CN104004837A - 检测结核分枝杆菌的pcr引物、引物组、探针及其试剂盒和检测方法 - Google Patents

检测结核分枝杆菌的pcr引物、引物组、探针及其试剂盒和检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了检测结核分枝杆菌的PCR引物、引物组、探针及其试剂盒和检测方法，该试剂盒含有高敏感度的引物组和探针，可以检测出单拷贝结核分枝杆菌DNA；本发明具有高敏感特性，大大提高阳性检出率，尤其在痰涂片阴性标本中，检测灵敏度明显高于一般检测方法；且加入内控系统，可有效防止假阴性；加入UNG酶体系，可有效避免污染；可应用于对TB药物治疗效果评价、指导用药和病情进展等具有重大临床意义；也能为临床停药提供参考依据，有助于结核病的疗效评估及复发控制等，具有广泛的临床应用作用，有利于推广应用。

Description

检测结核分枝杆菌的PCR引物、引物组、探针及其试剂盒和检测方法
技术领域
本发明属于病原菌检测领域，涉及一种检测结核分枝杆菌的PCR引物、引物组、探针及其试剂盒和检测方法。  
背景技术
结核病(Tuberculosis，TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)所致呼吸系统感染为主的慢性传染病，主要侵犯肺脏，称肺结核病，是一种古老的传染病，至今未得到有效根除，而且由于与艾滋病共感染和多重耐药结核分枝杆菌（XDR-TB）的出现，世界卫生组织于1993年宣布“全球结核病紧急状态”。在我国结核病发病率居高不下，形势严峻。提高发现率、治愈率是我国有效控制结核病的根本。2005年全球新发结核病880万，死亡线160万；在我国2001-2008年新增病例642万，其中传染性肺结核病人330万，仍位居全球第二。减少或消除TB感染危害的措施主要包括两个方面：一是减少或消灭新增传染源，二是提高结核病的治愈率，减少复发。在目前TB疫苗无新的进展条件下，结核病的早期诊断、早期治疗、阻断结核分枝杆菌的传染就显得更加重要。
结核病不能有效防控的一个重要原因是缺乏有效的诊断方法和有效的治愈评估标准。目前临床上用于结核病诊断方法主要有X-光和计算机断层扫描（CT）、痰涂片法和痰培养法。CT灵敏度低，只有在有等出现肺部病灶时才能用于诊断，达不到早期诊断效果，而且肺结核与其他肺部疾病难以区分，且不能作为确诊诊断；具有确诊意义的细菌学方法欠敏感，痰涂片法虽简单快速，但有60%-70%左右结核病人被诊断为涂片阴性，而且该方法不能区分结核分枝杆菌（MTB）和其他抗酸分支杆菌；培养法被誉为TB诊断“金标准”，可以鉴定MTB与其他分支杆菌，但诊断周期长，通常需要4到8周，且灵敏性低，延误病人治疗。临床上使用的检测方法由于检测结果的不确定性和检测的延误，不能有效掌握公众中感染人群和发病人群准确信息，给预防带来困难不能确定有效的治疗方案。
此外，目前尚未有在血液中检测MTB的诊断试剂。在病人血清标本检测MTB，使检测样本取材容易，样本均一，容易做到标准化定量，而且免除前处理，污染机会少。通过对结核病患者血清MTB检测阳性，说明了循环系统中确实存在结核分枝杆菌，可提高结核潜伏感染诊断准确率，具有痰液无法比拟的优越性。但血液中MTB载量低，因此，需要检测方法有很好的敏感性。
近十年来兴起的TB分子诊断技术如实时荧光PCR（Real Time PCR, RT PCR）等，大大提高了TB诊断的灵敏度和特异性。目前流行的RT PCR主要利用一对MTB特异性引物和荧光探针，配以PCR反应液、耐热DNA聚合酶（Taq）、脱氧核酸苷酸（dNTP）等成分，用体外热循环扩增法检测MTB基因片段，通过检测荧光强度变化来判断标本中是否存在MTB DNA。RT PCR检测对象为病原体基因保守序列，不受细胞表型和耐药性影响，可提高阳性检出率和结果准确性，其检测灵敏度一般能达到10个菌/mL。防污染，操作简单，而且在2~3小时内即可报告结果。常规RT PCR虽然能提高TB检测灵敏性和特异性，但其在结核病人血标本和痰涂片阴性病人（包括菌阴病人）痰标本检测阳性率依然有待提高。而且，目前结核RT PCR没有内控，阴性结果无法确认。目前涂片阴性病人在总TB病人数60%左右，该部分病人因痰液中MTB菌量不高而难以被检测。虽然涂阴病人吐菌量不高，但他们是TB重要传染源之一。据报道，约20%受检查的涂阴病人密切接触者最终被确诊为TB。因此如何提高TB涂阴病人中检测阳性率，是RT PCR亟需解决的问题。此外，目前市上仍未发现有在血标本检测MTB试剂。
