CN112011633A - LAMP同时检测结核杆菌复合菌群及rpoB基因突变的引物组、试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种LAMP同时检测结核杆菌复合菌群及rpoB基因突变的引物组、试剂盒及方法，引物组包括结核杆菌复合菌群IS6110基因扩增引物、rpoB基因扩增引物组；结核杆菌复合菌群IS6110基因扩增引物的F3、B3、LF、LB、FIP、BIP序列依次如SEQ ID NO:4～SEQ ID NO:9所示；rpoB基因扩增引物组包括rpoB基因516密码子野生型扩增引物、rpoB基因526密码子野生型扩增引物以及rpoB基因531密码子野生型扩增引物中的一种或几种，rpoB基因516密码子野生型扩增引物的F3、B3、FIP、BIP序列依次如SEQ ID NO:10～SEQ ID NO:13所示，rpoB基因526密码子野生型扩增引物的F3、B3、FIP、BIP序列依次如SEQ ID NO:14～SEQ ID NO:17所示，rpoB基因531密码子野生型扩增引物的F3、B3、FIP、BIP序列依次如SEQ ID NO:18～SEQ ID NO:21所示。
Description
技术领域
本发明属于结核病及耐药基因突变检测技术领域，具体涉及一种LAMP同时检测结核杆菌复合菌群及rpoB基因突变的引物组、试剂盒及方法。
背景技术
结核病是由结核分枝杆菌、牛结核分枝杆菌和非洲分枝杆菌等引起的慢性传染性疾病，可累及全身各个器官，以肺结核最为多见。结核分枝杆菌主要是经空气传播，大多数人在感染结核分枝杆菌后并无症状，称为潜伏感染。潜伏感染可持续几十年，仅有5％—10％的潜伏感染者发展为活动性肺结核。自治疗药物的相继问世，肺结核基本得到治愈，近年来肺结核的发病率呈上升趋势，被世界健康组织宣布成为威胁全人类的两大疾病之一，其中一个主要原因是因为结核杆菌耐药性的产生，结核耐药往往造成无法迅速找到有相应治疗作用的药物，错过疾病前期治疗的最佳时间点。
利福平是抗结核联合化疗中的主要药物。正常情况下，利福平(RFP)与RNA聚合酶β亚基(rpoB)特异性结合，阻断RNA的合成而起到抑制细菌生长的作用。rpoB基因在利福平的药物选择压力下发生突变而改变所编码的rpoB亚基构象，从而降低与利福平的亲和力。RpoB基因含有3542bp的开放阅读框，编码1178个氨基酸，rpoB基因突变将引起结核分枝杆菌对利福平耐药，研究表明大约95％～98％利福平耐药突变一般集中在rpoB基因的507～533位的27个氨基酸密码子，其中位于该区域的516/526/531位点突变最为常见。
检测结核杆菌菌群以及依据rpoB是否突变检测结核杆菌对利福平的耐药性具有重要意义，申请公布号为CN102304574A的发明专利，公开了一种耐利福平结核分枝杆菌的诊断方法，该方法根据rpoB基因设计了引物，并利用引物采用环介导等温核酸扩增的方式进行扩增，可检测出耐利福平结核分枝杆菌。申请公布号为CN102399901A的发明专利公开了用于对结核杆菌进行LAMP检测的专用引物以及检测试剂盒，专用引物包括F3、B3、LF、LB、FIP、BIP等，检测试剂盒包括专用引物以及各种反应试剂。现有技术中，均是分开检测结核杆菌菌群以及结核杆菌对利福平的耐药性，分开检测操作较为繁琐，不利于快速检测出结果。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种LAMP同时检测结核杆菌复合菌群及rpoB基因突变的引物组，该引物组便于快速同时检测结核杆菌复合菌群及结核杆菌对利福平的耐药性。
本发明的第二个目的是提供一种LAMP同时检测结核杆菌复合菌群及rpoB基因突变的试剂盒。
本发明的第三个目的是提供一种LAMP同时检测结核杆菌复合菌群及rpoB基因突变的方法。
为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：
LAMP同时检测结核杆菌复合菌群及rpoB基因突变的引物组，包括用于检测结核杆菌复合菌群的结核杆菌复合菌群IS6110基因扩增引物、用于检测结核分枝杆菌rpoB基因的rpoB基因扩增引物组；结核杆菌复合菌群IS6110基因扩增引物的F3、B3、LF、LB、FIP、BIP序列依次如SEQ ID NO:4～SEQ ID NO:9所示；rpoB基因扩增引物组包括rpoB基因516密码子野生型扩增引物、rpoB基因526密码子野生型扩增引物以及rpoB基因531密码子野生型扩增引物中的一种或几种，rpoB基因516密码子野生型扩增引物的F3、B3、FIP、BIP序列依次如SEQ ID NO:10～SEQ ID NO:13所示，rpoB基因526密码子野生型扩增引物的F3、B3、FIP、BIP序列依次如SEQ ID NO:14～SEQ ID NO:17所示，rpoB基因531密码子野生型扩增引物的F3、B3、FIP、BIP序列依次如SEQ ID NO:18～SEQ ID NO:21所示。
