CN102549006A

CN102549006A - 植物人工染色体及其制造方法

Info

Publication number: CN102549006A
Application number: CN2010800387565A
Authority: CN
Inventors: 达维·R·凯利
Original assignee: University of Georgia Research Foundation Inc UGARF
Current assignee: University of Georgia Research Foundation Inc UGARF
Priority date: 2009-08-31
Filing date: 2010-08-31
Publication date: 2012-07-04
Also published as: BR112012004570A2; IN2012DN01967A; US20130031671A1; CA2772403A1; WO2011026140A1

Abstract

在此描述了一种工程化的着色粒、以及使用这种工程化的着色粒的系统和方法。这种工程化的着色粒可以具有一个DNA序列的串联重复序列，该DNA序列具有结合基序以允许融合蛋白的结合，这些融合蛋白包括一个DNA结合蛋白和一个动粒蛋白以激活这种工程化的着色粒。还描述了包括这种工程化的着色粒的一种植物人工染色体、包含这种工程化的染色体的一种转基因植物、以及一种使用这种植物人工染色体通过加入复基因来合成一个大分子的方法。

Description

植物人工染色体及其制造方法

关于联邦赞助的研究或发展的声明

本发明是在国家科学基金(NSF)拨款#0421671下部分地用美国政府的支持来完成的。美国政府对于本发明具有一定的权利。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2009年8月31日提交的名称为“PLANT ARTIFICIALCHROMOSOMES AND METHODS OF MAKING THE SAME”的美国临时申请61/238,561；于2009年8月31日提交的名称为“PLANT ARTIFICIAL CHROMOSOMESAND METHODS OF MAKING THE SAME”的美国临时申请61/238,591；以及于2009年9月3日提交的名称为“PLANT ARTIFICIAL CHROMOSOMES AND METHODS OFMAKING THE SAME”的美国临时申请61/275,847的权益。如同在此全部描述的，将各个申请通过引用以其整体结合在此。

发明领域

本发明的领域涉及遗传转化。具体地，本发明涉及并且体现了一种用于在植物和大分子合成中转化的人工染色体(AC)的合成和用途。

背景

将在此所有的公开物通过引用结合到相同的程度，如同每个单独的公开物或专利申请明确地并且单独地是指通过引用来结合。以下描述包括在本发明的理解中可能有用的信息。这并不承认在此提供的任何信息是现有技术或与目前要求的发明相关，并且不承认所明确或隐含地引用的任何公开物是现有技术。

对于植物人工染色体的简要介绍

植物人工染色体被广泛认为是用于作物改进的转化载体的未来发展方向。原则上，它们可以避免与通过TDNA转化植物来制备转基因作物相关的多种主要问题。也就是说，在一个人工染色体上，新基因没有在它们可以引起新的突变处插入到基因组中，新基因具有一致的遗传背景从而它们的表达是更加均一的，并且与一次加入一个基因不同，一次可以加入多个基因。

一个人工染色体通常具有三个部分-一个着丝粒，一个基因盒、以及染色体终端，这样使得整个的人工染色体通常贯穿有丝分裂和减数分裂。

任何人工染色体的一个具有挑战性的特征是着丝粒。着丝粒是非常大的并且不具有可以用于保证激活的一致的序列特征。两种现存的人工染色体方法遵循“自上而下”或“自底向上”策略用于采用着丝粒。在自上而下方法中，将一个染色体通过染色体终端截短来切削，并且向新的更小的染色体中加入位点特异性重组位点。在“自底向上”策略中，将已知的着丝粒序列克隆到一个载体中，该载体最终被处理，更像一个质粒。这两种方法的局限性在于它们依赖于天然着丝粒，天然着丝粒在若干水平上是固有地不稳定的。这种自上而下法产生了不良地传送的染色体(Yu等人，Proc Natl Acad Sci US A 104(21)：8924-9(2007))并且这种自底向上策略似乎是不可预知的并且视为是质疑的(Ananiev等人，Chromosoma 118(2)：157-77(2009)；Carlson et al.PLoS Genet 3(10)：1965-74(2007))。或许自上而下和自底向上这两种策略的最有问题的特征是不能确定无疑地知道载体的序列。

概述

一些实施方案包括一种工程化的着丝粒，该着丝粒具有一个DNA序列的串联重复序列，该DNA序列可以包括对于一个或多个DNA结合蛋白的一个或多个结合基序，其中这一个或多个结合基序允许一个或多个融合蛋白的结合，这些融合蛋白包含该DNA结合蛋白以及一个动粒蛋白以激活该工程化的着丝粒。该融合蛋白可以进一步包括一个核定位信号，例如对于PKKRKV的一个核定位信号。该融合蛋白可以进一步包括一个表位识别序列。该表位识别序列可以包括但不局限于HA附加表位YPYDVPDYA的多聚体。

在一些实施方案中，该DNA序列可以具有对于一个或多个DNA结合蛋白的一个或多个结合基序。一些实施方案包括具有以下DNA结合基序的一个DNA序列：TetR(SEQ ID NO.1)、CENP-B盒(SEQ ID NO.2)、LacO(SEQ ID NO.3)、LexA(SEQID NO.4)、或GaW(SEQ ID NO.5)。一些实施方案包括具有以下DNA结合基序的组合的一个DNA序列：TetR(SEQ ID NO.1)、CENP-B盒(SEQ ID NO.2)、LacO(SEQ ID NO.3)、LexA(SEQ ID NO.4)、或Gal4(SEQ ID NO.5)。在这一个或多个结合基序之间，该DNA序列可以具有填充核酸残基。该填充核酸残基可以是但不局限于长度大约5-50bp，或50bp或更长。一些实施方案包括具有该DNA序列的串联重复序列的一个DNA分子，该DNA序列具有对于一个或多个DNA结合蛋白的一个或多个结合基序。

