JPH0279992A - ガラクトシルラクトースの製造方法及びその組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は生理活性を有するオリゴ９糖として有用なガラ
クトシルラクトースの製造方法に関する。

〔従来の技術〕

ガラクトシルラクトースは、ビフィＰバクテリウム菌の
増殖促進因子としての作用が注目され、アスペルギルス
・オリゼの生産するβ−ガラクトシダーゼを乳糖（ラク
トース）に作用させて製造する方法が開示されている。

（％公昭５８−２０２６６号公報）その後、単糖など副
生成物の多い酵素法の欠点を補う方法としてクリプトコ
ッカス属の酵母を用いる方法が開示されている。

（特開昭６０−２５１８９６号公報） 更に最近、特開昭６２−２０８２９３号公報には、ガラ
クトオリが糖の対乳糖収率を高め、培養時間が短縮され
た方法としてブレラ属の酵母を用いる方法が開示されて
いる。又、特開昭６３−１８５３７３号公報には、乳糖
を乳糖資化能を有する酵母の静止菌体で処理する方法が
示されている。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしながら、これらの方法は、いずれも原料のラクト
ース濃度を１０重量％以下と低くしないとガラクトシル
ラクトースのラクトースに対する生成収率が非常に悪く
、工業化の上で問題であった。

〔課題を解決する為の手段〕

本発明者らは、高濃度のラクトースを原料としてガラク
トシルラクトースを製造する方法について鋭意研究の結
果、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は、高濃度のラクトース中でガラクトース
をラクトースに転移しガラクトシルラクトースを生成さ
せる能力を有する微生物又はその微生物により得られる
酵素を高濃度のラクトースを含んだ水溶液に作用させる
ことを特徴とするガラクトシルラクトースの製造方法を
提供するものである。

〔構成〕

本発明のラクトースの高濃度とは、好ましくは１０重量
−以上、特に好ましくは１５〜４０重量−であシ、通常
水溶液である。

本発明の高濃度のラクトース中でガラクトースをラクト
ースに転移し、ガラクトシルラクトースを生成させる能
力を有する微生物又はその酵素とは、高濃度のラクトー
ス中においてラクトースを分解すると共にガラクトース
をラクトースに転移する微生物又は酵素であればいずれ
のものでもよいが、例えばロドトルラ属、キャンディダ
属、ビヒア属、スポロミセス属、クルイベロミセス属、
トルロプシス属、プレタノミセス属、ブレラ属、クリブ
トコツカス属、デバリオミセス馬、トリコスポロン属、
リボマイセス属に属する酵母類及びこれらから得られる
酵母である。好ましくは、リボマイセス属の酵母である
。

本発明は、特に好ましくはりポマイセス・スピーシズ（
Ｌｉｐｏｍｙｅｅｓ　ｓｐ　）　ＤＩＣ−６３００が挙
げられる。本菌は上記の特徴を有したガラクトシルラク
トース生産酵母であって、これは本発明者らＫよシ千葉
県印旙郡へ街町の畑土壌よシ分離されたもので、通産省
微生物工業技術研究所に微工研菌寄第１０１５０号とし
て寄託されている。いうまでもなく、これらの菌株を人
工的に変異処理した菌株、即ち化学的、物理的手段によ
る突然変異菌であっても本発明に係る菌として使用する
ことができる。

以下に本菌の菌学的性質について詳述する。

（１）各培地における生育状態 （ａ）　　ＭＹ液体培地：２５℃、４〜７日培養、細胞
は（３，０〜４．５　）　Ｘ　（４，５〜７．０）μ円
形あるいは卵形が多いが、不定形のものもある。

