CN111410683B - 杨树功能着丝粒组蛋白cenh3的抗原多肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开杨树功能着丝粒组蛋白CENH3的抗原多肽及其应用，属于生物信息学和分子细胞遗传学领域。该发明主要包括：筛选毛果杨CENH3蛋白特异的一段氨基酸序列并人工合成多肽，用该多肽免疫新西兰兔，制备抗血清，亲和纯化后得到CENH3蛋白抗体；抗体通过免疫荧光检测、ChIP‑FISH进行特异性验证，证明了该抗体可以准确识别功能着丝粒。该抗体可以在杨属树种中通用，不仅可以准确标记杨树功能着丝粒的位置，也为开展杨树着丝粒的结构、功能及进化研究奠定基础。本发明在杨树分子细胞遗传学、基因组学及表观组学等研究领域具有广阔的应用前景。

Description

杨树功能着丝粒组蛋白CENH3的抗原多肽及其应用

技术领域

本发明属于生物信息学及分子细胞遗传学领域，具体而言，涉及杨树功能着丝粒组蛋白CENH3的抗原多肽及其应用。

背景技术

着丝粒是真核生物细胞有丝分裂和减数分裂时，保障染色体稳定并正确分离的一个重要功能元件。着丝粒DNA由于含有大量的高度重复序列而加大了序列测定及分析的难度。快速发展的分子生物学技术、生物信息学分析方法及分子细胞遗传学技术在着丝粒研究中的综合运用，尤其是伴随着染色质免疫共沉淀技术(ChromatinImmunoprecipitation，ChIP)和高通量测序技术的应用，加速了人们对着丝粒结构、功能和进化关系的认识(樊起傅等，2017)。

着丝粒结构的一个显著特点是，该区域的组蛋白H3变异为CENH3(在哺乳动物中称作CENP-A)(Vafa et al.,1997)。CENH3蛋白是功能着丝粒的标志蛋白。目前主流研究植物着丝粒的核心实验流程是：首先制备能够识别功能着丝粒组蛋白CENH3的特异性抗体，然后通过ChIP技术富集着丝粒DNA，再利用高通量测序对富集的DNA进行测序分析(Szalkowskiet al.,2011)，最后结合荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)技术进行验证。利用该流程已成功进行了玉米(Wang et al.,2014)、紫云英(Tek et al.,2011)、马铃薯(Gong et al.,2012；Zhang et al.,2014)、棉花(Han et al.,2016)、莲藕(Zhu et al.,2016)、短柄草(Li et al.,2018)等物种的着丝粒研究，取得了一系列重大研究成果。

然而，已开展过着丝粒相关研究的植物种类多集中在草本植物，多年生林木还未见相关报道。杨树由于其自身的生物学特性及重要地位而成为林木研究的模式树种。2006年，美国科学杂志报道了毛果杨的全基因组测序结果(Tuskan et al.,2006)，胡杨、新疆杨的基因组测序结果也相继发表(Ma et al.,2013；Ma et al.,2019)。但杨树着丝粒含有大量的高度重复序列，这加大了着丝粒序列组装的难度，现有杨树基因组着丝粒的序列信息仍需完善。因此，迫切需要制备能够识别杨树功能着丝粒组蛋白CENH3的特异性抗体。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供杨树功能着丝粒组蛋白CENH3的抗原多肽，本发明所要解决的另一技术问题在于杨树功能着丝粒组蛋白CENH3的抗原多肽在杨属树种中的应用，为开展杨树着丝粒的结构、功能及进化研究奠定基础。

为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：杨树功能着丝粒组蛋白CENH3的抗原多肽，其氨基酸序列为MARTKHPVARKRARSPKRSD。

上述抗原多肽是根据毛果杨功能着丝粒组蛋白CENH3氨基酸序列N端的一段特异序列合成的一条多肽。

进一步的，所述杨树功能着丝粒组蛋白CENH3的抗原多肽在杨属树种中的应用。

进一步的，所述抗原多肽用于制备抗体。

一种制备上述抗体的方法：将抗原多肽偶联到蛋白载体上，常规免疫新西兰兔，4免后从兔颈动脉取血收集血清，血清过抗原亲和柱后收集兔源多克隆抗体。

一种验证上述抗体的方法，包括免疫荧光检测或ChIP-FISH。

上述验证抗体的方法，若所述方法为免疫荧光检测，则所述方法包括如下步骤：根尖固定、染色体制片、一抗孵育、二抗孵育、封片、镜检。

上述验证抗体的方法，若所述方法为ChIP-FISH，则所述方法包括如下步骤：杨树细胞核提取及纯化、染色质酶切及检验、染色质预处理、抗体孵育、rProteinA琼脂糖珠子的清洗和孵育、抗体染色质复合物的洗脱、提取ChIP-DNA、探针制备、制片变性及杂交、清洗制片、抗体孵育、清洗制片、DAPI套染、镜检。