一些实施方案包括一种工程化的着丝粒，这种工程化的着丝粒具有SEQ ID NO.6中所列出的一个DNA序列的串联重复序列。

在一些实施方案中，这种工程化的着丝粒可以具有至少500个串联重复序列。在其他实施方案中，这种工程化的着丝粒可以具有至少1000个串联重复序列。在一些实施方案中，该DNA结合蛋白可以包括LacI、LexA、Gal4、TetR、CENP-B、或其片段。在其他实施方案中，DNA结合蛋白可以是LacI、LexA、Gal4、TetR、CENP-B、及其片段的组合。在一些实施方案中，可以将一个或多个动粒蛋白融合到一个或多个DNA结合蛋白上。在某些实施方案中，这一个或多个DNA结合蛋白可以是由SEQ ID.NO.7编码的一种多肽、由SEQ ID NO.8编码的一种多肽的氨基酸1-72、由SEQ ID NO.9编码的一种多肽的氨基酸1-74、由SEQ ID NO.10编码的一种多肽的氨基酸1-206、由SEQ ID NO.11编码的一种多肽的氨基酸1-205、及其组合。在一些实施方案中，这一个或多个动粒蛋白可以是CENH3、CENP-C、MIS12、CENP-H、CENP-O/MCM21、NDC80、SPC24、CENP-A/CENH3、CENP-S、CENP-T、NNFl、NUF2、SPC25、或其片段或组合。

一些实施方案包括一种激活一种人工着色粒的方法，该方法通过提供一种人工着丝粒并且使该人工着丝粒与一个或多个融合蛋白进行接触。该融合蛋白或这些融合蛋白可以包括一个或多个DNA结合蛋白以及一个或多个动粒蛋白，由此这一个或多个融合蛋白的DNA结合蛋白部分可以结合到这种工程化的着丝粒上并且形成了一个动粒。

一些实施方案包括一种植物人工染色体(AC)，它包括这种工程化的着丝粒。

一些实施方案包括一种转基因植物，这种转基因植物具有一种包括这种工程化的着丝粒的人工染色体(AC)。在一些实施方案中，这种转基因植物AC可以表达一个或多个融合蛋白，这些融合蛋白可以包括一个或多个DNA结合蛋白和一个或多个动粒蛋白。在一些实施方案中，这种转基因植物AC可以包括能够表达一个或多个融合蛋白的一个核酸分子，这些融合蛋白可以包括一个或多个DNA结合蛋白和一个或多个动粒蛋白。一些实施方案包括一种携带这种包括工程化的着丝粒的人工染色体(AC)的种子。

一些实施方案包括一种系统，该系统包括一种工程化的着色粒，这种工程化的着丝粒包括一个DNA序列的串联重复序列，该DNA序列具有对于一个或多个DNA结合蛋白的一个或多个结合基序以及在这一个或多个结合基序之间的一个或多个填充核酸残基、以及表达一个或多个融合蛋白的一个或多个核酸，这些融合蛋白包括一个或多个DNA结合蛋白和一个或多个动粒蛋白。这一个或多个结合基序可以允许这一个或多个融合蛋白的结合以激活这种工程化的着色粒以形成一个动粒。该融合蛋白可以进一步包括一个核定位信号，例如对于PKKRKV的一个核定位信号。该融合蛋白可以进一步包括一个表位识别序列。该表位识别序列可以包括但不局限于HA附加表位YPYDVPDYA的多聚体。

一些实施方案包括一种系统，该系统包括一个DNA序列，该DNA序列可以具有对于一个或多个DNA结合蛋白的一个或多个结合基序。这些DNA结合基序可以是但不局限于：TetR(SEQ ID NO.1)、CENP-B盒(SEQ ID NO.2)、LacO(SEQ IDNO.3)、LexA(SEQ ID NO.4)、或GaW(SEQ ID NO.5)。这些DNA结合基序可以是以下的DNA结合基序的组合：TetR(SEQ ID NO.1)、CENP-B盒(SEQ IDNO.2)、LacO(SEQ ID NO.3)、LexA(SEQ ID NO.4)、或Gal4(SEQ ID NO.5)。在这一个或多个结合基序之间，该DNA序列可以具有填充核酸残基。该填充核酸残基可以是但不局限于长度大约5-50bp，或50bp或更长。一些实施方案包括具有该DNA序列的串联重复序列的一个DNA分子，该DNA序列具有对于一个或多个DNA结合蛋白的一个或多个结合基序。

在一些实施方案中，该系统包括一种工程化的着丝粒，这种工程化的着丝粒具有SEQ ID NO.6中列出的一个DNA序列的串联重复序列。

在一些实施方案中，这种工程化的着丝粒可以具有至少500个串联重复序列。在其他实施方案中，这种工程化的着丝粒可以具有至少1000个串联重复序列。在一些实施方案中，该DNA结合蛋白可以包括LacI、LexA、Gal4、TetR、CENP-B、或其片段。在其他实施方案中，这些DNA结合蛋白可以是LacI、LexA、Gal4、TetR、CENP-B、及其片段的组合。在一些实施方案中，可以将一个或多个动粒蛋白融合到一个或多个DNA结合蛋白上。在某些实施方案中，这一个或多个DNA结合蛋白可以是由SEQ ID.NO.7编码的一种多肽、由SEQ ID NO.8编码的一种多肽的氨基酸1-72、由SEQ ID NO.9编码的一种多肽的氨基酸1-74、由SEQ ID NO.10编码的一种多肽的氨基酸1-206、由SEQ ID NO.11编码的一种多肽的氨基酸1-205、及其组合。在一些实施方案中，这一个或多个动粒蛋白可以是CENH3、CENP-C、MIS12、CENP-H、CENP-O/MCM21、NDC80、SPC24、CENP-A/CENH3、CENP-S、CENP-T、NNFl、NUF2、SPC25、或其片段或组合。

一些实施方案包括一种使用这种植物人工染色体通过加入复基因来合成一个大分子的方法。在一些实施方案中，可以合成一种人工染色体；引入一个或多个补充构建体；并且通过共表达一个或多个融合蛋白来激活经转化的人工染色体，这些融合蛋白包括一个或多个DNA结合蛋白和一个或多个动粒蛋白。在一些实施方案中，这种人工染色体可以通过全基因合成来合成。

附图简要说明

在引用的附图中阐述了示例性实施方案。在此披露的实施方案和附图旨在被认为是说明性的而不是限制性的。

根据在此的一个实施方案，图1描述了排列的结合位点(Arrayed Binding Sites，ABS)阵列的产生，它们成功转化到玉米中，并且证实了它们募集了与一个荧光标记融合的DNA结合蛋白LacI。

