CN106048019A - 一种抗结核药耐药基因及其筛选方法 - Google Patents

一种抗结核药耐药基因及其筛选方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗结核药耐药基因及其筛选方法，所述抗结核药耐药基因为pks12、pks5、PPE34、Rv1978、Rv1847、hemK、PPE3、glyA1、PE_PGRS27、PE_PGRS19、Rv1520、Rv1505c、Rv2407、mmuM、vapB17、Rv3727、Rv3737。本发明以进一步了解MDR/XDR结核分枝杆菌耐药的机制并为MDR/XDR‑TB的治疗提供新的候选药物靶基因。

Description

一种抗结核药耐药基因及其筛选方法
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种抗结核药耐药基因及其筛选方法。
背景技术
基因(遗传因子)是具有遗传效应的DNA片段。基因支持着生命的基本构造和性能。储存着生命的种族、血型、孕育、生长、凋亡过程的全部信息。环境和遗传的互相依赖，演绎着生命的繁衍、细胞分裂和蛋白质合成等重要生理过程。生物体的生、长、衰、病、老、死等一切生命现象都与基因有关。它也是决定生命健康的内在因素。因此，基因具有双重属性：物质性(存在方式)和信息性(根本属性)。人们对基因的认识是不断发展的。19世纪60年代，遗传学家孟德尔就提出了生物的性状是由遗传因子控制的观点，但这仅仅是一种逻辑推理的产物。20世纪初期，遗传学家摩尔根通过果蝇的遗传实验，认识到基因存在于染色体上，并且在染色体上是呈线性排列，从而得出了染色体是基因载体的结论。20世纪50年代以后，随着分子遗传学的发展，尤其是沃森和克里克提出双螺旋结构以后，人们才真正认识了基因的本质，即基因是具有遗传效应的DNA片断。研究结果还表明，每条染色体只含有1～2个DNA分子，每个DNA分子上有多个基因，每个基因含有成百上千个脱氧核苷酸。由于不同基因的脱氧核苷酸的排列顺序(碱基序列)不同，因此，不同的基因就含有不同的遗传信息。1994年中科院曾邦哲提出系统遗传学概念与原理，探讨猫之为猫、虎之为虎的基因逻辑与语言，提出基因之间相互关系与基因组逻辑结构及其程序化表达的发生研究。
结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium Tuberculosis，Mtb)这一单个致病菌-引起的死亡人数最多的慢性传染病。常用的抗结核药物包括一线和二线药物。通常疗效高不良反应少患者较易耐受的成为一线抗结核病药物，常用药物有异烟肼、利福平、吡嗪酰胺、乙胺丁醇和链霉素；主要用于对一线抗结核药产生耐用性或用于与其他抗结核药配伍使用的称为二线抗结核病药物，常用药物有卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素、氟喹喏酮类、丙(乙)硫异烟胺、环丝氨酸、对氨基水杨酸等。由于化疗不当及管理不善等原因，越来越多的结核分枝杆菌对主流抗结核药物产生了耐药性，已成为全球结核病疫情第三次回升的主要原因之一，给结核病防治工作带来了严峻挑战。耐多药结核病(multidrug-resistanttuberculosis，MDR-TB，即结核分枝杆菌至少对利福平和异烟肼同时耐药)的出现和传播，增加了结核病治疗的难度，所用的二线抗结核药物不仅毒副作用大，费用昂贵，而且疗效远不如药物敏感的肺结核，成为当前世界结核病治疗中的一大难题。更为严峻的是，广泛耐药结核病(extensively drug resistant tuberculosis，XDR-TB，即结核分枝杆菌在对利福平和异烟肼同时耐药基础上，也对氟喹喏酮类药物中任何一种药物耐药，以及对3种二线抗结核注射药物硫酸卷曲霉素、卡那霉素和阿米卡星中至少1种具有耐药性的结核病)已出现并正在持续增加和扩散，目前几乎无药可治。2006年，XDR-TB首次在南非夸祖鲁纳塔尔省暴发，53例患者(大多合并HIV感染)中52例死亡，病死率高达98％，平均存活时间为25天，引起了全球关注。近来研究报道，在南非XDR-TB两年治疗有效率为16％，病死率达46％，而5年治疗有效率仅为11％，病死率高达73％，已超过艾滋病，成为威胁人类健康的头号杀手，人类公共卫生健康已面临巨大挑战。有关MDR/XDR结核分枝杆菌耐药及其调控机制目前尚未阐明，进一步阐明耐药结核病，尤其是耐多药/广泛耐药结核病(MDR/XDR-TB)发生和演变的机理以及寻求新的药物靶基因已迫在眉睫。
