CN111394484A - 一种以异源菌株模拟的结核分枝杆菌核酸检测质控品 - Google Patents

一种以异源菌株模拟的结核分枝杆菌核酸检测质控品 Download PDF

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范云
韩雪菲
黄维纲
王华梁
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Abstract

本发明涉及一种以异源菌株模拟的结核分枝杆菌核酸检测质控品，包括异源菌株宿主以及包含结核分枝杆菌特定核酸序列的外源特征序列。本发明消除了直接使用结核分枝杆菌致病菌作为质控品所存在的生物安全风险；理论上可以模拟具有任意一种靶标序列特征的结核分枝杆菌供
Figure DDA0002428749600000011
系统(配合
Figure DDA0002428749600000012
系统)及基于类似检测靶标的检测系统质控使用；同时该质控品还适用于结核分枝杆菌RNA检测质控使用；制备方便，适合商业化应用。

Description

一种以异源菌株模拟的结核分枝杆菌核酸检测质控品
技术领域
本发明属于结核分枝杆菌分子检测领域，特别涉及一种以异源菌株模拟的结核分枝杆菌核酸检测质控品。
背景技术
根据世界卫生组织(WHO)估计全球有一亿左右结核病患者，每年有150万人因此死亡，是死亡人数最多的单一病原传染病(高于HIV)。结核病由结核分枝杆菌引起，它的防治难点在于容易产生耐药。近年来耐药菌株引发的结核病例快速增加，每年由多耐药菌株(MDR-TB，对利福平和异烟肼耐药)引发的病例超过50万，其中一部分还是广泛耐药菌株(XDR-TB，多耐药基础上拮抗其他2线治疗抗生素)甚至全耐药菌株(TDR-TB，拮抗目前已知治疗药物)。此外，结核分枝杆菌生长缓慢，传统细菌培养方法检测需要数周，给及时诊治带来困难。
相较于镜检、培养等传统检测手段动辄需要数周乃至数月，以结核分枝杆菌核酸(DNA或RNA)序列为检测靶标的分子检测技术，只需几天甚至数小时即能确定是否结核分枝杆菌感染，一些检测方法还能提供菌株的药敏信息。比如美国Cepheid公司推出的
Figure BDA0002428749580000011
MTB/RIF检测(配合
Figure BDA0002428749580000012
Dx系统使用，以下简称Xpert系统)，可在2小时内从痰液样本中给出是否感染，以及是否利福平耐药的检测结果。而超过90％拮抗利福平的菌株会同时拮抗异烟肼，因此利福平耐药是MDR-TB的重要前瞻指标。2010年起，Xpert系统被WHO推荐用于结核病诊断，已是目前应用最为广泛的快速诊断方法。同时，其它以核酸为靶标的分子检测方法也已在我国各级医疗机构得到推广应用，如基于DNA特征序列的PCR-荧光探针法、微阵列芯片法、环介导恒温扩增法，基于结核分枝杆菌RNA特征序列的RNA恒温扩增检测法等。其中RNA恒温扩增检测法具有灵敏度高、检测迅速、设备要求低的特点，并且只对活菌敏感而不受死亡细菌干扰，可以更及时地反映药物治疗效果，是今后检测技术的重要发展方向之一。
而对这些核酸检测方法检测质量的监督和管理，需要用到相应的室内/室间质控品。通常是以灭活后的结核分枝杆菌作为质控品，但是该方法存在潜在的生物安全风险。并且结核分枝杆菌大量培养，需要在三级生物安全(BSL-3)实验室进行，实验条件要求严苛。而常规处理条件下，灭活后的菌株RNA发生降解，无法作为RNA质控品使用。此外，结核分枝杆菌菌种在运输和入境过关中存在诸多限制，难以收集多种基因型菌株供质控使用。如Xpert系统以rpoB基因(编码RNA聚合酶β亚基，β-Subunit of RNA polymerase)的81bp核心序列为检测靶标，有5个探针对其进行检测，理论上存在32种不同的探针组合，需要32种不同的质控品才能对其作最为全面的质控。实际上，自然界目前发现的这一区段的突变子数要远少于32种，而这些不同的突变子还分布于全世界各地，鉴于致病菌株的严格管控，收集齐备这些不同基因型菌株只存在理论可能，因此依靠病原菌株收集难以满足质控品的多样性需要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种以异源菌株模拟的结核分枝杆菌核酸检测质控品，消除直接使用结核分枝杆菌致病菌带来的潜在生物安全风险,同时可供当前主流核酸检测方法(Xpert系统)以及具有发展优势的检测方法(RNA恒温扩增检测)使用的质控品。并且可针对特定检测方法(Xpert系统)，提供多种特征序列供质控使用以充分验证仪器性能。