A)ABS阵列的结构。显示了三个连续的单体。每个单体含有对于LacI、LexA和Gal4的结合位点。

B)使用重叠引物产生ABS阵列。

C)ABS PCR产物不进入一个琼脂糖凝胶中并且用Ndel消化。

D)通过DNA印记测定两个ABS玉米品系。HindIII在阵列中没有切割，而Ndel切割了。ABS-ch3具有最长的阵列；ABS-ch7具有最小的。这些阵列是串联的并且是连续的。

E)在粗线期ABS-ch7的FISH分析。检测到一个单一的亮的插入点(箭头1)。在它附近的绿斑点(箭头2)展示了染色体7上的着丝粒。

F)在有丝分裂中期的ABS-ch3的FISH分析。在染色体3L上存在一个单一的插入中臂(mid-arm)。来自红的ABS基因座(加框的区域)的信号比从主着丝粒重复序列CentC检测到的绿色信号更亮。

G)证明ABS募集了LacI。一个LacI-YFP蛋白当在ABS-ch3基因座(箭头)处系住时更亮地发荧光。

详细说明

如同全部描述的，将在此所引用的所有公开物通过引用以其整体结合在此。除非另外指明，在此使用的技术和科学术语具有与本发明所属于的领域的普通技术人员所通常理解的相同的含义。Singleton等人，Dictionary of Microbiology and MolecularBiology 3red.，J.Wiley and Sons(纽约，NY 2001)；March，Advanced Organic ChemistryReactions，Mechanisms and Structure 5^th ed.，J.Wiley and Sons(纽约，NY 2001)；以及Sambrook和Russel，Molecular Cloning：A Laboratory Manual 3rd ed.，Cold SpringHarbor Laboratory Press(冷泉港，NY 2001)，向本领域普通技术人员提供了本申请中使用的多个术语的总体指导。

在本披露的帮助下，本领域的普通技术人员将理解与在此披露的那些类似或等同的方法和材料，这些方法和材料可以用在本发明的实践中。的确，本发明决不仅限于本申请在此具体所述的那些方法、材料、应用、和目的。

动粒栓系(kinetochore tethering)概念

本披露涉及一种设计人工染色体载体的方式。不是依赖于现有的着丝粒，而是采用一种完全合成的系统，该系统避免了着丝粒的不稳定性，通过实施一个遗传决定方法。这是一个双组分系统，含有工程化的着丝粒以及被设计用来激活这些着丝粒的蛋白。这些工程化的着丝粒含有长阵列的具有已知DNA结合基序的重复序列。这些DNA结合基序的例子列于表1中。这些激活蛋白是已经或可以融合到这些DNA结合蛋白上的关键的动粒蛋白，这些DNA结合蛋白结合到合成的着丝粒上。栓系的蛋白，单独的亦或组合的，募集了其余的动粒并且支持了染色体分离。这个或这些DNA结合蛋白(在此也称为结合模块)可以是但不局限于表2中列出的蛋白。这些动粒蛋白可以是但不局限于表3A和表3B中列出的那些。原则上，结合到一个已知基序(来自任何物种)上的任何DNA结合模块能以这种方式使用。

表1.DNA结合基序.

表2.DNA结合蛋白.

该DNA结合分子可以是但不局限于LacI、LexA、TetR、Gal4、或CENP-B。该DNA结合分子可以是衍生自例如大肠杆菌、人、酵母、或其他物种。在一些实施方案中，保留了DNA结合模块的蛋白序列，并且编码DNA序列被改变用来体现对于玉米的最优密码子使用。由于原核生物缺少一个核被膜，可以将一个核定位信号加入到这些融合蛋白上以确保这些蛋白可以被输入到植物细胞核中。在一些实施方案中，该核定位信号可以是对于PKKKRKV或其他。在一些实施方案中，可以加入表位识别序列。这个表位识别序列可以是但不局限于HA附加表位YPYDVPDYA的多聚体。

在一些实施方案中，可以使用上述序列的修改型和/或变体以及表1和表2中列出的那些，其中这些修改和/或变体可以包括长度改变。对于结合基序的核酸的数目可以是：至少10个、或至少11个、或至少12个、或至少13个、或至少14个、或至少15个、或至少16个、或至少17个、或至少18个、或至少19个、或至少20个、或至少21个、或至少22个、或至少23个、或至少24个或至少25个、或更多。该结合蛋白的氨基酸数可以是：至少20个、或至少30个、或至少40个、或至少50个、或至少60个、或至少70个、或至少80个、或至少90个、或至少100个、或至少110个、或至少120个、或至少130个、或至少140个、或至少150个、或至少160个、或至少170个、或至少180个、或至少190个、或至少200个或更多。这些残基变体可以是例如保守性替换、通常替换、以及其他。这些修改型和变体可以是天然发生的变体，例如来自其他物种。

表3A.动粒蛋白-如所述的由SEQ ID NO.编码

蛋白	登陆号	SEQ ID NO.
			CENH3/CENP-A	AF519807	12
CENP-C	AF129857	13
			MIS12	FJ971487	14
CENP-o/MCM21	BT024183	15
			NDC80	EU971283	16
CENP-S	EU966192	17
			CENP-T	BT041097	18

NNF1	EC890639	19
			NUF2	BT040808	20
SPC21	(预测的基因，maizegdb.org)

表3B.人类动粒蛋白以及它们的可能的同源物(Cheeseman and Desai，Mol CellBiol(2008))

在一些实施方案中，可以使用由以上序列以及表3A和表3B中列出的那些所编码的多肽或蛋白的修改型和/或变体，其中这些修改和/或变体可以包括长度改变。氨基酸数可以是：至少20个、或至少30个、或至少40个、或至少60个、或至少100个、或至少200个、或至少300个、或至少400个、或至少500个、或至少600个、或至少700个、或至少800个、或至少900个、或至少1000个、或至少1200个、或至少1400个、或至少1600个、或至少1800个、或至少2000个或更多。这些残基变体可以是例如保守性替换、通常替换、以及其他。这些修改型和变体可以是天然发生的变体，例如来自其他物种。

着丝粒

本发明的一些实施方案提供了一个DNA序列，该DNA序列包括对于一个或多个DNA结合蛋白(在此也称为结合模块)的结合基序。这些结合基序是DNA结合蛋白所结合的DNA区域。贯穿本说明书中，这些结合基序还可以称为一个DNA结合位点。在某些实施方案中，这一个或多个DNA结合基序可以选自下组，该组的构成为：TetR(SEQ ID NO.1)、CENP-B盒(SEQ ID NO.2)、LacO(SEQ ID NO.3)、LexA(SEQ ID NO.4)、Gal4(SEQ ID NO.5)、及其组合。

