KR102558524B1 - 올리고당의 고효율 생산을 위한 신규 아우레오바시디움 플루란스 균주 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 출원은 수탁번호 KCCM13230P로 기탁된 아우레오바시디움 플루란스 CJFSKY2201 균주; 상기 균주의 배양액; 및 상기 균주를 배양하는 단계 및 상기 배양액로부터 올리고당을 수득하는 단계를 포함하는 올리고당 제조 방법;에 관한 것이다.

Description

올리고당의 고효율 생산을 위한 신규 아우레오바시디움 플루란스 균주 및 이의 용도{Novel Aureobasidium pulluans strain and uses thereof for high-efficiency production of oligosaccharides}

본 출원은 수탁번호 KCCM13230P로 기탁된 아우레오바시디움 플루란스 CJFSKY2201 균주; 상기 균주의 배양액; 및 상기 균주를 배양하는 단계 및 상기 배양액로부터 올리고당을 수득하는 단계를 포함하는 올리고당 제조 방법;에 관한 것이다.

올리고당(oligosaccharides)은 다양한 생물학적 과정에서 중요한 역할을 하며, 올리고당의 유제품, 제과, 음료 등에 기능성 강조, 감미질 개선, 물성 개선의 목적으로 사용되고 있으며, 그 기능성이 알려지면서 올리고당 합성에 대한 관심이 증가하고 있다. 현재 국내외적으로 가장 많이 판매되고 있는 올리고당은 프락토올리고당으로, 이는 각종 건강기능식품의 원료소재로 널리 사용하고 있으며 판매량이 해마다 증가하고 있는 추세이다. 이를 필두로 하여 전체 올리고당의 수요는 계속해서 증가될 것으로 전망하고 있다.

올리고당은 토마토, 바나나, 양파, 버섯 등의 천연식품에도 들어있으나, 천연식품에서 곧바로 추출하는 것이 어려워, 대부분의 경우 합성하여 만든다. 또한 올리고당의 의학적, 건강기능식품으로의 적용을 위한 연구 및 실제 적용을 위해서는 그 대량 합성이 필요하나, 올리고당의 합성은 매우 어렵다. 현재 올리고당 생산에는 효소를 이용하는 방법과 미생물을 이용한 전체 세포 생체 촉매 방법을 이용하고 있으며, 기존 고함량 프락토올리고당 제조법으로는 크로마토그래피법과 결정화법이 알려져 있으나, 두 방법 모두 수율이 극히 낮고 대량생산이 어려워 경제성이 결여된 방법이었다(한국등록특허공보 KR 10-1994-0005660 B1).

올리고당의 수요는 계속적으로 늘어나 설비적인 투자는 계속적으로 진행되었지만, 아직 그 생산을 위한 균주의 개발은 진행되지 않았다. 그러나 한정된 제조 공간 내 더 이상의 물리적인 투자는 불가능해졌고, 투자금액 대비 생산성 향상율도 미비했다.

이러한 배경하에, 본 출원자들은 조성물을 올리고당 생산을 위한 균주 자체 개발을 통해 균주 자체의 활성을 높이고자 예의 노력 연구한 결과, 설탕액을 빠르게 올리고당으로 전환시키는 균주를 개발함으로써 본 출원을 완성하였다.

본 출원의 하나의 목적은 수탁번호 KCCM13230P로 기탁된 아우레오바시디움 플루란스(Aureobasidium pullulans) CJFSKY2201 균주를 제공하는 것이다.

본 출원의 다른 하나의 목적은 수탁번호 KCCM13230P로 기탁된 아우레오바시디움 플루란스(Aureobasidium pullulans) CJFSKY2201 균주의 배양액을 제공하는 것이다.

본 출원의 다른 하나의 목적은 상기 균주를 배양하는 단계 및 상기 배양액으로부터 올리고당을 수득하는 단계를 포함하는, 올리고당 제조 방법을 제공하는 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

본 출원의 하나의 양태로서, 본 출원은 수탁번호 KCCM13230P로 기탁된 아우레오바시디움 플루란스(Aureobasidium pullulans) CJFSKY2201 균주를 제공한다.

