CZ20022367A3 - Hybrid ozimé řepky olejky a způsob jeho přípravy - Google Patents
Hybrid ozimé řepky olejky a způsob jeho přípravy Download PDFInfo
- Publication number
- CZ20022367A3 CZ20022367A3 CZ20022367A CZ20022367A CZ20022367A3 CZ 20022367 A3 CZ20022367 A3 CZ 20022367A3 CZ 20022367 A CZ20022367 A CZ 20022367A CZ 20022367 A CZ20022367 A CZ 20022367A CZ 20022367 A3 CZ20022367 A3 CZ 20022367A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- plant
- seq
- dna
- length
- sequence
- Prior art date
Links
- 235000006008 Brassica napus var napus Nutrition 0.000 title claims abstract description 66
- 240000000385 Brassica napus var. napus Species 0.000 title claims description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 16
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 325
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 claims abstract description 153
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 98
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims abstract description 61
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 54
- 206010021929 Infertility male Diseases 0.000 claims abstract description 33
- 208000007466 Male Infertility Diseases 0.000 claims abstract description 33
- 101000708283 Oryza sativa subsp. indica Protein Rf1, mitochondrial Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 277
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 234
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 71
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 claims description 53
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 49
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 46
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 35
- 230000035558 fertility Effects 0.000 claims description 33
- 108020005120 Plant DNA Proteins 0.000 claims description 30
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 25
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 25
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 23
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 19
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 13
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 11
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 9
- 108020005029 5' Flanking Region Proteins 0.000 claims description 7
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 claims description 4
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 2
- 239000012297 crystallization seed Substances 0.000 claims 2
- 101710141795 Ribonuclease inhibitor Proteins 0.000 claims 1
- 229940122208 Ribonuclease inhibitor Drugs 0.000 claims 1
- 102100037968 Ribonuclease inhibitor Human genes 0.000 claims 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 claims 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 claims 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 claims 1
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 30
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 abstract description 20
- 230000009418 agronomic effect Effects 0.000 abstract description 18
- 230000009466 transformation Effects 0.000 abstract description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 239000010773 plant oil Substances 0.000 abstract 1
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 131
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 44
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 30
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 22
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 22
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 20
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 18
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 18
- 239000000047 product Substances 0.000 description 18
- 108010016529 Bacillus amyloliquefaciens ribonuclease Proteins 0.000 description 16
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 15
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 14
- IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N Phosphinothricin Natural products CP(O)(=O)CCC(N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 12
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 12
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 12
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 10
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 10
- 235000011293 Brassica napus Nutrition 0.000 description 9
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 101710183938 Barstar Proteins 0.000 description 8
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 8
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 8
- 238000011161 development Methods 0.000 description 8
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 8
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 8
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 7
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 7
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 7
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 7
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 7
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 6
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 6
- 208000021267 infertility disease Diseases 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 239000005561 Glufosinate Substances 0.000 description 5
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 5
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- 238000007861 thermal asymmetric interlaced PCR Methods 0.000 description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 4
- DPUOLQHDNGRHBS-KTKRTIGZSA-N erucic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCCCCC(O)=O DPUOLQHDNGRHBS-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 4
- IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N glufosinate-P Chemical compound CP(O)(=O)CC[C@H](N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 4
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 3
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 3
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 3
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 3
- 241000219198 Brassica Species 0.000 description 3
- DPUOLQHDNGRHBS-UHFFFAOYSA-N Brassidinsaeure Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCCCCCC(O)=O DPUOLQHDNGRHBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- URXZXNYJPAJJOQ-UHFFFAOYSA-N Erucic acid Natural products CCCCCCC=CCCCCCCCCCCCC(O)=O URXZXNYJPAJJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 3
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 3
- 108010082527 phosphinothricin N-acetyltransferase Proteins 0.000 description 3
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 2
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 description 2
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 2
- 101100148606 Caenorhabditis elegans pst-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 2
- YAHZABJORDUQGO-NQXXGFSBSA-N D-ribulose 1,5-bisphosphate Chemical compound OP(=O)(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)C(=O)COP(O)(O)=O YAHZABJORDUQGO-NQXXGFSBSA-N 0.000 description 2
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 2
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 2
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 2
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 2
- 241000221662 Sclerotinia Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 241000187391 Streptomyces hygroscopicus Species 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- GINJFDRNADDBIN-FXQIFTODSA-N bilanafos Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCP(C)(O)=O GINJFDRNADDBIN-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 244000309464 bull Species 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- NOPFSRXAKWQILS-UHFFFAOYSA-N docosan-1-ol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCO NOPFSRXAKWQILS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000024346 drought recovery Effects 0.000 description 2
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 231100001222 nononcogenic Toxicity 0.000 description 2
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 2
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- SNBCLPGEMZEWLU-QXFUBDJGSA-N 2-chloro-n-[[(2r,3s,5r)-3-hydroxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl]acetamide Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CNC(=O)CCl)[C@@H](O)C1 SNBCLPGEMZEWLU-QXFUBDJGSA-N 0.000 description 1
- 108020005065 3' Flanking Region Proteins 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 101150118014 BNRF1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000193744 Bacillus amyloliquefaciens Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 235000011331 Brassica Nutrition 0.000 description 1
- 235000011303 Brassica alboglabra Nutrition 0.000 description 1
- 244000060924 Brassica campestris Species 0.000 description 1
- 235000005637 Brassica campestris Nutrition 0.000 description 1
- 235000014698 Brassica juncea var multisecta Nutrition 0.000 description 1
- 235000011302 Brassica oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 235000003899 Brassica oleracea var acephala Nutrition 0.000 description 1
- 235000011301 Brassica oleracea var capitata Nutrition 0.000 description 1
- 235000001169 Brassica oleracea var oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 235000006618 Brassica rapa subsp oleifera Nutrition 0.000 description 1
- 235000000540 Brassica rapa subsp rapa Nutrition 0.000 description 1
- 101100287651 Caenorhabditis elegans kbp-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- UAUDZVJPLUQNMU-UHFFFAOYSA-N Erucasaeureamid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCCCCCC(N)=O UAUDZVJPLUQNMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000702191 Escherichia virus P1 Species 0.000 description 1
- 108010046276 FLP recombinase Proteins 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- YFCDLVPYFMHRQZ-UHFFFAOYSA-N N-Nitrosodiethanolamine Chemical compound OCCN(N=O)CCO YFCDLVPYFMHRQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 1
- 241000592344 Spermatophyta Species 0.000 description 1
- 208000037065 Subacute sclerosing leukoencephalitis Diseases 0.000 description 1
- 206010042297 Subacute sclerosing panencephalitis Diseases 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 241000235033 Zygosaccharomyces rouxii Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 101150103518 bar gene Proteins 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- -1 but not limited to Proteins 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 230000000093 cytochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 229960000735 docosanol Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000010410 dusting Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- UAUDZVJPLUQNMU-KTKRTIGZSA-N erucamide Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCCCCC(N)=O UAUDZVJPLUQNMU-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000000646 gametocidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 125000004383 glucosinolate group Chemical group 0.000 description 1
- 102000005396 glutamine synthetase Human genes 0.000 description 1
- 108020002326 glutamine synthetase Proteins 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 239000010720 hydraulic oil Substances 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000012966 insertion method Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000009403 interspecific hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 238000007479 molecular analysis Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 238000003976 plant breeding Methods 0.000 description 1
- 230000010152 pollination Effects 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000005849 recognition of pollen Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000010421 standard material Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 101150065190 term gene Proteins 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 230000006032 tissue transformation Effects 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8287—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for fertility modification, e.g. apomixis
- C12N15/8289—Male sterility
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
- C12Q1/683—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism involving restriction enzymes, e.g. restriction fragment length polymorphism [RFLP]
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Botany (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Springs (AREA)
- Bending Of Plates, Rods, And Pipes (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Tento vynález se týká rostlin ozimé řepky olejky, konkrétně dvojice rostlin ozimé řepky olejky, která je obzvláště vhodná pro produkci hybridních semen. Konkrétněji, jedna rostlina je charakterizována tím, že je to rostlina se samčí sterilitou, díky přítomnosti genu samčí sterility v jejím genomu, zatímco druhá je charakterizována tím, že nese gen obnovující fertilitu, který je schopný zabránit aktivitě genu samčí sterility. Pár rostlin ozimé řepky olejky podle vynálezu spojuje schopnost vytvářet hybridní semena s optimálním celkovým agronomickým výkonem, genetickou stabilitou a adaptabilitou k různému genetickému pozadí.
Všechny dokumenty citované v tomto textu jsou formou odkazu součástí předkládaného popisu.
Dosavadní stav techniky
Fenotypová exprese transgenu v rostlině je určena jak strukturou genu samotného tak jeho lokalizací v rostlinném genomu. Současně přítomnost transgenu v odlišných místech genomu ovlivňuje celkový fenotyp rostliny odlišným způsobem. Agronomicky nebo průmyslově úspěšné vnesení komerčně zajímavých znaků do rostliny metodami genových manipulací může být značně zdlouhavý postup závislý na mnoha různých faktorech. Skutečná transformace a regenerace geneticky transformovaných rostlin jsou pouze prvními kroky v celé řadě selekčních kroků, která zahrnuje extenzívní genetickou charakterizaci, další šlechtění a vyhodnocení v polních pokusech.
Řepka olejka (Brassica napus, AACC, 2n=38) je přírodní hybrid vzniklý mezidruhovou hybridizací mezi brukví zelnou (Brassica oleracea, CC, 2n = 18) a brukví tuřínem (Brassica campestris, AA, 2n = 20). Ozimá řepka olejka se vysévá v průběhu posledních 10 dnů srpna a prvních deseti dnů září a sklízí se následující rok v červenci, neboť vyžaduje období s nízkou teplotou pro vernalizaci. Rychleji rostoucí jarní řepky se sejí na konci března až začátku dubna a sklizeň probíhá od poloviny srpna do září. Hlavní typy řepky olejky pěstované v současnosti jsou odrůdy s nízkým a vysokým obsahem erukové kyseliny. Tzv. Dvojitě nízké (00) odrůdy obsahují nízkou (typicky méně než 1 %) hladinu erukových kyselin (které jsou pro člověka obtížně stravitelné) a nízké hladiny glukosinolátů (které činí vedlejší produkty nestravitelné pro zvířata). Běžné využiti 00 odrůd přestavuje olej pro lidskou spotřebu a krmivo pro zvířata s vysokým obsahem proteinů. K průmyslovému využití patří také základní suroviny pro léčiva a hydraulické oleje. Odrůdy řepky s vysokým obsahem erukové kyseliny (HEAR) jsou pěstované specificky pro jejich obsah erukové kyseliny - typicky 50 až 60 % oleje. Hlavním konečným použitím HEAR je výroba erukamidu, což je kluzné činidlo používané pří výrobě polyethanu. Malý podíl se využívá při výrobě behenylalkoholu, který se přidává k voskovitým surovým minerálním olejům pro zlepšení jejich tekutosti.
Rostliny řepky olejky jsou bisexuální a typicky ze 60 až 70 % samosprašné. Produkce hybridů a vnášení genetické variability jakožto základu pro selekci byly tradičně závislé na adaptaci v přírodě se vyskytujícího jevu jako je například self-inkompatibilita a cytoplazmatická samčí sterility. Metody umělé kontroly opylení jako je například ruční sterilizace
(emaskulace) nebo použití gametocidních látek nebyly ve šlechtění řepky více rozšířeny vzhledem k jejích omezené praktické použitelnosti a vysokým finančním nákladům.
Byly vyvinuty transgenní metody pro vytvoření samčí nebo samičí sterilní rostliny, které poskytují zajímavé alternativy k tradičním technikám.
EP 0,344,029 popisuje systém pro získání jaderné samčí sterility, přičemž rostliny jsou transformovány genem samčí sterility, který obsahuje například DNA kódující barnázu, který je řízen promotorem specifickým pro tapetum (specifické pletivo prašníků), PTA29, který po vnesení do rostliny zajišťuje selektivní destrukci buněk tapeta. Transformace rostlin tabáku a řepky olejky takovým chimérickým genem vedlo k rostlinám, u kterých bylo zcela zabráněno tvorbě pylu (Mariani et al. 1990, Nátuře 347: 737-741).
Pro obnovu fertility v potomstvu rostlin se samčí sterilitou byl vytvořen systém, kdy je samčí sterilní rostlina křížena s transgenní rostlinou nesoucí gen obnovující fertilitu, který je po expresi schopen snížit nebo zcela zrušit aktivitu genu samčí sterility (viz US 5,689,041, US 5,792,929). Takový gen obnovující fertilitu je umístěn pod kontrolu promotoru řídícího expresi alespoň v buňkách toho typu, kde je gen samčí sterility exprimován. Mariani et al. (1992. Nátuře 357:3$4-387) prokázali, že u řepky olejky sterilita kódovaná genem pTA29-barnáza může být obnovena chimérickým genem pTA29-barstar.
Cytochemická a histochemická analýza vývoje prašníků u rostlin Brassica napus obsahujících samotný chimérický gen pTA29:barnáza nebo pTA29:barstar je popsána v publikaci De Block a De Brouwer (1993, Planta 189:218-225).
Úspěšné transformace rostlin druhů Brassica bylo dosaženo
·.
řadou metody včetně infekce užitím Agrobacterium (jak bylo popsáno například v EP 0,116,718 a EP 0,270,882), ostřelováním mikročásticemi - biobalistickou metodou (jak bylo popsáno například Chen et al., 1994, Theor. Appl. Genet. 88:187-192) a pomocí přímého příjmu DNA (jak bylo popsáno například De Block et al. 1989, Plant Physiol. 914:694-701, Poulsen 1996, Plant Breeding 115:209225).
Avšak žádná z citovaných publikací nepopisovala ani nenavrhovala řešení popsané v předkládané přihlášce.
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález se týká dvojice rostlin ozimé řepky olejky obzvláště vhodných pro produkci hybridních semen. Konkrétněji se předkládaný vynález týká první transgenní rostliny ozimé řepky olejky nebo jejích semen, buněk nebo tkání, obsahujících, integrovanou do svého genomu, expresní kazetu, která obsahuje gen samčí sterility, a druhé transgenní rostliny ozimé řepky olejky nebo jejích semen, buněk nebo tkání, obsahujících, integrovanou do svého genomu, expresní kazetu, která obsahuje gen obnovující fertilitu, a hybridní semena získaná křížením první a druhé rostliny, která obsahují gen samčí sterility a/nebo gen obnovující fertilitu integrované do svého genomu.
V jednom provedení vynálezu první rostlina ozimé řepky olejky nebo její semena, buňky nebo pletiva, obsahuje expresní kazetu pTHW107. Ve výhodném provedení vynálezu první rostlina ozimé řepky olejky nebo její semena, buňky nebo pletiva obsahují událost MS-BNl. V dalším provedení vynálezu druhá rostlina ozimé řepky olejky nebo její semena, buňky nebo pletiva, obsahuje expresní kazetu pTHW1118. Ve výhodném • ·· ·· »· • ♦ ♦ » · · ♦ • » · « · • · · · · · ··· *· ♦» ···· provedení vynálezu rostlina ozimé řepky olejky nebo její semena, buňky nebo pletiva obsahují událost RF-BN1. V obzvláště výhodném provedení vynálezu první rostlina ozimé řepky olejky obsahuje událost MS-BN1 a druhá rostlina ozimé řepky olejky obsahuje událost RF-BN1 a hybridní semena od nich získaná obsahují dokonce MS-BN1 a RF-BN1 nebo samotnou RF-BN1.
Vynález se týká transgenních semen ozimé řepky olejky nebo rostliny, která může být z těchto semen pěstována, jejichž genomová DNA je charakterizována jednou nebo oběma následujícími vlastnostmi:
a) Genomová DNA je schopna poskytnout alespoň dva, výhodně alespoň tři, výhodněji alespoň čtyři, nejvýhodněji pět souborů restrikčních fragmentů vybraných ze skupiny, kterou tvoří:
i) jeden soubor dvou EcoRI fragmentů, jeden délky mezi 2140 a 2450 bp, výhodně přibližně 2266 bp a jeden délky více než 14 kbp, ii) jeden soubor dvou EcoRV fragmentů, kde jeden má délku mezi 1159 a 1700 bp, výhodně přibližně 1,4 kbp a druhý má délku více než 14 kbp, iii) jeden soubor dvou Hpal fragmentů, jeden délky mezi 1986 a 2140 bp, výhodně délky přibližně 1990 bp a jeden délky mezi 2140 a 2450 bp, výhodně přibližně 2229 bp, iv) jeden soubor tří AflIII fragmentů, jeden délky mezi 514 a 805 bp, výhodně délky přibližně 522 bp a jeden délky mezi 2140 a 2450 bp, výhodně přibližně 2250 bp a jeden délky mezi 2450 a 2838 bp, výhodně přibližně 2477 bp,
v) Jeden soubor dvou Ndel fragmentů, oba délky mezi 5077 a 14057 bp, výhodně jeden délky přibližně 6500 bp a jeden délky přibližně 10 kbp,
kde každý z restrikčních fragmentů je schopen hybridizace v podmínkách standardní stringence, s fragmentem o velikosti 3942 bp obsahujícím sekvenci PTA29-barnázy připravitelnou štěpením plazmidu pTHWlO7 enzymem HindlII, jak je popsáno v tomto textu, a/nebo
b) Genomová DNA je schopna poskytnout alespoň dva, výhodně alespoň tři, výhodněji čtyři soubory restrikčních fragmentů vybraných ze skupiny, kterou tvoří:
i) jeden soubor tří BamHI fragmentů, kde jeden má délku mezi 805 a 1099 bp, výhodně přibližně 814 bp, jeden má délku mezi 1700 a 1986 bp, výhodně přibližně 1849 bp, jeden má délku mezi 2450 a 2838 bp, výhodně přibližně 2607 bp a jeden má délku mezi 5077 a 14057 bp, výhodně přibližně 6500 bp, ii) jeden soubor čtyř EcoRI fragmentů, jeden délky mezi 805 a 1159 bp, výhodně přibližně 1094 bp, jeden délky mezi 1986 a 2450 bp, výhodně přibližně 214 9 bp a dva délky mezi 5077 a 14057 bp, výhodně jeden délky přibližně 7000 bp a jeden délky přibližně 10 kbp, iii) jeden soubor dvou EcoRV fragmentů, kde oba mají délku mezi 5077 a 14057 bp, výhodně jeden má délku přibližně
5,4 kbp a druhý má délku přibližně 8 kbp, iv) Jeden soubor tří HindlII fragmentů, kde jeden má délku mezi 1700 a 2140 bp, výhodně přibližně 1969 bp a dva mají délku mezi 2450 a 2838 bp, výhodně jeden má délku přibližně 2565 bp a jeden má délku přibližně 2635 bp, kde každý z restrikčních fragmentů je schopen hybridizace v podmínkách standardní stringence, s fragmentem o velikosti 2182 bp obsahujícím sekvenci PTA29-barstar připravitelnou štěpením plazmidu pTHW118 enzymem Hpal, jak je popsáno v tomto textu.
· *
Předkládaný vynález se týká semen rostlin ozimé řepky olejky nebo rostliny, která může být z těchto semen pěstována nebo jejích buněk nebo tkání, jejichž genomová DNA je charakterizována jednou nebo oběma následujícími vlastnostmi:
a) Genomová DNA je schopna poskytnout alespoň dva, výhodně alespoň tři, například alespoň čtyři, výhodněji pět souborů restrikčních fragmentů vybraných ze skupiny popsané v bodě
a) výše obsahující soubory restrikčních fragmentů popsané v bodě a) i), ii), iii) , iv) a v) výše, přičemž selekce může zahrnovat kteroukoliv kombinaci i) , ii) , iii), iv) a v) popsaných v bodě a) výše, a/nebo
b) Genomová DNA je schopna poskytnout alespoň dva, výhodně alespoň tři, nejvýhodněji čtyři soubory restrikčních fragmentů vybraných ze skupiny popsané v bodě b) výše obsahující soubory restrikčních fragmentů popsané v bodě b)
i) , ii) , iii) a iv) výše, přičemž selekce může zahrnovat kteroukoliv kombinaci i) , ii) , iii) a iv) popsaných v bodě
b) výše.
Vynález se dále týká semen ozimé řepky olejky nebo rostlin pěstovaných z těchto semen, jejichž genomová DNA je charakterizována jednou nebo oběma následujícími vlastnostmi:
c) Genomová DNA může být použita k amplifikaci DNA fragmentu o velikosti mezi 260 a 300 bp, výhodně přibližně 280 bp, s použitím polymerázové řetězové reakce s dvěma primery majícími nukleotidové sekvence SEKV. ID. Č. 12 a SEKV. ID. Č. 19, v daném pořadí, a/nebo
d) Genomová DNA může být použita k amplifikaci DNA fragmentu o velikosti mezi 195 a 235 bp, výhodně přibližně 215 bp, s použitím polymerázové řetězové reakce s dvěma primery majícími nukleotidové sekvence SEKV. ID. Č. 23 a SEKV. ID. Č. 41, v daném pořadí.
• 4 ·· 4 4 4« • ♦ 4 « > » «
4 4 4 4 ·
4 4 4 4 4 4 • · · · 4 · •44 44 44 4444
Vynález se dále týká semen ozimé řepky olejky nebo rostlin pěstovaných z těchto semen, jejichž genomová DNA je charakterizována vlastnostmi popsanými v bodě a) a c) výše a/nebo vlastnostmi popsanými v bodě b) a d) výše.
Předkládaný vynález se týká semen rostliny ozimé řepky olejky nebo rostliny, která může být z těchto semen pěstována, jejichž genomová DNA je charakterizována jednou nebo oběma následujícími vlastnostmi:
a) Genomová DNA je schopna poskytnout alespoň dva, výhodně alespoň tři, výhodněji alespoň čtyři, nejvýhodněji pět souborů restrikčních fragmentů vybraných ze skupiny, kterou tvoří:
i) Jeden soubor dvou EcoRI fragmentů, jeden délky mezi 2140 a 2450 bp, výhodně přibližně 2266 bp a jeden délky více než 14 kbp, ii) Jeden soubor dvou EcoRV fragmentů, kde jeden má délku mezi 1159 a 1700 bp, výhodně přibližně 1,4 kbp a druhý má délku více než 14 kbp, iii) Jeden soubor dvou Hpal fragmentů, jeden délky mezi 1986 a 2140 bp, výhodně délky přibližně 1990 bp a jeden délky mezí 2140 a 2450 bp, výhodně přibližně 2229 bp, iv) Jeden soubor tří AflIII fragmentů, jeden délky mezi 514 a 805 bp, výhodně délky přibližně 522 bp, jeden délky mezi 2140 a 2450 bp, výhodně přibližně 2250 bp a jeden délky mezi 2450 a 2838 bp, výhodně přibližně 2477 bp,
v) Jeden soubor dvou Ndel fragmentů, oba délky mezi 5077 a 14057 bp, výhodně jeden délky přibližně 6500 bp a jeden délky přibližně 10 kbp, kde každý z restrikčních fragmentů je schopen hybridizace v podmínkách standardní stringence, s fragmentem o velikosti
3942 bp obsahujícím sekvenci PTA29-barnázy přepravitelnou štěpením HindlII plazmidu pTHWlO7, jak je popsáno v tomto textu, a/nebo,
c) Genomová DNA může být použita k amplifikaci DNA fragmentu o velikosti mezi 260 a 300 bp, výhodně přibližně 280 bp, s použitím polymerázové řetězové reakce s dvěma primery majícími nukleotidové sekvence ze SEKV. ID. Č. 12 a SEKV. ID. Č. 19, v daném pořadí.
Předkládaný vynález se týká semen rostliny ozimé řepky olejky, výhodně rostliny se samčí sterilitou nebo rostliny, která může být z těchto semen pěstována nebo jejích buněk nebo tkání, jejichž genomová DNA je charakterizována tím, že je schopna poskytnout alespoň dva, výhodně alespoň tři, výhodněji pět souborů restrikčních fragmentů vybraných ze skupiny popsané výše obsahující soubory restrikčních fragmentů popsané v bodě i), ii), iii), iv) a v) výše, přičemž selekce může zahrnovat kteroukoliv kombinaci i), ii) , iii), iv) a v) popsaných výše.
Předkládaný vynález se dále týká semen rostliny ozimé řepky olejky nebo rostliny pěstované z těchto semen, jejichž genomová DNA je charakterizována jednou nebo oběma následujícími vlastnostmi:
b) Genomová DNA je schopna poskytnout alespoň dva, výhodně alespoň tři, výhodněji čtyři restrikční fragmenty nebo soubory restrikčních fragmentů vybraných ze skupiny, kterou tvoří:
i) Jeden soubor tří BamHI fragmentů, kde jeden má délku mezi 805 a 1099 bp, výhodně přibližně 814 bp, jeden mé délku mezi 1700 a 1986 bp, výhodně přibližně 1849 bp, jeden má délku mezi 2450 a 2838 bp, výhodně přibližně 2607 bp a jeden má délku mezi 5077 a 14057 bp, výhodně přibližně
Μ · · · · • 00 0 0 0 0
0 0 «0 ·
0 · « · « ♦ 000 00 ·0 0 · 0 ·
6500 bp, ii) Jeden soubor čtyř EcoRI fragmentů, jeden délky mezi 805 a
1159 bp, výhodně přibližně 1094 bp, jeden délky mezi 1986 a 2450 bp, výhodně přibližně 2149 bp a dva délky mezi 5077 a 14057 bp, výhodně jeden délky přibližně 7000 bp a jeden délky přibližně 10 kbp, iii) Jeden soubor dvou EcoRV fragmentů, kde oba máji délku mezi 5077 a 14057 bp, výhodně jeden má délku přibližně
5,4 kbp a druhý má délku přibližně 8 kbp, iv) Jeden soubor tři HindlII fragmentů, kde jeden má délku mezi 1700 a 2140 bp, výhodně přibližně 1969 bp a dva máji délku mezi 2450 a 2838 bp, výhodně jeden má délku přibližně 2565 bp a jeden má délku přibližně 2635 bp, kde každý z restrikčních fragmentů je schopen hybridizace v podmínkách standardní stringence, s fragmentem o velikosti 2182 bp obsahujícím sekvenci PTA29-barstar připravitelnou štěpením Hpal plazmidu pTHWH8, popsáno v tomto textu,
A/nebo
d) Genomová DNA může být použita k amplifikaci DNA fragmentu o velikosti mezi 195 a 235 bp, výhodně přibližně 215 bp, s použitím polymerázové řetězové reakce s dvěma primery majícími nukleotidové sekvence ze SEKV. ID. Č. 23 a SEKV. ID. Č. 41, v daném pořadí.
Předkládaný vynález se týká semen rostliny ozimé řepky olejky, výhodně rostliny obnovující fertilitu nebo rostliny, která může být z těchto semen pěstována nebo jejích buněk nebo tkání, jejichž genomová DNA je schopna poskytnout alespoň dva, výhodně alespoň tři, nejvýhodněji čtyři soubory restrikčních fragmentů vybraných ze skupiny popsané výše, obsahující soubory restrikčních fragmentů popsané v bodě b) i) , ii), iii) a iv) výše, přičemž selekce může zahrnovat kteroukoliv kombinaci i), ii), iii) a iv) popsaných výše.
Předkládaný vynález se týká transgenních rostlin ozimé řepky olejky, buněk, tkání nebo semen, které jsou výhodně charakterizovány oběma vlastnostmi popsanými v bodě b) a/nebo
d) výše, v daném pořadí.