现有的结核分枝杆菌耐药靶基因筛选技术存在成本较高，操作繁琐，特异性低，验证难度较高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗结核药耐药基因及其筛选方法，旨在解决现有的结核分枝杆菌耐药靶基因筛选技术存在成本较高，操作繁琐，特异性低，验证难度较高的问题。
本发明是这样实现的，一种抗结核药耐药基因，其特征在于，所述抗结核药耐药基因为：pks12、pks5、PPE34、Rv1978、Rv1847、hemK、PPE3、glyA1、PE_PGRS27、PE_PGRS19、Rv1520、Rv1505c、Rv2407、mmuM、vapB17、Rv3727、Rv3737；
pks12基因序列为SEQ ID NO：1；pks5基因序列为SEQ ID NO：2；PPE34基因序列为SEQ ID NO：3；Rv1978基因序列为SEQ ID NO：4；Rv1847基因序列为SEQ ID NO：5；hemK基因序列为SEQ ID NO：6；PPE3基因序列为SEQ ID NO：7；glyA1基因序列为SEQ ID NO：8；PE_PGRS27基因序列为SEQ ID NO：1；PE_PGRS19基因序列为SEQ ID NO：10；Rv1520基因序列为SEQ ID NO：11；Rv1505c基因序列为SEQ ID NO：12；Rv2407基因序列为SEQ ID NO：13；mmuM基因序列为SEQ ID NO：14；vapB17基因序列为SEQ ID NO：15；Rv3727基因序列为SEQ IDNO：16；Rv3737基因序列为SEQ ID NO：17。
本发明的另一目的在于提供一种所述的抗结核药耐药基因的筛选方法，所述筛选方法包括以下步骤：
步骤一，结核分枝杆菌临床分离株培养；
步骤二，菌型鉴定及药物敏感试验；
步骤三，对结核分枝杆菌行13种抗结核药物敏感试验，筛选出两列广泛耐药结核分枝杆菌临床分离株，编号为ZMC13-88、ZMC13-264；
步骤四，CTAB法提取该2株广泛耐药结核分枝杆菌DNA；
步骤五，DNA全基因组测序及数据分析；
步骤六，筛选新型耐药候选基因；
步骤七，PCR扩增验证部分目标基因。
进一步，所述结核分枝杆菌临床分离株培养包括：
生物安全柜内将新鲜痰标本用四倍体积的4％NaOH消化15分钟，间断震荡摇匀，直至标本充分液化，转移至10ml离心管中，3000rpm室温离心5分钟；
用一次性吸管吸取上述痰液沉淀2-3滴均匀涂抹于酸性培养基斜面，每份标本接种2管，拧盖3/4紧，做好标记；放入37℃二氧化碳培养箱中培养。
进一步，所述菌型鉴定及药物敏感试验包括：
生物安全柜内用一次性接种环分别挑取制备好的10-2mg/ml及10-4mg/ml悬菌液各1环，先后接种于两个含药培养基斜面上，先接种低浓度悬菌液，再接种高浓度，进行标记；将以上接种好的培养基斜面向上置于37℃培养箱培养，4周后观察结果。
进一步，所述CTAB法提取该2株广泛耐药结核分枝杆菌DNA，具体步骤如下：
(1)向1.5mlEP管中加入1ml生理盐水，用接种环刮取新鲜菌落于EP管中，80℃水浴灭活30min；
(2)12000rpm室温离心5min，弃上清，加入400μl1×TE溶液，吹打混匀，加入50μl溶菌酶溶液，充分混匀，37℃孵育过夜；
(3)向EP管中加入70μl 10％SDS后再加入5μl蛋白酶K，混匀，65℃孵育10min；
(4)加入5M NaCl和CTAB/NaCl各100μl，65℃预热20分钟，旋涡混匀至液体变为乳白色，65℃孵育10min；
(5)加入750μl氯仿/异戊醇24∶1，上下颠倒混匀，静置5min，12000rpm室温离心5min；
(6)将上清液转移至另一离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇以沉淀DNA；-20℃放置2h，颠倒混匀6-8次；
