5分鐘停止反應。將5 0 // 1此酶反應 放入離心管，加入3倍量之乙醇於其中，充分攪拌後，於 4 °C靜置30分鐘。繼而離心分離（15，0 0 0 r p m ，5分鐘），除去上澄液後，加入lm£2 7 5w/w%乙 醇，經攪拌洗淨。再之離心分離，除去上澄液、真空乾燥 後，加入1 me去離子水，充分攪拌。以酚硫酸法測定該液 中之全糖量（換算爲葡萄糖），做爲試驗之全糖。對照區 之反應係使用於1 0 0 °C熱處理1 0分鐘失活之圓孢芽孢 桿菌C 9由來、或圓孢芽孢桿菌c 1 1由來、圓孢芽孢桿 菌N7 5由來、球形節桿菌A 1 9由來之精製α -異麥芽 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -111 - 13 S 1- 7 五、發明説明（1Q9) 糖基葡糖質生成酶進行同樣試驗，做爲對照區之全糖量。 •葡萄糖生成量係依以下計算式計算。 計算式： 葡聚糖生成量（mg/2)=〔（試驗之全糖量）一（ 對照區之全糖量）〕x20 結果示於表2 7。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 由表2 7之結果可知，本發明之α: —異麥芽糖基葡糖 質生成酶即使作用於麥芽四糖亦不會成葡萄糖，即該α -異麥芽糖基葡糖質生成酶係實質上不具有生成葡聚糖之作 用，獲知該生成量係在檢測之臨界以下者。 實驗2 4 轉移受體特異性 以下試驗各種糖質會不會變成本發明酶的轉移受體。 調製D -葡萄糖、D -木糖、L-木糖、D -半乳糖、D 一果糖、D -甘露糖、D -阿拉伯糖、D -岩藻糖、D - 表 2 7 反應時間 (小時） - ------ 生成葡聚糖（mg/ml) C9酵素 C11酵素 N75酵素 A19酵素 4 0.0 0.0 0.0 0.0 8 0.0 0.0 0.0 0.0 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -112- 1312369 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（110) 僞果糖、L 一山梨糖、L —鼠李糖、甲基一 α —糖脊、甲 基-/3 -糖苷、Ν -乙醯基、葡萄糖胺、山梨糖醇、海藻 糖、異麥芽三糖、纖維二糖、龍膽二糖、甘油、麥芽糖醇 、乳糖、蔗糖、α -環狀糊精、Θ —環狀糊精、r -環狀 糊精 '及L 一抗壞血酸之溶液。 在此等濃度1 · 6之受體溶液中，加入做爲糖供體之 濃度4 %的澱粉部份分解物（Pinedex #100 )，對糖供體固 體物之每1 g分別加入各1單位之實驗4 - 2之方法所得 來自圓孢芽孢桿菌C 9之精製α -異麥芽糖基葡糖質生成 酶標品，實驗7 - 2之方法所得來自圓孢芽孢桿菌C 1 1 之精製之α -異麥芽糖基葡糖質生成酶標品，實驗1 1 一 2之方法所得來自圓孢芽孢桿菌Ν7 5之精製α -異麥芽 糖基葡糖質生成酶標品，實驗1 5 - 2之方法所得來自球 形節桿菌A 1 9的精製α -異麥芽糖基轉移酶標品，於 3 0 °C、ρ Η 6 . 0 (球形節桿菌A 1 9時係ρ Η 8 . 4 )作用2 4小時。受體爲單糖或三糖時係用氣相層析法（ 以稱爲G L C法），受體爲三糖以上時係用Η P L C法析 酶反應後之反應液，確認各糖會不會成爲此酶之轉移受體 。又，GLC中係用島津公司製「GC — l 6Α」爲 GLC裝置，管柱係用塡充G，L， Science 公司製「2 % Silcon OV-Chr.omosolve W」不錄鋼管柱（3mm0x 2m) ，載劑氣體係以流量4 0m£ /分鐘之氮氣，1 6 0°C〜 3 2 0 °C以7 · 5 °C /分鐘之速度昇溫，檢驗係以氫火焰 離子檢測器分析。HP L C中HP L C裝置係用東曹公司 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210 X 297公釐） ---- 裝 ^ 訂 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -113- 1312369 A7 B7 五、發明説明（111) 製「CCPD」，管柱係用「〇DS — A〇—303」（ YMC公司製），溶離液係以流速0.52/分鐘之水， 檢驗係以示差折射計分析。結果示於表2 8。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -114- 13
7 7 A B 五、發明説明（112) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 表2 8 糖 質 轉移生成物 C9酵素 C11酵素 N75酵素 A19酵素 D-葡萄糖 + + + + D-木糖 十+ + + + + + L-木糖 + + + + + + + D-半乳糖 + + + 土 D-果糖 + + + + D-甘露糖 — — — 土 D-阿拉伯糖 土 土 土 土 D-岩藻糖 + + + 土 D -僞果糖 + + + + L-山梨糖 + + + + L-鼠李糖 — 一 — — 甲基-糖苷 + + + + + + + + 甲基-/5 -糖苷 + + + + + + + + Ν-乙醯基葡萄糖胺 + + + — 山梨糖醇 — — — — 海藻糖 + + +十 + + 十+ 異麥芽糖 + + + + + + + + 異麥芽三糖 + + + + + + 土 纖維二糖 + + + + + + + + 龍膽二糖 + + + + + + + 甘油 + + + + 麥芽糖醇 + + + + + + + + 乳糖 + + + + + + + + 蔗糖 + + + + + + + + α -環狀糊精 — — — — yS -環狀糊精 — — — — τ -環狀糊精 — — — — L-抗壞血酸 + + + 十 表中 「-」示未檢出對受體之糖轉移物、 「土」示雖檢出對受體之糖轉移物，但其生成量爲1% 以下、 「+」示對，受體之糖轉移爲1以上1 0%以下、 「++」示對，受容體之糖轉移物爲1 0 %以上。 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -115 1312369 A7 B7 五、發明説明（113) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} 由表2 8結果可知，本發明之α -異麥芽糖基葡糖質 生成酶可做爲轉移受體供各種糖質利用。圓孢芽孢桿菌屬 之微生物C9株、Cl 1株及Ν75株由來之α -異麥芽 糖基葡糖質生成酶係尤其可充分轉移於D -及L -木糖、 甲基一 α -糖苷、甲基一；S—糖苷、海藻糖、異麥芽糖、 異麥芽三糖、纖維三糖、龍膽二糖、麥芽糖醇、乳糖及薦 糖、其次可轉移D -葡萄糖、D -果糖、D -岩藻糖、β -僞果糖、L -山梨糖、Ν-乙醯基葡荀糖胺、甘油及l -抗壞血酸，更可以轉移於D -阿拉伯糖、球形節桿菌Α 1 9由來之α -異麥芽糖基葡糖質生成酶係尤其可充分車專 移甲基一 α -糖符、甲基_ /5 -糖普、海藻糖、纖維二糖. 、麥芽糖、乳糖及蔗糖，其次可轉移D -葡萄糖、D-/ L 一木糖、D -果糖、D -僞果糖、L 一山梨糖、異麥芽 糖、龍膽二糖、甘油、及L -抗壞血酸，更可轉移d -半 乳糖、D -甘露糖、D -阿拉伯糖、D -岩藻糖及異麥芽 三糖。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 針對上述本發明之α -異麥芽糖基葡糖質生成酶的性 質，與先前曾報告的具有6 -葡萄糖基轉移作用的酶，
Bioscience Biotechnology and Biochemistry，第 5 6 卷，第 1 6 9〜1 7 3頁（1 9 9 2年）中記載的糊精。葡萄糖 酶、及日本農藝化學會誌第3 7卷，第6 6 8〜6 7 2頁 (1 9 6 3年）記載之轉葡糖苷酶相比較。結果示於表 9 Q 。 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -116 - 1312369 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（114) 表 2 9 性質 本發明之 α —異麥芽糖基葡糖質生成酶 精精·葡聚糖 酶 轉葡糖苷酶 C9酵素 C11酵素 Ν75酵素 Α19酵素 (對照） (對照） 水解能力 不會水解 不會水解 不會水解 不會水解 不會水解 主要會水解 最適pH 6.0-6.5 6.0 6.0 8.4 4.0-4.2 3.5 藉EDTA阻斷 被阻斷 被阻斷 被阻斷 被阻斷 不會阻斷 不被阻斷 由表2 9可知’本發明之α -異麥芽糖基葡糖質生成 酶係具有與已知之糊精•葡聚糖酶或轉葡糖苷酶完全不一 樣之理化學性質。 實驗25 生成環狀四糖 使用各種糖質，進行藉由本發明之α -異麥芽糖基葡 糖質生成酶及α -異麥芽糖基轉移酶之作用予以生成環狀 四糖的試驗。調製麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五 糖、直鏈澱粉，可溶性澱粉、澱粉部份分解物（商品名 Pinedex #100，松谷化學公司製）或糖原（牡蠣由來，和光 純藥公司販售）之溶液。
對固體每1 g以1單位之實驗7 - 2的方法所得圓孢 孢芽孢桿菌C 1 1由來之精製。α -異麥芽糖基葡糖質生 成酶標品，與對固體與1 g以1 〇單位之實驗7 一 3的方 法所得圓孢芽孢桿菌C 1 1由來之精製。α -異麥芽糖基 轉移酶標品加入上述所得濃度0 · 5 %水溶液，於3 0 °C 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 衣 ： 訂 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -117 - 1312369 A7 _ B7 五、發明説明（115) 、ρ Η 6 · 0作用。作用條件係以下述四個系進行。 (1 )使α -異麥芽糖基葡糖質生成酶作用2 4小時 ，使酶失活，繼而使a -異麥芽糖基轉移酶作用2 4小時 後，使酶失活。 (2 )使α -異麥芽糖基葡糖質生成酶與〇： -異麥芽 糖基轉移酶同時作用2 4小時後，使酶失活。 (3 )僅使α -異麥芽糖基葡糖質生成酶作用2 4小 時後，使酶失活。 (4)只使α-異麥芽糖基轉移酶作用24小時後， 使酶失活。 爲調查此等熱失活之反應液中的環狀四糖的生成量， 以與實驗1 一樣之α -葡糖酶•葡糖澱粉酶處理，水解殘 .存之還原性寡糖，以Η P L C法定量環狀四糖。此等結果 示於表3〇。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智楚財產局8工消費合作社印製 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -118- 1312369 Μ 7 Β 五、發明説明（116) 表 3 0 基質 環狀四糖生成量(％) α-異麥芽糖基葡糖 質生成酶作用使α-異麥芽糖基轉移酶作 用 α-異麥芽糖基葡糖 質生成酶與α-異麥 芽糖基轉移酶同時 作用 只有α -異 麥芽糖基轉 移酶作用 只有α -異麥 芽糖基葡糖 質生成酶作 用 麥芽糖 4.0 4.2 0.0 0.0 麥芽三糖 10.2 12.4 0.0 0.0 麥芽四糖 11.3 21.5 0.0 0.0 麥芽五糖 10.5 37.8 0.0 0.0 直鏈澱粉 3.5 31.6 0.0 0.0 可溶性澱粉 5.1 38.2 0.0 0.0 澱粉部份分解物 6.8 63.7 0.0 0.0 糖原 10.2 86.9 0.0 0.0 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 由表3 0之結果可知，測試之各糖質均只單獨依賴α -異麥芽糖基葡糖質生成酶及僅依賴α -異麥芽糖基轉移 酶作用，完全無法生成環狀四糖，與之相比，藉由倂用α -異麥芽糖基葡糖質生成酶與α -異麥芽糖基轉移酶則可 生成環狀四糖。