Vynález se dále týká transgenních, výhodně hybridních rostlin ozimé řepky olejky s obnovenou fertilitou, buněk, tkání nebo semen získaných křížením rostliny se samčí sterilitou s rostlinou obnovující fertilitu podle vynálezu, charakterizovanou příslušnými vlastnostmi popsanými výše, přičemž rostliny s obnovenou fertilitou, buňky, pletiva nebo semena jsou charakterizována molekulárními vlastnostmi jak rostliny se samčí sterilitou, tak vlastnostmi rostliny ozimé řepky olejky obnovující fertilitu popsanými výše. Vynález se dále týká transgenních, výhodně hybridních rostlin ozimé řepky olejky, buněk, tkání nebo semen získaných křížením rostliny se samčí sterilitou s rostlinou obnovující fertilitu podle vynálezu charakterizovanou molekulárními vlastnostmi popsanými výše, přičemž hybridní rostliny, buňky, pletiva nebo semena jsou charakterizována molekulárními vlastnostmi rostliny ozimé řepky olejky obnovující fertilitu popsanými výše.
Vynález se také týká semen uložených v ATCC pod přístupovým číslem PTA-730, rostliny, která je vypěstována z těchto semen a buněk nebo tkání z rostliny vypěstované z těchto semen. Vynález se dále týká rostliny získatelné množením a/nebo křížením s rostlinou ozimé řepky olejky pěstovanou ze semen uložených v ATCC pod přístupovým číslem PTA-730.
Vynález se dále týká způsobu produkce hybridních semen ozimé řepky olejky, který zahrnuje křížení rostliny ozimé řepky olejky se samčí sterilitou podle předkládaného vynálezu s rostlinou ozimé řepky olejky obnovující fertilitu podle • 0«
0··· vynálezu.
Vynález se dále týká rostliny ozimé řepky olejky, rostlinné buňky, rostlinné pletiva nebo semen, které obsahují rekombinantní DNA obsahující alespoň jeden transgen, integrovaný do části chromozómové DNA charakterizované sekvencí SEKV. ID. Č. 22 a/nebo rekombinantní DNA obsahující alespoň jeden transgen, integrovaný do části chromozómové DNA charakterizované sekvencí SEKV. ID. Č. 34.
Vynález dále poskytuje způsob produkce transgenní buňky rostliny ozimé řepky olejky nebo rostliny z ní získané, který obsahuje vnesení rekombinantní DNA molekuly do části chromozómové DNA buňky ozimé řepky olejky charakterizované sekvencí SEKV. ID. Č. 22 a, volitelně, regeneraci rostliny ozimé řepky olejky z transformované buňky ozimé řepky olejky.
Vynález dále poskytuje způsob produkce transgenní buňky rostliny ozimé řepky olejky nebo rostliny z ní získané, který obsahuje vnesení rekombinantní DNA molekuly do části chromozómové DNA buňky ozimé řepky olejky charakterizované sekvencí SEKV. ID. Č. 34 a, volitelně, regeneraci rostliny ozimé řepky olejky z transformované buňky ozimé řepky olejky.
Vynález se dále týká způsobu identifikace transgenní rostliny nebo jejích buněk nebo tkání, obsahujících elitní událost MS-BNl podle vynálezu, přičemž tento způsob zahrnuje zjištění jedné nebo obou následujících charakteristických vlastností genomové DNA transgenní rostliny nebo jejích buněk nebo tkání:
a) Genomová DNA je schopna poskytnout alespoň dva, výhodně alespoň tři, výhodněji alespoň čtyři, nej výhodněji pět souborů restrikčních fragmentů vybraných ze skupiny, kterou tvoří
i) Jeden soubor dvou EcoRI fragmentů, jeden délky mezi 2140 ·· ··· · a 2450 bp, výhodně přibližně 2266 bp a jeden délky více než 14 kbp, ii) Jeden soubor dvou EcoRV fragmentů, kde jeden má délku mezi 1159 a 1700 bp, výhodně přibližně 1,4 kbp a druhý má délku více než 14 kbp, iii) Jeden soubor dvou Hpal fragmentů, jeden délky mezi 1986 a 2140 bp, výhodně délky přibližně 1990 bp a jeden délky mezi 2140 a 2450 bp, výhodně přibližně 2229 bp, iv) Jeden soubor tří AflIII fragmentů, jeden délky mezi 514 a 805 bp, výhodně délky přibližně 522 bp, jeden délky mezi 2140 a 2450 bp, výhodně přibližně 2250 bp a jeden délky mezi 2450 a 2838 bp, výhodně přibližně 2477 bp,
v) Jeden soubor dvou Ndel fragmentů, oba délky mezi 5077 a 14057 bp, výhodně jeden délky přibližně 6500 bp a jeden délky přibližně 10 kbp, kde každý z restrikčních fragmentů je schopen hybridizace v podmínkách standardní stringence, s fragmentem o velikosti 3942 bp obsahujícím sekvenci PTA29-barnázy připravitelnou štěpením HindlII plazmidu pTHW107, jak popsáno v tomto textu, a/nebo
c) Genomová DNA může být použita k amplifikaci DNA fragmentu o velikosti mezi 260 a 300 bp, výhodně přibližně 280 bp, podle PCR identifikačního protokolu, popsaného v tomto textu, s dvěma primery identifikujícími elitní událost majícími nukleotidovou sekvenci ze SEKV. ID. Č. 12 a SEKV. ID. Č. 19, v daném pořadí.
Vynález se dále týká způsobu identifikace transgenní rostliny nebo jejích buněk nebo tkání, obsahující elitní událost RF-BN1 podle vynálezu, tento způsob zahrnuje zjištění jedné nebo obou následujících charakteristických vlastností genomové DNA transgenní rostliny nebo jejích buněk nebo tkání:
Β 99
9 « • · · • · · ··· ··· ·· ·» « · · • Β <
Β Β « ·· ·β«Β
b) Genomová DNA je schopna poskytnout alespoň dva, výhodně alespoň tři, výhodněji čtyři restrikční fragmenty nebo soubory restrikčních fragmentů vybraných ze skupiny, kterou tvoří:
i) Jeden soubor tří BamHI fragmentů, kde jeden má délku mezi 805 a 1099 bp, výhodně přibližně 814 bp, jeden má délku mezi 1700 a 1986 bp, výhodně přibližně 1849 bp, jeden má délku mezi 2450 a 2838 bp, výhodně přibližně 2607 bp a jeden má délku mezi 5077 a 14057 bp, výhodně přibližně 6500 bp, ii) Jeden soubor čtyř EcoRI fragmentů, jeden délky mezi 805 a 1159 bp, výhodně přibližně 1094 bp, jeden délky mezi 1986 a 2450 bp, výhodně přibližně 2149 bp a dva délky mezi 5077 a 14057 bp, výhodně jeden délky přibližně 7000 bp a jeden délky přibližně 10 kbp, iii) Jeden soubor dvou EcoRV fragmentů, kde oba mají délku mezi 5077 a 14057 bp, výhodně jeden má délku přibližně
5,4 kbp a druhý má délku přibližně 8 kbp, iv) Jeden soubor tří HindlII fragmentů, kde jeden má délku mezi 1700 a 2140 bp, výhodně přibližně 1969 bp a dva mají délku mezi 2450 a 2838 bp, výhodně jeden má délku přibližně 2565 bp a jeden má délku přibližně 2635 bp, kde každý z restrikčních fragmentů je schopen hybridizace v podmínkách standardní stringence, s fragmentem o velikosti 2182 bp obsahujícím sekvencí PTA29-barstar přípravítelnou štěpením Hpal plazmidu pTHWll8, jak popsáno v tomto textu a/nebo
d) Genomová DNA může být použita k amplifikaci DNA fragmentu o velikostí mezi 195 a 235 bp, výhodně přibližně 215 bp, s použitím PCR identifikačního protokolu, popsaného v tomto textu, s dvěma primery identifikujícími elitní událost • .ί * *« *» ·· • ® * · · · 4 « « # , * * ··»»·♦ • · ···#· ·♦· ·«« 449 et ·« ··»· majícími nukleotidovou sekvenci SEKV. ID. Č. 23 a SEKV. ID. Č. 41, v daném pořadí.
Vynález se také týká soupravy pro identifikaci rostliny obsahující elitní událost MS-BNl podle předkládaného vynálezu, souprava obsahuje PCR sondy mající nukleotidovou sekvenci SEKV. ID. Č. 12 a SEKV. ID. Č. 19.
Vynález se dále týká soupravy pro identifikaci rostliny obsahující elitní událost RF-BNl podle předkládaného vynálezu, souprava obsahuje PCR sondy mající nukleotidovou sekvenci SEKV. ID. Č. 23 a SEKV. ID. Č. 41.
Vynález se také týká soupravy pro identifikaci elitní události MS-BNl a/nebo RF-BN1 v biologických vzorcích, tato souprava obsahuje alespoň jeden specifický primer nebo sondu mající sekvencí, která odpovídá (nebo je komplementární k) sekvenci mající identitu sekvence mezi 80 % a 100 % se specifickým úsekem MS-BNl a/nebo alespoň jeden specifický primer nebo sondu mající sekvenci, která odpovídá (nebo je komplementární k) sekvenci mající identitu sekvence mezi 80 % a 100 % se specifickým úsekem RF-BN1. Výhodně sekvence sondy odpovídá specifickému úseku obsahujícímu část 5' nebo 3' sousedícího úseku MS-BNl a/nebo RF-BNl. Nej výhodněji specifická sonda má (nebo je komplementární k) sekvencí mající identitu sekvence mezi 80 % a 100 % s rostlinnou DNA sekvencí v SEKV. ID. Č. 36 nebo SEKV. ID. Č. 38 pro MS-BNl nebo s rostlinnou DNA sekvencí v SEKV. ID. Č. 39 nebo SEKV. ID. Č. 40 pro RF-BNl.
Výhodně souprava podle vynálezu obsahuje, kromě primeru, který specificky rozpoznává 5' nebo 3' sousedící úsek MS-BNl a/nebo RF-BNl, druhý primer, který specificky rozpoznává sekvenci z MS-BNl a/nebo RF-BNl v cizorodé DNA, pro použití v PCR identifikačním protokolu. Výhodně, souprava podle vynálezu obsahuje dva (nebo . více) specifické primery, jeden, který rozpoznává sekvenci ve 3' hraničním úseku MS-BN1 a/nebo RF-BN1, nej výhodněji sekvenci v rostlinné DNA úseku SEKV. ID. Č. 36 nebo SEKV. ID. Č. 38 pro MS-BNl nebo v rostlinné DNA sekvenci SEKV. ID. Č. 39 nebo SEKV. ID. Č. 40 pro RF-BN1 a další, který rozpoznává sekvenci MS-BN1 a/nebo RF-BN1 v cizorodé DNA, v daném pořadí. Obzvláště výhodně primer rozpoznávající rostlinnou DNA sekvenci v 5' hraničním úseku MS-BNl obsahuje nukleotidovou sekvenci ze SEKV. ID. Č. 19. Konkrétně, primer rozpoznávající rostlinnou DNA sekvenci v 5' hraničním úsek MS-BNl obsahuje nukleotidovou sekvenci ze SEKV. ID. Č. 19 a primer rozpoznávající cizorodou DNA MS-BNl obsahuje nukleotidovou sekvenci ze SEKV. ID. Č. 12, popsáno v tomto textu. Obzvláště výhodně, primer rozpoznávající rostlinnou DNA sekvenci v 5' hraničním úseku RF-BNl obsahuje nukleotidovou sekvenci ze SEKV. ID. Č. 41. Konkrétně, primer rozpoznávající rostlinnou DNA sekvenci v 5' hraničním úseku MS-BNl obsahuje nukleotidovou sekvenci ze SEKV. ID. Č. 41 a primer rozpoznávajíc! cizorodou DNA z RF-BNl obsahuje nukleotidovou sekvenci ze SEKV. ID. Č. 23, popsáno v tomto textu.
Způsoby a soupravy podle předkládaného vynálezu mohou být použity pro odlišné účely, jako jsou například, ale bez omezení, následující: k identifikaci MS-BNl a/nebo RF-BNl v rostlinách, rostlinném materiálu nebo v produktech, jako jsou například, ale bez omezení, potraviny nebo krmné produkty (čerstvé nebo zpracované) obsahující nebo pocházející z rostlinného materiálu, dodatečně nebo alternativně mohou být použity způsoby a soupravy podle předkládaného vynálezu k identifikaci transgenního rostlinného materiálu pro účely segregace mezi transgenním a netransgenním materiálem, dodatečně nebo alternativně mohou být použity způsoby a soupravy podle předkládaného vynálezu k určování kvality (t j.
procento čistého materiálu) rostlinného materiálu obsahujícího MS-BNl a/nebo RF-BNl.
Je třeba mít na mysli, že konkrétní provedení vynálezu jsou popsána závislými patentovými nároky.
Popis obrázků
Následující detailní popis vynálezu uváděný jako příklad, aniž by omezoval vynález na popsaná specifická provedení, může/mohou být lépe pochopen ve spojení s doprovázejícími obrázky, jejichž seznam je následující:
Obr. 1. Plazmidová mapa pVE113
Obr. 2. Restrikční mapa získaná po štěpení MS-BN1 genomové DNA
Sekvence analyzované metodou „Southern blot: dráha 1, MS-BN1 DNA štěpená EcoRI, dráha 2, MS-BNl DNA štěpená EcoRV, dráha 3, MS-BN1 DNA štěpená Hpal, dráha 4, MS-BNl DNA štěpená AflIII, dráha 5, MS-BNl DNA štěpená Ndel, dráha 6, netransgenní ozimé řepky olejky DNA štěpená BamHI, dráha 7, netransgenní ozimé řepky olejky štěpená BamHI + DNA kontrolního plazmidu pTHWlO7 štěpená BamHI.
Obr. 3. Restrikční mapa získaná po štěpení RF-BNl genomové DNA
Sekvence analyzované metodou „Southern blot: dráha 1, RF-MS1 DNA štěpená BamHI, dráha 2, RF-BNl DNA štěpená EcoRI, dráha 3, RF-BNl DNA štěpená EcoRV, dráha 4, RF-BNl DNA štěpená Hindlll, dráha 5, netransgenní ozimé řepky olejky DNA štěpená BamHI, dráha 6, netransgenní ozimé řepky olejky štěpená BamHI + DNA kontrolního plazmidu pTHW118 štěpená BamHI.
í
Obr. 4. PCR analýza odlišných linií s použitím MS-BN1 PCR identifikačního protokolu. Nanesení sekvencí na gel: dráha 1, vzorek DNA z řepky olejky rostliny obsahující transgenní událost MS-BN1, dráha 2, vzorek DNA z řepky olejky rostliny obsahující další transgenní událost, dráha 3, DNA z divokého typu řepky olejky, dráha 4, negativní kontrola (voda), dráha 5, standard molekulární hmotnosti (100 bp „žebřík).
Obr. 5. PCR analýza odlišných linií s použitím RF-BNl PCR identifikačního protokolu. Nanesení sekvencí na gel: dráha 1, vzorek DNA z řepky olejky rostlin obsahující transgenní událost RF-BNl, dráha 2, vzorek DNA z řepky olejky rostlin obsahující další transgenní událost, dráha 3, DNA z divokého typu řepky olejky, dráha 4, negativní kontrol (voda), dráha 5, standard molekulární hmotnosti (100 bp „žebřík).
Detailní popis
Termín gen, jak se v tomto textu používá, se týká kterékoliv DNA sekvence obsahující několik operativně spojených DNA fragmentů, jako je například promotor a 5' netranslatovaný úsek (5'UTR), které spolu tvoří úsek promotoru, kódující úsek (který může nebo nemusí kódovat protein) a netranslatovaný 3' úsek (3'UTR) obsahující' polyadenylační místo. Typicky v rostlinných buňkách 5'UTR, kódující úsek a 3'UTR jsou transkribovány na RNA, která, v případě genu kódujícího protein, je translatována na protein. Gen může obsahovat další DNA fragmenty, jako jsou například introny. Jak se používá v tomto textu, genetický lokus je poloha daného genu v genomu rostliny.
• · ·
Termín chimérický při popisu genu nebo DNA sekvence je použit k označení toho, že gen nebo DNA sekvence obsahuje alespoň dva funkčně relevantní DNA fragmenty (jako je například promotor, 5'UTR, kódující úsek, 3'UTR, intron), které nejsou přirozeně spojeny jeden s druhým a pocházejí například z odlišných zdrojů.
Termín cizorodý při popisu genu nebo DNA sekvence vzhledem k rostlinným druhům je použit k označení toho, že gen nebo DNA sekvence není přirozeně nalézána v těchto rostlinných druzích nebo není přirozeně nalézána v tomto genetickém lokusu v těchto rostlinných druzích. Termín cizorodá DNA je použit v tomto textu při popisu DNA sekvence, která byla vnesena do genomu rostliny jako výsledek transformace.
Termín transformující DNA, jak se v tomto textu používá, se týká rekombinantní DNA molekuly použité pro transformace. Transformující DNA obvykle obsahuje alespoň jeden požadovaný gen (např. chimérický gen), který je schopen poskytnout transformované rostlině jednu nebo více specifických vlastností.
Termín rekombinantní DNA molekula je použit jako příklad a tedy může zahrnovat izolovanou molekulu nukleové kyseliny, která může být DNA a která může být získána rekombinantními nebo i dalšími postupy.
Termín transgen, jak se používá v tomto textu, se týká termín požadovaného genu, který byl vnesen do genomu rostliny. Termín transgenní rostlina se týká rostliny obsahující alespoň jeden transgen v genomu všech svých buněk.
Cizorodá DNA přítomná v rostlinách podle předkládaného vynálezu výhodně obsahuje dva požadované geny, konkrétněji, buďto gen samčí sterility a gen rezistence k herbicidu, nebo gen obnovující fertilitu a gen rezistence k herbicidu.
• 0
| 0 | 0 | 0 · 0 | 04 »0 |
| • | * | • 0 | #0· · |
| • | • 0 | 0 0 | 0 0 0 0 0 |
| • | • | • 0 | 0 »00 |
| • · · | 0 0 0 | • 0 0 >0 | 0 0 0 0 0 0 |
Termín gen samčí sterility, jak se v tomto textu používá, se týká genu, který po expresi v rostlině činí rostlinu neschopnou produkce fertilního, životaschopného pylu. Příkladem genu samčí sterility je gen obsahující DNA sekvenci kódující barnázu pod kontrolou promotoru směrujícího expresi do buněk tapeta. Konkrétněji, gen samčí sterility podle předkládaného vynálezu je gen PTA29-barnáza popsaný v tomto textu.
Termín gen obnovující fertilitu, jak se v tomto textu používá, se týká genu, který svou expresí v rostlině obsahující gen samčí sterility, je schopný zabránit fenotypové expresi genu samčí sterility, čili obnovit fertilitu rostliny. Konkrétněji gen obnovující fertilitu obsahuje DNA kódující protein nebo polypeptid schopný zabránit fenotypové expresi genu samčí sterility pod kontrolou promotoru směřujícího expresi alespoň do buněk, ve kterých je gen samčí sterility exprimován. Konkrétněji, gen obnovující fertilitu podle předkládaný vynálezu je gen TA29-barstar, jak je popsán v tomto textu.
Inkorporace rekombinantní DNA molekuly v rostlinném genomu je typicky výsledkem transformace buňky nebo pletiva (nebo dalších genetických manipulací). Konkrétní místo inkorporace je buďto náhodné nebo je v předem určené lokalizaci (pokud je použit způsob cílené integrace).
Cizorodá DNA může být charakterizována lokalizací a konfigurací v místě inkorporace rekombinantní DNA molekuly v rostlinném genomu. Místo v rostlinném genomu, kde byla vložena rekombinantní DNA, se také označuje jako inzerční místo nebo cílové místo. Inzerce (vložení) transgenu do rostlinného genomu může být spojena s delecí rostlinné DNA, označovanou jako delece cílového místa.
Termíny souse.dící úsek nebo sekvence sousedící » · » ·* .··..·· ,, ., ·**:::*.
• · · · · · !
• ·· ······.· • · ······ ··· ··· ··♦ «· ·· ···· („flanking region a „flanking sequence), jak se v tomto textu používají, se týkají sekvence alespoň délky 20 bp, výhodně alespoň 50 bp až 5000 bp rostlinného genomu, která je lokalizována buďto v protisměru a je bezprostředně přiléhající, nebo po směru a je bezprostředně přiléhající k cizorodé DNA. Transformační postupy vedoucí k náhodné integraci cizorodé DNA poskytují transformanty s odlišnými sousedícími úseky, které jsou charakteristické a unikátní pro každou transformantu. Když je transgen vnesen do rostliny metodou tradičního křížení, jeho inzerční místo v rostlinném genomu nebo jeho sousedící úseky se obecně nezmění. Termín inzerční úsek, jak se v tomto textu používá, se týká úseku odpovídajícímu alespoň 40 bp, výhodně alespoň 100 bp až více než 10000 bp, obsaženému v protisměru a po směru sousedících úsecích transgenu (tj . obklopujících transgen) v rostlinném genomu (netransformovaném) včetně inzerčního místa (a případné delece cílového místa). S ohledem na malé rozdíly v rámci biologického druhu způsobeného mutacemi, inzerční úsek si zachová alespoň 85%, výhodně 90%, výhodněji 95% a nejvýhodněji 100% sekvenční identitu se sekvencí obsahující úseky v protisměru a po směru sousedící s cizorodou DNA v rostlině tohoto druhu.
Exprese požadovaného genu se týká skutečnosti, že gen uděluje rostlině jeden nebo více fenotypových znaků (např. tolerance k herbicidu), které byly zamýšleny, že budou přeneseny tím, že se vnesen rekombinantní DNA molekula transformující DNA - použitá při transformaci (na základě struktury a funkce části nebo všech požadovaných genů ) .
Termín událost je definován jako (umělý) genetický lokus, který v důsledku genetické manipulace nese cizorodou DNA obsahující alespoň jednu kopii požadovaného genu. Typické alelové stavy události jsou přítomnost nebo absence cizorodé
• 4 44 • · · ·
DNA. Jak se v tomto textu specificky používá MS událost a RF událost se týkají události nesoucí gen TA29-barnázy a gen TA29-barstar, v uvedeném pořadí. Událost je charakterizována fenotypově expresí jednoho nebo více transgenů. Na genetické úrovni, událost je část genetické výbavy rostlin. Na molekulární úrovni je událost charakterizována restrikční mapou (např. určenou metodou Southern blotting) a/nebo v protisměru a/nebo po směru sousedící sekvencí transgenů a/nebo molekulární konfigurací transgenů. Obvykle transformace rostlin transformující DNA obsahující alespoň jeden požadovaný gen vede k mnohočetným událostem, z nichž každá je jedinečná.
Termín elitní událost, jak se v tomto textu používá, je událost, která je vybrána ze skupiny, kterou tvoří události, získané transformací stejnou transformující DNA nebo zpětným křížením s rostlinou získanou takovou transformací, na základě exprese a stability transgenů a jeho kompatibility s optimálními agronomickými charakteristikami rostlin, které ho obsahují. Tedy kritéria pro výběr elitní události jsou jedno nebo více, výhodně dvě nebo více, nejvýhodněji všechna následuj ící:
a) přítomnost transgenů neohrožuje další požadované vlastnosti rostlin, jako jsou například vlastnosti související s agronomickým výkonem nebo komerční hodnotou,
b) událost je charakterizována dobře definovanou molekulární konfigurací, která je stabilně děděna a pro kterou lze vyvinout vhodný diagnostický nástroj ke kontrole identity,
c) požadovaný gen (nebo geny) v transgenů projevuje správnou, vhodnou a prostorově i časově trvalou expresi fenotypu, jak při heterozygotním (nebo hemizygotním) tak i homozygotním výskytu události, v komerčně přijatelném stupni v rozmezí environmentálních - podmínek, ve kterých se rostliny nesoucí
·< 00 • 0 0 • · * • 0 · • · ·
0000 událost budou pravděpodobně vyskytovat při jejich normálním agronomickém použití.
Je výhodné, když je cizorodá DNA asociována s polohou v rostlinném genomu, která dovoluje introgresi do požadovaného komerčního genetického pozadí.
Status události jako elitní události je potvrzen introgresi elitní události do odlišného relevantního genetického pozadí a pozorováním shody s jedním, dvěma nebo všemi z výše uvedených kritérií a), b) a c) .
Navíc pro transgeny kódující samčí sterilitu a obnovu fertility popsané výše v tomto textu, výběr elitní události je také určen kompatibilitou mezi těmito událostmi, konkrétně tím, že potomstvo pocházející z křížení mezi rostlinou nesoucí událost samčí sterility a rostlinou nesoucí událost obnovitele fertility, ve kterém jsou obě události přítomny, má následující vlastnosti:
a) adekvátní fenotypovou expresi fenotypů obnovitele fertility, tj. samčí fertility, a
b) fenotypovou expresi v komerčně přijatelném stupni v rozmezí environmentálních podmínek, ve kterých se rostliny nesoucí událost budou pravděpodobně vyskytovat při jejich normálním agronomickém použití.
Termín elitní událost se tedy týká genetického lokusu obsahujícího transgen, který odpovídá výše popsaným kritériím. Rostliny, rostlinný materiál nebo potomstvo, jako je například semeno, mohou obsahovat jeden nebo více elitních událostí ve svém genomu.
Diagnostický nástroj vyvinutý k identifikaci elitní události rostlin nebo rostlinného materiálu obsahujících elitní událost, je založen na specifických genomových charakteristikách elitní události, jako je například
··· ·♦ ·♦ • · · • · · • · · • · · •0 ·♦·· specifická restrikční mapa genomového úseku obsahujícího cizorodou DNA a/nebo sekvence úseků sousedících s transgenem.
Termín restrikční mapa, jak se v tomto textu používá, se týká souboru „Southern blot profilů získaných po štěpení rostlinné genomové DNA konkrétním restrikčním enzymem nebo souborem restrikčních enzymů a hybridizaci se sondou sdílející sekvenční podobnost s transgenem v podmínkách standardní stringence. Podmínky standardní stringence, jak se v tomto textu používá, označují podmínky pro hybridizaci popsané zde nebo jako podmínky obvyklé pro hybridizaci jak byly popsány v příručce Sambrook et al. (1989) (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, NY), které například mohou zahrnovat následující kroky: 1) imobilizace fragmentů rostlinné genomové DNA na filtru, 2) prehybridizace filtru po dobu 1 až 2 hodin v podmínkách: 42 °C v 50% formamidu, 5X SSPE, 2X Denhardtova reagencie a 0,1% SDS nebo po dobu 1 až 2 hodin v 68 °C v 6X SSC, 2X Denhardtova reagencie a 0,1% SDS, 3) přidání hybridizační sondy, která byla označena, 4) inkubace po dobu 16 až 24 hodin, 5) promývání filtru po dobu 20 minut při teplotě místnosti v IX SSC, 0,1 %SDS, 6) promývání filtru třikrát po dobu 20 minut, vždy v 68 °C v 0,2 X SSC, 0,1% SDS a 7) expozice filtru po dobu 24 až 48 hodin na rentgenový film v -70 °C s intenzifikačním stínítkem.
Vzhledem k přítomnosti (endogenních) restrikčních míst v rostlinném genomu před inkorporací cizorodé DNA, inzerce cizorodé DNA změní specifickou restrikční mapu tohoto genomu. Tedy, konkrétní transformanta nebo z ní pocházející potomstvo mohou být identifikovány pomocí jednoho nebo více specifických restrikční profilů. Podmínky pro stanovení restrikční mapy události jsou popsány v protokolu pro identifikaci restrikční mapy. Alternativně, jakmile jeden nebo oba úseky sousedící s · · ·· ·» ·♦ ·· ·· ······· • · ····· · » ·· ·»···· · • · ··«··· «·· ·«· ··· ·· ·♦ ··*· transgenem byly sekvencovány, mohou být vyvinuty PCR sondy, které specificky rozpoznávají tyto sekvence podle PCR identifikačního protokolu. Rostliny nebo rostlinný materiál obsahující elitní událost mohou být identifikovány testováním podle PCR identifikačního protokolu použitím těchto specifických primerů.