发明内容
为了解决上述存在的问题，本发明通过设计和实验筛选高灵敏和高特异性的RT PCR引物探针序列以及设置高效的PCR热循环反应系统来提高RT PCR检出效率，本发明着重于针对MTB复合群基因组设计大量特异性引物和检测探针，并筛选出一组高灵敏和特异性的引物探针序列，并针对该组序列设置特殊、高效的RT PCR热循环反应系统，实现高敏感的MTB DNA PCR检测。本发明设计的引物探针以及基于该引物探针所建立的高敏感荧光PCR试剂盒含有内控，能有效提高临床上结核涂阴病人标本和血标本的检出率。
本发明所采取的技术方案是：
检测结核分枝杆菌的PCR引物，其引物序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6；或者为该些序列的核苷酸互补序列；
上述引物的核苷酸序列分别如下所示：
SEQ ID NO:1：CGATGGCGA ACTCAAGGAGCACATCA，
SEQ ID NO:2：GGCCGAGTTTGGTCATCAGCCGTTC，
SEQ ID NO:3：CGAACTCAAGGAGCACATCA,
SEQ ID NO:4：GAGTTTGGTCATCAGCCGTTC，
SEQ ID NO:5：GTCCACGCCGCCAACTAC， 
SEQ ID NO:6：ATGCCCTCACGGTTCAGG。
检测结核分枝杆菌的PCR引物组，其由引物序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6组成；或者由该些序列的核苷酸互补序列组成。
检测结核分枝杆菌的PCR检测探针，其序列如下所示：
SEQ ID NO:7：CCGCAAAGTGTGGCTA，
SEQ ID NO:8：CCCGCAAAGTGTGGCT；
或者为该些序列的核苷酸互补序列。
进一步的，上述探针序列5’端标记的荧光基团选自FAM、HEX、VIC、CY5、TET中一种，探针序列3’端标记的淬灭基团选自TAMRA、MGB、BHQ中一种。
一种检测结核分枝杆菌的PCR检测试剂盒，该试剂盒含有上述所述的引物组。
进一步的，该试剂盒还含有至少1条上述所述的检测探针。
进一步的，该试剂盒还包含内控引物组和内控探针，其核苷酸序列分别为：
内控引物组的核苷酸序列为：
SEQ ID NO:9：CGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTACG，
SEQ ID NO:10：GGTCACCCACACTGTGCCCATCTACG，
SEQ ID NO:11：CCACACTGTGCCCATCTACGA，
SEQ ID NO:12：GCGCTCGGTGAGGATCTTC；
或者为该些序列的核苷酸互补序列；
内控探针序列的核苷酸序列为： 
SEQ ID NO:13：ATGCCCTCCCCCATGCCATCCT。
内控探针序列所标记的荧光基团可从FAM、HEX、VIC、CY5、TET选择，但不同于前面所述探针的荧光基团。
进一步的，该试剂盒还含有：DNA裂解液； PCR反应液；Taq 酶 和UNG酶；强阳性对照品、临界阳性对照品及阴性对照品。
所述的PCR反应液含有15~25mM Tris-HCl (pH8.0)，15~25mM KCl，2.5~5mM (NH4)SO4，2~5mM MgCl2，0.5~2mM dNTP/UTP Mix，200~600nM引物组，100~300nM 探针，200~600nM内控引物，100~300nM内控探针。
所述的强阳性对照品及临界阳性对照品为含TB基因质粒的大肠杆菌菌液，浓度分别为5000cfu/ml和50 cfu /ml，阴性对照品为生理盐水。
一种结核分枝杆菌高敏感PCR检测方法，包括以下步骤：
1）DNA提取：
取液化后的痰液标本1000ul以及阴性质控品、临界阳性质控品和强阳性质控品各500ul于1.5ml无菌离心管中，1,3000rpm离心10min；用移液器吸去上清；加入1ml生理盐水洗涤沉淀，13,000rpm离心5min，弃上清；加入30ul DNA提取液，震荡混匀，稍离心，于56℃孵育30min后，100℃孵育10min；于13,000rpm离心10min；取上清即为PCR反应的模板DNA；