(7)12000rpm室温离心15min，弃去液体，用1ml 70％冰乙醇洗涤DNA沉淀；
(8)12000rpm室温离心5min，尽量弃去管中液体，再次12000rpm室温离心5min，用10μl加样枪小心吸去管中液体，37℃或常温干燥10min；
(9)向管中加入50μl1×TE溶解DNA沉淀。用ND-1000核酸蛋白测定仪检测提取DNA样本浓度及OD值，用1×TE将部分DNA原液稀释至10ng/μl，-20℃保存备用。
进一步，所述DNA全基因组测序及数据分析步骤如下：
(1)将提取的2例结核分枝杆菌分离株DNA，经低温冷冻真空干燥浓缩处理送往美国Z-BioMed生物公司进行全基因组测序；
(2)ZMC13-88共有2237个突变点，ZMC13-264共有2110个突变点，突变形式是多样的，以点突变为主，同时存在少量的插入及缺失突变收录；
(3)分析两个临床分离株共有的Nonsyn-SNPs，共同存在626个非同义突变点，分布在517个基因中。
进一步，所述筛选新型耐药候选基因包括：
(1)分析两例XDR-TB临床分离株突变基因及碱基突变前后氨基酸变化，并与结核病耐药基因数据库TBDreaMDB中已知耐药基因进行比较，找到这两例临床分离株发生临床耐药的已知耐药基因改变；
(2)两例临床分离株有384个Nonsyn-SNPs是大数据研究未发现的新突变点；
(3)对384个新突变点使用基因突变对蛋白质功能影响预测工具Polyphen2软件，分析预测其改变后对基因编码蛋白质功能的影响，共筛选出突变后对蛋白质功能产生影响的17个耐药新候选基因19个位点；
(4)通过蛋白质化合物数据库分析候选新基因与已知耐药基因及抗结核药物之间的关系，发现其与已知耐药基因之间存在联系。
进一步，所述PCR扩增验证部分目标基因包括：
(1)选择Polyphen-2评价对蛋白质功能显著影响的4个突变点，分别是Pks5、Pks12、Rv847、Rv1978基因，分别设计引物进行7例MDR-TB临床分离株验证；
(2)PCR扩增目标基因，选取7例临床MDR-TB及XDR-TB结核分枝杆菌分离株进行PCR扩增及测序验证，重复选择了2013-88这个分离株；
(3)凝胶电泳验证PCR产物：
(4)基因测序及分析：取20μllPCR产物，送上海英俊公司进行DNA测序，得到测序结果，通过NCBI中BLAST把测序结果与H37Rv菌株相应基因序列进行比对及结果分析，验证基因突变在其他临床分离株中的突变情况。
进一步，所述凝胶电泳验证PCR产物步骤如下：
①配制2％琼脂糖凝胶：称取0.5g琼脂糖粉加入5ml 5×TBE，纯水定容至25ml，微波炉中火煮沸3次后使琼脂糖完全溶解后取出，稍冷却后，加入1.25μl I型Gold view，混匀后倒入洗净制胶模具中，插入梳子，排出气泡，水平室温放置30min使其凝固；
②小心取出梳子，将琼脂凝胶放入电泳槽中，电泳液高于凝胶表面2-5mm；
③取2μl PCR产物加入凝胶上样孔中，最后一个上样孔中加入3μl 100bp DNAladder，110v 2min出孔，80v电泳50min，取出琼脂凝胶通过凝胶成像仪拍照。
本发明提供的抗结核药耐药基因及其筛选方法，以进一步了解MDR/XDR结核分枝杆菌耐药的机制并为MDR/XDR-TB的快速诊断、疫苗研究、新药研发及新靶基因治疗奠定基础，解决了现有的结核分枝杆菌耐药靶基因筛选技术存在成本较高，操作繁琐，特异性低，验证难度较高的问题。本发明的操作简单，使用方便，促进了行业的发展。
附图说明
图1本发明实施例提供的抗结核药耐药基因的筛选方法流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
本发明实施例的抗结核药耐药基因为：pks12、pks5、PPE34、Rv1978、Rv1847、hemK、PPE3、glyA1、PE_PGRS27、PE_PGRS19、Rv1520、Rv1505c、Rv2407、mmuM、vapB17、Rv3727、Rv3737；