Jak se používá v tomto textu, biologický vzorek je vzorek rostliny, rostlinný materiál nebo produkty obsahující rostlinný materiál. Termín rostlina zahrnuje také rostlinné pletiva, v jakémkoliv stádiu dospělosti, ozimé řepky olejky (Brassica napus), a také jakékoliv buňky, pletiva nebo orgány odebrané nebo pocházející z takových rostlin, včetně, avšak bez omezení, jakýchkoliv semen, listů, stonků, květů, kořenů, jednotlivých buněk, gamete, buněčných kultur, tkáňových kultur nebo protoplastů. Rostlinný materiál, jak se v tomto textu používá, se týká materiálu, který je získán nebo pochází z rostlin. Produkty obsahující rostlinný materiál jsou potraviny, krmivá, a nebo další produkty, které jsou vyráběny s použitím rostlinného materiálu nebo mohou být kontaminovány rostlinným materiálem. Je třeba rozumět, že v kontextu předkládaného vynálezu, takové biologické vzorky jsou výhodně testovány na přítomnost nukleových kyselin specifických pro MS-BNl a/nebo RF-BN1, ukazujících na přítomnost nukleových kyselin ve vzorcích. Tedy metody označované zde jako metody pro identifikaci elitní události MS-BNl a/nebo RF-BN1 v biologických vzorcích, se výhodně týkají identifikace nukleových kyselin, které obsahují elitní událost, v biologických vzorcích.
Termín souprava, jak se v tomto textu používá, se týká souboru reagencií pro účely provádění způsobu podle vynálezu, konkrétněji, identifikace elitní událost MS-BNl a/nebo RF-BN1 v biologických vzorcích. Konkrétněji, výhodné provedení »* ·* • * ···*· « » · 4 9 4 4 9 4 9 4
9 9 9 9 9 4 9
999 999 949 49 94 9944
Volitelně, reagencie protokolu.
soupravy podle vynálezu obsahuje alespoň jeden nebo dva specifické oligonukleotidové primery, jak bylo popsáno výše.
souprava může dále obsahovat jakékoliv další popsané v tomto textu v PCR identifikačním Alternativně, podle dalšího provedení vynálezu, souprava může obsahovat specifické sondy, jak bylo popsáno výše, které specificky hybridizují s nukleovou kyselinou biologického vzorku k identifikaci přítomnost MS-BN1 a/nebo RF-BNl ve vzorku. Volitelně, souprava může ještě dále obsahovat jakékoliv další reagencie (jako je například, ale bez omezení, hybridizační pufr, značka) pro MS-BN1 a/nebo RF-BNl v biologických vzorcích, specifických sond.
identifikaci s použitím
Souprava podle vynálezu může být použita a její složky mohou být specificky upraveny, pro účely kontroly kvality (např., čistota jednotlivých šarží semen), detekce elitní události v rostlinném materiálu nebo materiálu obsahujícím rostlinný materiál nebo pocházejícím z rostlinného materiálu, jako jsou například, ale bez omezení, potravinářké produkty nebo krmivá.
Předkládaný vynález se týká vývoje souboru elitních událostí u ozimé řepky olejky, MS-BN1 a RF-BNl, rostlin, obsahujících tyto události, potomstva získaného křížením těchto rostlin a také rostlinných buněk nebo rostlinného materiálu získaného z těchto událostí. Rostliny obsahující elitní událost MS-BN1 byly získány prostřednictvím transformace plazmidem pTHW107, jak bylo popsáno v příkladu 1. Rostliny obsahující elitní událost RF-BNl byly získány prostřednictvím transformace plazmidem pTHW118, jak je také popsáno v příkladu 1.
Rekombinantní DNA molekula použitá pro vytvoření elitní události MS-BN1 obsahuje DNA sekvenci kódující molekulu • 4 * 4 4 · ·
4 4 «
4 4 4 4 4 4
4 4 4 4 4
444 «4 4· 4444 barnázy pod kontrolou promotoru směrujícího expresi selektivně do buněk tapeta (nazvaná TA29-barnáza). TA29 promotor má tapetum selektivní expresní profil u řepky olejky (De Block a Debrouwer, Planta 189:218-225, 1993). Exprese genu TA29barnázy v rostlinách ozimé řepky olejky vede k destrukci tapeta, což činí rostliny sterilní - jde o rostliny se samčí sterilitou (Mariani et al, 1990, výše). Rekombinantní DNA molekula použitá pro vytvoření elitní události RF-BNl obsahuje DNA sekvenci kódující molekulu barstar pod kontrolou promotoru specifického pro tapetum (nazvaná PTA29-barstar) . Exprese genu TA29-barstar v rostlinách ozimé řepky olejky v přítomnosti genu TA29-barnázy zabraňuje aktivitě barnázy v buňkách tapeta, a tím zabraňuje destrukci tapeta, a tudíž obnovuje fertilitu těchto rostlin (Mariani et al. 1992, výše).
Obě rekombinantní DNA, které se užívají pro vytvoření elitní událost MS-BNl a RF-BNl, navíc obsahují DNA sekvence kódující enzym fosfinotricinacetyltransferázu a 35S promotor z viru mozaiky květáku (CMV), kde sekvence kódující fosfinotricinacetyltransferázu je pod kontrolou 35S promotoru (nazvaná 35S-bar). 35S promotor má konstitutivní expresní profil u řepky olejky, což znamená významnou expresi ve většině buněčných typů v průběhu většiny životního cyklu rostliny. Exprese genu 35S-bar v rostlině řepky olejky poskytuje rostlině rezistenci k herbicidním sloučeninám fosfinotricinu, bialafosu nebo glufosinatu, nebo obecněji, inhibitorům glutaminsyntetázy nebo jejich solím nebo optickým izomerům.
Rostliny ozimé řepky olejky nebo rostlinný materiál obsahující MS-BNl může být identifikován podle protokol identifikace restrikční mapy popsaného pro MS-BNl v příkladu 5 v tomto textu. Stručně, genomová DNA ozimé řepky olejky je štěpena výběrem několika (výhodně dvou až pěti) z
• · · • · · · · · následujících restrikčních enzymů: EcoRI, EcoRV, Ndel, Hpal, AflIII, pak je přenesena na nylonovou membránu a hybridizována s 3942 bp HindlII fragmentem plazmidu pTHWlO7 (nebo T-DNA v něm obsaženou). Pro každý restrikční enzym, který byl použit, se určí, zda mohou být identifikovány následující fragmenty:
- EcoRI: jeden fragment velikosti mezi 2140 a 2450 bp, výhodně přibližně 2266 bp a jeden fragment více než 14 kbp,
- EcoRV: jeden fragment velikosti mezi 1159 a 1700 bp, výhodně přibližně 1,4 kbp a jeden fragment více než 14 kbp,
- Hpal: jeden fragment velikosti mezi 1986 a 2140 bp, výhodně přibližně 1990 bp a jeden fragment velikosti mezi 2140 a 2450 bp, výhodně přibližně 2229 bp,
- AflIII: jeden fragment velikosti mezi 514 a 805 bp, výhodně přibližně 522 bp, jeden fragment velikosti mezi 2140 a 2450 bp, výhodně přibližně 2250 bp a jeden fragment velikosti mezi 2450 a 2838 bp, výhodně přibližně 2477 bp,
- Ndel: dva fragmenty délky mezi 5077 a 14057 bp, výhodně jeden délky přibližně 6500 bp a jeden délky přibližně 10 kbp.
Délky DNA fragmentů jsou určeny srovnáním se souborem DNA fragmentů známé délky, konkrétně Pstl fragmenty DNA fága lambda. Fragment delší než 14 kbp byl určen jako fragment délky mezi 14 kbp a 40 kbp, když extrakce DNA byla provedena způsobem podle Dellaporta et al. (1983, Plant Molecular Biology Reportér, 1, vol. 3, p. 19-21).
Jestliže rostlinný materiál po štěpení s alespoň dvěma, výhodně alespoň třemi, konkrétně s alespoň čtyřmi, a zejména pak se všemi uvedenými restrikční enzymy, poskytuje DNA fragmenty se stejnou délkou, jak byly popsány výše, rostlina ozimé řepky olejky je identifikována jako rostlina nesoucí • · · · · · • * · · · • · · · • a · · · ·
elitní událost MS-BNl.
Rostliny nebo rostlinný materiál obsahující MS-BNl mohou také být identifikovány podle PCR identifikačního protokolu popsaného pro MS-BNl v příkladu 5 v tomto textu. Stručně, genomová DNA ozimé řepky olejky je amplifikována PCR (polymerázovou řetězovou reakcí) s použitím primerů, které specificky rozpoznávají sousední sekvence MS-BNl, výhodně rozpoznávající 5' nebo 3' sousední sekvence MS-BNl popsané v tomto textu, konkrétně primer mající sekvenci SEKV. ID. Č. 19 a primer, který rozpoznává sekvence v transgenu, konkrétně primer mající sekvenci SEKV. ID. Č. 12. Endogenní primery ozimé řepky olejky jsou použity jako kontroly. Jestliže rostlinný materiál poskytne fragment mezi 260 a 300 bp, výhodně přibližně 280 bp, rostliny ozimé řepky olejky byly identifikovány jako rostliny nesoucí elitní událost MS-BNl.
Rostliny obsahující MS-BNl jsou fenotypově charakterizovány tím, že za absence genu obnovitele fertility v jejich genomu projevují samčí sterilitu. Rostliny se samčí sterilitou jsou definovány jako rostliny, které nejsou schopné vytvářet fertilní, životaschopný pyl.
Rostliny obsahující MS-BNl mohou být například získány ze semen obsahujících MS-BNl uložených v ATCC pod přístupovým číslem PTA-730. Takové rostliny pak mohou být dále množeny pro přenesení elitní události podle vynálezu na další kultivary stejného rostlinného druhu.
Rostliny ozimé řepky olejky nebo rostlinný materiál obsahující RF-BNl mohou být identifikovány podle protokolu identifikace restrikční mapy popsaného pro RF-BNl v příkladu 5 v tomto textu. Stručně, genomová DNA ozimé řepky olejky je štěpena výběrem (výhodně dvěma až čtyřmi) z následujících restrikčních enzymů: BamHI, EcoRI, EcoRV a HindlII, pak je přenesena na nylonovou membránu a hybridizována s 2182 bp Hpal fragmentem plazmidu pTHW118 (nebo T-DNA v něm obsaženou). Pro každý restrikční enzym se pak určí, zda mohou být identifikovány následující fragmenty:
- BamHI: jeden fragment délky mezi 805 a 1099 bp, výhodně přibližně 814 bp, jeden fragment délky mezi 1700 a 1986 bp, výhodně přibližně 1849 bp, jeden fragment délky mezi 2450 a 2838 bp, výhodně přibližně 2607 bp a jeden fragment délky mezi 5077 a 14057 bp, výhodně přibližně 6500 bp,
- EcoRI: jeden fragment délky mezi 805 a 1159 bp, výhodně přibližně 1094 bp, jeden fragment délky mezi 1986 a 2450 bp, výhodně přibližně 2149 bp a dva fragmenty délky mezi 5077 a 14057 bp, výhodně jeden délky přibližně 7000 bp a jeden přibližně 10 kbp,
- EcoRV: dva fragmenty délky mezi 5077 a 14057 bp, výhodně jeden přibližně 5,4 kbp a přibližně 8 kbp,
- HindlII: jeden fragment délky mezi 1700 a 1986 bp, výhodně přibližně 1969 bp a dva fragmenty mezi 2450 a 2838 bp, výhodně jeden přibližně 2565 bp a jeden přibližně 2635 bp,
Délky DNA fragmentů jsou určeny srovnáním se souborem DNA fragmentů známé délky, konkrétně Pstl fragmenty DNA fága lambda.
Jestliže rostlinný materiál po štěpení s alespoň dvěma, výhodně alespoň třemi, a zejména pak se všemi uvedenými restrikční enzymy, poskytuje DNA fragmenty se stejnou délkou, jak byly popsány výše, rostlina ozimé řepky olejky je identifikována jako rostlina nesoucí elitní událost RF-BN1.
Rostliny nebo rostlinný materiál obsahující RF-BN1 mohou také být identifikovány podle PCR identifikačního protokolu popsaného pro RF-BNl v příkladu 5 v tomto textu. Stručně, genomová DNA ozimé řepky olejky je amplífíkována PCR s použitím primeru, který specificky rozpoznává sousední • ·
sekvence RF-BNl, výhodně 5' nebo 3' hraniční sekvence RF-BNl popsané v tomto textu, konkrétně primer mající sekvenci SEKV. ID. Č. 41, a primer, který rozpoznává sekvence v transgenu, konkrétně primer mající sekvenci SEKV. ID. Č. 23. Endogenní primery ozimé řepky olejky jsou použity jako kontroly. Jestliže rostlinný materiál poskytuje fragment mezi 195 a 235 bp, výhodně přibližně 215 bp, rostliny ozimé řepky olejky jsou identifikovány jako rostliny nesoucí elitní událost RF-BNl.
Rostliny obsahující RF-BNl jsou charakterizovány tím, že gen barstar je exprimován v buňkách tapeta. Produkce genu v buňkách tapeta rostlin nemá ani prospěšný ani škodlivý účinek na tvorbu pylu, jak bylo ukázáno (Mariani et al. 1992, výše). Tedy za absence genu samčí sterility v genomu rostliny, gen TA29-barstar nemá za následek pozorovatelný fenotyp. V přítomnosti genu samčí sterility v genomu rostliny, gen TA29barstar poskytuje rostlinu s obnovenou fertilitou, tedy fertilní fenotyp. Fenotyp rostliny s obnovenou fertilitou je definován jako rostlina, která, i přes přítomnost genu samčí sterility ve svém genomu, je schopna produkce fertilního, životaschopného pylu.
Rostliny obsahující RF-BNl mohou být například získány ze semen uložených v ATCC pod přístupovým číslem PTA-730. Takové rostliny mohou být dále množeny a/nebo použity v obvyklých šlechtitelských postupech k přenesení elitní události podle vynálezu na další kultivary stejného rostlinného druhu.
Rostliny obsahující MS-BN1 a/nebo RF-BNl jsou také charakterizovány jejich tolerancí ke glufosinátu, což v kontextu předkládaného vynálezu zahrnuje rostliny, které jsou tolerantní k herbicidu Liberty™. Tolerance k herbicidu Liberty™ je definována kritériem, že postřik rostlin ve stádiu tří až čtyřech listů (3V až 4V) dávkou alespoň 200 gramů účinné složky/hektar (g.a.i./ha), výhodně 400 g.a.i./ha a • 1 případně až 1600 g.a.i./ha, obsahující MS-BNl a/nebo charakterizovány přítomností v buňkách, která se stanoví PAT supra).
• · ·· • · · • · · • · · · · · nezahubí rostliny. Rostliny RF-BNl mohou být dále fosfinotricinacetyltransferázy testem (De Block et al, 1987,
Rostliny ozimé řepky olejky podle vynálezu mohou být pěstovány obvyklým způsobem. Přítomnost genu 35S-bar zajišťuje, že jsou tolerantní ke glufosinátu. Tudíž plevele na polích, kde jsou tyto rostliny ozimé řepky olejky pěstovány, mohou být plevely hubeny aplikací herbicidů obsahujících glufosinát jako účinnou složku (jako je například Liberty™) .
Rostliny obsahující MS-BNl a/nebo RF-BNl jsou také charakterizovány tím, že mají agronomické vlastnosti, které jsou srovnatelné s komerčně dostupnými odrůdami ozimé řepky olejky v USA. Relevantní agronomické vlastnosti jsou: výška rostliny, síla/pevnost stonku, tendence k poléhání, zimuvzdornost, odolnost k rozpraskávání, tolerance k suchu, a rezistence k nemocem (černá hniloba, skvrnitost listů, Sclerotinia), produkce semen a výnos.
Bylo pozorováno, že přítomnost cizorodé DNA v inzerčních úsecích v genomu rostlin ozimé řepky olejky (Brassica napus) popsaných v tomto textu, konkrétněji v inzerčních místech genomu rostlin ozimé řepky olejky, poskytují zvláště zajímavé fenotypové a molekulární vlastnosti rostlinám, které obsahují tyto události. Konkrétněji, přítomnost cizorodé DNA v těchto konkrétních úsecích genomu těchto rostlin vede k trvalé fenotypové expresi transgenů, aniž by se významně zhoršil kterýkoliv z aspektů požadované agronomické výkonnosti rostliny, což činí tyto rostliny zejména vhodné pro produkci hybridní ozimé řepky olejky. Tedy, inzerční úseky odpovídající sekvencím SEKV. ID. Č. 22 a SEKV. ID. Č. 34, a v nich konkrétně inzerční místo MS-BNl a RF-BNl, jsou zejména vhodné • · · · « ··· ·· 44 44 pro vnesení požadovaných genů. Konkrétněji, inzerční úseky MS-BNl (SEKV. ID. Č. 22) a RF-BN1 (SEKV. ID. Č. 34) nebo inzerční místa MS-BN1 a RF-BN1, v daném pořadí, jsou zvláště vhodná pro vnesení plazmidů obsahujících gen samčí sterility a gen obnovující fertilitu, v daném pořadí, a zajišťují optimální expresi každého z těchto genů nebo obou genů v rostlině aniž by se zhoršila její agronomická výkonnost.
Rekombinantní DNA molekula může být specificky vložena do inzerčního úseku metodou cílené inzerce. Tyto metody jsou odborníkům dobře známy a patří k nim například homologní rekombinace s použitím rekombinázy, jako například, ale bez omezení, FLP rekombináza ze Saccharomyces cervisiae (US Patent 5,527,695), CRE rekombináza z fága Pl Escherichia coli (publikovaná PCT přihláška WO 9109957, rekombináza z pSRI Saccharomyces rouxii (Araki et al. 1985, J. Mol. Biol. 182:191-203) nebo rekombinační systém fága lambda jak byl popsán například v US Patentu 4,673,640.
Termín sekvenční identita, ve vztahu k nukleotidové sekvenci (DNA nebo RNA), se týká hodnoty počtu poloh s identickým nukleotidem děleného počtem nukleotidů v kratší ze dvou srovnávaných sekvencích. Porovnání dvou nukleotidových sekvencí se provádí algoritmem podle Wilbura a Lipmanna (Wilbur a Lipmann, 1983) s použitím parametrů: velikost okna 20 nukleotidů, délka slova 4 nukleotidy a penalta za mezeru 4. Počítačově prováděná analýza a interpretace sekvenčních dat, včetně srovnání sekvencí jak bylo popsáno výše, může být např. výhodně prováděna pomocí programů Intelligenetics™ Suitě (Intelligenetics lne., CA). Sekvence jsou v podstatě podobné když tyto sekvence mají sekvenční identitu alespoň přibližně 75 %, zejména alespoň přibližně 80 %, konkrétněji alespoň přibližně 85 %, a zvláště přibližně 90 %, obzvláště přibližně 95 %, a obzvláště přibližně 100%, a zejména *· ♦» 99
9 9 · 9
9 9 9 9 • 9 9 9 9 • ·· ·* ···<
obzvláště jde o sekvence zcela identické. Je jasné, že když jsou RNA sekvence v podstatě podobné, nebo mají jistý stupeň sekvenční identity s DNA sekvencí, thymin (T) v DNA sekvenci se považuje za shodný s uracilem (U) v RNA sekvenci.
Jak se používá v tomto textu, termín obsahující je třeba chápat jako specifikující přítomnost dané vlastnosti, hodnoty, kroku nebo složky, což přitom nevylučuje přítomnost nebo přidání jedné nebo více dalších vlastností, hodnot, kroků nebo složek nebo jejich skupin. Tedy např. nukleová kyselina nebo protein obsahující sekvenci nukleotidů nebo aminokyselin může obsahovat více nukleotidů nebo aminokyselin, než které jsou uvedeny, t j. může být např. vložena ve větší nukleové kyselině nebo proteinu. Chimérický gen obsahující DNA sekvenci, která je funkčně nebo strukturně definována, může obsahovat ještě další DNA sekvence, atd.
Následující příklady popisují vývoj a charakteristické vlastnosti rostlin ozimé řepky olejky obsahující elitní události MS-BN1 a RF-BN1.
Pokud není uvedenou jinak, všechny techniky rekombinantní DNA byly prováděny podle standardních protokolů popsaných
Molecular Cloning: A Cold Spring Harbour v příručce Sambrook Laboratory Manual, et al. (1989)
Second Edition,
Laboratory Press, NY, a nebo v dílech 1 a 2 příručky Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA. Standardní materiály a metody pro rostlinnou molekulární genetiku byly popsány v příručce Plant Molecular Biology Labfax (1993) R.D.D. Croy, publikované v BIOS Scientific Publications Ltd (UK) a Blackwell Scientific Publications, UK.
| V • · | * ·· ·· · · • · · | ·· | ·· • • | ||
| • • | • • | ||||
| • | • · « | • | • | • | |
| ··· ·· | • · | ···· |
V popisu
SEKV. ID.
SEKV. ID.
SEKV. ID.
SEKV. ID.
SEKV. ID.
SEKV. ID.
SEKV. ID.
SEKV. ID.
SEKV. ID.
SEKV. ID.
SEKV. ID.
SEKV. ID.
SEKV. ID.
SEKV. ID.
SEKV. ID.
SEKV. ID.
SEKV. ID.
SEKV. ID.
SEKV. ID.
SEKV. ID.
SEKV. ID.
SEKV. ID.
SEKV. ID.
SEKV. ID.
SEKV. ID.
SEKV. ID.
SEKV. ID.
SEKV. ID.
SEKV. ID.
i příkladech se odvolává na následující sekvence:
Č. 1: plazmid pTHW107
Č. 2: plazmid pTHW118
Č. 3: primer 248
Č. 4: primer 249
Č. 5: primer 247
Č. 6: primer 250
Č. 7: primer 251
Č. 8: primer 254
Č. 9: primer 258
Č. 10: primer SP6
Č. 11: primer T7
Č. 12: primer 201 (BNA01)
Č. 13: sekvence obsahující 5' sousedící úsek
MS-BN1
Č. 14: primer 611
Č. 15: primer 259
Č. 16: primer 260
Č. 17 : primer 24
Č. 18: sekvence obsahující 3’ sousedící úsek
MS-BN1
Č. 19: primer 51 (BNA02)
Č. 20: primer 48
Č. 21: sekvence obsahující deleci cílového místa MS-BN1
Č. 22: inzerční úsek MS-BN1
Č. 23: primer 193 (BNA03)
Č. 24: sekvence obsahující 5' sousedící úsek
1ZP-BN1
Č. 25: primer 286
Č. 27: primer 315
Č. 28: primer 316
Č. 29: primer 288
Č. 30: sekvence obsahující 3' sousedící ««· «· ····
| úsek RF-BN1 | ||||
| SEKV. | ID. | Č. | 31: | primer 269 |
| SEKV. | ID. | Č. | 32: | primer 283 |
| SEKV. | ID. | Č. | 33: | primer 284 |
| SEKV. | ID. | Č. | 34 : | integrační úsek RF-BN1 |
| SEKV. | ID. | Č. | 35: | primer 57 |
| SEKV. | ID. | Č. | 36: | sekvence obsahující 5' sousedící úsek |
| MS-BN1 v rostlině ozimé řepky olejky | ||||
| SEKV. | ID. | Č. | 37: | primer 68 |
| SEKV. | ID. | Č. | 38: | sekvence obsahující 3' sousedící úsek |
| MS-BN1 v rostlině ozimé řepky olejky | ||||
| SEKV. | ID. | Č. | 39: | sekvence obsahující 5' sousedící úsek |
| RF-BN1 v rostlině ozimé řepky olejky | ||||
| SEKV. | ID. | Č. | 40: | sekvence obsahující 3' sousedící úsek |
| RF-BNl v ozimé řepky olejky | ||||
| SEKV. | ID. | Č. | 41: | primer 268 (BNA04) |
| SEKV. | ID. | Č. | 42: | primer BNA05 |
| SEKV. | ID. | Č. | 43: | primer BNA06 |
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Transformace rostlin Brassica napus genem samčí sterility a genem obnovitele fertility
a) konstrukce chimérické DNA obsahující gen barnázy pod kontrolou promotoru specifického pro tapetum (pTHW107).
Plazmid pTHW107 (SEKV. ID. Č. 1) byl v podstatě získán z intermediátního vektoru pGSVl. PGSVl je sám odvozen z pGSC • · ······ ··· ··· ··· ·· ·· ····
1700 (Cornelissen a Vandewielle, 1989), ale obsahuje umělý T-úsek, který tvoří levá a pravá hraniční sekvence TL-DNA formy pTiB6S3 a multilinker klonovacích míst umožňující inzerci chimérického genu mezi T-DNA hraniční repetice. Vektor PGSV1 je poskytnut s genem barstar v hlavním čtecím rámci plazmidu, s regulačními signály pro expresi v E. coli.
Úplný popis DNA obsažené mezi hraničními repeticemi v pTHW107 je uveden v tabulce 1.
Tabulka 1: T-DNA plazmidu pTHW107
| nt polohy | Orientace | Popis a odkazy |
| 1-25 | Repetice pravé hranice z TL-DNA z pTiB6S3 (Gielen et al (1984) The EMBO Journal 3: 835-846). | |
| 26-97 | Sekvence odvozená ze syntetického polylinkeru | |
| 309-98 | Proti směru | 3' netranslatovaný konec z TL-DNA genu 7 (3'g7)z pTiB6S3 (Velten a Schell. (1985) Nucleic Acids Research 13: 6981-6998, Dhaese et al. (1983) The EMBO Journal 3: 835-846). |
| 310-330 | Sekvence odvozená ze syntetického polylinkeru |
| 882-331 | Proti směru | Kódující sekvence genu bar ze Streptomyces hygroscopícus (Thompson et al. (1987) The EMBO Journal 6: 2519- 2523). Dva N-koncové kodony kódujícího úseku bar divokého typu byly substituovány kodony ATG a GAC, v daném pořadí. |
| 2608-883 | Proti směru | Promotor genu malé podjednotky ribulóza- 1,5-bifosfátkarboxylázy atSIA z Arabidopsis thaliana (PssuAra) (Krebbers et al. (1988) Plant Molecular Biology 11: 745-759). |
| 2609-2658 | Sekvence odvozená ze syntetického polylinkeru | |
| 2919-2659 | Proti směru | 260 bp Taql fragment z 3' netranslatovaného konce genu nopalinsyntázy (3'nos) z T-DNA pTiT37 a obsahující rostlinný polyadenylační signál (Depicker et al. (1982) Journal of Molecular and Applied Genetics 1: 561-573) . |
| 2920-3031 | 31netranslatovaný úsek po směru (downstream) od kódující sekvence barnázy z B. Amyloliquefaciens | |
| 3367-3032 | Proti směru | Kódující úsek genu barnázy z Bacillus amyloliguefaciens (Hartley (1988) Journal of Molecular Biology 202:913- 915) . |
··· ··· ··· ·· ·♦ ····
| 4877-3368 | Proti | Promotorový úsek | anther-speciíického |
| směru | (prašníkově specifického) genu TA29 z Nicotiana tabacum. Promotor obsahuje 1,5 kb sekvenci v protisměru (upstream) od ATG iniciačního kodonu (Seurinck et al. (1990) Nucleic Acids Research 18: 3403) . | ||
| 4878-4921 | Sekvence odvozená polylinkeru | ze syntetického | |
| 4922-4946 | Repetice levé hranice (Gielen et al (1984 835-846). | z TL-DNA Z pTiB6S3 ) EMBO Journal 3: |
b) Konstrukce chimérické DNA obsahující gen barstar pod kontrolou konstitutivního promotoru (pTHW118)
Plazmid pTHW118 (SEKV. ID. Č. 2) byl také v podstatě odvozen z intermediátního vektoru pGSV 1 (popsán výše). Kompletní popis DNA obsažené mezi hraničními repeticemi v pTHW118 je uveden v tabulce 2.