本发明具有有益效果：运用本发明公开的20个特异氨基酸序列人工合成抗原多肽，用该多肽免疫新西兰兔，获得CENH3蛋白抗体。制备的抗体通过免疫荧光检测、ChIP-FISH进行特异性验证，证明了该抗体可以准确识别功能着丝粒。该抗体可以在杨属树种中通用，不仅可以准确标记杨树功能着丝粒的位置，也为开展杨树着丝粒的结构、功能及进化研究奠定基础。本发明在杨树分子细胞遗传学、基因组学及表观组学等研究领域具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为杨树CENH3的免疫检测及ChIP-FISH结果图。a为杨树的中期染色体；b中红色为CENH3的信号，可见CENH3信号集中在中期染色体的着丝粒位置；c中绿色为ChIP DNA的信号；d为a、b、c合成后的结果，可见CENH3的信号与ChIP DNA的主信号重合，说明ChIP DNA来自着丝粒的DNA，该DNA可以用于下一步测序分析。标尺＝10μm。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。实施例中没有注明的温度均为室温，没有注明的试剂均为常规化学试剂。

实施例1：获取毛果杨着丝粒组蛋白CENH3的氨基酸序列

首先在毛果杨基因组数据库中搜索到一个与编码拟南芥CENH3蛋白基因(At1g01370HTR12)同源的基因Potri.014G096400.1，即毛果杨的CENH3蛋白基因，从而获得该基因的氨基酸序列，该基因位于毛果杨的14号染色体且在毛果杨中为单拷贝。通过对不同物种的CENH3蛋白的氨基酸序列进行生物信息学分析，其中包括毛果杨、拟南芥、水稻以及玉米。结果发现毛果杨CENH3蛋白的氨基酸序列与水稻的相似度为54％，与玉米的相似度为53％，与拟南芥的相似度最高为60％。不同物种CENH3蛋白的氨基酸序列在N端变化很大但在C端则比较保守。

实施例2：制备杨树着丝粒组蛋白CENH3抗体

选择毛果杨着丝粒组蛋白CENH3蛋白N端的20个特异氨基酸序列，具体序列为MARTKHPVARKRARSPKRSD，依据该序列人工合成多肽，作为抗原。将合成的多肽偶联到蛋白载体上，然后常规免疫新西兰兔，4免后从兔颈动脉取血收集血清，血清过抗原亲和柱后收集兔源多克隆抗体，抗体纯度90％，抗体浓度为0.4mg/ml，将抗体分装后，-20℃保存。

实施例3：抗体免疫荧光检测

免疫荧光检测是对所制备抗体特异性的细胞学检验，因为抗原与抗体反应具有高度的特异性，所以通过免疫荧光检测可以判断所制备CENH3抗体的质量。实验流程如下：

(1)根尖固定：选取杨树生长旺盛的根尖，用4％(w/v)的多聚甲醛固定15min，然后用1×PBS缓冲液润洗3遍，每遍5min。

(2)染色体制片：1)将根尖转移到干净的载玻片上；2)用双面刀片将根尖分生组织切下；3)向载玻片上加入10μL 1×PBS；4)轻轻盖上盖玻片，用解剖针敲击盖玻片使根尖分生组织充分散开；5)将载玻片泡入盛有1×PBS的染缸中，泡掉盖玻片，取出制片气干备用。

(3)一抗孵育：每张制片加大约100μL一抗孵育液，孵育液组成为：100μL 1×TNB+3μL CENH3抗体，盖上盖玻片，37℃湿盒中孵育过夜。

(4)二抗孵育：第二天甩掉盖玻片，用1×PBS润洗三遍，每遍5min，然后每张制片加大约100μL二抗孵育液，孵育液组成为：100μL 1×TNB+1μL Alexa Fluor 594(InvitrogenA-21442)，37℃孵育1h，之后再用1×PBS润洗三遍，每遍5min。

(5)封片：晾干后，每张制片加20μL含有DAPI的Vectashield(Vector Labs，H-1200)胶封片；

(6)镜检：制片用荧光显微镜(Olympus BX51,Japan)观察，选择中期染色体分散且荧光信号良好的分裂相拍照(图1a、b)并定位拍照过的分裂相以方便下一步ChIP-FISH实验后拍照。

图1a为杨树的中期染色体，可以看出，该分裂相染色体分散性较好，b中红色为CENH3的信号，可见CENH3在杨树染色体的着丝粒域产生了专一明亮的信号，表明该抗体可以特异性识别其功能着丝粒域。

