KR20040002408A - 이소말토오스의 제조방법 및 용도 - Google Patents

이소말토오스의 제조방법 및 용도 Download PDF

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미야케도시오
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가부시끼가이샤 하야시바라 세이부쓰 가가꾸 겐꾸조
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/12—Disaccharides

Abstract

본 발명은, 이소말토오스의 신규의 제조방법과 그 용도를 제공하는 것을 과제로 하고, 이 과제를, 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도 2 이상의 당질에, α-이소말토실 전이효소의 비존재하 또는 존재하에서 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소를 작용시켜 비환원성 말단의 결합 양식으로서 α-1,6 글루코실 결합을 가지고, 이 비환원성 말단 이외의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도 3 이상의 α-이소말토실글루코 당질, 및/또는 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}을 생성시키고, 이 생성물에 이소말토오스 유리 효소를 작용시켜서 이소말토오스를 생성시키며, 이 생성한 이소말토오스를 채취하는 것을 특징으로 하는 이소말토오스의 제조방법과 그 용도를 확립함으로써 해결하는 것이다.

Description

이소말토오스의 제조방법 및 용도{PROCESS FOR PRODUCING ISOMALTOSE AND USE THEREOF}
이소말토오스는, 발효식품 등에 미량 존재하고 있는 난(難)결정성으로서, 우수한 보습성을 가진 저감미(低甘味) 당질인데, 종래, 글루코오스, 말토오스, 파노오스 등과의 혼합당질로 하여 각종 식품, 화장품, 의약품 등에 폭넓게 사용되고 있는 유용한 당질이다.
이소말토오스는, 천연계에 있어서는 발효식품 등에 미량 존재하는 것에 불과한 희소 당질인데, 공업적으로는 산(酸)촉매를 이용하는 덱스트란의 부분 가수분해 반응, 덱스트라나아제나 이소말토덱스트라나아제 등을 이용하는 효소반응, 글루코오스로부터의 글루코아밀라아제 또는 산촉매를 이용하는 역(逆)합성 반응, 말토오스 또는 말토덱스트린으로부터의 α-글루코시다아제를 이용하는 글루코오스 당전이 반응 등에 의한 제조방법이 알려져 있다.
그러나, 종래법에 의해 얻어지는 반응액 중의 이소말토오스 함유량은, 고형물당 약 10 내지 약 25％(w/w) (이하, 본 명세서에 있어서는 별달리 명시하지 않는 한,「％（w/w)」을 간단히 「％」로 약기한다.) 정도에 불과하여 이소말토오스의 공업적 제조방법으로서는 순도가 낮아, 도저히 만족할 수 있는 것이 아니었다. 이 문제점을 개선하는 방법으로서, 예를 들면, 일본국 특개 소58-72598호 공보에 개시된 칼럼 크로마토그래피가 있다. 이 방법에 의하면, 고형물당, 이소말토오스 함유량이 약 10 내지 약 25％인 원료당액으로부터 고순도 이소말토오스를 얻을 수 있다. 그러나, 이 이소말토오스의 제조방법에 있어서도, 얻어지는 이소말토오스의 순도, 수율은 원료당액 중의 이소말토오스 함유량에 의존하지 않을 수 없다는 문제점이 있었다.
이와 같은 상황하에서, 이소말토오스를 공업적으로, 대량으로, 또한 염가로 고수율로 제조할 수 있는 신규의 제조방법의 확립이 강하게 고대되고 있었다.
본 발명은, 상기한 종래 기술을 감안하여, 이소말토오스를 공업적으로, 대량으로, 또한 염가로 고수율로 제조할 수 있는 이소말토오스의 제조방법과 그 용도를 확립하는 것을 과제로 한다.
본 발명은 이소말토오스의 신규의 제조방법과 그 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도 2 이상의 당질로부터 이소말토오스를 고수율로 얻기 위한 이소말토오스의 제조방법과 그 용도에 관한 것이다.
도 1은 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소의 효소활성에 미치는 온도의 영향을 나타내는 도면.
도 2는 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소의 효소활성에 미치는 pH의 영향을 나타내는 도면.
도 3은 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소의 온도 안정성을 나타내는 도면.
도 4는 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 α-이소말토실글루코 당질 생성효소의 pH 안정성을 나타내는 도면.
도 5는 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 α-이소말토실 전이효소의 효소활성에 미치는 온도의 영향을 나타내는 도면.
도 6은 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 α-이소말토실 전이효소의 효소활성에 미치는 pH의 영향을 나타내는 도면.
도 7은 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 α-이소말토실 전이효소의 온도 안정성을 나타내는 도면.
도 8은 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 α-이소말토실 전이효소의 pH 안정성을 나타내는 도면.
도 9는 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소의 효소활성에 미치는 온도의 영향을 나타내는 도면.
도 10은 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소의 효소활성에 미치는 pH의 영향을 나타내는 도면.
도 11은 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소의 온도 안정성을 나타내는 도면.
도 12는 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소의 pH 안정성을 나타내는 도면.
도 13은 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 α-이소말토실 전이효소의 효소활성에 미치는 온도의 영향을 나타내는 도면.
도 14는 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 α-이소말토실 전이효소의 효소활성에 미치는 pH의 영향을 나타내는 도면.
도 15는 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 α-이소말토실 전이효소의 온도 안정성을 나타내는 도면.
도 16은 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 α-이소말토실 전이효소의 pH 안정성을 나타내는 도면.
도 17은 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소반응에 의해 얻어진 α-이소말토실말토트리오스의1H-NMR 스펙트럼을 나타내는 도면.
도 18은 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소반응에 의해 얻어진 α-이소말토실말토테트라오스의1H-NMR 스펙트럼을 나타내는 도면.
도 19는 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소반응에 의해 얻어진 α-이소말토실말토트리오스의13C-NMR 스펙트럼을 나타내는 도면.
도 20은 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소반응에 의해 얻어진 α-이소말토실말토테트라오스의13C-NMR 스펙트럼을 나타내는 도면.
도 21은 생성물 A의1H-NMR 스펙트럼을 나타내는 도면.
도 22는 생성물 A의13C-NMR 스펙트럼을 나타내는 도면.
[발명을 실시하기 위한 최선의 형태]
본 발명에서 사용하는 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소라 함은, 전분질로부터 α-이소말토실글루코오스(별명, 파노오스), α-이소말토실말토오스, α-이소말토실말토트리오스, α-이소말토실테트라오스 등의 α-이소말토실글루코 당질을 생성하는 효소를 의미하고, 구체적으로는, 일본국 특원2000-234937호 명세서에 개시된, 2000년 4월 25일부로 일본국 이바라키현 쯔쿠바시 동(東)1정목 1번지 1, 중앙 제6소재의 독립 행정법인 산업기술 총합 연구소, 특허생물 기탁 센터에 수탁번호 FERM BP-7143로서 기탁되어 있는 바실루스 글로비스포루스(Bacillus globisporus) C9, 및 2000년 4월 25일부로 일본국 이바라키현 쯔쿠바시 동(東)1정목 1번지 1, 중앙 제6소재의 독립 행정법인 산업기술 총합 연구소, 특허생물 기탁 센터에 수탁번호 FERM BP-7144로서 기탁되어 있는 바실루스 글로비스포루스(Bacillus globisporus) C11 유래의 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소, 및 일본국 특원2001-5441호 명세서에 개시된 유전자 재조합형 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소활성을 가진 폴리펩티드 등을 예시할 수 있다.
그리고 본 발명에서 사용하는 α-이소말토실 전이효소라 함은, 파노오스, 이소말토실말토오스와 같은 α-이소말토실글루코 당질로부터 환상 4당을 생성하는 효소를 의미하고, 일본국 특원2000-229557호 명세서에 개시된 바실루스 글로비스포루스(Bacillus globisporus) C9(FERM BP-7143) 및 바실루스 글로비스포루스(Bacillus globisporus) C11(FERM BP-7144) 유래의 α-이소말토실 전이효소, 및 일본국 특원2000-350142호 명세서에 개시된 유전자 재조합형 α-이소말토실 전이효소 활성을 가진 폴리펩티드 등을 예시할 수 있다.
더욱이 본 발명에서 사용하는 이소말토오스 유리 효소는, α-이소말토실글루코 당질이나 환상 4당으로부터 이소말토오스를 유리하는 작용을 가진 효소를 의미하고, 예를 들면, 문헌[Journal of Biochemistry, 제75권, 105 내지 112 페이지 (1974년)]에 보고되어 있는 아르드로박터 글로비포르미스(Arthrobacter globiformis) T6(NRRL B-4425), 동경 대학 응용 미생물 연구소에서 분양 제공되는 아르드로박터 글로비포르미스(Arthrobacter globiformis)(IAM 12103), 및 문헌 [Carbohydrate Research, 제89권, 289 내지 299 페이지 (1981년)]에 보고되어 있는 악티노마듀라(Actinomadura) RlO(NRRL B-11411) 등의 미생물 유래의 이소말토덱스트라나아제(EC3.2.1.94)를 예시할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도 2 이상의 당질이라 함은, 예를 들면, 옥수수 전분, 쌀 전분, 밀 전분 등의 지상 전분, 감자 전분, 고구마 전분, 타피오카 전분 등의 지하 전분 및 이들의 부분 가수분해물(전분 부분 분해물)을 의미한다. 상기 전분 부분 분해물은, 통상, 상기한 지상 내지 지하 전분을 물에 현탁하여, 통상, 농도 10％ 이상, 보다 바람직하게는 15％ 내지 65％, 더욱 바람직하게는 20％ 내지 50％의 전분유(澱粉乳)로 하여, 이것을 가열해서 액화하거나, 또는 상기한 지상 내지 지하 전분을 산제(酸劑) 혹은 효소제에 의해 액화해서 얻을 수 있다. 액화의 정도는 비교적 낮게 설정하는 것이 좋은데, 통상, DE 15 미만, 바람직하게는 DE lO 미만, 보다 바람직하게는 DE 9 내지 0.1의 범위로 하는 것이 바람직하다. 산제로 액화할 경우에는, 예를 들면, 염산, 인산, 옥살산 등의 산제에 의해 액화한 후, 통상, 탄산 칼슘, 산화칼슘, 탄산 나트륨 등의 알칼리제를 사용하여 소망의 pH로 중화하는 방법을 채용한다. 효소제로 액화할 경우에는, α-아밀라아제, 특히, 내열성의 액화형 α-아밀라아제를 본 발명에 있어서는 적절하게 사용할 수 있다.
이들 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도 2 이상의 당질에, α-이소말토실 전이효소의 비존재하 또는 존재하에서 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소를 작용시켜서, 비환원성 말단의 결합 양식으로서 α-1,6 글루코실 결합을 가지고, 이 비환원성 말단 이외의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도 3 이상의 α-이소말토실글루코 당질, 및/또는 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}을 생성시키고, 이 생성물에 이소말토오스 유리 효소를 작용시켜 이소말토오스를 생성시키며, 이 생성한 이소말토오스를 채취함으로써 이소말토오스를 고수율로 얻을 수 있다. 또한, α-이소말토실글루코 당질 생성 효소를 작용시킬 때에, α -이소말토실 전이효소, 시클로말토덱스트린글루카노트란스페라아제(이하, 『CGTase』로 약기함.), α-글루코시다아제, 글루코아밀라아제 및 전분 지절(枝切) 효소(이소아밀라아제, 풀룰라나아제 등)로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 효소를 작용시키거나, 또는 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소를 작용시킨 후에, α-이소말토실 전이효소, CGTase, α-글루코시다아제, 글루코아밀라아제 및 이소아밀라아제로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 효소를 작용시킴으로써 이소말토오스를 보다 고수율로 제조할 수 있다. 특히, 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도 2 이상의 당질에, α-이소말토실 전이효소의 존재하에서 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소를 작용시켜서 얻게되는 환상 4당에 이소말토오스 유리 효소를 작용시킬 경우, 환상 4당으로부터의 이소말토오스 생성율을 최대 100％까지 향상시키는 것이 가능해 진다.
본 발명에 있어서 복수의 효소를 사용할 경우의 순서는, 이소말토오스의 생성 수율, 반응 시간, 반응 조건 등을 감안하면서 설정하면 좋은데, 복수의 효소를 동시에 작용시키는 것도, 또한, 이들 효소의 필요량을 수회로 나누어 상이한 타이밍에서 작용시키는 것도 가능하다. 본 발명에서 사용하는 효소를 작용시킬 때의 pH는, 상기 효소가 그들의 효소활성을 발휘할 수 있는 pH이면 좋고, 통상, pH 4 내지 10, 바람직하게는 pH 5 내지 8의 범위로부터 선택된다. 또한, 효소를 작용시킬 때의 온도는 통상, 10 내지 80℃, 바람직하게는 30 내지 70℃의 범위로부터 선택된다. 효소량은, 각 효소의 반응 조건, 반응 시간을 고려해서 적당히 증감하면 좋은데, 통상, 기질 고형물 그램당, α-이소말토실 전이효소 및 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소는 각각 0.01 내지 100 단위의 범위로부터, 이소말토오스 유리 효소 및 전분 지절 효소는 각각 1 내지 10,000 단위의 범위로부터, 그리고 CGTase, α-글루코시다아제, 글루코아밀라아제 및 이소아밀라아제는 0.05 내지 7,000 단위의 범위로부터 적당히 선택해서 사용된다. 또한, 이용하는 효소반응 시간은 효소량에 의존하지만, 이소말토오스의 생성 수율을 감안하면서 적당히 선택하면 좋은데, 통상, 1 내지 200시간, 바람직하게는 5 내지 150시간, 10 내지 100시간에서 전체 효소 반응을 완결하도록 설정한다. 한편, 각각의 효소반응시의 pH 및 온도는 본 발명에 있어서의 효소반응이 완료할 때까지의 공정에서 적당히 변경하는 것도 가능하다.
이렇게 해서 얻어지는 효소반응액 중의 이소말토오스 함유량은 고형물당, 통상, 30％ 이상, 바람직하게는 40％ 이상, 보다 바람직하게는 50％ 이상, 최대 99％ 이상이나 달한다. 특히, 이들 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도 2 이상의 당질에, α-이소말토실글루코 당질 생성 효소, α-이소말토실 전이효소 및 이소말토오스 유리 효소를 동시 또는 이 순서로 첨가할 때에는, 고형물당의 이소말토오스 함유율이 50％ 이상인 효소반응액을 용이하게 얻을 수 있다. 상기 효소반응액은, 통상, 여과, 원심분리 등의 통상적인 방법에 의해 효소반응액 중의 불용물을 제거하고, 이어서, 활성탄에 의해 탈색하고, H형, OH형 이온교환 수지 등으로 탈염하여 정제하고, 농축해서 시럽상 제품으로 하거나, 더욱이 이것을 건조해서 분말상 제품으로 한다. 필요하면, 더욱이, 예를 들면, 이온 교환 칼럼 크로마토그래피, 활성탄 칼럼 크로마토그래피, 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 등의 칼럼 크로마토그래피에 의한 분획, 알코올 및 아세톤 등 유기용매를 사용하는 분별, 막분리법 등의 1종 또는 2종 이상을 적당히 조합해서 정제하여 이소말토오스 고함유물로 하는 것도 가능하다. 특히, 이소말토오스 고함유물의 공업적 대량 제조방법으로서는 이온교환 수지 칼럼 크로마토그래피의 채용이 바람직하다. 구체적으로는, 예를 들면, 일본국의 특개 소58-23799호 공보 및 특개 소58-72598호 공보 등에 개시되어 있는, 술폰기를 결합한 스티렌-디비닐벤젠 가교 공중합체 수지의 Na+형, K+형 등의 알칼리 금속형, 및 Ca2+형, Mg2+형 등의 알칼리 토류 금속형의 1종 또는 2종 이상의 강산성 캐타이온(cation) 교환 수지를 이용하는 이온교환 수지 칼럼 크로마토그래피에 의할 때에는, 이소말토오스 고함유물을 공업적으로 고수율, 대량, 용이, 또한 염가로 제조할 수 있다. 상기 강산성 캐타이온 교환 수지의 시판품으로서는, 다우 케미칼사제의 상품명 『다우엑스 50WX2』, 『다우엑스 50WX4』 및 『다우엑스 50WX8』, 로옴 앤드 하아스사제의 상품명 『암바라이트 CG-120』, 東京有機化學 공업사제의 상품명 『ⅩT-1022E』, 三菱化成 공업사제의 상품명 『다이아이온 SK1B』, 『다이아이온 SK1O2』 및 『다이아이온 SK1O4』 등을 예시할 수 있다. 상기 이온교환 수지 칼럼 크로마토그래피에 있어서는, 고정상 방식, 이동상 방식, 의사(擬似) 이동상 방식 중의 어느 방식을 채용하는 것도 가능하다. 이러한 방법에 의하면, 이소말토오스의 고형물당의 순도를, 통상, 60％ 이상, 바람직하게는 80％ 이상, 보다 바람직하게는 99％ 이상의 최고 순도까지 향상시키는 것이 가능하다. 한편, 최고 순도의 이소말토오스 이외의 이소말토오스, 즉, 이소말토오스 고함유물은, 통상, 이소말토오스 이외에, 글루코오스, 말토오스, 말토트리오스, 말토테트라오스, 기타의 전분 부분 가수분해물, α-이소말토실글루코 당질, 및 α-글루코실-(1→6)-α-글루코실-(1→3)-α-글루코실-(1→6)-α-글루코오스(이하, 『개환(開環) 4당』이라 약칭할 경우도 있음.)로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 당질을, 고형물당, 통상, 1 내지 60％ 함유하고 있다.