pks12基因序列为SEQ ID NO：1；pks5基因序列为SEQ ID NO：2；PPE34基因序列为SEQ ID NO：3；Rv1978基因序列为SEQ ID NO：4；Rv1847基因序列为SEQ ID NO：5；hemK基因序列为SEQ ID NO：6；PPE3基因序列为SEQ ID NO：7；glyA1基因序列为SEQ ID NO：8；PE_PGRS27基因序列为SEQ ID NO：1；PE_PGRS19基因序列为SEQ ID NO：10；Rv1520基因序列为SEQ ID NO：11；Rv1505c基因序列为SEQ ID NO：12；Rv2407基因序列为SEQ ID NO：13；mmuM基因序列为SEQ ID NO：14；vapB17基因序列为SEQ ID NO：15；Rv3727基因序列为SEQ IDNO：16；Rv3737基因序列为SEQ ID NO：17。
如图1所示，本发明实施例的抗结核药耐药基因筛选方法包括以下步骤：
S101：结核分枝杆菌临床分离株培养；
S102：菌型鉴定及药物敏感试验；
S103：对结核分枝杆菌行13种抗结核药物(包括一线和二线结核药)敏感试验：筛选出两列广泛耐药结核分枝杆菌临床分离株(编号为ZMC13-88、ZMC13-264)；
S104：CTAB法提取该2株广泛耐药结核分枝杆菌DNA；
S105：DNA全基因组测序及数据分析；
S106：筛选新型耐药候选基因；
S107：PCR扩增验证部分目标基因。
下面结合实验对本发明的应用原理作进一步的描述：
1、结核分枝杆菌临床分离株培养：
于生物安全柜内将新鲜痰标本用四倍体积的4％NaOH消化约15分钟，间断震荡摇匀，直至标本充分液化，后将其转移至10ml离心管中，3000rpm室温离心5分钟。
用一次性吸管吸取上述痰液沉淀约2-3滴均匀涂抹于酸性培养基斜面，每份标本接种2管，拧盖3/4紧，做好标记；放入37℃二氧化碳培养箱中培养。
第1周每三天观察1次细菌生长情况，以后每周观察1次。4-8周后报告结果，可见分枝杆菌在酸性培养基上的形态为米黄色或乳白色，粗糙、干燥，菜花状或颗粒状突起于培养基表面，挑取少量菌落进行涂片及萋-纳氏抗酸染色，进一步确定为分枝杆菌生长。
2、菌型鉴定及药物敏感试验：
于生物安全柜内用一次性接种环分别挑取制备好的10-2mg/ml及10-4mg/ml悬菌液各1环，先后接种于两个含药培养基斜面上，先接种低浓度悬菌液，再接种高浓度，进行标记。将以上接种好的培养基斜面向上置于37℃培养箱培养，4周后观察结果。
3.对结核分枝杆菌行13种抗结核药物(包括一线和二线结核药)敏感试验：筛选出两列广泛耐药结核分枝杆菌临床分离株(编号为ZMC13-88、ZMC13-264)，药敏结果如表1所示，使用Spoligotyping这两例结核分枝杆菌基因型别鉴定均属于北京家族型。
表1：两例XDR-TB临床分离株耐药情
注：R利福平、H异烟肼、S链霉素、Lfx左氧氟沙星、Cfx环丙沙星、Gfx加替沙星、Mfx莫西沙星、Ak阿米卡星、Cm卷曲霉素、Pto丙硫异烟胺、PAS对氨基水杨酸。
4.CTAB法提取该2株广泛耐药结核分枝杆菌DNA，具体步骤如下：
(1)向1.5mlEP管中加入1ml生理盐水，用接种环刮取适量新鲜菌落于EP管中，80℃水浴灭活30min。
(2)12000rpm室温离心5min，弃上清，加入400μl1×TE溶液，吹打混匀，加入50μl溶菌酶溶液(10mg/ml)，充分混匀，37℃孵育过夜。
(3)向EP管中加入70μl 10％SDS后再加入5μl蛋白酶K，混匀，65℃孵育10min。
(4)加入5M NaCl和CTAB/NaCl(65℃预热20分钟)各100μl，旋涡混匀至液体变为乳白色，65℃孵育10min。
(5)加入750μl氯仿/异戊醇(24∶1)，上下颠倒混匀，静置5min，12000rpm室温离心5min。
(6)将上清液转移至另一离心管中，加入0.6倍体积(450μl)的异丙醇以沉淀DNA；-20℃放置2h，颠倒混匀6-8次。
(7)12000rpm室温离心15min，弃去液体，用1ml 70％冰乙醇洗涤DNA沉淀。
(8)12000rpm室温离心5min，尽量弃去管中液体，再次12000rpm室温离心5min，用10μl加样枪小心吸去管中液体，37℃或常温干燥10min。