其生成量係在使α -異麥芽糖基葡糖質生 成酶作用後，再使α -異麥芽糖基轉移酶作用時爲較低之 約1 1%以下，但同時使α -異麥芽糖基葡糖質生成酶與 α 一異麥芽糖基轉移酶作用時則各糖質之生成環狀四糖的 量可提高’尤其糖原時可增加至約8 7 %，澱粉部份分解 本祕尺度適用中國國家標準（⑽）Μ圖2獻2副 1312369 A7 B7 五、發明説明（117) 物則可增加至約6 4 % (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 此倂用α -異麥芽糖基葡糖質生成酶與α -異麥芽糖 基轉移酶可生成環狀四糖之作用機作係根據二酶反應特性 以推測應爲如以下者。 (1 )本發明之α -異麥芽糖基葡糖質生成酶係會作 用於糖原或澱粉部份分解物等之α - 1 ，4聚葡糖鏈的非 還原末端葡萄糖基，使該葡萄糖基分子間轉至其他α - 1 ’ 4聚葡糖鏈的非還原末端葡萄糖基之6位羥基，生成非 還原末端上具有α -異麥芽糖基之α - 1，4聚葡糖鏈。 (2)α-異麥芽糖基轉移酶係作用於非還原末端上 具有異麥芽糖基之α - 1 ，4聚葡糖鏈，使該異麥芽糖基 分子間轉移至其他非還原末端上具有異麥芽糖之α 一 1 ， 4聚葡糖鏈的非還原末端葡萄糖基之3位羥基，生成非還 原末端具有異麥芽糖一 1 ，3_異麥芽糖基之α 一 1，4 聚葡糖鏈。 (3 )繼而α -異麥芽糖基轉移酶係作用於其非還原 末端上具有異麥芽糖一 1 ，3 一異麥芽糖之α — l，4聚 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 葡糖鏈，藉由分子內轉移作用自α _ 1 , 4聚葡糖鏈切斷 異麥牙糖基- 1 , 3 -異麥芽糖基，環狀化生成爲環狀四 糖。 (4 )被切斷之α — 1 ，4聚葡糖鏈係再次受到（1 )至（3)的反應，再生成爲環狀四糖。因倂用^_異麥 芽糖基葡糖質生成酶與〇： 一異麥芽糖基轉移酶’而如上述 一酶可以重覆作用’增加環狀四糖的生成量。 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS〉A4^#TlT〇^297^tl-------- -120 - 1312369 A7 ____ B7 五、發明説明（118) 實驗2 6 澱粉液化程度之影響 使玉米澱粉成爲濃度15%澱粉乳，加〇 . 1 %碳酸 鈣，調整爲pH6 · 0，對每lg澱粉加入〇 . 2〜 2 -〇之α -澱粉酶（商品名：Tamameal 60L, Nobo公司製 )’於95 °C反應10分鐘，繼而於120 °C熱壓處理 20分鐘，驟冷爲約35°C，得DE3 . 2至20 . 5之 液化溶液，再對每1 g固體物加入2單位實驗7 - 2之方 法所得圓孢芽孢桿菌C 1 1由來之精製α -異麥芽糖基葡 糖質生成酶標品，對每1 g固體物加入2 0單位實驗7 -3之方法所得圓孢芽孢桿菌C11由來之精製α—異麥芽 糖基轉移酶標品，於3 5 t反應2 4小時。於1 〇 〇 °C熱 處理1 5分鐘使酵素失活。繼而與實驗1 一樣以α -配糖 酶及葡糖澱粉酶處理，水解殘存之還原性寡糖，以 HPLC法定量環狀四糖。結果示於表31。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 表3 1 α -澱粉酶之使用量每1單位澱粉(％) DE 環狀四糖生成率(％) 0.2 3.2 54.5 0.4 4.8 50.5 0.6 7.8 44.1 1.0 12.5 39.8 1.5 17.3 34.4 2.0 20.5 30.8 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） -121 - 1312369 A 7 __B7__ 五、發明説明（119) C请先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 由表3 1之結果可知，由本發明之α -異麥芽糖棊葡 糖質生成酶與α -異麥芽糖基轉移酶生成之環狀四糖係受 到澱粉之液化程度的影響，液化程度愈低，即D Ε値低時 ’自潑粉之環狀四糖的生成率高，相反，液化程度愈高’ 即D Ε値高時自澱粉之環狀四糖的生成率低。具體言，獲 知澱粉之部份分解程度係約2 0以下，較佳係D Ε約1 2 以下’更佳係D Ε約5以下爲最適宜。 實驗2 7 澱粉部份分解物濃度之影響 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 調製澱粉部份分解物「Paindex #100」（D Ε約2〜5 )之最後濃度0.5〜40%之水溶液，分別對固體物1 g加入實驗7 - 2方法所得圓孢孢芽孢桿菌C 1 1由來之 精製-異麥芽糖基葡糖質生成酶標品，與對固體物1 g 添加實驗7 - 3之方法所得圓孢芽孢桿菌C 1 1由來的精 製α -異麥芽糖基轉移酶標品，倂用二酶，於3 〇 °C， PH6 . ◦作用48小時後，於1〇〇 °c熱處理15分鐘 使酶失活。繼而與實驗1 一樣，使用α -配糖酶及葡糖澱 粉酶處理，水解殘存之還原性寡糖，以HP L C法定量環 狀四糖。此等結果示於表32。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -122 - 1312369 A7
7 B 五、發明説明（12〇) 表3 2 Paindex 濃度（％) 環狀四糖生成量（％) 0.5 63.6 2.5 62.0 5 60.4 10 57.3 15 54.6 20 51.3 30 45.9 40 39.5 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 由表3 2之結果可知，澱粉部份分解物之濃度爲 0 _ 5%低濃度時，環狀四糖之生成量係約6 4%，濃度 4 0%之高濃度時則環狀四糖之生成量係約4 0%，可是 基質之澱粉部份分解物的濃度對環狀四糖的生成量有極大 相關關係。由此結果可知，環狀四糖的生成量係澱粉部份 分解物爲愈低濃度，其生成量有愈高之趨向。 實驗2 8 添加環糊精聚葡糖基轉移酶之效果 調製濃度1 5 %之澱粉部份分解物「Paindex #100」水 溶液對毎1 g固體物加入1單位之實驗7 - 2之方法所得 圓孢芽孢桿菌C 1 1由來之精製α -異麥芽糖基葡糖質生 成酶標品，與對每1 g固體物加入1 0單位實驗7 - 3之 方法所得C 1 1株由來之精製α -異麥芽糖基轉移酶標品 ，與對每1 g固體物加入0〜0 . 5單位嗜熱脂肪芽孢桿 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公嫠） -123 - 1312369 Α7 ____Β7 __ __ 五、發明説明（杈1)
菌由來的環糊精聚葡糖轉移酶（CGTase) ’倂用三 種酶於3 0 °C，p Η 6 . 0作用4 8小時後，於1 〇 ◦ °C (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 熱處理15分鐘使酶失活。繼而與實驗1一樣使用α-配 糖酶及葡糖澱粉酶處理，水解殘存之還原性寡糖’以 HP L C定量環狀四糖。此等結果示於表3 3。 表 CGTase添力口量（單位） 環狀四糖生成量（％) 0 54.6 2.5 60.1 5 63.1 10 65.2 由表3 3結果可知，添加CGT a s e可增加環狀四 糖之生成量。 實驗29 調製環狀四糖 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 調整玉米由來之植物糖原（Qupee公司製）水溶液（約 1〇〇《）爲濃度 4w/v%、pH6 . 0，溫度 30°c 後，對每1 g固體物加入1單位實驗7 - 2之方法所得精 製α -異麥芽糖基葡糖質生成酶標品，與對每1 g固體單 位添加1 0單位實驗7 - 3之方法所得精製α -異麥芽糖 基轉移酶標品，使其作用4 8小時後，於1 0 〇 °C熱處埋 1 0分鐘使酶失去活性。取一部份此反應液，以Η P L c 本紙張尺度適用中.國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 124- 1312369 經濟部智慧財產局Μ工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（122) 調查環狀四糖生成量，結果糖組成爲約8 4%。調整此反 應液爲PH5 . 0’溫度45¾後，與實驗1—樣，用α -配糖酶及葡糖澱粉酶處理、水解殘存之還原性寡糖等， 再以氫氧化鈉調整爲Ρ Η 5 _ 8，保持於9 0 °C 1小時 使酶失活，過濾，除去不溶物。使用逆滲透膜濃縮此濾液 至固體濃度約1 6 %爲止後，依常法脫色、脫鹽、過濾、 濃縮，得含約3，7 0 0 g固體成份之約6 . 2 k g糖液 。所得糖液以Organo製離子交換樹脂（Amberlite C R -1310 ，Na型）塡充之管柱（凝膠量約225彡）處 理，在管柱內溫度6 0 °C，流速約4 5 小時條件進行 層析分離。以實驗1記載之Η P L C法監視溶出液之組成 ，回收環狀四糖純度爲9 8 %以上之餾份，依常法脫鹽、 脫色、過濾、濃縮，結果得到約7 . 5 k g之含約 2，5 0 0 g固體成份之糖液。以Η P L C法測定所得糖 液之糖組成，環狀四糖之純度係約9 9 . 5 %。 實驗3 0 自環狀四糖之水溶液結晶化 以蒸發器使實驗2 9之方法所得純度約9 8 %以上之 環狀四糖餾份濃縮爲固體物濃度約5 0 %後，將所得約5 k g濃縮糖液放入圓筒狀塑膠容器，一邊慢慢旋轉，一邊 以約2 0小時之時間使溫度自6 5 °C降至2 0 °C，使其晶 析、得白色結晶狀粉末。於圖4 5示其顯微鏡照片。繼而 使用離心過濾器分蜜，以濕重量1 , 3 6 0 g回收結晶狀 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） —-------„IT (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -125 - 1312369 A7 B7 五、發明説明（123) 物。再於6 0 °C乾燥3小時，得1， 1 7 0 g環狀四糖結 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 晶狀粉末。以Η P L C測定所得結晶狀粉末的糖組成，結 果環狀四糖之純度係9 9 . 9 %以上之極高純度者。 以粉末X射線繞射法分析此環狀四糖的結晶狀粉末， 結果如圖4 6所示，得到做爲主要繞射角（2 0 )有 10.1。 ，：L5.2。，20. 3。及 25. 5。爲特徵 之繞射譜。又’以卡爾費歇( Karl-Fischer )法測定此結晶 狀粉末的水份時獲知其水份爲1 3 . 0 %，又爲每1分子 環狀四糖含5〜6分子水之結晶。 另外，熱重量測定此環狀四糖之結晶粉末時得圖4 7 所示熱重量曲線，由其重量變化與溫度間之關係，昇溫爲 溫度1 5 0 °C爲止溫度時，確認可減少相當於4〜5分子 水之重量，繼而於溫度2 5 0 t附近確認減少相當於1分 子之水’更於溫度2 8 附近可推測環狀四糖本身之熱 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 分解的重量減少。由此等結果可知，本發明之環狀四糖5 〜6含水結晶係常壓下，昇溫至1 5 0 °C時可以每一結晶 分子脫去4〜5分子水而成爲含1分子水之結晶，更可在 溫度2 5 0 °C附近自結晶脫去1分子水而成無水結晶。 實驗3 1 變換爲環狀四糖i含水結晶 將實驗3 0之方法所得環狀四糖5〜6含水結晶粉末 放入玻璃容器中，保持此玻璃容器於預先保溫於溫度 1 4 0 °C之油浴中3 〇分鐘。以粉末X射線繞射法分析所 本紙張尺度適用中.國國家標準（CNS)八4規格（210x29?公釐） -126- 1312369 Α7 Β7 五、發明説明（124) 待is狀四糖粉末，結果與熱處理前之5〜6含水結晶之粉 末X射線繞射不同，得如圖4 8所示，做爲主要繞射角（ 20)具有8·3。 ，ι6.6。 ，17.◦。及18·2 。爲特徵之繞射譜。以卡爾·費歇法測定此結晶狀粉末的 水份時’獲知其水份爲約2 · 7 %，係爲每1分子環狀四 糖含1分子結晶水者。另外，熱重量測定此結晶粉末，得 第4 9圖所示熱重量曲線’由其重量變化與溫度之關係可 知’於温度2 7 0 °C附近確認減少相當於1分子水之重量 ’更於溫度2 9 0 °C附近觀察到可能爲環狀四糖本身之熱 分解的重量減少。由此等可判斷，本發明之環狀四糖結晶 狀物係1含水結晶。 實驗3 2 變換爲無水結晶 以溫度4 0 °C或1 2 0。(：分別真空乾燥1 6小時實驗 3 0之方法所得環狀四糖5至6含水結晶粉末。以卡爾· 費歇法測定所得環狀四糖粉末之水份，結果溫度4 〇 〇c真 空乾燥者水份爲約4 _ 2 %，溫度1 2 0 °C真空乾燥者水 份爲約0 . 2 %，可判斷其爲實質上無水者。以X射線繞 射法分析此等真空乾燥之環狀四糖粉末時發現其與真空乾 燥前之5〜6含水結晶之粉末X線繞射及1含水結晶者完 全不同，得到如圖5 0 (真空乾燥溫度40。(：），圖5 1 (真空乾燥溫度1 2 〇它）所示，做爲主要繞射角（2 θ )具有 10. 8。 ，14.7。、15.〇。 ，15.7。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） ---------— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -127 - 1312369 A7 ____ B7 五、發明説明（125) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本貫) 及2 1 . 5 °爲特徵之繞射譜。二繞射譜間之巔値強度雖 有強弱，但基本上巔値之繞射角（2 Θ )係相同者，由結 晶學上判斷其爲相同之無水結晶。又，繞射譜之底線係呈 山狀，與真空乾燥前之環狀四糖5〜6含水結晶者，及工 含水結晶者相比晶化度降低’判斷有非結晶狀態（非晶形 )之環狀四糖存在。由此推測，真空乾燥4 〇 t時之水份 爲含約4 · 2 %的環狀四糖粉末係混雜含其水份之環狀四 糖非晶物，與環狀四糖無水結晶在內之粉末。 由以上可知’真空乾燥環狀四糖5〜6含水結晶粉末 時’ 5〜6含水結晶會失去水分子，變換爲非結狀態非晶 物與無水結晶。又，與實驗3 1 —樣熱重量分析水份 〇· 2%的無水環狀四糖粉末時，觀察到如圖5 2所示， 只觀察到於溫度2 7 0 °C附近可能爲環狀四糖之熱分解的 重量減少現象。 實驗3 3 環狀四糖對水之飽和濃度 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 爲調查環狀四糖在溫度1 0〜9 0 °C水之飽和濃度， 於可以栓住密封之玻璃製容器放入1 〇 2水，在其中放入 各溫度可完全溶解之量以上的量之實驗3 0方法所得環狀 四糖5〜6含水結晶，密封玻璃容器，保溫於溫度1 0〜 9 0 °C攪拌二天。精密過濾各溫度之環狀四糖飽和溶液， 除去未溶解之環狀四糖後，以乾燥減量法調查其濾液之水 份，求得各溫度之飽和濃度。結果示於表3 4。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -128 - 1312369 A7 __B7 五、發明説明（126) 表 3 4 溫度（t:) __®和濃度（％ Ί 10 --___30.3 30 34.2 50 ___42.6 70 . 53.0 90 70.5 實驗3 4 熱安定性 調製溶解實驗3 0方法所得環狀四糖5〜6含水結晶 爲濃度1 Ow/ν%的環狀四糖水溶液，取8 4該溶液於 玻璃製試管，密封後，於1 2 0 °C加熱3 0〜9 0分鐘。 放冷後測定此等溶液之著色度與以Η P L C法測定純度。 著色度係以4 8 0 nm下之l cm管的吸光度爲準，結果 示於表3 5。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 表 加熱時間（分） 著色度（Ams) 純度（％) 0 0.00 100 30 0.00 100 60 0.00 100 90 0.00 100 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） -129- 1312369 A7 ____ B7 五、發明説明（127) 由表3 5之結果可知，環狀四糖水溶液係加熱至 1 2 0 °C之咼温亦不會著色，亦不會降低糖組成之純度 可知環狀四糖係對熱安定之糖質。 實驗3 5 P Η安定性 溶解實驗3 0之方法所得環狀四糖5〜6含水結晶於 各種緩衝液（2 0 m Μ )，調製環狀四糖爲濃度4 w/ ν %，p Η 2〜1 0之環狀四糖溶液。分別取8 溶液於玻 璃製試管，密封後，於1 0 0 t加熱2 4小時。放冷後測 定此等溶液之著色度，以及以Η P L C法的純度測定。著 色度係以4 8 0 nm中1 cm管之吸光度爲準，結果示於 表3 6 。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨Ο X 297公釐） -130- 1312369 A7 B7 五、發明説明（128) 表 3 6 pH(緩衝液之種類） 者色度（A480nm) 純度（％) 2.0(乙酸） 0.00 93 3.0(乙酸） 0.00 100 4.0(乙酸） 0.00 —— · 100 5.0(乙酸） 0.00 100 6.0(Tris-鹽酸） 0.00 100 7.0(Tris-鹽酸） 0.00 100 8.0(Tris-鹽酸） 0.00 ~ 100 9.0(氨） 0.00 100 10.0(氨） 0.00 -----—---- -- ------- 100 一 ---------— (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 由表3 6之結果可知，環狀四糖係於1 q q 高溫加 熱24小時，亦於PH2〜10廣範圍不會著色，ph2 時糖純度雖稍降低，但p Η 3〜1 0範圍則完全不會降低 糖組成之純度，環狀四糖係以廣範圍Ρ Η範圍、換言之於 ρ Η 3〜5的酸性時，Ρ Η 6〜8之中性時，ρ Η 9〜 1 0之鹼性時均經煮沸亦爲極安定之糖質。 實驗3 6 胺羰基反應 溶解實驗3 0方法所得環狀四糖5〜6含水結晶於水 ，再加入市販試藥特級之甘胺酸與磷酸緩衝液’調製爲以 50mM磷酸緩衝液調整爲ΡΗ7·0之含1 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -131 - 1312369 B7 五、發明説明（129) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 胺酸的1 0 w/ V %環狀四糖溶液。取4 4該溶液於玻璃 製試管，密封後於1 0 0 °C加熱3 0〜9 0分鐘。於室內 放冷後，測定此等之著色度，調查胺羰基反應性。著色度 係4 8 0 nm下1 cm管之吸光度評估，結果示於表3 7 莩 3 7 加熱時間（分） 著色度（A 4 8。Π m ) _ 0 0.00 30 0.00 60 0.00 90 0.00 由表3 7之結果可知，環狀四糖係甘胺酸共存下加熱 亦不會著色，不會與甘胺酸引起褐度，換言之，係很難引 走胺羰基反應（亦稱爲美拉德反應）之安定的糖質。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 實驗3 7 胺羰基反應 溶解實驗3 0方法所得環狀四糖5〜6含水結晶與市 販之多腺（日本製藥製）於脫離子水，調製爲含5w/v %多腺之1 0 w/ v %環狀四糖溶液。取4 2該溶液於玻 璃製試管，密封後於1 2 0 °C加熱3 0〜9 0分鐘。於室 內放冷後，測定此等之著色度以調查胺羰基反應性。同時 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） -132 - 1312369 A7 B7 五、發明説明（彳30) 以只含多腺的溶液爲對照區，同樣加熱。著色度係以 4 8 0 n m下之1 c m管的吸光度爲準，以減去對照區之 吸光度値表不。結果示於表3 8。 表 3 8 加熱時間（分） 著色度（A48flnn〇 0 0.00 30 0.00 60 0.00 90 0.00 由表3 8之結果可知，環狀四糖係在多腺共存下加熱 亦不會與多腺引起褐變，換言之係很難引起胺羰基反應之 糖質。 實驗3 8 包合作用 溶解實驗3 0方法所得環狀四糖5〜6含水結晶於脫 離子水，調製爲2 0 %水溶液。每1 〇 〇 g該水溶液中加 入2g甲醇，3g乙醇，4 · 乙酸進行包含。其後分 別過濾，凍結乾燥濾液，除去未包合物。做爲對照使用習 知具有包合能力之支鏈環化環糊精（商品名Isoelite P. maruha公司販賣）。 爲測定凍結乾燥粉末中之包合物量，分別勝1 g凍結 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210X297公釐） ----------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部智慧財產局R工消費合作社印製 -133 - 1312369 A7 _ B7 ____ 五、發明説明（131) 乾燥粉末溶解於5 4脫離子水’分別加入5 rn£二乙酸進行 萃取，再次重覆萃取後，以氣相層析法定量二乙醚中之萃 取物。結果示於表3 9。 表 3 9 包合物 包合量（mg/g-凍結乾燥粉末） 環狀四糖 I s 〇 e 1 i t e p (對照） 甲醇 6.71 2.92 乙醇 17.26 8.92 乙酸 67.74 30.57 實驗3 9 甜味度 溶解實驗3 0方法所得環狀四糖5〜6含水結晶於脫 離子水，調製爲每一固體1 〇〜3 0 %水溶液，以此等水 溶液做爲甜味度試驗溶液。另一方面以蔗糖（市販砂糖） 6 %水溶液爲準，以8名官能測試者進行官能試驗。結果 環狀四糖之甜味度係蔗糖之約2 7%。 實驗4 0 消化性試驗 使用實驗3 0方法所得環狀四糖5〜6含水結晶，依 照「曰本營養食糧學會誌」第4 3卷2 3〜2 9頁（ 1 9 9 0年）記載之岡田等之方法’調查在試管內藉由唾 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -- -134- ---------- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作杜印製 1312369 A7 B7___ 五、發明説明（132) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 液澱粉酶，合成胃液、胰臟液澱粉酶、小腸粘膜酶之環狀 四糖的消化性。對照係用做爲難消化性糖質爲習知之麥芽 糖醇。結果示於表4 0。 表 4 0 消化酶 消化酶之分解率（％) 環狀四糖 麥芽糖醇（對照） 唾液殿粉酶 0.0 0.0 合成胃液 0.0 0.0 胰臟液 0.0 0.0 小腸粘膜酶 0.74 4.0 由表4 0之結果可知，環狀四糖係完全不會藉由唾液 澱粉酶、合成胃液、胰臟液澱粉酶予以消化者，雖可稍被 小腸粘膜酶所消化，但只爲0 · 7 4 %之低値程度而已， 等於對照之難消化性糖質麥芽糖醇的1 / 5以下，可見環 狀四糖係很難消化之糖質。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 實驗4 1 發酵性試驗 使用實驗3 0方法所得環狀四糖5〜6含水結晶，依 據 Journal of Nutritional Science and Vitaminology 37 卷 529〜544頁（1991)所記載之Oku等方法， 調查老鼠盲腸內容物對環狀四糖的發酵性。