Tabulka 2: T-DNA plazmidu pTHW118
| nt polohy | Orientace | Popis a odkazy |
| 1-25 | Repetice pravé hranice z TL-DNA z pTiB6S3 (Gielen et al (1984) The EMBO Journal 3: 835-846). | |
| 26-53 | Sekvence odvozená ze syntetického polylinkeru |
• · · · · ·
| 54-90 | Reziduální sekvence z TL-DNA v repetici pravé hranice. | |
| 91-97 | Sekvence odvozená ze syntetického polylinkeru | |
| 309-98 | Proti směru | 3' netranslatovaný konec z TL-DNA genu 7 (3'g7)z pTiB6S3 (Velten a Schell. (1985) Nucleic Acids Research 13: 6981-6998, Dhaese et al. (1983) The EMBO Journal 3: 835-846). |
| 310-330 | Sekvence odvozená ze syntetického polylinkeru | |
| 883-331 | Proti směru | Kódující sekvence genu rezistence k bialafosu (bar) ze Streptomyces hygroscopicus (Thompson et al. (1987) The EMBO Journal 6: 2519-2523). Dva kodony N-konce kódujícího úseku baz divokého typu byly nahrazeny kodony ATG a GAC, v daném pořadí. |
| 2608-883 | Proti směru | Promotor genu malé podjednotky ribulóza- 1,5-bifosfátkarboxylázy atSIA z Arabidopsis thaliana (PssuAra) (Krebbers et al. (1988) Plant Molecular Biology 11: 745-759). |
| 2609-2658 | Sekvence odvozená ze syntetického polylinkeru |
| 2919-2659 | Proti směru | 260 bp Taql fragment z 3' netranslatovaného konce genu nopalinsyntázy (3'nos) z T-DNA pTiT37 a obsahující rostlinný polyadenylační signál (Depicker et al. (1982) Journal of Molecular and Applied Genetics 1: 561-573). |
| 2920-2940 | Sekvence odvozená ze syntetického polylinkeru | |
| 2941-2980 | 3'netranslatovaný úsek po směru (downstream) od barstar kódující sekvence z Bacillus amyloliguefaciens | |
| 3253-2981 | Proti směru | Kódující úsek genu barstar z Bacillus amyloliguefaciens (Hartley (1988) Journal of Molecular Biology 202:913- 915) . |
| 4762-3254 | Proti směru | Promotorovy úsek anther-specifického (prašníkově specifického) genu TA29 z Nicotiana tabacum. Promotor obsahuje 1,5 kb sekvenci v protisměru (upstream) od ATG iniciačního kodonu (Seurinck et al. (1990) Nucleic Acids Research 18: 3403) . |
| 4763-4807 | Sekvence odvozená ze syntetického polylinkeru | |
| 4808-4832 | Repetice levé hranice z TL-DNA z pTiB6S3 (Gielen et al (1984) EMBO Journal 3: 835-846). |
c) Transformace rostlin Brassica napus
Pro transformaci rostlin Brassica napus byl užit vektorový systém, který byl popsán v Deblaere et al. (1985, 1987).
Vektorový systém sestává z kmene Agrobacterium a dvou plazmidových složek: 1) non-onkogenní Ti-plazmid (pGV400) a
2) intermediátní klonovací vektor založený na plazmidu pGSV 1. Non-onkogenní Ti-plazmid z něhož byla odstraněna T-oblast nese geny vir nezbytné pro přenos umělé T-DNA klonované do druhého plazmidu do rostlinného genomu. Kmeny Agrobacteria vzniklé triparentální konjugací mezi uvedenými složkami pak mohou být použity pro transformaci rostlin.
Selekce byla prováděna na fosfinotricinu (PPT) ve všech stádiích, s výjimkou regenerace rostlinek, která probíhala bez přítomnosti PPT, aby se urychlil růst. Tak byl připraven soubor primárních transformant (rostliny generace To) .
Příklad 2
Vývoj genetických událostí
2.1. Charakterizace transgenní události
2.1.1. Analýza MS události metodou Southern blot
Přítomnost transgenu a počet genových inzercí byly kontrolovány standardní metodou analýzy Southern blot. Celková genomová DNA byla izolována z 1 g pletiva nadzemních částí rostlin podle Dellaporta (1983, Plant Molecular Biology Reportér, 1, vol,3, p,19-21 nebo Doyle et al. 1987, Phytochem. Bull. 19:11) a štěpena restrikčním enzymem Sací. Sací má unikátní restrikční místo v T-DNA fragmentu, ležící mezi • · · konstrukty s geny barnázy a bar. Southern analýza byla prováděna s následujícími dvěma sondami:
Sonda barnáza: 478 bp Pstl-EcoRI fragment plazmidu pVEH3 Sonda bar: 546 bp NcoI-BglII fragment plazmidu pDEHO
Plazmidy pVE113 a pDEHO jsou popsány na obrázku 1 a v dokumentu WO 92/09696, v uvedeném pořadí. Hybridizace MS událostí se sondou „barnáza poskytla 12 Kb pás, zatímco hybridizace se sondou „bar poskytla 14 Kb fragment. Relativní intenzita pásů poskytla indikaci toho, zda rostliny byly homozygotní nebo hemizygotní pro transgenní lokus. U obou událostí byla zjištěna jednoduchá inzerce. To bylo potvrzeno skutečností, že segregační profil transgenu mohl být vysvětlen na principu mendelovské dědičnosti jednoho lokusu.
2.1.2. Analýza RF události metodou Southern blot
Přítomnost transgenu a počet genových inzercí byly kontrolovány standardní metodou analýzy Southern blot. Celková genomová DNA byla izolována z 1 g pletiva nadzemních částí rostlin podle Dellaporta (1983, Plant Molecular Biology Reportér, 1, vol,3, p,19-21 nebo Doyle et al. 1987, Phytochem. Bull. 19:11) a štěpena restrikčním enzymem Sací. Sací má unikátní restrikční místo v T-DNA fragmentu, ležící mezi konstrukty s geny barnázy a bar. Southern analýza byla prováděna s následujícími dvěma sondami:
Sonda barnáza: 436 bp HindlII-Pstl fragment plazmidu pVE113 Sonda bar: 546 bp NcoI-BglII fragment plazmidu pDEHO
Hybridizace MS událostí se sondou „barnáza poskytla 3 Kb pás, zatímco hybridizace se sondou bar poskytla 14 Kb fragment. Relativní intenzita pásů poskytla indikaci toho, zda rostliny byly homozygotní nebo hemizygotní pro transgenní lokus. U několika událostí byla zjištěna jednoduchá inzerce.
·· ·· ·«
To bylo potvrzeno skutečností, že segregační profil transgenu mohl být vysvětlen na principu mendelovské dědičnosti jednoho lokusu.
2.1.3. Obecný fenotyp a agronomická výkonnost rostlin
Rostliny Tx generace u obou událostí MS a RF byly vyhodnoceny na řadu fenotypových znaků, jako je např. výška rostliny, síla/pevnost stonku, tendence k poléhání, zimuvzdornost, odolnost k rozpraskávání, tolerance k suchu, a rezistence k nemocem (černá hniloba, skvrnitost listů, Sclerotinia), produkce semen a výnos.
Linie byly hodnoceny jako podobné (nebo zlepšené) v uvedených agronomických charakteristikách ve srovnání s netransformovanou odrůdou a také s řadou kultivarů řepky olejky. V některých případech rostliny segregovaly z důvodu somaklonální variace pro jeden nebo více z výše uvedených znaků. Pokud to nevedlo k vnesení komerčně zajímavého fenotypového znaku, takové rostliny byly odstraněny.
2.2. vývoj linií nesoucích znaky MS nebo RF
Různé hemizygotní rostlinky To generace (Ms/- nebo Rf/) byly přeneseny z pletivoových kultur do půdy ve skleníku. Přítomnost transgenu a počet genových kopií byly kontrolovány Southern blot analýzou, jak bylo popsáno výše. Rostliny byly ponechány do kvetu, a pak byla vyhodnocena
Rostliny TO generace byly typu rostliny (-/-) pro Tl semena byla vyseta a dále sterilita nebo fertilita kvetu kříženy s rostlinami divokého vytvoření Tl semen (MsTl a RfTl) pěstována ve skleníku. Rostliny byly pak hodnoceny na toleranci ke glufosinátu amonnému. Ms-Tl rostliny byly také hodnoceny na segregaci sterility/fertility (u nepostříkaných
9 9
99
9 9 9 9 9
9 9 9 9 9
999 9 9 9
9 9 9 9 9
999 99 99 9999 rostlin)r zatímco Rf-Tl rostliny byly kontrolovány na fertilitu květů.
Ms-Tl rostliny obsahující transgen byly kříženy s testovacími rostlinami homozygotními pro gen obnovující fertilitu (Rf/Rf), pro produkci MsRf-Fl semen. Tato semena (Ms/-, Rf/- a Rf/-) byla vyseta ve skleníku a ošetřena postřikem Liberty™. Zbylé F1 potomstvo bylo vyhodnoceno na segregaci fertility/sterility pro ověření toho, zda znak samčí sterility může být adekvátně obnoven u Brassica napus (fertilita blízká 100 %).
. Nej lepší události byly vybrány pro další testování. Ms-Tl rostliny byly kříženy s homozygotním obnovitelem fertility a semena byla vyseta na poli. Rostliny pak byly hodnoceny na toleranci k herbicidu Liberty™ (800 gramů účinné složky na hektar (g.a.i./ha), přičemž doporučená dávka pro rolníky je 400 g.a.i./ha), segregaci fertility/sterility a na obecné fenotypové vlastnosti. Linie, u kterých došlo ke 100% obnovení fertility a u kterých nebyly pozorovány žádné negativní změny ve fenotypu nebo agronomické výkonnosti (podrobně viz (d) ) ve srovnání s isogenní kontrolou divokého typu, byly selektovány.
Rf-Tl rostliny obsahující transgen byly kříženy s testovacími rostlinami obsahujícími gen samčí sterility (Ms/-) pro produkci F1 semen. Tato semena byla pěstována ve skleníku, postříkána herbicidem Liberty™ a pak byla vyhodnocena obnova fertility (blízko ke 100 %).
Mezitím byl Rf-Tl rostliny samosprášeny pro získání generace Sl. Sl rostliny byly pěstovány ve skleníku, ošetřeny postřikem herbicidu Liberty™ a opět samosprášeny pro vytvoření generace S2, z S2 pak byly vybrány homozygotní rostliny.
·· ···· • ·. · · · · · · ·
9 9 9 9 9
4 4 9 9 9 9 9 • · 4 4 4 4
444 444 944 44
2.3. Kombinace událostí MS a RF.
Vybrané Ms-Tl rostliny byly kříženy s vybranými Rf-S2 událostmi ve skleníku pro otestování obnovy fertility. Semena byla vyseta ve skleníku, na rostliny byl aplikován postřik Liberty™ a byla kontrolována fertilita květů.
2.4. Testování MS a RF události v odlišném genetickém základu a v odlišný lokalizaci
Vybrané události byly vneseny do dvou odlišných genetických základů, které jsou heteroticky odlišné, k prokázání toho, že MS a RF události jsou plně funkční a neměly žádné negativní účinky na výnos nebo kvalitu u žádného z testovaných základů.
Současně byly vybrané MS a RF události testovány ve čtyřech až pěti odlišných prostředích ke zjištění toho, zda není negativní interakce mezi prostředím a MS nebo RF událostí.
V dalším stádiu byla produkce hybridních semen s použitím vybraných MS a RF událostí testována extenzivněji v polních podmínkách. Vybraná MS událost ve svém původním genetickém základu a ve dvou odlišných a heteroticky odlišných základech byly kříženy s vybranou RF událostí, také ve svém původním genetickém základu a ve dvou odlišných a heteroticky odlišných základech. Fl hybridi byly hodnoceni na rezistenci k herbicidu Liberty™, fertilitu a také celkovou agronomickou výkonnost (výnos a kvalita).
2.5. Selekce elitní události
Výše popsaný postup selekce při vývoji transgenních MS linií poskytl několik elitních událostí, které vykazovaly
| 4 | • | » | ·· | ·« | ·· | ||
| ·· · | • · | • · · | • | • | • | • | |
| • | • | • · | • | • | * | • | |
| • | • • · · | • · • · · | • • · | • | ·· | • | • • »·· |
optimální expresi transgenu, tj. rezistenci ke glufosinátu amonnému, fenotyp samčí sterility a schopnost kompletní obnovy fertility s homozygotní obnovitelskou linií, konkrétně s vybranou RF elitní událostí.
Výše popsaný selekční postup při vývoji transgenních RF linií poskytl několik elitních událostí, které vykazovaly
| optimální | expresi | transgenu, | tj. rezistenci ke | glufosinátu |
| amonnému, | a schopnost obnovy | fertility Fl, když | se kříží s | |
| rostlinou | nesoucí | gen samčí | sterility, konkrétně | s vybranou |
| MS elitní | událostí. | |||
| Příklad 3 | ||||
| Vnesení vybraných | kandidátních elitních událostí | do rostlin |
ozimé řepky olejky
Několik MS a RF elitních událostí, které byly vyvinuty u rostlin B. napus, jak bylo popsáno výše, bylo vneseno do kultivaru ozimé řepky olejky opakovaným zpětným křížením rostlin odrůdy Drakkar.
Rostliny byly vyšetřeny a bylo zjištěno následující:
a) Přítomnost cizorodé DNA nijak nepoškozuje další požadované charakteristiky rostlin, jako jsou například vlastnosti související s agronomickou výkonností nebo komerční hodnotou,
b) událost byla charakterizována dobře definovanou molekulární konfigurací, která byla trvale děděna,
c) požadované geny v cizorodé DNA vykazují správnou, vhodnou a trvalou prostorovou i časovou fenotypovou expresi, jak v heterozygotním (nebo hemizygotním) tak i homozygotním výskytu události, v komerčně přijatelném stupni a v rozsahu »9 ·« ·· * · ·
9 ·»··*· • · · ··»··« · • » ······ ·«· ··· ··· et »· ·»«· environmentálních podmínek, kterým rostliny nesoucí událost budou pravděpodobně vystaveny při jejich normálním agronomickém použití.
Dále, rostliny byly vyhodnoceny na jejich agronomicky významné vlastnosti a výkonnost ve srovnání s divokým typem ozimé řepky olejky.
Extenzivní testování v polních podmínkách ukázalo, že určité kandidátní elitní události u jarní řepky olejky, když byly přeneseny na ozimé řepky olejky, vedly ke vzniku rostlin, které vykazovaly adekvátní expresi požadovaných genů v cizorodé DNA ve spojení s optimální agrónomickou výkonností. Tyto události byly vybrány jako MS a RF elitní události u ozimé řepky olejky a byly nazvány MS-BN1 a RF-BN1, v uvedeném pořadí.
Příklad 4
Charakterizace elitních událostí MS-BN1 a RF-BN1
Jakmile byly jednou události MS-BNl a RF-BN1 identifikovány jako elitní události, kdy exprese požadovaných transgenů a také celková agronomická výkonnost byly optimální, lokusy transgenů byly analyzovány podrobněji na molekulární úrovni. To zahrnovalo detailní analýzu metodou Southern blot (s použitím vícečetné sady restrikčních enzymů) a sekvencování úseků sousedících s transgenem.
4.1. Southern blot analýza s použitím více restrikčních enzymů
Pletivo listů bylo odebráno z transgenních a kontrolních rostlin. Celková genomová DNA byla izolována z pletiva listů metodou podle Dellaporta et al. (1983, Plant Molecular Biology • « · · · · · * • ·· ······ · t · ······ ··· ··· ··· ·· ·· ····
Reportér, 1, vol. 3, p,19-21). DNA koncentrace každého preparátu pak byla určena měřením optické denzity na spektrofotometru při vlnové délce 260 nm.
μρ genomové DNA bylo štěpeno restrikčním enzymem v reakci o celkovém objemu 40 μΐ, a sice v podmínkách podle doporučení výrobce enzymu. Doba štěpení a/nebo množství restrikčního enzymy byly upraveny tak, aby bylo zajištěno úplné štěpení vzorků genomové DNA bez nespecifické degradace. Po štěpení bylo k naštěpené DNA přidáno 4 μΐ nanášecího barviva a vzorky byly naneseny na 1% agarózový gel.
Následující kontrolní DNA byly také naneseny na gel:
- negativní kontrola s genomovou DNA připravenou z netransgenní rostlin Brassica. Tato negativní kontrola je použita k potvrzení absence pozadí hybridizace.
- DNA pozitivní kontrola: s heterozygotní integrací jedné kopie transgenů do genomu Brassica napus, 10 μς genomové DNA má stejný počet molekul jako přibližně 19 pg DNA 1501 bp Pvul-HindlII fragmentu pTHWH8 (velikost diploidního genomu Brassica napus: 0,8x109 bp) . Množství představující jednu kopii plazmidu na celý genom bylo přidáno k 1 μς naštěpené DNA z netransgenní Brassica napus. Takto rekonstituovaný vzorek byl použit k ukázání toho, že hybridizace jsou prováděny v podmínkách umožňujících hybridizaci sondy s cílovou sekvencí.
DNA fága Lambda (kmen Clind 1 ts 857 Sam 7, Life
Technologies) štěpený Pstl byl zahrnut jako velikostní standard.
Po elektroforéze byly DNA vzorky (štěpená genomová DNA
Brassica, kontroly a DNA sloužící jako velikostní standard) byly přeneseny na nylonovou membránu pomocí kapilárního • · * * · 0 0 • 0 · · 0 · · • · 0 · · ·
0 · 0 0 0 • 00 · · ·· 0··· blottingu trvajícího 12 až 16 hodin.
DNA templáty použité pro přípravu sond pro MS-BNl událost byly připraveny restrikčním štěpením PTW107 enzymem HindlII. Tak byl vyštěpen 3942 bp DNA fragment, relevantní část transformující DNA (část který obsahoval PSSUARA, 3'nos, barnáza, PTA29).
DNA templáty použité pro přípravu sondy pro RF-BNl události byly připraveny restrikčním štěpením PTW118 enzymem Hpal. Tak byl vyštěpen 2182 bp DNA fragment, který obsahoval relevantní části transformující DNA (část PSSUARA, 3'nos, barstar, PTA29).
Po purifikaci byly DNA fragmenty značeny standardním postupem a byly použity k hybridizací na membráně.
Hybridizace byla prováděna v podmínkách standardní stringence: značená sonda byla denaturována zahříváním po dobu 5 až 10 minut ve vodní lázni na teplotu 95 °C až 100 °C a pak ochlazením na ledu po dobu 5 až 10 minut, a po té byla přidána k hybridizačnímu roztoku (6 X SSC (20 X SSC je 3,0 M NaCl, 0,3 M citrát sodný, pH 7,0), 5 X Denhardtovo činidlo (100 X Denhardt = 2% Ficoll, 2% polyvinylpyrolidon, 2% bovinní sérový albumin), 0,5% SDS a 20 pg/ml denaturované nosičové DNA (jednořetězcová DNA z rybího spermatu, s průměrnou délkou 120 až 3000 nukleotidů). Hybridizace byly prováděny přes noc v 65 °C. Bloty byly promývány třikrát po dobu 20 až 40 minut v 65 °C, promývacím roztokem (2 X SSC, 0,1 SDS).
Autoradiografy byly elektronicky skenovány.
4.1.1. MS-BNl
Restrikční profil získaný po štěpení MS-BNl genomové DNA s různými restrikční enzymy je uveden na obrázku 2 a přehledně • · shrnut v tabulce 3.
Tabulka 3: Restrikční mapa MS-BN1
| Číslo dráhy | Nanesená DNA | Migrace hybridizujících DNA fragmentů mezi pásy velikostního standardu | Určená délka hybridizuj ících DNA fragmentů | |
| Větší než | Menší než | |||
| 1 | MS-BN1 - EcoRI | 2140 14057 | 2450 | 2266 bp (*) >14 kbp |
| 2 | MS-BN1 - EcoRV | 1159 14057 | 1700 | 1,4 kbp (*) >14 kbp |
| 4 | MS-BN1 - Hpal | 1986 2140 | 2140 2450 | 1990 bp 2229 bp |
| 5 | MS-BN1 - AflIII | 2450 2140 514 | 2838 2450 805 | 2477 bp (*) 2250 bp 552 bp (*) |
| 6 | MS-BN1 - Ndel | 5077 5077 | 14057 14057 | 10 kbp 6510 bp |
| 7 | Netransgenní ozimé řepky olej ky | |||
| 8 | Kontrolní plazmidová DNA - BamHI | 1700 2450 | 1986 2838 | 1966 bp (*) 2607 bp (*) |
(*) délky těchto fragmentů byly predikovány na základě restrikční mapy plazmidu pTHW107
4.1.2. RF-BNl
Restrikční profil získaný po štěpení RF-BNl genomové DNA « · • · 4 ♦* ·· » · · · · · 0 4 · • 4 »4404 ·
04 44444 4 *
4 4 4 4 4 4 0
444 444 444 44 ** 4 4 4«· s různými restrikční enzymy je uveden na obrázku 3 a přehledně shrnut v tabulce 4.
Tabulka 4: Restrikční mapa RF-BNl
| Číslo | Nanesená DNA | Migrace | Určená | délka | |
| dráhy | hybridizujících DNA | hybridizuj ících | |||
| fragmentů | mezi pásy | DNA fragmentů | |||
| velikostního | |||||
| standardu | |||||
| Větší než | Menší než | ||||
| 1 | MS-BNl - BamHI | 805 | 1099 | 814 bp | |
| 1700 | 1986 | 1849 bp | (*) | ||
| 2450 | 2838 | 2607 bp | *) | ||
| 5077 | 14057 | 6580 bp | |||
| 2 | MS-BNl - EcoRI | 805 | 1159 | 1094 bp | |
| 1986 | 2450 | 2149 bp | |||
| 5077 | 14057 | 7000 bp | |||
| 5077 | 14057 | 10 kbp | |||
| 3 | MS-BN1 - EcoRV | 5077 | 14057 | 5,4 kbp | |
| 5077 | 14057 | 8 kbp | |||
| 4 | MS-BNl -HindlII | 1700 | 2140 | 1969 bp | |
| 2450 | 2838 | 2565 bp | |||
| 2450 | 2838 | 2635 bp | |||
| 6 | Netransgenní ozimé řepky olej ky | ||||
| 5 | Kontrolní | 1700 | 1986 | 1849 bp | (*) |
| plazmid DNA | 2450 | 2838 | 2607 bp | (*) | |
| - BamHI | 5077 | 14057 | 8100 bp |
(*) délky těchto fragmentů byly predikovány na základě restrikční mapy plazmidu pTHW107 ♦ · *
4.2. Identifikace sousedící úseky
Sousedící úseky elitní události MS-BNl a RF-BNl byly nejdříve identifikovány pro jarní řepky olejky, ve kterých události byly vyvinuty, a pak kontrolovány u ozimé řepky olej ky.
4.2.1. Identifikace úseků sousedících s MS-BNl
4.2.1.1. Pravý (5') sousedící úsek
Pro stanovení sekvence sousedícího úseku MS-BNl na pravé hranici byla užita ligací-zprostředkovaná polymerázová řetězová reakce (Mueller et al. 1989, Science 780-786, Marině t al., 1994, PCR Methods and Applications, 71-75) s extenzním záchytem („extension capture) (Tormanen et al., 1993, NAR 20:5487-5488).
Oligonukleotidy použité pro přípravu linkeru byly následuj ící:
MDB248: (SEKV. ID. Č. 3)
5'CAT.GCC.CTG.ACC.CAG.GCT.AAG.TAT.TTT.AAC.TTT.AAC.CAC.TTT.
GCT.CCG.ACA.GTC.CCA.TTG
MDB249: (SEKV. ID. Č. 4)
5'CAA.TGG.GAC.TGT.CGG.AGG.ACT.GAG.GGC.CAA.AGC.TTG.GCT.CTT.AGC.
CTG.GGT.CAG.GGC.ATG
Po přípravě linkeru následovala syntéza prvního řetězce z genomové MS-BNl DNA štěpené Ncol, s použitím biotinylovaného genově specifického primeru:
#·· ··· ··· ♦· »* ····
| Sekvence (5 ' -»3 ') | Poloha v PTHW107 | |
| Biotinylovaný primer MDB247 | CCG.TCA.CCG.AGA.TCT.GAT.CTC.ACG.CG (SEKV. ID. Č. 5) | 322 <- 347 |
Linker pak byl ligován k prvnímu řetězci DNA, který pak byl kondenzován k magnetickým perličkám, ze kterých byl nebiotinylovaný řetězec eluován. Tato DNA byla použita pro PCR amplifikaci ve větším měřítku s použitím následujících primerů:
| Sekvence (5 ' -»3 ') | Poloha v PTHW107 | |
| Linkerový primer MDB250 | GCACTGAGGGCCAAAGCTTGGCTC (SEKV. ID. Č. 6) | |
| T-DNA primer MDB251 | GGA.TCC.CCC.GAT.GAG.CTA.AGC.TAG.C (SEKV. ID. Č. 7) | 293 <r- 317 |
Tato PCR poskytla fragment přibližně 1150 bp. Tento fragment pravé hranice (RB) byl eluován z agarózového gelu a na lOOnásobně zředěné této DNA byla provedena sdružená („nested) PCR s použitím následujících primerů:
| Sekvence (5 '->3 ') | Poloha v PTHW107 | |
| „Nested linkerový primer MDB254 | CTTAGCCTGGGTCAGGGCATG (SEKV. ID. Č. 8) | |
| T-DNA primer MDB258 | CTA.CGG.CAA.TGT.ACC.AGC.TG (SEKV. ID. Č. 9) | 224 243 |
Tato reakce poskytla fragment velikosti přibližně 1000 bp,
4 44# ·· « 4 44 4 4 4 » » ·
4 4 · · 4 4 ·· 4*4444
4 444444
444 444 444 44 *· 4444 který byl eluován z agarózového gelu, purifikován a ligován do vektoru pGem®-T. Rekombinantní plazmidová DNA byla podrobena screeningu s použitím standardní PCR reakce s následujícími primery:
| Sekvence (5 ' ->3 ' ) | Poloha v PTHW107 | |
| SP6 primer | TAA.TAC.GAC.TCA.CTA.TAG.GGC.GA (SEKV. ID. Č. 10) | (SP6 promotor ve vektoru PGem®-T) |
| T7 primer | TTT.AGG.TGA.CAC.TAT.AGA.ATA.C (SEKV. ID. Č. 11) | (T7 promotor ve vektoru PGem®-T) |
| T-DNA primer MDB201 | gCT.TGG.ACT.ATA.ATA.CCT.GAC (SEKV. ID. Č. 12) | 143 163 |
Tak vznikly následující fragmenty:
SP6-T7: 1224 bp
SP6-MDB201: 1068 bp
T7-MDB201: 1044 bp
Fragment pravé hranice byl (SEKV. ID. Č. v němž polohy
13) , což poskytlo 1 až 867 odpovídají purifikován a sekvencován výsledný 963 bp fragment, rostlinné DNA a úsek bp 868 až 953 odpovídá T-DNA z pTW 107.