이렇게 해서 얻게되는 본 발명의 이소말토오스 및 이소말토오스 고함유물은 양질이고 상품의 단 맛을 가짐과 아울러 충치의 원인의 하나인 덱스트란의 생성을 저해하는 작용을 가지고 있어, 충치를 일으키기 어려운 감미료로서 적절하게 이용된다. 또한, 본 발명의 이소말토오스 및 이소말토오스 고함유물은 보존 안정성도 우수하다. 특히, 이소말토오스 결정 고함유 제품의 경우에는, 풀룰란, 히드록시에틸 스타치, 폴리비닐피롤리돈 등의 공지의 결합제와 병용하여 정제(錠劑)의 당의제로서도 유리하게 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 이소말토오스 및 이소말토오스 고함유물은 침투압 조절성, 부형성, 광택 부여성, 보습성, 점성, 당질결정 석출 방지성, 난(難)발효성, 호화(糊化) 전분의 노화 방지성 등의 유용한 성질도 겸비하고 있다. 따라서 본 발명의 이소말토오스 및 이소말토오스 고함유물은 감미료, 정미(呈味) 개량제, 풍미 개량제, 품질 개량제, 안정제, 부형제 등으로서, 식품, 사료, 이료(餌料), 화장품, 의약품, 기호품 등의 각종 조성물에 유리하게 사용할 수 있다.
본 발명의 이소말토오스 및 이소말토오스 고함유물은 각종 물품의 단 맛 부여를 위한 조미료로서도 이용할 수 있다. 필요에 따라서, 예를 들면, 가루엿, 포도당, 프룩토오스, 락토수크로오스, 말토오스, 수크로오스, 이성화당, 벌꿀, 메이플 슈거, 이소말토올리고당, 갈락토올리고당, 프룩토올리고당, 소르비톨, 말티톨, 락티톨, 디히드로칼콘, 스테비오시드, α-글리코실스테비오시드, 레바우디오시드, 글리시리진, L-아스파르틸-L-페닐알라닌메틸 에스테르, 스쿠라로스, 아세술팜 K, 사카린, 글라이신, 알라닌 등과 같은 기타의 감미료의 1종 또는 2종 이상과 병용하는 것도 마음대로이고, 필요하면, 덱스트린, 전분, 락토오스 등의 증량제의 1종 또는 2종 이상과 병용하는 것도 마음대로이다.
또한 본 발명의 이소말토오스 및 이소말토오스 고함유물, 특히, 이들의 분말상 제품은 그대로, 또는 필요에 따라서 적당한 증량제, 부형제, 결합제, 감미료 등의 1종 또는 2종 이상과 병용하여 과립, 원형, 단봉상, 판상, 입방체상, 정제상, 필름상 또는 시이트상 등의 각종 형상으로 성형해서 이용하는 것도 마음대로이다.
더욱이 본 발명의 이소말토오스 및 이소말토오스 고함유물의 단 맛은, 신 맛, 짠 맛, 떫은 맛, 감미로운 맛, 쓴 맛 등의 다른 맛을 가진 각종 물질과 잘 조화하고, 그 자체가 내산성, 내열성도 크므로 각종 음식물의 단 맛 부여, 정미 개량에, 또한 품질개량을 목적으로 하여 이용할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면, 아미노산, 펩티드류, 간장, 분말간장, 된장, 분말된장, 모로미, 히시오, 후리카케, 마요네즈, 드레싱, 식초, 초간장, 초밥용 분말초, 츄카노모토, 텐츠유, 멘츠유, 소스, 케첩, 불고기의 소오스, 커리 루우, 스튜 믹스, 수프 믹스, 우려낸 국물 농축액, 핵산계 조미료, 복합 조미료, 미린, 신(新)미린, 테이블 슈거, 커피 슈거 등의 각종 조미료로서 유리하게 사용할 수 있다. 또한, 예를 들면, 전병, 아라레, 오코시, 떡류, 만두, 은단 모양의 담약, 팥소류, 양갱, 물양갱, 킨교쿠, 젤리, 카스테라, 눈깔사탕 등의 각종 일본식 과자, 빵, 비스켓, 크래커, 쿠키, 파이, 푸린, 버터 크림, 카스터드 크림, 슈크림, 와플, 스폰지 케이크, 도넛, 초콜렛, 츄잉검, 캬라멜, 캔디 등의 양과자, 아이스 크림, 샤베트 등의 빙과, 과실의 시럽절임, 얼음꿀 등의 시럽류, 플라워 페이스트, 땅콩 페이스트, 후루츠 페이스트, 스프레드 등의 페이스트류, 잼, 마마레이드, 시럽절임, 당과 등의 과실, 야채의 가공 식품류, 후쿠진츠케, 베타라츠케, 센마이츠케, 랏쿄츠케 등의 절임류, 단무지의 절임믹스, 배추절임의 믹스 등의 절인 야채의 믹스류, 햄, 소세지 등의 축육제품류, 어육 햄,어육 소시지, 어묵, 오뎅, 튀김 등의 어육제품, 성게알, 물오징어의 젓, 초 다시마, 말린 오징어, 미린 조미한 복어 말림 등의 각종 진미류, 김, 산채, 말린 오징어, 작은 물고기, 조개 등으로 제조되는 졸임류, 콩자반, 포테이토 샐러드, 다시마 말이 등의 반찬식품, 요구르트, 치즈 등의 유제품, 어육, 축육, 과실, 야채의 병조림, 통조림류, 청주, 합성 술, 리큐어, 양주 등의 주류, 커피, 홍차, 코코아, 쥬스, 탄산음료, 락트산 음료, 유산균 음료 등의 청량 음료수, 푸린 믹스, 핫케이크 믹스, 즉석 팥죽, 즉석 수프 등의 즉석 식품, 더욱이 이유식, 치료식, 드링크제, 펩티드 식품, 냉동 식품, 건강식품 등의 각종 음식물에 유리하게 사용할 수 있다.
더욱이, 가축, 집에서 기르는 새, 기타 꿀벌, 누에, 물고기 등의 사육 동물용의 사료, 이료 등의 기호성을 향상시킬 목적으로 사용할 수도 있다. 그 외, 담배, 치약, 입술 연지, 립 크림, 내복액, 정제, 트로치, 간유 드롭, 입안 청량제, 입안 향기제, 양치질제 등의 각종 고형물용 감미제로서, 또는 이들의 정미 개량제, 교미제(矯味劑), 품질 개량제, 안정제 등으로서 유리하게 사용할 수 있다.
본 발명의 이소말토오스 및 이소말토오스 고함유물은, 품질개량제 및/또는 안정제로 하여, 유효성분, 활성성분 또는 생리활성 물질을 함유하는 건강식품, 의약품 등에 배합함으로써, 안정한 고품질의 액상, 페이스트상 또는 고상의 건강식품이나 의약품을 얻을 수 있다. 상기 유효성분이나 생리활성 물질로서는, 예를 들면, 인터페론-α, 인터페론-β, 인터페론-γ, TNF-α, TNF-β, 마크로파아지 유주(遊走)저지 인자, 콜로니 자극 인자, 트랜스퍼 팩터, 인터류킨 등의 림포카인, 인슐린, 성장 호르몬, 프롤락틴, 에리트로포이에틴, 난세포 자극 호르몬 등의 호르몬,BCG 백신, 일본 뇌염 백신, 홍역 백신, 폴리오 생 왁찐, 두묘, 파상풍 톡소이드, 하브 항독소, 인간 면역 글로불린 등의 생물 제제, 페니실린, 에리트로마이신, 클로람페니콜, 테트라사이클린, 스트렙토마이신, 황산 가나마이신 등의 항생 물질, 티아민, 리보플라빈, L-아스코르브산, α-글리코실 아스코르브산, 간유, 카로티노이드, 에르고스테롤, 토코페롤, 루틴, α-글리코실루틴, 나린진, α-글리코실나린진, 헤스페리딘, α-글리코실헤스페리딘 등의 비타민류, 리파아제, 엘라스타아제, 우로키나아제, 프로테아제, β-아밀라아제, 이소아밀라아제, 글루카나아제, 락타아제 등의 효소, 약용 인삼 엑기스, 조릿대 엑기스, 매실 엑기스, 소나무 엑기스, 자라 엑기스, 클로렐라 엑기스, 알로에 엑기스, 프로폴리스 엑기스 등의 엑기스류, 바이러스, 유산균, 효모 등의 생균, 로얄 젤리 등을 예시할 수 있다.
이상 설명한 각종 조성물에 본 발명의 이소말토오스 또는 이소말토오스 고함유물을 함유시키는 방법은, 이들의 조성물이 완성될 때까지의 공정에서 함유시키면 좋은데, 예를 들면, 혼화, 용해, 융해, 침지, 침투, 살포, 도포, 피복, 분무, 주입, 결정석출, 고화 등 공지의 방법이 적당히 선택된다. 그 양은, 통상, 상기 조성물 중량당 0.1％ 이상, 바람직하게는 1％ 이상, 보다 바람직하게는 2 내지 99.99％ 배합한다.
이하, 본 발명을 실험예에 의해 구체적으로 설명한다.
실험예 1: α-이소말토실글루코 당질 생성 효소와 α-이소말토실 전이효소의 조제
전분 부분 분해물(상품명 『파인덱스＃4』, 일본국의 松谷화학 주식회사제)4.Ow/v％, 효모 추출물(상품명 『아사히미스트』, 일본국의 아사히 맥주 주식회사제) 1.8w/v％, 인산 2칼륨 0.1w/v％, 인산 1나트륨·12수염(水鹽) 0.06w/v％, 황산 마그네슘·7수염 0.05w/v％, 및 물로 된 액체 배지를, 500ml 용량의 삼각 플라스크에 100ml씩 넣고, 오토클레이브에서 121℃에서 20분간 멸균하고, 냉각하여 바실루스 글로비스포루스 C9(FERM BP-7143)를 접종하고, 27℃ 및 230rpm에서 48시간 회전진탕 배양한 것을 종배양으로 하였다.
용량 30L의 퍼멘터에 종배양의 경우와 동일 조성의 배지를 약 20L 넣고, 가열 멸균, 냉각하여 온도 27℃로 한 후, 종배양액 1v/v％을 접종하고, 온도 27℃, pH 6.0 내지 8.0으로 유지하면서 48시간 통기 교반 배양하였다. 배양 후, 배양액 중의 α-이소말토실글루코 당질 생성효소 활성은 약 0.45 단위/ml이고, α-이소말토실 전이효소 활성은 약 1.5 단위/ml이며, 환상 4당 생성활성은 약 0.95 단위/ml이고, 원심분리(10,000rpm, 30분간)해서 회수한 상청 약 18L의 효소활성을 측정한 결과, 이 상청은, α-이소말토실글루코 당질 생성 효소는 약 0.45 단위/ml의 활성(총 활성 약 8,110 단위)이고, α-이소말토실 전이효소는 약 1.5 단위/ml의 활성(총 활성 약 26,900 단위)을 가지고 있었다. 이 상청은, α-이소말토실글루코 당질 생성 효소 및 α-이소말토실 전이효소 함유 효소제로서 이용할 수 있다.
그리고 상기 효소활성은 다음과 같이 해서 측정하였다. 즉, α-이소말토실글루코 당질 생성 효소활성은, 말토트리오스를 농도 2w/v％가 되도록 100mM 아세트산 완충액(pH 6.0)에 용해시켜 기질액으로 하고, 그 기질액 0.5ml에 효소액 0.5ml을 가하고 35℃에서 60분간 효소반응하고, 그 반응액을 10분간 펄펄 끓여서 반응을 정지시킨 후, 그 반응액중에서 주로 생성하는 이소말토실말토오스와 말토오스의 중에서 말토오스량을 고속 액체 크로마토그래피(이하, 『HPLC법』이라고 약기한다.)로써 정량하여 실행했다. HPLC법은, 『YMC Pack ODS-AQ303』칼럼(주식회사 Y·M·C제)을 사용하여 칼럼 온도 40℃, 유속 0.5ml/min 물(水)의 조건에서 실시하고, 검출은 시차(示差) 굴절계 『RI-8012』(일본국의 Tosoh 주식회사제)를 사용하여 하였다. α-이소말토실글루코 당질 생성 효소의 활성 1 단위는, 상기의 조건하에서 1분간에 1μ몰의 말토오스를 생성하는 효소량으로 정의하였다.
또한, α-이소말토실 전이효소 활성은, 파노오스를 농도 2w/v％가 되도록 100mM 아세트산 완충액(pH 6.0)에 용해시켜 기질액으로 하고, 그 기질액 0.5ml에 효소액 0.5ml을 가하여 35℃에서 30분간 효소반응하고, 그 반응액을 10분간 펄펄 끓여서 반응을 정지시킨 후, 그 반응액중에서 주로 생성하는 환상 4당과 글루코오스의 중에서 글루코오스량을 글루코오스 옥시다아제법으로 정량하여 실행했다. α-이소말토실 전이효소의 활성 1 단위는, 상기의 조건하에서 1분간에 1μ몰의 글루코오스를 생성하는 효소량으로 정의하였다.
더욱이 환상 4당 생성활성은, 전분 부분 분해물(상품명 『파인덱스＃100』, 일본국의 松谷화학 주식회사제)을 농도 2w/v％가 되도록 50mM 아세트산 완충액(pH 6.0)에 용해시켜 기질액으로 하고, 그 기질액 0.5ml에 효소액 0.5ml을 가하여 35℃에서 60분간 효소반응하고, 그 반응액을 100℃에서 10분간 열처리해서 반응을 정지시킨 후, 더욱이 α-글루코시다아제(상품명 『트란스 글루코시다아제 L 「아마노」』, 일본국의 天野제약제) 70 단위/ml와 글루코아밀라아제(일본국의 나가세 생화학공업 주식회사 판매) 27 단위/ml를 함유하는 50mM 아세트산 완충액(pH 5.0) 1ml을 가하여 50℃에서 60분간 처리하고, 그 액을 100℃에서 10분간 열처리해서 효소를 실활시킨 후, 환상 4당량을 상기 HPLC법으로 정량하였다. 환상 4당 생성활성 1 단위는, 상기 조건하에서 1분간에 1μ몰의 환상 4당을 생성하는 효소량으로 정의하였다.
실험예 2: α-이소말토실글루코 당질 생성 효소와 α-이소말토실 전이효소의 단리
<실험예 2-1: α-이소말토실글루코 당질 생성 효소의 단리>
실험예 1에서 얻은 배양 상청 약 18L을 80％ 포화 황산 암모늄액으로 염석해서 4℃에서 24시간 방치한 후, 그 염석 침전물을 원심분리(10,000 rpm, 30분간)하여 회수하고 10mM 인산 완충액(pH 7.5)에 용해 후, 동일 완충액에 대하여 투석해서 조(粗)효소액 약 400ml을 얻었다. 이 조효소액은, α-이소말토실글루코 당질 생성 효소활성을 8,110 단위와, α-이소말토실 전이효소 활성을 24,700 단위와, 환상 4당 생성활성을 약 15,600 단위 가지고 있었다. 이 조효소액을 일본국의 三菱화학 주식회사제 『Sepabeads FP-DA13』겔을 사용한 이온 교환 크로마토그래피(겔 용량 1,000ml)에 사용하였다. 이 때, α-이소말토실글루코 당질 생성 효소, α-이소말토실 전이효소 및 환상 4당의 어느 것이라도 『Sepabeads FP-DA13』겔에 흡착하지 않고, 비흡착 획분으로 용출하였다. 이 효소액을 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불순물을 제거하여 Amersham Pharmacia Biotechnology 주식회사제 『Sephacryl HR S-200』겔을 사용한어피니티 크로마토그래피(겔 량 500ml)에 사용하였다. 효소활성 성분은, 『Sephacryl HR S-200』겔에 흡착하고, 황산 암모늄 1M으로부터 OM의 리니어 그래디언트에서, 다시 계속하여 말토테트라오스 OmM으로부터 100mM의 리니어 그래디언트에서 용출시킨 결과, α-이소말토실글루코 당질 생성 효소와 α-이소말토실 전이효소는 분리해서 용출하고, α-이소말토실 전이효소 활성은 황산 암모늄의 리니어 그래디언트에서 그 농도가 약 OM부근에서 용출하고, α-이소말토실글루코 당질 생성 효소활성은 말토테트라오스의 리니어 그래디언트에서 그 농도가 약 30mM 부근에서 용출하였다. 따라서 α-이소말토실 전이효소 활성획분과 α-이소말토실글루코 당질 생성효소 활성획분을 따로따로 수집하여 회수하였다.
더욱이 상기 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소 활성획분을 1m 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하고, 일본국의 Tosoh 주식회사제 『Butyl-Toyopearl 650M』겔을 사용한 소수 크로마토그라피(겔 량 350ml)에 사용하였다. 이 효소활성 성분은, 『Butyl-Toyopearl 650M』겔에 흡착하고, 황산 암모늄 1M으로부터 OM의 리니어 그래디언트에서 용출시킨 결과, 황산 암모늄 농도 약 0.3M 부근에서 흡착한 효소활성 성분이 용출하고, 이 효소활성을 나타내는 획분을 수집하여 회수하였다. 다시, 이 회수액을 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하고, 『Sephacryl HR S-200』겔을 사용한 어피니티 크로마토그래피를 이용해서 정제하였다. 이 정제의 각 스텝에 있어서의 α-이소말토실글루코 당질 생성효소 활성량, 비활성(比活性), 수율을 표 1에 나타낸다.