盲腸內容物係 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X297公釐） ' -135- 1312369 A7 ___B7 五、發明説明（133) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 用於乙醚麻醉下屠殺Wister系雄鼠，厭氣下採取，懸濁於 4倍量之〇 . 1 Μ碳酸氫鈉水溶液者。對每單位重量之肓 腸內容物添加約7 %環狀四糖，添加後及1 2小時後殘存 之環狀四糖量係以氣相層析法定量。結果添加後立即測出 之環狀四糖濃度係每lg盲腸內容物爲6 8 . Omg， 1 2小時後之每1 g盲腸內容物之環狀四糖濃度係 6 3 . Omg，可見具有9 3%未被發酵而殘留，獲知環 狀四糖係極不易發酵之糖質。 實驗4 2 同化性試驗 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 使用實驗3 0之方法所得環狀四糖5〜6含水結晶， 依據「腸內flora與食物因子」，光岡知足編，學會出版中 心（1 9 8 4年）記載之方法，調查各種腸內細菌之同化 性。即，將預先培養之新鮮菌接種約1 0 7 C F U於5 i添 加0 . 5%環狀四糖之PYE培養基、厭氣條件下於 3 7 °C培養4天。對照係使用易於被同化之糖質葡萄糖。 同化性之判斷係培養後之培養液的P Η爲6 . 0以上時， 不被同化爲（-)，6 . 0以下時爲做爲被同化（+ )。 另外以蒽酮法測定培養液中殘存之糖質，調查糖質之減少 量，確認同化性之判定。結果示於表4 1。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） -136- 1312369 五、發明説明（134) 表 4 1 同化性 膠內細菌株 璁狀四糖 葡萄糖（對照） 黏液擬桿菌 JCM5 826 一 青春雙岐桿菌 JCM1275 一 產氣莢膜梭菌 JCM3816 一 + 大腸桿菌 IFO3301 — 產氣真桿菌 ATCC25986 一 嗜酸乳桿菌 JCM1132 — (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -St Γ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 由表4 1之結果可知’環狀四糖係不被試驗之任何腸 內細菌株同化’對照之葡萄糖則均被同化，所以可知環狀 四糖係很難被腸內細菌同化之糖質。 實驗4 3 急性毒性試驗 使用小鼠，經口投予實驗3 0之方法所得環狀四糖高 含水結晶，進行急性毒性試驗。結果確認環狀四糖係低毒 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐) -137 -
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（135) 性物質，即使在投予可能之最大投予量亦未見死亡例。因 此其LD5Q値係爲5 0 g/k g小鼠體重以上。 由以上之實驗4 0至4 3之結果可知，經口攝取環狀 四糖亦很難被消化，吸收，做爲無熱量至低熱量之可食材 料可以有利地利用於減肥甜味料，高甜味度甜味料之賦形 劑，減肥飲食物之增粘劑、增量劑、賦形劑，更可做爲食 物纖維，脂肪代替食品材料等利用。 以下於實施例A示本發明之環狀四糖，含其之糖質的 製造方法，實施例B示含有環狀四糖，含其糖質所成之組 成物。 實施例A — 1
依實驗3之方法，在發酵器培養4 8小時圓孢芽孢桿 菌C9 (寄存號碼CCRC 9 10 17 1)。培養後使 用SF膜除菌過濾，回收約18 <之培養濾液’再以UF 膜濃縮該濾液，回收約1 <含8 · 8單位/W本發明之《 一異麥芽糖基葡糖質生成酶與26.7單位/Ja-異麥 芽糖基轉移酶的濃縮酶液。 使馬鈴薯澱粉乳爲濃度約2 %澱粉乳’加入氯化鈣使 其爲最後濃度ImM，調整爲pH6 . 0，於9 5°C加熱 約2 0分鐘進行糊化’繼而冷却爲約3 5 °C ’對每1 g澱 粉固體物加入◦· 5m£含上述方法中調製之—異麥芽糖 基葡糖質生成酶、與α -異麥芽糖基轉移酶的濃縮酶液’ 於ρ Η 6 . 0，溫度3 5 °C反應4 8小時。加熱該反應液 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁)
-138- !312369 Α7 Β7 五、發明説明（136) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 爲9 5 °C保持1 0分鐘後’經冷却’依常法以活性碳脫色 過濾所得濾液’藉由Η型及◦ η型離子交換樹脂脫鹽，精 製’更加以濃縮，噴霧乾燥，對每單位原料澱粉固體物以 收率約9 0 %得含環狀四糖粉末。 本品係以固體單位而言含〇 _ 7%葡荀糖、1 . 4% 異麥芽糖、1 1 . 1%麥芽糖、62 . 1%環狀四糖、及 2 4 . 7 %其他糖質’具有溫和之甜味、適度之粘度、保 濕性、包合性，做爲甜味料、呈味改良劑、品質改良劑、 離水防止劑、安定劑、賦形劑、包合劑、粉末化基材等可 以有利地利用於各種飮食物、化粧品、醫藥品等之組成物 實施例A — 2 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 使馬鈴薯澱粉成爲濃度6 %之澱粉乳，加入碳酸鈣使 其濃度0 · 1%，調整爲pH6 . 5，對每lg澱粉固體 物加入α —殺粉酶劑（Nobo公司製，商品名「Tarmameel 60L」）使其可成爲0 . 2 %，於9 5 °C反應1 0分鐘，繼 而於1 2 Ot熱壓2 0分鐘，急速冷卻爲約3 5°C，得 D E約4之液化溶液，對每1 g澱粉固體物以0 · 2 5 2 比率加入含實施例A - 1方法調製之α -異麥芽糖基葡糖 質生成酶與α -異麥芽糖基轉移酶的濃縮酶液，於ρ Η 6 · 0，溫度3 5 °C反應4 8小時。加熱該反應液爲9 5 t保持1 0分鐘後，經冷却，依常法以活性碳脫色過濾所 得濾液，藉由Η型及0H型離子交換樹脂脫鹽，精製，再 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） ' -139 - 1312
I A7 B7 五、發明説明（_) 137 予濃縮，含濃度6 0%之環狀四糖之糖漿係每單位原料殿 粉固體物而言，以收率約9 0 %獲得。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本品係單位固體含有0.9%葡萄糖'1·5%異麥 芽糖、11 . 3%麥芽糖、60 . 1%環狀四糖、及 26 · 2%其他糖質，具有溫和之低甜味、適度之粘度' 保濕性、包合性、做爲甜味料、呈味改良劑、品質改良劑 、防離水劑、安定劑、賦形劑、色合劑、粉末化基材等可 以有利地利用於各種飲食物、化粧品、醫藥品等之組成物 0 實施例A - 3 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 依實驗3之方法，在發酵器培養4 8小時圓孢芽孢桿 菌Cll (CCRC 910172)。培養後使用 SF膜除菌過濾，回收約18 <之培養濾液，再以UF膜 濃縮該濾液，回收約1 <含9 . 0單位/ 本發明之α — 異麥芽糖基葡糖質生成酶與3 0 . 2單位α -異麥 芽糖基轉移酶之濃縮酶液。使木薯澱粉成爲約2 5%濃度 之澱粉乳，對每1 g澱粉固體物加入0 · 2 % -澱粉 酶（商品名：Neospitase、Nagase生化學工業公司製），於 8 5〜9 0°C反應約2 0分鐘，繼而於1 2 〇°C熱壓處理 2 0分鐘，再急速冷却至3 5 °C，將D E約4之液化溶液 。對每1 g澱粉固體物添加0 . 2 5 J含上述方法所調製 之α -異麥芽糖基葡糖質生成酶與α -異麥芽糖基轉移酶 的濃縮酶液，對每1 g澱粉固體物再添加1 〇單位環麥芽 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -140- 1312369 A7 B7 五、發明説明（138) 糖糊精聚葡糖轉移酶（林原生物化學硏究所製），於？ Η 6 . 0，溫度3 5 °C，反應4 8小時。於9 5 °C保持該反 應30分is後’g周整爲pH5 . 0，溫度5〇°C後，對每 1 g固體物加入3 0 0單位之〇： -配糖酶劑（商品名：「 Transglucosidase L、Amano」，天野製藥公司製），對每1 g固體物再加入3 〇單位葡糖激粉酶劑（商品名r Glucoteam」長瀨生化學公司製），反應1 7小時，加熱該 反應液爲9 5 C ’保持3 0分鐘後’經冷却，依常法以活 性碳脫色過濾所得濾液，藉由Η型及〇 η型離子交換樹脂 脫鹽，精製，再予濃縮，對每單位原料澱粉固體物以收率 約90%得濃度60%之含環狀四糖的糖漿。 此糖漿係以固體單位而言含38.4%葡萄糖、 58 · 1%環狀四糖 '及3 _ 5%其他糖質，具有溫和之 甜味適度之粘度、保濕性、包合性，做爲甜味料、呈味改 良劑、品質改良劑、離水防止劑、安定劑、賦形劑、包合 劑、粉末化基材等可以有利地利用於各種飮食物、化粧品 、醫藥品等之組成物。 實施例Α - 4 使玉米澱粉成爲濃度2 0 %之澱粉乳，加入碳酸鈣使 其濃度0 . 1%，調整爲PH6 _ 5，對每lg澱粉加入 α -激粉酶劑（Nobo公司製’商品名「Tarmameel 60L」） 使其可成爲0 · 3%，於9 5 °C反應1 5分鐘，繼而於 1 2 0 °C熱壓2 0分鐘，急速冷卻爲約3 5 °C，得D E約 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS〉A4規格（210X297公釐） ---------— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -s 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -141 - 1312369 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（彳39) 4之液化溶液，在每1 g澱粉固體物加入〇 · 2 52實施 例A - 3之方法所得含α -異麥芽糖基葡糖質生成酶與α -異麥芽糖基轉移酶之濃縮酶液，對每1 g澱粉固體物再 添加1 0單位環麥芽糖糊精聚葡糖轉移酶（林原生物化學 研究所製），於P Η 6 · 0，溫度3 5 °C，反應4 8小時 。於95 t保持該反應30分鐘後’調整爲PH5 . 0， 溫度5 0 °C後，對每1 g固體物加入3 0 0單位之α —配 糖酶劑（商品名：「Transglucosidase L、Amano」，天野製 藥公司製），對每lg固體物再加入30單位葡糖澱粉酶 劑（商品名「Glucoteam」長瀨生化學公司製），反應17 小時，加熱該反應液爲9 5 °C，保持3 0分鐘後，經冷却 ，依常法以活性碳脫色過濾所得濾液，藉由Η型及◦ Η型 離子交換樹脂脫鹽，精製，再予濃縮，對每單位原料澱粉 固體物以收率約9 0%得濃度6 0%之含環狀四糖的糖漿 〇 此糖漿係以固體單位而言含34.2%葡萄糖、 62 · 7%環狀四糖、及3 · 1%其他糖質，具有溫和之 甜味適度之粘度、保濕性、包合性，做爲甜味料 '呈味改 良劑、品質改良劑、離水防止劑、安定劑' 賦形劑、包合 劑、粉末化基材等可以有利地利用於各種飮食物、化粧品 、醫藥品等之組成物。 實施例Α - 5 使用強酸性陽離子交換樹脂（Amberlist CR-1310，Na型 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ' -142 - ---------— (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 1312369 A7 B7 五、發明説明（140) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