4.2.1.2. Levý (3') sousedící úsek s MS-BNl
Sekvence úseku levé hranice sousedícího s vloženým transgenem v MS-BNl události byly určeny s použitím metody TAIL-PCR („thermal asymmetric interlaced PCR), který popsali Liu et al. (1995, Plant Journal 8(3): 457-463). Tento způsob užívá tři sdružené („nested) specifické primery v následných
• · ·«·♦·» ··* ··· ··· «· ·· ···· reakcích společně s kratším arbitrárně degenerovaným (AD) primerem, takže relativní účinnosti amplifikace specifického a nespecifického produktu mohou být teplotně kontrolovány. Specifické primery byly vybrány pro nasednutí („annealing) k hranici transgenu a na základě jejich podmínek pro nasednutí. Malé množství (5 μΐ) nepurifikovaných sekundárních a terciárních PCR produktů bylo analyzováno na 1% agarózovém gelu. Terciární PCR produkt byl použit pro preparativní amplifikaci, purifikován a sekvencován na automatickém sekvencovacím zařízení s použitím soupravy pro cyklovací sekvencování DyeDeoxy Terminátor.
Následující primery byly použity:
| Sekvence (5'—>3') | Poloha v PTHW107 | |
| Degenerovaný primer MDB611 | NgT.CgA.SWg.TNT.WCA.A (SEKV. ID. Č. 14) | |
| Primární TAIL MDB259 | gTg.Cag.ggA.AgC.ggT.TAA.CTg.g (SEKV. ID. Č. 15) | 7164 -> 4186 |
| Sekundární TAIL MDB260 | CCT.TTg.gAg.TAA.ATg.gTg.TTg.g (SEKV. ID. Č. 16) | 4346 4366 |
| Terciární TAIL HCA24 | gCg.AAT.gTA.TAT.TAT.ATg.CA (SEKV. ID. Č. 17) | 4738 4757 |
Kde: N=A,C,T nebo g, S=C nebo g, W=A nebo T
| Fragment amplifikovaný s | použitím | HCA24-MDB611 | byl | ||
| přibližně | dlouhý 540 bp, | z nichž | bylo 537 | bp sekvencováno | (3' |
| sousedící: | SEKV. ID. Č | . 18) . | Sekvence | mezi 1 a 180 | bo |
| obsahovala | PTHW107 DNA, | zatímco | sekvence | mezi 181 a 537 | bp |
odpovídala rostlinné DNA.
'4 · 4 4 >4 4 · • 4 444444 • 44 444 444 99 94 44·«
4.2.1.3. Identifikace delece cílového místa
Užitím primerů odpovídajících sekvencím v sousedících úsecích transgenu bylo na DNA divokého typu z rostliny Brassica napus var. Drakkar jako templátu identifikováno inzerční místo transgenu.
Následující primery byly použity:
| Sekvence (5 ' —»3 ') | Poloha v 5’ sousedícím úseku | Poloha v 3' sousedícím úseku | |
| (SEKV. ID. Č. 13) | (SEKV. ID. Č. 18) | ||
| VDS51 | TgA.CAC.TTT.gAg.CCA.CTC.g (SEKV. ID. Č. 19) | 733 -» 751 | |
| HCA48 | GgA.ggg.TgT.TTT.Tgg.TTA.TC (SEKV. ID. Č. 20) | 189 <- 208 |
Tím byl připraven 178 bp fragment (SEKV. ID. Č. 21), ve kterém úsek 132 až 150 bp odpovídá deleci cílového místa.
4.2.1.4.
Identifikace MS-BNl inzerčního úseku
Na základě identifikace sousedících úseků cílového místa mohl být určen inzerční úsek MS-BNl Č. 22) :
a delece (SEKV. ID.
1- 822:
823- 841
842-1198
5' sousedící úsek delece cílového místa
3' sousedící úsek bp 46-867 ze SEKV. ID. Č. 13 bp 132-150 SEKV. ID. Č. 21 bp 181-537 SEKV. ID. Č. 18 • 0 0 • ♦ 0 · · ·
4.2.2. Identifikace sousedících úseků RF-BN1
Hraniční sousedící úseky RF-BN1 byly určeny pomocí „Vectorette-PCR (použití „Vectorette a „Subvectorette PCR pro izolaci DNA sousedící s transgenem - viz Maxine J. Allen, Andrew Collick a Alec J. Jeffreys, PCR Methods and Applications - 1994 (4) pages 71-75) s RF-BN1 genomovou DNA štěpenou HindlII jako templátem. „Vectorette linker byl vytvořen s použitím primerů MDB248 (SEKV. ID. Č. 3) a MDB249 (SEKV. ID. Č. 4) popsanými výše.
4.2.2.1. Pravý (5') sousedící úsek BN-RFl
Následující primery byly použity:
| Sekvence (5'—>3') | Poloha v PTHW118 | |
| Vectorette primer MDB250 | GCA. CTG. AGG. GCC. AAA. GCT . TGG. CTC (SEKV. ID. Č. 6) | |
| Vectorette primer MDB254 | CTT.AGC.CTG.GGT.CAG.GGC.ATG (SEKV. ID. Č. 8) | |
| T-DNA primer MDB251 | GGA.TCC.CCC.GAT.GAG.CTA.AGC.TAG.C (SEKV. ID. Č. 7) | 293 <- 317 |
| T-DNA primer MDB193 | CTA.CGG.CAA.TGT.ACC.AGC (SEKV. ID. Č. 23) | 226 <- 243 |
| T-DNA primer MDB258 | CTA.CGG.CAA.TGT.ACC.AGC.TG (SEKV. ID. Č. 9) | 224 <7 243 |
| T-DNA primer MDB201 | GCT.TGG.ACT.ΑΤΑ.ATA.CCT.GAC (SEKV. ID. Č. 12) | 143 <- 163 |
Tím byl získán 1077 bp fragment (SEKV. ID. Č. 24), ve kterém úsek 1-881 bp odpovídá rostlinné DNA a úsek 882-1077 bp • · ♦♦···· ··· ·♦· ··· ♦· ·· ···· odpovídá T-DNA z pTW 118.
4.2.2.2. Levý (3') sousedící úsek BN-RF1
Pro identifikaci 3' sousedícího úseku elitní událost BNRF1, TAIL-PCR byla provedena jak bylo popsáno výše s použitím arbitrárně degenerovaného primeru a primerů lokalizovaných v T-DNA v blízkosti levé hranice.
Byly použity následující primery:
Arbitrárně degenerovaný primer:
MDB286 NTg.CgA.SWg.ANA.WgA.A (SEKV. ID. Č. 25)
Kde: N=A,C,T nebo g, S=C nebo g, W=A nebo T
T-DNA primery:
MDB314 gTA.ggA.ggT.Tgg.gAA.gAC.C (SEKV. ID. Č. 26)
MDB31S ggg.CTT.TCT.ACT.AgA.AAg.CTC.TCg.g (SEKV. ID. Č. 27)
MDB316 CCg.ATA.ggg.AAg.TgA.TgT.Agg.Agg (SEKV. ID. Č. 28)
Byl získán fragment velikostí přibližně 2000 bp. Tento fragment byl klonován do vektoru pGem©-T vektor a použit jako templát pro další PCR reakci s použitím následující primerů:
Primer pro rostlinnou DNA:
MDB288 ATg.CAg.CAA.gAA.gCT.Tgg.Agg (SEKV. ID. Č. 29)
T-DNA primer:
MDB314 gTA.ggA.ggT.Tgg.gAA.gAC.C (SEKV. ID. Č. 26)
Takto byl získán fragment velikosti přibližně 1500 bp (SEKV. ID. Č. 30), kde úsek 1-166 bp odpovídá T-DNA z plazmidu pTW118 a úsek 167-1441 bp odpovídá rostlinné DNA.
• · • · ·♦·»♦· ··· ··· ··· ·· ·* ····
4.2.2.3. Molekulární analýza delece cílového místa
Úsek obsahující deleci cílového místa byl klonován pomocí TAIL-PCR (popsána výše) s použitím genomové DNA divokého typu a primerů specifických pro rostlinou DNA v protisměru (upstream) od T-DNA inzertu směrem k inzertu:
Arbitrárně degenerovaný primer:
| MDB286 | NTg.CgA.SWg.ANA.WgA.A | (SEKV | . ID. | Č. 25) |
| kde | : N=A,C,T nebo g, S=C nebo | g, W= | A nebo T | |
| Primery | pro rostlinou DNA: | |||
| MDB269 | ggTTTTCggAggTCCgAgACg | (SEKV, | . ID. | Č. 31) |
| MDB283 | CTTggACCCCTAggTAAATgC | (SEKV, | . ID. | Č. 32) |
| MDB284 | gTACAAAACTTggACCCCTAgg | (SEKV. | . ID. | Č. 33) |
| Byl | získán fragment velikosti | 1068 | bp | (SEKV. ID |
ve kterém je:
53-83: 5'sousedící úsek
84-133: delece cílového místa
134-1055: 3'sousedící úsek
Po inzerci T-DNA bylo cílové místo velikosti 51 bp deletováno. Srovnáním sekvence lokusu divokého typu s lokusem Rf3 odhalilo přítomnost „výplňového úseku DNA ve spojovacím místě pravé hranici. „výplňová sekvence TCTCG sekvence v pravé hranici sousedí se sekevncí TCA na 5' konci a sekvencí CGA na 3' konci. Tyto triplety byly také nalezeny na předělu delece cílového místa a T-DNA. Vyhledávání ve vzdálenějších rostlinných sekvencích odhalilo možný původ této „výplňové DNA. Sekvence TCA.TCTCG.CGA je také lokalizována v rostlinné DNA na 3'konci delece cílového místa. Je to „jádrová sekvence dvou identických repetic velikosti 13 bp lokalizovaná 209 bp po směru (downstream) od předělu delece cílového místa.
Inzerční úsek pro RF-BNl může být definován jako úsek obsahující levý sousedící úsek, deleci cílového místa a pravý sousedící úsek, a sice následovně:
1-881: 5' sousedící úsek (bp 1-881 SEKV. ID. Č. 24)
882-932: delece cílového místa (bp 84-133 SEKV. ID. Č. 34)
933-2207: 3' sousedící úsek (bp 167-1441 SEKV. ID. Č. 30)
3. Genetická analýza lokusu
Genetická stabilita inzertů pro dvě události byla ověřována molekulární a fenotypovou analýzou v potomstvu rostlin po několik generací.
Analýzy metodou Southern blot rostlin generací To, Ti a T2 byly srovnány pro obě události MS-BN1 a RF-BNl. Bylo zjištěno, že získané profily byly identické pro každou z událostí v odlišných generacích. To dokazuje, že molekulární konfigurace transgenu v rostlinách obsahujících jak MS-BN1 tak i RF-BNl je stabilní.
MS-BN1 a RF-BNl události vykazují pro své odpovídající transgeny mendelovskou segregaci jako jediný genetický lokus v alespoň třech následných generacích, což ukazuje na to, že inzerty jsou stabilní.
Na základě výše popsaných výsledků byly MS-BN1 a MS-RF1 identifikovány jako elitní události.
4.4. Identifikace sousedících sekvencí událostí MS-BNl a RF-BNl u ozimé řepky olejky
Sousedící sekvence elitní události MS-BNl a RF-BNl u ozimé řepky olejky byly určeny s použitím primerů, které byly vyvinuty na základě sousedících sekvencí dané události u jarní • 9
9 9 9 9 9
99 9 9 9 9 9 9 99 9 řepky olejky.
Pravá (5') sousedící sekvence MS-BNl ozimé řepky olejky byla určena s použitím T-DNA primeru (SEKV. ID. Č. 12) a primeru lokalizovaného v MS-BNl pravé hraniční rostlinné DNA: VDS57: 5'-gCA.TgA.TCT.gCT.Cgg.gAT.ggC-3' (SEKV. ID. Č. 35)
To poskytlo fragment velikosti 909 bp (SEKV. ID. Č. 36) se sekvencí v podstatě podobnou sekvenci SEKV. ID. Č. 13 (počínajíc nukleotidem 98).
Levá (3') sousedící sekvence MS-BNl ozimé řepky olejky byla určena s použitím T-DNA primeru (SEKV. ID. Č. 17) a primer lokalizovaného v MS-BNl levé hraniční rostlinné DNA: HCA68: 5'-CCA.TAT.Acg.CCA.gAg.Agg.AC-3' (SEKV. ID. Č. 37)
To poskytlo fragment 522 bp (SEKV. ID. Č. 38) se sekvencí v podstatě podobnou sekvenci SEKV. ID. Č. 18.
Pravá (5') sousedící sekvence RF-BN1 ozimé řepky olejky byla určena s použitím T-DNA primeru (SEKV. ID. Č. 12) a primeru lokalizovaného v RF-BN1 pravé hraniční rostlinné DNA (SEKV. ID. Č. 31). Tak vznikl fragment 694 bp (SEKV. ID. Č. 39) se sekvencí v podstatě podobnou sekvenci ze SEKV. ID. Č. 24 (nukleotidy 293 až 980).
Levá sousedící sekvence RF-BN1 ozimé řepky olejky byla určen s použitím T-DNA primeru (SEKV. ID. Č. 26) a primeru lokalizovaného v RF-BN1 levé hraniční rostlinné DNA (SEKV. ID. Č. 29). Tak vznikl fragment 1450 bp, z něhož 1279 bp bylo
| sekvencováno ( | SEKV. ID. | Č. 40) | Bylo | zj ištěno, | , že tato |
| sekvence je v | podstatě | podobná | sekvenci | SEKV. | ID. Č. 30 |
| (nukleotidy 141 | až 1421). | ||||
| Tedy tím | bylo potvrzeno, | že pravá | a levá | sousedící |
sekvence elitní události MS-BNl a RF-BN1 jsou v podstatě shodné pro jarní a ozimou řepku olej ku.
• ··
Příklad 5
Vývoj diagnostických nástrojů pro kontrolu identity
Následující protokoly byly vyvinuty s cílem identifikovat jakýkoliv rostlinný materiál ozimé řepky olejky obsahující elitní událost MS-BNl.
5.1. MS-BNl a RF-BNl Elitní událost restrikční mapa identifikace protokol
Rostliny ozimé řepky olejky obsahující elitní událost MS-BNl mohou být identifikovány metodou Southern blotting s použitím v podstatě stejného postupu jak byl popsán v příkladu
4.1. Tedy genomová DNA ozimé řepky olejky je 1) štěpena s alespoň dvěma, výhodně alespoň 3, konkrétně s alespoň 4, konkrétněji se všemi z následujících restrikčních enzymů: EcoRI, EcoRV, Ndel, Hpal, AflIII 2) přenesena na nylonovou membrány a 3) hybridizována s 3942 bp Hindlll fragmentem z plazmidu pTHW107. Jestliže alespoň pro dva použité restrikční enzymy jsou identifikovány DNA fragmenty stejné délky jako fragmenty uvedené v tabulce 3 v Příkladu 4.1.1., pak je rostlina ozimé řepky olejky identifikována jako rostlina nesoucí elitní událost MS-BNl.
Rostliny ozimé řepky olejky obsahující elitní událost RF-BNl mohou být identifikovány metodou Southern blotting s použitím v podstatě stejného postupu jak byl popsán v příkladu
4.1. Tedy genomová DNA ozimé řepky olejky je 1) štěpena s alespoň dvěma, výhodně alespoň 3, konkrétněji se všemi z následujících restrikčních enzymů: BamHI, EcoRI, EcoRV,
Hindlll 2) přenesena na nylonovou membránu a 3) hybridizována ·· ·· • · · s 2182 bp Hpal fragmentem plazmidu pTHWH8. Jestliže alespoň pro dva použité restrikční enzymy jsou identifikovány DNA fragmenty stejné délky jako fragmenty uvedené v tabulce 4 v příkladu 4.1.2., pak je rostlina ozimé řepky olejky identifikována jako rostlina nesoucí elitní událost RF-BNl.
5.2. PCR identifikační protokol pro elitní události MS-BNl a RF-BNl
Test protokolu, se všemi vhodnými kontrolami, musí být proveden ještě před screeningem neznámých vzorků. Předložený protokol by mohl vyžadovat optimalizaci složek, které se mohou obecně lišit mezi jednotlivými laboratořemi (příprava templátové DNA, Taq DNA polymeráza, kvalita primerů, dNTP, termocykler atd.).
Amplifikace endogenní sekvence hraje v protokolu klíčovou roli. Je třeba dosáhnout takových podmínek PCR a cyklování teplot, aby se amplifikovaly v ekvimolárních množstvích endogenní a transgenní sekvence v templátu známé transgenní genomové DNA. Kdykoliv se cílový endogenní fragment neamplifikuje se stejnou intenzitou zjištěnou po elektroforéze na agarózovém gelu a obarvení ethidiumbromidem, optimalizace podmínek pro PCR je nezbytná.
5.2.1. Templátová DNA
Templátová DNA se připravuje z listových terčíků nebo jednoho semena postupem podle Edwards et al. (Nucleic Acid Research, 19, p.1349, 1991). Když se používá DNA připravená jinými metodami, měl by se nejdříve provést test protokolu s různými množstvími templátu. Obvykle 50 ng genomové DNA jako templát poskytuje nej lepší výsledky.
·· ·· · ·
5.2.2. Přidělení pozitivní a negativní kontroly
Následující pozitivní a negativní kontroly by měly být zařazeny v každém běhu PCR:
- „Master Mix kontrola (DNA negativní kontrola). To je PCR, ve které není přidána do reakce žádná DNA. Pokud nastane očekávaný výsledek, tj. žádné PCR produkty, znamená to, že připravená reakční směs (Master Mix) pro PCR není kontaminovaná cílovou DNA.
- DNA pozitivní kontrola (vzorek genomové DNA obsahující transgenní sekvence). Úspěšná amplifikace této pozitivní kontroly demonstruje, že PCR podmínky v daném běhu PCR byly takové, že umožnily amplifkaci cílové sekvence.
- kontrola DNA divokého typu. Toto je PCR, ve které je jako templát genomová DNA připravená z netransgenní rostliny. Když nastane očekávaný výsledek, tedy žádná PCR amplifikace produktu z transgenu, avšak jen amplifikace endogenního PCR produktu, to znamená, že není detekovatelné pozadí transgenu při amplifikaci samotné genomové DNA.
5.2.3. Primery
Následující primery, které specificky rozpoznávají transgen a sousedící sekvence MS-BNl byly použity:
BNA01:5'-gCT.Tgg.ACT.ATA.ATA.CCT.gAC-3' (SEKV. ID. Č. 12) (MDB201) (cíl: transgen)
BNA02: 5'-TgA.CAC.TTT.gAg.CCA.CTC.g-3' (SEKV. ID. Č. 19) (VDS51) (cíl: rostlinná DNA)
Pro identifikaci rostlinného materiálu obsahujícího RF-BNl byly užity následující primery, které specificky rozpoznávají
| « «1 | 0 ·· | |||||
| »0 | • 0 | 0 0 0 | 0 | • | 0 | • |
| • | • | • 0 | 0 | % | 0 | 4 |
| 0 | ||||||
| • | 0 | 0 0 | 0 | 0 | * | 0 |
| « 00 | 00« | • 0 | f 0 | 0*00 |
transgen a sousedící sekvenci RF-BNl:
BNA03: 5'-TCA.TCT.ACg.gCA.ATg.TAC.CAg-3' (SEKV. ID. Č. 23) (MDB193) (cíl: transgen)
BNA04: 51-Tgg.ACC.CCT.Agg.TAA.ATg.CC-3' (SEKV. ID. Č. 41) (MDB268) (cíl: rostlinná DNA)
Primery zacílené na endogenní sekvence jsou vždy přítomny v PCR koktejlu. Tyto primery slouží jako vnitřní kontrola u neznámých vzorků a v pozitivní kontrole. Pozitivní výsledek s dvojicí endogenních primerů demonstruje, že je v preparátu genomové DNA přítomen dostatek DNA v odpovídající kvalitě, aby mohl být generován PCR produkt. Endogenní primery byly:
BNA05: 5'-AAC.gAg.TgT.CAg.CTA.gAC.CAg.C-3' (SEKV. ID. Č. 42) BNA06: 5'-CgC.AgT.TCT.gTg.AAC.ATC.gAC.C-3' (SEKV. ID. Č. 43)
5.2.4. Amplifikované fragmenty
Očekávané amplifikované fragmenty v PCR reakci jsou:
Pro dvojici primerů BNA05-BNA06: 394 bp (endogenní kontrola)
Pro dvojici primerů ΒΝΆ01-ΒΝΑ02: 280 bp (MS-BN1 elitní událost)
Pro dvojici primerů BNA03-BNA04: 215 bp (RF-BNl elitní událost)
5.2.5. Podmínky PCR
PCR reakční směs obsahuje v 50 μΐ reakci :
μΐ templátová DNA μΐ lOx Amplifikační pufr (dodávaný s Taq polymerázou) μΐ 10 mM dNTP μΐ BNA01 (MS-BN1) nebo BNA03 (RF-BNl) (10 pmol/μΐ) μΐ BNA02 (RF-BNl) nebo BNA04 (RF-BNl) (10 pmol/μΐ)
0,5 μΐ ΒΝΑ05 (10 pmol/μΐ)
0,5 μΐ ΒΝΑ06 (10 pmol/μΐ)
0,2 μΐ Taq DNA polymeráza (5 jednotek/μΐ) voda do 50 μΐ
Teplotní profil pro dosažení optimálních výsledků je následuj ící:
minuty v 95 °C
Pak následuje:
| 1 | minuta | v | 95 | °C |
| 1 | minuta | v | 57 | °C |
| 2 | minuty | v | 72 | °C |
| v | 5 | cyklech |
Pak následuje:
sekund v 92 °C 30 sekund v 57 °C 1 minuta v 72 °C ve 22 až 25 cyklech Pak následuje: 5 minut v 72 °C
5.2.6. Analýza na agarózovém gelu
Vzorky PCR o objemu 10 a 20 μΐ se nanášejí na 1,5% agarózový gel (Tris-borátový pufr) společně s vhodným standardem molekulární hmotnosti (např. 100 bp „žebřík PHARMACIA).
5.2.7. Validace výsledků
Data získaná pro vzorky DNA transgenní rostliny v jednom běhu PCR run a jednom PCR koktejlu nelze akceptovat, dokud 1) DNA pozitivní kontrol nevykazuje očekávané PCR produkty • · • · · · · · (transgenní a endogenní fragmenty), 2) DNA negativní kontrola je negativní pro PCR amplifikaci (žádné fragmenty) a 3) DNA kontrola divokého typu vykazuje očekávaný výsledek (amplifikován endogenní fragment).
Dráhy ukazující viditelná množství transgenního a endogenního PCR produktu očekávané velikosti, jsou indikací toho, že odpovídající rostlina, ze které byla genomová templátová DNA připravena, zdědila MS-BN1 a/nebo RF-BNl elitní událost. Dráhy bez viditelného množství obou transgenních PCR produktů avšak s viditelným množstvím endogenního PCR produktu indikují, že odpovídající rostliny, ze kterých byla genomová templátová DNA připravena, neobsahují elitní událost. Dráhy bez viditelného množství endogenního a transgenních PCR produktu jsou výsledkem toho, že kvalita a/nebo kvantita genomové DNA nebyla dostatečná pro vznik PCR produktu. Tyto rostliny nemohou být vyhodnoceny. Genomová DNA by měla být znovu připravena a měl by být proveden nový běh PCR s příslušnými vhodnými kontrolami.
5.2.8. Použití protokolu diskriminační PCR k identifikaci MS-BNl a RF-BNl
Rostlinný materiál z listů ozimé řepky olejky obsahující buďto MS-BNl, RF-BNl nebo jinou transgenní událost, byl testován podle výše popsaného protokolu. Vzorky z ozimé řepky olejky divokého typu byly použity jako negativní kontroly. Výsledky PCR analýz jsou ilustrovány na obrázku 4 a 5.
Obrázek 4 ilustruje výsledek získaný pomocí identifikačního protokolu PCR pro elitní událost MS-BN1 na dva vzorcích ozimé řepky olejky (dráha 1 a 2). Dráha 1 obsahuje elitní událost detekovanou jako 280 bp pás, zatímco vzorek v dráze 2 neobsahuje MS-BNl.
« ·
Obrázek 5 ilustruje výsledek získaný pomocí PCR identifikačního protokolu pro elitní událost RF-BNl na dvou vzorcích ozimé řepky olejky (dráha 1 a 2) . Dráha 1 obsahuje elitní událost detekovanou jako 215 bp pás, zatímco vzorek v dráze 2 neobsahuje RF-BNl.
Příklad 6
Produkce hybridních semen s použitím MS-BN1 a RF-BNl v rostlinách ozimé řepky olejky
Rostliny ozimé řepky olejky obsahující MS-BNl, které vykazovaly samčí sterilitu, byly kříženy s rostlinami ozimé řepky olejky homozygotními v RF-BNl. Hybridní semena byla sebrána z MS-BN1 a uložena ve sbírce ATCC pod přístupovým číslem ATCC PTA-730.
Tato hybridní semena byla znovu vyseta na pole. Bylo zjištěno, že rostliny byly 100% fertilní a projevovaly současně optimální agronomické vlastnosti. Hybridní rostliny obsahovaly buďto obě události MS-BNl a RF-BNl nebo jen RF-BN-1 samotnou.
Příklad 7
Vnesení MS-BNl a RF-BNl do výhodného kultivaru ozimé řepky olej ky
Elitní události MS-BNl a RF-BNl byly opakovaným zpětným křížením rostlin obsahujících událost MS-BNl nebo RF-BNl, v daném pořadí, přeneseny na řadu agronomicky významných kultivarů ozimé řepky olejky.
Bylo pozorováno, že introgrese elitní události do těchto kultivarů nijak významně neovlivnila žádné požadované fenotypové nebo agronomicky významné charakteristiky těchto kultivarů (žádná vazba), když exprese transgenu, která byla určována jako tolerance ke glufosinátu, dosáhla komerčně přijatelné úrovně. To potvrdilo status událostí MS-BNl a RF-BNl jako elitních událostí.
V připojených nárocích se užívá termín rostlina tak, že zahrnuje i jakákoliv rostlinná pletiva, v jakémkoliv stádiu zralosti, a také jakékoliv buňky, pletiva nebo orgány odebrané nebo pocházející z rostlin, včetně, aniž by však byl výčet omezující, semen, listů, stonků, květů, kořenů, jednotlivých buněk, gamet, buněčných kultur, tkáňových kultur nebo protoplastů.
Semena obsahující elitní událost MS-BNl a elitní událost RF-BNl nebo elitní událost RF-BNl samotnou byla uložena v Americké sbírce mikroorganismů a tkáňových kultur ATCC pod přístupovým číslem: PTA-730.