本发明提供了一种以异源菌株模拟的结核分枝杆菌核酸检测质控品，包括异源菌株宿主以及包含结核分枝杆菌特定(如种属特性、特定药敏性状等)核酸序列的外源特征序列。
所述异源菌株宿主选取合适的非致病菌、如非致病的大肠杆菌等。所述异源菌株宿主可以提供类似结核分枝杆菌的细菌细胞结构；细胞结构可为导入的外源序列提供一定物理保护，以及避免被体外核酸酶降解等；可以模拟细菌核酸的提取过程。
所述外源特征序列选自用于表征种属特征的16S-rDNA序列、菌株耐药性相关的rpoB基因序列中的一种或者两者的组合。
所述外源特征序列的获得方式包括从原宿主菌中扩增获得、从已知克隆中分离以及人工合成中的一种或几种。
所述质控品以异源菌株宿主为载体，通过导入或整合包含结核分枝杆菌部分核酸特征序列的外源核酸片段制备而成。
所述整合包括以单拷贝或多拷贝方式整合于染色体和/或整合于严谨型或松弛性质粒中。
所述质控品不仅用于以DNA为靶标的核酸检测还可用于以RNA为靶标的核酸检测。
当所述质控品需要作为RNA质控使用时，会在制备之初加入RNA保护剂以防止RNA降解。通常RNA保护剂还会继续存在于所述质控品基质中。
所述质控品的检测方式包括Xpert系统或者其它以rpoB基因的部分序列为检测靶标的核酸检测方法，或者以16S-rDNA/rRNA序列为检测靶标的核酸检测方法，这些核酸检测靶标可以是DNA也可以是这些序列转录形成的RNA。
有益效果
本发明消除了直接使用结核分枝杆菌致病菌作为质控品所存在的生物安全风险；理论上可以模拟具有任意一种靶标序列特征的结核分枝杆菌供
Figure BDA0002428749580000021
MTB/RIF系统(配合
Figure BDA0002428749580000022
Dx系统)及基于类似检测靶标的检测系统质控使用；作为Xpert系统质控品，可以为其提供针对每个探针和各种探针组合的质控品，为其提供全面的质控保障；所制备的质控品不仅可应用于DNA检测质控还可用于RNA检测质控；制备方便，适合商业化应用。
附图说明
图1为TOP10(a)、rif-s(b)、rif-r(c)菌株的Xpert系统检测结果。
图2为各模拟菌株Xpert系统检测结果及响应探针。
图3为各模拟菌株Xpert系统检测结果及响应探针。
图4为不同丰度质控品的检出。
图5a-b为RNA恒温扩增检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
下述实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆实验指南》(第四版，科学出版社，2017)等本领域常用工具书中所述方法进行，或按照试剂生产厂家建议条件进行。
实施例1
一、本实施例提供了一种以异源菌株模拟的结核分枝杆菌质控品的设计流程，需要说明的是，实施例仅为举例，其他任意相同结构的质控品均可以此作为参考。具体如下：
①首先根据检测仪器检测对象，确定需要导入的特征序列。本实施例选取包含了81bp核心区段(gcaccagccagctgagccaattcatggaccagaacaacccgctgtcggggttgacccacaagcgccgactgtcggcgctgg)的结核分枝杆菌rpoB基因部分序列作为导入序列。
②选择合适的非致病性异源宿主，可根据检测仪器的特殊要求选取合适的宿主。本实施例选取了遗传操作方便、快速生长、非致病的大肠杆菌DH5α及TOP10菌株作为异源宿主。
③将特征序列导入并稳定地存在于异源宿主菌中。可根据需要将一段或多段特征序列，导入异源宿主。为使异源片段稳定地存在于异源宿主中，一般还需要同时导入其它片段，如用于整合的同源序列、整合位点、质粒复制相关元件、抗性基因等。特征序列可根据需要，以单拷贝或多拷贝形式整合于宿主菌染色体、严谨型质粒或者松弛型质粒中。在本实施例中，特征序列整合于松弛型质粒中，以多拷贝形式存在于大肠杆菌中，并在抗性筛选压力下稳定地存在于大肠杆菌中。
④菌株以适当浓度保存于适当的存储液中，作为质控品使用。并根据核酸检测需要添加合适的稳定剂使其能分别满足DNA或者RNA检测使用。上述存储液，一般包括适合的缓冲液、防冻液、防腐剂、RNA保护剂等。在本实施例中，菌株以灭活形式提供，存储液由磷酸缓冲液、羧甲基纤维素钠、KroVin600(西宝生物，上海)组成。
