JPH0253033B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はガラクトオリゴ糖の製造法に関し、さ
らに詳しくは微生物の培養物またはその処理物を
利用したガラクトオリゴ糖の製造法に関する。

なお、本明細書において「ガラクトオリゴ糖」
とはガラクトース残基を含むオリゴ糖を意味す
る。

［従来の技術］ 近年、ガラクトオリゴ糖がビフイズス菌増殖因
子として注目されており、その製造法としては、
カビ、酵母、細菌など由来のβ−ガラクトシダー
ゼを利用した転移反応によつて乳糖または乳糖含
有物から製造する方法や、乳糖を含む培地にガラ
クトオリゴ糖を生産する能力を有する微生物を培
養し、培地中にガラクトオリゴ糖を生成せしめる
方法が知られている（−島英治編「食品工業と酵
素」第68頁、朝倉書店）。

［発明が解決しようとする問題点］ しかしながら、上記の従来の方法は、生成する
オリゴ糖の種類が10数程度であつたり、オリゴ糖
の収率が低いなど、実用化する上で問題があつ
た。

したがつて、本発明はビフイズス菌増殖因子と
して有用であると考えられているガラクトオリゴ
糖の収率が高く、しかも主成分の選択性が高いと
ともにその精製が容易な製造法を提供することを
目的としている。

［問題点を解決するための手段］ 本発明者らは、ビフイズス菌増殖因子として有
用であると考えられているガラクトオリゴ糖の生
産能の強い微生物を求めて、広く自然界より微生
物の検索を行なつた結果、クリプトコツカス
（Cryptococcus）属の微生物を乳糖または乳糖含
有物で培養することにより、培養物中に選択性良
くガラクトオリゴ糖が生成されることを認めた
（特願昭59−108547（特開昭60−251896号））。さら
に実用化上、効率の良いガラクトオリゴ糖の製造
法を求めて研究を進めた結果、クリプトコツカス
属の微生物の培養物またはその処理物と、乳糖ま
たは乳糖含有物とを反応させることによつても、
反応液中にガラクトオリゴ糖が大量に生成される
こと、さらに生成されたガラクトオリゴ糖の主成
分が、下記式 で表わされるＯ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−
（１→４）−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−
（１→４）−Ｄ−グルコースであることを認め、本
発明に至つた。

すなわち、本発明にかかるガラクトオリゴ糖の
製造法は、乳糖または乳糖含有物からガラクトオ
リゴ糖を生成する能力を有するクリプトコツカス
属に属する微生物を培養する工程と、上記微生物
培養工程によつて得られた培養物またはその処理
物と、乳糖または乳糖含有物とを反応させ、ガラ
クトオリゴ糖を生成させる工程を含むことを特徴
とする方法である。

本発明はクリプトコツカス属の微生物が非培養
条件下においてもガラクトオリゴ糖の生成能を有
することを見い出したものであつて、かかる方法
によつてガラクトオリゴ糖を製造した報告は過去
になく、新規なガラクトオリゴ糖の製造法であ
る。

以下本発明を詳細に説明する。

(イ) 使用する微生物 本発明で用いる微生物は、ガラクトオリゴ糖
生成能を有するものであり、クリプトコツカス
属に属する菌種である。その一例としてクリプ
トコツカス・ローレンテイ・バラエテイー・ロ
ーレンテイ（Cryptococcus laurentii var.
laurentii）OKN−４（以下OKN−４という）
は上記の特性を有し、ガラクトオリゴ糖を生成
するものであつて、本発明者らにより栃木県那
須群の土壌中より発見された菌種であり、工業
技術院微生物工業技術研究所へ微工研菌寄第
7629号として寄託されている。

OKN−４は次の菌学的性質を有する。

なお、以下に記載の菌学的性質の試験は、 J.Lodder；The Yeast（1970） 飯塚広、後藤照二；酵母の分類同定法
（1969） 長谷川武治；微生物の分類と同定（1975） に準拠し、また分類方法はJ.Lodder；The
Yeast（1970）に準拠して行なつた。