SEZNAM SEKVENCÍ <160> 43 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 4946 <212> DNA <2l3> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: T-DNA plazmidu pTHW107 <220>
<221> různé vlastnosti <222> (964)..(4906) <223> Hind III fragment <400> 1 aattacaacg gtatatatcc tgccagtact cggccgtcga actcggccgt cgagtacatg 60 gtcgataaga aaaggcaatt tgtagatgtt aattcccatc ttgaaagaaa tatagtttaa 120 • 4 4 · 4 • 4 · · · ·
| atatttattg | ataaaataac | aagtcaggta | ^2. ttatagtcca | • 4 4 4 4 44« 444 4 agcaaaaaca | 4 · 4 · 4 · 4 4 4 4 4 44 «4 4· taaatttatt | • • • 44 4 •180 |
| gatgcaagtt | taaattcaga | aatatttcaa | taactgatta | tatcagctgg | tacattgccg | 240 |
| tagatgaaag | actgagtgcg | atattatgtg | taatacataa | attgatgata | tagctagctt | 300 |
| agctcatcgg | gggatcctag | acgcgtgaga | tcagatctcg | gtgacgggca | ggaccggacg | 360 |
| gggcggtacc | ggcaggctga | agtccagctg | ccagaaaccc | acgtcatgcc | agttcccgtg | 420 |
| cttgaagccg | gccgcccgca | gcatgccgcg | gggggcatat | ccgagcgcct | cgtgcatgcg | 480 |
| cacgctcggg | tcgttgggca | gcccgatgac | agcgaccacg | ctcttgaagc | cctgtgcctc | 540 |
| cagggacttc | agcaggtggg | tgtagagcgt | ggagcccagt | cccgtccgct | ggtggcgggg | 600 |
| ggagacgtac | acggtcgact | cggccgtcca | gtcgtaggcg | ttgcgtgcct | tccaggggcc | 660 |
| cgcgtaggcg | atgccggcga | cctcgccgtc | cacctcggcg | acgagccagg | gatagcgctc | 720 |
| ccgcagacgg | acgaggtcgt | ccgtccactc | ctgcggttcc | tgcggctcgg | tacggaagtt | 780 |
| gaccgtgctt | gtctcgatgt | agtggttgac | gatggtgcag | accgccggca | tgtccgcctc | 840 |
| ggtggcacgg | cggatgtcgg | ccgggcgtcg | ttctgggtcc | attgttcttc | tttactcttt | 900 |
| gtgtgactga | ggtttggtct | agtgctttgg | tcatctatat | ataatgataa | caacaatgag | 960 |
| aacaagcttt 1020 | ggagtgatcg | gagggtctag | gatacatgag | attcaagtgg | actaggatct | |
| acaccgttgg 1080 | attttgagtg | tggatatgtg | tgaggttaat | tttacttggt | aacggccaca | |
| aaggcctaag 1140 | gagaggtgtt | gagaccctta | tcggcttgaa | ccgctggaat | aatgccacgt | |
| ggaagataat 1200 | tccatgaatc | ttatcgttat | ctatgagtga | aattgtgtga | tggtggagtg | |
| gtgcttgctc 1260 | attttacttg | cctggtggac | ttggcccttt | ccttatgggg | aatttatatt | |
| ttacttacta 1320 | tagagctttc | ataccttttt | tttaccttgg | atttagttaa | tatataatgg | |
| tatgattcat 1380 | gaataaaaat | gggaaatttt | tgaatttgta | ctgctaaatg | cataagatta | |
| ggtgaaactg 1440 | tggaatatat | atttttttca | tttaaaagca | aaatttgcct | tttactagaa | |
| ttataaatat 1500 | agaaaaatat | ataacattca | aataaaaatg | aaaataagaa | ctttcaaaaa | |
| acagaactat 1560 | gtttaatgtg | taaagattag | tcgcacatca | agtcatctgt | tacaatatgt | |
| tacaacaagt 1620 | cataagccca | acaaagttag | cacgtctaaa | taaactaaag | agtccacgaa | |
| aatattacaa 1680 | atcataagcc | caacaaagtt | attgatcaaa | aaaaaaaaac | gcccaacaaa |
gctaaacaaa gtccaaaaaa aacttctcaa gtctccatct tcctttatga acattgaaaa 1740
4
4 1
I h
| ctatacacaa | aacaagtcag | ataaatctct | ttctgggcct | gtcttcccaa | cctcctacat |
| cacttcccta 1860 | tcggattgaa | tgttttactt | gUěáWtte oattccasta atattgaw | ||
| tatgtttgtg 1920 | aaaactaata | gggttaacaa | tcgaagtcat | ggaatatgga | tttggtccaa |
| gattttccga 1980 | gagctttcta | gtagaaagcc | catcaccaga | aatttactag | taaaataaat |
| caccaattag 2040 | gtttcttatt | atgtgccaaa | ttcaatataa | ttatagagga | tatttcaaat |
| gaaaacgtat 2100 | gaatgttatt | agtaaatggt | caggtaagac | attaaaaaaa | tcctacgtca |
| gatattcaac 2160 | tttaaaaatt | cgatcagtgt | ggaattgtac | aaaaatttgg | gatctactat |
| atatatataa 2220 | tgctttacaa | cacttggatt | tttttttgga | ggctggaatt | tttaatctac |
| atatttgttt 2280 | tggccatgca | ccaactcatt | gtttagtgta | atactttgat | tttgtcaaat |
| atatgtgttc 2340 | gtgtatattt | gtataagaat | ttctttgacc | atatacacac | acacatatat |
| atatatatat 2400 | atatattata | tatcatgcac | ttttaattga | aaaaataata | tatatatata |
| tagtgcattt 2460 | tttctaacaa | ccatatatgt | tgcgattgat | ctgcaaaaat | actgctagag |
| taatgaaaaa 2520 | tataatctat | tgctgaaatt | atctcagatg | ttaagatttt | cttaaagtaa |
| attctttcaa 2580 | attttagcta | aaagtcttgt | aataactaaa | gaataataca | caatctcgac |
| cacggaaaaa 2640 | aaacacataa | taaatttgaa | tttcgaccgc | ggtacccgga | attcgagctc |
| ggtacccggg 2700 | gatcttcccg | atctagtaac | atagatgaca | ccgcgcgcga | taatttatcc |
| tagtttgcgc 2760 | gctatatttt | gttttctatc | gcgtattaaa | tgtataattg | cgggactcta |
| atcataaaaa 2820 | cccatctcat | aaataacgtc | atgcattaca | tgttaattat | tacatgctta |
| acgtaattca 2880 | acagaaatta | tatgataatc | atcgcaagac | cggcaacagg | attcaatctt |
| aagaaacttt 2940 | attgccaaat | gtttgaacga | tctgcttcgg | atcctctaga | gccggaaagt |
| gaaattgacc 3000 | gatcagagtt | tgaagaaaaa | tttattacac | actttatgta | aagctgaaaa |
aaacggcctc cgcaggaagc cgtttttttc gttatctgat ttttgtaaag gtctgataat 3060
4* Μ 44 • · ♦ ·
| ggtccgttgt tttgtaaatc agccagtcgc ttgagtaaag aatccggtct gaatttctga 3120 | |||||
| agcctgatgt 3180 | atagttaata | tccgcttcac | gccatgttcg | tccgcttttg | cccgggagtt |
| tgccttccct 3240 | gtttgagaag | atgtctccgc | cgatgctttt | ccccggagcg | acgtctgcaa |
| ggttcccttt 3300 | tgatgccacc | cagccgaggg | cttgtgcttc | tgattttgta | atgtaattat |
| caggtagctt 3360 | atgatatgtc | tgaagataat | ccgcaacccc | gtcaaacgtg | ttgataaccg |
| gtaccatggt 3420 | agctaatttc | tttaagtaaa | aactttgatt | tgagtgatga | tgttgtactg |
| ttacacttgc 3480 | accacaaggg | catatataga | gcacaagaca | tacacaacaa | cttgcaaaac |
| taacttttgt 3540 | tggagcattt | cgaggaaaat | ggggagtagc | aggctaatct | gagggtaaca |
| ttaaggtttc 3600 | atgtattaat | ttgttgcaaa | catggactta | gtgtgaggaa | aaagtaccaa |
| aattttgtct 3660 | caccctgatt | tcagttatgg | aaattacatt | atgaagctgt | gctagagaag |
| atgtttattc 3720 | tagtccagcc | acccacctta | tgcaagtctg | cttttagctt | gattcaaaaa |
| ctgatttaat 3780 | ttacattgct | aaatgtgcat | acttcgagcc | tatgtcgctt | taattcgagt |
| aggatgtata 3840 | tattagtaca | taaaaaatca | tgtttgaatc | atctttcata | aagtgacaag |
| tcaattgtcc 3900 | cttcttgttt | ggcactatat | tcaatctgtt | aatgcaaatt | atccagttat |
| acttagctag 3960 | atatccaatt | ttgaataaaa | atagctcttg | attagtaaac | cggatagtga |
| caaagtcaca 4020 | tatccatcaa | acttctggtg | ctcgtggcta | agttctgatc | gacatggggt |
| taaaatttaa 4080 | attgggacac | ataaatagcc | tatttgtgca | aatctcccca | tcgaaaatga |
| cagattgtta 4140 | catggaaaac | aaaaagtcct | ctgatagaag | tcgcaaagta | tcacaatttt |
| ctatcgagag 4200 | atagattgaa | agaagtgcag | ggaagcggtt | aactggaaca | taacacaatg |
| tctaaattaa 4260 | ttgcattcgc | taaccaaaaa | gtgtattact | ctctccggtc | cacaataagt |
| tattttttgg 4320 | cccttttttt | atggtccaaa | ataagtgagt | tttttagatt | tcaaaaatga |
tttaattatt tttttactac agtgcccttg gagtaaatgg tgttggagta tgtgttagaa 4380 • · · ·« 44 • · • 4
4
4 4
4444
| atgtttatgt 4440 | gaagaaatag | taaaggttaa | tatgatcaat | ttcattgcta | tttaatgtta |
| aaatgtgaat 4500 | ttcttaatct | gtgtgaaaac | aaccaaaaaa | tcacttattg | tggaccggag |
| aaagtatata 4560 | aatatatatt | tggaagcgac | taaaaataaa | cttttctcat | attatacgaa |
| cctaaaaaca 4620 | gcatatggta | gtttctaggg | aatctaaatc | actaaaatta | ataaaagaag |
| caacaagtat 4680 | caatacatat | gatttacacc | gtcaaacacg | aaattcgtaa | atatttaata |
| taataaagaa 4740 | ttaatccaaa | tagcctccca | ccctataact | taaactaaaa | ataaccagcg |
| aatgtatatt 4800 | atatgcataa | tttatatatt | aaatgtgtat | aatcatgtat | aatcaatgta |
| taatctatgt 4860 | atatggttag | aaaaagtaaa | caattaatat | agccggctat | ttgtgtaaaa |
| atccctaata 4920 catttacaat 4946 | taatcgcgac tgaatatatc | ggatccccgg ctgccg | gaattccggg | gaagcttaga | tccatggagc |
| <210> | 2 | |
| <211> | 4832 | |
| <212> | DNA | |
| <213> | Umělá | sekvence |
| <220> | ||
| <223> | Popis | umělé sekvence: T |
| <220> | ||
| <221> | různé | vlastnosti |
| <222> | (1883) | . . (4065) |
| <223> | Hpal | fragment |
| <400> | 2 |
aattacaacg gtatatatcc tgccagtact cggccgtcga actcggccgt cgagtacatg 60 gtcgataaga aaaggcaatt_ tgtagatgtt aattcccatc ttgaaagaaa tatagtttaa 120
99 9
9 9 9 99 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9
499 999 499 99 99 9999
| atatttattg ataaaataac aagtcaggta ttatagtcca agcaaaaaca taaatttatt 180 | ||||||
| gatgcaagtt | taaattcaga | aatatttcaa | taactgatta | tatcagctgg | tacattgccg | 240 |
| tagatgaaag | actgagtgcg | atattatgtg | taatacataa | attgatgata | tagctagctt | 300 |
| agctcatcgg | gggatcctag | acgcgtgaga | tcagatctcg | gtgacgggca | ggaccggacg | 360 |
| gggcggtacc | ggcaggctga | agtccagctg | ccagaaaccc | acgtcatgcc | agttcccgtg | 420 |
| cttgaagccg | gccgcccgca | gcatgccgcg | gggggcatat | ccgagcgcct | cgtgcatgcg | 480 |
| cacgctcggg | tcgttgggca | gcccgatgac | agcgaccacg | ctcttgaagc | cctgtgcctc | 540 |
| cagggacttc | agcaggtggg | tgtagagcgt | ggagcccagt | cccgtccgct | ggtggcgggg | 600 |
| ggagacgtac | acggtcgact | cggccgtcca | gtcgtaggcg | ttgcgtgcct | tccaggggcc | 660 |
| cgcgtaggcg | atgccggcga | cctcgccgtc | cacctcggcg | acgagccagg | gatagcgctc | 720 |
| ccgcagacgg | acgaggtcgt | ccgtccactc | ctgcggttcc | tgcggctcgg | tacggaagtt | 780 |
| gaccgtgctt | gtctcgatgt | agtggttgac | gatggtgcag | accgccggca | tgtccgcctc | 840 |
| ggtggcacgg | cggatgtcgg | ccgggcgtcg | ttctgggtcc | attgttcttc | tttactcttt | 900 |
| gtgtgactga | ggtttggtct | agtgctttgg | tcatctatat | ataatgataa | caacaatgag | 960 |
| aacaagcttt 1020 | ggagtgatcg | gagggtctag | gatacatgag | attcaagtgg | actaggatct | |
| acaccgttgg 1080 | attttgagtg | tggatatgtg | tgaggttaat | tttacttggt | aacggccaca | |
| aaggcctaag 1140 | gagaggtgtt | gagaccctta | tcggcttgaa | ccgctggaat | aatgccacgt | |
| ggaagataat 1200 | tccatgaatc | ttatcgttat | ctatgagtga | aattgtgtga | tggtggagtg | |
| gtgcttgctc 1260 | attttacttg | cctggtggac | ttggcccttt | ccttatgggg | aatttatatt | |
| ttacttacta 1320 | tagagctttc | ataccttttt | tttaccttgg | atttagttaa | tatataatgg | |
| tatgattcat 1380 | gaataaaaat | gggaaatttt | tgaatttgta | ctgctaaatg | cataagatta | |
| ggtgaaactg 1440 | tggaatatat | atttttttca | tttaaaagca | aaatttgcct | tttactagaa | |
| ttataaatat 1500 | agaaaaatat | ataacattca | aataaaaatg | aaaataagaa | ctttcaaaaa | |
| acagaactat 1560 | gtttaatgtg | taaagattag | tcgcacatca | agtcatctgt | tacaatatgt | |
| tacaacaagt 1620 | cataagccca | acaaagttag | cacgtctaaa | taaactaaag | agtccacgaa | |
| aatattacaa 1680 | atcataagcc | caacaaagtt | attgatcaaa | aaaaaaaaac | gcccaacaaa |
gctaaacaaa gtccaaaaaa aacttctcaa gtctccatct tcctttatga acattgaaaa « » ·· ·· ·· ·· 0 0 0 0 · 0 0 • 0 0 · 0 0 0
00 000 0 0 • 0 0 0 0 0 0 • 00 000 00 00 0··0
1740
| ctatacacaa aacaagtcag ataaatctct ttctgggcct gtcttcccaa cctcctacat 1800 | |||||
| cacttcccta 1860 | tcggattgaa | tgttttactt | gtaccttttc | cgttgcaatg | atattgatag |
| tatgtttgtg 1920 | aaaactaata | gggttaacaa | tcgaagtcat | ggaatatgga | tttggtccaa |
| gattttccga 1980 | gagctttcta | gtagaaagcc | catcaccaga | aatttactag | taaaataaat |
| caccaattag 2040 | gtttcttatt | atgtgccaaa | ttcaatataa | ttatagagga | tatttcaaat |
| gaaaacgtat 2100 | gaatgttatt | agtaaatggt | caggtaagac | attaaaaaaa | tcctacgtca |
| gatattcaac 2160 | tttaaaaatt | cgatcagtgt | ggaattgtac | aaaaatttgg | gatctactat |
| atatatataa 2220 | tgctttacaa | cacttggatt | tttttttgga | ggctggaatt | tttaatctac |
| atatttgttt 2280 | tggccatgca | ccaactcatt | gtttagtgta | atactttgat | tttgtcaaat |
| atatgtgttc 2340 | gtgtatattt | gtataagaat | ttctttgacc | atatacacac | acacatatat |
| atatatatat 2400 | atatattata | tatcatgcac | ttttaattga | aaaaataata | tatatatata |
| tagtgcattt 2460 | tttctaacaa | ccatatatgt | tgcgattgat | ctgcaaaaat | actgctagag |
| taatgaaaaa 2520 | tataatctat | tgctgaaatt | atctcagatg | ttaagatttt | cttaaagtaa |
| attctttcaa 2580 | attttagcta | aaagtcttgt | aataactaaa | gaataataca | caatctcgac |
| cacggaaaaa 2640 | aaacacataa | taaatttgaa | tttcgaccgc | ggtacccgga | attcgagctc |
| ggtacccggg 2700 | gatcttcccg | atctagtaac | atagatgaca | ccgcgcgcga | taatttatcc |
| tagtttgcgc 2760 | gctatatttt | gttttctatc | gcgtattaaa | tgtataattg | cgggactcta |
| atcataaaaa 2820 | cccatctcat | aaataacgtc | atgcattaca | tgttaattat | tacatgctta |
| acgtaattca 2880 | acagaaatta | tatgataatc | atcgcaagac | cggcaacagg | attcaatctt |
| aagaaacttt 2940 | attgccaaat | gtttgaacga | tctgcttcgg | atcctctaga | ccaagcttgc |
| gggtttgtgt 3000 | ttccatattg | ttcatctccc | attgatcgta | ttaagaaagt | atgatggtga |
tgtcgcagcc ttccgctttc gcttcacgga aaacctgaag cacactctcg gcgccatttt
*4 4« » 4 · • tt «
4 4 • 4 »
4· 4*44
3060
| cagtcagctg cttgctttgt tcaaactgcc tccattccaa aacgagcggg tactccaccc 3120 | |||||
| atccggtcag 3180 | acaatcccat | aaagcgtcca | ggttttcacc | gtagtattcc | ggaagggcaa |
| gctccttttt 3240 | caatgtctgg | tggaggtcgc | tgatacttct | gatttgttcc | ccgttaatga |
| ctgctttttt 3300 | catcggtagc | taatttcttt | aagtaaaaac | tttgatttga | gtgatgatgt |
| tgtactgtta 3360 | cacttgcacc | acaagggcat | atatagagca | caagacatac | acaacaactt |
| gcaaaactaa 3420 | cttttgttgg | agcatttcga | ggaaaatggg | gagtagcagg | ctaatctgag |
| ggtaacatta 3480 | aggtttcatg | tattaatttg | ttgcaaacat | ggacttagtg | tgaggaaaaa |
| gtaccaaaat 3540 | tttgtctcac | cctgatttca | gttatggaaa | ttacattatg | aagctgtgct |
| agagaagatg 3600 | tttattctag | tccagccacc | caccttatgc | aagtctgctt | ttagcttgat |
| tcaaaaactg 3660 | atttaattta | cattgctaaa | tgtgcatact | tcgagcctat | gtcgctttaa |
| ttcgagtagg 3720 | atgtatatat | tagtacataa | aaaatcatgt | ttgaatcatc | tttcataaag |
| tgacaagtca 3780 | attgtccctt | cttgtttggc | actatattca | atctgttaat | gcaaattatc |
| cagttatact 3840 | tagctagata | tccaattttg | aataaaaata | gctcttgatt | agtaaaccgg |
| atagtgacaa 3900 | agtcacatat | ccatcaaact | tctggtgctc | gtggctaagt | tctgatcgac |
| atggggttaa 3960 | aatttaaatt | gggacacata | aatagcctat | ttgtgcaaat | ctccccatcg |
| aaaatgacag 4020 | attgttacat | ggaaaacaaa | aagtcctctg | atagaagtcg | caaagtatca |
| caattttcta 4080 | tcgagagata | gattgaaaga | agtgcaggga | agcggttaac | tggaacataa |
| cacaatgtct 4140 | aaattaattg | cattcgctaa | ccaaaaagtg | tattactctc | tccggtccac |
| aataagttat 4200 | tttttggccc | tttttttatg | gtccaaaata | agtgagtttt | ttagatttca |
| aaaatgattt 4260 | aattattttt | ttactacagt | gcccttggag | taaatggtgt | tggagtatgt |
| gttagaaatg 4320 | tttatgtgaa | gaaatagtaa | aggttaatat | gatcaatttc | attgctattt |
aatgttaaaa tgtgaatttc ttaatctgtg tgaaaacacc aaaaaatcac ttattgtgga • » 99 • 4 · ·
4 4 *
4380
| ccggagaaag 4440 | tatataaata | tatatttgga | agcgactaaa | aataaacttt | tctcatatta |
| tacgaaccta 4500 | aaaacagcat | atggtagttt | ctagggaatc | taaatcacta | aaattaataa |
| aagaagcaac 4560 | aagtatcaat | acatatgatt | tacaccgtca | aacacgaaat | tcgtaaatat |
| ttaatataat 4620 | aaagaattaa | tccaaatagc | ctcccaccct | atkacttaaa | ctaaaaataa |
| ccagcgaatg 4680 | tatattatat | gcataattta | tatattaaat | gtgtataatc | atgtataatc |
| aatgtataat 4740 | ctatgtatat | ggttagaaaa | agtaaacaat | taatatagcc | ggctatttgt |
| gtaaaaatcc 4800 | ctaatataat | cgcgacggat | ccccgggaat | tccggggaag | cttagatcca |
| tggagccatt | tacaattgaa | tatatcctgc | cg |
4832 <210> 3 <211> 60 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: primer 248 <400> 3 catgccctga cccaggctaa gtattttaac tttaaccact ttgctccgac agtcccattg 60 <210> 4 <211> 60 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: primer 249 $0 f · ·
I · · • · ···« <400> 4 caatgggact gtcggaggac tgagggccaa agcttggctc ttagcctggg tcagggcatg 60 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: primer 247 <400> 5 ccgtcaccga gatctgatct cacgcg 26 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: primer 250 <400> 6 gcactgaggg ccaaagcttg gctc 24 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: primer 251 <400> 7 »· · ' · • * • · • · β · · ggatcccccg atgagctaag ctagc <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: primer 254 <400> 8 cttagcctgg gtcagggcat g <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: primer 258 <400> 9 ctacggcaat gtaccagctg <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: primer SP6 « · · • · ··» · <400> 10 taatacgact cactataggg ega 23 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: primer T7 <400> 11 tttaggtgac actatagaat ac 22 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: primer 201 <400> 12 gcttggacta taatacctga c 21 <210> 13 <211> 953 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: sekvence obsahující 5'sousedící úsek MS-BNl • « • * · • · ···· <220>
<221> různé vlastnosti <222> (1)..(24) <223> pGEM®-T <400> 13
| cccngccgcc | atggccgcgg | gattcttagc | ctgggtcagg | gcatgcatgg | tgtgatccaa | 60 |
| agactttctc | ggcccaaata | ctaatcatca | caagtcatgc | atgatctgct | cgggatggcc | 120 |
| aagaaaaatc | gaacccatga | caatattcac | agttgtaagt | tttttaccag | tagacaaata | 180 |
| ccacttggtt | taacatattg | taaacttaat | atatagaaga | tgttcctatt | cagaaaataa | 240 |
| tatatgtata | tatataaaat | tttattggcg | actcgaggat | gcacagaaat | ataaaatgtt | 300 |
| ggtcgcttag | accatctcca | atgtatttct | ctatttttac | ctctaaaata | aaggagctct | 360 |
| ataatagagg | tgggttttgc | tccaatgtat | ttctttaaaa | tagagatctc | tacatataga | 420 |
| gcaaaatata | gaggaatgtt | atttcttcct | ctataaatag | aggagaaaat | agcaatctct | 480 |
| attttagagg | caaaaataga | gatbsgttgg | agtgattttg | cctctaaatg | ctattataga | 540 |
| ggtagaaata | gaggtgggtt | ggagatgctc | ttactatttt | catagtaggt | gaaaacttga | 600 |
| aactagaaag | ctttggagtg | tacgagtgga | aaacctctct | ttgtagaaac | atacacatgc | 660 |
| catttagtta | actagttgac | atagattttt | gagtcagata | actttaagaa | tatatatgtt | 720 |
| tggatgagag | tttgacactt | tgagccactc | gaaggacaaa | ttttaaaaac | ttgtgggatg | 780 |
| ctgtggccat | aaaccttgag | gacvstttga | tcatattcta | ttaactacag | tacgaatatg | 840 |
| attcgacctt | tgcaattttc | tcttcaggta | ctcggccgtc | gaactcggcc | gtcgagtaca | 900 |
| tggtcgataa | gaaaaggcaa | tttgtagatg | ttaattccca | tcttgaaaga | aat | 953 |
<210> 14 <211> 16 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: primer 611 <400> 14 • 4 4
ngtcgaswgt ntwcaa
<210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: primer 259 <400> 15 gtgcagggaa gcggttaact gg <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: primer 260 <400> 16 cctttggagt aaatggtgtt gg <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: primer 24 <400> 17 gcgaatgtat attatatgca <210> 18 <211> 537 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: sekvence obsahující 3'sousedící úsek MS-BN1 <400> 18
| gcgaatgtat | attatatgca | taatttatat | attaaatgtg | tataatcatg | tataatcaat | 60 |
| gtataatcta | tgtatatggt | tagaaaaagt | aaacaattaa | tatagccggc | tatttgtgta | 120 |
| aaaatcccta | atataatcga | cggatccccg | ggaattccgg | gggaagctta | gatccatgga | 180 |
| tttgttatga | taaccaaaaa | caccctcctt | tttattataa | aggtagggat | agctaatctg | 240 |
| ttattcggtt | ttgattagag | atattaatcc | cgttttatca | agtacagttt | gatgtatttt | 300 |
| tttgttcgtt | ttcattacaa | tccaagacaa | gttaggttta | ttacatttta | ccaaaaaaaa | 360 |
| aggtttggtt | tattgtgaac | attgctgcgg | tttatttaaa | tttgattcta | ttcaaaggtc | 420 |
| aatccgtatt | taacaagtaa | actagtcttt | atataatctt | aaatctaacg | atctttgatt | 480 |
| tttaaattgc | atttanctat | gtcctctctg | gcgtatatgg | tctctttgaa | aacactc | 537 |
<210> 19 <211> 19 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: primer 51 <400> 19 tgacactttg agccactcg
4 4 4» 4» «·
4 4 444 · 4 · »
4 4 4 4 4 · se • 4 444444
444 »44 444 *4 «« «444 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: primer 48 <400> 20 ggagggtgtt tttggttatc 20 <210> 21 <211> 178 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: sekvence obsahující deleci inzerčního místa MS-BNl <400> 21 gacactttga gccactcgaa ggacaaattt taaaaacttg tgggatgctg tggccataaa 60 ccttgaggac gctttgatca tattctatta actacagtac gaatatgatt cgacctttgc 120 aattttctct tgttttctaa ttcatatgga tttgttatga taaccaaaaa caccctcc 178 <210> 22 <211> 1198 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: inzerční úsek MS-BNl t 9 9· *« «fc • · 0· · · · 9 · *· ·' » 99 9 9 · ·
0 · 9··*9 9 9 • 9 99·«··
99« 999 999 «· ·· 9999 <400> 22
| catggtgtga | tccaaagact | ttctcggccc | aaatactaat | catcacaagt | catgcatgat | 60 |
| ctgctcggga | tggccaagaa | aaatcgaacc | catgacaata | ttcacagttg | taagtttttt | 120 |
| accagtagac | aaataccact | tggtttaaca | tattgtaaac | ttaatatata | gaagatgttc | 180 |
| ctattcagaa | aataatatat | gtatatatat | aaaattttat | tggcgactcg | aggatgcaca | 240 |
| gaaatataaa | atgttggtcg | cttagaccat | ctccaatgta | tttctctatt | tttacctcta | 300 |
| aaataaagga | gctctataat | agaggtgggt | tttgctccaa | tgtatttctt | taaaatagag | 360 |
| atctctacat | atagagcaaa | atatagagga | atgttatttc | ttcctctata | aatagaggag | 420 |
| aaaatagcaa | tctctatttt | agaggcaaaa | atagagatbs | gttggagtga | ttttgcctct | 480 |
| aaatgctatt | atagaggtag | aaatagaggt | gggttggaga | tgctcttact | attttcatag | 540 |