본 출원의 "아우레오바시디움 풀루란스(Aureobasidium pullulans)"는 자연계에 분포하는 효모-유사 진균(yeast-like fungus)이다. 아우레오바시디움 풀루란스는 산림 토양, 담수, 공기중과 같은 다양한 환경 및 다양한 식물의 표면 등에서 발견되는 것으로 알려져 있으며, 올리고당 합성효소, 사이드로포어(siderophores), 풀루란(pullulan) 등 다양한 효소 활성을 갖는 것으로 알려져 있다.

본 출원자들은 아우레오바시디움 풀루란스에 속하는 신규한 균주를 개발하여 이를 아우레오바시디움 풀루란스 CJFSKY2201로 명명하였고, 이를 기탁번호 KCCM13230P로 기탁하였다.

본 출원의 “균주”는 한 개의 세포에서 유래한, 무성생식을 통해 증식하여 동질의 유전적 특징을 갖는 개체들의 집합을 의미하며, 하나의 종 안에는 유전적 특징이 서로 다른 여러 개의 균주들이 존재한다. 본 출원에서 균주는 아우레오바시디움 풀루란스를 의미하며, 구체적으로 기탁 번호 KCCM13230P로 기탁된 아우레오바시디움 풀루란스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 출원의 아우레오바시디움 플루란스 CJFSKY2201 균주는 단리된(isolated) 균주일 수 있고, 재조합 균주일 수 있으며, 상기 재조합은 유전적 변형에 의해 이루어질 수 있다. 또한, 자연적으로 비발생된(Non-naturally occurring) 균주일 수 있으며, 돌연변이 균주일 수 있다. 또한 상기 균주는 아우레오바시디움 풀루란스 균주의 균체, 건조된 균체 등을 포함할 수 있다. 상기 건조된 균체는 분무 건조균, 동결 건조균, 진공 건조균, 드럼 건조균 등의 건조균일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 출원에서 상기 균주는 장기간 안정적으로 보존하기 위하여, 물에 글리세롤 성분을 일정량 혼합하여 만든 보관용액에 균체를 풀어 -70 ℃에서 보관하거나 멸균된 10 % 탈지유에 현탁하여　동결 건조할 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 다양한 공지의 방법에 의해 장기 보존형태가 될 수 있다.

상기 균주는 야생형에 비하여 올리고당 합성능이 증가된 것일 수 있으며, 올리고당 합성효소의 활성이 증가된 것일 수 있고, 상기 올리고당 합성효소는 프락토실트랜스퍼라아제(Fructosyltransferase)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 프락토실트랜스퍼라아제는 설탕이나 원당을 원료로 하여 프락토올리고당을 제조하는데 사용되는 효소이다. 이는 원당이나 설탕을 가수분해한 후, 과당 1 분자를 원당 또는 설탕 분자에 결합시켜 올리고당을 합성하는 기능을 하는 것으로 알려져 있다.

본 출원의 다른 하나의 양태는, 수탁번호 KCCM13230P로 기탁된 아우레오바시디움 플루란스(Aureobasidium pullulans) CJFSKY2201 균주의 배양액을 제공한다.

본 출원의 용어, “배양”은 균주를 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 출원에서 상기 균주의 “배양액”은 균체를 포함한 배양 원액일 수 있으며, 또한 배양 상등액을 제거하거나 농축한 균체일 수 있다. 상기 배양액의 조성은 통상의 아우레오바시디움 배양에 필요한 성분뿐 아니라, 아우레오바시디움의 생장에 상승적으로 작용하는 성분을 추가적으로 포함할 수 있으며, 이에 따른 조성은 당업계의 통상의 기술을 가진 자에 의하여 용이하게 선택될 수 있다.

본 출원의 균주의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 아우레오바시디움 속 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용될 수 있으며, 구체적으로는 본 출원의 균주를 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 무기염, 아미노산, 비타민 및/또는 핵산 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 또는 혐기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.