Organo公司製）對實施例A - 3之方法所得含環狀四糖之 糖液進行管柱分餾。將樹脂塡充於4支內徑5 . 4 cm附 套不銹鋼製管柱，直排連接使樹脂層之全長爲2 〇m。維 持管柱內溫度爲6 0 °C，對樹脂加入5 v / v %糖液，以 S V 0 . 1 3灌入6 0 °C溫水予以分餾，以η P L法監 視溶出液之糖組成，採取高含環狀四糖之餾份，經精製以 固體單位之收率約2 1 %得到高含環狀四糖液。此高含有 液係固體單位約含約9 8%之環狀四糖。 濃縮上述溶液爲約7 0 %濃度後，放入助晶罐中，加 入約2 %環狀四糖5〜6含水結晶做爲晶種，得晶出率約 4 5%的糖膏。自乾燥塔上的噴嘴以1 5 0 k g/cm2高 壓噴霧此糖膏。同時自乾燥塔上方送入8 5 t熱風，在底 部所設移送用金屬網輸送帶上搜集結晶粉末，自輸送帶下 方一邊送4 5 °C溫熱風，將該粉末慢慢移動至乾燥塔外， 取出。將此結晶粉末塡充於熟成塔，一邊送溫風，一邊使 其熟成1 0小時，完成晶化與乾燥，得環狀四糖5〜6含 水結晶粉末。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 此品係實質上還原性極低，很難引起胺羰基反應，亦 不具吸濕性，很容易保存處理，具有溫和的低甜味，適度 之粘度、保濕性、包合性、難消化性 '做爲甜味料、低熱 量食品材料、呈味改良劑 '風味改良劑、品質改良劑、防 離水劑、安定劑、賦形劑、包合劑、粉末化基材等，可以 有利地利用於各種飮食物、化粧品、醫藥品等組成物。 本紙張尺度適用中周國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） -143- 1312369 A7 B7 五、發明説明（141) 實施例A - 6 依據實施例A - 4之方法所得含環狀四糖之糖漿做爲 原糖液，爲提尚環狀四糖之含量，依實施例A - 5之方法 ，使用鹽型強酸性陽離子交換樹脂對此糖液進行管柱分餾 ，採取高含環狀四糖餾份，以固體單位得收率約6 0 %的 高含環狀四糖液。此高含有液係以固體單位言含約9 0 % '之環狀四糖。 濃縮此溶液爲約8 5 %濃度後，繼而移至助晶機，一 邊攪拌一邊徐冷予以助晶，將其取出置於塑膠製盤中，放 置於室溫2天，調製結晶出熟成之塊狀物。繼而以削切機 粉碎此塊狀物，得環狀四糖5〜6含水結晶粉末。 此品係實質上不具吸濕性，很容易保存處理，具有溫 和的低甜味，適度之粘度、保濕性、包合性、難消化性、 做爲甜味料、低熱量食品材料、呈味改良劑、風味改良劑 、品質改良劑、防離水劑、安定劑、賦形劑、包合劑、粉 末化基材等，可以有利地利用於各種飮食物、化粧品、醫 藥品等組成物。 實施例A - 7 一邊濃縮實施例A - 6之方法所得高含環狀四糖液’ 一邊連續使其晶析，以籃型離心分離機分離所得糖膏’以 少量水噴霧結晶，經洗淨，以固體物單位得約5 5 %收率 之高純度環狀四糖5〜6含水結晶。 此品係固體單位而言爲純度9 8 %以上之高純度環狀 本纸银尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ---------— (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -144 -
142 四糖5〜6含水結晶，還原性極低，很難引起胺羰基反應 ’亦不具吸濕性，很容易保存處理，具有溫和的低甜味， 適度之粘度、保濕性、包合性、難消化性、做爲甜味料、 低熱量食品材料、呈味改良劑、風味改良劑、品質改良劑 、防離水劑、安定劑、防變色劑、賦形劑、包合劑、粉末 化基材等，可以有利地利用於各種飲食物、化粧品、醫藥 品等組成物，更可以有利地利用於工業試藥、化學原料等 0 實施例A — 8 在容量3 0 <之發酵器中放入約2 0 <之由5 . Ow /V%玉米由來之植物糖原，1·〇w/v%酵母萃取物 「Asahimist」、〇 · lw/v% 磷酸二鉀、0 . 06w/ v%磷酸—鈉· 12水鹽、0 . 05w/v%硫酸鎂· 7 水鹽及水所成液體培養基，於1 2 1 t殺菌2 0分鐘，冷 却後使溫度爲2 7 °C後，接種依實驗6之方法種培養之圚 孢芽孢桿菌Cl 1 (CCRC 910172)之種培養 液，保持於27t溫度，PH6 · 0至7 · 0，通氣攪拌 培養液7 2小時。於1 2 1 °C，加熱殺菌該培養液2 0分 鐘後，冷却、離心分離、回收其上澄液’再以U F膜過濾 該上澄液，依常法用活性碳脫色所得濾液’以Η形及◦ Η 形離子交換樹脂脫鹽，經精製，對每單位原料植物糖原固 體物以收率4 0 %得含環狀四糖液體。此液體係每單位固 體物含約8 7 %環狀四糖。 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（2丨0X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 Φ. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -145- A7 B7
1麵II 五 明 説明發 43 T— -邊濃縮此環狀四糖含液’ 一邊連續晶析，所得精密 以籃形離心分離機分蜜，以少量水噴霧結晶，經洗淨，對 原料植物糖原單位固體以收率約2 5%得純度9 8 %以上 之高純度環狀四糖5〜6含水結晶。 此品係高純度環狀四糖5〜6含水結晶，還原性極低 ，很難引起胺羰基反應，亦不具吸濕性，很容易保存處理 ’具有溫和的低甜味，適度之粘度 '保濕性、包合性、難 消化性、做爲甜味料 '低熱量食品材料、呈味改良劑、風 味改良劑、品質改良劑、防離水劑、安定劑、防變色劑、 賦形劑、包合劑、粉末化基材等，可以有利地利用於各種 飲食物、化粧品、醫藥品等組成物，更可以有利地利用於 工業試藥、化學原料等。 實施例A _ 9 依實驗1 0之方法’在發酵器培養4 8小時圓孢芽孢 桿菌N75 (CCRC 910173)。培養後使用 S F膜除菌過據，回收約1 8 <之培養濾液，再以u F膜 濃縮該濾液’回收約1 <含6 · 〇單位/w本發明之α 一 異麥芽糖基葡糖質生成酶與2 0 . 〇單位/da —異麥芽 糖基轉移酶之濃縮酶液。使玉米澱粉成爲約3 〇 %濃度之澱 粉乳’加入0 · 1%碳酸鈣於其中，調整爲PH6 · 5 ， 對每1 g澱粉固體物加入0 · 3 % a —澱粉酶（商品名 :Tamameal 60L Nobo公司製），於9 5°C反應約15分鐘 ，繼而於1 2 0°C熱壓處理2 0分鐘，再急速冷却至 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 ^9·. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -146- 1312369 A7 B7 五、發明説明（144) (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 5 1°C，將DE約4之液化溶液。對每1 S殿粉固體物添 加0 _ 4 Otn«含上述方法所調之01 -異麥芽糖基葡糖質生 成酶與α 一異麥芽糖基轉移酶的濃縮酶液’對每1 g澱粉 固體物再添加3 單位環麥芽糖糊精聚葡糖轉移酶（林原 生物化學硏究所製），於P Η 5 · 5，溫度5 1 °C ’反應 4 8小時。於9 5 t保持該反應3 0分鐘後，調整爲P Η 5 · 0，溫度5 0 t後，對每lg固體物加入3 00單位 之 α -配糖酶劑（商品名：「Transglucosidase L、Amano」 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ，天野製藥公司製）反應2 4小時，對每1 g固體物再加 入2 0單位葡糖澱粉酶劑（商品名「Glucoteam」長瀨生化 學公司製），反應1 7小時，加熱該反應液爲9 5 °C，保 持3 0分鐘後，經冷却，依常法以活性碳脫色過濾所得濾 液，藉由Η型及〇 Η型離子交換樹脂脫鹽，精製，再予濃 縮，得單位固體含有44.0%環狀四糖之糖槳。以所得 含有環狀四糖之糖漿做爲原糖液，爲提高環狀四糖之含量 ，依實施例Α - 5之方法使用鹽型強酸性陽離子交換樹脂 進行管柱層析，採收高含環狀四糖之餾份，經精製，濃縮 ，噴霧乾燥，對每單位原料固體物以收率約4 5 %得含環 狀四糖粉末。 此品係以固體單位而言含3 . 7 %葡萄糖、8 0 · 5 %環狀四糖、及1 5 . 8 %其他糖質，具有溫和之甜味、 適度之粘度、保濕性、包合性，做爲甜味料、呈味改良劑 、品質改良劑、離水防止劑、安定劑、賦形劑、包合劑、 粉末化基材等可以有利地利用於各種飮食物、化粧品、醫 本紙張尺度適用中國國家;( CNS ) A4規格（210X297公釐） -147 -
五、發明説明（） 145 藥品等之組成物。 實施例1 0 依實驗1 4之方法，在發酵器培養4 8小時球形節孢 桿菌A19 (CCRC 910175)。培養後使用 S F膜除菌過濾，回收約1 8 <之培養濾液，再以U F膜 濃縮該濾液，回收約1 <含1 5 . 2單位/ m£本發明之α 一異麥芽糖基葡糖質生成酶與2 3 . 〇單位/Ja -異麥芽 糖基轉移酶之濃縮酶液。 使馬鈴薯澱粉爲濃度約5 %澱粉乳，加入碳酸使其濃 度可成爲0 . 1%，調整爲ρΗ6 . 0，對每lg澱粉固 體物添加0 . 2 % α —澱粉酶（商品名：Tamameal 60L、 Nobo公司製）於9 5°C反應約1 0分鐘，繼而於1 20°C 熱壓處理2 0分鐘，再急速冷却至4 0°C，得DE約4之 液化溶液。對每1 g澱粉固體物添加〇 . 5 含上述方法 所調製之α -異麥芽糖基葡糖質生成酶與£^ 一異麥芽糖基 轉移酶的濃縮酶液’於ρ Η 6 . 0，溫度4 0 t：，反應 4 8小時。於9 5 t保持該反應1 〇分鐘後，經冷却，依 常法以活性碳脫色過濾所得濾液，藉由Η型及◦ Η型離子 交換樹脂脫鹽，精製’再予濃縮’對每單位原料澱粉固體 物以收率約9 0 %得濃度7 0 %之含環狀四糖的糖漿。 本品係以固體單位而言含2 · 5%葡萄糖、6 . 3% 異麥芽糖、30 . 1%環狀四糖’具有溫和之甜味適度之 粘度、保濕性、包合性，做爲甜味料、呈味改良劑、品質 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 Φ, 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -148- 1312369 A7 B7 _____ 五、發明説明（η6) 改良劑、離水防止劑、安定劑、賦形劑、包合劑、等可以 有利地利用於各種飮食物、化粧品、醫藥品等之組成物。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 實施例B - 1 甜味料 〇 . 8重量份實施例A - 7之方法所得環狀四糖5〜 6含水結晶中，均勻地混合〇 . 2重量份海藻糖含水結晶 (林原商事公司販賣，商品名「Treha」）、0 . 0 1重量 份α -葡糖基甜菊糖苷（東洋精糖公司販賣，商品名「aG Sweet」、〇 · 〇 1重量份L —天冬胺醯基一 L —苯丙胺酸 甲酯（商品名「阿斯巴甜」，以顆粒成形機做成顆粒狀甜 味料。此製品係甜味品質優，具有蔗糖之約2倍甜度。此 製品之熱量係因環狀四糖5〜6含水結晶爲難消化性，難 發酵性，所以實質上不具熱量，每1當位甜度約爲蔗糖之 約1 / 1 0。並且此製於室溫保存下不慮其變質劣化，極 爲安定。因此，此製品係極適於做爲高品質之低熱量，低 蛀牙性甜味料。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 實施例B - 2 硬糖果 在1 0 0重量份濃度5 5%蔗糖溶液中加熱混合5 〇 重量份實施例A - 2之方法所得含環狀四糖之糖漿，繼而 於減壓下加熱濃縮至水份2 %以下，混溶0 . 6重量份檸 檬酸及適量之檸檬香料與著色料，依常法成形，得製品。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） --- -149- 1312369 A7 _____ B7 五、發明説明（147) 此製品之口感’呈味’風味均極佳，亦無蔗糖晶析出，吸 濕性低’不會滴垂，可得安定且高品質之硬糖果。