(9)向管中加入50μl1×TE溶解DNA沉淀。用ND-1000核酸蛋白测定仪检测提取DNA样本浓度及OD值，用1×TE将部分DNA原液稀释至10ng/μl，-20℃保存备用。
5.DNA全基因组测序及数据分析：
(1)将提取的2例结核分枝杆菌分离株DNA，经低温冷冻真空干燥浓缩处理送往美国Z-BioMed生物公司进行全基因组测序。
(2)结果回示ZMC13-88共有2237个突变点，ZMC13-264共有2110个突变点，突变形式是多样的，以点突变为主，同时存在少量的插入及缺失突变(这两例广泛耐药结核分枝杆菌临床分离株存在特异性基因突变谱，被美国基因库(GenBank)收录，收录号CP009100和CP009101)。
(3)使用Venny V2.1(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)维恩图分析软件分析两个临床分离株共有的Nonsyn-SNPs，共同存在626个非同义突变点，分布在517个基因中。
6.筛选新型耐药候选基因：
(1)分析该两例XDR-TB临床分离株突变基因及碱基突变前后氨基酸变化，并与结核病耐药基因数据库TBDreaMDB(http://www.tbdreamdb.com)中已知耐药基因进行比较，找到这两例临床分离株发生临床耐药的已知耐药基因改变。
(2)把这两例XDR-TB临床分离株共有非同义突变与毕利军教授等报道的161例结核分枝杆菌全基因组测序数据进行比较，发现该两例临床分离株有242个Nosyn-SNPs在大样本数据研究分析报道与耐药有关，其中有27个基因与其报道一致为新耐药候选基因。另有384个Nonsyn-SNPs是大数据研究未发现的新突变点。
(3)对该384个大数据报道未阐述的新突变点使用基因突变对蛋白质功能影响预测工具Polyphen2软件(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)，分析预测其改变后对基因编码蛋白质功能的影响，共筛选出突变后对蛋白质功能产生影响的17个耐药新候选基因19个位点。
(4)通过STITCH(蛋白质化合物数据库)分析这些候选新基因与已知耐药基因及抗结核药物之间的关系，发现其与已知耐药基因之间存在密切而复杂联系，尤其是glyA1、hemK、mt3842(RV3737)三个基因之间关系尤为密切，它们和整个已知耐药基因及抗结核药之间也存在着复杂的网络联系。
7.PCR扩增验证部分目标基因：
(1)选择Polyphen-2评价对蛋白质功能显著影响的4个突变点，分别是Pks5、Pks12、Rv847、Rv1978基因，分别设计引物进行7例MDR-TB临床分离株验证，了解这些基因突变在临床耐药分离株中的突变情况，以下是这些基因的引物设计信息(表2)及基因片段信息。
表2耐药突变新基因引物信息表(4个)
(2)PCR扩增目标基因。选取7例临床MDR-TB及XDR-TB结核分枝杆菌分离株进行PCR扩增及测序验证。重复选择了2013-88这个分离株，目的是为了进行局部片段PCR扩增测序与高通量测序进行对比，了解高通量测序精确度，结果也证实高通量测序具有很高的准确性，高通量测序结果与小片段扩增测序结果是一致的。
(3)凝胶电泳验证PCR产物具体步骤如下：
①配制2％琼脂糖凝胶：称取0.5g琼脂糖粉加入5ml 5×TBE，纯水定容至25ml，微波炉中火煮沸3次后使琼脂糖完全溶解后取出，稍冷却后，加入1.25μl I型Gold view，混匀后倒入洗净制胶模具中，插入梳子，排出气泡，水平室温放置30min使其凝固。
②小心取出梳子，将琼脂凝胶放入电泳槽中(电泳液为0.5×TBE)，确保电泳液高于凝胶表面约2-5mm。
③取2μl PCR产物加入凝胶上样孔中，最后一个上样孔中加入3μl 100bp DNAladder，110v 2min出孔，80v电泳50min。取出琼脂凝胶通过凝胶成像仪拍照。
(4)基因测序及分析：取20μllPCR产物，送上海英俊公司进行DNA测序，得到测序结果，通过NCBI中BLAST把测序结果与H37Rv菌株相应基因序列进行比对及结果分析，验证这些基因突变在其他临床分离株中的突变情况。