Ｃｒ＠ｅｐｉｎｇあるいはＷｒｉｎｋｌｅｄ様の皮膜を
形成する。分裂子は形成せず、多極出芽法で増殖する。

（ｂ）ＭＹ寒天培地＝２５℃、１か月培養、集落はクリ
ーム色からやや褐色を帯びて不透明。

集落の性状は粘稠性を示す。

（Ｃ）／テト・デキストロース寒天培地によるスライド
培養＝２５℃、菌糸及び偽菌糸は形成しない。

（２）子のり胞子の形成：エタノールあるいは酢酸培地
で４〜６個の卵形の胞子を形成する。

（３）　　射出胞子の形成二ＭＹ寒天平面培養により射
出胞子の形成は認められ々かった。

（４）生理的性質 （＆）　　最適生育条件 ３０℃〜３５℃で良く生育し、１８℃〜３８℃でも良く
生育する。

−４，０〜６．０で良好な生育が見られる。

（ｂ）　　生育の範囲 ５℃以下、４０℃以上では生育は見られない。ｐＨ８ま
ではかなり良く生育するが、…９、　Ｏを越えると生育
しない。

硝酸塩の同化性：なし 脂肪の分解性：なし 尿素の分解性：なし ゼラチンの液化性：なし カロチノイドの生成：なし 生酸性二弱いが認められる。

デンプン様物質の生成：顕著に生成する。

ビタミンの要求性：要求する ５０％グルコース・酵母エキス培地：生育しない。

３７℃での生育：生育する 脂質含量：３４．４％ 糖質の発酵性：なし 各種炭素源の資化性 一アラピノース　　　　十 一アラビノース　　　　士 一すゲース　　　　　　　＋ −キシロース　　　　　十 一グルコース　　　　　十 一ガラクトース　　　　士 −ラムノース　　　　　＋ Ｌ−ソルゲース マルトース シェフロース ラクトース メリピオース セロビオース トレハロース ラフィノース α−メチル−Ｄ−グルコシド 可溶性デンプン イヌリン エタノール イノシット Ｄ−マンニット Ｄ−ソルビット グリセリン ＤＬ−乳醸 クエン酸 コハク酸 サリシン ＋ ＋ ＋ 本発明に係るガラクトシルラクトース竜生薗ＤＩＣ−６
３００は、子のり胞子が認められること、デンプン様物
質を生成すること、また糖類の発酵性がなく、硝酸塩を
同化しないこと、さらには細胞内に油滴状のものを含ん
でいること、脂質含量が３４６４チと高いことなどから
ロダー（Ｌｏｄｄｅｒ　）著「ザ・イースト・ア・タキ
ソノミック・スタブ４　　　（Ｔｈ＠　　Ｙｅａｓｔｓ
　　　Ａ　　Ｔａｘｏｎｏｍｌｃ　　　５ｔｕｄｙ　　
　（１９７１）　　　Ｊ　　によってりＩマイセス属に
属するものと考えられる。

ロダーの記載するりポマイセス属の既知菌種としテハリ
ホマイセス・コネンコアエ（Ｌｌｐｏｍｙｃｓｓｋｏｎ
ｅｎｋｏａｅ　）、リポマイセス・リポファー（Ｌｌｐ
ｏｍｙｃｅａ　１ｉｐｏｆｏｒ　）、リポマイセス・ス
ターキー（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ　５ｔａｒｋｅｙｉ　）
の３種があるが表−１に示すように、デンプン様物質の
生成、生育温度範囲、炭素源の資化性よシリポマイセス
・スターキーの近縁種と同定した。

尚、特開昭６３−１８５３７３号公報には、リポマイセ
ス・スターキーに属する酵母が記載されているが、生育
温度、コハク酸、イノシトール等の炭素源資化性能等か
ら全く別種の菌株と考えられる。

本発明は、微生物の培養及び微生物の酵素を使って行わ
れるが、電絡組成物中にグルコースが残らない様にする
為には、ラクトースを炭素源として微生物を培養しつつ
ラクトースを分解させグルコースを消費させて、ガラク
トースをラクトースに転移させることにより、ガラクト
シルラクトースを製造するのが良い。

本発明に用いられる菌株としてりＩマイセス・スビーシ
ズＤＩＣ−６３００がその代表例として挙げられるが、
リボマイセス属に！１４し、ガラクトシルラクトースを
生産する微生物はすべて本発明に含まれる。同定におけ
る実験方法はロダーの上記の著書及び飯塚廣、後藤昭二
著「酵母の分類同定法玉長谷用武治編著「微生物の分類
と同定」に従った。

／ ／ 万 ／ ／ 表 本発明の微生物の培養に使用する培地としては、通常の
固体培地及び液体培地を用いることができる。また、主
炭素源としてのラクトース及び窒素源、無機物、ビタミ
ン、その他の生長促進物質をそれぞれ適量に含有する培
地ならば、合成培地、天然培地のいずれも使用可能であ
る。前培養においては、ラクトース以外の炭素源、例え
ばグルコース、可溶性デンプン蔗糖、麦芽糖、廃糖蜜を
含んだ培地であっても差しつかえない。むしろラクトー
スより、グルコースや麦芽糖の方が重曹の増殖を目的と
するには優れた炭素源であるが、本培譬培地としては、
ラクトースが唯一の炭素源であることが、後の精製工程
、あるいは重曹の活性を維持する目的のためにもよシ好
ましい。もちろん、ラクトースを主成分として含んだ脱
脂粉乳等も本目的の培地成分となり得る。培地中のラク
トースとしては、約５〜４０重量係、好ましくは１０〜
４０重１１Ｌ、より好ましくは１５〜４０重ｔチの基質
濃度において目的とするガラクトシルラクトースを製造
することが可能である。むしろラクトース濃度が５重！
俤よりも低い場合は、ラクトースの分解のみが起こシガ
ラクトシルラクトースは生成しない。特にラクトース濃
度２０〜３０重量％においてガラクトシルラクトースの
生成収率が、対ラクトース６０重量％以上を示し、又最
高の生成率までに達する時間が６０〜９０時間と比較的
短時間である。