在某些实施方案中，在结合位点之间，该DNA序列包括填充核酸残基。在不同的实施方案中，这些填充核酸残基可以是但不局限于50bp或更长的。在其他实施方案中，这些填充核酸残基长度是大约5-50bp。在其他实施方案中，这些填充核酸残基长度是大约5、10、15、20、25、30、35、40或50bp。在仍然其他的实施方案中，这些填充核酸残基长度是大约12到13bp。

在某些实施方案中，该DNA序列可以是SEQ ID NO.6。在其他实施方案中，该DNA序列可以是160bp到180bp。在其他实施方案中，该DNA序列的大小可以是157bp的分数或倍数。碱基对的数目157bp是一个核小体的单绕式，以及玉米着丝粒重复的大小。

在一些实施方案中，碱基对的数目可以是对应于一种除玉米之外的选定的物种的着丝粒重复长度的碱基对数目的分数或倍数。

本发明的一些实施方案提供了一个DNA分子，该分子包括一个DNA序列的串联重复序列，该DNA序列包括对于一个或多个DNA结合蛋白的结合基序。在一些实施方案中，该DNA分子包括一个DNA序列的至少100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、或1500个串联重复，该DNA序列包括对于一个或多个DNA结合蛋白的结合基序。在一些实施方案中，该DNA分子包括一个DNA序列的至少500个串联重复，该DNA序列包括对于一个或多个DNA结合蛋白的结合基序。在一些实施方案中，该DNA分子包括一个DNA序列的至少1000个串联重复，该DNA序列包括对于一个或多个DNA结合蛋白的结合基序。在某些实施方案中，这一个或多个DNA结合基序可以选自下组，该组的构成为：TetR(SEQ ID NO.1)、CENP-B盒(SEQ ID NO.2)、LacO(SEQ ID NO.3)、LexA(SEQID NO.4)、Gal4(SEQ ID NO.5)、及其组合。

在某些实施方案中，包括对于一个或多个DNA结合蛋白的结合基序的DNA序列是SEQ ID NO.6。因此，在某些实施方案中，该DNA分子包括SEQ ID NO.6的串联重复序列。

在此披露的一些实施方案涉及一种人工着丝粒。在不同的实施方案中，包括一个DNA序列的串联重复序列的DNA分子是这种人工着丝粒，该DNA序列包括对于一个或多个DNA结合蛋白的结合基序。

在此描述的一些实施方案提供了激活一种人工着丝粒的一种方法。该方法可以包括：提供在此所述的一种工程化的着丝粒；并且将这种工程化的着丝粒与一个或多个融合蛋白进行接触，这些融合蛋白包括一个或多个DNA结合蛋白以及一个或多个动粒蛋白，由此这一个或多个融合蛋白的DNA结合蛋白部分结合到工程化的着丝粒上并且形成了一个动粒。要求关键的内部动粒蛋白例如像CENH3和CENPC募集所有其他的在成熟动粒中的蛋白，由于当这样的蛋白不存在时，所有其他的动粒蛋白不能定位。所述的系统被设计用来适应该动粒形成过程的完全复杂性。由于该构架(即具有结合基序的DNA序列)支撑多个结合位点(即结合基序)，该动粒募集过程可以被定制并优化。

在一些实施方案中，这一个或多个DNA结合蛋白可以选自表2。在某些实施方案中，这一个或多个动粒蛋白可以选自表3A和表3B。在某些实施方案中，该融合蛋白可以被配置用来使该DNA结合蛋白与该着丝粒结合。

一些实施方案包括一个系统，该系统包括一种工程化的着丝粒，这种工程化的着丝粒包括一个DNA序列的串联重复序列，该DNA序列具有对于一个或多个DNA结合蛋白的一个或多个结合基序以及在这一个或多个基序各自之间的一个或多个填充核酸残基、以及表达一个或多个融合蛋白的一个或多个核酸，这些融合蛋白包括一个或多个DNA结合蛋白以及一个或多个动粒蛋白。这一个或多个结合基序可以允许这一个或多个融合蛋白的结合以激活这种工程化的着丝粒从而形成一个动粒。该融合蛋白可以进一步包括一个核定位信号，例如对于PKKRKV的一个核定位信号。该融合蛋白可以进一步包括一个表位识别序列。该表位识别序列可以包括但不局限于HA附加表位YPYDVPDYA的多聚体。

一些实施方案包括一种系统，该系统包括一个DNA序列，该DNA序列具有对于一个或多个DNA结合蛋白的一个或多个基序。该DNA结合基序可以是但不局限于：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、或SEQ ID NO.5。该DNA结合基序可以是DNA结合基序TetR(SEQ ID NO.1)的组合，或其组合。在这一个或多个结合基序各自之间，该DNA序列可以具有填充核酸残基。该填充核酸残基可以是但不局限于长度大约5-50bp、或50bp或更长。

在一些实施方案中，该系统包括一种工程化的着丝粒，这种工程化的着丝粒具有如SEQ ID NO.6中列出的一个DNA序列的串联重复序列。

在一些实施方案中，该系统包括一种工程化的着丝粒，这种工程化的着丝粒具有至少500个串联重复。在其他实施方案中，该系统可以包括一种工程化的着丝粒，这种工程化的着丝粒具有至少1000个串联重复。在一些实施方案中，该系统可以具有DNA结合蛋白例如像LacI、LexA、Gal4、TetR、CENP-B或其片段。在其他实施方案中，在该系统中的DNA结合蛋白可以是LacI、LexA、Gal4、TetR、CENP-B或其片段的组合。在一些实施方案中，该系统中的一个或多个动粒蛋白可以与一个或多个DNA结合蛋白进行融合。在某些实施方案中，该系统的一个或多个DNA结合蛋白可以是由SEQ ID.NO.7编码的一种多肽、由SEQ ID NO.8编码的一种多肽的氨基酸1-72、由SEQ ID NO.9编码的一种多肽的氨基酸1-74、由SEQ ID NO.10编码的一种多肽的氨基酸1-206、由SEQ ID NO.11编码的一种多肽的氨基酸1-205、或其组合。在一些实施方案中，该系统中的一个或多个动粒蛋白可以是：CENH3、CENP-C、MIS 12、CENP-H、CENP-O/MCM21、NDC80、SPC24、CENP-A/CENH3、CENP-S、CENP-T、NNFl、NUF2、SPC25、及其片段和组合。