PKS5测序结果：测序成功7(1-7方块所示)例，7例MDR/XDR-TBX结核分枝杆菌临床分离株中，4例存在1722228位点A→C突变(编码链为负链)，CTG(Leu亮氨酸)2061CGG(Arg精氨酸)，2例为双峰，1例无突变。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种抗结核药耐药基因，其特征在于，所述抗结核药耐药基因为：pks12、pks5、PPE34、Rv1978、Rv1847、hemK、PPE3、glyA1、PE_PGRS27、PE_PGRS19、Rv1520、Rv1505c、Rv2407、mmuM、vapB17、Rv3727、Rv3737；
pks12基因序列为SEQ ID NO：1；pks5基因序列为SEQ ID NO：2；PPE34基因序列为SEQID NO：3；Rv1978基因序列为SEQ ID NO：4；Rv1847基因序列为SEQ ID NO：5；hemK基因序列为SEQ ID NO：6；PPE3基因序列为SEQ ID NO：7；glyA1基因序列为SEQ ID NO：8；PE_PGRS27基因序列为SEQ ID NO：1；PE_PGRS19基因序列为SEQ ID NO：10；Rv1520基因序列为SEQ IDNO：11；Rv1505c基因序列为SEQ ID NO：12；Rv2407基因序列为SEQ ID NO：13；mmuM基因序列为SEQ ID NO：14；vapB17基因序列为SEQ ID NO：15；Rv3727基因序列为SEQ ID NO：16；Rv3737基因序列为SEQ ID NO：17。
2.一种如权利要求1所述的抗结核药耐药基因的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法包括以下步骤：
步骤一，结核分枝杆菌临床分离株培养；
步骤二，菌型鉴定及药物敏感试验；
步骤三，对结核分枝杆菌行13种抗结核药物敏感试验，筛选出两列广泛耐药结核分枝杆菌临床分离株，编号为ZMC13-88、ZMC13-264；
步骤四，CTAB法提取该2株广泛耐药结核分枝杆菌DNA；
步骤五，DNA全基因组测序及数据分析；
步骤六，筛选新型耐药候选基因；
步骤七，PCR扩增验证部分目标基因。
3.如权利要求2所述的抗结核药耐药基因的筛选方法，其特征在于，所述结核分枝杆菌临床分离株培养包括：
生物安全柜内将新鲜痰标本用四倍体积的4％NaOH消化15分钟，间断震荡摇匀，直至标本充分液化，转移至10ml离心管中，3000rpm室温离心5分钟；
用一次性吸管吸取上述痰液沉淀2-3滴均匀涂抹于酸性培养基斜面，每份标本接种2管，拧盖3/4紧，做好标记；放入37℃二氧化碳培养箱中培养。
4.如权利要求2所述的抗结核药耐药基因的筛选方法，其特征在于，所述菌型鉴定及药物敏感试验包括：
生物安全柜内用一次性接种环分别挑取制备好的10-2mg/ml及10-4mg/ml悬菌液各1环，先后接种于两个含药培养基斜面上，先接种低浓度悬菌液，再接种高浓度，进行标记；将以上接种好的培养基斜面向上置于37℃培养箱培养，4周后观察结果。
5.如权利要求2所述的抗结核药耐药基因的筛选方法，其特征在于，所述CTAB法提取该2株广泛耐药结核分枝杆菌DNA，具体步骤如下：
(1)向1.5mlEP管中加入1ml生理盐水，用接种环刮取新鲜菌落于EP管中，80℃水浴灭活30min；
(2)12000rpm室温离心5min，弃上清，加入400μl1×TE溶液，吹打混匀，加入50μl溶菌酶溶液，充分混匀，37℃孵育过夜；
(3)向EP管中加入70μl 10％SDS后再加入5μl蛋白酶K，混匀，65℃孵育10min；
(4)加入5M NaCl和CTAB/NaCl各100μl，65℃预热20分钟，旋涡混匀至液体变为乳白色，65℃孵育10min；
(5)加入750μl氯仿/异戊醇24∶1，上下颠倒混匀，静置5min，12000rpm室温离心5min；
(6)将上清液转移至另一离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇以沉淀DNA；-20℃放置2h，颠倒混匀6-8次；
(7)12000rpm室温离心15min，弃去液体，用1ml 70％冰乙醇洗涤DNA沉淀；