＜OKN−４の菌学的性質＞ (a) 各培地における生育状態 MY液体培地：25℃３日間培養で、細胞の形
態は球、楕円形、伸長形大きさは（3.0〜
5.3）×（4.0〜5.3）μ 多極出芽、islet状の皮膜形成 培地はにごり沈澱を形成 MY寒天培地：25℃１か月培養で、コロニー
は淡いオレンジ色から黄褐色光沢があり、
軟質で、粘稠である。

スライド培養：ポテト・デキストローズ培地
で菌糸、偽菌糸は形成しない。

(b) 子のう胞子の形成：通常の胞子形成培地上
では認められない。

(c) 射出胞子の形成：MY寒天平面倍養で認め
られない。

(d) 生理的性質 (1) 最適生育条件：PH６〜７、温度30℃ (2) 生育の範囲：PH３〜９、温度20〜40℃ (3) 硝酸塩の同化：同化しない (4) 脂肪の分解：分解しない (5) 尿素の分解：分解する (6) ゼラチンの液化：液化しない (7) カロチノイドの生成：生成しないか生成
してもごく僅か (8) 有機酸の生成：生成しない (9) デンプン様多糖類の生成：生成する (10) ビタミンの要求性：ビタミン欠培地で生
育しない (11) アルブチンの分解：分解する (12) シクロヘキシミド耐性：生育しない (13) 37℃での生育：生育する (14) 50％グルコース酵母エキス倍地での生
育：生育しない (e) 各炭素源に対する同化性 (1) Ｄ−アラビノース ＋ (2) Ｌ−アラビノース ＋ (3) Ｄ−リボース ＋ (4) Ｄ−キシロース ＋ (5) Ｄ−グルコース ＋ (6) Ｄ−ガラクトース ＋ (7) Ｌ−ラムノース ＋ (8) Ｌ−ソルボース ＋ (9) 麦芽糖 ＋ (10) シヨ糖 ＋ (11) 乳糖 ＋ (12) メリビオース ＋ (13) セロビオース ＋ (14) トレハロース ＋ (15) ラフイノース ＋ (16) メレジトース ＋ (17) α−メチル−Ｄ−グルコシド ＋ (18) 可溶性デンプン ± (19) イヌリン − (20) エタノール ＋ (21) アドニツト ＋ (22) エリトリツト ＋ (23) イノシツト ＋ (24) Ｄ−マンニツト ＋ (25) Ｄ−ソルビツト ＋ (26) ズルシツト ＋ (27) グリセリン ＋ (28) DL−乳酸塩 − (29) コハク酸塩 ＋ (30) クエン酸塩 − (31) サリシン ＋ （＋：よく同化する ±：同化が疑わしい
−：同化しない） なお、糖類に対する発酵性はない。

以上の菌学的性質により本菌株はクリプトコ
ツカス・ローレンテイ・バラエテイ・ローレン
テイに属するものと同定された。

本発明における使用微生物としてはOKN−
４はその一例であり、その自然的及び人工的変
異株は勿論、クリプトコツカス属に属する菌種
でガラクトオリゴ糖生成能を有する微生物は総
て本発明方法において使用することができる。

(ロ) 培養工程 本発明に用いる、ガラクトオリゴ糖の生成能
力を有する微生物の培養は、通常用いられる固
体培地または液体培地が使用される。本発明に
使用される倍地は、炭素源としては微生物が同
化し得る炭素源を用いることが可能であるが、
好ましくは乳糖、または全乳、脂肪乳のように
乳糖を一成分として含有する物質、ソルビツ
ト、ラクチツトなどである。窒素源としては、
酵母エキス、ガゼイン、コーンスチープリカ
ー、大豆粉、線実粉、小麦グルテン、ペプト
ン、肉エキスなどの窒素化合物や
（NH₄）₂SO₄、NH₄Cl、尿素などの無機窒素化
合物を、無機塩類としてナトリウム塩類、カリ
ウム塩類、マグネシウム塩類、リン酸塩類など
を適宜に用いることができる。さらにビタミン
類や微量金属塩を追加して使用菌の生育を良好
ならしめることができる。