一些实施方案包括一种使用该植物人工染色体通过加入复基因来合成一个大分子的方法。在一些实施方案中，可以合成一个人工染色体，引入一个或多个募集构建体，并且通过共表达一个或多个融合蛋白来激活经转化的人工染色体，这些融合蛋白包括一个或多个DNA结合蛋白和一个或多个动粒蛋白。在一些实施方案中，该人工染色体可以通过全基因合成来合成。

在此披露的一些实施方案涉及产生人工着丝粒的方法。一些实施方案涉及产生含有对于DNA结合蛋白的结合位点的序列，并且将这些序列扩增成排列的结合位点(ABS)。扩增可以通过例如重叠PCR以及其他多聚化方法来实现。如在此所使用的，大约指示了它描述的值的±20％变化。应理解到，在此所述的特定尺寸是用于说明性的目的并且不旨在限制本发明的范围。仅仅通过举例，得到的PCR产物可以是至少约50kb、或至少大约75kb、或至少大约100kb、或至少大约125kb、或至少大约150kb、或至少大约175kb、或至少大约200kb、或至少大约225kb、或至少大约250kb、或至少大约275kb、或至少大约300kb、或至少大约350kb、或至少大约400kb或更长。在一些实施方案中，PCR产物是唯一由ABS阵列组成的。

在一些实施方案中，将金属球用PCR产物和一种标记质粒进行涂覆，并且转化玉米愈伤组织。这种转化可以使用标准的生物弹射击法或其他方法如农杆菌介导的转化或T-DNA来进行。在一些实施方案中，将这些PCR产物插入到植物基因组中的单一位点处。在一些实施方案中，该植物可以是玉米。

在一些实施方案中，这种工程化的着丝粒可以包含具有表1的一个或多个DNA结合基序的重复序列的阵列。在一些实施方案中，通过表2的DNA结合蛋白，这些动粒蛋白被栓系到ABS阵列上。这些动粒蛋白可以单独栓系或组合栓系。这种动粒蛋白复合体可以包含表3A或3B中的一个或多个蛋白。

在一些实施方案中，该构建体可以是一种三蛋白嵌合体，含有融合到一个N端尾上的一个结合模块以及一个植物组蛋白变体核区域。这个N端可以被一个允许使用一种组蛋白抗体的序列代替。这种嵌合体组蛋白可以结合到该ABS位点上并且募集天然组蛋白以形成一种着丝粒状态。在栓系的蛋白通过分离而去除后，这种着丝粒状态可以是稳定的。例如在一些实施方案中，该构建体可以是一种三蛋白嵌合体，含有融合到一个燕麦N端尾上的一个Gal4结合模块以及一个玉米CENH3(着丝粒组蛋白H3)组蛋白核区域。该N端可以例如被一个允许使用一种燕麦CENH3抗体的燕麦序列代替。该嵌合体CENH3可以结合到该ABS位点上并且募集天然CENH3以形成一种着丝粒状态。在栓系的蛋白通过分离而去除后，这种着丝状态可以是稳定的。

在一些实施方案中，可以使用着丝粒蛋白C(CENPC)来募集CENH3到DNA，使用一种栓系构建体例如像一个Lac 1-CENPC栓系构建体。在一些实施方案中，与一个LexA结合模块融合的微型染色体不稳定性12(MIS 12)能以一种类似的方式来使用以募集CENH3、CENPC、或足以使栓系位点处的动粒成核的其他蛋白。

在一些实施方案中，通过将各蛋白融合到不同的DNA结合模块上，可以使用两个或更多个蛋白的组合，从而转基因品系的杂交导致了相同ABS阵列上的蛋白的组合。在一些实施方案中，可以将CENH3和CENPC一起使用以募集整个动粒复合体。在一些实施方案中，可以将CENH3、CENPC、以及MIS 12、或这些的组合和/或其他蛋白在相同的ABS位点处组合以赋予最多的动粒功能。不希望受理论约束，认为这些蛋白结合到该ABS上并且相信会发生动粒激活。

人工染色体

在此披露的一些实施方案提供了一种人工染色体，这种人工染色体包括本发明的人工着丝粒。

用于产生人工染色体的方法在本领域是已知的。参见例如Carr等人，Nat Biotech27，1151-1162(2009)for artificial full gene synthesis，Carlson等人，PLoS Genet 3：1965-1974(2007)以及Ananiev等人，Chromosoma 118：157-77(2009)。因此，可以使用本领域已知的方法并且使用本发明的人工着丝粒来制备一种人工染色体。在不同实施方案中，本发明的人工着丝粒可以用来代替合成一种人工染色体的已知方法中所描述的着丝粒。

在此披露的一些实施方案提供了产生一种人工染色体的一种方法，这种人工染色体包括本发明的人工着丝粒。在不同的实施方案中，该方法可以涉及将栓系位点合并到一个现存的染色体中，这样使得在栓系位点处的动粒形成产生了一种人工第二着丝粒，这种人工第二着丝粒可以引起染色体破裂并且形成一种新的染色体，这种新的染色体仅通过这种人工着丝粒来分离。

在其他实施方案中，该方法可以包括转化一种大的工程化的圆形分子，这种分子能够独立地分离而没有对于端粒的需要。以此方式转化的一种人工染色体可以包括工程化的基因。

在其他实施方案中，该方法可以包括转化一种染色体，这种染色体包括一种人工着丝粒、一个或多个感兴趣的基因、以及一个或多个端粒。在其他实施方案中，该方法可以包括设计一种具有如所述的端粒的玉米人工染色体的方法(Ananiev等人，Chromosoma.118：157-77(2007))。在其他实施方案中，该染色体可以是玉米中的一种圆形人工染色体(Carlson等人，PLoS Genet.3：1965-1974(2007))。在仍然其他的实施方案中，该染色体可以用于玉米人工染色体的一般性应用(Carlson等人，PLoS Genet.3：1965-1974(2007))。

在一些实施方案中，所形成的人工染色体可以与天然染色体在结构上类似并且在功能上类似，例如像通过有丝分裂和减数分离的精确分离。在一些实施方案中，这种着丝粒可以是本发明的着丝粒并且其他组分例如像基因和端粒可以被工程化从而与天然组分尽可能地类似。