二、MTB-RIF-S、MTB-RIF-R片段的合成
①MTB-RIF-S片段设计
MTB-RIF-S具体序列如SEQ NO.1所示，主要包含以下几个部分：
1.结核分枝杆菌rpoB基因的部分序列；
2.结核分枝杆菌16S-rDNA部分序列；
3.两部分序列中间加入EcoR I和Hind III的酶切位点。
②MTB-RIF-R片段设计
MTB-RIF-R具体序列如SEQ NO.2所示，主要包含以下几个部分：
1.结核分枝杆菌rpoB基因的部分序列，包含3个点突变，分别位于Xpert系统探针B、D、E内；
2.结核分枝杆菌16S-rDNA部分序列；
3.两部分序列中间加入EcoR I和Hind III的酶切位点。
③MTB-RIF-S/MTB-RIF-R片段合成
在合成MTB-RIF-S/MTB-RIF-R片段时，在MTB-RIF-S/MTB-RIF-R序列两端加入酶切位点，5’末端和3’末端分别添加EcoR V和BamH I酶切位点。合成后的片段插入载体pUC57的EcoR V和BamH I酶切位点之间，分别构建成质粒p16S-S和p16S-R，转化大肠杆菌TOP10后，获得携带质粒菌株rif-s和rif-r。此处片段合成、质粒构建及菌株构建，委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
实施例2
Xpert系统检测rif-s,rif-r菌株
rif-s,rif-r菌株LB培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)培养16小时后，收集菌体，TE(pH 8)缓冲液清洗2遍，重新悬于TE缓冲液,湿热灭菌121℃20分钟，用分光光度计测定600nm处OD值，稀释菌液至OD600nm＝0.001。
取500μl菌液，按Xpert MTB/RIF试剂盒说明书中痰液样本要求处理并在
Figure BDA0002428749580000041
Dx System(Cepheid美国)中测定，测定结果见图1a-c。结果表明在Xpert系统检测中rif-s被识别为利福平敏感结核分枝杆菌，rif-r则为利福平耐药结核分枝杆菌。直接用大肠杆菌TOP10菌株进行检测，则检测不到结核分枝杆菌。这些结果表明，该策略成功在异源菌株大肠杆菌中实现了对结核分枝杆菌及利福平不同抗性菌株的模拟。
实施例3
1.对应Xpert系统不同探针的突变菌株构建
质粒p16S-S/p16S-R分别用Hind III酶切后，电泳回收3kb片段，连接酶处理使其自连，转化大肠杆菌DH5α，分别获得去除结核分枝杆菌16S-rDNA序列后的质粒pRIF-S，pRIF-BDE及对应菌株MTB-S，MTB-BDE。
2.以PCR引入定点突变方式构建各突变质粒，具体流程如下：
①以表1配方配制反应液
表1 PCR反应液组成
组分 体积
5×PrimeSTAR Buffer(Mg<sup>2+</sup>Plus)Plus) 10μl
dNTP Mixture(2.5mM each) 4μl
引物 Ca.0.3μM/每条
模板 Ca.1μg
PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5U/μl) 0.5μl
灭菌水 加至50μl
②以表2条件进行PCR反应
表2 PCR反应条件
Figure BDA0002428749580000051
PCR结束后用PCR产物回收试剂盒回收PCR产物，Dpn I酶切PCR产物(反应体积50ul)1小时，取1μl转化大肠杆菌DH5α，筛选并测序验证，获得相应的质粒和菌株。
实施过程如下：
以表3引物列表中MA-F，MA-R为引物，以pRIF-S为模板，通过PCR定点突变和转化获得质粒pRIF-A和对应菌株MTB-A；
以表3引物列表中MB-F，MB-R为引物，以pRIF-S为模板，通过PCR定点突变和转化获得质粒pRIF-B和对应菌株MTB-B；
以表3引物列表中MC-F，MC-R为引物，以pRIF-S为模板，通过PCR定点突变和转化获得质粒pRIF-C和对应菌株MTB-C；
以表3引物列表中MD-F，MD-R为引物，以pRIF-S为模板，通过PCR定点突变和转化获得质粒pRIF-D和对应菌株MTB-D；
以表3引物列表中ME-F，ME-R为引物，以pRIF-S为模板，通过PCR定点突变和转化获得质粒pRIF-E和对应菌株MTB-E；