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本覓) 實施例B - 3 口香糖 加熱熔融3重量份膠基質至柔軟之程度，加入2重量 份無水結晶麥芽糖醇、2重量份木糖醇、2重量份實施例 A - 7之方法所得環狀四糖5〜6含水結晶粉末，及1重 量份海藻糖含水結晶，再混合適量之香料與著色料，依常 法以滾筒混捏，成形，包裝，得製品。此製品係組織、呈 味、風味均佳、做爲低蛀牙性、低熱量口香糖極適宜者。 實施例B - 4 加糖練乳 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1 〇 0重量份原乳中溶解2重量份實施例A 一 5之方 法所得環狀四糖5〜6含水結晶粉末及2重直份鹿糖’以 加熱盤加熱殺菌，繼而濃縮爲7 0 %濃度，在無菌狀態下 製罐爲製品。此製品具溫和之甜味、風味亦佳、可有利地 利用於水果、咖啡、可可、紅荼等調味用。 實施例B - 5 乳酸菌飮料 溶解1 7 5重量份脫脂奶粉' 1 3 〇重量份實施例A - 4之方法所得含環狀四糖之糖漿及5 〇重量份尚含乳鹿 本紙張尺度適用中國國家標準（CNs ) A4規格（210X297公釐） -150- 1312369 A7 __B7 五、發明説明（148) 糖之粉末（林原商事公司販賣，商品「乳果Oligo」於 1，1 5 0重量份水中，於6 5°C殺菌3 〇分鐘，冷卻爲 4 0 °C後，再依常法植菌3 0重量份乳酸菌之起動劑，於 3 7 °C培養8小時，得乳酸菌飮料。此製品之風味佳，含 寡糖、環狀四糖’不但可安定地保有乳酸菌，還可促進增 殖雙岐菌，極適於做爲具有整腸作用之乳酸菌飲料。 實施例B - 6 果汁粉末 ' 對3 3重量份經噴霧乾燥之橘子果汁粉末，混合攪拌 5◦重量份實施例A-7之方法所得環狀四糖5〜6含水 結晶粉末' 1 0重量份無水結晶麥芽糖醇、〇 . 6 5重量 份無水棒檬酸、0 _ 1重量份蘋果酸、0 . 2重量份2 -0 - α -葡萄糖基一 L 一抗壞血酸、〇 . 1重量份檸檬酸 鈉、0 · 5重量份支鏈澱粉酶及適量之粉末香料、粉碎成 微粉末，放入流動層造粒機，以4 0 °C排風溫度，以實施 例A - 5之方法所得高含環狀四糖液做爲結合劑、適量地 噴霧、造粒3 0分鐘、計量、包裝爲製品。此製品係約 3 0 %果汁含有率之果汁粉末、無異味、異臭 '高品質、 低熱量之果汁、商品價値極高。 實施例B - 7 鮮奶油 充分地混合1 〇 〇重量份玉米殿粉、1 0 0重量份貫 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) M規格（210 X 297公釐） ---------^^衣-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -151 - 1312369 A7 P一_____B7__ 五、發明説明（149) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 施例A ~ 2之方法所得含環狀四糖之糖漿、6 0重量份海 藻糖含水結晶、4 0重量份蔗糖及1重量份食鹽，加入 2 8 0重量份鷄蛋，經攪拌，慢慢加入煮沸之1， 〇 〇 〇 重量份牛奶於其中，再予以加熱續加攪拌，待玉米澱粉完 全糊化成爲半透明時停止加熱，經冷卻加入適量之香精香 料、計量、包裝得製品。此製品具有潤滑光澤、風味良好 、可抑制澱粉之老化，係高品質之鮮奶油。 實施例B — 8 巧克力 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 混合4 0重量份可可糊料、1 〇重量份可可脂及5 〇 重量份依實驗2 4之方法製造之環狀四糖1含水結晶，以 精磨機降低其粒度後，放入巧克力漿精磨機於5 〇 °C混揑 二晝夜。在其間添加0 . 5重量份卵磷脂，使其充分地分 散。繼而以溫度調節機調節爲3 1 °C，在奶油凝固前灌入 模型中，抽去泡沬，通過1 〇 °C之冷卻隧道使其固化。脫 去模型予以包裝爲製品。此製品不具吸濕性、色' 光澤均 佳、內部組織亦佳，可在口中立即溶化、高品質甜味及柔 和風味。此製品係做爲低蛀牙性、低熱量之巧克力極爲有 用者。 實施例B - 9 米糕粉 均句地混合9 0重量份米粉、2 〇重量份玉米澱粉、 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -152 - 1312369 A7 B7
五、發明説明（15CD 7 〇重量份無水結晶麥芽糖醇、5 0重量份實施例A〜 β方法所得含環狀四糖粉末及4重量份支鏈澱粉製造成米 糕粉。混捏米糕粉與適量之抹茶與水，放入容器中蒸煮 6 〇分鐘製造抹茶米粉禚。此製品之光澤、口感均佳、風 味亦佳。又，可以抑制澱粉之老化，可以保存多日，做爲 低熱量之米粉糕極爲適宜。 實施例Β _ 1 〇 紅豆餡 依常法加水煮沸1 0重量份原料紅豆、去澀味、除去 水溶性雜質，得約2 1重量份之紅豆糊。在該紅豆糊中加 入1 4重量份蔗糖、5重量份實施例Α — 3之方法所得含 環狀四糖之糖漿及4重量份水，經煮沸，加少量沙拉油於 其中，注意不要壓碎紅豆之程度予以混捏，製得約3 5重 量份紅豆餡。此製品不會有燒焦味、不會脫水極爲安定、 口味、風味均佳，做爲麵包、豆沙包、湯圓、夾心餅、冰 果等點心材料極適宜。 實施例B - 1 1 麵包 依常法以水混捏1 0 0重量份麵粉、2重量份酵母、 5重量份蔗糖、1重量份實施例A - 1之方法所得含環狀 四糖粉末及0 . 1重量份養料，依常法加水混捏，於2 6 t發酵2小時麵團，然後熟成3 0分鐘，烘烤之。此製品 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210Χ297公釐） ---------— (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
、1T 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -153- 1312369 A7 B7 五、發明説明（151) 係色相、質地均極佳，具適度之彈性、溫和之甜味，係高 品質麵包。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} 實施例B — 1 2 火腿 均勻搓入15重量份食鹽及3重量份硝酸鉀於 1， 000重量份豬腿肉中，放於冷卻室堆積一晝夜。在 冷卻室浸漬於由5 0 0重量份水、1 0 0重量份食鹽、3 重量份硝酸鉀、4 0重量份實施例A - 5之方法所得環狀 四糖5〜6含水結晶粉末及香辛料所成鹽漬液7天，繼而 依常法以冷水洗後，以繩子束搏、煙燻、烹煮、冷卻、包 裝得製品。此製品係色澤佳、風味佳之高品質火腿。 實施例B - 1 3 粉末肽 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 在1重量份4 0 %食品用大豆肽溶液（不二製油公司 販賣，商品名「Hynewto S」中混合2重量份實施例A — 6 之方法所得環狀四糖5〜6含水結晶粉末，放入塑膠製方 形淺盤中，於5 0 °C減壓乾燥，粉碎後得粉末肽。此製品 係風味良好，不但可做爲預混合物，冷凍點心等低熱量製 點心用材料係極爲有用，做爲經口流動食物，經管流動食 物之難消化性食物纖維，整腸材料亦有用。 實施例B - 1 4 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -154- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1312369 A7 _____B7 五、發明説明（152) 粉末蛋黃 以盤式加熱殺菌機，於6 0〜6 4 °C殺菌自新鮮蛋調 製成之蛋黃，對1重量份所得液狀蛋黃混合4重量份實驗 2 5之方法製得的含環狀四糖無水結晶粉末後，移至方形 淺盤中放置一夜，轉換爲環狀四糖5〜6含水結晶，調製 成塊狀。以削切機使該塊狀物切成粉末，得粉末蛋黃。 此製品不但可做爲預混粉末 '冷凍點心、烘烤點心、 乳化劑等低熱量製點心材料有用，做爲經口灌食、經管灌 食用之難消化性食物纖維、整腸材料亦極有用。又，亦可 以有利地利用於美膚劑、育毛劑等。 實施例B - 1 5 浴用劑 對1重量份柚皮果汁混合1 〇重量份實驗2 5之方法 製造之含環狀四糖無水結晶粉末，晶析出環狀四糖5〜6 含水結晶之晶體’熟成後經粉化，得到含柚皮萃取物之環 狀四糖5〜6含水結晶粉末。 混合5重量份此粉末、9 〇重量份燒鹽' 2重量份海 藻糖含水結晶、1重量份無水矽酸及0 . 5重量份α -葡 萄糖基橘皮苷（林原公司販賣，商品名α G Hesperidin) ’製造爲浴用劑。 此製品具柚子香味，在沐浴熱水中稀釋爲1 〇 〇〜 1 〇 ’ 0 〇 〇倍利用時，沐浴後肌膚可變潤滑、保暖，係 爲極尚品質之沐浴用劑。 本紙張尺度itii]中國國家縣（CNS )_A4*^~^1Gx29 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
-155- 1312369 A7 B7 五、發明説明（153) 實施例B _ 1 6 化粧用乳霜 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 依常法加熱熔解2重量份一硬脂酸聚氧化乙二醇、5 重量份自行乳化型一硬脂酸甘油、2重量份實施例A - 8 之方法所得環狀四糖5〜6含水結晶粉末、1重量份α -糖基芸香素（林原公司販賣，商品名a G Rutin ) 、1重量 份流動石蠟、1 0重量份三辛烷酸甘油及適量之防腐劑， 再加入2重量份L 一乳酸、5重量份1，3 -丁二醇及 6 6重量份精製水，以勻漿器使其乳化，再加入適量之香 料，攪拌混合，製造爲化粧用乳霜。此製品係具抗氧化性 、安定性高，可做爲高品質之防晒、美膚劑、色白劑等有 利地利用。 實施例B - 1 7 牙膏 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 混合4 5重量份磷酸氫鈣、1 . 5重量份月桂基硫酸 鈉、2 5重量份甘油、0 . 5重量份月桂酸聚氧化乙烯山 梨聚糖酯、1 5重量份實施例A - 2之方法所得含環狀四 糖之糖漿、〇，〇 2重量份糖精及〇 . 〇 5重量份防腐劑 於1 3重量份水、得牙膏。此製品係具充分之界面活性劑 之洗淨力，去除異味，使用後感覺上極舒適。 實施例B - 1 8 灌食用固體製劑 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1312369 A7 B7 _— 五、發明説明（154) 調製由1 0 0重量份實施例A - 6之方法所得環狀四 糖5〜6含水結晶粉末、2 0 0重量份海藻糖含水結晶、 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 2 0 0重量份高含麥芽糖四醇粉末、2 7 0重量份粉末蛋 黃、2 0 9重量份脂脂奶粉、4 · 4重量份氯化鈉、 1 . 8重量份氯化鉀、4重量份硫酸鎂、0 . 0 1重量份 維生素Bi、〇 . 1重量份抗壞血酸鈉、〇 . 6重量份維生 素E乙酸鹽及〇.〇4重量份菸鹼醯胺所成配合物，各分 裝2 5 g此配合物於防濕性層合小袋中，熱封後得製品。 此製品可藉環狀四糖強化難消化性之食物纖維，係整 腸作用極佳之灌食用品。溶解1袋份於約1 5 0〜3 0 0 4水中做爲灌食用，可利用此製品，經口或經鼻、經管灌 胃、腸等使用方法，補給能量予活體極爲有利。 實施例B - 1 9 錠劑 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 在5 0重量份阿斯匹林中充分地混合1 4重量份實施 例A - 7之方法所得環狀四糖5〜6含水結晶、4重量份 玉米澱粉後，依常法用製錠機製錠，得厚度5 . 