LAMP同时检测结核杆菌复合菌群及rpoB基因突变的试剂盒，包括上述的LAMP同时检测结核杆菌复合菌群及rpoB基因突变的引物组。
进一步地，所述结核杆菌复合菌群IS6110基因扩增引物的F3、B3、LF、LB、FIP、BIP加入量比例为0.5:0.5:1:1:4:4，rpoB基因516密码子野生型扩增引物的F3、B3、FIP、BIP加入量比例为0.5:0.5:4:4，rpoB基因526密码子野生型扩增引物的F3、B3、FIP、BIP加入量比例为0.5:0.5:4:4，rpoB基因531密码子野生型扩增引物的F3、B3、FIP、BIP加入量比例为0.5:0.5:4:4。
进一步地，还包括内参基因及用于检测内参基因的内参基因扩增引物。
进一步地，所述内参基因为人源CALR基因，人源CALR基因序列如SEQ ID NO:2所示；内参基因扩增引物由SEQ ID NO:22～SEQ ID NO:27组成。
进一步地，还包括分别与结核杆菌复合菌群IS6110基因扩增引物、rpoB基因516密码子野生型扩增引物、rpoB基因526密码子野生型扩增引物、rpoB基因531密码子野生型扩增引物、内参基因扩增引物对应的五组反应体系，每组反应体系均包括相应的缓冲液、MgSO4、Betaine、dNTPS、dUTP、显色剂、Bst DNA聚合酶、UNG酶以及逆转录酶。缓冲液为Thermo buffer，显色剂为SYBR GREEN I。
进一步地，每组所述反应体系的体积为23ul，包括以下各物质：2.5ul的缓冲液、0.75～1.5ul的MgSO4、2～4ul的Betaine、2.5～3.5ul的dNTPS、1ul的dUTP、0.5ul的显色剂、1ul的Bst DNA聚合酶、0.125ul的UNG酶以及0.1ul的逆转录酶，包括以下各引物：0.5ul的F3、0.5ul的B3、0或1ul的LF、0或1ul的LB、4ul的FIP、4ul的BIP。
LAMP同时检测结核杆菌复合菌群及rpoB基因突变的方法，包括以下步骤：
1)提取纯化样品的核酸；
2)配制上述试剂盒中的LAMP反应体系，进行环介导等温扩增反应；
3)结果判断，以90个循环，即45分钟，作为阈值，低于此阈值为阳性，高于此阈值为阴性。
进一步地，扩增条件为60～65℃，30～60min，30～60s收集一次信号。
本发明的有益效果：
本发明的LAMP同时检测结核杆菌复合菌群及rpoB基因突变的引物组，便于快速同时检测结核杆菌复合菌群及结核杆菌对利福平的耐药性。
本发明的LAMP同时检测结核杆菌复合菌群及rpoB基因突变的试剂盒，单独使用时不需要昂贵的仪器，常规的实时恒温荧光PCR仪即可使用。
本发明的LAMP同时检测结核杆菌复合菌群及rpoB基因突变的试剂盒，操作简便，适应性好。
本发明的LAMP同时检测结核杆菌复合菌群及rpoB基因突变的试剂盒，内参基因的设置能够有效监控样本采集/样本保存/样本核酸的提取过程，避免假阴性存在。
本发明的LAMP同时检测结核杆菌复合菌群及rpoB基因突变的试剂盒，特异性强，与常见菌种无交叉反应。灵敏度高，其中结核杆菌复合菌群检测限为1000copies/mL。
附图说明
图1为结核杆菌复合菌群IS6110基因环介导扩增体系检测灵敏度；
图2为结核杆菌复合菌群IS6110核酸恒温扩增反应体系特异性验证；
图3为内参CALR基因恒温扩增反应体系特异性验证；
图4为rpoB基因516位点野生型引物特异性检测；
图5为rpoB基因526位点野生型引物特异性检测；
图6为rpoB基因531位点野生型引物特异性检测。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例以及附图对本发明作进一步说明。
实施例1
本实施例的用于LAMP同时检测结核杆菌复合菌群及rpoB基因突变的的引物组以及试剂盒中含有的反应体系如下：
结核杆菌复合菌群的检测
结核杆菌复合菌群核酸检测采用保守的IS6110基因片段，IS6110基因片段序列如SEQ ID NO:1所示。
用于结核杆菌复合菌群IS6110基因核酸恒温扩增的引物如表1所示。
表1结核杆菌复合菌群特异性恒温扩增的引物
| 引物名称 | 引物序列 |