2）PCR反应体系： 
PCR反应液       43.2μl
5U/ul Taq 酶       0.8μl
1U/ul UNG酶     0.06μl
DNA模板          6μl。
3）PCR反应程序为：
以ABI7500为例，第一步：37℃ 5分钟；第二步： 95 ℃ 10 分钟；第三步： 95 ℃ 15 秒， 62~68 ℃ 15 秒，72℃ 20秒， 5~15 个循环； 第四步：95℃ 15秒，60℃ 1分钟，40个循环；60 ℃时采集荧光；
4）结果分析：
以ABI 7500仪器为例，打开Delta Rn vs Cycles 扩增线性图，选择Auto baseline，阈值线选择自动；或选择Manual Ct，在左侧的线性扩增图中调整阈值线的位置，使阈值线与扩增曲线上升拐点后1~2 cycles相交；
根据下表判断结果：
实验结果需同时满足以下质量控制，否则，本次实验无效，需重新进行：
①阴性质控品Ct值为None；TB强阳阳性质控品Ct值应为8~12之间；TB临界阳性质控品Ct值应为18~22之间；
②质控品内控基因Ct值应为18~22之间。
本发明的有益效果是：
1）本发明的结核分枝杆菌高敏感荧光PCR检测法能明显提高RT PCR检测效率，通过临床标本检测证实其在涂阴病人标本和血标本检测阳性率高于其他RT PCR检测。此外，本发明可对TB药物治疗效果评价、指导用药和病情进展等具有重大临床意义。
2）在高危人群中及早发现结核病潜伏患者，有利于结核病的预防及控制；
3）为临床停药提供参考依据，有助于结核病的疗效评估及复发控制；
4）高敏感特性大大提高阳性检出率，尤其在痰涂片阴性标本中，检测灵敏度明显高于一般检测方法；
5）由于痰本在采集过程中存在不均一性，本发明的试剂盒加入内控系统，能有效监控病人痰液样本的质量，防止由于标本质量问题（如采集方法或病人咳痰方式不正确以及标本运输保存出了问题等）造成的假阴性。
附图说明
图1为TB阳性对照品（红色）和内控（绿色）的扩增曲线；
图2为实施例4的特异性实验图；
图3为实施例4的灵敏度实验图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此：
实施例1：检测结核分枝杆菌的PCR引物组及探针
本发明通过设计筛选高灵敏和高特异性的RT PCR引物探针序列以及设置高效的PCR热循环反应系统来提高RT PCR检出效率，本发明通过针对MTB复合群基因组设计大量特异性引物和检测探针，并并通过大量实验筛选出了一组高灵敏和特异性的引物探针序列，并针对该组序列设置特殊、高效的RT PCR热循环系反应统，实现高敏感的MTB DNA荧光PCR检测。
结核分枝杆菌高敏感PCR检测的引物组及探针，其核苷酸序列分别如下所示：
    引物组序列：
    SEQ ID NO:1：CGATGGCGA ACTCAAGGAGCACATCA，
    SEQ ID NO:2：GGCCGAGTTTGGTCATCAGCCGTTC，
    SEQ ID NO:3：CGAACTCAAGGAGCACATCA,
    SEQ ID NO:4：GAGTTTGGTCATCAGCCGTTC，
SEQ ID NO:5：GTCCACGCCGCCAACTAC， 
SEQ ID NO:6：ATGCCCTCACGGTTCAGG； 
或者为该些序列的核苷酸互补序列；
探针序列：
SEQ ID NO:7：CCGCAAAGTGTGGCTA，
SEQ ID NO:8：CCCGCAAAGTGTGGCT；
或者为序列的该些核苷酸互补序列； 
实施例2：检测结核分枝杆菌的PCR检测试剂盒
结核分枝杆菌高敏感PCR检测试剂盒包括以下成份：
1）含有实施例1中所述引物组，还含有至少一条实施例1中所述的检测探针；
    探针序列5’端标记的荧光基团可选择FAM、HEX、VIC、CY5、TET中任意一种，探针序列3’端标记的淬灭基团可选择TAMRA、MGB、BHQ中任意一种。
2）内控引物组和内控探针，其序列分别为：
内控引物组序列为：
SEQ ID NO:9：CGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTACG，
SEQ ID NO:10：GGTCACCCACACTGTGCCCATCTACG，