转基因种子

一些实施方案涉及携带在此所述的一种人工染色体的一种转基因种子。在不同的实施方案中，一种转基因种子包括一种人工染色体，这种人工染色体包括在此所述的人工着丝粒。在一些实施方案中，这种转基因种子进一步包括能够表达在此所述的融合蛋白的核酸以激活这种人工着丝粒。

转基因植物

一些实施方案涉及一种表达在此所述的人工染色体的转基因植物。在一些实施方案中，该染色体包括在此所述的人工着丝粒。在一些实施方案中，该转基因植物进一步包括能够表达在此所述的融合蛋白的核酸以激活这种人工着丝粒。在一些实施方案中，这种转基因植物可以是玉米。

一些实施方案包括通过使用一种植物人工染色体来实现玉米改进的方法。例如，改进产量的基因赋予耐盐性、赋予耐旱性、赋予耐昆虫性、或将其他有益的农业学性状单独或组合地加入含有一种人工着丝粒的分子中。

通过以下实例进一步描述本申请的实施方案

实例

提供了以下非限制性实例以进一步阐述本发明的实施方案。本领域的普通技术人员应该理解到，以下这些实例中披露的技术代表了本发明诸位发明人发现的在本申请的实践下良好地起作用的方法，并且因此可以被认为构成了用于其实践的模式的实例。对于提到的特定材料的程度，仅用于说明性的目的而不旨在限制本发明。鉴于本披露，本领域的普通技术人员应当理解到，在不偏离本申请的精神和范围下，在所披露的特定的实施方案中可以进行多种改变并且仍然获得相似的或类似的效果。

实例1A：制备一种工程化的着丝粒。

产生了一个156bp的序列，该序列含有对于四个不同的DNA结合模块(Lacl、Gal4、LexA、以及TetR)的多个结合位点，已知它们各自栓系了植物中的蛋白(Matzke等人，Plant Molecular Biology Reporter 21(1)：9-19(2003)；Matzke等人，Plant Physiology139(4)：1586-1596(2005)；Bohner等人，Plant J19(1)：87-95(1999)；Zuo等人，CurrentOpinion in Biotechnology 11(2)：146-151(2000)；Zuo等人，Methods MoI Biol 323：329-42(2006))。为了将该单体多聚化，通过重叠PCR，将这些扩增成长的排列的结合位点(称为ABS)(图1)。以这种方式产生了唯一由ABS阵列组成的长度＞200kb的PCR产物。然后将金属球用该PCR产物和一种标记质粒进行涂覆，并且通过标准的生物弹射击法转化玉米愈伤组织。在三个得到的转基因品系中，将这些PCR产物完整地插入到玉米基因组中的单一位点处。该ABS基因座是遗传上稳定的并且测量其大小是大约100到200kb，最大的包括大概1300个拷贝的ABS单体(如通过qPCR所测量的)。ABS-ch3、ABS-ch4、和ABS-ch7分别位于染色体3、4和7上。还测试了该系统用于证实它可以用于栓系一个蛋白。将一个Lacl-YFP融合蛋白转化到玉米中、与ABS品系杂交并且对子代记分。在ABS-ch3和Lacl-YFP杂交体中，可以看到单一的大的荧光斑点(图1)。这些数据确立了我们的栓系系统是起作用的。

实例1B：制备一种工程化的着丝粒。

产生了一个157bp的序列(SEQ ID NO.6)，该序列含有对于五个不同的DNA结合模块(Lacl、Gal4、LexA、TetR以及CENP-B)的多个结合位点，已知它们中的前四个栓系了植物中的蛋白(Matzke等人，Plant Molecular Biology Reporter 21(1)：9-19(2003)；Matzke等人，Plant Physiology 139(4)：1586-1596(2005)；Bohner等人，Plant J19(1)：87-95(1999)；Zuo等人，Current Opinion in Biotechnology 11(2)：146-151(2000)；Zuo等人，Methods MoI Biol 323：329-42(2006))。为了将该单体多聚化，通过重叠PCR，将这些扩增成长的排列的结合位点(称为ABS)(图1)。以这种方式产生了唯一由ABS阵列组成的长度＞200kb的PCR产物。然后将金属球用该PCR产物和一种标记质粒进行涂覆，并且通过标准的生物弹射击法转化玉米愈伤组织。在三个得到的转基因品系中，将这些PCR产物完整地插入到玉米基因组中的单一位点处。该ABS基因座是遗传上稳定的并且测量其大小是大约100到200kb，最大的包括大概1300个拷贝的ABS单体(如通过qPCR所测量的)。ABS-ch3、ABS-ch4、和ABS-ch7分别位于染色体3、4和7上。还测试了该系统用于证实它可以用于栓系一个蛋白。将一个Lacl-YFP融合蛋白转化到玉米中、与ABS品系杂交并且对子代记分。在ABS-ch3和Lacl-YFP杂交体中，可以看到单一的大的荧光斑点(图1)。这些数据确立了我们的栓系系统是起作用的。

实例2：栓系CENH3、CENPC、以及MISl 2.

通过以下方法将三种动力蛋白单独或组合栓系到ABS阵列上。A)着丝粒组蛋白H3。CENH3是一种组蛋白变体并且导致自身栓系，具有一个可替换的长的N端尾。所采用的构建体是一种三蛋白嵌合体，它含有融合到一个燕麦N端尾上的一个Gal4结合模块以及一个玉米CENH3组蛋白核区域(Zhong等人，Plant Cell 14：2825-2836(2002))。用燕麦序列代替N端允许了使用一种燕麦CENH3抗体。该嵌合体CENH3可以结合到该ABS位点上并且募集天然CENH3以形成一种着丝粒状态，在栓系的蛋白通过分离而去除后，这种着丝状态可以是稳定的。B)着丝粒蛋白C。CENPC在玉米着丝粒组装体中具有重要作用，并且涉及募集CENH3到DNA(Dawe等人，Plant Cell11(7)：1227-1238(1999)；Erhardt等人，JCell Biol 183：805-818(2008))。采用一种Lacl-CENPC栓系构建体。C)微型染色体不稳定性12。MIS 12是玉米中一种重要的微管蛋白结合面，调节了与微管的相互作用(Li等人，Nat Cell Biol(2009))。采用一种LexA-MIS12栓系构建体。MIS 12单独可以赋予染色体分离。D)蛋白的组合。将每个蛋白融合到不同的DNA结合模块中，从而转基因品系的杂交导致了蛋白组合在相同的ABS阵列中。CENH3和CENPC一起可以募集整个动粒复合体。通过在相同的ABS位点处组合CENH3、CENPC以及MIS 12，如果不是全部的话，赋予大多数动粒功能。不希望受理论约束，认为这些蛋白结合到ABS上并且与动粒激活相联系。