| F3 | cgccgccaactacggt |
| B3 | cggcgctggacgagat |
| LF | tcacggttcagggttagcc |
| LB | caaagcccgcaggacca |
| FIP | gcatctggccacctcgatgctacggtgcccgcaaagt |
| BIP | acggctgatgaccaaactcggcggctgtggccggatca |
用于结核杆菌复合菌群IS6110基因核酸恒温扩增的反应体系如表2所示。
表2结核杆菌复合菌群特异性恒温扩增反应体系
扩增程序：63℃，60min，30s收集一次信号。
检测灵敏度：对构建的甲型流感病毒M基因质粒进行梯度稀释，以108copies/ml、107copies/ml、106copies/ml、105copies/ml、104copies/ml、103copies/ml、102copies/ml、101copies/ml、1copies/ml、0copies/ml为模板进行检测灵敏度验证，灵敏度检测结果如图1所示。由图1可见，检测灵敏度为103copies/ml。
引物特异性：进行交叉实验，进行交叉检测反应所用菌种如表3所示。
表3结核杆菌复合菌群交叉反应所用菌种
| 1 | 肺炎链球菌 | 7 | 甲乙流感病毒 | 13 | 胞内分枝杆菌 |
| 2 | 诺卡氏菌 | 8 | 丙型流感病毒 | 14 | 鸟分支杆菌 |
| 3 | 绿脓杆菌 | 9 | 人类副流感病毒 | 15 | 草分支杆菌 |
| 4 | 大肠杆菌 | 10 | 隐球菌 | 16 | 偶发分支杆菌 |
| 5 | 表皮葡萄球菌 | 11 | 龟分枝杆菌 | 17 | 胃分支杆菌 |
| 6 | 金黄色葡萄球菌 | 12 | 土地分支杆菌 | 18 | 海分枝杆菌 |
交叉反应结果如图2所示，由图2可见，检测的特异性强，与常见菌种无交叉反应。
人源内参基因的检测
内参基因为人源CALR基因，AB385014.1。
内参基因序列如SEQ ID NO:2所示。
用于内参基因核酸恒温扩增的引物如表4所示。
表4内参基因特异性恒温扩增的引物
| 引物名称 | 引物序列 |
| F3 | ttgcagacaagccaggatg |
| B3 | agatgtcgggaccaaacatg |
| LF | gcctttgttgctgaaaggct |
| LB | cggctatgtgaagctgtttcc |
| FIP | tgaactgcaccaccagcgtcctctgtcggccagtttcg |
| BIP | gcagaacatcgactgtggggggtctgagtctccgtgcatgt |
用于内参基因核酸恒温扩增的反应体系如表5所示。
表5内参基因核酸恒温扩增的反应体系
扩增程序：63℃，60min，30s收集一次信号。
引物特异性：进行交叉实验，进行交叉检测病原如表3所示。
交叉反应结果如图3所示，由图3可见，检测的特异性强，与常见菌种无交叉反应。
结核杆菌对利福平耐药性的检测
检测结核杆菌复合菌群利福平耐药基因rpoB密码子突变情况，耐药基因rpoB基因序列如SEQ ID NO:3所示。
结核分枝杆菌rpoB基因516密码子的检测：
用于结核分枝杆菌rpoB基因516密码子野生型恒温扩增特异性引物如表6所示。
表6结核分枝杆菌rpoB基因516密码子野生型恒温扩增特异性引物
用于结核分枝杆菌rpoB基因516密码子野生型恒温扩增反应体系如表7所示。
表7结核分枝杆菌rpoB基因516密码子野生型恒温扩增反应体系
扩增程序：63℃，60min，30s收集一次信号。
513、526、531位点突变位点对应的突变的氨基酸以及野生型的氨基酸如表8所示。
表8 513、526、531位点突变位点对应的突变型的氨基酸以及野生型的氨基酸
引物特异性：进行交叉实验，进行交叉检测反应所用模板如表9所示。
表9进行rpoB基因516位点野生型引物扩增反应体系特异性检测的模板
| 名称 | 性质 | 浓度 | 结果 |
| WT—GAC | 质粒 | 10<sup>7</sup>copies/ml | 阳性 |
| Mu—GGC | 质粒 | 10<sup>7</sup>copies/ml | 阴性 |
| Mu—GTC | 质粒 | 10<sup>7</sup>copies/ml | 阴性 |
| Mu—TAC | 质粒 | 10<sup>7</sup>copies/ml | 阴性 |
| 人源基因 | 基因组 | 阴性 | |
| 其他呼吸道病原 | 基因组 | 阴性 |