[표 1]
공 정 α-이소말토실글루코 당질생성효소 활성량(단위) α-이소말토실글루코 당질생성 효소 비활성(단위/mg 단백) 수율(%)
배양 상청 8,110 0.12 100
황산 암모늄 염석후의 투석액 7,450 0.56 91.9
이온교환 칼럼 용출액 5,850 1.03 72.1
어피니티 칼럼 용출액 4,040 8.72 49.8
소수 칼럼 용출액 3,070 10.6 37.8
어피니티 칼럼 용출액 1,870 13.6 23.1
정제한 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소를 7.5w/v％ 농도의 폴리아크릴아미드를 함유하는 겔 전기 영동에 의해 이 효소의 순도를 검정한 결과, 단백 밴드는 단일이어서 순도가 높은 효소 표품이었다.
<실험예 2-2: α-이소말토실글루코 당질 생성 효소의 성질>
실험예 2-1에서 얻은 정제 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소를 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법(겔 농도 7.5w/v％)에 사용하고, 동시에 영동한 분자량 마아커(일본 바이오·랏도·라보라토리즈 주식회사제)와 비교해서 이 효소의 분자량을 측정한 결과, 분자량 약 140,000 ±20,000 달톤이었다.
정제 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소를 2w/v％ 앰폴라인(Amersham Pharmacia Biotechnology사제) 함유 등전점 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법에 사용하고, 영동 후, 단백 밴드 및 겔의 pH를 측정해서 이 효소의 등전점을 구한 결과, 등전점은 pI 약 5.2 ±0.5이었다.
이 효소활성에 미치는 온도, pH의 영향을 활성측정의 방법에 준해서 조사하였다. 그리고 온도의 영향에 대해서는, Ca2+비존재하와 1mM 존재하에서 측정하였다. 이들 결과를 제1도(온도의 영향), 제2도(pH의 영향)에 나타내었다. 효소의 최적 온도는 pH 6.0, 60분간 반응에서 약 40℃（Ca2+비존재), 약 45℃（Ca2+1mM 존재), 최적 pH는, 35℃, 60분간 반응에서 약 6.0 내지 6.5이었다. 이 효소의 온도 안정성은, 효소용액(20mM 아세트산 완충액, pH 6.0)을 Ca2+비존재하 또는 1mM 존재하에서 각 온도에서 60분간 유지하고, 수냉(水冷)한 후, 잔존하는 효소활성을 측정함으로써 구하였다. 그리고 pH 안정성은, 이 효소를 각 pH 50mM 완충액 중에서 4℃, 24시간 유지한 후, pH를 6.0으로 조정하고, 잔존하는 효소활성을 측정함으로써 구하였다. 각각의 결과를 제3도(온도 안정성), 제4도(pH 안정성)에 나타내었다. 이 효소의 온도 안정성은 약 35℃까지 (Ca2+비존재), 약 40℃까지 (Ca2+1mM 존재)이고, pH 안정성은 약 4.5 내지 9.0이었다.
이 효소활성에 미치는 금속 이온의 영향을 농도 1mM의 각종 금속염 존재하에서 활성측정의 방법에 준해서 조사하였다. 그 결과를 표 2에 나타낸다.
[표 2]
금속 이온 상대활성(%) 금속 이온 상대활성(%)
무첨가 100 Hg2+ 4
Zn2+ 92 Ba2+ 65
Mg2+ 100 Sr2+ 80
Ca2+ 115 Pb2+ 103
Co2+ 100 Fe2+ 98
Cu2+ 15 Fe3+ 97
Ni2+ 98 Mn2+ 111
Al3+ 99 EDTA 20
표 2의 결과로부터 명백한 바와 같이, 이 효소활성은, Hg2+, Cu2+, EDTA에 의해서 현저하게 저해되고, Ba2+, Sr2+에 의해서 저해되었다. Ca2+, Mn2+에 의해서 활성화되는 것도 밝혀졌다.
<실험예 2-3: α-이소말토실 전이효소의 단리>
실험예 2-1에서 얻은 α-이소말토실 전이효소 획분을 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 대하여 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하고, 일본국의 Tosoh 주식회사제 『Butyl-Toyopearl 650M』겔을 사용한 소수 크로마토그래피(겔 량 350ml)에 사용하였다. 이 효소는 『Butyl-Toyopearl 650M』겔에 흡착하고, 황산 암모늄 1M으로부터 OM의 리니어 그래디언트에서 용출 시켰을 때, 황산 암모늄농도 약 0.3M 부근에서 겔로부터 용출하여, 이 효소활성 획분을 수집하였다. 다시, 이 회수 획분을 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 대하여 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하고, 『Sephacryl HR S-200』겔을 사용하는 어피니티 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 각 정제 스텝에 있어서의 α-이소말토실 전이효소 활성량, 비활성, 수율을 표 3에 나타낸다.
[표 3]
공 정 α-이소말토실 전이효소 활성량(단위) α-이소말토실 전이효소 비활성(단위/mg 단백) 수율(%)
배양 상청 26,900 0.41 100
황산 암모늄 염석후의 투석액 24,700 1.85 91.8
이온교환 칼럼 용출액 19,400 3.41 72.1
어피니티 칼럼 용출액 13,400 18.6 49.8
소수 칼럼 용출액 10,000 21.3 37.2
어피니티 칼럼 용출액 6,460 26.9 24.0
<실험예 2-4: α-이소말토실 전이효소의 성질>
실험예 2-3에서 얻은 정제 α-이소말토실 전이효소를 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법(겔 농도 7.5w/v％)에 사용하고, 동시에 영동한 분자량 마아커(일본 바이오·랏도·라보라토리즈 주식회사제)와 비교해서 이 효소의 분자량을 측정한 결과, 분자량 약 112,000 ±20,000 달톤이었다.
정제 α-이소말토실 전이효소를 2w/v％ 앰폴라인(Amersham Pharmacia Biotechnology사제) 함유 등전점 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법에 사용하고, 영동후, 단백 밴드 및 겔의 pH를 측정해서 이 효소의 등전점을 구한 결과, 등전점은 pI 약 5.5 ±0.5이었다.
이 효소활성에 미치는 온도, pH의 영향을 활성측정의 방법에 준해서 조사하였다. 그 결과를 제5도(온도의 영향), 제6도(pH의 영향)에 나타내었다. 효소의 최적 온도는 pH 6.0, 30분간 반응에서 약 45℃, 최적 pH는 35℃, 30분간 반응에서 약 6.0이었다. 이 효소의 온도 안정성은, 효소용액(20mM 아세트산 완충액, pH 6.0)을 각 온도에서 60분간 유지하고, 수냉한 후, 잔존하는 효소활성을 측정함으로써 구하였다. 또한, pH 안정성은, 이 효소를 각 pH 50mM 완충액 중에서 4℃, 24시간 유지한 후, pH를 6.0으로 조정하여 잔존하는 효소활성을 측정함으로써 구하였다. 각각의 결과를 제7도(온도 안정성), 제8도(pH 안정성)에 나타내었다. 이 효소의 온도 안정성은 약 40℃까지이고, pH 안정성은 약 4.0 내지 9.0이었다.
이 효소활성에 미치는 금속 이온의 영향을 농도 1mM의 각종 금속염 존재하에서 활성측정의 방법에 준해서 조사하였다. 그 결과를 표 4에 나타낸다.
[표 4]
금속 이온 상대활성(%) 금속 이온 상대활성(%)
무첨가 100 Hg2+ 1
Zn2+ 88 Ba2+ 102
Mg2+ 98 Sr2+ 101
Ca2+ 101 Pb2+ 89
Co2+ 103 Fe2+ 96
Cu2+ 57 Fe3+ 105
Ni2+ 102 Mn2+ 106
Al3+ 103 EDTA 104
표 4의 결과로부터 명백한 바와 같이, 이 효소활성은 Hg2+에 의해서 현저하게 저해되고, Cu2+에 의해서 저해되었다. 또한, Ca2+에 의해서 활성화되지 않는 것도, EDTA에 의해서 저해되지 않는 것도 알았다.
상기한 바실루스 글로비스포루스 C9(FERM BP-7143) 유래의 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소 및 α-이소말토실 전이효소의 모두가 본 발명에 있어서는 적절하게 사용할 수 있다.
실험예 3: α-이소말토실글루코 당질 생성 효소 및 α-이소말 전이효소의 조제
전분 부분 분해물 『파인덱스#4』 4.Ow/v％, 효모 추출물 『아사히미스트』 1.8w/v％, 인산 2칼륨 0.1w/v％, 인산 1나트륨·12수염 0.06w/v％, 황산 마그네슘·7 수염 0.05w/v％, 및 물로 된 액체 배지를, 500ml용량의 삼각 플라스크에 100ml씩 넣고, 오토클레이브에서 121℃, 20분간 멸균하고, 냉각하여 바실루스 글로비스포루스 C11(FERM BP-7144)를 접종하고, 27℃, 230rpm에서 48시간 회전진탕 배양한 것을 종배양으로 하였다.
용량 30L의 퍼멘터에 종배양의 경우와 동일 조성의 배지를 약 20L 넣어서, 가열 멸균, 냉각하여 온도 27℃로 한 후, 종배양액 1v/v％를 접종하고, 온도 27℃, pH 6.0 내지 8.0으로 유지하면서, 48시간 통기 교반 배양하였다. 배양 후, 배양액 중의 이 효소활성은 약 0.55 단위/ml이고, α-이소말토실 전이효소 활성은 약 1.8 단위/ml이며, 환상 4당 생성활성은 약 1.1 단위/ml이고, 원심분리(10,000rpm, 30분간)해서 회수한 상청 약 18 리터의 효소활성을 측정한 결과, α-이소말토실글루코 당질 생성 효소는 약 0.51 단위/ml의 활성(총 활성 약 9,180 단위)이고, α-이소말토실 전이효소는 약 1.7 단위/ml의 활성(총활성 약 30, 400 단위)이었다.
더욱이 상기 배양 상청 약 18L을 80％ 포화 황산 암모늄액으로 염석해서 4℃에서 24시간 방치한 후, 그 염석 침전물을 원심분리(10,000rpm, 30분간)해서 회수하여 10mM 인산 완충액(pH 7.5)에 용해 후, 이 완충액에 대하여 투석해서 조효소액 약 416ml을 얻었다. 이 조효소액은, α-이소말토실글루코 당질 생성 효소활성을8,440 단위, α-이소말토실 전이효소 활성을 약 28,000 단위, 환상 4당 생성활성을 약 17,700 단위를 가진 것이 밝혀졌다. 이 조효소액을, 실험예 2-1에 기재한 『Sepabeads FP-DA13』겔을 사용한 이온 교환 크로마토그래피에 사용하였다. α-이소말토실글루코 당질 생성 효소활성, α-이소말토실 전이효소 활성, 환상 4당 생성활성의 모두가, 『Sepabeads FP-DA13』겔에 흡착하지 않고 비흡착 획분으로 용출하였다. 이 비흡착 획분을 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하여 Amersham Pharmacia Biotechnology 주식회사제 『Sephacryl HR S-200』겔을 사용한 어피니티 크로마토그래피(겔 량 500ml)에 사용하였다. 효소활성은, 『Sephacryl HR S-200』겔에 흡착하고, 황산 암모늄 1M으로부터 OM의 리니어 그래디언트, 더욱 계속하여 말토테트라오스 OmM으로부터 100mM의 리니어 그래디언트에서 용출시킨 결과, α-이소말토실 전이효소활성 성분과 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소는 분리해서 용출하고, α-이소말토실 전이효소 활성성분은 황산 암모늄의 리니어 그래디언트에서 그 농도가 약 0.3M 부근에서 용출하며, α -이소말토실글루코 당질생성 효소 활성은 말토테트라오스의 리니어 그래디언트에서 그 농도가 약 30mM 부근에서 용출하였다. 따라서 α-이소말토실 전이효소 활성획분과 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소 획분을 따로따로 수집하여 회수하였다.
실험예 4: α-이소말토실글루코 당질 생성 효소와 α-이소말토실 전이효소의 단리
<실험예 4-1: α-이소말토실글루코 당질 생성 효소의 단리>
실험예 3에서 얻은 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소획분을 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하여 일본국의 Tosoh 주식회사제 『Butyl-Toyopearl 650M』겔을 사용한 소수 크로마토그래피(겔 량 350ml)에 사용하였다. 이 효소는, 『Butyl-Toyopearl 650M』겔에 흡착하고, 황산 암모늄 1M으로부터 OM의 리니어 그래디언트에서 용출시킨 결과, 황산 암모늄농도 약 0.3M 부근에서 흡착한 효소가 용출하여, 이 효소활성을 나타내는 획분을 수집해서 회수하였다. 다시, 이 회수액을 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하여 『Sephacryl HR S-200』겔을 사용한 어피니티 크로마토그래피를 이용해서 정제하였다. 이 정제의 각 스텝에 있어서의 α-이소말토실글루코 당질 생성효소 활성량, 비활성, 수율을 표 5에 나타낸다.
[표 5]
공 정 α-이소말토실글루코 당질생성 효소활성량(단위) α-이소말토실글루코 당질생성 효소 비활성(단위/mg 단백) 수율(%)
배양 상청 9,180 0.14 100
황산 암모늄 염석후의 투석액 8,440 0.60 91.9
이온교환 칼럼 용출액 6,620 1.08 72.1
어피니티 칼럼 용출액 4,130 8.83 45.0
소수 칼럼 용출액 3,310 11.0 36.1
어피니티 칼럼 용출액 2,000 13.4 21.8
정제한 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소를 7.5w/v％ 농도의 폴리아크릴아미드를 함유하는 겔 전기 영동에 의해 이 효소의 순도를 검정한 결과, 단백 밴드는 단일이어서 순도가 높은 효소 표품이었다.
<실험예 4-2: α-이소말토실글루코 당질 생성 효소의 성질>
실험예 4-1에서 얻은 정제 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소를 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법(겔 농도 7.5w/v％)에 사용하고, 동시에 영동한 분자량 마아커(일본 바이오·랏도·라보라토리즈 주식회사제)와 비교해서 이 효소의 분자량을 측정한 결과, 분자량 약 137,000 ±20,000 달톤이었다.
정제 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소를 2w/v％ 앰폴라인(Amersham Pharmacia Biotechnology사제) 함유 등전점 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법에 사용하고, 영동 후, 단백 밴드 및 겔의 pH를 측정해서 이 효소의 등전점을 구한 결과, 등전점은 pI 약 5.2 ±0.5이었다.
이 효소활성에 미치는 온도, pH의 영향을 활성측정의 방법에 준해서 조사하였다. 그리고 온도의 영향에 대해서는, Ca2+비존재하와 1mM 존재하에서 측정하였다. 이들 결과를 제9도(온도의 영향), 제10도(pH의 영향)에 나타내었다. 효소의 최적 온도는 pH 6.0, 60분간 반응에서 약 45℃（Ca2+비존재), 약 50℃（Ca2+1mM 존재), 최적 pH는 35℃, 60분간 반응에서 약 6.0이었다. 이 효소의 온도 안정성은 효소용액(20mM 아세트산 완충액, pH 6.0)을 Ca2+비존재하 또는 1mM 존재하에서 각 온도에서 60분간 유지하고 수냉한 후, 잔존하는 효소활성을 측정함으로써 구하였다. 그리고 pH 안정성은 이 효소를 각 pH 50mM 완충액 중에서 4℃, 24시간 유지한 후, pH를 6.0으로 조정하고, 잔존하는 효소활성을 측정함으로써 구하였다. 각각의결과를 제11도(온도 안정성), 제12도(pH 안정성)에 나타내었다. 이 효소의 온도 안정성은 약 40℃까지 (Ca2+비존재), 약 45℃까지 (Ca2+1mM 존재)이고, pH 안정성은 약 5.0 내지 10.0이었다.
이 효소활성에 미치는 금속 이온의 영향을 농도 1mM의 각종 금속염 존재하에서 활성측정의 방법에 준해서 조사하였다. 그 결과를 표 6에 나타낸다.
[표 6]
금속 이온 상대활성(%) 금속 이온 상대활성(%)
무첨가 100 Hg2+ 4
Zn2+ 91 Ba2+ 65
Mg2+ 98 Sr2+ 83
Ca2+ 109 Pb2+ 101
Co2+ 96 Fe2+ 100
Cu2+ 23 Fe3+ 102
Ni2+ 93 Mn2+ 142
Al3+ 100 EDTA 24
표 6의 결과로부터 명백한 바와 같이, 이 효소활성은, Hg2+, Cu2+, EDTA에 의해서 현저하게 저해되고, Ba2+, Sr2+에 의해서 저해되었다. Ca2+, Mn2+에 의해서 활성화되는 것도 밝혀졌다.
<실험예 4-3: α-이소말토실글루코 당질 생성 효소의 아미노산 서열>
본 발명은 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소 자체에 관한 발명은 아니며, 또한, 그 상세한 아미노산 서열의 분석 방법에 대해서는 일본국 특원2001 -5441호명세서에 상세히 개시되어 있는 바로부터 할애하는데, 실험예 4-1에서 얻은 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소는 일본국 특원2001-5441호 명세서에 개시되어 있는 폴리펩티드와 마찬가지로 서열표에 있어서의 서열번호 1에 병기한 아미노산 서열에 있어서의 제36 내지 1284 번째의 아미노산 서열을 가진다.
<실험예 4-4: α-이소말토실 전이효소의 단리>
실험예 3에서 얻은 α-이소말토실 전이효소 획분을, 1M 황산 암모늄을 함유한 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하여 일본국의 Tosoh 주식회사제 『Butyl-Toyopearl 650M』겔을 사용한 소수 크로마토그래피(겔 량 350ml)에 사용하였다. 이 효소는, 『Butyl-Toyopearl 650M』 겔에 흡착하고, 황산 암모늄 1M로부터 OM의 리니어 그래디언트에서 용출시킨 결과, 황산 암모늄농도 약 0.3M 부근에서 흡착한 효소가 용출하여, 이 효소활성을 나타내는 획분을 수집하여 회수하였다. 다시, 이 회수액을 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.07)에 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하여 『Sephacryl HR S-200』 겔을 사용한 어피니티 크로마토그래피를 사용해서 정제하였다. 이 정제의 각 스텝에서의 α-이소말토실 전이효소 활성량, 비활성, 수율을 표 7에 나타낸다.
