CN116024371A - 一种多重qPCR检测病原菌的引物探针组、试剂盒和检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测临床常见病原菌的多重PCR引物、探针及检测方法。本发明对临床常见病原菌烟曲霉、金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌、脓肿分枝杆菌基因序列分析和比对，设计荧光PCR的检测引物和探针，一次性同时鉴定临床样本是否存在这四种病原菌感染。本发明的检测方法简化了原有检测工作量，缩短检测时间，同时为临床诊治提供病原学依据，对临床针对性选择抗生素使用具有重要指导作用。

Description

一种多重qPCR检测病原菌的引物探针组、试剂盒和检测方法

技术领域

本发明属于分子生物学和医学领域，具体涉及一种检测临床常见病原菌的多重PCR引物、探针及检测方法。

背景技术

据估算全球约有10亿人受到真菌感染，严重真菌患者数量超过1.5亿，真菌病导致的死亡人数每年约为160万例。侵袭性曲霉病主要发生在免疫功能严重受损的宿主。根据中国上海复旦大学和全球真菌感染行动基金的研究报告显示，我国约117.9万人患有侵袭性曲霉病，其最常见病原就是烟曲霉。

金黄色葡萄球菌是一种重要的人畜共患病原体，可引起人和动物的多种感染和疾病，包括皮肤感染、肺炎、感染性关节炎、心内膜炎、脓毒症等。甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌(MRSA)是引起医院相关性和社区相关性感染的重要致病菌之一，其发病率和死亡率一直居高不下，对临床构成巨大威胁。

据世界卫生组织估算，全球约有1/4的人感染结核分枝杆菌并长期处于结核分枝杆菌潜伏感染状态。在无预防性治疗的情况下，结核分枝杆菌潜伏感染人群中大约有5％-10％会发生活动性结核病。我国是结核病高负担国家之一，全国15周岁以上人群结核分枝杆菌潜伏感染率为20.3％。此外非结核分枝杆菌(non-tuberculous Mycobacteria,NTM)病的发病率和患病率在一些国家和地区呈增加趋势，甚至超过了结核病的发病率和患病率。NTM在我国的发病率呈现明显上升趋势，分离率从1979年的4.3％上升至2010年的22.9％，其中脓肿分枝杆菌复合群占比高达35.96％。

上述四种病原菌，临床常见的检测方法多为分离培养，但此方法检测周期耗时长，敏感性低、特异性差。而分子诊断技术可有效弥补传统方法的不足。荧光定量PCR技术在PCR反应系统中引入荧光标记探针从而实现其定量功能。荧光定量PCR技术在病原体检测方面已有成熟应用，但针对上述四种病原菌多进行单独检测，且各自检测使用的具体方法、扩增试剂以及检测条件各不相同，极大的增加了临床检测工作量和检测成本。因此，急需建立一种快速、灵敏、特异的检测技术来提高临床对烟曲霉、金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌、脓肿分枝杆菌的检测能力。

发明内容

本发明的目的在于利用多重荧光PCR方法，提供对临床感染标本同时进行烟曲霉、金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌、脓肿分枝杆菌四种病原微生物的检测引物、探针和检测方法。具有灵敏度高、特异性强、检测周期短、效率高、成本低等优势，体现出更高的可行性与应用前景。

本发明首先提供了一种多重qPCR检测病原菌的引物探针组，其中包含适用于单反应同时检测烟曲霉、金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌、脓肿分枝杆菌的四重荧光PCR引物组合；

所述的引物组合包括：

用于对烟曲霉进行检测的正反向引物对，核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示；

用于对金黄色葡萄球菌进行检测的正反向引物对，核苷酸序列如SEQ ID NO.4-5所示；

用于对结核分枝杆菌进行检测的正反向引物对，核苷酸序列如SEQ ID NO.7-8所示；

用于对脓肿分枝杆菌检测的正反向引物对，核苷酸序列如SEQ ID NO.10-11所示；

所述的探针组合包括：

用于对烟曲霉扩增产物进行报告的探针，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

用于对金黄色葡萄球菌扩增产物进行报告的探针，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

用于对结核分枝杆菌扩增产物进行报告的探针，核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；

用于对脓肿分枝杆菌扩增产物进行报告的探针，核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

所述探针的5’端修饰有报告基团，所述报告基团为FAM、HEX、ROX和Cy5；四种探针采用不同的报告基团修饰。

所述探针的3’端修饰有淬灭基团，所述猝灭基团为BHQ1和BHQ2；SEQ ID NO.3所示核苷酸序列与SEQ ID NO.6所示核苷酸序列采用淬灭基团BHQ1修饰，SEQ ID NO.9所示核苷酸序列与SEQ ID NO.12所示核苷酸序列采用淬灭基团BHQ2修饰。