(8)12000rpm室温离心5min，尽量弃去管中液体，再次12000rpm室温离心5min，用10μl加样枪小心吸去管中液体，37℃或常温干燥10min；
(9)向管中加入50μl1×TE溶解DNA沉淀，用ND-1000核酸蛋白测定仪检测提取DNA样本浓度及OD值，用1×TE将部分DNA原液稀释至10ng/μl，-20℃保存备用。
6.如权利要求2所述的抗结核药耐药基因的筛选方法，其特征在于，所述DNA全基因组测序及数据分析步骤如下：
(1)将提取的2例结核分枝杆菌分离株DNA，经低温冷冻真空干燥浓缩处理送往美国Z-BioMed生物公司进行全基因组测序；
(2)ZMC13-88共有2237个突变点，ZMC13-264共有2110个突变点，突变形式是多样的，以点突变为主，同时存在少量的插入及缺失突变收录；
(3)分析两个临床分离株共有的Nonsyn-SNPs，共同存在626个非同义突变点，分布在517个基因中。
7.如权利要求2所述的抗结核药耐药基因的筛选方法，其特征在于，所述筛选新型耐药候选基因包括：
(1)分析两例XDR-TB临床分离株突变基因及碱基突变前后氨基酸变化，并与结核病耐药基因数据库TBDreaMDB中已知耐药基因进行比较，找到这两例临床分离株发生临床耐药的已知耐药基因改变；
(2)两例临床分离株有384个Nonsyn-SNPs是大数据研究未发现的新突变点；
(3)对384个新突变点使用基因突变对蛋白质功能影响预测工具Polyphen2软件，分析预测其改变后对基因编码蛋白质功能的影响，共筛选出突变后对蛋白质功能产生影响的17个耐药新候选基因19个位点；
(4)通过蛋白质化合物数据库分析候选新基因与已知耐药基因及抗结核药物之间的关系，发现其与已知耐药基因之间存在联系。
8.如权利要求2所述的抗结核药耐药基因的筛选方法，其特征在于，所述PCR扩增验证部分目标基因包括：
(1)选择Polyphen-2评价对蛋白质功能显著影响的4个突变点，分别是Pks5、Pks12、Rv847、Rv1978基因，分别设计引物进行7例MDR-TB临床分离株验证；
(2)PCR扩增目标基因，选取7例临床MDR-TB及XDR-TB结核分枝杆菌分离株进行PCR扩增及测序验证，重复选择了2013-88这个分离株；
(3)凝胶电泳验证PCR产物：
(4)基因测序及分析：取20μllPCR产物，送上海英俊公司进行DNA测序，得到测序结果，通过NCBI中BLAST把测序结果与H37Rv菌株相应基因序列进行比对及结果分析，验证基因突变在其他临床分离株中的突变情况。
9.如权利要求8所述的抗结核药耐药基因的筛选方法，其特征在于，所述凝胶电泳验证PCR产物步骤如下：
①配制2％琼脂糖凝胶：称取0.5g琼脂糖粉加入5ml 5×TBE，纯水定容至25ml，微波炉中火煮沸3次后使琼脂糖完全溶解后取出，稍冷却后，加入1.25μl I型Gold view，混匀后倒入洗净制胶模具中，插入梳子，排出气泡，水平室温放置30min使其凝固；
②小心取出梳子，将琼脂凝胶放入电泳槽中，电泳液高于凝胶表面2-5mm；
③取2μl PCR产物加入凝胶上样孔中，最后一个上样孔中加入3μl 100bp DNA ladder，110v 2min出孔，80v电泳50min，取出琼脂凝胶通过凝胶成像仪拍照。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110016473A (zh) * 2019-04-10 2019-07-16 深圳市南山区慢性病防治院 一种高效提取结核杆菌dna的方法
CN110706755A (zh) * 2019-08-26 2020-01-17 上海科技发展有限公司 结核菌耐药性检测方法、装置、计算机设备和存储介质
CN110917339A (zh) * 2019-12-27 2020-03-27 遵义医学院附属医院 一种溶葡萄球菌酶凝胶剂及其在mrsa感染创面中的应用
CN111575302A (zh) * 2020-06-24 2020-08-25 遵义医科大学附属医院 一种结核分枝杆菌的突变基因及其应用