本発明の培養に使用する窒素源としては、アンモニウム
塩、尿素、コーン・ステイープ・リカー酵母エキス、ペ
プトンなどの窒素化合物が用いられる。又その他マグネ
シウム塩、リン酸塩、カリウム塩、カルシウム塩、鉄塩
などの無機塩、および必要に応じてビタミン類、アミノ
酸類などの生育に必須な物質あるいは生長促進物質を添
加することも好ましい。

培養温度は２０〜４０℃で生育可能であるが、菌の生育
速度、ガラクトシルラクトース生成収率などの点で、３
０〜３５℃が特に好ましい。また本酵母は−３〜９で生
育可能であるが、ｐＨ４〜６がより好ましい。一方、ガ
ラクトシルラクトースの生成に適したーは本菌株の菌体
内酵素であるβ−ガラクトシダーゼが転移作用を示す範
囲であればよいが、その好適な声は３〜６であり、とく
に−が６以上になると転移作用が極めて弱くなる。

長期連続運転等を目的とした工業束量においては雑菌汚
染の少ないｐＨ３〜４で培養することが特に好ましい。

培養時間は条件によっても異なるが、適当な−に制御し
、通常の通気攪拌培養を行った場合、例えばラクトース
濃度が２０重ｔＳではガラクトシルラクトースの生成収
率が対ラクトース８０チ以上を示し、培養時間は６０〜
７０時間である。

このようにして得られたガラクトシルラクトースを含有
した培養液もしくは反応液は、口過又は遠心分離により
菌体を除去する。Ｒｓｓｔｌｎｇ　ｃａｌｌ法もしくは
固定化菌体法で行う場合は、無菌的に上記操作を行った
後、かかる目的の方法を用いればよい。

得られた培養上清液、もしくは反応上清液は、ガラクト
シルラクトースとラクトースとを主に含有してなる組成
物であるが、培地成分等の夾雑物があるので、使用でき
る組成物とするには、例えば活性炭やイオン交換樹脂を
用いて脱色、脱塩を行ない、濃縮してシロップ状とする
か、もしくは濃縮液をスプレードライ、又は凍結乾燥す
ることにより粉末化することもできる。またガラクトシ
ルラクトースを純粋にもしくは高純度で採取するには、
活性炭カラムクロマトグラフィーを行って糖類を吸着さ
せ、適当な濃度のエタノール水溶液で溶出後、減圧濃縮
し、前述と同様な操作を行ってシロップ状とするか粉末
化すればよい。

〔効果〕

本発明は、原料のラクトース濃度を２０〜４０重量係と
いう高濃度としても、目的とするガラクトシルラクトー
スが、ラクトースに対して収率６０％以上の高い収率で
得られ、優れた土竜性を示すものである。又、得られた
組成物は、収率が高い為、脱塩、脱色をする程度でその
ままガラクトシルラクトース組成物として使用可能なも
のである。

〔実施例〕

以下実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発
明はこれらに限定されるものではない。

文中「チ」、「部」は、断わりのない限り、重量基準で
ある。

実施例１ ラクト−ス５チ、酵母エキス０．１％、硫酸アンモニウ
ム０．５’ｌ　リン酸１カリウム０．４１　　リン酸２
カリウム０．１５９ｇ、硫酸マグネシウム０．０６％（
ｐＨ６，０）の培地組成よりなる培地１００ｒｎｌを入
れた坂ロフラスコ２本にリポマイセス・スピーシズＤＩ
Ｃ−６３００菌をスラントより１白金耳液種し、３０℃
で２日間培養し、これを種菌とした。

ラクトース２０チに代えた以外種培養と同様の培地成分
を含んだ培地４１を１０１容ジヤーフアメンターに仕込
み、殺菌後、種菌２本を加え、通気ｔ４．　Ｏｌ／ｍ１
　ｎ　ｓ攪拌速度６００ｒｐｍ、温度３０℃で６　Ｎ　
ＮａＯＨにて−を４．０にコントロールしながら培養を
行った。培養時間７２時間間口上清液についてＨＰＬＣ
で分析を行った結果、ガラクトシルラクトース１７．０
チ、ラクトース２．５ヂであり、加えたラクトースに対
するガラクトシルラクトースの生成収率は８５チであっ
た。