[표 7]
공 정 α-이소말토실 전이효소 활성량(단위) α-이소말토실전이효소 비활성(단위/mg 단백) 수율(%)
배양 상청 30,400 0.45 100
황산 암모늄 염석후의 투석액 28,000 1.98 92.1
이온교환 칼럼 용출액 21,800 3.56 71.7
어피니티 칼럼 용출액 13,700 21.9 45.1
소수 칼럼 용출액 10,300 23.4 33.9
어피니티 칼럼 용출액 5,510 29.6 18.1
<실험예 4-5: α-이소말토실 전이효소의 성질>
실험예 4-4에서 얻은 정제 α-이소말토실 전이효소를 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법(겔 농도 7.5w/v％)에 사용하고, 동시에 영동한 분자량 마아커(일본 바이오·랏도·라보라토리즈 주식회사제)와 비교해서 이 효소의 분자량을 측정한 결과, 분자량 약 102,000 ±20,000 달톤이었다.
정제 α-이소말토실 전이효소를 2w/v％ 앰폴라인(Amersham Pharmacia Biotechnology사제) 함유 등전점 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법에 사용하고, 영동후, 단백 밴드 및 겔의 pH를 측정해서 이 효소의 등전점을 구한 결과, 등전점은 pI 약 5.6 ±0.5이었다.
이 효소활성에 미치는 온도, pH의 영향을 활성측정의 방법에 준해서 조사하였다. 그 결과를 제13도(온도의 영향), 제14도(pH의 영향)에 나타내었다. 효소의 최적 온도는 pH 6.0, 30분간 반응에서 약 50℃, 최적 pH는 35℃, 30분간 반응에서 약 5.5 내지 6.0이었다. 이 효소의 온도 안정성은, 효소용액(20mM 아세트산 완충액, pH 6.0)을 각 온도에서 60분간 유지하고, 수냉한 후, 잔존하는 효소활성을 측정함으로써 구하였다. 또한, pH 안정성은, 이 효소를 각 pH 50mM 완충액 중에서 4℃, 24시간 유지한 후, pH를 6.0으로 조정하고, 잔존하는 효소활성을 측정함으로써 구하였다. 각각의 결과를 제15도(온도 안정성), 제16도(pH 안정성)에 나타내었다. 이 효소의 온도 안정성은 약 40℃까지이고, pH 안정성은 약 4.5 내지 9.0이었다.
이 효소활성에 미치는 금속 이온의 영향을 농도 1mM의 각종 금속염 존재하에서 활성측정의 방법에 준해서 조사하였다. 그 결과를 표 8에 나타낸다.
[표 8]
금속 이온 상대활성(%) 금속 이온 상대활성(%)
무첨가 100 Hg2+ 2
Zn2+ 83 Ba2+ 90
Mg2+ 91 Sr2+ 93
Ca2+ 91 Pb2+ 74
Co2+ 89 Fe2+ 104
Cu2+ 56 Fe3+ 88
Ni2+ 89 Mn2+ 93
Al3+ 89 EDTA 98
표 8의 결과로부터 명백한 바와 같이, 이 효소활성은 Hg2+에 의해서 현저하게 저해되고, Cu2+에 의해서 저해되었다. 또한, Ca2+에 의해서 활성화되지 않는 것도, EDTA에 의해서 저해되지 않는 것도 알았다.
<실험예 4-6: α-이소말토실 전이효소의 아미노산 서열>
본 발명은 α-이소말토실 전이효소 자체에 관한 발명이 아니고, 또한, 그 상세한 아미노산 서열의 분석 방법에 대해서는 일본국 특원2000-350142호 명세서에 상세히 개시되어 있는 바로부터 할애하는데, 실험예 4-4에서 얻은 α-이소말토실전이효소는 일본국 특원2000-350142호 명세서에 개시되어 있는 바와 같이, 서열표에 있어서의 서열번호 2에 병기한 아미노산 서열에 있어서의 제30 내지 1093번째의 아미노산 서열을 가진다.
실험예 5: α-이소말토실글루코 당질 생성 효소의 각종 당질에의 작용
각종 당질(기질)에 대한 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소의 작용에 대해서 시험하였다. 즉, 말토오스, 말토트리오스, 말토테트라오스, 말토펜타오스, 말토헥사오스, 말토헵타오스, 이소말토오스, 이소말토트리오스, 파노오스, 이소파노오스, α, α-트레할로오스, 코지비오스, 니게로오스, 네오트레할로오스, 셀로비오스, 겐티비오스, 말티톨, 말토트리이톨, 락토오스, 수크로오스, 에를로오스, 세라기노오스, 말토실글루코시드, 이소말토실글루코시드를 함유하는 용액을 조제하고, 이들 용액에, 실험예 2-1에서 얻은 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소, 또는 실험예 4-1에서 얻은 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소 표품을 기질 고형물 그램당 각각 2 단위씩 가하여 기질농도를 2％(w/v)로 조제하고, 30℃, pH 6.0에서 24시간 반응시켰다. 효소반응 전후의 반응액을 실리카 겔 박층 그로마토그래피(이하, 『TLC법』이라고 약기한다.) 분석에 사용하였다. TLC법은, 전개 용매로서 n-부탄올, 피리딘, 물 혼합액(용량비 6:4:1), 박층 플레이트로서 메르크사제 『키젤겔 60』(알루미늄 플레이트, 20 ×20cm)을 사용하여 2회 전개해서 당질을 분리하고, 이어서 알루미늄 플레이트 위에 황산-메탄올을 분무해서 발색시켜 전체 당질을 검출하고, 더욱이 환원 당질은, 디페닐아민아닐린법으로 발색시켜 검출하는 방법에 의해 실시하였다. TLC법의 결과를 표 9에 나타낸다.
[표 9]
기 질 효소작용 기 질 효소작용
C9효소 C11효소 C9효소 C11효소
말토오스 ＋ ＋ 니게로오스 ＋ ＋
말토트리오스 ＋＋ ＋＋ 네오트레할로오스 ＋ ＋
말토테트라오스 ＋＋＋ ＋＋＋ 셀로비오스 - -
말토펜타오스 ＋＋＋ ＋＋＋ 겐티비오스 - -
말토헥사오스 ＋＋＋ ＋＋＋ 말티톨 - -
말토헵타오스 ＋＋＋ ＋＋＋ 말토트리이톨 ＋ ＋
이소말토오스 - - 락토오스 - -
이소말토트리오스 - - 수크로오스 - -
파노오스 - - 에를로오스 ＋ ＋
이소파노오스 ＋＋ ＋＋ 세라기노오스 - -
트레할로오스 - - 말토실글루코시드 ＋＋ ＋＋
코지비오스 ＋ ＋ 이소말토실글루코시드 - -
주: 효소반응 전후에서,
「-」는 변화없음을 나타내고,
「+」는 기질의 스폿이 약간 감소하고, 다른 생성물이 나타남을 나타내고,
「++」는 기질의 스폿이 상당히 감소하고, 다른 생성물이 나타남을 나타내고,
「+++」는 기질의 스폿이 거의 소실하고, 다른 생성물이 나타남을 나타낸다.
표 9의 결과로부터 명백한 바와 같이, α-이소말토실글루코 당질생성 효소는, 시험한 많은 종류의 당질의 중에서, 글루코오스 중합도 3 이상이고, 비환원 말단에 말토오스 구조를 가진 당질에 잘 작용하는 것이 밝혀졌다. 또한, 글루코오스 중합도가 2인 당질에서는, 말토오스, 코지비오스, 니게로오스, 네오트레할로스, 말토트리이톨, 에를로오스에도 약간 작용하는 것이 밝혀졌다.
실험예 6: 말토올리고당으로부터의 생성물
농도 1％의 말토오스, 말토트리오스, 말토테트라오스 또는 말토펜타오스 수용액에, 실험예 4-1에서 얻은 정제 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소를 고형물 그램당, 말토오스 및 말토트리오스에 대하여는 2 단위, 말토테트라오스에 대하여는 0.2 단위, 말토펜타오스에 대하여는 0.1 단위 가하고, 35℃, pH 6.0에서 8시간 작용시킨 후, 100℃에서 10분간 유지하여 효소를 실활시켜서 반응을 정지하였다. 얻어진 효소반응액의 당조성을 HPLC법에 의해 측정하였다. HPLC법으로서는, 『YMC Pack ODS-AQ303 』 칼럼(일본국의 주식회사 Y·M·C사제)을 이용하고, 칼럼 온도 40℃, 유속 0.5ml/min 물의 조건하에서 실시하고, 검출은 시차(示差) 굴절계(상품명 『RI-8012』, 일본국의 Tosoh 주식회사제)를 이용해서 하였다. 그 결과를 표 10에 나타낸다.
[표 10]
반응에서 생성한 당질의 종류 기 질
말토오스 말토트리오스 말토테트라오스 말토펜타오스
글루코오스 8.5 0.1 0.0 0.0
말토오스 78.0 17.9 0.3 0.0
말토트리오스 0.8 45.3 22.7 1.9
말토테트라오스 0.0 1.8 35.1 19.2
말토펜타오스 0.0 0.0 3.5 34.4
말토헥사오스 0.0 0.0 0.0 4.6
이소말토오스 0.5 0.0 0.0 0.0
글루코실말토오스 8.2 1.2 0.0 0.0
글루코실말토트리오스 2.4 31.5 6.8 0.0
X 0.0 2.1 30.0 11.4
Y 0.0 0.0 1.4 26.8
Z 0.0 0.0 0.0 1.7
기타 0.6 0.1 0.2 0.0
표 중에서, 글루코실말토오스는 α-이소말토실글루코오스(별명, 62-O-α-글루코실말토오스, 파노오스)이고, 글루코실말토트리오스는 α-이소말토실말토오스(별명, 63-O-α-글루코실말토트리오스)이며, X는 실험예 7에 기재된 α-이소말토실글루코트리오스(별명, 64-O-α-글루코실말토테트라오스)이며, Y는 실험예 7에 기재된 α-이소말토실글루코테트라오스(별명, 65-O-α-글루코실말토펜타오스)이고, Z는 미확인의 당질임.
표 10의 결과로부터 명백한 바와 같이, 이 효소의 작용의 결과, 기질 말토오스로부터는, 주로 글루코오스와 α-이소말토실글루코오스(별명, 62-O-α-글루코실말토오스, 파노오스)가 생성하고, 말토트리오스, 이소말토오스, α-이소말토실말토오스(별명, 63-O-α-글루코실말토트리오스)를 소량 생성하는 것이 판명되었다. 또한, 기질 말토트리오스로부터는, 주로 말토오스와 α-이소말토실말토오스가 생성하고, 소량이지만 글루코오스, 말토테트라오스, α-이소말토실글루코오스(별명, 62-O-α-글루코실말토스, 파노오스), 생성물 Ⅹ가 생성하는 것이 밝혀졌다. 기질 말토테트라오스로부터는, 주로 말토트리오스와 생성물 Ⅹ가 생성하고, 소량이지만 말토오스, 말토펜타오스, α-이소말토실말토오스(별명, 63-O-α-글루코실말토트리오스), 생성물 Y가 생성하는 것이 밝혀졌다. 기질 말토펜타오스로부터는, 주로 말토테트라오스와 생성물 Y가 생성하고, 소량이지만 말토트리오스, 말토헥사오스, 생성물 Ⅹ및 생성물 Z가 생성하는 것이 판명되었다.
기질 말토테트라오스로부터의 주생성물인 생성물 Ⅹ 및 기질 말토펜타오스로부터의 주생성물인 생성물 Y의 단리·정제를 하였다. 분취용 HPLC 칼럼 『YMC-Pack ODS-A R355-15S-15 12A』(일본국의 주식회사 YMC제)을 사용하여 정제함으로써, 상기한 말토테트라오스로부터의 반응물, 말토펜타오스로부터의 반응물 각각으로부터 순도 99.9％ 이상의 생성물 Ⅹ를 고형물 수율 약 8.3％로, 순도 99.9％ 이상의 생성물 Y를 고형물 수율 약 11.5％로 단리하였다.
실험예 7: 생성물의 구조해석
실험예 6의 방법으로 얻은 생성물 Ⅹ 및 생성물 Y를 사용하고, 통상적인 방법에 따라 메틸화 분석과 NMR 분석을 하였다. 메틸화 분석의 결과는 표 11에 정리하였다. NMR 분석의 결과에 대해서는,1H-NMR 스펙트럼을 제17도(생성물 Ⅹ), 제18도(생성물 Y)에,13C-NMR 스펙트럼 및 귀속(歸屬)을 제19도(생성물 Ⅹ), 제20도(생성물 Y), 표 1에 정리하였다.
[표 11]
분석 메틸화물의 종류 조성비
생성물 X 생성물 Y
2,3,4-트리메틸화물 1.00 1.00
2,3,6-트리메틸화물 3.05 3.98
2,3,4,6-테트라메틸화물 0.82 0.85
[표 12]
NMR 화학 시프트값(ppm)
글루코오스 번호 탄소번호 생성물 X 생성물 Y
a 1a 100.8 100.8
2a 74.2 74.2
3a 75.8 75.7
4a 72.2 72.2
5a 74.5 74.5
6a 63.2 63.1
b 1b 102.6 102.6
2b 74.2 74.2
3b 75.8 75.7
4b 72.1 72.1
5b 74.0 74.0
6b 68.6 68.6
c 1c 102.3 102.3
2c 74.2 74.2
3c 76.0 76.0
4c 79.6 79.5
5c 73.9 73.9
6c 63.2 63.1
d 1d 102.2 102.3
2d 74.0(α), 74.4(β) 74.2
3d 76.0 76.0
4d 79.8 79.5
5d 73.9 73.9
6d 63.2 63.1
e 1e 94.6(α), 98.5(β) 102.1
2e 74.2(α), 76.7(β) 74.0(α), 74.4(β)
3e 75.9(α), 78.9(β) 76.0
4e 79.6(α), 79.4(β) 79.8
5e 72.6(α), 77.2(β) 73.9
6e 63.4(α), 63.4(β) 63.1
f 1f 94.6(α), 98.5(β)
2f 74.2(α), 76.7(β)
3f 76.0(α), 78.9(β)
4f 79.6(α), 79.5(β)
5f 72.6(α), 77.2(β)
6f 63.3(α), 63.3(β)
이들 결과로부터, α-이소말토실글루코 당질 생성 효소에 의한 말토테트라오스로부터의 생성물 Ⅹ는, 말토테트라오스의 비환원 말단 글루코오스의 6위치 히드록실기에 글루코오스기가 α결합한 5당이고, 구조식 1로 나타내어지는 α-이소말토실글루코트리오스(별명, 64-O-α-글루코실말토테트라오스)인 것이 밝혀졌다.
구조식 1:
αD-Glcp(1→6)αD-Glcp(1→4)αD-Glcp(1→4)αD-Glcp(1→4)D-Glcp
그리고 말토펜타오스로부터의 생성물 Y는, 말토펜타오스의 비환원 말단 글루코오스의 6위치 히드록실기에 글루코실기가 α결합한 6당이고, 구조식 2로 나타내어지는 α-이소말토실글루코테트라오스(별명, 65-O-α-글루코실말토펜타오스)인 것이 밝혀졌다.
구조식 2:
αD-Glcp(1→6)αD-Glcp(1→4)αD-Glcp(1→4)αD-Glcp(1→4)αD-Glcp(1→4)D-Glcp
이상으로부터, α-이소말토실글루코 당질 생성 효소의 말토올리고당에 대한 작용은 아래와 같이 판단되었다.
(1) 이 효소는, 기질로서, α-1,4 결합으로 된 글루코오스 중합도 2 이상의 당질(말토올리고당)에 작용하여, 그 비환원성 말단의 글루코실 잔기를 다른 분자의 비환원성 말단의 글루코실 잔기의 6위치에 전이하는 작용을 가진 분자간 6-글루코실 전이를 촉매하고, 비환원 말단에 6-O-α-글루코실기를 가진, 글루코오스 중합도가 1 증가한 α-이소말토실글루코 당질(별명, 6-O-α-글루코실말토올리고당)과, 글루코오스 중합도가 1 감소한 말토올리고당을 생성한다.
(2) 이 효소는, 4-글루코실 전이도 약간 촉매하여, 말토올리고당으로부터 글루코오스 중합도가 1 증가한 말토올리고당과, 글루코오스 중합도가 1 감소한 말토올리고당을 약간 생성한다.