一种试剂盒，其中包含有上述的引物探针组。

一种多重qPCR检测病原菌检测方法，通过上述的引物探针组进行四重荧光PCR反应，并对样本进行判定；所述的检测方法用于单反应同时检测烟曲霉、金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌、脓肿分枝杆菌。

所述的样本包括但不限于肺泡灌洗液、痰液、血液、脑脊液、心包积液、胸水、尿液、脓液、拭子和组织等。

所述的多重荧光定量PCR检测方法包括以下步骤：提取样品的基因组DNA作为模板，使用上述的检测引物和检测探针进行多重荧光定量PCR扩增，反应结束后，根据探针标记的荧光报告基团的荧光信号，读取并记录样品的PCR扩增循环次数Ct，根据各样品的Ct值，按照建立的判断标准，判断样品中是否含有上述四种病原微生物。

所述的多重荧光PCR检测体系为：2×Hieff

Universal TaqMan multiplexqPCR master mix 5μL、四种探针引物预混液1.2μL，终浓度分别为10μM，DNA模板3.8μL。

所述的多重荧光定量PCR扩增程序优选为：95℃ 5分钟；95℃ 15秒，58.5℃ 30秒，40个循环。

样本进行判定中，同时设立阴性对照和阳性对照，根据扩增曲线的Ct值判定结果。

阳性对照品应有明显的S型扩增曲线，3个复孔重复性好且Ct值均＜30；阴性对照品3个复孔至少2个孔应无Ct值且无典型的S型曲线。

样本进行判定中，判断标准如下：

待测样本孔有Ct值和明显的S型扩增曲线，说明该样本对应菌种为阳性检出。待测样本无Ct值和明显的S型扩增曲线，说明该样本对应菌种为阴性检出。

有益效果

本发明针对四种常见的人体致病微生物的特异性基因的保守区域设计多重特异性引物和探针。通过实验室条件优化和筛选，建立了单反应同时检测这四种病原的方法，简化了原有的检测工作量。四重qPCR检测与单重检测无明显差异，对临床阳性样本检测敏感性高，对临床阴性样本无非特异性扩增，显示良好的特异性。

附图说明

图1-图4分别为实施例中针对烟曲霉、金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌、脓肿分枝杆菌四种病原设计的引物探针组合的荧光PCR扩增曲线图。

图5-图6分别为阴性对照品、阳性对照品的荧光PCR扩增曲线图。

图7-图8分别为多重荧光PCR、单重荧光PCR扩增曲线图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明进行进一步的阐述，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

本发明中所用试剂与仪器如下：

所用试剂：Hieff

Universal TaqMan multiplex qPCR master mix：YEASEN；11211ES08

烟曲霉、金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌、脓肿分枝杆菌探针

烟曲霉、金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌、脓肿分枝杆菌上、下游引物工作液

阳性对照品

阴性对照品

所用仪器：CFX 384Optics Module：Bio-Rad；CFX384

Gilson移液器；Gilson

Scilogex掌上离心机：Scilogex；S1010E

IKAVortex 2：IKA；V2 SO25

微孔板迷你离心机：其林贝尔；BE-6100Hard-

Thin-Wall 384-WellSkirted PCR Plates：Bio-Rad；HSP3905

Microseal B Adhesive Sealer：Bio-Rad；MSB1001

实施例1

1、待测样本准备：待测样本要求DNA浓度在0-10ng/μL之间，若浓度≤10ng/μL，可直接取3.8μL进入后续反应；若浓度＞10ng/μL，需用无酶水将DNA稀释至0-10ng/μL，取3.8μL进入后续反应。

2、探针引物设计

通过对美国国立生物技术信息中心(NCBI)网站中烟曲霉、金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌、脓肿分枝杆菌基因组中特异性序列比对，找到高度保守的核苷酸序列，并结合文献，设计烟曲霉、金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌、脓肿分枝杆菌的特异性四重荧光PCR引物和探针。设计的引物及探针核苷酸序列见表1。表2为Panel的探针和引物用量。

表1 4种病原微生物引物和探针信息

表2Panel探针和引物用量

3、对照品准备

阳性对照品：选取临床样本中已知微生物种类，且微生物类别与待验的微生物类别一致的阳性样本，阳性对照样本混合前浓度为0-10ng/μL，作为阳性对照品进入反应体系。用相对应的多重qPCR引物和探针进行扩增，若有明显的S型扩增曲线，3个复孔一致性好且Ct值＜30，则该DNA混合物可持续作为后续qPCR验证的阳性对照品。