WO2023223354A1 (en) * 2022-05-20 2023-11-23 Aarogyaai Innovations Pvt. Ltd. Novel mutations for determining drug resistance in tuberculosis treatment and implementations thereof

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101421415A (zh) * 2004-07-12 2009-04-29 阿维斯塔金格兰技术有限公司 通过比较感染性生物的临床分离物中的多态性区域构建比较数据库和鉴定致病因子
CN102559916A (zh) * 2012-02-24 2012-07-11 孙爱华 一种结核分枝杆菌耐多药检测方法
WO2015088384A1 (ru) * 2013-12-12 2015-06-18 Автономная Некоммерческая Организация "Научно-Исследовательский Центр Биотехнологии Антибиотиков И Других Биологически Активных Веществ "Биоан" Использование генов систем токсин-антитоксин ii типа для генотипирования штаммов mycobacterium tuberculosis

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101421415A (zh) * 2004-07-12 2009-04-29 阿维斯塔金格兰技术有限公司 通过比较感染性生物的临床分离物中的多态性区域构建比较数据库和鉴定致病因子
CN102559916A (zh) * 2012-02-24 2012-07-11 孙爱华 一种结核分枝杆菌耐多药检测方法
WO2015088384A1 (ru) * 2013-12-12 2015-06-18 Автономная Некоммерческая Организация "Научно-Исследовательский Центр Биотехнологии Антибиотиков И Других Биологически Активных Веществ "Биоан" Использование генов систем токсин-антитоксин ii типа для генотипирования штаммов mycobacterium tuberculosis

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EARL,A.M.等: "登录号:JLDD01000023.1", 《GENBANK》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110016473A (zh) * 2019-04-10 2019-07-16 深圳市南山区慢性病防治院 一种高效提取结核杆菌dna的方法
CN110706755A (zh) * 2019-08-26 2020-01-17 上海科技发展有限公司 结核菌耐药性检测方法、装置、计算机设备和存储介质
CN110917339A (zh) * 2019-12-27 2020-03-27 遵义医学院附属医院 一种溶葡萄球菌酶凝胶剂及其在mrsa感染创面中的应用
CN111575302A (zh) * 2020-06-24 2020-08-25 遵义医科大学附属医院 一种结核分枝杆菌的突变基因及其应用
WO2023223354A1 (en) * 2022-05-20 2023-11-23 Aarogyaai Innovations Pvt. Ltd. Novel mutations for determining drug resistance in tuberculosis treatment and implementations thereof

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