배지로는 천연배지 또는 합성배지를 사용할 수 있다. 배지의 탄소원으로는 예를 들어, 글루코오스, 수크로오스, 덱스트린, 글리세롤, 녹말 등이 사용될 수 있고, 질소원으로는 펩톤, 육류 추출물, 효모 추출물, 건조된 효모, 대두, 암모늄염, 나이트레이트 및 기타 유기 또는 무기 질소 함유 화합물이 사용될 수 있고, 인원으로는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 또는 이에 대응되는 소디움-함유 염 등이 사용될 수 있으나, 이러한 성분에 한정되는 것은 아니다. 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있고, 무기염으로는 마그네슘. 망간, 칼슘. 철, 칼륨 등이 사용될 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.

본 출원의 일 실시예에서는 아우레오바시디움 플루란스 균주를 수크로오스, 효모 추출물이 포함된 배지에서 pH 5 내지 6의 조건으로 종균배양(Seed culture)하였으며, 본배양(Main culture)은 수크로오스, 효모 추출물, 인산 제2칼륨, 황산마그네슘 및 소포제 등을 포함한 배지에서 약 pH 7의 조건으로 하였으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 성분 및 각 재료의 투입량은 적절히 조정될 수 있다.

본 출원의 다른 하나의 양태는, 상기 균주가 고정화된 비드(bead)를 제공한다. 본 출원에서 상기 비드(bead)는 균주를 고정화하기 위한 것으로, 그 제조 방법에 특별한 제한을 받지 않는다. 상기 고정화는 어떤 공간이나 물체의 부분에 균체를 고정시키고, 그 생물학적 촉매 성질을 유지하여, 연속적으로 재사용을 가능하게 하는 작업을 말한다. 일반적으로 고정화 담체와 고정화 방법의 선정에는 미생물의 특성이 고려되어야 하며, 고정화 방법에는 흡착법, 포괄법 등이 있고, 고정화 담체로는 Ca-alginate, K-carrageenan, Gelatin, Chitosan, Polyacrylamide gel 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 출원의 일 실시예에서는 세포의 현탁액에 Alginate 용액을 혼합하고, 혼합액을 필터링한 후, 비드 제조기 탱크에 혼합액을 채우고, 이를 염화칼슘(CaCl₂₎ 용액에 침적시켜 비드를 제조하였다.

본 출원의 다른 하나의 양태는, 상기 균주를 배양하는 단계 및 상기 배양액으로부터 올리고당을 수득하는 단계를 포함하는, 올리고당 제조 방법을 제공한다.

본 출원의 용어, “배양” 및 “배양액”은 전술한 바와 같다.

올리고당류는 당질원료를 이용하여 10 이하의 당 분자가 직쇄 또는 분지결합하도록 효소를 작용시켜 얻은 당액이나 이를 여과, 정제, 농축한 액상 또는 분말상의 것으로, 올리고당과 올리고당 가공품의 2가지 식품유형이 있다.

본 출원의 용어, “올리고당(oligosaccharides)”은 당 단위의 수가 약 2~10 개 정도인 당을 말하며, 그 종류로는 이소말토올리고당, 프락토올리고당, 갈락토올리고당, 자일로올리고당, 겐티오올리고당, 말토올리고당, 혼합올리고당 등이 있다.

본 출원의 “프락토올리고당(fructooligosaccharides)”은 설탕의 과당 잔기에 1 이상의 과당 분자, 구체적으로는 약 1 내지 5의 과당 분자, 보다 구체적으로는 약 1 내지 3의 과당 분자가 결합된 당류의 혼합물로서, 1-케스토스 (1-kestose, GF2), 니스토스(nystose, GF3) 및 1-F 프락토퓨라노실 니스토스(1-F fructofuranosyl nystose, GF4) 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 프락토올리고당은 주로 원당 또는 설탕을 원료로 효소 분해하여 만들어지나, 이에 제한되지 않는다. 프락토올리고당은 다양한 가공식품에 이용되며, 떡류, 카스텔라, 한과류 및 케?, 젤리 등의 제조에 널리 이용되나, 이에 제한되지 않는다.

상기 올리고당 가공품은 올리고당에 식품 또는 식품첨가물을 가하여 가공한 것을 말하며, 각각 프락토올리고당, 이소말토올리고당, 갈락토올리고당, 자일로올리고당, 겐티오올리고당을 10 %이상, 말토 올리고당을 40 %이상 함량으로 포함하는 것을 말한다.