SEQ ID NO:11：CCACACTGTGCCCATCTACGA，
SEQ ID NO:12：GCGCTCGGTGAGGATCTTC；
或者为该些序列的核苷酸互补序列；
内控探针序列为：
SEQ ID NO:13：ATGCCCTCCCCCATGCCATCCT，或者为其核苷酸互补序列；
内控探针序列所标记的荧光基团可从FAM、HEX、VIC、CY5、TET选择，但不同于1）中所述探针的标记荧光基团。
4）PCR反应液：15~25mM Tris-HCl (pH8.0)，15~25mM KCl，2.5~5mM (NH4)SO4，2~5mM MgCl2，0.5~2mM dNTP/UTP Mix，200~600nM引物组，100~300nM 探针，200~600nM内控引物，100~300nM内控探针。
    5）DNA提取液；Taq 酶和UNG酶；强阳性对照品、临界阳性对照品及阴性对照品，其中阴性对照为生理盐水；强阳性对照品、临界阳性为含TB基因质粒的大肠杆菌菌液，浓度分别为5000 cfu/ml、50 cfu/ml。
实施例3：检测结核分枝杆菌的PCR检测方法
利用实施例2建立的检测试剂盒，对待检测样品进行检测，步骤如下：
    1）DNA提取：
    取液化后的痰液标本1000ul以及阴性质控品、临界阳性质控品和强阳性质控品各500ul于1.5ml无菌离心管中，1,3000rpm离心10min；用移液器吸去上清；加入1ml生理盐水洗涤沉淀，13,000rpm离心5min，弃上清；加入30ul DNA提取液，震荡混匀，稍离心，于56℃孵育30min后，100℃孵育10min；于13,000rpm离心10min；取上清，获得模板DNA；
    2）PCR反应体系制备
   PCR反应液       43.2μl
5U/ul Taq 酶       0.8μl
1U/ul UNG酶     0.06μl
DNA模板          6μl。
    3）PCR反应程序为（以ABI7500为例）：
    第一步：37℃ 5分钟；第二步： 95 ℃ 10 分钟；第三步： 95 ℃ 15 秒， 62~68 ℃ 15 秒，72℃ 20秒， 5~15 个循环； 第四步：95℃ 15秒，60℃ 1分钟，40个循环；60 ℃时采集荧光；
    4）结果分析：
以ABI 7500仪器为例，打开Delta Rn vs Cycles 扩增线性图，选择Auto baseline，阈值线选择自动；或选择Manual Ct，在左侧的线性扩增图中调整阈值线的位置，使阈值线与扩增曲线上升拐点后1~2 cycles相交。
根据下表判断结果：
质量控制：
阴性质控品Ct值为None；TB强阳阳性质控品Ct值应为8~12之间；TB临界阳性质控品Ct值应为18~22之间；
质控品内控基因Ct值应为18~22之间。
以上要求需在同一实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，但并不局限于此。
实施例4：
一、检测结核分枝杆菌的PCR试剂盒的建立
1）合成结核分枝杆菌高敏感PCR检测的引物组，其核苷酸序列分别如下所示：
    引物组序列：
SEQ ID NO:1：CGATGGCGA ACTCAAGGAGCACATCA，
SEQ ID NO:2：GGCCGAGTTTGGTCATCAGCCGTTC，
SEQ ID NO:3：CGAACTCAAGGAGCACATCA,
SEQ ID NO:4：GAGTTTGGTCATCAGCCGTTC，
SEQ ID NO:5：GTCCACGCCGCCAACTAC， 
SEQ ID NO:6：ATGCCCTCACGGTTCAGG。
2）合成探针，其序列如下：
    SEQ ID NO:7：FAM-CCGCAAAGTGTGGCTA-MGB 
3）合成内控引物探针，其序列如下：
内控引物组
SEQ ID NO:9：CGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTACG
SEQ ID NO:10：GGTCACCCACACTGTGCCCATCTACG
SEQ ID NO:11：CCACACTGTGCCCATCTACGA
SEQ ID NO:12：GCGCTCGGTGAGGATCTT C
内控探针序列
SEQ ID NO:13：VIC-ATGCCCTCCCCCATGCCATCCT-TAMRA