| taggtgaaaa | cttgaaacta | gaaagctttg | gagtgtacga | gtggaaaacc | tctctttgta | 600 |
| gaaacataca | catgccattt | agttaactag | ttgacataga | tttttgagtc | agataacttt | 660 |
| aagaatatat | atgtttggat | gagagtttga | cactttgagc | cactcgaagg | acaaatttta | 720 |
| aaaacttgtg | ggatgctgtg | gccataaacc | ttgaggacvs | tttgatcata | ttctattaac | 780 |
| tacagtacga | atatgattcg | acctttgcaa | ttttctcttc | aggttttcta | attcatatgg | 840 |
| atttgttatg | ataaccaaaa | acaccctcct | ttttattata | aaggtaggga | tagctaatct | 900 |
| gttattcggt | tttgattaga | gatattaatc | ccgttttatc | aagtacagtt | tgatgtattt | 960 |
| ttttgttcgt 1020 | tttcattaca | atccaagaca | agttaggttt | attacatttt | accaaaaaaa | |
| aaggtttggt 1080 | ttattgtgaa | cattgctgcg | gtttatttaa | atttgattct | attcaaaggt | |
| caatccgtat 1140 | ttaacaagta | aactagtctt | tatataatct | taaatctaac | gatctttgat | |
| ttttaaattg | catttancta | tgtcctctct | ggcgtatatg | gtctctttga | aaacactc |
1198 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: primer 193 • »· ·· «» • · » · 0 » 4 • * · 0 · * »·«*·< « ··· · · · ·· ·· ·· ··»· <400> 23 tcatctacgg caatgtacca gc 22 <210> 24 <211> 1077 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: sekvence obsahující 5'sousedící úsek RF-BNl <220>
<221> různé vlastnosti <222> (1)..(45) <223> pGEM®-T <220>
<221> různé vlastnosti <222> (1061)..(1077) <223> pGEM®-T <400> 24
| gagctctccc | atatggtcga | cctgcaggcg | gccgcactag | tgattcttag | cctgggtcag | 60 |
| ggcatggcat | gtctgatggt | acatgctaaa | tgctatattt | cctgtttaaa | gtgttaaaat | 120 |
| cattttctga | tggaactaaa | tccagtttta | agagtaactg | acaagtacaa | ttaagcacaa | 180 |
| caatataata | gtagtaattg | gcatctttga | ttgttaaata | tcaaaacagt | aaagttacaa | 240 |
| aaaaaaatac | caaaccaata | atgaagactt | ggcggagaca | gtgccgtgcg | aaggttttcg | 300 |
| gaggtccgag | acgagttcaa | aaatacattt | tacataatat | atttttcata | tatatatata | 360 |
| tataacattc | aaaagtttga | attattacat | aaacgttttc | taaattttct | tcaccaaaat | 420 |
| tttataaact | aaatttttaa | atcatgaaca | aaaagtatga | atttgtaata | taaatacaaa | 480 |
| gatacaaatt | tttgattgaa | atattggtag | ctgtcaaaaa | agtaaatctt | agaatttaaa | 540 |
| ttaactatag | taaactatat | attgaaaata | ttataaattt | ttatcaaatt | ctcataaata | 600 |
• · · · · · * · a · * · · ··« · · * • · · ···»·♦ · • · ·····<
··· ··· ··· Β· ·· ····
| tataaaataa | atctaactca | tagcatataa | aaagaagact | aatgtggatc | aaaatattta | -660 |
| cagtttttta | gaagtagaat | ctttatagtt | ttatttaaaa | tatagcaaaa | atgatcacaa | 720 |
| acctagttay | ttaaggagaa | gtccaattca | aaatcaaata | aaaataaaat | ctatctaaaa | 780 |
| aaatatgtta | actaccatgc | aaaagtattt | tttttgtaat | tagaaaccct | gaaatttgta | 840 |
| caaaacttgg | acccctaggt | aaatgccttt | ttcatctcgc | gataagaaaa | ggcaatttgt | 900 |
| agatgttaat | tcccatcttg | aaagaaatat | agtttaaata | tttattgata | aaataacaag | 960 |
| tcaggtatta 1020 | tagtccaagc | aaaaacataa | atttattgat | gcaagtttaa | attcagaaat | |
| atttcaataa 1077 | ctgattatat | cagctggtac | atcgccgtag | aatcccgcgc | catggcg |
<210> 25 <211> 16 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: primer 286 <400> 25 ntgcgaswga nawgaa 16 <210> 26 <211> 19 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: primer 314 <400> 26 gtaggaggtt gggaagacc 19 <210> 27 fc fc • fcfc • « fcfcfcfc <211> 25 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: primer 315 <400> 27 gggctttcta ctagaaagct ctcgg <210> 28 <211> 24 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: primer 316 <400> 28 ccgataggga agtgatgtag gagg <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: primer 288 <400> 29 atgcagcaag aagcttggag g <210> 30 «
• · · <211> 1501 • ·· ·* ·· •· · · · » 4
4 ♦ « « 9 • 9 4 4 4 4 4 4
4 4 4 4 9
494 44 99 4444 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: sekvence obsahující 3'sousedící úsek RF-BNl <220>
<221> různé vlastnosti <222> (1)..(16) <223> pGEM®-T <220>
<221> různé vlastnosti <222> (1458)..(1501) <223> pGEM®-T <400> 30
| ccatggccgc gggattgtag gaggttggga agacaggccc agaaagagat ttatctgact 60 | ||||||
| cgttttgtgt | atagttttca | atgttcataa | aggaagatgg | agacttgaga | agtttttttt | 120 |
| ggactttgtt | tagctttgtt | gggcgttttt | tttttttgat | caataacttt | gttgggctta | 180 |
| tggtcgataa | gcgtgcgcat | gtctgatggt | acatgctaaa | tgctatattt | ctgtttaaag | 240 |
| tgttaaaatc | attttctgat | ggaactaaat | ccagttttaa | gagtaactga | caagtacaat | 300 |
| taagcacaac | aataaaatag | tagtaattgg | catctttgat | tgttaaatat | caaaacaata | 360 |
| aagttacaaa | aaaaaatacc | aaaccaataa | tgaagacttg | gcggagacag | tgccgtgcga | 420 |
| aggttttcgg | aggtccgaga | cgagttcaaa | aatacatttt | acataatata | tttttcatat | 480 |
| atatatatat | atataacatt | caaaagtttg | aattattaca | taaacgtttt | ctaaattttc | 540 |
| ttcaccaaaa | ttttataaac | taaaattttt | maatcatgaa | caaaaagtat | gaatttgtaa | 600 |
| tataaatacm | aagatacaaa | tttttgattg | aaatattggt | agctgtcaaa | aaagtaaatc | 660 |
| ttagaattta | aattaactat | agtaaactat | atatggaaaa | tattataaat | ttttatcaaa | 720 |
| ttctcataaa | tatataaaat | aaatctaact | catagcatat | aaaaagaaga | ctaatgtgga | 780 |
| tcaaratatt | tacagttttt | tagaagtaga | atctctatag | ttttatttaa | aatatagcaa | 840 |
| aaatgatcac | aaacctagtt | actttaacca | <32. * 9 gaagtccaat | 9 · ♦9 99 9 9 • 9 9 9 9 9 9 9 9 9 99 tcaaaatcaa | 99 99 99 * 9 9 9 9 | |
| • 9 9 9 • 9 9 0 9 < 9 9 9 9 99 99 *9 ataaaaataa | 9 9 9 9 -900 | |||||
| aaatctatct | aaaaaaatat | gttaactacc | atgcaaaagt | attttttttt | gtaattagaa | 960 |
| accctgaaat 1020 | ttgtacaaaa | cttggacccc | taggtaaatt | ccctagaaag | tatcctatta | |
| gcgtcgacaa 1080 | actgttgctc | atatttttct | ctccttactt | tatatcatac | actaatatan | |
| gnagatgatc 1140 | taattaatta | ttcatttcca | tgctagctaa | ttcaagaaaa | agaaaaaaaa | |
| ctattatcta 1200 | aacttatatt | cgagcaacac | ctcggagata | acaggatata | tgtcattaat | |
| gaatgcttga 1260 | actcatctcg | cgaactcatc | tcgcatcgct | tatagccaca | aagatccaac | |
| ccctctcttc 1320 | aatcatatat | cagtagtaca | atacaaatag | atattgtgag | cacatatgcc | |
| gtctagtact 1380 | gatgtgtaca | tgtagaggag | ccgcaaatgt | ttagtcactc | caacaaatga | |
| gcatgaccac 1440 | gcatcttctg | atgatgtaca | gccgtccctt | ttgctctctc | aaatatcctc | |
| caagcttctt | gctgcataaa | tcactagtgc | ggccgcctgc | aggtcgacca | tatgggagag |
1500 c 150 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: primer 269 <400> 31 ggttttcgga ggtccgagac g 21 <210> 32 <211> 21 <212> DNA
4 4 4 • · 4 4 ♦ · • 4
4444 <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: primer 283 <400> 32 cttggacccc taggtaaatg c
| <210> | 33 | |
| <211> | 22 | |
| <212> | DNA | |
| <213> | Umělá | sekvence |
| <220> | ||
| <223> | Popis | umělé sekvence: |
| <400> | 33 | |
| gtacaaaact tggaccccta gg | ||
| <210> | 34 | |
| <211> | 1068 | |
| <212> | DNA | |
| <213> | Umělá | sekvence |
| <220> | ||
| <223> | Popis | umělé sekvence |
| místa | RF-BNl | |
| <400> | 34 |
primer 284 cgcgttggga gctctcccat atggtcgacc tgcaggcggc cgcactagtg attcttggac 60 ccctaggtaa atgccttttt caaaagcctc taagcacggt tctgggcggg gagtcagcga 120 gaaaaaaaga tatttcccta gaaagtatcc tattagcgtc gacaaactgt tgctcatatt 180 tttctctcct tactttatat catacactaa tataaaaaga tgatctaatt aattattcat 240 ttccatgcta gctaattcaa gaaaaagaaa aaaactatta tctaaactta tattcgagca 300 • 1 ·· ♦ ♦ • ·
| acacctcgga | gataacagga | tatatgttat | taatgaatgc | ttgaactcat | ctcgcgaact | .360 |
| catctcgcat | cgcttatagc | cacaaagatc | caacccctct | cttcaatcat | atatcagtag | 420 |
| tacaatacaa | atagatattg | tgagcacata | tgccgtctag | tactgatgtg | tatatgtaga | 480 |
| gganngcaaa | tgtttagtca | ctccaacaaa | tgagcatgac | nacgcatctt | ctgatgatgt | 540 |
| acagccgtcc | cttttgctct | ctcaaatatc | ctccaagctt | cttgctgcat | ggaatcttct | 600 |
| tcttggtgtc | tttcatgata | acaaaatcta | acgagagaga | aacccttagt | caagaaaaaa | 660 |
| caaataaaac | tctaacgaga | gtgtgtgaga | aagtagagag | tatgtgtgag | tgacggagag | 720 |
| aaagtgagac | cataaagatg | ttgtgcaaag | agagcaagac | ttaacctata | tatactcaca | 780 |
| tacacgtaca | catcataccc | attanagata | ataaaaagga | aaaaggaaca | actaacaagg | 840 |
| gaactgtatc | ccatacttta | tctcatcata | catgatgcat | aatatattct | ttcgtatatc | 900 |
| aagaaaaatg | agcctgatat | ttttttattt | cgaaactaaa | agagtgtcta | tttctctctc | 960 |
| ttagagatag 1020 | tgccatgtca | aatttctaag | aagtagcaag | atttacaaag | gaatctaaag | |
| caaccccacg 1068 | cgcattgtgt | tcatttctct | cgaccatccc | gcggccat |
<210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: primer 57 <400> 35 gcatgatctg ctcgggatgg c 21 <210> 36 <211> 909 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: sekvence obsahující 5'sousedící úsek MS-BNl v rostlině ozimé řepky olejky
0 0 0 · 0 0 ·
<400> 36
| tgcatgatct gctcgggatg gccaagaaaa atcgaaccca tgacaatatt cacagttgta 60 | ||||||
| agttttttac | cagtagacaa | ataccacttg | gtttaacata | ttgtaaactt | aatatataga | 120 |
| agatgttcct | attcagaaaa | taatatatgt | atatatataa | aattttattg | gcgactcgag | 180 |
| gatgcacaga | aatataaaat | gttggtcgct | tagaccatct | ccaatgtatt | tctctatttt | 240 |
| tacctctaaa | ataaaggaac | tctataatag | aggtgggttt | tactccaatg | tatttcttta | 300 |
| aaatagagat | ctctacatat | agagcaaaat | atagaggaat | gttatttctt | cctctataaa | 360 |
| tagaggagaa | aatagcaatc | tctattttag | aggcaaaaat | agagatgggt | tggagtgatt | 420 |
| ttgcctctaa | atgctattat | agaggtagaa | atagaggtgg | gttggagatg | ctcttactat | 480 |
| tttcatagta | ggtgaaaact | tgaaactaga | aagctttgga | gtgtacgagt | ggaaaacctc | 540 |
| tctttgtaga | aacatacaca | tgccatttag | ttaactagtt | gacatagatt | tttgagtcag | 600 |
| ataactttaa | gaatatatat | gtttggatga | gagtttgaca | ctttgagcca | ctcgaaggac | 660 |
| aaattttaaa | aacttgtggg | atgctgtggc | ccataaacct | tgaggacgct | ttgatcatat | 720 |
| tctattaact | acagtacgaa | tatgattcga | cctttgcaat | tttctcttca | gtactcggcc | 780 |
| gtcgaactcg | gccgtcgagt | acatggtcga | taagaaaagg | caatttgtag | atgttaattc | 840 |
| ccatcttgaa | agaaatatag | tttaaatatt | tattggataa | aataacaagt | caggtattat | 900 |
| agtccaagc | 909 |
<210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: primer 68 <400> 37 ccatatacgc cagagaggac 20 <210> 38 •4 44 44
4 4 · 4 · 4 4 4
4 4 4 4 4
4 4 4 4 • 44 44 4444 <211> 522 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: sekvence obsahující 3'sousedící úsek MS-BNl v rostlině ozimé řepky olejky <400> 38
| gcgaatgtat | attatatgca | taatttatat | attaaatgtg | tataatcatg | tataatcaat | 60 |
| gtataatcta | tgtatatggt | tagaaaaagt | aaacaattaa | tatagccggc | tatttgtgta | 120 |
| aaaatcccta | atataatcga | cggatccccg | ggaattccgg | gggaagctta | gatccatgga | 180 |
| tttgttatga | taaccaaaaa | caccctcctt | tttattataa | aggtagggat | agctaatctg | 240 |
| ttattcggtt | ttgattagag | atattaatcc | cgttttatca | agtacagttt | gatgtatttt | 300 |
| tttgttcgtt | ttcattacaa | tccaagacaa | gttaggttta | ttacatttta | ccaaaaaaaa | 360 |
| aggtttggtt | tattgtgaac | attgctgcgg | ttttatttaa | atttgattct | attcaaaggt | 420 |
| caatccgtat | ttaacaagta | aactagtctt | tatataatct | taaatctaac | gatacttgga | 480 |
| tttttaaatt | gcatttagct | atgtcctctc | tggcgtatat | gg | 522 |
<210> 39 <211> 694 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: sekvence obsahující 5'sousedící úsek RF-BNl v rostlině ozimé řepky olejky <400> 39 ggttttcgga ggtccgagac gagttcaaaa atacatttta cataatatat ttttcatata 60 tatatatata tataacattc aaaagtttga attattacat aaacgttttc taaattttct 120 • 0 0 *:
• 0 000 000
• 0 0» • 0
0 0 «
0
000 0
| tcaccaaaat | tttataaact | aaaattttta | aatcatgaac | aaaaagtatg | aatttgtaat | .180 |
| ataaatacaa | agatacaaat | ttttgattga | aatattggta | gctgtcaaaa | aagtaaatct | 240 |
| tagaatttaa | attaactata | gtaaactata | tattgaaaat | attataaatt | tttatcaaat | 300 |
| tctcataaat | atataaaata | aatctaactc | atagcatata | aaaagaagac | taatgtggat | 360 |
| caaaatattt | acagtttttt | agaagtagaa | tctttatagt | tttatttaaa | atatagcaaa | 420 |
| aatgatcaca | aacctagtta | ctttaaccag | aagtccaatt | caaaatcaaa | taaaaataaa | 480 |
| aatctatcta | aaaaaatatg | ttaactacca | tgcaaaagta | tttttttttg | taattagaaa | 540 |
| ccctgaaatt | tgtacaaaac | ttggacccct | aggtaaatgc | ctttttcatc | tcgcgataag | 600 |
| aaaaggcaat | ttgtagatgt | taattcccat | cttgaaagaa | atatagttta | aatatttatt | 660 |
| gataaaataa | caagtcaggt | attatagtcc | aagc | 694 |
<210> 40 <211> 1279 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: sekvence obsahující 3'sousedící úsek RF-BN1 v rostlině ozimé řepky olejky <400> 40
| gggggttttt | ttttttgatc | aataactttg | ttgggcttat | ggtcgataag | cgtgcgcatg | 60 |
| tctgatggta | catgctaaat | gctatatttc | tgtttaaagt | gttaaaatca | ttttctgatg | 120 |
| gaactaaatc | cagttttaag | agtaactgac | aagtacaatt | aagcacaaca | ataaaatagt | 180 |
| agtaattggc | atctttgatt | gttaaatatc | aaacaataaa | gttcaaaaaa | aaataccaac | 240 |
| ccaataatga | agacttggcg | gagacagtgc | cgtgcgaagg | ttttcggagg | tccgagacga | 300 |
| gttcaaaaat | acattttaca | taatatattt | ttcatatata | tatatatata | taacattcaa | 360 |
| aagtttgaat | tattacataa | acgttttcta | aattttcttc | accaaaattt | tataaactaa | 420 |
| aatttttaaa | tcatgaacaa | aaagtatgaa | tttgtaatat | aaatacaaag | atacaaattt | 480 |
| ttgattgaaa | tattggtagc | tgtcaaaaaa | gtaaatctta | gaatttaaat | taactatagt | 540 |
| aaactatata | ttgaaaatat | tataaatttt | tatcaaattc | tcataaatat | ataaaataaa | 600 |
| tctaactcat | agcatataaa | aagaagacta | atgtggatca | aaatatttac | agttttttag | 660 |
3$ ·
· 4 • ·· • 4 4 • 4
114
4
4 •4 4444
| aagtagaatc tttatagttt tatttaaaat atagcaaaaa tgatcacaaa cctagttact.720 | ||||||
| ttaaccagaa | gtccaattca | aaatcaaata | aaaataaaaa | tctatctaaa | aaaatatgtt | 780 |
| aactaccatg | caaaagtatt | tttttttgta | attagaaacc | ctgaaatttg | tacaaaactt | 840 |
| ggacccctag | gtaaattccc | tagaaagtat | cctattagcg | tcgacaaact | gttgctcata | 900 |
| tttttctctc | cttactttat | atcatacact | aatataaaaa | gatgatctaa | ttaattattc | 960 |
| atttccatgc 1020 | tagctaattc | aagaaaaaga | aaaaaaactt | attatctaaa | cttatattcg | |
| agcaacacct 1080 | cggagataac | aggatatatg | tcattaatga | atgcttgaac | tcatctcgcg | |
| aactcatctc 1140 | gcatcgctta | tagccacaaa | gatccaaccc | ctctcttcaa | tcatatatca | |
| gtagtacaat 1200 | acaaatagat | attgtgagca | catatgccgt | ctagtactga | tgtgtatatg | |
| tagaggagcc | gcaaatgttt | agtcactcca | acaaatgagc | atgaccacgc | atcttctgat |
1260 gatgtacagc cgtcccttt 1279 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: primer 268 (BNA04) <400> 41 tggaccccta ggtaaatgcc 20 <210> 42 <211> 22 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: primer BNA05 ’· » *
• · ··»·»» ·«· >1« ·»· · .« ·»*· <400> 42 aacgagtgtc agctagacca gc 22 <210> 43 <211> 22 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: primer BNA06 <400> 43 cgcagttctg tgaacatcga cc
100
Claims (2)
1. Rostlina ozimé řepky olejky, semena, buňky nebo pletiva rostliny podle nároku 1, kde genomová DNA rostlin ozimé řepky olejky nebo semen, buněk nebo pletiv rostliny poskytnou alespoň dva soubory restrikčních fragmentů vybraných ze skupiny, kterou tvoří:
I) jeden soubor BamHI fragmentů, kde jeden má délku mezi 805 a 1099 bp, výhodně přibližně 814 bp, jeden má délku mezi 1700 a 1986 bp, jeden má délku mezi 2450 a 2838 bp a jeden má délku mezi 5077 a 14057 bp,
II) jeden soubor EcoRI fragmentů, jeden délky mezi 805 a 1159 bp, jeden délky mezi 1986 a 2450 bp a dva délky mezi 5077 a 14057 bp,
III) jeden soubor EcoRV fragmentů, kde oba mají délku mezi 5077 a 14057 bp,
IV) jeden soubor HindlII fragmentů, kde jeden má délku mezi 1700 a 2140 bp a dva mají délku mezi 2450 a 2838 bp, přičemž každý z restrikčních fragmentů je schopen hybridizace v podmínkách standardní stringence, s fragmentem o velikosti 2182 bp obsahujícím sekvenci PTA29-barstar připravitelnou štěpením plazmidu pTHW118 enzymem Hpal.
2. Rostlina, semena, rostlinné buňky nebo pletivo podle nároku
1, kde genomová DNA rostliny, semen, rostlinných buněk nebo pletiv je schopna poskytnout alespoň tři soubory restrikčních fragmentů vybraných ze skupiny.
3. Rostlina, semena, rostlinné buňky nebo pletivo podle nároku
2, kde genomová DNA rostliny, semen, rostlinných buněk nebo
101 pletiv je schopna poskytnout čtyři soubory restrikčních fragmentů vybraných ze skupiny.
4. Rostlina, semena, rostlinné buňky nebo pletivo podle nároku
2, kde genomová DNA rostliny, semen, rostlinných buněk nebo pletiv je schopna poskytnout všech pět souborů restrikčních fragmentů vybraných ze skupiny.
5. Rostlina ozimé řepky olejky, semena, buňky nebo pletiva rostliny podle nároku 1, kde genomová DNA může být použita k amplifikaci DNA fragmentu o velikosti mezi 195 a 235 bp, s použitím polymerázové řetězové reakce se dvěma primery majícími nukleotidové sekvence SEKV. ID. Č. 23 a SEKV. ID. Č. 41.
6. Rostlina ozimé řepky olejky, semena, buňky nebo pletiva rostliny podle nároku 5, kde genomová DNA může být použita k amplifikaci DNA fragmentu o velikosti přibližně 215 s použitím polymerázové řetězové reakce s dvěma primery majícími nukleotidové sekvence ze SEKV. ID. Č. 23 a SEKV. ID. Č. 41.
7. Rostlina, semena, rostlinné buňky nebo pletivo podle nároku 1, kde dále genomová DNA rostliny, buňky, pletiva nebo semen je schopna poskytnout alespoň tři soubory restrikčních fragmentů vybrané ze skupiny, kterou tvoří:
I) jeden soubor EcoRI fragmentů, jeden délky mezi 2140 a 2450 bp, výhodně přibližně 2266 bp, a jeden délky více než 14 kbp,
II) jeden soubor EcoRV fragmentů, kde jeden má délku mezi 1159 a 1700 bp, výhodně přibližně 1,4 kbp, a druhý má délku více než 14 kbp,
III) jeden soubor Hpal fragmentů, jeden délky mezi 1986 a
102
2140 bp, výhodně délky přibližně 1990 bp, a jeden délky mezi 2140 a 2450 bp, výhodně přibližně 2229 bp,
IV) jeden soubor AflIII fragmentů, jeden délky mezi 514 a 805 bp, výhodně délky přibližně 522 bp, a jeden délky mezi 2140 a 2450 bp, výhodně přibližně 2250 bp, a jeden délky mezi 2450 a 2838 bp, výhodně přibližně 2477 bp,
V) jeden soubor Ndel fragmentů, oba délky mezi 5077 a 14057 bp, výhodně jeden délky přibližně 6500 bp a jeden délky přibližně 10 kbp, kde každý z restrikčních fragmentů je schopen hybridizace v podmínkách standardní stringence, s fragmentem o velikosti 3942 bp obsahujícím sekvenci PTA29-barnázy připravitelnou štěpením plazmidu pTHW107 enzymem HindlII.
8. Rostlina, semena, rostlinné buňky nebo pletivo podle nároku
7, kde genomová DNA rostliny, semen, rostlinných buněk nebo tkání je schopna poskytnout alespoň tři soubory restrikčních fragmentů vybraných ze skupiny.
9. Rostlina, semena, rostlinné buňky nebo pletivo podle nároku
8, kde genomová DNA rostliny, semen, rostlinných buněk nebo tkání je schopna poskytnout alespoň čtyři soubory restrikčních fragmentů vybraných ze skupiny.
10. Rostlina, semena, rostlinné buňky nebo pletivo podle nároku
9, kde genomová DNA rostliny, semen, rostlinných buněk nebo tkání je schopna poskytnout všech pět souborů restrikčních fragmentů vybraných ze skupiny.
11. Rostlina, semena, rostlinné buňky nebo pletivo podle nároku
7, kde dále genomová DNA může být použita k amplifikaci DNA fragmentu o velikosti mezi 260 a 300 bp, s použitím
103 polymerázové řetězové reakce s dvěma primery majícími nukleotidové sekvence SEKV. ID. Č. 12 a SEKV. ID. Č. 19.
12. Rostlina, semena, rostlinné buňky nebo pletivo podle nároku
1, které mohou být získány křížením rostliny s rostlinou ozimé řepky olejky získanou ze semen uložených v ATCC pod přístupovým číslem PTA-730.
13. Rostlina, semena, rostlinné buňky nebo pletivo podle kteréhokoliv z nároků 1 až 12, kde se jedná o hybridní rostlinu, semena nebo hybridní rostlinné buňky nebo pletiva.
14. Semena uložená v ATCC pod přístupovým číslem PTA-730.
15. Rostlina ozimé řepky olejky nebo její semena, rostlinné buňky nebo pletiva, kde: a) genomová DNA rostlin ozimé řepky olejky nebo semen, buněk nebo pletiv rostliny poskytnou alespoň dva soubory restrikčních fragmentů vybraných ze skupiny, kterou tvoří:
I) jeden soubor BamHI fragmentů, kde jeden má délku mezi 805 a 1099 bp, výhodně přibližně 814 bp, jeden má délku mezi 1700 a 1986 bp, jeden má délku mezi 2450 a 2838 bp a jeden má délku mezi 5077 a 14057 bp,
II) jeden soubor EcoRI fragmentů, jeden délky mezi 805 a
mezi 1700 a 2140 bp a dva mají délku mezi 2450 a 2838 bp, přičemž každý z restrikčních fragmentů je schopen
9 ·
104 hybridizace v podmínkách standardní stringence, s fragmentem o velikosti 2182 bp obsahujícím sekvenci PTA29-barstar připravitelnou štěpením plazmidu pTHW118 enzymem Hpal, a/nebo
b) kde genomová DNA může být použita k amplifikaci DNA fragmentu o velikosti mezi 195 a 235 bp, s použitím polymerázové řetězové reakce se dvěma primery majícími nukleotidové sekvence SEKV. ID. Č. 23 a SEKV. ID. Č. 41.