2 5mm 、1錠6 80mg之錠劑。 此製品係利用環狀四糖之賦形性者，不具吸濕性、具： 充分之物理強度，且在水中之散解極爲良好。 實施例B - 2 0 糖衣錠 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ~~ ~ -157 - 1312369 Α7 Β7 五、發明説明（155) 以1 5 0 m g重量之坯片做爲芯劑，使用由4 0重量 %實施例A - 7之方法所得環狀四糖5〜6含水結晶、2 重量份支鏈澱粉（平均分子量2 0萬）、3 0重量份水、 2 5重量份滑石及3重量份氧化鈦所成之澆注液，使用其 令錠劑成爲重量約2 3 Omg之糖衣，繼而以6 5重量份 環狀四糖5〜6含水結晶粉末、1重量份支鏈澱粉及3 4 重量份水所成之上層澆液，使其爲糖衣、再以蠟液使其成 爲具光澤、優異外觀之糖衣錠。此製品係耐衝擊性優，可 長時間維持高品質。 實施例B — 2 1 外傷治療用膏藥 在1 0 0重量份實施例A - 7之方法所得環狀四糖5 〜6含水結晶粉末及3 0 0重量份麥芽糖中，加入溶解3 重量份碘之5 0重量份甲醇，再加入2 0 0重量份1 〇w / v %支鏈澱粉水溶液予以混合，得到可適度延展，具黏 著性之外傷治療用膏藥。此製品可藉由環狀四糖防止碘' 甲醇之揮發，係經久亦不會變化之商品價値極高之膏藥。 又，此製品不但可因含碘而具殺菌作用’亦可藉由麥 芽糖對細胞做爲能源補給劑而作用，所以可縮短治癒時間 ，並使傷口極爲完好。 產業上之可利用性 如上述說明，本發明係有關新穎之α 一異麥芽糖基葡 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1Τ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -158- 1312369 A7 B7 五、發明説明（156) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 糖質生成酶與其製造方法，以及其用途，詳而言係有關新 穎之α -異麥芽糖基葡糖質生成酶與此酶之製造方法，產 生此酶之微生物，使用此酶之α -葡萄糖基轉移方法，生 成<2 _異麥芽糖基葡糖之方法，更爲倂用此_與〇： -異麥 芽糖基轉移酶以製造具有環{θ6}-α-D-吡喃葡糖 基 _ (1 — 3) —a— D—唯喃葡糖基—（1—·6) — α 一 D—哏喃葡糖基_ (1->_3) — α — D -吼喃葡糖基一 (1 —)之構造的環狀四糖之製造方法，以及含此等糖質 及組成物。依本發明時可以在工業上廉價且大量地製造具 有環{ — 6 } - α — D -吡喃葡糖基一（1 — 3) -D —吡喃葡糖基—（1 — 6) -a — D —吡喃葡糖基一（ 1 — 3) —α-D -吡喃葡糖基—（1 —)之構造的環狀 .四糖，含其之糖質及組成物。該環狀四糖或含其之糖質係 實質上爲非還原性至低還原性者，很難產生胺羰基反應， 不具吸濕性，很容易保存處理，具有溫和的低甜味，適度 之粘度、保濕性、包合性 '難消化性、做爲甜味料、低熱 量食品材料、呈味改良劑、風味改良劑、品質改良劑、防 離水劑、安定劑、賦形劑、包合劑、粉末化基材等，可以 有利地利用於各種飮食物、化粧品、醫藥品等組成物。 本發明係具有如上述之顯著作用效果之發明，對斯業 界貢獻巨大，確爲具極重大意義之發明。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐〉 -159 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1312369 A7 _B7五、發明説明（157) 序 歹ϋ<110>林原生物化學硏究所公司 <120> α 一異麥芽糖基葡糖質生成酶，其製法及用途 <130> W0854 <150> 233,364/00 <151> 2000-8-1 <150〉 234,937/00 <151〉 2000-8-2 <160〉 19 <210〉 1 <211> 9 <212> PRT<213>圓孢芽孢桿菌 <400> 1 Tyr Val Ser Ser Leu Gly Asn Leu He 1 5 <210〉 2 <2H> 10 <212) PRT<213>圓孢芽孢捍菌 <400> 2 He Asp Gly Val Tyr His Ala Pro Asn Gly 1 5 i〇 <210> 3 , <211〉 10 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ▼裝· 訂
LP 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -160- 1312369 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（158)
<212> PRT <213〉圓孢芽孢桿菌 -<400〉 3
He Asp Gly Val Tyr His Ala Pro Tyr Gly 1 5 l〇
<210〉 4 <211> 8 <212) PRT <213〉：画孢芽孢桿菌 <400〉 4 lie Asp Gly Val Tyr His Ala Pro 1 5 <210〉 5 .
<211〉 8 <212> PRT <213〉圓孢芽孢桿菌 <400〉 5
Asp Ala Ser Ala Asn Val Thr Thr 1 5
<210〉 6 <211〉 8 <212〉 PRT 〈2L3>圓孢芽孢桿菌 <400> 6
Trp Ser Leu Gly Phe Met Asn Phe 1 5 <210> 7 <211> 8 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） — 裝 · 訂 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1312369 A7 B7 五、發明説明（159)
<212) PRT (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 〈213>圓孢芽孢桿菌 (400> 7
Asn Tyr Thr Asp Ala Trp Met Phe 1 5
<210> 8 <211〉 8 <212> PRT <213〉圓孢芽孢桿菌 <400〉 8
Gly Asn Glu Met Arg Asn Gin Tyr 1 5
<210〉 9 <211> 8 <212> PRT <213〉圓孢芽孢桿菌 <400> 9 lie Thr Thr Trp Pro lie Glu Ser 1 5 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
<210> 10 <211> 8 <212) PRT <213〉圓孢芽孢桿菌 <400> 10
Trp Ala Phe Gly Leu Trp Met Ser 1 5 <210> 11 〈211〉 9 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -162 - 1312369 A7 B7 五、發明説明（16〇)
<212> PRT (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) <213〉圓孢芽孢桿菌 <400> 11
His Val Ser Ala Leu Gly Asn Leu Leu 1 5
<210〉 12 <211〉 8 <212> PRT <213〉圓孢芽孢桿菌 <400> 12
Asp Phe Ser Asn Asn Pro Thr Val 1 5
<210〉 13 <211> 8 <212> PRT <213〉圓孢芽孢桿菌 <400> 13
Tyr Thr Val Asn Ala Pro Ala Ala 1 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
<210> 14 <211> 8 <212> PRT <2丨3>圓孢芽孢桿菌 <400> 14
Tyr Glu Ala Glu Ser Ala Glu Leu 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -163 - 1312369 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（161) <210〉 15 〈211> 6 <212> PRT <213〉圓孢芽孢桿菌 <400> 15 Asn Trp Trp Met Ser Lys 1 5 <210〉 16 <211〉 8 <212> PRT 〈213>圓孢芽孢桿菌 <400> 16 Thr Asp Gly Gly Glu Met Val Trp 1 5 <210〉 17 <211> 8 <212> PRT <213〉圓孢芽孢桿菌 <400〉 17 Asn lie Tyr Leu Pro Gin Gly Asp 1 5 <210> 18 <211> 13 〈212〉 PRT <213〉球形節桿菌 " <400> 18 Ala Pro Leu Gly Val Gin Arg Ala Gin Phe Gin Ser Gly 1 5 in 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -164- 1312369 A7 B7 五、發明説明（162)
<210> 19 <211〉 10 <212〉 PRT <213>假生林節桿菌 <400〉 19
Asp Thr Leu Ser Gly Val Phe His Gly Pro 1 5 10 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -165-

Claims (1)

1312369 Α8 Β8 C8 D8
98. 3. 1 〇 »Τ 年月 補元 六、申請專利範圍 第90 1 1 8090號專利申請案 中文申請專利範圍修正本 民國98年3月10日修正 1. 一種α-異麥芽糖基葡糖質生成酶，其特徵爲來自芽 孢桿菌屬微生物，且具有以下理化學上性質者， (1 )作用 自做爲非還原末端的結合式樣具有α-1，4葡糖苷結合 之葡萄糖聚合度爲2以上之糖質，在實質上不增加還原力 之下藉由α-葡萄糖基轉移，即可生成做爲非還原末端的結 合式樣具有α-1,6葡糖苷結合，做爲此非還原末端以外之結 合式樣具有α-1，4葡糖苷結合之葡萄糖聚合度3以上的α_ 異麥芽糖基葡糖質、 (2)分子量 在SDS-凝膠電泳法中，120,000至1 60,000達頓； (3 )等電點 依含有兩性電解質之電泳法中，ΡI 4.7〜7.8 ; (4 )最適溫度 ΡΗ6.0，60分鐘反應下，40°C〜50Χ：; ρΗ6·0，60分鐘反應下，lmMCa2 +存在下，45〜55°C ; (5 )最適pH 35°C，60分鐘反應下，pH 6.0 ; (6 )溫度安定性 保持於ΡΗ6·0，60分鐘條件下，45°C以下爲安定； 保持於pH6.0，60分鐘條件下’ lmMCa2 +存在下，5〇°c (請先聞«背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）- J 1312369 Λ8 Β8 C8 D8 __ 六、申請專利範圍 以下爲安定； (7 ) PH安定性 (請先閲脅背面之注意事項再填寫本頁) 保持41，24小時之條件下’ pH4.5〜1 〇 · 〇範圍內爲安 定； (8)不會生成葡聚糖； (9 )活性被EDTA阻斷：以及 (1 〇 )於Ca2 +及Mn2 +下活性被安定化及/或賦活化。 2. 如申請專利範圍第1項之α-異麥芽糖基葡糖質生成 酶，其中芽孢桿菌屬之微生物爲圓孢芽孢桿菌（Bacillus globisporus ) C9 ( CCRC 910171 )、圓孢芽孢桿菌（ Bacillus gi〇bisporus) Cll ( CCRC 910172)、圓孢芽孢桿 囷（B a s i 11 u s g 1 〇 b i s ρ 〇 ru s ) N 7 5 ( C C RC 9 1 0 1 7 3 )、或此等 變異株者。 