실험예 8: 전이 수용체 특이성
각종 당질을 사용하여, 이 효소가 당전이 수용체로 될 수 있는가 아닌가의 시험을 하였다. 즉, D-글루코오스, D-크실로오스, L-크실로오스, D-갈락토오스, D-프룩토스, D-만노스, D-아라비노오스, D-푸코오스, L-소르보오스, L-람노오스, 메틸―α-글루코시드, 메틸―β-글루코시드, N-아세틸-글루코사민, 소르비톨, α,α-트레할로오스, 이소말토오스, 이소말토트리오스, 셀로비오스, 겐티비오스, 말티톨, 락토오스, 수크로오스, α-사이클로덱스트린, β-사이클로덱스트린 또는 γ-사이클로덱스트린을 사용하여 농도 1.6％의 용액(당전이 수용체 용액)을 조제하고, 여기에, 당공여체로서 전분 부분 분해물 『파인덱스＃100』(농도 4％)을 가하고, 실험예 2-1의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질생성효소 또는 실험예 4-1에서 얻은 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소를, 당공여체 고형물 그램당, 각각 1 단위씩 가하고, 이것을 30℃, pH 6.0에서 24시간 반응시켰다. 효소반응후의 반응액을, 당수용체가 단당 또는 이당류인 경우는 가스 크로마토그래피법(이하, 『GLC법』이라 약기한다.)에 의해, 당수용체가 3당류 이상인 경우는 HPLC법에 의해 분석하고, 각각의 당수용체가 이 효소에 의한 당전이 수용체로 되는가 아닌가를 확인하였다. 그리고 GLC법에 있어서, GLC장치는 『GC-16A』(일본국의 주식회사 島津제작소제), 칼럼은 지·엘·사이언스 주식회사제 『2％ 실리콘 OⅤ-17/크로모소르브W』를 충전한 스테인레스제 칼럼(3mmφ×2m), 캐리어 가스는 질소 가스를 유량 40ml/분에서 160℃로부터 320℃까지 7.5℃／분의 속도로 승온하고, 검출은 수소염 이온 검출기로 분석하였다. HPLC에서는, HPLC의 장치는 일본국의 Tosoh 주식회사제 『CCPD』, 칼럼은 『ODS-AQ-303』(일본국의 주식회사 YMC사제), 용리액은 물을 유속 0.5ml/분으로, 검출은 시차 굴절형으로 분석하였다. 그 결과를 표 13에 나타낸다.
[표 13]
당 질 당전이 생성물 당 질 당전이 생성물
C9효소 C11효소 C9효소 C11효소
D-글루코오스 ＋ ＋ 소르비톨 - -
D-크실로오스 ＋＋ ＋＋ 트레할로오스 ＋＋ ＋＋
L-크실로오스 ＋＋ ＋＋ 이소말토오스 ＋＋ ＋＋
D-갈락토오스 ＋ ＋ 이소말토트리오스 ＋＋ ＋＋
D-푸룩토오스 ＋ ＋ 셀로비오스 ＋＋ ＋＋
D-만노오스 - - 겐티비오스 ＋＋ ＋＋
D-아라비노오스 ± ± 말티톨 ＋＋ ＋＋
D-푸코오스 ＋ ＋ 락토오스 ＋＋ ＋＋
L-소르보오스 ＋ ＋ 수크로오스 ＋＋ ＋＋
L-람노오스 - - α-시클로덱스트린 - -
메틸-α-글루코오스 ＋＋ ＋＋ β-시클로덱스트린 - -
메틸-β-글루코오스 ＋＋ ＋＋ γ-시클로덱스트린 - -
N-아세틸글루코사민 ＋ ＋
표 중에서,
「-」는 수용체로의 당전이물이 검출되지 않았음을 나타내고,
「±」는 수용체로의 당전이물이 검출되었으나, 그 생성량이 1% 미만이었음을 나타내며,
「+」는 수용체로의 당전이물이 1% 이상 10% 미만이었음을 나타내고,
「++」는 수용체로의 당전이물이 10% 이상이었음을 나타낸다.
표 13의 결과로부터 명백한 바와 같이, α-이소말토실글루코 당질생성 효소는, 그 당전이 수용체로서 여러가지의 당질을 사용할 수 있고, 특히, D-크실로오스, L-크실로오스, 메틸―α-글루코시드, 메틸―β-글루코시드, α,α-트레할로오스, 이소말토오스, 이소말토트리오스, 셀로비오스, 겐티비오스, 말티톨, 락토오스 및 수크로오스에 잘 전이하고, 이어서, D-글루코오스, D-프룩토오스, D-푸코오스, L-소르보오스 및 N-아세틸글루코사민에도 전이하며, 더욱이는 D-아라비노오스에도 전이하는 작용을 가진 효소이다.
실험예 9: 배양물로부터의 환상 4당의 조제
전분 부분 분해물(상품명 『파인덱스＃1』, 일본국의 松谷화학 주식회사제) 5w/v％, 효모 추출물(상품명 『아사히 미스트』, 일본국의 아사히 맥주 주식회사제) 1.5w /v％, 인산 2칼륨 0.1w/v％, 인산 1나트륨·12수염 0.06w/v％, 황산 마그네슘·7수염 0.05w/v％, 및 물로 된 액체 배지를, 500ml 용량의 3각 플라스크에 100ml을 넣고, 오토클레이브에서 121℃, 20분간 멸균하고, 냉각하여 바실루스 글로비스포루스 C9(FERM BP-7143)를 접종하고, 27℃, 230rpm에서 48시간 회전 진탕 배양한 후, 원심분리해서 균체를 제거하여 배양 상청을 얻었다. 다시 이 배양 상청을 오토클레이브(120℃, 15분간)하고, 방냉한 후, 불용물을 원심분리해서 제거하여 상청을 회수하였다. 이 상청 약 90ml을 pH 5.0, 온도 45℃로 조정한 후, α-글루코시다아제(상품명 『트란스글루코시다아제 L 「아마노」』, 일본국의 天野제약 주식회사제)를 고형물 그램당 1,500 단위와 글루코아밀라아제(일본국의 나가세 생화학공업 주식회사 판매)를 고형물 그램당 75 단위 첨가해서 24시간 처리하고, 이어서 수산화 나트륨으로 pH를 12로 조정하여 2시간 펄펄 끓여 잔존하는 환원당을 분해하였다. 불용물을 여과해서 제거한 후, 일본국의 三菱화학제 이온교환 수지 『다이아이온 PK218』과 『다이아이온 WA30』을 사용해서 탈색, 탈염하고, 더욱이 일본국의 三菱화학제 캐타이온 교환 수지 『다이아이온 SK-1B 』와 일본국의 오르가노제 음이온 교환 수지 『IRA411』로써 다시 탈염하고, 활성탄으로 탈색하여 정밀여과한 후, 에바포레이터에서 농축하고, 동결 진공건조하여 고형물로서 약 0.6g의 당질분말을 얻었다. 이 당질분말은 환상 4당을 99.9％ 이상 함유하고 있었다.
실험예 10: 환상 4당의 생성
각종 당질을 사용하여 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소 및 α-이소말토실 전이효소의 작용에 의한 환상 4당 생성시험을 하였다. 당질로서, 말토오스, 말토트리오스, 말토테트라오스, 말토펜타오스, 아밀로오스, 가용성 전분, 전분 부분 분해물(상품명 『파인덱스#100』, 일본국의 松谷화학 주식회사제) 또는 글리코겐(굴 조개 유래, 일본국의 和光純藥 주식회사 판매)을 사용하여 이들의 수용액을 따로 따로 조제하였다.
이들 수용액(농도 0.5％)에, 실험예 4-1에서 얻은 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질생성 효소를 고형물 그램당 1 단위와, 실험예 4-4의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 정제 α-이소말토실 전이효소를 고형물 그램당 10 단위를 가하고, 이들을 30℃, pH 6.0에서 작용시켰다. 작용 조건은, 아래의 4가지의 계(系)에서 실시하였다.
(1) α-이소말토실글루코 당질 생성 효소를 각종 당질에 24시간 작용시킨 후, 효소를 열실활하고, 계속하여 α-이소말토실 전이효소를 24시간 작용시킨 후, 효소를 열실활시켰다.
(2) α-이소말토실글루코 당질 생성 효소와 α-이소말토실 전이효소를 24시간 작용시킨 후, 효소를 열실활시켰다.
(3) α-이소말토실글루코 당질 생성 효소만을 24시간 작용시킨 후, 효소를 열실활시켰다.
(4) α-이소말토실 전이효소만을 24시간 작용시킨 후, 효소를 열실활시켰다.
이들 열실활시킨 반응액 중의 환상 4당의 생성량을 조사하기 위해서, 실험예 1과 마찬가지의 α-글루코시다아제와 글루코아밀라아제를 사용해서 처리하고, 잔존하는 환원성 올리고당을 가수분해하여, HPLC법으로 환상 4당을 정량하였다. 이들 결과를 표 14에 나타낸다.
[표 14]
기 질 환상 4당 생성량(%)
α-이소말토실글루코 당질생성 효소 작용후, α-이소말토실 전이효소를 작용 α-이소말토실글루코 당질생성 효소와 α-이소말토실 전이효소를 동시에 작용 α-이소말토실글루코 당질생성 효소만의 작용 α-이소말토실 전이효소만의 작용
말토오스 4.0 4.2 0.0 0.0
말토트리오스 10.2 12.4 0.0 0.0
말토테트라오스 11.3 21.5 0.0 0.0
말토펜타오스 10.5 37.8 0.0 0.0
아밀로오스 3.5 31.6 0.0 0.0
가용성 전분 5.1 38.2 0.0 0.0
전분 부분 분해물 6.8 63.7 0.0 0.0
글리코겐 10.2 86.9 0.0 0.0
표 14의 결과로부터 명백한 바와 같이, 시험한 어느 당질이라도 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소만의 작용 및 α-이소말토실 전이효소만의 작용에서는 환상 4당은 전혀 생성하지 않았음에 대해서, α-이소말토실글루코 당질 생성 효소와 α-이소말토실 전이효소를 병용함으로써 환상 4당이 생성하였다. 그 생성량은, α-이소말토실글루코 당질 생성 효소를 작용시킨 후에 α-이소말토실 전이효소를 작용시켰을 경우에는 약 11％ 이하로서 비교적으로 낮은 것에 대해서, α-이소말토실글루코 당질 생성 효소와 α-이소말토실 전이효소를 병용하면 어느 당질에서도 환상 4당의 생성량은 향상하고, 특히, 글리코겐에서는 약 87％로 증가하고, 전분 부분 분해물에서는 약 64％로 증가하는 것이 판명되었다.
α-이소말토실글루코 당질 생성 효소와 α-이소말토실 전이효소의 병용에 있어서의 환상 4당의 생성 메커니즘은, 양(兩)효소의 반응특성으로부터 아래와 같이 추찰된다.
(1) α-이소말토실글루코 당질 생성 효소는, 글리코겐이나 부분 분해물 등의 α-1,4 글루칸 체인의 비환원 말단 글루코오스기에 작용하여 그 글루코오스기를, 다른 α-1,4 글루칸 체인의 비환원 말단 글루코오스기의 6위치 히드록실기에 분자간 전이시켜, 비환원 말단에 α-이소말토실기를 가진 α-1,4 글루칸 체인이 생성한다.
(2) α-이소말토실 전이효소는, 비환원 말단에 이소말토실기를 가진 α-1,4 글루칸 체인에 작용하여 그 이소말토실기를, 다른 비환원 말단에 이소말토실기를가진 α-1,4 글루칸 체인의 비환원 말단 글루코오스기의 3위치 히드록실기에 분자간 전이시켜, 비환원 말단에 이소말토실-1,3-이소말토실기를 가진 α-1,4 글루칸 체인이 생성한다.
(3) 계속해서, α-이소말토실 전이효소는, 그 비환원 말단에 이소말토실-1,3-이소말토실기를 가진 α-1,4 글루칸 체인에 작용하여 분자내 전이 작용에 의해 이소말토실-1,3-이소말토실기를 α-1,4 글루칸 체인으로부터 잘라 떼어버리고, 고리화(環化)하여 환상 4당이 생성한다.
(4) 잘라 떼어버려진 α-1,4 글루칸 체인은, 다시, (1) 내지 (3)의 반응을 경유함으로써 새로이 환상 4당이 생성한다. α-이소말토실글루코 당질 생성 효소와 α-이소말토실 전이효소의 병용에서 상기한 바와 같이 양(兩)효소가 반복하여 작용해서 환상 4당의 생성량이 증가한다고 추정된다.
실험예 11: 전분 액화도의 영향
옥수수 전분을 농도 15％의 전분유(澱粉乳)로 하고, 여기에 탄산 칼슘을 0.1％ 가해서 pH 6.0으로 조정하고, α-아밀라아제(상품명 『타마밀 60L』, 노보사제)를 전분 그램당 0.2 내지 2.0％을 가하여, 95℃에서 10분간 반응시킨 다음, 120℃에서 20분간 오토클레이브하고, 약 35℃로 급냉하여 DE 3.2 내지 20.5의 액화 용액을 얻고, 여기에 실험예 4-1에서 얻은 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소를 고형물 그램당 2 단위와, 실험예 4-4의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 Cl1 유래의 정제 α-이소말토실 전이효소를 고형물 그램당 20 단위를 가하고 35℃에서 24시간 반응시켰다. 100℃에서 15분간열처리하여 효소를 실활시켰다. 계속해서, 실험예 1과 마찬가지로 α-글루코시다아제와 글루코아밀라아제를 사용해서 처리하여 잔존하는 환원성 올리고당을 가수분해하고, HPLC법으로 환상 4당을 정량하였다. 이들 결과를 표 15에 나타낸다.
[표 15]
α-아밀라아제 사용량전분당(當)（％) DE 환상 4당 생성율(%)
0.2 3.2 54.5
0.4 4.8 50.5
0.6 7.8 44.1
1.0 12.5 39.8
1.5 17.3 34.4
2.0 20.5 30.8
표 15의 결과로부터 명백한 바와 같이, α-이소말토실글루코 당질생성 효소와 α-이소말토실 전이효소에 의한 환상 4당의 생성은, 전분의 액화의 정도에 의해서 영향을 받는데, 액화의 정도가 낮을수록, 즉, DE가 낮은 값일수록 전분으로부터의 환상 4당의 생성율은 높고, 반대로, 액화의 정도가 높을수록, 즉, DE가 높은 값일수록 전분으로부터의 환상 4당의 생성율이 낮은 것이 밝혀졌다. 구체적으로는, 전분의 부분 분해의 정도는 약 20 이하, 바람직하게는 DE 약 12 이하, 더욱 바람직하게는 DE 약 5 이하가 적합함이 판명되었다.
실험예 12: 전분 부분 분해물 농도의 영향
전분 부분 분해물 『파인덱스＃100』(DE 약 2 내지 약 5)의 최종농도 0.5 내지 40％의 수용액을 조제하고, 각각에, 실험예 4-1에서 얻은 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소를 고형물 그램당 1 단위와, 실험예 4-4에서 얻은 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 정제 α-이소말토실 전이효소를 고형물 그램당 10 단위 가하고, 이들 양(兩)효소를 병용하여 30℃, pH 6.0에서 48시간 작용시킨 후, 100℃에서 15분간 열처리해서 효소를 실활시켰다. 이어서 실험예 1과 마찬가지로 α-글루코시다아제와 글루코아밀라아제를 사용하여 잔존하는 환원성 올리고당을 가수분해하고, HPLC법으로 환상 4당을 정량하였다. 이들 결과를 표 16에 나타낸다.
[표 16]
파인덱스 농도(%) 환상 4당 생성량(%)
0.5 63.6
2.5 62.0
5 60.4
10 57.3
15 54.6
20 51.3
30 45.9
40 39.5
표 16의 결과로부터 명백한 바와 같이, 전분 부분 분해물의 농도가 0.5％의 저농도에서는 환상 4당의 생성량은 약 64％인데 대해, 농도 40％의 고농도에서는 환상 4당의 생성량은 약 40％로서, 기질인 전분 부분 분해물의 농도에 의존해서 환상 4당의 생성량이 변화하는 것이 판명되었다. 이 결과로부터, 환상 4당의 생성량은 전분 부분 분해물의 농도에 의해 변화한다는 것이 판명되었다.
실험예 13: 시클로덱스트린글루카노트란스페라아제 첨가 효과
전분 부분 분해물 『파인덱스＃100』 수용액(농도 15％)을 조제하고, 실험예4-1에서 얻은 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소를 고형물 그램당 1 단위와, 실험예 4-4에서 얻은 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 정제 α-이소말토실 전이효소를 고형물 그램당 10 단위와, 바실루스 스테아로더어모필루스 유래의 CGTase를 고형물 그램당 0 내지 0.5 단위 가하고, 이들 두 효소를 병용해서 30℃, pH 6.0에서 48시간 작용시킨 후, 100℃에서 15분간 열처리해서 효소를 실활시켰다. 이어서 효소반응액을 α-글루코시다아제(상품명 『트란스글루코시다아제 L 「아마노」』, 일본국의 天野제약 주식회사제)와 글루코아밀라아제(일본국의 나가세 생화학공업 주식회사 판매)를 사용하여 잔존하는 환원성 올리고당을 가수분해하고, HPLC법으로 환상 4당을 정량하였다. 이들 결과를 표 17에 나타낸다.
[표 17]
CGTase 첨가량(단위) 환상 4당 생성량(%)
0 54.6
2.5 60.1
5 63.1
10 65.2
표 17의 결과로부터 명백한 바와 같이, CGTase를 첨가함으로써 환상 4당의 생성량이 증가하는 것이 판명되었다.