以表3引物列表中MB-F，MB-R为引物，以pRIF-BDE为模板，通过PCR定点突变和转化获得质粒pRIF-BE和对应菌株MTB-BE；
以表3引物列表中MD-F，MD-R为引物，以pRIF-BDE为模板，通过PCR定点突变和转化获得质粒pRIF-DE和对应菌株MTB-DE。
表3引物列表
引物名称 序列
MA-F TTCTTCGGCACCAGCCAGCAGAGCCAATTCATGGACCAGAACAACCCGCTGTCGGGG
MA-R CTGGTCCATGAATTGGCTCTGCTGGCTGGTGCCGAAGAACTCCTTGATCGCGGCGACC
MB-F AGCTGAGCCAATTCATGGTCCAGAACAACCCGCTGTCGGGGTTGACCCACAAGCGCCG
MB-R CGACAGCGGGTTGTTCTGGACCATGAATTGGCTCAGCTGGCTGGTGCCGAAGAACTCCT
MC-F ATTCATGGACCAGAACAACACGCTGTCGGGGTTGACCCACAAGCGCCGACTGTCGGCGC
MC-R TGGGTCAACCCCGACAGCGTGTTGTTCTGGTCCATGAATTGGCTCAGCTGGCTGGTGCC
MD-F CAGCTGAGCCAATTCATGGACCAGAACAACCCGCTGTCGGGGTTGACCTACAAGCGCCG
MD-R CGACAGCGGGTTGTTCTGGTCCATGAATTGGCTCAGCTGGCTGGTGCCGAAGAACTCCT
ME-F ACCCACAAGCGCCGACTGTTGGCGCTGGGGCCCGGCGGTCTGTCACGTGAGCGTGCCGG
ME-R ACCGCCGGGCCCCAGCGCCAACAGTCGGCGCTTGTGGGTCAACCCCGACAGCGGGTTG
实施例4
Xpert系统质控品制备、测定
将上述菌株及大肠杆菌DH5α按实施例2中描述制备、清洗、灭菌、测定OD600nm值，并加入合适的缓冲液(本实验中使用的是KroVin600 0.2％，PBS，CMCNa 1％)，按目标值OD600nm＝1/103稀释，4℃存放。
按实施例2中进行样本处理并测定，结果见图2、图3。测试结果表明，除DH5α外所有测试菌株的结果都为结核分枝杆菌阳性，并且均能得到对应探针响应(对应探针检测为阴性)，并且可以实现多个探针的组合(2个探针阴性：MTB-BE,MTB-DE；3个探针阴性：MTB-BDE)，而DH5α菌株测试结果为结核分枝杆菌阴性。因此该策略制备的质控品，可以用于Xpert系统所有5个探针的质控。
将MTB-E测定OD600nm值后，分别按目标值OD600nm＝1/103、1/105、1/107稀释并制备成质控品后进行测试，结果见图4。结果表明，可以调控实现不同菌量检测丰度的质控品。
当检测方法为Xpert系统时，可以提供不小于9种不同检出特征的质控品供其使用，理论上只需按实施例中的突变子构建方法继续拓展，可以模拟任意一种结核分枝杆菌的rpoB核心区域及其两侧序列特征。并且可进一步模拟出自然界并不存在但是具有质控意义的特征序列用于质控。
实施例5
结核分枝杆菌核酸检测试剂盒(RNA恒温扩增检测)质控品制备
将实施例1中的rif-s及大肠杆菌模式菌株DH5α培养16小时，收集菌体并用RNA稳定剂处理(本实施例中使用life technologies公司的
Figure BDA0002428749580000071
Solution)8小时，加入合适的缓冲液(本实施例中缓冲液为KroVin600 0.2％，1mM PBS，羧甲基纤维素钠1％，50％
Figure BDA0002428749580000072
Solution)，分别配制成OD600nm＝1/103样本，其中rif-s还配制了OD600nm＝1/10的高值样本，划线培养确认无菌生长。取1ml每份，按结核分枝杆菌核酸检测试剂盒(RNA恒温扩增，上海仁度)处理，Applied Biosystems 7500荧光定量PCR仪按试剂盒推荐条件检测，结果见图5a-b。检测结果显示质控品样本高值(SH)及低值(SL)均显示结核分枝杆菌阳性，并且高值的Ct值小于低值，与预期一致。而没有转化相应特征片段的大肠杆菌DH5α(D5)则显示为结核分枝杆菌阴性。本实施例表明，所研发质控品可作为RNA恒温扩增检测质控使用，并且该质控品以非致病菌大肠杆菌替代结核分枝杆菌作为质控使用，消除了潜在生物安全风险。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海市临床检验中心