进行交叉实验结果如图4所示，rpoB基因516位点野生型引物检测的特异性强。
结核分枝杆菌rpoB基因526密码子的检测：
用于结核分枝杆菌rpoB基因526密码子野生型恒温扩增特异性引物如表10所示。
表10结核分枝杆菌rpoB基因526密码子野生型恒温扩增特异性引物
| 引物名称 | 引物序列 |
| F3 | ccaattcatggaccagaacaac |
| B3 | tgacccgcgcgtacac |
| FIP | gctcacgtgacagaccgccggcgctgtcggggttggcaca |
| BIP | cgtgcacccgtcgcactaccgatcagaccgatgttgg |
用于结核分枝杆菌rpoB基因526密码子野生型恒温扩增反应体系如表11所示。
表11结核分枝杆菌rpoB基因526密码子野生型恒温扩增反应体系
扩增程序：63℃，60min，30s收集一次信号。
引物特异性：进行交叉实验，进行交叉检测反应所用模板如表12所示。
表12进行rpoB基因526位点野生型引物扩增反应体系特异性检测的模板
| 名称 | 性质 | 浓度 | 结果 |
| WT—CAC | 质粒 | 10<sup>7</sup>copies/ml | 阳性 |
| Mu—GAC | 质粒 | 10<sup>7</sup>copies/ml | 阴性 |
| Mu—CGC | 质粒 | 10<sup>7</sup>copies/ml | 阴性 |
| Mu—TAC | 质粒 | 10<sup>7</sup>copies/ml | 阴性 |
| Mu—CTC | 质粒 | 10<sup>7</sup>copies/ml | 阴性 |
| 人源基因 | 基因组 | 阴性 | |
| 其他呼吸道病原 | 基因组 | 阴性 |
进行交叉实验结果如图5所示，rpoB基因526位点野生型引物检测的特异性强。
结核分枝杆菌rpoB基因531密码子的检测：
用于结核分枝杆菌rpoB基因531密码子野生型恒温扩增特异性引物如表13所示。
表13结核分枝杆菌rpoB基因531密码子野生型恒温扩增特异性引物
用于结核分枝杆菌rpoB基因531密码子野生型恒温扩增反应体系如表14所示。
表14结核分枝杆菌rpoB基因531密码子野生型恒温扩增反应体系
扩增程序：63℃，60min，30s收集一次信号。
引物特异性：进行交叉实验，进行交叉检测反应所用模板如表15所示。
表15进行rpoB基因531位点野生型引物扩增反应体系特异性检测的模板
| 名称 | 性质 | 浓度 | 结果 |
| WT—TCG | 质粒 | 10<sup>7</sup>copies/ml | 阳性 |
| Mu—TTG | 质粒 | 10<sup>7</sup>copies/ml | 阴性 |
| Mu—TGG | 质粒 | 10<sup>7</sup>copies/ml | 阴性 |
| 人源基因 | 基因组 | 阴性 | |
| 其他呼吸道病原 | 基因组 | 阴性 |
进行交叉实验结果如图6所示，rpoB基因531位点野生型引物检测的特异性强。
实施例2
本实施例的LAMP同时检测结核杆菌复合菌群及rpoB基因突变的方法，包括以下步骤：
1)用常规方法提取纯化样品的DNA。
2)配制结核杆菌复合菌群特异性恒温扩增的反应体系、结核分枝杆菌rpoB基因516密码子野生型恒温扩增反应体系、结核分枝杆菌rpoB基因526密码子野生型恒温扩增反应体系、结核分枝杆菌rpoB基因531密码子野生型恒温扩增反应体系、内参基因核酸恒温扩增的反应体系，进行环介导等温扩增反应，反应在一体化装置中进行，同时进行五组扩增反应，并对五组扩增反应同时进行荧光检测，通过对样本中的荧光染料SYBRGreen I荧光变化进行信号收集，形成扩增曲线，显示样本扩增状态，以实现五个反应体系下的检测。
3)结果判断，以90个循环，即45分钟，作为阈值，低于此阈值为阳性，高于此阈值为阴性。
序列表
<110> 河南智泰生物科技有限公司
<120> LAMP同时检测结核杆菌复合菌群及rpoB基因突变的引物组、试剂盒及方法
<160> 27
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 500
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcatcagggc caccgcgagg gccccgatgg tttgcggtgg ggtgtcgagt cgatctgcac 60