阴性对照品：以无酶水代替临床样本加入反应体系作为阴性对照，其他试剂使用或反应条件与临床样本一致。

4、PCR扩增和信号收集

选用10μL的实时荧光PCR扩增体系，反应体系见表3。

表3多重qPCR反应体系

PCR扩增条件为：

表4多重qPCR反应程序

5、结果判读

阳性对照品与阴性对照品符合上述条件，则本次实验有效，否则需要重复实验。

待测样本有Ct值和明显的S型扩增曲线，说明该样本对应菌种为阳性检出。

待测样本无Ct值和明显的S型扩增曲线，说明该样本对应菌种为阴性检出。

实施例2本发明与单重荧光PCR方法比较

使用临床阳性样本对本发明四重荧光PCR方法与单重荧光PCR方法进行对比。依据上述实例1中操作步骤进行，由图7、图8可知，本发明的四重荧光PCR体系与单重qPCR结果无明显差异。

实施例3多重荧光PCR检测体系的特异度评价

用本发明的多重荧光PCR方法检测临床上述四种菌株阴性但含有其同属的其他菌株的样本。结果除阳性对照外，其余病原体均为阴性。

表5临床阴性样本

实施例4临床样本检测

用本发明的多重荧光PCR方法检测临床10份感染患者的样本，样本类型包括肺泡灌洗液、痰液和血液。结果见表6，结果显示本发明所建立的方法与mNGS测序结果完全一致，本发明准确、可靠。

表6临床样本检测结果

以上所述实施例仅为本发明的几种优选实施方式，并不能因此理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种多重qPCR检测病原菌的引物探针组，其特征在于，其中包含适用于单反应同时检测烟曲霉、金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌、脓肿分枝杆菌的四重荧光PCR引物组合；

所述的引物组合包括：

用于对烟曲霉进行检测的正反向引物对，核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示；

用于对金黄色葡萄球菌进行检测的正反向引物对，核苷酸序列如SEQ ID NO.4-5所示；

用于对结核分枝杆菌进行检测的正反向引物对，核苷酸序列如SEQ ID NO.7-8所示；

用于对脓肿分枝杆菌检测的正反向引物对，核苷酸序列如SEQ ID NO.10-11所示。

2.根据权利要求1所述的多重qPCR检测病原菌的引物探针组，其特征在于，所述的探针组合包括：

用于对烟曲霉扩增产物进行报告的探针，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

用于对金黄色葡萄球菌扩增产物进行报告的探针，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

用于对结核分枝杆菌扩增产物进行报告的探针，核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；

用于对脓肿分枝杆菌扩增产物进行报告的探针，核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

3.根据权利要求1所述的多重qPCR检测病原菌的引物探针组，其特征在于，所述探针的5’端修饰有报告基团，所述报告基团为FAM、HEX、ROX和Cy5；四种探针采用不同的报告基团修饰。

4.根据权利要求1所述的多重qPCR检测病原菌的引物探针组，其特征在于，所述探针的3’端修饰有淬灭基团，所述猝灭基团为BHQ1和BHQ2；SEQ ID NO.3所示核苷酸序列与SEQ IDNO.6所示核苷酸序列采用淬灭基团BHQ1修饰，SEQ ID NO.9所示核苷酸序列与SEQ IDNO.12所示核苷酸序列采用淬灭基团BHQ2修饰。

5.一种试剂盒，其特征在于，其中包含有上述的引物探针组。

6.一种多重qPCR检测病原菌检测方法，通过权利要求1所述的引物探针组进行四重荧光PCR反应，并对样本进行判定；所述的检测方法用于单反应同时检测烟曲霉、金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌、脓肿分枝杆菌。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述的样本包括但不限于肺泡灌洗液、痰液、血液、脑脊液、心包积液、胸水、尿液、脓液、拭子和组织等。

8.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述的多重荧光定量PCR检测方法包括以下步骤：提取样品的基因组DNA作为模板，使用上述的检测引物和检测探针进行多重荧光定量PCR扩增，反应结束后，根据探针标记的荧光报告基团的荧光信号，读取并记录样品的PCR扩增循环次数Ct，根据各样品的Ct值，按照建立的判断标准，判断样品中是否含有上述四种病原微生物。

9.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述的多重荧光PCR检测体系为：

UniversalTaqMan multiplex qPCR master mix 5μL、四种探针引物预混液1.2μL，终浓度分别为10μM，DNA模板3.8μL。

10.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述的多重荧光定量PCR扩增程序优选为：95℃ 5分钟；95℃ 15秒，58.5℃ 30秒，40个循环；

样本进行判定中，同时设立阴性对照和阳性对照，根据扩增曲线的Ct值判定结果；

阳性对照品应有明显的S型扩增曲线，3个复孔重复性好且Ct值均＜30；阴性对照品3个复孔至少2个孔应无Ct值且无典型的S型曲线

样本进行判定中，判断标准如下：

待测样本孔有Ct值和明显的S型扩增曲线，说明该样本对应菌种为阳性检出。待测样本无Ct值和明显的S型扩增曲线，说明该样本对应菌种为阴性检出。

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