실험예 15: 이소말토오스 유리 효소의 조제
덱스트란 3.O w/v％, 펩톤 0.7w/v％, 인산 2칼륨 0.2w/v％, 황산 마그네슘·7수염 0.05w/v％ 및 물로 된 액체 배지를 500ml 용량의 삼각 플라스크에100ml씩 넣어, 오토클레이브에서 121℃, 20분간 멸균하고, 냉각하여 아르드로박터 글로비포르미스(IAM 12103)를 접종하고, 27℃, 230rpm에서 48시간 회전진탕 배양한 것을 종배양으로 하였다. 용량 30L의 퍼멘터에 종배양의 경우와 동일 조성의 배지를 약 20L 넣고, 가열 멸균, 냉각하여 온도 27℃로 한 후, 종배양액 1v/v%을 접종하고, 온도 27℃, pH 6.0 내지 8.0으로 유지하면서, 72시간 통기 교반 배양하였다. 배양 후, 배양액 중의 이소말토오스 유리 효소로서의 이소말토덱스트라나아제 활성은 약 16.5 단위/ml이며, 원심분리(10,000rpm, 30분간)해서 회수한 후, 상청 약 18L의 효소활성을 측정한 결과, 이 효소는 약 16 단위/ml의 활성(총 활성 약 288,000 단위)이었다. 한편, 이소말토덱스트라나아제 활성의 측정은, 농도 0.1M 아세트산 완충액(pH 5.5)을 함유하는 농도 1.25w/v％ 덱스트란 수용액 4ml을 기질액으로 하고, 그 기질액에 효소액 1ml을 가하여 40℃에서 20분간 효소반응하고, 그 반응액으로부터 1ml을 취하여, 그것을 소모기 구리액 2ml에 가해서 반응을 정지시킨 후, 생성한 이소말토오스의 환원력을 소모기·넬슨법으로 정량함으로써 실시하였다. 이소말토덱스트라나아제의 활성 1 단위는, 상기의 조건하에서 1분간에 1μ몰의 이소말토오스에 상당하는 환원력을 생성하는 효소량으로 정의하였다. 배양 상청 약 18L을 UF막으로 약 2L로 농축한 후, 80％ 포화 황산 암모늄액으로 염석해서 4℃, 24시간 방치하였다. 그 염석 침전물을 원심분리(10,000rpm, 30분간)해서 회수하여 5mM 인산 완충액(pH 6.8)에 용해 후, 동일 완충액에 대하여 투석해서 조(粗)효소액 약 400ml을 얻었다. 이 조효소액을 『Sepabeads FP-DA13』겔을 사용한 이온 교환 크로마토그래피(겔 량 2L)에 사용하였다. 이소말토덱스트라나아제 활성은,『Sepabeads FP-DA13 』 겔에 흡착하지 않고, 비흡착 획분으로 용출하였다. 이 활성획분을 회수하고, 80％ 포화 황산 암모늄액으로 염석해서 4℃, 24시간 방치하였다. 그 염석 침전물을 원심분리(10,000rpm, 30분간)해서 회수하여 5mM 인산 완충액(pH 6.8)에 용해 후, 동일 완충액에 대하여 투석하여 이소말토덱스트라나아제 활성으로서 161,000 단위를 함유하는 부분 정제 효소액 약 500ml을 얻었다.
실험예 16: α-이소말토실글루코 당질 및 환상 4당으로부터의 이소말토오스의 조제
최종 고형물 농도 0.2％의 파노오스, α-이소말토실말토오스, α-이소말토실트리오스, α-이소말토실테트라오스, 또는 환상 4당 수용액에, 실험예 15의 방법으로 얻은 이소말토덱스트라나아제를 고형물 그램당 100 단위(환상 4당의 경우, 100 단위 또는 3000 단위)를 가하여 40℃, pH 5.5에서 24시간 작용시키고 100℃에서 20분간 유지해서 반응을 정지하였다. 그 효소반응액의 당조성을 HPLC법을 이용해서 측정하였다. HPLC는, 『MCIGEL CKO4SS』 칼럼(일본국의 三菱화학 주식회사제)을 사용하고, 칼럼내 온도 80℃, 용리액으로서의 물의 유속 0.5ml/min의 조건에서 실시하고, 검출은 시차 굴절계 『RI-8012』(일본국의 Tosoh 주식회사제)를 이용해서 하였다. 그 결과를 표 18에 나타낸다.
[표 18]
기 질 효소량(단위) 반응에서 생성한 당질(HPLC 면적 %)
G1 IM G2 G3 G4 A
IMG1 100 35 65 0 0 0 0
IMG2 100 0 51 49 0 0 0
IMG3 100 0 41 0 59 0 0
IMG4 100 0 35 0 0 65 0
환상 4당 100 0 22 0 0 0 78
3000 0 100 0 0 0 0
표 중에서, IMGl, IMG2, IMG3, IMG4는 각각, 파노오스, α-이소말토실말토오스, α -이소말토글루코트리오스, 이소말토글루코테트라오스를 의미하고, G1, IM, G2, G3, G4는 각각, 글루코오스, 이소말토오스, 말토오스, 말토트리오스, 말토테트라오스를 의미하며, A는 환상 4당으로부터 이소말토오스를 생성하는 과정에서의 중간체를 의미한다.
표 18의 결과로부터 명백한 바와 같이, α-이소말토실글루코 당질에 이소말토덱스트라나아제를 작용시킨 결과, 기질로서의 파노오스로부터는 글루코오스와 이소말토오스만이 생성하고, 기질로서의 α-이소말토실말토오스로부터는 이소말토오스와 말토오스만이 생성하며, 기질로서의 α-이소말토실트리오스로부터는 이소말토오스와 말토트리오스만이 생성하고, 기질로서의 α--이소말토실테트라오스로부터는 이소말토오스와 말토테트라오스만이 생성하는 것이 판명되었다. 한편, 기질로서의 환상 4당으로부터는 생성물 A를 중간체로 하여 이소말토오스만이 생성하는 것이 판명되었다.
이어서, 기질로서의 환상 4당으로부터의 중간체인 생성물 A의 정제와 단리를 하였다. 즉, 분취용 HPLC칼럼 『YMC-Pack ODS-A R355-15S-15 12A』(일본국의 주식회사 YMC사제)을 사용하여 생성물 A를 정제하여 단리함으로써, 상기의 환상 4당으로부터의 반응물로부터 순도 98.2％ 이상의 생성물 A를 고형물 수율 약 7.2％로서 단리하였다.
생성물 A에 대해서, 통상적인 방법에 따라서 메틸화 분석과 NMR 분석을 하였다. 메틸화 분석 결과는 표 19에 정리하였다. NMR 분석 결과에 대해서는1H-NMR 스펙트럼을 제21도에 나타내었다. 또한,13C-NMR 스펙트럼을 제22도에 나타내고, 그것들의 귀속을 표 20에 정리하였다.
[표 19]
분석 메틸화물의 종류 조성비
2,3,4-트리메틸화물 2.00
2,4,6-트리메틸화물 0.92
2,3,4,6-테트라메틸화물 0.88
[표 20]
글루코오스 번호 탄소 번호 NMR 화학 시프트값(ppm)
a 1a 100.7
2a 74.2
3a 75.8
4a 72.3
5a 74.5
6a 63.2
b 1b 102.1
2b 74.3
3b 75.9
4b5b6b 72.674.268.0
c 1c 100.6
2c 72.8
3c 83.0
4c 72.0
5c 73.1
6c 62.9
e 1e2e 94.9(α), 98.8(β)74.1(α), 76.6(β)
3e 75.8(α), 78.7(β)
4e 72.1(α), 72.1(β)
5e 72.6(α), 76.9(β)
6e 68.3(α), 68.3(β)
이들의 결과로부터, 이소말토덱스트라나아제에 의한 환상 4당으로부터 이소말토오스를 생성할 때의 중간체인 생성물 A는 환상 4당의 α-1,3 결합의 어느 하나가 가수분해해서 개환화한 4당류이고, 구조식 3으로 나타내어지는 α-글루코실-(1→6)-α-글루코실-(1→3 )-α-글루코실-(1→6)-α-글루코오스(개환 4당)인 것이 판명되었다.
구조식 3:
αD-Glcp(1→6)αD-Glcp(1→3)αD-Glcp-(1→6)αD-Glcp
이상으로부터, 이소말토덱스트라나아제의 α-이소말토실글루코 당질에 대한작용은 아래와 같이 판단된다.
이소말토덱스트라나아제는, 기질로서, 비환원 말단에 6-O-α-글루코실기를 가진 α-이소말토실글루코 당질에 작용하여 그 비환원성 말단의 이소말토실 잔기와 글루코오스(말토올리고당) 잔기 사이의 α-1,4 결합을 특이적으로 가수분해하여 이소말토오스와 글루코오스(말토올리고당)를 생성한다. 또한, 이소말토덱스트라나아제는, 기질로서, 환상 4당에도 작용하여 그 α-1,3 결합을 가수분해하고, 개환하여 중간체로서 개환 4당을 생성하고, 더욱이 개환 4당에도 작용하여 그 α-1,3 결합을 가수분해하여 이소말토오스를 생성한다.
실험예 17: 각종 기질로부터의 이소말토오스의 생성
각종 당질을 사용하여 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소 및 이소말토덱스트라나아제의 작용에 의한 이소말토오스의 생성에 대해서 시험하였다. 즉, 말토오스, 말토트리오스, 말토테트라오스, 말토펜타오스, 말토헥사오스, 말토헵타오스, 아밀로오스, 또는 전분 부분 분해물(상품명 『파인덱스＃100』, 일본국의 松谷화학 주식회사제)과 염화 칼슘을 사용하고, 각각 수용액의 당질 최종농도가 5％, 염화 칼슘 최종농도가 1mM이 되도록 조제하였다. 이어서, 실험예 4-1에서 얻은 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소를 고형물 그램당 0.2 단위와, 실험예 15의 방법으로 얻은 이소말토덱스트라나아제를 고형물 그램당 100 단위를 가하고, 이들을 40℃, pH 5.5에서 반응시켰다. 반응 조건은 아래의 두가지의 계에서 실시하였다.
(1) α-이소말토실글루코 당질 생성 효소를 당질에 65시간 작용시킨 후, 효소를 열실활하고, 계속하여 이소말토덱스트라나아제를 65시간 작용시킨 후, 효소를 열실활시켰다.
(2) α-이소말토실글루코 당질 생성 효소와 이소말토덱스트라나아제를 병용하여 당질에 65시간 작용시킨 후, 이들 효소를 가열 실활시켰다. 이어서, 가열 처리한 효소반응액 중의 이소말토오스 생성량을 HPLC법으로 정량하였다. 이들 결과를 표 21에 나타낸다.
[표 21]
기 질 이소말토오스 생성량(%)
α-이소말토실글루코 당질 생성 효소를 작용시킨 후, 이소말토덱스트라나아제를 작용 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소와 이소말토덱스트라나아제를 병용
말토오스 6.6 7.0
말토트리오스 15.7 18.7
말토테트라오스 15.8 45.4
말토펜타오스 15.3 55.0
말토헥사오스 10.1 58.1
말토헵타오스 8.5 63.6
아밀로로스 4.0 64.9
전분 부분 분해물 3.8 62.7
표 21의 결과로부터 명백한 바와 같이, 시험한 어떠한 당질로부터도 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소와 이소말토덱스트라나아제의 작용에 의해 이소말토오스가 생성하였다. 그 생성량은, α-이소말토실글루코 당질 생성 효소를 작용시킨 후에 이소말토덱스트라나아제를 작용시켰을 경우에는 약 15％ 이하로서 비교적으로 낮은데 대해서, α-이소말토실글루코 당질 생성 효소와 이소말토덱스트라나아제를 함께 작용시키면 어떠한 당질에 있어서도 이소말토오스의 생성량은 향상하고, 특히, 말토헵타오스, 아밀로오스, 전분 부분 분해물에서는 60％ 이상까지 증가하는 것이 판명되었다. 이 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소와 이소말토덱스트라나아제의 병용에서의 이소말토오스의 생성 메커니즘은 양(兩)효소의 반응 특성으로부터 아래와 같이 추정된다.
(1) α-이소말토실글루코 당질 생성 효소는, 아밀로오스나 전분 부분 분해물 등의 α-1,4 글루칸 체인의 비환원 말단 글루코오스기에 작용하여 그 글루코오스기를 다른 α-1,4 글루칸 체인의 비환원 말단 글루코오스기의 6위치 히드록실기에 분자간 전이시켜, 비환원 말단에 α-이소말토실기를 가진 α-1,4 글루칸 체인이 생성한다.
(2) 이소말토덱스트라나아제는, 비환원 말단에 이소말토실기를 가진 α-1,4 글루칸 체인에 작용하여 그 이소말토실기와 α-1,4 글루칸 체인 사이의 α-1,4 결합을 가수분해 하여 이소말토오스와 글루코오스 중합도가 2 감소한 글루칸 체인을 생성한다.
(3) 잘라 떼어버려진 α-1,4 글루칸 체인은, 다시, (1) 내지 (2)의 반응을 받음으로써 새로이 이소말토오스가 생성한다. α-이소말토실글루코 당질 생성 효소와 이소말토덱스트라나아제의 병용에서, 상기한 바와 같이, 이들 두 효소가 반복하여 작용해서 이소말토오스의 생성량이 증가한다고 추정된다.
실험예 18: 이소아밀라아제의 첨가 효과
전분 부분 분해물 『파인덱스＃100』 수용액(최종농도 5％, 1mM 염화 칼슘함유)을 조제하고, 실험예 4-1에서 얻은 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질생성 효소를 전분 그램당 0.2 단위와, 실험예 15에서 얻은 이소말토덱스트라나아제를 전분 그램당 100 단위와, 슈우도모나스 아밀데라모사스 유래 이소아밀라아제(일본국의 주식회사 林原 생물화학 연구소제)를 전분 그램당 0 내지 250 단위 가하고, 40℃, pH 5.5에서 병용하여 65시간 작용시킨 후, 100℃에서 15분간 열처리해서 효소를 실활시켰다. 생성한 이소말토오스를 HPLC법으로 정량하였다. 이들 결과를 표 22에 나타낸다.
[표 22]
이소아밀라아제 첨가량(단위) 이소말토오스 생성량(%)
0 62.7
50 65.1
250 71.1
표 22의 결과로부터 명백한 바와 같이, 이소아밀라아제를 첨가함으로써 이소말토오스의 생성량이 증가하는 것이 판명되었다.
실험예 19: 전분 부분 분해물 농도의 영향
농도가 다른 8종류의 전분 부분 분해물 『파인덱스＃100』(DE 약 2 내지 약 5) 수용액(최종농도 1 내지 40％의 수용액, 1mM 염화 칼슘 함유)을 조제하고, 각각, 실험예 4-1에서 얻은 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질생성 효소를 고형물 그램당 0.2 단위와, 실험예 15의 방법으로 얻은 이소말토덱스트라나아제를 고형물 그램당 100 단위와, 슈유도모나스 아밀로데라모사스 유래 이소아밀라아제(일본국의 주식회사 林原 생물화학 연구소제)를 고형물 그램당 250 단위 가하고, 40℃, pH 5.5에서 병용하여 65시간 작용시킨 후, 100℃에서 15분간 열처리해서 효소를 실활시켰다. 생성한 이소말토오스를 HPLC법으로 정량하였다. 이들 결과를 표 23에 나타낸다.
[표 23]
파인덱스 농도(%) 이소말토오스 생성량(%)
1 73.0
2.5 72.8
5 71.1
10 67.0
15 63.7
20 60.7
30 55.4
40 50.7
표 23의 결과로부터 명백한 바와 같이, 전분 부분 분해물의 농도가 1％인 저농도에서는 이소말토오스의 생성량은 약 73％인데 대해, 농도 40％인 고농도에서는 이소말토오스의 생성량은 약 51％로서, 기질인 전분 부분 분해물의 농도에 의존해서 이소말토오스의 생성량이 변화하는 것이 판명되었다.
실험예 20: 전분 액화 정도의 영향
옥수수 전분을 농도 15％ 전분유로 하고, 여기에 탄산 칼슘을 0.1％ 가해서 pH 6.0으로 조정하고, α-아밀라아제(상품명 『타마밀 60L』, 노보사제)를 전분 그램당 0.2 내지 2.0％을 가하여, 95℃에서 10분간 반응시킨 다음, 120℃에서 오토클레이브하고, 약 40℃로 급냉하여 DE 3.2 내지 20.5의 액화 용액을 얻고, 여기에 최종 전분농도 5％, pH 5.5로 조정한 후, 실험예 4-1에서 얻은 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 표품을 고형물 그램당 0.2 단위와, 실험예 15의 방법으로 얻은 이소말토덱스트라나아제를 고형물 그램당 100 단위와, 슈우도모나스 아밀로데라모사스 유래 이소아밀라아제(일본국의 주식회사 林原 생물화학 연구소제)를 고형물 그램당 250 단위를 가하고, 4O℃에서 65시간 반응시켰다. 100℃에서 15분간 열처리해서 효소를 실활시켰다. 생성한 이소말토오스를 HPLC법으로 정량하였다. 그 결과를 표 24에 나타낸다.
[표 24]
α-아밀라아제 사용량(전분 그램당의 ％（w/w)) DE 이소말토오스 생성율(％)
0.2 3.2 71.5
0.4 4.8 71.0
0.6 7.8 66.2
1.0 12.5 59.8
1.5 17.3 53.2
2.0 20.5 47.9
표 24의 결과로부터 명백한 바와 같이, α-이소말토실글루코 당질생성 효소와 이소말토덱스트라나아제에 의한 이소말토오스 생성율은, 전분의 액화도의 영향을 받고, 액화의 정도가 낮을 수룩, 즉, DE가 낮은 값일수록 전분으로부터의 이소말토오스의 생성율은 높고, 반대로, 액화의 정도가 높은, 즉, DE가 높은 값일수록 전분으로부터의 이소말토오스의 생성율이 낮은 것이 판명되었다. 구체적으로는, 전분의 부분 분해의 정도는 DE 약 20 이하, 바람직하게는 DE 약 12 이하, 더욱 바람직하게는 DE 약 5 이하가 적합하다는 것이 판명되었다.