免疫荧光检测实验之前必须彻底清洁实验工具(镊子、刀片等)，因为细胞学实验室的工具经常接触乙酸，酸会对蛋白造成很大影响。为了获得更好的染色体制片，我们也尝试了不同酶解时间(30min、1h、1h30min)对制片的影响，发现纤维素和果胶酶处理后根尖变软，不仅不易获得分散性好的分裂相，而且二抗的荧光信号很弱，这可能是酶解过程对CENH3蛋白造成了影响。

本实验制片时使用1×PBS揭片，不同于传统实验中使用液氮或-80℃超低温冰箱冷冻后揭片。冷冻后揭片，对制片手法要求更高，因为敲片时常常会使盖玻片破碎，破碎的盖玻片给冷冻揭片带来很大困难；冷冻揭片的制片，二抗荧光信号不仅背景较强而且信号也较1×PBS揭片的要弱，这主要是因为，一方面使用1×PBS时，1×PBS在松动盖玻片的同时，洗去了制片的杂质，从而使二抗荧光信号的背景变弱，另一方面，低温可能对蛋白产生了一定影响，使得冷冻揭片制片的二抗荧光信号较1×PBS揭片的要弱。

实施例5：ChIP-FISH

ChIP技术被广泛应用于DNA与蛋白质之间的互作研究。根据着丝粒上具有特异的CENH3组蛋白这一特点，利用ChIP技术就能获得着丝粒的DNA。通过ChIP-FISH可以进一步验证抗体特异性，实验流程如下：

(1)ChIP-DNA提取：杨树细胞核提取及纯化、染色质酶切及检验、染色质预处理、抗体孵育、rProteinA琼脂糖珠子的清洗和孵育、抗体染色质复合物的洗脱、提取ChIP-DNA。

(2)探针制备：取10μL ChIP-DNA，采用缺刻平移法用地高辛标记为25μL FISH探针；

(3)制片变性及杂交：将实施例3拍照过的制片用1×PBS洗去盖玻片，用70％、90％、100％的乙醇逐级脱水，每级3min，制片晾干备用。将制片加100μL70％DFA，放置在85℃变性3min；将制片立即用70％，90％，100％的冰乙醇逐级脱水，每级5min；晾干备用；每张制片配制20μL杂交液，杂交液组成为：10μL DFA+2μL 20×SSC+4μL 50％DS+2μL探针+2μLddH₂O；探针加到制片上，盖好盖玻片，放入湿盒，37℃杂交过夜(后续步骤需避光操作)；

(4)清洗制片：2×SSC泡掉盖玻片，并用2×SSC洗制片5min；42℃的2×SSC洗制片20min；1×TNT洗制片5min；

(5)抗体孵育：每张制片配制二抗孵育液约100μL，37℃在湿盒中孵育1h，二抗孵育液组成为：100μL 1×TNB+1μL Anti-digoxigenin Fluorescein(Roche，11207741910)；

(6)清洗制片：1×TNT洗制片三次，每次5min；1×PBS洗制片5min；纯水洗制片1min；

(7)DAPI套染：晾干后，每张制片加20μL含有DAPI的Vectashield(Vector Labs，H-1200)胶封片；

(8)镜检：制片用荧光显微镜(Olympus BX51,Japan)拍照，选择实施例3拍照过的分裂相继续拍照(图1c、d)。

图1c中绿色为ChIP-DNA的信号，d为a、b、c合成后的结果，可见CENH3的信号与ChIPDNA的主信号重合，说明ChIP DNA来自着丝粒的DNA，该DNA可以用于下一步测序分析。

为了进一步验证该抗体的适用性，我们选用5大派杨树的代表种，即小叶杨(青杨派)、美洲黑杨(黑杨派)、毛白杨(白杨派)、胡杨(胡杨派)及大叶杨(大叶杨派)为实验对象，运用本发明制备的CENH3抗体开展了免疫荧光检测、ChIP-FISH实验，均获得了稳定的实验结果，说明该抗体在杨属树种中通用，不仅可以准确标记杨树功能着丝粒的位置，也为开展杨树着丝粒的结构、功能及进化研究奠定基础。本发明在杨树分子细胞遗传学、基因组学及表观组学等研究领域具有广阔的应用前景。

Claims (2)

1.杨树功能着丝粒组蛋白CENH3的抗原多肽，其特征在于，其氨基酸序列为MARTKHPVARKRARSPKRSD。

2.权利要求1所述的抗原多肽用于制备抗体，其特征在于，步骤如下：选择毛果杨着丝粒组蛋白CENH3蛋白N端的20个特异氨基酸序列，依据该序列人工合成多肽，作为抗原，将合成的多肽偶联到蛋白载体上，然后常规免疫新西兰兔，4免后从兔颈动脉取血收集血清，血清过抗原亲和柱后收集兔源多克隆抗体，抗体纯度90%，抗体浓度为0.4mg/ml，将抗体分装后，-20℃保存。

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