3. —種α-異麥芽糖基葡糖質生成酶，其特徵爲來自節 桿菌屬微生物，且具有以下理化學上性質者， (1 )作用 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 自做爲非還原末端的結合式樣具有α-1，4葡糖苷結合之 葡萄糖聚合度爲2以上之糖質，在實質上不增加還原力之 下藉由α -葡萄糖基轉移，即可生成做爲非還原末端的結合 式樣具有α-1,6葡糖苷結合，做爲此非還原末端以外之結合 式樣具有α-1，4葡糖苷結合式樣之葡萄糖聚合度3以上的 α_異麥芽糖基葡糖質、 (2)分子量 在SDS-凝膠電泳法中，74，0 00至1 14,000達頓； 本紙張尺度適用中國國家榇準（CNS ) Α4规格（210X297公釐）-2 - 1312369 A8 B8 C8 D8 _ 六、申請專利範圍 (3 )等電點 依含有兩性電解質之電泳法中，PI3.8〜4.8 ; (4 )最適溫度 pH8_4，60分鐘反應下，60°C ;或pH8.4，60分鐘反應 下 ’ lmMCa2 +存在下，65。(： ·， (5 )最適pH 35°C ’ 60分鐘反應下，pH8.4 ; (6 )溫度安定性 保持於pH8.0，60分鐘條件下，55°C以下爲安定； 保持於pH8,0，60分鐘條件，lmMCa2 +存在下，60。〇以 下爲安定； (7 ) pH安定性 保持4 °C ’ 2 4小時之條件下，p Η 5 _ 0〜9 · 0範圍內爲安 定； (8) 不會生成葡聚糖； (9) 活性被EDTA阻斷；及 (10) 於Ca2 +及Μη2 +下活性被安定化及/或賦活化。 4_如申請專利範圍第3項之α -異麥芽糖基葡糖質生成 酶，其中節桿菌屬之微生物爲球形節桿菌（Arthr〇bacter globiformis) A19 ( CCRC 910175)、或其變異株者。 5 ·如申請專利範圍第1項或第3項之α_異麥芽糖基葡 糖質生成酶，其中做爲非還原末端之結合式樣具有α—!,4葡 糖苷結合之葡萄糖聚合度爲2以上糖質爲一種或二種以上 選自麥芽寡糖、麥芽糖糊精、澱粉糊精、直鏈薇粉、支鏈 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐）-3 - ---------------訂------Φ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1312369 A8 B8 C8 D8__—__ 六、申請專利範圍 澱粉、溶性澱粉、液化澱粉、糊化澱粉及糖原之糖質者。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本貰) 6. 如申請專利範圍第1項或第3項之α-異麥芽糖基葡 糖質生成酶，其中該酶爲精製酶或粗製酶。 7. —種α-異麥芽糖基葡糖質生成酶之製造方法，其特 徵爲以營養培養基培養如申請專利範圍第1項或第3項之 具有產生α-異麥芽糖基葡糖質生成酶能力的芽孢桿菌屬或 節桿菌屬微生物，自所得培養物藉由選出離心分離、過濾 、膜濃縮、硫銨鹽析、陰離子交換層析法、親和層析法、 及疏水層析之1種或2種以上的方法採取α·異麥芽糖基葡 糖質生成酶者。 8. 如申請專利範圍第7項之α-異麥芽糖基葡糖質生成 酶之製造方法，其中芽孢桿菌屬之微生物爲圓孢芽孢桿菌 (Bacillus globisporus) C9 ( CCRC 910171)、圓孢芽孢桿 菌（Bacillus globisporus) Cll ( CCRC 910172)、圓抱芽 孢桿菌（Basillus globisporus) N75 ( CCRC 910173)、或 此等變異株者。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 9. 如申請專利範圍第7項之α-異麥芽糖基葡糖質生成 酶之製造方法，其中節桿菌屬之微生物爲球形節桿菌（ Arthrobacter globiformis) A19 ( CCRC 910175)、或其變 異株者。 10. —種α-異麥芽糖基葡糖質之生成方法，其特徵爲 使如申請專利範圍第1項或第3項之α-異麥芽糖基葡糖質 生成酶作用於含非還原末端之結合式樣具有α -1，4葡糖苷結 合之葡萄糖聚合度爲2以上之糖質的溶液，使其作用進行 本纸張尺度逋用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐）-4 - 1312369 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 α -葡萄糖基轉移反應，以生成α -異麥芽糖基葡糖質者。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 11. 如申請專利範圍第10項之α -異麥芽糖基葡糖質之 生成方法’其中作爲非還原末端之結合式樣具有α-〗，4葡糖 苷結合之葡萄糖聚合度爲2以上的糖質爲一種或二種以上 選自麥芽寡糖、麥芽糖糊精、澱粉糊精、直鏈殺粉、支鍵 澱粉、溶性澱粉、液化澱粉、糊化澱粉及糖原之糖質者。 12. —種環狀四糖或含此之糖質的製造方法，其特徵 爲含有使含有做爲非還原末端的結合式樣具有α-1,4葡糖苷 結合的葡萄糖聚合度2以上的糖質之溶液中，自做爲非還 原末端的結合式樣具有α-1,4葡糖苷結合的葡萄糖聚合度2 以上的糖質，實質上未增加還原力下，藉由α-異麥芽糖基 轉移生成做爲非還原末端的結合式樣具有α-1,6葡糖苷結合 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ，做爲該非還原末端以外的結合式樣具有α-1,4葡糖音結合 的葡萄糖聚合度3以上的α -異麥芽糖基葡糖質的α -異麥芽 糖基葡糖質生成酶、與自該α -異麥芽糖基葡糖質，藉由含 有α-異麥芽糖基轉移的反應生成具有環6) -a-D_吡喃葡 糖基-(1—·3) -a-D -批喃葡糖基-(1—>6) -a-D-啦喃葡糖基-(1—3) -a-D-D比喃葡糖基-(1->}構造的環狀四糖之a_異麥 芽糖基轉移酶進行作用，生成具有環{ — 6) -a-D-吡喃葡糖 基-(I-^3) -a-D-D比喃葡糖基-(1—>·6) -a-D -卩比喃葡糖基-( 1—3) -a-D-D比喃葡糖基-(1 — }構造的環狀四糖或含有此之 糖質的步驟、與採取所得之環狀四糖或含此之糖質之步驟 所成者。 1 3 ·如申請專利範圍第1 2項之環狀四糖或含此之糖質 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210 X 297公釐）-5 - 1312369 Α8 Β8 C8 D8 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 六、申請專利範圍 的製造方法，其中α_異麥芽糖基葡糖質生成酶爲如申請專 利範圍第1項或第3項之α·異麥芽糖基葡糖質生成酶。 14. 如申請專利範圍第13項之環狀四糖或含此之糖質 的製造方法，其中α_異麥芽糖基葡糖質生成酶爲具有下述 理化學性質者’ (1 ) 分子量 在SDS-凝膠電泳法中，82,000至136,000達頓； (2 )等電點 依含有兩性電解質之電泳法中，Ρ1 3 · 7〜8 · 7 ; (3 )最適溫度 ρΗ6.0，30分鐘反應之條件下，45°C〜50°C ; (4 )最適pH 3 5 °C，30分鐘反應之條件下，pH 5· 5〜6· 5 ; (5 )溫度安定性 保持於PH6.0，60分鐘之條件下，45°C以下爲安定； (6) pH安定性 保持4°C，24小時之條件下，pH3.6〜1 0.0範圍內爲安 定。 15. 如申請專利範圍第13項之環狀四糖或含其之糖質 的製造方法，其中α-異麥芽糖基葡糖質生成酶及α-異麥芽 糖基轉移酶同時使環狀麥芽糊精葡糖轉移酶作用，並視其 需要進一步使一種或二種以上選自α -殿粉酶、β -殺粉酶、 葡糖澱粉酶及α-配糖酶之酶與之作用者。 16. —種環狀四糖或含此之糖質的製造方法，其特徵 本紙張尺度適用中國國家標準（〇灿）八4说格（210父297公釐）-6- ---------------訂------ (請先閱脅背面之注意事項再填寫本頁) 1312369 αβΪ C8 D8 六、申請專利範圍 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 爲含有使含有做爲非還原末端的結合式樣具有α-1,4葡糖苷 結合的葡萄糖聚合度2以上的糖質之營養培養基中，自如 申請專利範圍第1項或第3項之α-異麥芽糖基葡糖質生成 酶產生能、與α-異麥芽糖基葡糖質’藉由含有α-異麥芽糖 基轉移的反應，生成具有環{ — 6 ) -ot-D-吡喃葡糖基-(1—3 )-α-D-吡喃葡糖基-(1 —6) -α-D-吡喃葡糖基-(i—3) -α-D-吡喃葡糖基-(1— }構造的環狀四糖之具有α-異麥芽糖 基轉移酶產生能的芽孢桿菌屬或節桿菌屬微生物，使培養 液中生成環{ —6 ) -a-D-吡喃葡糖基-(1 —3 ) -a-D-吡喃葡糖 基-(1—6 ) -a-D-吡喃葡糖基-(1—3 ) -a-D-吡喃葡糖基-( 1 — }構造的環狀四糖或含有此之糖質之步驟、與獲取所得 之環狀四糖或含此之糖質之步驟所成者。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 17·如申請專利範圍第16項之環狀四糖或含此之糖質 的製造方法，其中芽孢桿菌屬之微生物爲圓孢芽孢桿菌（ Bacillus globisporus) C9 ( CCRC 910171)、圓孢芽孢桿菌 (Bacillus globisporus ) C 1 1 ( CCRC 9 1 0 1 72 )、圓孢芽孢 桿菌（Basillus globisporus ) N75 ( CCRC 91 01 73 )、或此 等變異株者。 1 8 ·如申請專利範圍第丨6項之環狀四糖或含此之糖質 的製造方法，其中節桿菌屬之微生物爲球形節桿菌（ Arthrobacter globiformis) A19 ( CCRC 910175)、或其變 異株者。 19.如申請專利範圍第13項或第16項之環狀四糖或 含此之糖質的製造方法，其中做爲非還原末端之結合式樣 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）y _ 1312369 A8 B8 C8 D8 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 六、申請專利範圍 具有α - 1,4葡糖苷結合之葡萄糖聚合度爲2以上的糖質爲 一種或二種以上選自麥芽寡糖、麥芽糖糊精、可溶性澱粉’ 、直鏈澱粉、支鏈澱粉、溶性澱粉、液化澱粉、糊化澱粉 及糖原之糖質者。 20.如申請專利範圍第13項或第16項之環狀四糖、 或含其之糖質的製造方法，其中獲取環狀四糖、或含其之 糖質之步驟中，含有使用一種或二種以上選自脫色、脫鹽 ，藉管柱之分級，藉膜之分離，藉微生物之發酵處理及藉 鹼處理之分解除去的精製方法進行精製的步驟。 2 1 .如申請專利範圍第1 3項或第1 6項之環狀四糖或 含其之糖質的製造方法，其中環狀四糖或含其之糖質爲呈 糖漿、糖膏、非晶質粉末、非晶質固狀物、結晶粉末，或 結晶固狀物之型態者。 22. 如申請專利範圍第21項之環狀四糖或含其之糖質 的製造方法’其中不必使用有機溶媒下可以自水溶液中晶 析出結晶者。 23. 如申請專利範圍第21項之環狀四糖或含其之糖質 的製造方法，其中結晶爲一種或二種以上選自環狀四糖的5 至6含水結晶、i含水結晶及無水結晶者。 本紙張尺度逋用中關家縣（CNS )〜胁（21£)><297公釐）· 8 _ I I I I I I 訂 I I I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
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