炭素源の濃度は１〜15重量％の範囲で、培養
温度は20〜40℃、培養液のPHは３〜９の範囲内
で、培養時間は１〜３日間程度である。静置培
養または通気撹拌、振とう培養のいずれの方法
でも行なうことができる。

(ハ) ガラクトオリゴ糖生成工程 ガラクトオリゴ糖生成工程では上記培養工程
で得られた培養物をそのまま用いることができ
るが、培養物の処理物を用いることもできる。

本発明で用いる培養物の処理物とは、上記の
微生物の培養を終了した培養液から遠心分離ま
たはケイ藻土濾過などの分離手段によつて得ら
れた微生物の菌体、およびその菌体を凍結した
凍結菌体、乾燥手段によつて得られる乾燥菌
体、菌体を物理的手段によつて破壊した菌体残
渣、その乾燥物、そして菌体および菌体残渣か
ら抽出手段によつて抽出した水溶性物質、菌体
を公知の固定化手段によつて固定化した固定化
菌体、固定化増殖菌体を意味する。

本発明で用いる培養物またはその処理物の量
は、培養物またはその処理物のガラクトオリゴ
糖を生成する能力に応じて適宜変更し得る。

本発明のガラクトオリゴ糖生成工程において
用いる乳糖または乳糖含有物の濃度は、乳糖と
して１〜40重量％の範囲、好ましくは2.5〜30
重量％である。

培養物またはその処理物と、乳糖または乳糖
含有物の反応条件としてはガラクトオリゴ糖を
生成する範囲で適宜変更し得るが、温度は20〜
70℃であり、好ましくは30〜65℃、反応液のPH
はPH２〜８の範囲内で、好ましくはPH３〜６で
あり、反応時間は条件によつて異なる。反応時
間を長くすると一度生成したガラクトオリゴ糖
が分解するので、ガラクトオリゴ糖の収率が最
大となる時間を選定することが好ましい。さら
に微量の無機塩類などを反応の安定化剤として
添加することも好ましい。

反応が終了した反応液は、必要に応じて固形
分を除去するために遠心分離またはケイ藻土濾
過などの分離手段を行なう。得られる上澄液ま
たは濾液は、着色も少なく、塩濃度が低いた
め、次に行なう脱色、脱塩などの精製操作が容
易である。

前記（）式で表わされる主成分のガラクト
オリゴ糖を精製する場合には、さらに反応液を
ゲル濾過や活性炭吸着などのクロマトグラフイ
ー等にかける。

［実施例］ 以下に本発明を実施例によつて具体的に説明す
るが、本発明はこれらに限定されるものでない。

実施例における全糖量はフエノール硫酸法によ
りグルコース換算で示し、乳糖およびガラクトオ
リゴ糖の定量は高速液体クロマトグラフイー（ポ
ンプは日立製作所製655型、検出器は昭和電工製
SE−31、カラムはLichrosorb−NH₂（5μｍ）
Cica Merk製、溶媒はアセトニトリル：水＝
65：35を用い、流速は0.7ml／min）を実施し、
ピーク面積より求めた。

実施例 １ 500ml容三角フラスコに第１表に示す組成の減
菌した培地100mlを入れたものに、MY寒天斜面
培地に予め２日間、前培養した前記OKN−４（微
工研菌寄第7629号）を一白金耳植菌し、30℃で２
日間ロータリー振とう培養器で振とう培養した。
培養終了後、遠心分離機にて遠心分離
（8000rpm）し、菌体を回収した。回収した菌体
を蒸留水50mlで２回洗浄後、水50mlに懸濁した。

この菌体懸濁液に６％の乳糖液（PH5.5）50ml
を加え65℃で24時間反応を実施した。６時間目に
反応液の糖組成を高速液体クロマトグラフイーで
調べたところ、第１図に示すように全糖３ｇ中、
単糖類19％、乳糖44％、ガラクトオリゴ糖GO−
１が24％、その他のガラクトオリゴ糖13％であつ
た。