实例3：栓系的品系的细胞学和分子测定。

在ABS位点处重新产生的动粒活性产生了双着丝染色体(两个着丝粒在一个染色体上)，因为每个染色体还具有它的天然着丝粒。这种双着丝动粒活性可以在植物发育早期引起染色体破裂以及可见的破碎的染色体。由于在所有试验中这些ABS位点是杂合的，染色体破裂不影响植物活力或子代中染色体的恢复。得到了原则的双着丝活性组成证明的迹象。

实例4：应用动粒栓系

一种有用的人工染色体通过全基因合成来合成。在该人工染色体之内的人工着丝粒涉及多个排列的拷贝的单个或多个结合位点。这样一个构建体不需要通过重叠PCR来制备，其中每个单体是相同的，但是可以通过基因合成来制备。在结合位点之间的填充序列可以是随机的或可变的序列以协助人工染色体的构建。这种转化的人工染色体是通过共表达的栓系蛋白来激活的。然而，一旦一种人工着丝粒被激活，它不再需要栓系构建体以维持活性。该系统最初是在玉米中设计的但是该方法对于所有植物都通用，因为所有的组分是在体外工程化的。主要用途包括作物的改进以及药物蛋白的生产。

实例5：密码子优化

所选择的DNA结合模块是来自大肠杆菌(LacI、LexA、TetR)、酵母(GaW)以及人类(CENP-B)。这些物种的DNA结合模块的蛋白序列是保守性的，但是这些编码DNA序列被改变以反映对于玉米的优化的密码子使用。由于原核生物缺少一个核被膜，将一个核定位信号PKKKRKV加入到这些融合蛋白上以确保这些蛋白可以被输入到植物细胞核中。还可以加入表位识别序列如HA附加表位YPYDVPDYA的多聚体。

以上所述的不同方法和技术提供了进行该申请的多种方式。当然，应该理解到没有必要所述的所有目标和优点需要根据在此所述的任何具体实施方案来实现。因此，例如，本领域的普通技术人员将认识到，这些方法能以实现或优化在此所传授的一个优点或一组优点的方式来进行，而没有必要实现在此所传授或建议的其他目的或优点。在此提到了多种替代方案。应该理解到，一些优选地实施方案明确地包括一种、另一种或若干特征，而其他明确地排除一种、另一种或若干特征，而仍然其他通过包括一种、另一种或若干有利特征而缓和了一种具体特征。

此外，熟练的技工将认识到来自不同实施方案的不同特征的适用性。类似地，在此所述的不同的要素、特征和步骤、连同其他已知的对于每个此类要素、特征或步骤的等效物可以由本领域的普通技术人员以不同的组合使用以根据在此所述的原则执行这些方法。在不同的实施方案中，在不同的要素、特征和步骤中，一些是明确地被包括的并且其他是明确地被排除的。

虽然已经在某些实施方案和实例的背景下披露了本申请，本领域的普通技术人员应理解到，本申请的实施方案延伸过明确披露的实施方案到其他替代实施方案和/或用途及其变体和等效物。

在一些实施方案中，用于描述和要求本申请的特定实施方案的表达成分的量的数目、特性如分子量、反应条件等等应理解为是在一些情况下通过术语“大约”来改变。因此，在一些实施方案中，在书面说明和所附权利要求中陈述的数字参数是近似值，可以取决于通过一个具体实施方案寻求获得的所希望的特性而变化。在一些实施方案中，这些数字参数应当鉴于所报道的重要数字并且通过应用常规的舍入技术被理解。尽管阐明了本申请的一些实施方案的宽的范围的数字范围和参数是近似值，在具体实例中给出的数字值是尽可能精确地报道的。

在一些实施方案中，在描述本申请的一个具体实施方案的背景下(尤其是在某些以下权利要求的背景下)的术语“一个”和“一种”以及“这种”和类似的引用可以被理解为覆盖了单数和复数。在此的值的范围的引用仅仅旨在充当单独参考落入范围内的每个单个值的速记方法。除非在此另外指明，将每个单个的值合并到本说明书中，好像它是在此单独引用的。除非在此另外指明或通过上下文另外清晰地否定，在此所述的其他方法能以任何合适的顺序进行。除非另外要求，关于在此某些实施方案提供的任何以及所有实例或示例性语言(例如“如”)的使用仅仅旨在更好地说明本申请并且不对本申请的范围造成限制。在本说明书中没有语言应被理解为表示任何对于本申请的实践必要的非要求的要素。

在此描述了本申请的优选实施方案，包括本发明的诸位发明人用于进行本申请已知的最好模式。基于阅读上述发明，对于那些优选的实施方案的变体对于本领域的普通技术人员将变得显而易见。考虑到熟练技工可以酌情采用这些变体，并且本申请可以除在此具体描述之外被实践。因此，如通过适用法律所允许的，本申请的多个实施方案包括对此所附的权利要求中引用的主题的所有变体和等效物。此外，除非在此另外指明或通过上下文另外清晰地否定，在其所有可能变体中的上述要素的任何组合包括在本申请中。

在此参考的所有专利、专利申请、专利申请公开、以及其他材料如文章、书籍、说明书、出版物、文件、事物和/或类似物通过引用以其整体出于所有目的特此结合在此，除非与此有关的任何起诉文件历史、与本文件不一致或冲突的任何类似物、或与本文件现在或以后相关的关于说明书的最宽范围可能具有限制性影响的任何类似物。通过举例，在此在与任何合并的材料相关的以及与本文件相关的术语的说明、定义、和/或应用之间若存在任何不一致或冲突，在本文件中的说明、定义、和/或应用应该普遍。

最后，应理解到，本申请在此披露的实施方案说明了本申请的实施方案的原则。可以采用的其他变体可以在本申请的范围内。因此，通过举例，但不是限制，本申请的实施方案的替代结构可以根据在此传授的内容来应用。因此，本申请的实施方案不限于如所精确表示和描述的那些。