본 출원에서 상기 균주를 이용하여 올리고당을 수득하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용할 수 있으며, 연속공정 제조 방법, 반 회분식 제조 방법, Batch식 제조 방법 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 바람직하게는, 상기 균주의 배양액에 설탕을 혼합하여 반응시킨 후, 반응물로부터 올리고당을 수득하는 방법 또는 상기 균주의 배양액으로부터 프락토실트랜스퍼라아제(Fructosyltransferase) 효소를 분리하고, 분리된 효소와 설탕을 혼합하여 반응시킨 후, 반응물로부터 올리고당을 수득하는 방법일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 출원의 “설탕(GF)”은 수크로스(sucrose) 또는 자당으로 불리기도 하며, 1 분자의 과당(fructose)과 1 분자의 글루코스(glucose)가 글리코사이드 결합으로 연결된 이당류를 말한다.

상기 설탕을 혼합하여 반응시키는 단계는 40℃ 내지 60℃의 온도 범위에서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 반응 시간은 원하는 목적 물질의 생성량이 얻어질 때까지 계속될 수 있다.

상기 올리고당을 수득하는 단계는 당업계에 알려진 통상적인 분리 방법에 의하여 수행될 수 있다. 이러한 분리 방법에는, 원심분리, 여과, 크로마토그래피 및 결정화 등의 방법이 이용될 수 있다. 예를 들면, 반응물을 저속 원심분리하여 바이오매스를 제거하고 얻어진 상등액을 이온교환 크로마토그래피를 통하여 분리할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또 다른 방법으로, 반응물로부터 균주 분리 및 여과 공정을 수행하고, 별도의 정제 공정 없이 목적 물질을 회수할 수도 있다. 또 다른 방법으로, 상기 회수 단계는 정제 공정을 추가로 포함할 수 있다.

본 출원에서는 올리고당 생산에 사용되는 아우레오바시디움 플루란스 균주에 자외선 조사로 랜덤 돌연변이를 유발하여 동일한 설비, 동일한 배양 조건에서도 고역가인 균주를 개발한 바, 종래보다 더 빠르고 많이 설탕을 올리고당으로 전환시키는 것이 가능하다. 이것은 생산성 향상으로 이어질 뿐만 아니라, 긴급 물량에 대한 대응도 가능하게 한다. 또한, 종래보다 빠른 시간 안에 올리고당을 생산하여 그에 수반되는 연료, 인력 등 고정비용을 획기적으로 절감할 수 있으며, 더 안정적으로 올리고당을 생산할 수 있다.

본 출원의 다른 하나의 양태는, 수탁번호 KCCM13230P로 기탁된 아우레오바시디움 플루란스(Aureobasidium pullulans) CJFSKY2201 균주, 이의 파쇄물, 이의 배양물, 이의 농축액, 또는 이의 건조물을 포함하는 조성물을 제공한다. 상기 균주에 관한 보다 상세한 사항은 전술된 내용을 참조할 수 있다.

상기 아우레오바시디움 플루란스 CJFSKY2201 균주, 이의 파쇄물, 이의 배양물, 이의 농축액, 또는 이의 건조물을 포함하는 조성물은 올리고당 제조용 조성물로 활용될 수 있으며, 식품 조성물 또는 사료 조성물의 제조에 활용될 수 있다.

상기　균주의 상태는 액상 상태 또는 건조 상태일 수 있으며, 상기 건조를 위한 방법에는 통풍 건조, 자연 건조, 분무 건조 및　동결 건조 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.