acagctgacc gagctgggtg tgccgatcgc cccatcgacc tactacgacc acatcaaccg 120
ggagcccagc cgccgcgagc tgcgcgatgg cgaactcaag gagcacatca gccgcgtcca 180
cgccgccaac tacggtgttt acggtgcccg caaagtgtgg ctaaccctga accgtgaggg 240
catcgaggtg gccagatgca ccgtcgaacg gctgatgacc aaactcggcc tgtccgggac 300
cacccgcggc aaagcccgca ggaccacgat cgctgatccg gccacagccc gtcccgccga 360
tctcgtccag cgccgcttcg gaccaccagc acctaaccgg ctgtgggtag cagacctcac 420
ctatgtgtcg acctgggcag ggttcgccta cgtggccttt gtcaccgacg cctacgtcgc 480
aggatcctgg gctggcgggt 500
<210> 2
<211> 500
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acgggtggac ttcccgctgg atcgaatcca aacacaagtc agattttggc aaattcgttc 60
tcagttccgg caagttctac ggtgacgagg agaaagataa aggtttgcag acaagccagg 120
atgcacgctt ttatgctctg tcggccagtt tcgagccttt cagcaacaaa ggccagacgc 180
tggtggtgca gttcacggtg aaacatgagc agaacatcga ctgtgggggc ggctatgtga 240
agctgtttcc taatagtttg gaccagacag acatgcacgg agactcagaa tacaacatca 300
tgtttggtcc cgacatctgt ggccctggca ccaagaaggt tcatgtcatc ttcaactaca 360
agggcaagaa cgtgctgatc aacaaggaca tccgttgcaa ggatgatgag tttacacacc 420
tgtacacact gattgtgcgg ccagacaaca cctatgaggt gaagattgac aacagccagg 480
tggagtccgg ctccttggaa 500
<210> 3
<211> 600
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cggcaaccgc cgcctgcgta cggtcggcga gctgatccaa aaccagatcc gggtcggcat 60
gtcgcggatg gagcgggtgg tccgggagcg gatgaccacc caggacgtgg aggcgatcac 120
accgcagacg ttgatcaaca tccggccggt ggtcgccgcg atcaaggagt tcttcggcac 180
cagccagctg agccaattca tggaccagaa caacccgctg tcggggttga cccacaagcg 240
ccgactgtcg gcgctggggc ccggcggtct gtcacgtgag cgtgccgggc tggaggtccg 300
cgacgtgcac ccgtcgcact acggccggat gtgcccgatc gaaacccctg aggggcccaa 360
catcggtctg atcggctcgc tgtcggtgta cgcgcgggtc aacccgttcg ggttcatcga 420
aacgccgtac cgcaaggtgg tcgacggcgt ggttagcgac gagatcgtgt acctgaccgc 480
cgacgaggag gaccgccacg tggtggcaca ggccaattcg ccgatcgatg cggacggtcg 540
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cggcgctgga cgagat 16