실험예 23: 시클로덱스트린글루카노트란스페라아제와 글루코아밀라아제의 첨가 효과
전분 부분 분해물 『파인덱스#100』수용액(최종농도 20％, 1mM 염화 칼슘 함유)을 조제하고, 실험예 4-1에서 얻은 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질생성 효소를 전분 그램당 0.2 단위와, 실험예 15의 방법으로 얻은 이소말토덱스트라나아제를 고형물 그램당 100 단위와, 슈우도모나스 아밀로데라모사 유래 이소아밀라아제(일본국의 주식회사 林原 생물화학 연구소제)를 전분 그램당 250 단위와, 바실루스 스테아로더어모필루스 유래 CGTase(일본국의 주식회사 林原 생물화학 연구소)를 0 내지 0.5 단위 가하고, 이들 효소를 병용하여, 40℃, pH 5.5에서 65시간 작용시킨 후, 100℃에서 15분간 열처리해서 효소를 실활시켰다. 계속해서, 글루코아밀라아제(상품명 『ⅩL-4』, 일본국의 나가세 생화학공업 주식회사제)를 전분 그램당 20 단위 가하고, 50℃에서 24시간 작용시킨 후, 100℃에서 20분간 열처리해서 효소를 실활시켰다. 생성한 이소말토오스를 HPLC법으로 정량하였다. 이들 결과를 표 25에 나타낸다.
[표 25]
CGTase 첨가량(전분 그램당의 단위수) 이소말토오스 생성량(％)
0 60.7
0.1 62.9
0.25 65.0
0.5 66.4
표 25의 결과로부터 명백한 바와 같이, α-이소말토실글루코 당질생성 효소와 이소말토덱스트라나아제의 효소반응계에 CGTase를 첨가함으로써, 이소말토오스의 생성량이 증가하는 것이 판명되었다. 그리고 상기 글루코아밀라아제는, CGTase 존재하에서 생성한 이소 말토오스에 1개 이상의 D-글루코오스 잔기를 결합한 당질로부터 D-글루코오스 잔기를 유리시켜 이소말토오스를 더욱 생성시킬 목적으로 사용한 것이다.
이하, 실시예 A 및 실시예 B에서 본 발명의 이소말토오스 또는 이소말토오스 고함유물의 제조방법과 그 용도에 대해서 상세히 설명한다.
실시예 A-1
옥수수 유래의 피토글리코겐(큐피 주식회사제)의 수용액(약 100L)을 농도 4w/v％, pH 6.0, 온도 30℃로 조정한 후, 실험예 4-1의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소를 전분 그램당 1 단위와, 실험예 4-4의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 정제 α-이소말토실 전이효소를 전분 그램당 10 단위 가하여 48시간 반응시킨 후, 100℃에서 10분간 열처리해서 효소를 실활시켰다. 이 효소반응액의 일부를 취하여 HPLC법에 의해 환상 4당의 생성량을 조사한 결과, 당조성으로 약 84％ 이었다. 그리고 HPLC법은, 『Shodex KS-801 칼럼』(일본국의 昭化電工 주식회사제)을 사용하고, 칼럼 온도 60℃, 유속 0.5ml/min물의 조건에서 실시하고, 검출은 시차 굴절계 『RI-8012』(일본국의 Tosoh 주식회사제)를 사용하여 하였다. 이 효소반응액을 pH 5.0, 온도 45℃로 조정한 후, α-글루코시다아제(상품명 『트란스글루코시다아제 아마노』, 일본국의 天野 엔자임 주식회사제)를 전분 그램당 1500 단위와, 글루코아밀라아제(상품명 『ⅩL-4』, 일본국의 나가세 생화학공업 주식회사제)를 전분 그램당 75 단위를 가하고 24시간 반응시켜 잔존하는 환원성 올리고당 등을 가수분해하고, 더욱이 수산화 나트륨으로 pH를 5.8로 조정하고, 온도 90℃에서 1시간 유지해서 효소를 실활시킨 다음, 불용물을 여별(濾別)하였다. 이 여액을 역침투막(상품명 『호로셋푸 HR5155PI』, 일본국의 東洋紡績 주식회사제)을 사용해서 고형분 농도 약 16％까지 농축한 후, 통상적인 방법에 따라서, 탈색, 탈염, 여과, 농축함으로써 고형분 약 3,700g을 함유하는 당액 약 6.2kg을 얻었다. 이 당액을 이온교환 수지(상품명『암바라이트 CR-1310(Na+형)형』, 오르가노사제)를 충전한 칼럼(겔 량 약 225L)에 사용하고, 칼럼 온도 60℃에서 유속 약 45L/h의 조건으로 크로마토 분리를 하였다. 용출액의 당조성을 상기 HPLC법으로 모니터하여 환상 4당의 순도가 98％ 이상인 획분을 회수하고, 이것을 통상적인 방법에 따라 탈염, 탈색, 여과, 농축하여 고형분 약 2,500g을 함유하는 당액 약 7.5kg을 얻었다. 이 당액의 당조성을 HPLC법으로 측정한 결과, 환상 4당의 순도는 약 99.5％ 이었다. 얻어진 환상 4당 함유 당액을 에바포레이터에서 농도 약 50％까지 농축한 후, 이 농축액 약 5kg을 원통형상 플라스틱 용기에 넣고, 완만하게 회전시키면서 약 20시간 동안 온도를 65℃로부터 20℃까지 강하시켜서 환상 4당을 결정석출시켰다. 계속해서, 원심여과기를 이용해서 분밀(分蜜)하여 환상 4당 결정을 습(濕) 중량으로서 1,360g 회수하고, 다시 60℃에서 3시간 건조하여 환상 4당 결정 분말을 1,170g 얻었다. 이 결정 분말의 당조성을 HPLC법으로 측정한 결과, 환상 4당 결정 분말의 순도는 99.9％ 이상으로서 극히 고순도이었다.
이어서, 상기 환상 4당 결정 분말을 탈이온수에 용해하고, 농도 1％, pH 5.5, 온도 50℃로 조정한 후, 실험예 15의 방법으로 조제한 이소말토덱스트라나아제를 고형물 그램당 500 단위 가하고, pH 5.5, 50℃에서 70시간 반응시켰다. 95℃로 가열하여 10분간 유지한 후, 냉각하고 여과해서 얻게되는 여액을 통상적인 방법에 따라 활성탄으로 탈색하고, H형 및 OH형 이온교환 수지에 의해 탈염해서 정제하고, 다시, 농도 약 75％로 농축하여 시럽상 이소말토오스 고함유물을 고형물당 약 95 ％의 수율로 얻었다.
이 제품은, 고형물당, 이소말토오스 96.1％, 개환(開環) 4당 2.8％, 및 그 밖의 당질을 1.1％ 함유하고 있었다. 이 제품은, 난(難)결정성이고, 우수한 보습성, 저감미성, 침투압 조절성, 부형성, 광택 부여성, 보습성, 점성, 당질결정 석출 방지성, 난(難)발효성, 전분의 노화 방지성 등을 가지고 있으므로, 각종 음식물, 건강식품, 사료, 이료(餌料), 화장품, 의약품, 기호물 등에 유리하게 사용할 수 있다.
실시예 A-2
실시예 A-1의 방법으로 얻어진 시럽상 이소말토오스 고함유물을, 강산성 캐타이온 교환 수지(상품명 『암바라이트 CR-1310』, Na+형, 오르가노 주식회사제)를 사용해서 칼럼 크로마토그래피를 하였다. 즉, 상기 수지를 내경 12.5cm의 쟈켓부 스테인레스제 칼럼 10개에 충전하고, 이들 칼럼을 직렬로 접속해서 수지층 전체 길이를 16m로 하였다. 칼럼내 온도를 40℃로 유지하면서, 상기 시럽을 수지량에 대하여 1.5v/v％ 가하고, 여기에 40℃의 온수를 SV O.2로 흘려서 분획하고, 용출액의 당조성을 HPLC법으로 모니터하면서 이소말토오스 고함유 획분을 채취하고, 이것을 정제하여 이소말토오스 고함유액을 얻었다. 이소말토오스의 고형물당의 수율은 약 80％이었다. 이 액을 통상적인 방법에 따라 탈색, 탈염, 농축하여 농도 약 75％의 시럽상 이소말토오스 고함유물을 얻었다.
이 제품은, 고형물당 약 99.9％ 이상의 극히 고순도의 이소말토오스를 함유하고 있었다. 이 제품은, 난결정성이고, 우수한 보습성, 저감미성, 침투압 조절성, 부형성, 광택 부여성, 보습성, 점성, 당질결정 석출 방지성, 난발효성, 전분의 노화 방지성 등을 가지고 있으므로, 각종 음식물, 건강식품, 사료, 이료, 화장품, 의약품, 기호물 등에 유리하게 사용할 수 있다.
실시예 A-3
타피오카 전분을 농도 약 20％의 전분유로 하고, 여기에 탄산 칼슘 0.1％ 가하여 pH 6.5로 조정하고, α-아밀라아제(상품명 『타마밀 60L』, 노보사제)를 전분 그램당 0.3％ 가하여 95℃에서 15분간 반응시기고, 이어서 120℃에서 20분간 오토클레이브하고, 다시 약 40℃로 급냉해서 DE 약 4의 액화 용액을 얻어, 여기에 실험예 2-1의 방법으로 얻은 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소를 전분 그램당 0.2 단위와, 실험예 15의 방법으로 얻은 이소말토덱스트라나아제를 전분 그램당 100 단위와, 이소아밀라아제(일본국의 주식회사 林原 생물화학 연구소제)를 전분 그램당250 단위와, CGTase(일본국의 주식회사 林原 생물화학 연구소제)를 전분 그램당 0.5 단위가 되도록 가하고, pH 5.5, 온도 40℃에서 64시간 반응시켰다. 그 반응액을 95℃에서 30분간 유지한 후, 온도 50℃로 조정한 다음, 글루코아밀라아제제(劑)(상품명 『글루코자임』, 일본국의 나가세 생화학공업 주식회사제)를 고형물 그램당 10 단위 가하고 24시간 반응시켜, 그 반응액을 95℃로 가열하여 30분간 유지한 후, 냉각하여 여과해서 얻게되는 여액을, 통상적인 방법에 따라 활성탄으로 탈색하여 H형 및 OH형 이온교환 수지에 의해 탈염해서 정제하고, 더욱 농축하여 건조함으로써 분말화하여 조립(造粒)해서 과립상 이소말토오스 고함유물을 고형물당 약 95％의 수율로 얻었다.
이 제품은, 글루코오스 11.0％, 이소말토오스 66.5%, 그 외의 2 당류를 2.4％, 3당류 이상을 20.1％ 함유하고 있었다. 이 제품은, 우수한 보습성, 저감미성, 침투압 조절성, 부형성, 광택 부여성, 보습성, 점성, 당질결정 석출 방지성, 난발효성, 전분의 노화 방지성 등을 가지고 있으므로, 각종 음식물, 건강식품, 사료, 이료, 화장품, 의약품, 기호물 등에 유리하게 사용할 수 있다.
실시예 A-4
바실루스 글로비스포루스 C9(FERM BP-7143)를 실험예 1의 방법에 준하여 퍼멘터에서 48시간 배양하였다. 배양후, SF막을 이용해서 제균 여과하여 약 18L의 배양여액을 회수하고, 다시 그 여액을 UF막 농축하여, α-이소말토실글루코 당질 생성 효소를 8.8 단위/ml와 α-이소말토실 전이효소를 26.7 단위/ml를 함유한 농축 효소액 약 1L을 회수하였다. 옥수수 전분을 농도 약 27％의 전분유로 하고, 여기에탄산 칼슘 0.1％ 가하여 pH 6.5로 조정하고, α-아밀라아제(상품명 『타마밀 60L』, 노보사제)를 전분 그램당 0.3％ 가하여 95℃에서 15분간 반응시키고, 이어서 120℃에서 20분간 오토클레이브 하고, 다시 약 40℃로 급냉해서 DE 약 4의 액화 용액을 얻고, 여기에 상기 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소와 α-이소말토실 전이효소를 함유하는 농축 효소액을 전분 그램당 0.25ml의 비율이 되도록 가하고, 더욱이 실험예 15의 방법으로 얻은 이소말토덱스트라나아제를 전분 그램당 100 단위와, 이소아밀라아제(일본국의 주식회회사 林原 생물화학 연구소제)를 전분 그램당 250 단위와, CGTase(일본국의 주식회사 林原 생물화학 연구소제)를 전분 그램당 0.5 단위가 되도록 가하고, pH 5.5, 온도 40℃에서 70시간 반응시켰다. 그 반응액을 95℃로 가열해서 10분간 유지한 후, 온도 50℃로 조정한 다음, 글루코아밀라아제제(劑)(상품명 『글루코자임』, 일본국의 나가세 생화학공업 주식회사제)를 전분 그램당 20 단위 가하고 24시간 반응시켜, 그 반응액을 95℃로 가열해서 30분간 유지한 후, 냉각하여 여과해서 얻게되는 여액을 통상적인 방법에 따라 활성탄으로 탈색하고, H형 및 OH형 이온교환 수지에 의해 탈염해서 정제하고, 더욱 농축해서 농도 75％의 시럽상 이소말토오스 고함유물을 고형물당 약 95％의 수율로 얻었다.
이 제품은, 고형물당, 글루코오스 32.6％, 이소말토오스 59.4 ％, 기타의 2당류를 1.2％, 3당류 이상을 6.8％ 함유하고 있었다. 이 제품은, 난결정성이고, 우수한 보습성, 저감미성, 침투압 조절성, 부형성, 광택 부여성, 보습성, 점성, 당질결정 석출 방지성, 난발효성, 전분의 노화 방지성 등을 가지고 있으므로, 각종 음식물, 건강식품, 사료, 이료, 화장품, 의약품, 기호물 등에 유리하게 사용할 수 있다.
실시예 A-5
실시예 A-4의 방법으로 얻어진 이소말토오스 함유 시럽을 원당액(原糖液)으로 하고, 이소말토오스의 함량을 높이기 위해서, 실시예 A-2의 방법에 준해서 염형 강산성 캐타이온 교환 수지를 사용하는 칼럼 크로마토그래피를 한 후, 이소말토오스 고함유 획분을 채취하고, 이것을 정제하고, 농축해서 이소말토오스 고함유 시럽을 고형물당 약 60％의 수율로 얻었다.
이 제품은, 고형물당, 글루코오스 4.8％, 이소말토오스 85.3％, 기타의 2당류를 3.9％, 3당류 이상을 6.0％ 함유하고 있었다. 이 제품은, 난결정성이고, 우수한 보습성, 저감미성, 침투압 조절성, 부형성, 광택 부여성, 보습성, 점성, 당질결정 석출 방지성, 난발효성, 전분의 노화 방지성 등을 가지고 있으므로, 각종 음식물, 건강식품, 사료, 이료, 화장품, 의약품, 기호물 등에 유리하게 사용할 수 있다.
실시예 B-1: 감미료
실시예 A-1의 방법에 의해 얻은 분말상 이소말토오스 고함유물 0.8 중량부에, 트레할로오스 함수결정(등록상표 『Treha』, 일본국의 주식회사 林原상사 판매) 0.2 중량부, α-글리코실스테비오시드(상품명 『αG 스위트』, 일본국의 東洋精糖 주식회사 판매) 0.01 중량부, 및 L-아스파르틸―L-페닐알라닌메틸 에스테르(상품명 『아스파루테에무』) 0.01 중량부를 균일하게 혼합하고, 과립 성형기에서과립상 감미료를 얻었다.
이 제품은, 단 맛의 질이 좋고, 수크로오스의 약 2배의 감미도를 가지고 있다.
이 제품은, 난결정성이고, 우수한 보습성, 저감미성을 가진 이소말토오스를 함유하는 저감미료 조성물이다. 또한, 이 제품은, 실온 보존하에서 변질 열화의 우려가 없고, 안정하다.
실시예 B-2: 하드 캔디
농도 55％ 수크로오스 용액 100 중량부에 실시예 A-2의 방법으로 얻은 시럽상 이소말토오스 고함유물 50 중량부를 가열 혼합하고, 이어서 감압하에서 수분 2％ 미만이 될 때까지 가열 농축하고, 여기에 시트르산 0.6 중량부 및 적당량의 레몬 향료와 착색료를 혼화하고, 통상적인 방법에 따라서 성형하여 제품을 얻었다.
이 제품은 깨물기, 정미, 풍미 모두가 양호하고, 수크로오스의 결정석출도 일어나지 않으며, 흡습성이 적은 안정한 고품질의 하드 캔디이다.
실시예 B-3: 츄잉 검
츄잉 검 베이스 3 중량부를 유연해질 정도로 가열 용융하고, 여기에 무수 결정 말티톨 2 중량부, 크실리톨 2 중량부, 실시예 A-5의 방법으로 얻은 시럽상 이소말토오스 고함유물 2 중량부, 및 트레할로오스 함수결정 1 중량부를 가하고, 다시 적당량의 향료와 착색료를 혼합하여, 통상적인 방법에 따라 로울러에 의해 혼련하여, 성형, 포장해서 제품을 얻었다.
이 제품은 텍스처, 정미, 풍미가 양호하고, 낮은 충치 유발성, 저칼로리의 츄잉 검으로서 바람직하다.
실시예 B-4: 분말 펩티드
40％ 식품용 대두 펩티드 용액(상품명 『하이뉴트 S』, 일본국의 不二製油 주식회사 판매) 1 중량부에 실시예 A-4의 방법으로 얻은 시럽상 이소말토오스 고함유물 2 중량부를 혼합하고, 플라스틱제 바트에 넣어 50℃에서 감압건조하여 분쇄해서 분말 펩티드를 얻었다.
이 제품은 풍미양호하고, 프레 믹스, 빙과 등의 저칼로리 제과재료로서 유용할뿐만 아니라, 경구 유동식, 경관 유동식을 위한 난소화성의 식물(食物)섬유, 정장(整腸) 재료, 건강식품 재료로서도 유용하다.