상기 조성물은 동결보호제 또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 동결보호제 또는 부형제는 비자연적으로 발생한(non-naturally occurring) 물질 또는 자연적으로 발생한 물질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또 하나의 구체 예로, 상기 동결보호제 또는 부형제는 아우레오바시디움 플루란스 CJFSKY2201 균주가 자연적으로 접촉하지 않는 물질, 또는 상기 균주와 자연적으로 동시에 포함되지 않는 물질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또 하나의 구체예로, 상기 조성물은 글리세롤, 트레할로스, 말토덱스트린, 탈지분유 및 전분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 동결보호제; 및/또는 포도당, 덱스트린 및 탈지우유로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 부형제;를 추가로 포함할 수 있다. 본 출원의 동결보호제는 상기 조성물 총 중량에 대하여 0.01 중량% 내지 20 중량%, 0.01 중량% 내지 10 중량% 포함될 수 있고, 구체적으로 상기 글리세롤은 5 중량% 내지 20 중량%, 상기 트레할로스는 2 중량% 내지 10 중량%, 상기 말토덱스트린은 2 중량% 내지 10 중량%, 상기 탈지분유는 0.5 중량% 내지 2 중량%, 상기 전분은 0.1 중량% 내지 1 중량%로 상기 조성물에 포함될 수 있다. 또한, 상기 부형제는 상기 조성물 총 중량에 대하여 75 중량% 내지 95 중량% 또는 85 중량% 내지 95 중량%로 포함할 수 있다.

또한, 상기 아우레오바시디움 플루란스 CJFSKY2201 균주, 이의 파쇄물, 이의 배양물, 이의 농축액, 또는 이의 건조물을 포함하는 조성물을 제조하는 방법은, 상기 아우레오바시디움 플루란스 CJFSKY2201 균주, 이의 파쇄물, 이의 배양물, 이의 농축액, 또는 이의 건조물과 첨가제를 혼합하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 첨가제는 전술한 동결보호제 또는 부형제일 수 있다.

본 출원의 다른 하나의 양태는 상기 제조 방법에 의해 생산된 올리고당을 포함하는 식품 조성물을 제공한다.

이때 상기 용어 “올리고당”은 상기에서 서술한 바와 같다.

본 출원의 용어 "식품"이란, 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료, 비타민 복합제, 건강 기능 식품 및 건강 식품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.

상기 건강 기능 식품(functional food)은, 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)과 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미한다. 여기서 '기능'이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 출원의 식품은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조 가능하며, 상기 제조시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 상기 식품의 제형은 식품으로 인정되는 제형이면 제한없이 제조될 수 있다.

상기 건강 식품(health food)은 일반식품에 비해 적극적인 건강유지나 증진 효과를 가지는 식품을 의미하고, 건강보조식품(health supplement food)은 건강보조 목적의 식품을 의미한다. 경우에 따라, 건강 기능 식품, 건강식품, 건강보조식품의 용어는 호용된다.

구체적으로, 상기 건강 기능 식품은 본 출원의 조성물을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품 소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용이 없는 장점이 있다.

이때, 상기 식품에 포함되는 올리고당의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 식품 조성물의 총 중량에 대하여 0.01 내지 100 중량%, 구체적으로는 1 내지 80 중량%로 포함될 수 있다.

상기 식품 조성물은 생리학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있는데, 담체의 종류는 특별히 제한되지 않으며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다.

또한, 상기 식품 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu), 크륨(Cr) 등의 미네랄; 및 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다.

또한, 상기 식품 조성물은 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 포함할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용될 수 있다.

본 출원의 다른 하나의 양태는 상기 제조 방법에 의해 생산된 올리고당을 포함하는 사료 조성물을 제공한다.

이때 상기 용어 “올리고당”은 상기에서 서술한 바와 같다.

본 출원의 용어 "사료"는, 동물이 먹고, 섭취하며, 소화시키기 위한 또는 이에 적당한 임의의 천연 또는 인공 규정식, 한끼식 등 또는 상기 한끼식의 성분을 의미한다.

상기 사료의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 사료를 사용할 수 있다. 상기 사료의 비제한적인 예로는, 곡물류, 근과류, 식품 가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박 류 또는 곡물 부산물류 등과 같은 식물성 사료; 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물 성류, 유지류, 단세포 단백질류, 동물성 플랑크톤류 또는 음식물 등과 같은 동물성 사료를 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.