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<211> 19
<212> DNA
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<400> 6
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 37
<212> DNA
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<400> 8
gcatctggcc acctcgatgc tacggtgccc gcaaagt 37
<210> 9
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
acggctgatg accaaactcg gcggctgtgg ccggatca 38
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gatcacaccg cagacgttga 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ggtacggcgt ttcgatgaac 20
<210> 12
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gcgcttgtgg gtcaaccccc agctgagcca attcaacga 39
<210> 13
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cgtgcacccg tcgcacgagc cgatcagacc gatgttg 37
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ccaattcatg gaccagaaca ac 22
<210> 15
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tgacccgcgc gtacac 16
<210> 16
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gctcacgtga cagaccgccg gcgctgtcgg ggttggcaca 40
<210> 17
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cgtgcacccg tcgcactacc gatcagaccg atgttgg 37
<210> 18
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gctgtcgggg ttgacc 16
<210> 19
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tgacccgcgc gtacac 16
<210> 20
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tgcacgtcgc ggacctacaa gcgccgacta tc 32
<210> 21
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gtcgcactac ggccggatga tcagaccgat gttgggc 37
<210> 22
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttgcagacaa gccaggatg 19
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<211> 20
<212> DNA
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agatgtcggg accaaacatg 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gcctttgttg ctgaaaggct 20
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
cggctatgtg aagctgtttc c 21
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<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