第２図は、反応液中の糖組成の経時変化を示
す。

第１表 培地組成 乳 糖 50ｇ NH₄Cl ２ｇ KH₂PO₄ 0.8ｇ Na₂HPO₄・12H₂O 0.3ｇ MgSO₄・7H₂O 0.02ｇ 酵母エキス ３ｇ 水 １ PH 6.0 GO−１を単離したものは下記の性質を有する
白色の針状結晶であり、前記（）式で示される
Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−Ｏ
−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−Ｄ−
グルコースであることが確認された。

＜ガラクトオリゴ糖GO−１の理化学的性質＞ (1) 元素分析値：Ｃ：42.47％ Ｈ：6.30％ (2) 分子量：504 分子量は完全メチル化体および完成アセチル
化体のマススペクトルより求めた。

(3) 構成糖の比率： グルコース：ガラクトース＝１：２ 1NHClを用いて加水分解し、生成する単糖
をグルコースはGlucose−Ｂ−Test wako（和
光純薬製）法にて、ガラクトースはＦ−キツト
乳糖／ガラクトース（ベーリングマンハイム山
の内製薬製）にて定量し、その比を求めた。

(4) 全糖に対する還元糖の比率： 全糖：還元糖＝３：１ 全糖はフエノール硫酸法にて測定し、還元糖
はソモギー・ネルソン（Somogyi−Nelson）
法にて測定した。

(5) 融点：229.5〜230.5℃ (6) 比旋光度：［α］²⁵ _D＋61゜→＋39゜ (7) 紫外線吸収スペクトル：特異な吸収はない。

(8) 赤外線吸収スペクトル： KBr法による赤外線吸収スペクトルは第３
図に示す通りである。

(9) 溶媒に対する溶解性： 水に易溶、アセトン、アルコール、クロロホ
ルム、ベンゼンに不溶で、含水アルコールに難
溶である。

(10) 呈色反応： アニリン、フタル酸反応およびアンモニア、
硝酸銀反応は陽性でニンヒドリン反応および塩
化第二鉄反応は陰性である。

(11) 塩基性、酸性、中性の区別：中性である。

(12) 結合様式： (i) 水素化ホウ素ナトリウム還元物を1NHCl
を用いて加水分解し、この加水分解物を薄層
クロマトグラフイーで分析したところ、ガラ
クトースとソルビツトが検出された。これに
より還元末端はグルコースである。

(ii) メチル化分析することによつて ２，３，４，６−テトラ−Ｏ−メチル−
１，５−ジ−Ｏ−アセチルガラクチトール ２，３，６−トリ−Ｏ−メチル−１，
４，５−トリ−Ｏ−アセチルガラクチトー
ル ２，３，６−トリ−Ｏ−メチル−１，
４，５−トリ−Ｏ−アセチルグルシトール の３種がアルジトールアセテートが検出さ
れた。

(iii) 完全メチル化体の核磁気共鳴スペクトルを
分析したところ α−アノマー： δ 4.77（1H、Ｊ＝3.60Hz、Ｈ−１（α）） δ 4.29（1H、Ｊ＝6.90Hz、Ｈ−1′（β）） δ 4.58（1H、Ｊ＝6.75Hz、Ｈ−1″（β）） β−アノマー： δ 4.14（1H、Ｊ＝7.50Hz、Ｈ−１（β）） δ 4.34（1H、Ｊ＝6.90Hz、Ｈ−1′（β）） δ 4.59（1H、Ｊ＝6.75Hz、Ｈ−1″（β）） 以上、(ii)、(iii)の結果より、糖−糖間の結合様式
はβであることがわかつた。

実施列 ２ 実施例１と同様にして得られた洗浄菌体を凍結
乾燥して乾物4.8ｇを得た。この凍結乾燥菌体4.8
ｇを10％乳糖（PH6.0）100ｇに加え、40℃で24時
間反応させた。反応終了後オリゴ糖の生成量を高
速液体クロマトグラフイーで分析したところ、糖
組成は、単糖類18％、乳糖42％、ガラクトオリゴ
糖GO−１が25％、その他のガラクトオリゴ糖15
％であつた。