    4）PCR反应液：25mM Tris-HCl (pH8.0)，25mM KCl，2.5mM (NH4)SO4，2mM MgCl2，0.5mM dNTP/UTP Mix，引物组中的6条引物浓度均为200nM，100nM 探针，内控引物中的4条引物均为200nM，100nM内控探针。
    5）DNA提取液；Taq 酶和UNG酶；强阳性对照品、临界阳性对照品及阴性对照品，其中阴性对照为生理盐水；强阳性对照品、临界阳性为含TB基因质粒的大肠杆菌菌液，浓度分别为5000 cfu/ml、50 cfu/ml。。
二、检测结核分枝杆菌的PCR检测方法
   利用“一”中建立的检测试剂盒，对待检测样品进行检测，步骤如下：
 1）DNA提取：取待检测的样本，按实施例3所述的DNA提取方法进行模板DNA的提取；
    2）PCR反应体系制备
PCR反应液       43.2μl
5U/ul Taq 酶       0.8μl
1U/ul UNG酶     0.06μl
DNA模板          6μl。
    3）PCR反应程序为（以ABI7500为例）：
    第一步：37℃ 5分钟；第二步： 95 ℃ 10 分钟；第三步： 95 ℃ 15 秒， 62~68 ℃ 15 秒，72℃ 20秒， 5~15 个循环； 第四步：95℃ 15秒，60℃ 1分钟，40个循环；60 ℃时采集荧光；
    4）结果分析：
以ABI 7500仪器为例，打开Delta Rn vs Cycles 扩增线性图，选择Auto baseline，阈值线选择自动；或选择Manual Ct，在左侧的线性扩增图中调整阈值线的位置，使阈值线与扩增曲线上升拐点后1~2 cycles相交。
根据下表判断结果：
质量控制：
阴性质控品Ct值为None；TB强阳阳性质控品Ct值应为8~12之间；TB临界阳性质控品Ct值应为18~22之间；
质控品内控基因Ct值应为18~22之间。
以上要求需在同一实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。
下面对本发明的PCR检测试剂盒作进一步的效果检测。
首先按照实施例4中所述的试剂盒和检测方法对TB阳性对照品和内控内控为阳性并保证在一定Ct值范围内，表示该标本质量没问题，防止假阴性）进行检测，确认本发明的可行性，检测结果如图1所示，从中可以看出本发明可以对MTB的阳性对照品和进行准确的检测，可应用于对TB的检测。
一、特异性实验
  选择MTB 荧光PCR检测试剂盒国家标准品中阴性参考品的15种非结核分枝杆菌DNA作为模板，包括：鸟分枝杆菌、土地分枝杆菌、施氏分枝杆菌、堪萨斯分支杆菌、亚洲分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、戈登分枝杆菌、龟脓分枝杆菌、偶然分枝杆菌、草分枝杆菌、巴西诺卡氏菌、北京棒杆菌、肺炎球菌、嗜肺军团菌、百日咳博德特氏菌。以MTB标准株H37Rv DNA作为本次实验阳性对照。根据实施例5所述，对上述参考品进行结核分枝杆菌高敏感PCR检测。
检测结果如图2所示，结果显示只有MTB标准株H37Rv DNA检测为阳性，其他均为阴性，证实本发明检测方法特性性高，没有发生交叉反应。
二、灵敏度实验
  （1）我们用上述实施例4的检测试剂和盒检测方法对中国食品药品检定研究院提供的结核分枝杆菌PCR检测试剂盒用国家参考品中的最低检出限参考品（浓度分别为102 cfu/ml、10cfu /ml、1cfu /ml）进行核酸提取检测。
检测结果如图3所示表明，本发明试剂盒的灵敏度可达1 cfu/ml，灵敏度明显优于普通PCR方法（10 cfu/ml）。
（2）取上述实施例4中的MTB高敏感荧光PCR检测法与普通荧光 PCR试剂盒检测痰涂片阴性结核病人痰标本，并对结果进行比较。
我们用实施例4中的MTB高敏感荧光PCR检测法对合作医院收集的92例MTB拷贝数较低的痰涂片阴性结核病人痰标本进行检测并与市上较好的实时荧光PCR检测试剂比较。结果见表1，在92例涂阴痰标本中，本检测方法检测阳性32例（34.78%），而市上荧光PCR检测阳性为12例（11.04%），从而看出我们的新方法检测MTB灵敏度明显高于市上荧光PCR试剂。
表1两种方法检测涂阴结核病人组痰标本结果比较（n=92例）
 