この時点で培！液を回収し、遠心分離により菌体を除去
した。得られた培養上清液４００Ｍを２００３ｍＡ’の
活性炭を充てんしたカラムに吸着させ、５１の蒸留水を
流して単糖及び２塘類の１部を溶出させた。次いで５チ
のエタノール溶液を３１流して残りの２糖類を溶出後、
１５チのエタノール２１を流してガラクトシルラクトー
スを溶出させた。溶出液は減圧濃縮後、陽イオン交換樹
脂（ア７ハ−５（）　２００Ｃ：ローム・アンド・ハー
ス社製）と陰イオン交換樹脂（アンバーライトＩＲＡ−
９３：ローム・アンド・ハース社製）ヲ２　：　１ノ割
合で充てんしたカラム（Ｖｏｌ、　２００　ｍｌ　）を
通して脱塩後、再び減圧濃縮し、凍結乾燥させた。得ら
れた白色粉末の成分はガラクトシルラクトース９９．１
１　ラフ）−ス０．９　％　（ＨＰＬＣ法）を含むもの
であった。

実施例２ ラクトース濃度を３０俤にした以外は実施例１で用いた
培地組成とまったく同様の培地４１を１０１容ジヤーフ
アメンターに仕込み、前培讐したりポマイセス・スピー
シズＤＩＣ−６３００菌ｔ−ｉ種して実施例１とまった
く同様の条件で培養した。

培讐時間９０時間口の培養上清液についてＨＩ’ＬＣで
分析した結果、ガラクトシルラクトース１９．５チ、ラ
クトース９．３％であり、この場合のガラクトシルラク
トースの対ラクトース収率は６５．０％であった。

実施例３ 実施例１で得られたガラクトシルラクトースを理化学的
性質により確認した。

（１）元素分析値 Ｃ：４２．０２チ　　Ｈ：６．３３チ （２）分子量＝５０４ 分子量はマススにクトル法によυ決定した。

（３）構成糖の比率 ０゜Ｓ　Ｎ　ＨＣ１中Ｚｏｏ℃で３．５時間加水分解し
、グルコースはグルコースオキシダーゼ法で、マたガラ
クトースはＦキット（ペーリンが−・マンハイム社製）
で定量した結果、がラクトースとグルコースの比は２：
１であった。

（４）　　１３Ｃ−ＮＭＲによる結合様式の決定ガラク
トシルラクトースの　Ｃ−ＮＭＲピーク群から反応に関
与していないラクトース中のα、β−グルコースに帰属
されるピークを除去した残シのピークの帰属を検討する
ことにより、転移したがラクトースとラクトース中のが
ラクトースの結合位置を決定した。との結果、ラフ）−
スのガラクトースの４位がガラクトースの１位と反応し
たとして全ピークが帰属できた。（表−上記の理化学的
性質よシ、リボマイセス・スピーシズＤＩＣ６３００に
よりラクトースを基質として生成されるオリゴ糖はＯ−
β−Ｄ−がラクトピラノシル−（１→４）−０−β−Ｄ
−ガラクトピラノシル−（ｌ→４）−Ｄ−グルコースす
なわちガラクトシルラクトースであることが確認された
。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１の条件で培養を行った場合の経時変
化を表わしたものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、高濃度のラクトース中でガラクトースをラクトース
   に転移し、ガラクトシルラクトースを生成させる能力を
   有する微生物又はその微生物により得られる酵素を、高
   濃度のラクトースを含んだ水溶液に作用させることを特
   徴とするガラクトシルラクトースの製造方法。 ２、高濃度のラクトースが１０重量％を越える濃度であ
   る請求項１のガラクトシルラクトースの製造方法。 ３、高濃度のラクトースが１５〜４０重量％の濃度であ
   る請求項１のガラクトシルラクトースの製造方法。 ４、前記微生物が、リポマイセス属に属する酵母である
   請求項１のガラクトシルラクトースの製造方法。 ５、前記微生物がリポマイセス・スピーシズＤＩＣ−６
   ３００（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ．ＤＩＣ−６３００
   ）である請求項１、４のガラクトシルラクトースの製造
   方法。 ６、請求項１で得られたガラクトシルラクトースとラク
   トースとを含んでなる組成物。 ７、ガラクトシルラクトースを６０重量％以上含んでな
   る請求項６の組成物。