実施例 ３ 実施例１と同様にして得られた洗浄菌体１Kg
（湿重量）を２の蒸留水に懸濁した菌体懸濁液
をマントンゴーリング菌体破砕機を用いて560
Kg／cm²で５回処理した。この菌体破砕物を遠心分
離機にて遠心分離（8000rpm）し、沈澱した菌体
破砕物残渣を回収した。回収した菌体残渣を３回
蒸留水で洗浄した後凍結乾燥し、100ｇの菌体破
砕物残渣を得た。この破砕物残渣3.2ｇを10％乳
糖（PH5.5）100ｇに添加し、60℃で６時間反応さ
せた。反応終了後オリゴ糖の生成量を高速液体ク
ロマトグラフイーで分析したところ、糖組成は、
単糖頼14.0％、乳糖52.4％、ガラクトオリゴ糖
GO−１が23.0％、その他のガラクトオリゴ糖
10.6％であつた。

実施例 ４ 実施例３と同様にして得られた菌体破砕物（凍
結乾燥体）1.0ｇを25mlのMacllvaine buffer（PH
6.0）に懸濁し、これにザイモリエース20−Ｔ（生
化学工業製）を0.01％酵素濃度となるように添加
後、30℃で３時間反応させた。反応終了後、反応
液を遠心分離（10000rpm20分）し、上澄液を得
た。

この上澄液10mlに0.2ｇの乳糖を添加し、60℃、
PH6.0で２時間反応させ、高速液体クロマトグラ
フイーで反応液中のオリゴ糖を分析したところ反
応液の組成は、単糖類3.7％、乳糖80.3％、ガラ
クトオリゴ糖GO−１が12.9％、その他のガラク
トオリゴ糖3.1％であつた。

実施例 ５ 実施例１で得た洗浄菌体（乾物量5.4ｇ）を120
ml水に懸濁させ、120mlの３％アルギン酸ソーダ
溶液と混合後、注射器にて10％塩化カルシウム溶
液中に添加して粒状ゲル（１〜２mmφ）120ｇ
（湿重量）を得た。よく水洗いした後、ゲル１ｇ
にPH5.0の2.5％乳糖溶液5.0ml加え、60℃で５時間
反応させた。反応終了後の糖組成を調べたとこ
ろ、単糖類8.7％、乳糖72.2％、ガラクトオリゴ
糖GO−１が14.7％でその他のガラクトオリゴ糖
4.3％であつた。

［発明の効果］ 以上説明した通り、本発明のガラクトオリゴ糖
の製造法によれば、ビフイズス菌増殖因子として
有用である前記（）式で表わされるガラクトオ
リゴ糖を収率良く、高い選択率で得ることがで
き、しかも微生物を培養しながら培養物中にガラ
クトオリゴ糖を蓄積せしめる方法と異なり、ガラ
クトオリゴ糖生成工程においては反応時間も短
く、また予め微生物を培養するための各種栄養
素、塩類を除いておくことができるから、着色も
少なく、塩濃度が低くなり、後に続く精製操作が
極めて容易になる利点がある。

また、菌体を固定化することもできるから、反
応操作の点においても実用化する上で多大な効果
をもたらすものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１で得られた反応液の糖組成を
示す高速液体クロマトグラフ、第２図はその主要
成分の経時変化を示すグラフ、第３図は実施例１
で得られた結晶GO−１の赤外線吸収スペクトル
示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 乳糖または乳糖含有物からガラクトオリゴ糖
   を生成する能力を有するクリプトコツカス
   （Cryptococcus）属に属する微生物を培養する工
   程と、 上記微生物培養工程によつて得られた培養物ま
   たはその処理物と、乳糖または乳糖含有物とを反
   応させ、ガラクトオリゴ糖を生成させる工程 を含むことを特徴とするガラクトオリゴ糖の製造
   法。 ２ 前記微生物が、クリプトコツカス・ローレン
   テイ・バラエテイ・ローレンテイ
   （Cryptococcus laurentii var.laurentii）OKN−
   ４である特許請求の範囲第１項に記載のガラクト
   オリゴ糖の製造法。 ３ 前記ガラクトオリゴ糖が下記式 で表わされるＯ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−
   （１→４）−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−
   （１→４）−Ｄ−グルコースを含む特許請求の範囲
   第１項または第２項に記載のガラクトオリゴ糖の
   製造法。