본 출원의 사료 조성물에 포함되는 올리고당은 사료의 사용목적 및 사용조건에 따라 달라질 수 있으며, 일 예로 가축 사료 조성물의 총 중량에 대하여 0.01 내지 100 중량%, 보다 구체적으로는 1 내지 80 중량%로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 출원에서는 수탁번호 KCCM13230P로 기탁된 아우레오바시디움 플루란스 CJFSKY2201 균주가 올리고당 합성능이 높은 것을 확인하여, 이를 이용하여 올리고당을 효과적으로 생산할 수 있으며, 본 출원의 제조 방법에 의해 생산된 올리고당을 식품 조성물, 사료 조성물 등의 생산에 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 기존 균주 및 선별된 돌연변이 균주의 올리고당 생산 반응 결과, 36일 동안의 유속 및 일별 누적 생산량을 그래프로 나타낸 도이다.

이하, 하기 실시예에 의하여 본 출원을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 출원을 예시하기 위한 것일 뿐 본 출원의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 균주의 배양 방법

본 출원에서 아우레오바시디움 플루란스 균주의 종균배양(Seed culture)은 수크로오스, 효모 추출물이 포함된 배지에서 pH 5 내지 6의 조건으로 하였으며, 이때 평균 OD(optical density, 광학밀도)는 10이었다.

균주의 본배양(Main culture)은 수크로오스, 효모 추출물, 인산 제2칼륨, 황산마그네슘 및 소포제 등을 포함한 배지에서, 약 pH 7의 조건으로 하였으며, 이때 평균 OD는 160이었다.

실시예 2. 돌연변이 균주의 선별

실시예 2-1. 1차 선별

아우레오바시디움 플루란스 균주 배양액 1 ml를 취하여 3M 멸균 희석액(Saline) 9 ml로 희석 후 무균 플레이트(SPL Petridish)에 분주하여 10 배 희석하였다. 이후 Clean bench 안에서 플레이트에 자외선(UV)을 20초 위의 높이에서 일정 시간 조사했다. 조사 후, 각 플레이트에서 0.1 ml씩을 취하여 3M 멸균 희석액(Saline) 9.9 mL로 100배 희석했다. 희석된 용액을 플레이트에 1 mL씩 분주하여 PDA(BD Difco) 배지에서 알루미늄 호일을 이용하여 차광 배양하였으며, 28 ℃에서 균이 완전히 자라는 2~3일 간 배양했다.

배양된 균주 중 특징별로 그룹을 설정하여 그룹별로 500 mL 진탕 플라스크(Shaking incubator, Lab tech)에 배양액 150 mL를 넣어 220 RPM으로 프리시드(Pre-Seed) 배양을 하였다. 21시간 후, OD(optical density, 광학밀도) 및 역가를 측정하여 우수한 균주를 1차로 선택하였다.

실시예 2-2. 2차 선별

실시예 1-1에서 선별한 돌연변이 균주를 각각 배양액 0.9 ml에 40% 글리세린 0.9 ml를 넣어 제작한 MCB 1 캡슐(Thermo 1.8ml)을 순수분리하였다. 이로부터 무작위로 20개 균을 선택한 후, 500 mL 진탕 플라스크에 배양액 150 mL를 넣어 240 RPM으로 Pre-Seed 배양하였다. 21시간 후 OD 및 역가를 측정하여 우수한 균주를 선택했다.

선발된 돌연변이 균주로 제작한 MCB 1 캡슐을 순수분리 후 높은 역가를 나타낸 균주의 바이알을 순수분리하고, 균 10개씩을 무작위로 선택하여 500 mL 진탕 플라스크에 배양액 150 mL를 넣어 240 RPM으로 Pre-Seed 배양하였다. 21시간 후 OD 및 역가를 측정하여 우수한 균주를 선택했다.

실시예 2-3. 최종 선별

실시예 1-2에서 높은 역가를 나타낸 균주로 제작한 MCB를 각각 1 캡슐 순수분리한 후 균 10개씩을 특성에 따라 선택하여 슬랜트 배지로 계대하였다. 이후 500 mL 진탕 플라스크에 배양액 150 mL를 넣어 240 RPM으로 Pre-Seed 배양하였다. 21시간 배양 후 OD 및 역가를 측정하여 우수한 균주를 선택했다.

배양 결과, 상기 표 1에 나타난 것과 같이, 4-1-7-1 균주가 기존 균주 대비 역가가 약 24%로 증가한 것을 확인한 바, 이를 가장 우수한 균주로 최종 선별하였다.