tgaactgcac caccagcgtc ctctgtcggc cagtttcg 38
<210> 27
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
gcagaacatc gactgtgggg ggtctgagtc tccgtgcatg t 41
Claims (9)
1.LAMP同时检测结核杆菌复合菌群及rpoB基因突变的引物组，其特征在于，包括用于检测结核杆菌复合菌群的结核杆菌复合菌群IS6110基因扩增引物、用于检测结核分枝杆菌rpoB基因的rpoB基因扩增引物组；结核杆菌复合菌群IS6110基因扩增引物的F3、B3、LF、LB、FIP、BIP序列依次如SEQ ID NO:4～SEQ ID NO:9所示；rpoB基因扩增引物组包括rpoB基因516密码子野生型扩增引物、rpoB基因526密码子野生型扩增引物以及rpoB基因531密码子野生型扩增引物中的一种或几种，rpoB基因516密码子野生型扩增引物的F3、B3、FIP、BIP序列依次如SEQ ID NO:10～SEQ ID NO:13所示，rpoB基因526密码子野生型扩增引物的F3、B3、FIP、BIP序列依次如SEQ ID NO:14～SEQ ID NO:17所示，rpoB基因531密码子野生型扩增引物的F3、B3、FIP、BIP序列依次如SEQ ID NO:18～SEQ ID NO:21所示。
2.LAMP同时检测结核杆菌复合菌群及rpoB基因突变的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的LAMP同时检测结核杆菌复合菌群及rpoB基因突变的引物组。
3.根据权利要求2所述的LAMP同时检测结核杆菌复合菌群及rpoB基因突变的试剂盒，其特征在于，所述结核杆菌复合菌群IS6110基因扩增引物的F3、B3、LF、LB、FIP、BIP加入量比例为0.5:0.5:1:1:4:4，rpoB基因516密码子野生型扩增引物的F3、B3、FIP、BIP加入量比例为0.5:0.5:4:4，rpoB基因526密码子野生型扩增引物的F3、B3、FIP、BIP加入量比例为0.5:0.5:4:4，rpoB基因531密码子野生型扩增引物的F3、B3、FIP、BIP加入量比例为0.5:0.5:4:4。
4.根据权利要求2或3所述的LAMP同时检测结核杆菌复合菌群及rpoB基因突变的试剂盒，其特征在于，还包括内参基因及用于检测内参基因的内参基因扩增引物。
5.根据权利要求4所述的LAMP同时检测结核杆菌复合菌群及rpoB基因突变的试剂盒，其特征在于，所述内参基因为人源CALR基因，人源CALR基因序列如SEQ ID NO:2所示；内参基因扩增引物由SEQ ID NO:22～SEQ ID NO:27组成。
6.根据权利要求4所述的LAMP同时检测结核杆菌复合菌群及rpoB基因突变的试剂盒，其特征在于，还包括分别与结核杆菌复合菌群IS6110基因扩增引物、rpoB基因516密码子野生型扩增引物、rpoB基因526密码子野生型扩增引物、rpoB基因531密码子野生型扩增引物、内参基因扩增引物对应的五组反应体系，每组反应体系均包括相应的缓冲液、MgSO4、Betaine、dNTPS、dUTP、显色剂、Bst DNA聚合酶、UNG酶以及逆转录酶。
7.根据权利要求6所述的LAMP同时检测结核杆菌复合菌群及rpoB基因突变的试剂盒，其特征在于，每组所述反应体系的体积为23ul，包括以下各物质：2.5ul的缓冲液、0.75～1.5ul的MgSO4、2～4ul的Betaine、2.5～3.5ul的dNTPS、1ul的dUTP、0.5ul的显色剂、1ul的Bst DNA聚合酶、0.125ul的UNG酶以及0.1ul的逆转录酶，包括以下各引物：0.5ul的F3、0.5ul的B3、0或1ul的LF、0或1ul的LB、4ul的FIP、4ul的BIP。
8.LAMP同时检测结核杆菌复合菌群及rpoB基因突变的方法，其特征在于，
1)提取纯化样品的核酸；
2)配制如权利要求2中试剂盒中的LAMP反应体系，进行环介导等温扩增反应；
3)结果判断。
9.根据权利要求8所述的LAMP同时检测结核杆菌复合菌群及rpoB基因突变的方法，其特征在于，扩增条件为60～65℃，30～60min，30～60s收集一次信号。
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