（3）实施例4中的MTB高敏感荧光PCR检测法与普通荧光 PCR试剂盒检测结核病人血标本结果比较
我们用实施例4中的MTB高敏感荧光PCR检测法对合作医院收集的156例结核病人血标本进行检测并与市上较好的实时荧光PCR检测试剂比较。结果见表2，在156例涂阴痰标本中，本检测方法检测阳性39例（25.0%），而市上荧光PCR检测阳性为7例（4.49%），从而看出高敏感方法检测病人血标本中MTB灵敏度明显高于市上荧光PCR试剂。
表2 两种方法检测结核病人血标本结果比较（n=156例）
<110>  广州海力特生物科技有限公司
 
<120>  检测结核分枝杆菌的PCR引物、引物组、探针及其试剂盒和检测方法
 
<130> 
 
<160>  13   
 
<170>  PatentIn version 3.5
 
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<211>  26
<212>  DNA
<213>  人工引物
 
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<210>  2
<211>  25
<212>  DNA
<213>  人工引物
 
<400>  2
ggccgagttt ggtcatcagc cgttc                                             25
 
 
<210>  3
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工引物
 
<400>  3
cgaactcaag gagcacatca                                                   20
 
 
<210>  4
<211>  21
<212>  DNA
<213>  人工引物
 
<400>  4
gagtttggtc atcagccgtt c                                                 21
 
 
<210>  5
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工引物
 
<400>  5
gtccacgccg ccaactac                                                     18
 
 
<210>  6
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工引物
 
<400>  6
atgccctcac ggttcagg                                                     18
 
 
<210>  7
<211>  16
<212>  DNA
<213>  人工探针
 
<400>  7
ccgcaaagtg tggcta                                                       16
 
 
<210>  8
<211>  16
<212>  DNA
<213>  人工探针
 
<400>  8
cccgcaaagt gtggct                                                       16
 
 
<210>  9
<211>  29
<212>  DNA
<213>  人工引物
 
<400>  9
cggggtcacc cacactgtgc ccatctacg                                         29
 
 
<210>  10
<211>  26
<212>  DNA
<213>  人工引物
 
<400>  10
ggtcacccac actgtgccca tctacg                                            26
 
 
<210>  11
<211>  21
<212>  DNA
<213>  人工引物
 
<400>  11
ccacactgtg cccatctacg a                                                 21
 
 
<210>  12
<211>  19
<212>  DNA
<213>  人工引物
 
<400>  12
gcgctcggtg aggatcttc                                                    19
 
 
<210>  13
<211>  22
<212>  DNA
<213>  人工探针
 
<400>  13
atgccctccc ccatgccatc ct                                                22

Claims (10)