상기 선별된 균주는 아우레오바시디움 플루란스 CJFSKY2201로 명명하였으며, 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(Korean CultureCenter of Microorganisms, KCCM)에 2022년 8월 24일자로 기탁하여 기탁번호 KCCM13230P 를 부여 받았다.

실시예 3. 선별된 돌연변이 균주의 파일럿 반응기 실험

최종 선별된 돌연변이 균주(4-1-7-1) 및 기존 균주를 현장 반응기 비율대로 축소한 파일럿(Pilot) 반응기로 실험하였다. 기존 균주와 돌연변이 균주의 반응기 유속과 생산량을 비교하였다. 반응기 자켓 온도는 49 °C로 하였다.

선별된 최종 돌연변이 균주(4-1-7-1)와 기존 균주의 올리고당 생산성에 직접적인 영향을 주는 역가를 비교한 결과, 하기 표 2에 나타낸 것과 같이, 평균 역가는 기존 균주가 370, 돌연변이 균주는 450으로 나타난 바, 기존 균주 대비 평균 역가가 약 20 % 향상된 것을 확인하였다.

총 36일 동안 올리고당 생산 반응을 진행한 결과, 돌연변이 균주는 178 L, 기존 균주는 144 L의 올리고당을 생산한 바, 하기 표 3에 나타낸 것과 같이, 돌연변이 균주의 올리고당의 생산성은 기존 균주 대비 약 23 % 향상된 것을 확인하였다.

또한, 도 1에 나타낸 것과 같이, 기존 균주 대비 돌연변이 균주의 유속은 평균 +0.04 증가하였고, 그에 따른 36일 간의 올리고당 누적 생산량도 약 23 % 증가하였다.

실시예 4. 선별된 돌연변이 균주의 현장 반응기 실험

최종 선별된 돌연변이 균주 및 기존 균주를 현장 반응기를 이용하여 비교 실험하였다. 다른 배양 조건은 파일럿 반응기 실험과 동일하게 하여, 현장 반응기에서의 유속과 생산량 등을 비교하였다. 그 결과, 역가, pH, DO, OD 및 C/W 등의 배양 패턴이 파일럿 반응기 실험 결과와 거의 유사함을 확인하였다. 또한, 현장 배양 결과, 기존 균주 대비 돌연변이 균주는 하기 표 4에 나타낸 것과 같이 올리고당 생산성이 약 10 % 향상된 것을 확인하였다.

이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술 분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

한국미생물보존센터(KCCM) KCCM13230P 20220824

Claims (9)

1. 수탁번호 KCCM13230P로 기탁된 아우레오바시디움 플루란스(Aureobasidium pullulans) CJFSKY2201 균주.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 균주는 야생형에 비하여 올리고당 합성능이 증가된 것인, 균주.
   
3. 수탁번호 KCCM13230P로 기탁된 아우레오바시디움 플루란스(Aureobasidium pullulans) CJFSKY2201 균주의 배양액.
   
4. (a) 제1항의 균주를 배양하는 단계; 및
   (b) 상기 배양액으로부터 올리고당을 수득하는 단계;를 포함하는, 올리고당 제조방법.
   
5. 제4항에 있어서,
   상기 (b) 단계는 상기 배양액에 설탕을 혼합하여 반응시킨 후, 반응물로부터 올리고당을 수득하는 것인, 올리고당 제조 방법.
   
6. 제4항에 있어서,
   상기 (b) 단계는 상기 배양액으로부터 프락토실트랜스퍼라아제(Fructosyltransferase) 효소를 분리하고, 분리된 효소와 설탕을 혼합하여 반응시킨 후, 반응물로부터 올리고당을 수득하는 것인, 올리고당 제조 방법.
   
7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고당은 프락토올리고당인, 올리고당 제조 방법.
   
8. 제7항에 있어서, 상기 프락토올리고당은 1-케스토스 (1-kestose), 니스토스(nystose) 및 1-F 프락토퓨라노실 니스토스(1-F fructofuranosyl nystose)를 포함하는 것인, 올리고당 제조 방법.
   
9. 제5항 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응시키는 단계는 40 ℃ 내지 60 ℃의 온도 범위에서 수행되는 것인, 올리고당 제조 방법.