Claims

1.一种包括一个DNA序列的串联重复序列的工程化的着色粒，包括：

对于一个或多个DNA结合蛋白的一个或多个结合基序，其中这一个或多个结合基序允许一个或多个融合蛋白的结合，这些融合蛋白包括该DNA结合蛋白和一个动粒蛋白以激活这种工程化的着色粒。

2.如权利要求1所述的工程化的着色粒，其中该融合蛋白进一步包括一个核定位信号。

3.如权利要求2所述的工程化的着色粒，其中该核定位信号是对PKKRKV的核定位信号。

4.如权利要求1所述的工程化的着色粒，其中该融合蛋白进一步包括一个表位识别序列。

5.如权利要求4所述的工程化的着色粒，其中该表位识别序列包括HA附加表位YPYDVPDYA的多聚体。

6.如权利要求1所述的工程化的着色粒，其中这一个或多个DNA结合基序是选自下组，该组的构成为：TetR(SEQ ID NO.1)、CENP-B盒(SEQ ID NO.2)、LacO(SEQ ID NO.3)、LexA(SEQ ID NO.4)、Gal4(SEQ ID NO.5)，及其组合。

7.如权利要求1所述的工程化的着色粒，其中该DNA序列是SEQ ID NO.6。

8.如权利要求1所述的工程化的着丝粒，包括至少500个串联重复序列。

9.如权利要求1所述的工程化的着丝粒，包括至少1000个串联重复序列。

10.如权利要求1所述的工程化的着丝粒，其中这一个或多个DNA结合蛋白是选自下组，该组的构成为：LacI、LexA、Gal4、TetR、CENP-B、及其片段和组合。

11.如权利要求1所述的工程化的着丝粒，其中这一个或多个DNA结合蛋白是选自下组，该组的构成为：由SEQ ID.NO.7编码的一种多肽、由SEQ ID NO.8编码的一种多肽的氨基酸1-72、由SEQ ID NO.9编码的一种多肽的氨基酸1-74、由SEQ ID NO.10编码的一种多肽的氨基酸1-206、由SEQ ID NO.11编码的一种多肽的氨基酸1-205、及其组合。

12.如权利要求1所述的工程化的着丝粒，其中这一个或多个动粒蛋白是选自下组，该组的构成为：CENP-A/CENH3、CENP-C、MIS 12、CENP-O/MCM21、NDC80、CENP-S、CENP-T、NNFl、NUF2、SPC25、及其片段和组合。

13.一种激活一种人工着色粒的方法，包括：

提供如权利要求1所述的工程化的着丝粒；并且

将这种工程化的着丝粒与一个或多个融合蛋白进行接触，这些融合蛋白包括一个或多个DNA结合蛋白以及一个或多个动粒蛋白，由此这一个或多个融合蛋白的DNA结合蛋白部分结合到工程化的着丝粒上并且形成了一个动粒。

14.一种植物人工染色体(AC)，包括如权利要求1所述的工程化的着丝粒。

15.一种转基因植物，包括如权利要求14所述的人工染色体(AC)。

16.如权利要求15所述的转基因植物，其中该AC表达一个或多个融合蛋白，这些融合蛋白包括一个或多个DNA结合蛋白和一个或多个动粒蛋白。

17.如权利要求15所述的转基因植物，进一步包括一个核酸分子，该核酸分子能够表达包括一个或多个DNA结合蛋白和一个或多个动粒蛋白的一个或多个融合蛋白。

18.一种携带如权利要求14所述的人工染色体(AC)的种子。

19.一种系统，包括：

一种包括一个DNA序列的串联重复序列的人工着色粒，该DNA序列包括对于一个或多个DNA结合蛋白的一个或多个结合基序、以及

表达一个或多个融合蛋白的一个或多个核酸，这些融合蛋白包括这一个或多个DNA结合蛋白和一个或多个动粒蛋白，

其中这一个或多个结合基序允许这一个或多个融合蛋白的结合以激活这种工程化的着色粒以形成一个动粒。

20.如权利要求19所述的系统，其中该融合蛋白进一步包括一个核定位信号。

21.如权利要求20所述的系统，其中该核定位信号是对于PKKRKV。

22.如权利要求19所述的系统，其中该融合蛋白进一步包括一个表位识别序列。

23.如权利要求22所述的系统，其中该表位识别序列包括HA附加表位YPYDVPDYA的多聚体。

24.如权利要求19所述的系统，其中这一个或多个DNA结合基序是选自下组，该组的构成为：TetR(SEQ ID NO.1)、CENP-B盒(SEQ ID NO.2)、LacO(SEQ ID NO.3)、LexA(SEQ ID NO.4)、Gal4(SEQ ID NO.5)，及其组合。

25.如权利要求19所述的系统，其中该DNA序列是SEQ ID NO.6。

26.如权利要求19所述的系统，包括至少500个串联重复序列。

27.如权利要求19所述的系统，包括至少1000个串联重复序列。

28.如权利要求19所述的系统，其中这一个或多个DNA结合蛋白是选自下组，该组的构成为：LacI、LexA、Gal4、TetR、CENP-B、及其片段和组合。

29.如权利要求19所述的系统，其中这一个或多个DNA结合蛋白是选自下组，该组的构成为：由SEQ ID.NO.7编码的一种多肽、由SEQ ID NO.8编码的一种多肽的氨基酸1-72、由SEQ ID NO.9编码的一种多肽的氨基酸1-74、由SEQ ID NO.10编码的一种多肽的氨基酸1-206、由SEQ ID NO.11编码的一种多肽的氨基酸1-205、及其组合。

30.如权利要求19所述的系统，其中这一个或多个动粒蛋白是选自下组，该组的构成为：CENP-A/CENH3、CENP-C、MIS 12、CENP-O/MCM21、NDC80、CENP-S、CENP-T、NNFl、NUF2、SPC25、及其片段和组合。

31.一种使用该植物人工染色体通过加入复基因来合成一个大分子的方法，包括：

合成一个人工染色体；

引入一个或多个募集构建体；并且

通过共表达一个或多个融合蛋白来激活经转化的人工染色体，这些融合蛋白包括一个或多个DNA结合蛋白和一个或多个动粒蛋白。

32.如权利要求31所述的方法，其中该人工染色体是通过全基因合成来合成的。