1.检测结核分枝杆菌的PCR引物，其引物序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6；或者为该些序列的核苷酸互补序列；
上述引物的核苷酸序列分别如下所示：
    SEQ ID NO:1：CGATGGCGA ACTCAAGGAGCACATCA，
    SEQ ID NO:2：GGCCGAGTTTGGTCATCAGCCGTTC，
    SEQ ID NO:3：CGAACTCAAGGAGCACATCA，
    SEQ ID NO:4：GAGTTTGGTCATCAGCCGTTC，
    SEQ ID NO:5：GTCCACGCCGCCAACTAC， 
SEQ ID NO:6：ATGCCCTCACGGTTCAGG。
2.检测结核分枝杆菌的PCR引物组，其由引物序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6组成；或者由该些序列的核苷酸互补序列组成。
3.检测结核分枝杆菌的PCR检测探针，其序列如下所示：
    SEQ ID NO:7：CCGCAAAGTGTGGCTA ，
SEQ ID NO:8：CCCGCAAAGTGTGGCT；
或者为该些序列的核苷酸互补序列。
4.根据权利要求3所述的检测结核分枝杆菌的PCR检测探针，其特征在于：探针序列5’端标记的荧光基团选自FAM、HEX、VIC、CY5、TET中一种，探针序列3’端标记的淬灭基团选自TAMRA、MGB、BHQ中一种。
5.一种检测结核分枝杆菌的PCR检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒含有权利要求2所述的引物组。
6.根据权利要求5所述的一种检测结核分枝杆菌的PCR检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒还含有至少1条权利要求3所述的检测探针。
7.根据权利要求5所述的一种检测结核分枝杆菌的PCR检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒还包含内控引物组和内控探针，其核苷酸序列分别为：
内控引物组的核苷酸序列为：
SEQ ID NO:9：CGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTACG，
SEQ ID NO:10：GGTCACCCACACTGTGCCCATCTACG，
SEQ ID NO:11：CCACACTGTGCCCATCTACGA，
SEQ ID NO:12：GCGCTCGGTGAGGATCTTC，
或者为该些序列的核苷酸互补序列；
内控探针序列的核苷酸序列为： 
SEQ ID NO:13：ATGCCCTCCCCCATGCCATCCT；
   内控探针序列所标记的荧光基团可从FAM、HEX、VIC、CY5、TET选择，但不同于权利要求3所述探针的标记荧光基团。
8.根据权利要求5所述的一种检测结核分枝杆菌的PCR检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒还含有：DNA裂解液； PCR反应液；Taq 酶 和UNG酶；强阳性对照品、临界阳性对照品及阴性对照品。
9.根据权利要求8所述的一种检测结核分枝杆菌的PCR检测试剂盒，其特征在于：所述的PCR反应液含有15~25mM Tris-HCl (pH8.0)，15~25mM KCl，2.5~5mM (NH4)SO4，2~5mM MgCl2，0.5~2mM dNTP/UTP Mix，200~600nM引物组，100~300nM 探针，200~600nM内控引物，100~300nM内控探针。
10.一种结核分枝杆菌高敏感PCR检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）DNA提取：
取液化后的痰液标本1000ul以及阴性质控品、临界阳性质控品和强阳性质控品各500ul于1.5ml无菌离心管中，1,3000rpm离心10min；用移液器吸去上清；加入1ml生理盐水洗涤沉淀，13,000rpm离心5min，弃上清；加入30ul DNA提取液，震荡混匀，稍离心，于56℃孵育30min后，100℃孵育10min；于13,000rpm离心10min；取上清即为PCR反应的模板DNA；
2）PCR反应体系： 
PCR反应液       43.2μl
5U/ul Taq 酶       0.8μl
1U/ul UNG酶     0.06μl
DNA模板          6μl；
    3）PCR反应程序为：
    以ABI7500为例，第一步：37℃ 5分钟；第二步： 95 ℃ 10 分钟；第三步： 95 ℃ 15 秒， 62~68 ℃ 15 秒，72℃ 20秒， 5~15 个循环； 第四步：95℃ 15秒，60℃ 1分钟，40个循环；60 ℃时采集荧光；
    4）结果分析：
以ABI 7500仪器为例，打开Delta Rn vs Cycles 扩增线性图，选择Auto baseline，阈值线选择自动；或选择Manual Ct，在左侧的线性扩增图中调整阈值线的位置，使阈值线与扩增曲线上升拐点后1~2 cycles相交；
根据下表判断结果：
实验结果需同时满足以下质量控制，否则，本次实验无效，需重新进行：
①阴性质控品Ct值为None；TB强阳阳性质控品Ct值应为8~12之间；TB临界阳性质控品Ct值应为18~22之间；
②质控品内控基因Ct值应为18~22之间。
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