<120> 一种以异源菌株模拟的结核分枝杆菌核酸检测质控品
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cgttgatcaa catccggccg gtggtcgccg cgatcaagga gttcttcggc accagccagc 180
tgagccaatt catggaccag aacaacccgc tgtcggggtt gacccacaag cgccgactgt 240
cggcgctggg gcccggcggt ctgtcacgtg agcgtgccgg gctggaggtc cgcgacgtgc 300
acccgtcgca ctacggccgg atgtgcccga tcgaaacccc tgaggggccc aacatcggaa 360
ttcaagcttc aagtcgaacg gaaaggtctc ttcggagata ctcgagtggc gaacgggtga 420
gtaacacgtg ggtgatctgc cctgcacttc gggataagcc tgggaaactg ggtctaatac 480
cggataggac cacgggatgc atgtcttgtg gtggaaagcg ctttagcggt gtgggatgag 540
cccgcggcct atcagcttgt tggtggggtg acggcctacc aaggcgacga cgggtagccg 600
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<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
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<210> 11
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
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<210> 12
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
accgccgggc cccagcgcca acagtcggcg cttgtgggtc aaccccgaca gcgggttg 58

Claims (10)

1.一种以异源菌株模拟的结核分枝杆菌核酸检测质控品，其特征在于：包括异源菌株宿主以及包含结核分枝杆菌特定核酸序列的外源特征序列。
2.根据权利要求1所述的质控品，其特征在于：所述异源菌株宿主为非致病菌。
3.根据权利要求1所述的质控品，其特征在于：所述外源特征序列选自结核分枝杆菌16S-rDNA的部分序列或者耐药性相关基因rpoB中的部分序列，或是两者的组合。
4.根据权利要求1或3所述的质控品，其特征在于：所述外源特征序列的获得方式包括从原宿主菌中扩增获得、从已知克隆中分离以及人工合成中的一种或几种。
5.根据权利要求1所述的质控品，其特征在于：所述质控品以异源菌株宿主为载体，通过导入或整合包含结核分枝杆菌部分核酸特征序列的外源核酸片段制备而成。
6.根据权利要求5所述的质控品，其特征在于：所述整合包括以单拷贝或多拷贝方式整合于染色体和/或整合于严谨型或松弛性质粒中。
7.根据权利要求1所述的质控品，其特征在于：不仅用于以DNA为靶标的核酸检测还用于以RNA为靶标的核酸检测。
8.根据权利要求7所述的质控品，其特征在于：当用于以RNA为靶标的核酸检测时，溶液基质中包含RNA保护剂。
9.根据权利要求1或7所述的质控品，其特征在于：所述质控品的检测方式包括
Figure FDA0002428749570000011
MTB/RIF系统或者其它以rpoB基因的部分序列为检测靶标的核酸检测方法，或者以16S-rDNA/rRNA序列为检测靶标的核酸检测方法。
10.根据权利要求8所述的质控品，其特征在于：当其作为
Figure FDA0002428749570000012
MTB/RIF系统质控品使用，至少能提供9种及以上不同检出特征的阳性质控品供其使用。
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