실시예 B-5: 욕용제(浴用劑)
유자의 껍질 쥬우스 1 중량부에 대하여, 실시예 A-3의 방법으로 얻은 과립상 이소말토오스 고함유물 10 중량부 및 환상 4당 1 중량부의 비율로 혼합하고, 분말화하여 유자의 껍질 엑기스 함유 이소말토오스 함유 분말을 얻었다.
이 분말 5 중량부에, 소염(燒鹽) 90 중량부, 트레할로오스 함수결정 2 중량부, 무수 규산 1 중량부 및 α-글루코실 헤스페리딘(상품명 『αG 헤스페리딘』, 일본국의 주식회사 林原 판매) 0.5 중량부를 혼합해서 욕용제를 제조하였다.
이 제품은, 유자의 향기도 풍부해서, 입욕용의 온수에 100 내지 10,000배로희석해서 이용하면 좋고, 입욕후는 피부가 산뜻하고 매끈매끈하며, 냉기를 느끼지 않는 고품질의 욕용제이다.
실시예 B-6: 화장용 크림
모노스테아르산 폴리옥시에틸렌글리콜 2 중량부, 자기 유화형 모노스테아르산 글리세린 5 중량부, 실시예 A-2의 방법으로 얻은 시럽상 이소말토오스 고함유물 2 중량부, α-글루코실 루틴(상품명 『αG루틴』, 일본국의 주식회사 林原 판매) 1 중량부, 유동 파라핀 1 중량부, 트리옥탄산 글리세린 10 중량부 및 방부제 적당량을 통상적인 방법에 따라 가열 용해하고, 여기에 L-락트산 2 중량부, 1,3-부틸렌글리콜 5 중량부 및 정제수 66 중량부를 가하고, 호모게나이저로써 유화하고, 더욱이 향료 적당량을 가해서 교반혼합하여 화장용 그림을 제조하였다.
이 제품은, 항산화성을 가지고, 안정성이 높으며, 고품질의 햇볕에 탐 방지제, 피부 미화제, 색백제 등으로서 유리하게 사용할 수 있다.
실시예 B-7: 치약
제2인산 칼슘 45 중량부, 라우릴 황산 나트륨 1.5 중량부, 글리세린 25 중량부, 폴리옥시에틸렌소르비탄라우레이트 0.5 중량부, 실시예 A-5의 방법으로 얻은 시럽상 이소말토오스 고함유물 15 중량부, 사카린 0.02 중량부 및 방부제 0.05 중량부를 물 13 중량부와 혼합해서 치약을 얻었다.
이 제품은, 계면활성제의 세정력을 저하함이 없고, 싫은 맛을 개량하며, 사용후에 느끼는 감도 양호하다.
실시예 B-8: 유동식용 고체제제
실시예 A-1의 방법으로 얻은 분말상 이소말토오스 고함유물 1OO 중량부, 트레할로오스 함수결정 200 중량부, 말토테트라오스 고함유 분말 200 중량부, 분말 난황 270 중량부, 탈지 분유 209 중량부, 염화 나트륨 4.4 중량부, 염화 칼륨 1.8 중량부, 황산 마그네슘 4 중량부, 티아민 0.01 중량부, 아스코르브산 나트륨 0.1 중량부, 비타민 E 아세테이트 0.6 중량부 및 나이아신 아미드 0.04 중량부로 된 배합물을 조제하고, 이 배합물 25 그램씩을 방습성 라미네이트 자루에 충전하고, 히이트 시일해서 제품을 얻었다.
이 제품은, 정장작용이 우수한 유동식이다. 1 자루분을 약 150 내지 300ml의 물에 용해해서 유동식으로 하여, 경구적 또는 비강, 위, 장 등에 경관적 사용 방법에 의해 이용되어 생체에의 에너지 보급용으로 유리하게 이용할 수 있다.
실시예 B-9: 정제
아스피린 50 중량부에 실시예 A-2의 방법으로 얻은 시럽상 이소말토오스 고함유물 14 중량부, 콘 스타치 4 중량부를 충분히 혼합한 후, 통상적인 방법에 따라서 타정기(打錠機)에 의해 타정하여 두께 5.25mm, 1정당 680mg의 정제를 제조하였다.
이 제품은 이소말토오스의 부형성을 이용한 것으로서, 흡습성이 없고, 물리적 강도도 충분히 있고, 더욱이 수중에서의 붕괴는 극히 양호하다.
실시예 B-10: 당의정
중량 150mg의 소정(素錠)을 심제(芯劑)로 하고, 여기에 실시예 A-1의 방법으로 얻은 분말상 이소말토오스 고함유물 40 중량부, 풀룰란(평균 분자량 20만) 2 중량부, 물 30 중량부, 탈크 25 중량부 및 산화 티탄늄 3 중양부로 된 바탕액을 사용하여, 정제 중량이 약 230mg이 될때 까지 당의(糖衣)하고, 이어서, 환상 4당 결정 분말 65 중량부, 풀룰란 1 중량부 및 물 34 중량부로 된 마무리액을 사용하여 당의하고, 다시 왁스액으로 광택내기하여 광택이 있는 외관이 좋은 당의제를 얻었다. 이 제품은 내충격성도 우수하고, 고품질을 장기간 유지한다.
실시예 B-11: 외상치료용 고약
실시예 A-5의 방법으로 얻은 시럽상 이소말토오스 고함유물 100 중량부 및 말토오스 300 중량부에, 요오드 3 중량부를 용해한 메탄올 50 중량부를 가하여 혼합하고, 다시 10w/v％ 풀룰란 수용액 200 중량부를 가해서 혼합하여 적당한 퍼짐성, 부착성을 나타내는 외상치료용 고약을 얻었다.
이 제품은 이소말토오스에 의해 요오드, 메탄올의 휘산이 방지되고, 경시 변화가 적으며 상품가치가 높은 고약이다.
또한, 이 제품은, 요오도에 의한 살균 작용뿐만 아니라, 말토오스에 의한 세포에의 에너지 보급제로서도 작용하므로 치유 기간이 단축되며, 창면도 깨끗하게낫는다.
본 발명자들이 상기 과제를 해결하는 것을 목적으로 하여 예의 연구하는 중에, 문헌[European Journal of Biochemistry, 제226권, 641 내지 648 페이지 (1994년)]에서, 주로, 4개의 글루코오스 잔기가 α-1,3 결합과 α-1,6 결합에 의해 교대로 결합된 구조를 가진 알테르난(alternan)에 가수분해 효소알테르나나아제(alternanase)를 작용시켜 얻게 되는, 분자내에 이소말토오스 구조를 가진 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실―(1→3)-α-D-글루코피라노실―(1→6)-α-D-글루코피라노실―(1→3)-α-D-글루코피라노실―(1→}의 구조를 가진 4당류(이하, 『환상 4당』으로 약기한다.)의 보고가 있었다.
한편, 본 발명자들은 일본국 특원2000-229557호 명세서에 있어서, 파노오스 등의 전분유래의 당질로부터 환상 4당을 생성하는 α-이소말토실 전이효소를 사용하는 환상 4당의 제조방법을 개시함과 아울러, 일본국 특원2000-234937호 명세서에서는 상기 α-이소말토실 전이효소와, 말토올리고당 등으로부터 α-이소말토실글루코 당질을 생성하는 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소를 전분원료에 작용시켜 환상 4당을 효율적으로 제조하는 방법을 개시하고 있다.
그 후, 본 발명자들은 상기 α-이소말토실글루코 당질 및 환상 4당이, 이들 분자내에 이소말토오스 구조를 가지고 있는 것에 착안하고, 이들 당질로부터 이소말토오스를 제조하는 방법에 대해서 연구하였다. 즉, 본 발명자들은, 이들 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소와 α-이소말토실 전이효소의 효소반응 메커니즘에 대해서 연구한 결과, 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도 2 이상의 당질에, α-이소말토실 전이효소의 비존재하 또는 존재하에서 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소와, 이소말토오스를 유리(遊離)하는 작용을 가진 이소말토오스 유리 효소를 작용시키면 이소말토오스의 생성수율이 비약적으로 향상하고, 더욱이 공업적으로 용이하게 실시할 수 있는 것을 발견하였다.
더욱이 본 발명자들은 이와 같은 제조방법에 의해 얻게되는 이소말토오스의 용도를 확립해서 본 발명을 완성하였다. 구체적으로는, 본 발명은, 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도 2 이상의 당질에, α-이소말토실 전이효소의 비존재하 또는 존재하에서 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소를 작용시켜, 비환원성 말단의 결합 양식으로서 α-1,6 글루코실 결합을 가지고, 이 비환원성 말단 이외의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도 3 이상의 α-이소말토실글루코 당질 및/또는 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실―(1→3)-α-D-글루코피라노실―(1→6)-α-D-글루코피라노실―(1→3)-α-D-글루코피라노실―(1→}을 생성시키고, 이 생성물에 이소말토오스 유리 효소를 작용시켜서 이소말토오스를 생성시키며, 이 생성한 이소말토오스를 채취하는 것을 특징으로 하는 이소말토오스의 제조방법과 그 용도를 확립하여 본 발명의 과제를 해결한 것이다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명은, 이소말토오스의 신규의 제조방법과 그 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도 2 이상의 당질에, α-이소말토실 전이효소의 비존재하 또는 존재하에서 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소를 작용시켜서, 비환원성 말단의 결합 양식으로서 α-l,6 글루코실 결합을 가지고, 이 비환원성 말단 이외의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도 3 이상의 α-이소말토실글루코 당질, 및/또는 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}을 생성시키고, 이어서, 이소말토오스 유리 효소를 작용시켜서 이소말토오스를 생성시키며, 이 생성한 이소말토오스를 채취하는 것을 특징으로 하는 이소말토오스의 제조방법과 그 용도에 관한 발명이다.
이러한 본 발명에 의하면, 이 분야에 있어서 유용한 이소말토오스 및 이소말토오스 고함유물을 공업적으로 대량으로 동시에, 염가로 고수율로 제조할 수 있게 되었다. 이러한 본 발명에 의한 이소말토오스 및 이소말토오스 고함유물은 난(難)결정성이고, 우수한 보습성, 저감미성, 침투압 조절성, 부형성, 광택 부여성, 보습성, 점성, 당질결정 석출 방지성, 난발효성, 전분의 노화 방지성 등을 가지고 있으므로, 각종 음식물, 건강식품, 사료, 이료, 화장품, 의약품, 기호품 등에 유리하게 사용할 수 있다.
본 발명은 이렇게도 현저한 작용 효과를 나타내는 발명이어서, 이 분야에 공헌하는 바, 실로 큰 의의가 있는 발명이다.

Claims (19)

  1. 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도 2 이상의 당질에, α-이소말토실 전이효소의 비존재하 또는 존재하에 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소를 작용시켜, 비환원성 말단의 결합 양식으로서 α-1,6 글루코실 결합을 가지고, 이 비환원성 말단 이외의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도 3 이상의 α-이소말토실글루코 당질, 및/또는, 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}을 생성시키고, 이 생성물에 이소말토오스 유리 효소를 작용시켜서 이소말토오스를 생성시키며, 이 생성한 이소말토오스를 채취하는 것을 특징으로 하는 이소말토오스의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, α-이소말토실글루코 당질 생성 효소를 작용시킬 때에, α-이소말토실 전이효소, 시클로말토덱스트린글루카노트란스페라아제, α-글루코시다아제, 글루코아밀라아제 및 전분 지절 효소로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 효소를 작용시키는 것을 특징으로 하는 이소말토오스의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, α-이소말토실글루코 당질 생성 효소를 작용시킨 후에, α-이소말토실 전이효소, 시클로말토덱스트린글루카노트란스페라아제, α-글루코시다아제, 글루코아밀라아제 및 이소아밀라아제로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의효소를 작용시키는 것을 특징으로 하는 이소말토오스의 제조방법.
  4. 제1항, 제2항 또는 제3항에 있어서, 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도 2 이상의 당질이, 말토올리고당, 말토덱스트린, 아밀로덱스트린, 아밀로오스, 아밀로펙틴, 가용성 전분, 액화 전분, 호화 전분 및 글리코겐으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 당질인 이소말토오스의 제조방법.
  5. 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}, α-글루코실-(1→6)-α-글루코실-(1→3)-α-글루코실-(1→6)-α-글루코오스 및 파노오스로부터 선택되는 2종 이상의 혼합당질에 이소말토오스 유리 효소를 작용시켜 이소말토오스를 생성시키고, 이 생성한 이소말토오스를 채취하는 것을 특징으로 하는 이소말토오스의 제조방법.
  6. 제5항에 있어서, 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}, α-글루코실-(1→6)-α-글루코실-(1→3)-α-글루코실-(1→6)-α-글루코오스 및 파노오스가, 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도 2 이상의 당질에 효소를 작용시켜서 얻어진 것인 것을 특징으로 하는 이소말토오스의 제조방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, α-이소말토실 전이효소가, 아래의 이화학적 성질을 가진 효소인 이소말토오스의 제조방법.
    (1) 작용
    비환원성 말단의 결합 양식으로서 α-1,6 글루코실 결합을 가지고, 이 비환원성 말단 이외의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도가 3 이상인 당질로부터, α-이소말토실 전이함으로써 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가진 환장 4당을 생성한다.
    (2) 분자량
    SDS-겔 전기 영동법에 의해 약 82,000 내지 132,000 달톤
    (3) 등전점
    앰폴라인 함유 전기 영동법에 의해 pI 약 5.0 내지 6.1
    (4) 최적 온도
    pH 6.0, 30분간 반응에서, 약 45 내지 50℃
    (5) 최적 pH
    35℃, 30분간 반응에서, pH 약 5.5 내지 6.0
    (6) 온도 안정성
    pH 6.0, 60분간 유지에서 약 40℃까지 안정
    (7) pH 안정성
    4℃, 24시간 유지에서 pH 약 4.0 내지 9.0
  8. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, α-이소말토실글루코 당질 생성 효소가, 아래의 이화학적 성질을 가진 효소인 이소말토오스의 제조방법.
    (1) 작용
    비환원성 말단의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도가 2 이상인 당질로부터, 환원력을 실질적으로 증가함이 없이 α-글루코실 전이함으로써, 비환원성 말단의 결합으로서 α-1,6 글루코실 결합 양식을 가지고, 이 비환원 말단 이외의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도가 3 이상인 당질을 생성한다.
    (2) 분자량
    SDS-겔 전기 영동법에 의해 약 117,000 내지 160,000 달톤
    (3) 등전점
    앰폴라인 함유 전기 영동법에 의해 pI 약 4.7 내지 5.7
    (4) 최적 온도
    pH 6.0, 60분간 반응에서, 약 40 내지 45℃
    1mMCa2+존재하에서는 약 45 내지 50℃
    (5) 최적 pH
    35℃, 60분간 반응에서, pH 약 6.0 내지 6.5
    (6) 온도 안정성
    pH 6.0, 60분간 유지에서 약 35 내지 40℃까지 안정
    1mMCa2+존재하에서는 약 40 내지 45℃까지 안정
    (7) pH 안정성
    4℃, 24시간 유지에서 pH 약 4.5 내지 10.0
  9. 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 이소말토오스를 채취하는 공정에 있어서, 알칼리 금속형 및/또는 알칼리 토류 금속형 강산성 캐타이온 교환 수지를 사용하는 칼럼 크로마토그래피를 이용하는 것을 특징으로 하는 이소말토오스의 제조방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 얻어지는 이소말토오스가, 고형물당 이소말토오스를 40％(w /w) 이상 함유하는 이소말토오스 고함유물인 이소말토오스의 제조방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 기재한 이소말토오스의 제조방법에 의해 얻을 수 있는, 고형물당 이소말토오스를 40 내지 99％（w/w) 함유함과 아울러, 글루코오스, 말토오스, 말토트리오스, 말토테트라오스, 전분 부분 가수분해물, α-이소말토실글루코 당질, 및 α-글루코실-(1→6)-α-글루코실-(1→3)-α-글루코실-(1→6)-α-글루코오스로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 당질을 1 내지 60％（w/w) 함유하는 것을 특징으로 하는 이소말토오스 고함유물.
  12. 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 기재한 이소말토오스의 제조방법에 의해 얻게되는 이소말토오스 또는 제11항 기재의 이소말토오스 고함유물을 함유하는 음식물 또는 건강식품.
  13. 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 기재한 이소말토오스의 제조방법에 의해 얻을 수 있는 이소말토오스 또는 제11항 기재의 이소말토오스 고함유물을 함유하는 사료 또는 이료.
  14. 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 기재한 이소말토오스의 제조방법에 의해 얻게되는 이소말토오스 또는 제11항 기재의 이소말토오스 고함유물을 함유하는 화장품.
  15. 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 기재한 이소말토오스의 제조방법에 의해 얻게되는 이소말토오스 또는 제11항 기재의 이소말토오스 고함유물을 함유하는 의약품.
  16. 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 기재한 이소말토오스의 제조방법에 의해 얻게되는 이소말토오스 또는 제11항 기재의 이소말토오스 고함유물을 사용하는 것을 특징으로 하는 음식물 또는 건강식품의 제조방법.
  17. 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 기재한 이소말토오스의 제조방법에 의해 얻게되는 이소말토오스 또는 제11항 기재의 이소말토오스 고함유물을 사용하는 것을 특징으로 하는 사료 또는 이료의 제조방법.
  18. 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 기재한 이소말토오스의 제조방법에 의해 얻게되는 이소말토오스 또는 제11항 기재의 이소말토오스 고함유물을 사용하는 것을 특징으로 하는 화장품의 제조방법.
  19. 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 기재한 이소말토오스의 제조방법에 의해 얻게되는 이소말토오스 또는 제11항 기재의 이소말토오스 고함유물을 사용하는 것을 특징으로 하는 의약품의 제조방법.
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