16. Rostlina, semena, buňky nebo pletiva rostliny podle nároku 15, kde genomová DNA může být použita k amplifikaci DNA fragmentu o velikosti přibližně 215 s použitím polymerázové řetězové reakce s dvěma primery majícími nukleotidové sekvence ze SEKV. ID. Č. 23 a SEKV. ID. Č. 41.
17. Rostlina, buňky, pletivo nebo semena podle nároku 15, kde dále genomová DNA rostliny, buňky, pletiva nebo semen je schopna poskytnout alespoň tři soubory restrikčních fragmentů vybraných ze skupiny.
18. Rostlina, buňky, pletivo nebo semena podle nároku 17, kde dále genomová DNA rostliny, buňky, pletiva nebo semen je schopna poskytnout alespoň čtyři soubory restrikčních fragmentů vybraných ze skupiny.
19. Rostlina, buňky, pletivo nebo semena podle nároku 18, kde dále genomová DNA rostliny, buňky, pletiva nebo semen je schopna poskytnout všech pět souborů restrikčních fragmentů vybraných ze skupiny.
20. Rostlina, buňky, pletivo nebo semena podle nároku 13, kde dále genomová DNA rostliny, buňky, pletiva nebo semen je schopna poskytnout alespoň tři soubory restrikčních ··· ···
105 fragmentů vybraných ze skupiny, kterou tvoří:
I) jeden soubor EcoRI fragmentů, jeden délky mezi 2140 a 2450 bp, výhodně přibližně 2266 bp, a jeden délky více než 14 kbp,
II) jeden soubor EcoRV fragmentů, kde jeden má délku mezi 1159 a 1700 bp, výhodně přibližně 1,4 kbp, a druhý má délku více než 14 kbp,
III) jeden soubor Hpal fragmentů, jeden délky mezi 1986 a 2140 bp, výhodně délky přibližně 1990 bp a jeden délky mezi 2140 a 2450 bp, výhodně přibližně 2229 bp,
IV) jeden soubor AflIII fragmentů, jeden délky mezi 514 a 805 bp, výhodně délky přibližně 522 bp, a jeden délky mezi 2140 a 2450 bp, výhodně přibližně 2250 bp, a jeden délky mezi 2450 a 2838 bp, výhodně přibližně 2477 bp,
V) jeden soubor Ndel fragmentů, oba délky mezi 5077 a 14057 bp, výhodně jeden délky přibližně 6500 bp a jeden délky přibližně 10 kbp, přičemž každý z restrikčních fragmentů je schopen hybridizace v podmínkách standardní stringence, s fragmentem o velikosti 3942 bp obsahujícím sekvenci PTA29-barnázy připravitelnou štěpením plazmidu pTHWlO7 enzymem HindlII, a/nebo
b) kde genomová DNA může být použita k amplifikaci DNA fragmentu o velikosti mezi 260 a 300 bp, s použitím polymerázové řetězové reakce se dvěma primery majícími nukieotidové sekvence SEKV. ID. Č. 12 a SEKV. ID. Č. 19.
21. Rostlina, semena, rostlinné buňky nebo pletivo podle nároku 20, kde genomová DNA může být použita k amplifikaci DNA fragmentu o velikosti mezi 260 a 300 bp, s použitím polymerázové řetězové reakce se dvěma primery majícími nukieotidové sekvence SEKV. ID. Č. 12 a SEKV. ID. Č. 19.
106
22. Rostlina, semena, rostlinné buňky nebo pletivo podle nároku
20, kde genomová DNA rostliny, semen, rostlinných buněk nebo tkání je schopna poskytnout alespoň tři soubory restrikčních fragmentů vybraných ze skupiny.
23. Rostlina, semena, rostlinné buňky nebo pletivo podle nároku
22, kde genomová DNA rostliny, semen, rostlinných buněk nebo tkání je schopna poskytnout alespoň čtyři soubory restrikčních fragmentů vybraných ze skupiny.
24. Rostlina, semena, rostlinné buňky nebo pletivo podle nároku
23, kde genomová DNA rostliny, semen, rostlinných buněk nebo tkání je schopna poskytnout všech pět souborů restrikčních fragmentů vybraných ze skupiny.
25. Způsob produkce hybridních semen vyznačující se tím, že zahrnuje
a) křížení transgenní rostliny ozimé řepky olejky se samčí sterilitou, která má jednu z uvedených charakteristik nebo obě:
1) genomová DNA rostliny, buňky, pletiva nebo semen je schopna poskytnout alespoň dva soubory restrikčních fragmentů vybraných ze skupiny, kterou tvoří:
I) jeden soubor EcoRI fragmentů, jeden délky mezi 2140 a 2450 bp, výhodně přibližně 2266 bp, a jeden délky více než 14 kbp,
II) jeden soubor EcoRV fragmentů, kde jeden má délku mezi 1159 a 1700 bp, výhodně přibližně 1,4 kbp, a druhý má délku více než 14 kbp,
III) jeden soubor Hpal fragmentů, jeden délky mezi 1986 a 2140 bp, výhodně délky přibližně 1990 bp a jeden délky mezi 2140 a 2450 bp, výhodně přibližně 2229 bp,
107
IV) jeden soubor AflIII fragmentů, jeden délky mezi 514 a 805 bp, výhodně délky přibližně 522 bp, a jeden délky mezi 2140 a 2450 bp, výhodně přibližně 2250 bp, a jeden délky mezi 2450 a 2838 bp, výhodně přibližně 2477 bp,
V) jeden soubor Ndel fragmentů, oba délky mezi 5077 a 14057 bp, výhodně jeden délky přibližně 6500 bp a jeden délky přibližně 10 kbp, přičemž každý z restrikčnich fragmentů je schopen hybridizace v podmínkách standardní stringence, s fragmentem o velikosti 3942 bp obsahujícím sekvenci PTA29-barnázy připravitelnou štěpením plazmidu pTHW107 enzymem HindlII, a/nebo
1) genomová DNA může být použita k amplifikaci DNA fragmentu o velikosti mezi 260 a 300 bp, s použitím polymerázové řetězové reakce s dvěma primery majícími nukleotidové sekvence SEKV. ID. Č. 12 a SEKV. ID. Č. 19, s rostlinou ozimé řepky olejky obnovující fertilitu, obsahující, a to trvale integrován do svého genomu, gen obnovující fertilitu obsahující:
DNA kódující inhibitor ribonukleázy konstitutivní promotor, kde DNA je v stejné transkripční jednotce a pod kontrolou konstitutivního promotoru,
b)sklizení hybridních semen z rostlin ozimé řepky olejky se samčí sterilitou.
26. Způsob podle nároku 25 vyznačující se tím, že rostlina obnovující fertilitu je charakterizována jednou z následujících vlastností nebo oběma:
1) genomová DNA rostlin ozimé řepky olejky nebo semen, buněk nebo pletiv rostliny poskytnou alespoň dva soubory restrikčnich fragmentů vybraných ze skupiny, kterou tvoří:
I) jeden soubor BamHI fragmentů, kde jeden má délku mezi
108
805 a 1099 bp, výhodně přibližně 814 bp, jeden má délku mezi 1700 a 1986 bp, jeden má délku mezi 2450 a
2838 bp a jeden má délku mezi 5077 a 14057 bp,
II) jeden soubor EcoRI fragmentů, jeden délky mezi 805 a 1159 bp, jeden délky mezi 1986 a 2450 bp a dva délky mezi 5077 a 14057 bp,
III) jeden soubor EcoRV fragmentů, kde oba máji délku mezi 5077 a 14057 bp,
IV) jeden soubor HindlII fragmentů, kde jeden má délku mezi 1700 a 2140 bp a dva máji délku mezi 2450 a 2838 bp, přičemž každý z restrikčních fragmentů je schopen hybridizace v podmínkách standardní stringence, s fragmentem o velikosti 2182 bp obsahujícím sekvenci PTA29-barstar připravitelnou štěpením plazmidu pTHW118 enzymem Hpal, a/nebo
2) genomová DNA může být použita k amplifikaci DNA fragmentu o velikosti mezi 195 a 235 bp, s použitím polymerázové řetězové reakce se dvěma primery majícími nukleotídové sekvence SEKV. ID. Č. 23 a SEKV. ID. Č. 41.
27. Hybridní semena rostlin ozimé řepky získatelná způsobem podle nároku 25 nebo 26.
28. Způsob přípravy buněk nebo rostlin transgenní ozimé řepky olejky vyznačující se tím, že zahrnuje inzerci rekombinantní DNA molekuly do části chromozómové DNA buňky ozimé řepky olejky, kterážto molekula je v podstatě podobná sekvenci SEKV. ID. Č. 22, a regeneraci rostliny ozimé řepky olejky z transformované buňky ozimé řepky olejky.
29. Způsob podle nároku 28, kde rekombinantní DNA molekul je gen samčí sterility a regenerovaná rostlina je rostlina se • · · ·
109 samčí sterilitou.
30. Způsob přípravy buněk nebo rostlin transgenní ozimé řepky olejky vyznačující se tím, že zahrnuje inzerci rekombinantní DNA molekuly do části chromozómové DNA buňky ozimé řepky olejky, kterážto molekula je v podstatě podobná sekvenci SEKV. ID. Č. 34, a regeneraci rostliny ozimé řepky olejky z transformované buňky ozimé řepky olejky.
31. Způsob podle nároku 21, kde rekombinantní DNA molekul je gen obnovy fertility a regenerovaná rostlina je obnovitel fertility schopný po křížení s rostlinou se samčí sterilitou poskytnout potomstvo se samčí fertilitou.
32. Transgenní buňka nebo rostlina ozimé řepky získatelná způsobem podle kteréhokoliv z nároků 28 až 31.
33. Způsob identifikace transgenní rostliny nebo jejích buněk nebo pletiv, obsahující elitní událost MS-BNl, vyznačující se tím, že zahrnuje stanovení toho, zda genomová DNA rostliny, buněk nebo pletiv má jednu z následujících vlastností nebo obě:
1) genomová DNA rostliny, buňky, pletiva nebo semen je schopna poskytnout alespoň dva soubory restrikčních fragmentů vybraných ze skupiny, kterou tvoří:
I) jeden soubor EcoRI fragmentů, jeden délky mezi 2140 a 2450 bp, výhodně přibližně 2266 bp, a jeden délky více než 14 kbp,
II) jeden soubor EcoRV fragmentů, kde jeden má délku mezi 1159 a 1700 bp, výhodně přibližně 1,4 kbp, a druhý má délku více než 14 kbp,
III) jeden soubor Hpal fragmentů, jeden délky mezi 1986 a 2140 bp, výhodně délky přibližně 1990 bp a jeden délky
110 mezi 2140 a 2450 bp, výhodně přibližně 2229 bp,
IV) jeden soubor AflIII fragmentů, jeden délky mezi 514 a
805 bp, výhodně délky přibližně 522 bp, a jeden délky mezi 2140 a 2450 bp, výhodně přibližně 2250 bp, a jeden délky mezi 2450 a 2838 bp, výhodně přibližně
2477 bp,
V) jeden soubor Ndel fragmentů, oba délky mezi 5077 a 14057 bp, výhodně jeden délky přibližně 6500 bp a jeden délky přibližně 10 kbp, přičemž každý z restrikčních fragmentů je schopen hybridizace v podmínkách standardní stringence, s velikosti 3942 bp obsahujícím sekvenci připravitelnou štěpením plazmidu pTHW107 fragmentem o PTA29-barnázy enzymem HindlII, a/nebo
2) genomová DNA může být použita k amplifikaci DNA fragmentu o polymerázové velikosti mezi řetězové reakce
260 a 300 bp, s použitím s dvěma primery majícími nukleotídové sekvence SEKV. ID. Č. 12 a SEKV. ID. Č. 19.
34. Způsob podle nároku 33 vyznačující se tím, že zahrnuje stanovení toho, zda genomová DNA transgenní rostliny, jejích pletiv nebo buněk může být použita k amplifikaci DNA fragmentu o velikosti mezi 260 a 300 bp, s použitím polymerázové řetězové reakce se dvěma primery majícími nukleotidové sekvence SEKV. ID. Č. 12 a SEKV. ID. Č. 19.
35. Souprava pro identifikaci transgenní rostliny, jejích buněk nebo pletiva obsahujících elitní událost MS-BN1, vyznačující se tím, že obsahuje PCR sondy, z nichž jedna rozpoznává sekvence v transgenu, další rozpoznává rostlinou DNA sekvenci ve 3' sousedícím úseku SEKV. ID. Č. 13 nebo 5' sousedící sekvenci SEKV. ID. Č. 18 události • 9
111
MS-BNl, pro použití v PCR identifikačním protokolu.
36. Souprava podle nároku 35 pro identifikaci transgenní rostliny, jejích buněk nebo pletiva obsahujících elitní událost MS-BNl, vyznačující se tím, že obsahuje PCR sondy mající nukleotidovou sekvenci SEKV. ID. Č. 12 a SEKV. ID. Č. 19.
37. Způsob identifikaci transgenní rostliny nebo jejích buněk událost RF-BNl, nebo pletiv obsahujících elitní vyznačující se tím, že zahrnuje stanovení jedené nebo obou z následujících charakteristik genomové DNA transgenní rostliny nebo jejích buněk nebo pletiv:
1) genomová DNA rostlin ozimé řepky olejky nebo semen, buněk nebo pletiv rostliny poskytnou alespoň dva soubory restrikčních fragmentů vybraných ze skupiny, kterou tvoří:
I) jeden soubor BamHI fragmentů, kde jeden má délku mezi 805 a 1099 bp, výhodně přibližně 814 bp, jeden má délku mezi 1700 a 1986 bp, jeden má délku mezi 2450 a 2838 bp a jeden má délku mezi 5077 a 14057 bp,
II) jeden soubor EcoRI fragmentů, jeden délky mezi 805 a 1159 bp, jeden délky mezi 1986 a 2450 bp a dva délky mezi 5077 a 14057 bp,
III) jeden soubor EcoRV fragmentů, kde oba mají délku mezi 5077 a 14057 bp,
IV) jeden soubor HindlII fragmentů, kde jeden má délku mezi 1700 a 2140 bp a dva mají délku mezi 2450 a 2838 bp, přičemž každý z restrikčních fragmentů je schopen hybridizace v podmínkách standardní stringence, s velikosti 2182 bp obsahujícím sekvenci připravitelnou štěpením plazmidu pTHW118 fragmentem o PTA29-barstar enzymem Hpal, a/nebo ♦* ·♦
112
2) genomová DNA může být použita k amplifikaci DNA
zahrnuje stanovení toho, zda genomová DNA transgenní rostliny, jejích buněk nebo pletiv může být použita k amplifikaci DNA fragmentu o velikosti mezi 195 a 235 bp, s použitím polymerázové řetězové reakce se dvěma primery majícími nukleotidové sekvence SEKV. ID. Č. 23 a SEKV. ID. Č. 41.
39. Souprava pro identifikaci transgenní rostliny, jejích buněk nebo pletiva obsahujících elitní událost RF-BN1, vyznačující se tím, že obsahuje PCR sondy, z nichž jedna rozpoznává sekvence v transgenu, a další rozpoznává rostlinou DNA sekvenci v 3' sousedícím úseku SEKV. ID. Č. 24 nebo 5' sousedící SEKV. ID. Č. 30 události RF-BN1, pro použití v PCR identifikačním protokolu.
40. Souprava podle nároku 39, pro identifikaci transgenní rostlin, jejích buněk nebo pletiva obsahujících elitní událost RF-BN1, vyznačující se tím, že obsahuje PCR sondy mající nukleotidovou sekvenci SEKV. ID. Č. 23 a SEKV. ID. Č. 41.
41. Souprava pro identifikaci elitní události MS-BNl v biologických vzorcích vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden PCR primer nebo sondu, která rozpoznává sekvence v 3' nebo 5' sousedícím úseku události MS-BNl.
113
42. Souprava podle nároku 41 vyznačující se tím, že alespoň jeden PCR primer rozpoznává sekvence v rostlinné DNA v SEKV. ID. Č. 13.
43. Souprava podle nároku 42 vyznačující se tím, že primer rozpoznávající sekvence v rostlinné DNA v SEKV. ID. Č. 13 obsahuje sekvencí SEKV. ID. Č. 19.
nároků 41 az
44. Souprava podle kteréhokoliv z vyznačující se tím, že dále obsahuje alespoň druhý PCR primer nebo sondu, která rozpoznává sekvence v cizorodé DNA MS-BN2.
45. Souprava podle nároku 44 vyznačující se tím, že primer rozpoznávájící sekvenci v cizorodé DNA MS-BNl obsahuje sekvenci SEKV. ID. Č. 12.
46. Primer pro použití v MS-BNl PCR identifikačním protokolu, který má sekvenci, která za optimalizovaných PCR podmínek specificky rozpoznává sekvenci v 5' nebo 3' sousedícím úseku MS-BNl.
47. Primer podle nároku 46, který má alespoň 80% sekvenční identitu se sekvencí rostlinné DNA SEKV. ID. Č. 13 nebo SEKV. ID. Č. 18 nebo komplementární sekvencí.
48. Primer podle nároku 47 obsahující sekvenci SEKV. ID. Č. 19.
49. Primer obsahující sekvenci SEKV. ID. Č. 12.
50. Způsob pro potvrzení čistoty osiva vyznačující se tím, že zahrnuje detekci MS-BNl specifické DNA sekvence pomocí specifického primerů nebo sondy, která specificky
114 rozpoznává 5' nebo 3' sousedící úsek MS-BNl, ve vzorcích semen.
51. Způsob screeningu osiva na přítomnost MS-BNl vyznačující se tím, že zahrnuje detekci MS-BNl specifické DNA sekvence pomocí specifického primeru nebo sondy, která specificky rozpoznává 5' nebo 3' sousedící úsek MS-BNl, ve vzorcích šarže osiva.
52. Souprava pro identifikaci elitní události RF-BNl v biologických vzorcích vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden PCR primer nebo sondu, která rozpoznává sekvence v 3' nebo 5' sousedícím úseku události RF-BNl.
53. Souprava podle nároku 52 vyznačující se tím, že alespoň jeden PCR primer rozpoznává sekvenci rostlinné DNA v SEKV. ID. Č. 24.
54. Souprava podle nároku 53 vyznačující se tím, že primer rozpoznávající sekvenci v rostlinné DNA v SEKV. ID. Č. 24 obsahuje sekvenci SEKV. ID. Č. 41.
55. Souprava podle kteréhokoliv z nároků 52 až 54 vyznačující se tím, že dále obsahuje alespoň druhý PCR primer nebo sondu, která rozpoznává sekvenci v cizorodé DNA MS-BN2.
56. Souprava podle nároku 55 vyznačující se tím, že primer rozpoznávající sekvenci v cizorodé DNA RF-BNl obsahuje sekvenci SEKV. ID. Č. 23.
57. Primer pro použití v RF-BNl PCR identifikačním protokolu
115 který má sekvenci, která za optimalizovaných PCR podmínek specificky rozpoznává sekvenci v 5' nebo 3' sousedícím úseku MS-BNl.
58. Primer podle nároku 57, který má alespoň 80% sekvenční identitu se sekvencí rostlinné DNA SEKV. ID. Č. 24 nebo SEKV. ID. Č. 30 nebo komplementární sekvencí.
59. Primer podle nároku 58 obsahující sekvenci SEKV. ID. Č. 41.
60. Primer obsahující sekvenci SEKV. ID. Č. 23.
61. Způsob potvrzení čistoty osiva vyznačující se tím, že zahrnuje detekci RF-BNl specifické DNA sekvence pomocí specifického primeru nebo sondy, která specificky rozpoznává 5' nebo 3' sousedící úsek události RF-BNl, ve vzorcích semen.
62. Způsob screeningu osiva na přítomnost RF-BNl vyznačující se tím, že zahrnuje detekci RF-BNl specifické DNA sekvence pomocí specifického primeru nebo sondy, která specificky rozpoznává 5' nebo 3' sousedící úsek RF-BNl, ve vzorcích šarže osiva.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US09/457,037 US6506963B1 (en) | 1999-12-08 | 1999-12-08 | Hybrid winter oilseed rape and methods for producing same |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20022367A3 true CZ20022367A3 (cs) | 2003-01-15 |
| CZ306357B6 CZ306357B6 (cs) | 2016-12-21 |
Family
ID=23815191
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2002-2367A CZ306357B6 (cs) | 1999-12-08 | 2000-12-06 | Hybrid ozimé řepky olejky, způsob identifikace transgenní rostliny a souprava pro tuto identifikaci |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (5) | US6506963B1 (cs) |
| EP (1) | EP1244348B1 (cs) |
| CN (2) | CN1690211B (cs) |
| AT (1) | ATE323404T1 (cs) |
| AU (1) | AU783406B2 (cs) |
| CZ (1) | CZ306357B6 (cs) |
| DE (1) | DE60027469T2 (cs) |
| DK (1) | DK1244348T3 (cs) |
| HK (2) | HK1051295A1 (cs) |
| HU (1) | HU225433B1 (cs) |
| PL (1) | PL205071B1 (cs) |
| UA (1) | UA88861C2 (cs) |
| WO (1) | WO2001041558A1 (cs) |
Families Citing this family (289)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6506963B1 (en) * | 1999-12-08 | 2003-01-14 | Plant Genetic Systems, N.V. | Hybrid winter oilseed rape and methods for producing same |
| CA2525916C (en) * | 2003-05-16 | 2012-01-03 | House Foods Corporation | Quantitative pcr method of detecting specific plant genus in food or food ingredient |
| US8293503B2 (en) | 2003-10-03 | 2012-10-23 | Promega Corporation | Vectors for directional cloning |
| CA2603944C (en) * | 2005-04-08 | 2015-06-23 | Bayer Bioscience N.V. | Elite event a2704-12 comprising the integration of the phosphinothricin acetyltransferase (pat) gene into soybeans, and methods and kits for identifying such event in biological samples |
| CN101278053A (zh) | 2005-07-29 | 2008-10-01 | 孟山都技术有限公司 | 利用来自转基因杂交体的分离子来开发新的种质 |
| BRPI0720219A2 (pt) | 2006-12-08 | 2013-12-24 | Univ Iowa State Res Found Inc | Genes de planta envolvidos em absorção e metabolismo de nitrato |
| EP2016821A1 (en) * | 2007-06-13 | 2009-01-21 | Syngeta Participations AG | New hybrid system for Brassica napus |
| JP2011507506A (ja) | 2007-12-21 | 2011-03-10 | ケイヘーネ・エヌ・ブイ | トリコーム特異的なプロモーター |
| US9051580B2 (en) | 2008-05-08 | 2015-06-09 | Monsanto Do Brasil Ltda. | Genes and methods for increasing disease resistance in plants |
| CN102459615B (zh) | 2009-06-08 | 2017-05-03 | 纽海姆有限公司 | 耐旱植物 |
| MA33933B1 (fr) | 2010-01-22 | 2013-01-02 | Bayer Ip Gmbh | Combinaisons de principes actifs acaricides et/ou insecticides |
| WO2011147968A1 (en) | 2010-05-28 | 2011-12-01 | Nunhems B.V. | Plants with increased fruit size |
| BR112012031323A2 (pt) | 2010-06-09 | 2015-09-08 | Bayer Cropscience Nv | métodos e meios para modificação de genoma vegetal em uma sequência de nucleotídeos comumente usada na engenahria genética de plantas |
| AU2011264074B2 (en) | 2010-06-09 | 2015-01-22 | Bayer Cropscience Nv | Methods and means to modify a plant genome at a nucleotide sequence commonly used in plant genome engineering |
| WO2012065944A1 (en) | 2010-11-15 | 2012-05-24 | Bayer Cropscience Ag | N-aryl pyrazole(thio)carboxamides |
| SG190295A1 (en) | 2010-11-29 | 2013-06-28 | Bayer Ip Gmbh | Alpha,beta-unsaturated imines |
| AU2011334989A1 (en) | 2010-12-01 | 2013-06-13 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Use of fluopyram for controlling nematodes in crops and for increasing yield |
| EP2460407A1 (de) | 2010-12-01 | 2012-06-06 | Bayer CropScience AG | Wirkstoffkombinationen umfassend Pyridylethylbenzamide und weitere Wirkstoffe |
| US20130345058A1 (en) | 2011-03-10 | 2013-12-26 | Wolfram Andersch | Use of lipochito-oligosaccharide compounds for safeguarding seed safety of treated seeds |
| CN103491785A (zh) | 2011-03-23 | 2014-01-01 | 拜耳知识产权有限责任公司 | 活性化合物组合 |
| EP2694494A1 (en) | 2011-04-08 | 2014-02-12 | Bayer Intellectual Property GmbH | Fungicide hydroximoyl-tetrazole derivatives |
| DK2699093T3 (en) | 2011-04-22 | 2016-02-01 | Bayer Ip Gmbh | Combination of active compounds comprising a carboximidderivat and a fungicide compound |
| WO2012165961A1 (en) | 2011-05-31 | 2012-12-06 | Keygene N.V. | Pest resistant plants |
| US9241493B2 (en) | 2011-06-14 | 2016-01-26 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Use of an enaminocarbonyl compound in combination with a biological control agent |
| AU2012293636B2 (en) | 2011-08-10 | 2015-12-03 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Active compound combinations comprising specific tetramic acid derivatives |
| EP2748323B1 (en) | 2011-08-22 | 2019-05-01 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Methods and means to modify a plant genome |
| EP2561759A1 (en) | 2011-08-26 | 2013-02-27 | Bayer Cropscience AG | Fluoroalkyl-substituted 2-amidobenzimidazoles and their effect on plant growth |
| BR112014005471A2 (pt) | 2011-09-12 | 2017-03-28 | Bayer Ip Gmbh | compostos de fórmula (i), (v), (vii), composição fungicida, método para o controle dos fungos fitopatogênicos das culturas, utilização dos compostos de fórmula (i) e processo para a produção das composições para o controle de fungos nocivos fitopatogênicos |
| EP2755484A1 (en) | 2011-09-16 | 2014-07-23 | Bayer Intellectual Property GmbH | Use of 5-phenyl- or 5-benzyl-2 isoxazoline-3 carboxylates for improving plant yield |
| JP6138797B2 (ja) | 2011-09-16 | 2017-05-31 | バイエル・インテレクチュアル・プロパティ・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツングＢａｙｅｒ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ ＧｍｂＨ | 植物収量を向上させるためのアシルスルホンアミド類の使用 |
| CA2848625A1 (en) | 2011-09-16 | 2013-03-21 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Use of mefenpyr-diethyl in combination with prothioconazole and tebuconazole for improving plant yield |
| ES2628436T3 (es) | 2011-10-04 | 2017-08-02 | Bayer Intellectual Property Gmbh | ARNi para el control de hongos y oomicetos por la inhibición del gen de sacaropina deshidrogenasa |
| CN104039957A (zh) | 2011-10-19 | 2014-09-10 | 凯金公司 | 用于产生补身醇的方法和组合物 |
| CA2856361A1 (en) | 2011-11-21 | 2013-05-30 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Fungicide n-[(trisubstitutedsilyl)methyl]-carboxamide derivatives |
| KR20140096391A (ko) | 2011-11-30 | 2014-08-05 | 바이엘 인텔렉쳐 프로퍼티 게엠베하 | 살진균성 ｎ-바이시클로알킬 및 ｎ-트리시클로알킬 피라졸-４-(티오)카르복사미드 유도체 |
| AU2012357896B9 (en) | 2011-12-19 | 2016-12-15 | Bayer Cropscience Ag | Use of anthranilic acid diamide derivatives for pest control in transgenic crops |
| TWI558701B (zh) | 2011-12-29 | 2016-11-21 | 拜耳知識產權公司 | 殺真菌之３－［（１，３－噻唑－４－基甲氧基亞胺）（苯基）甲基］－２－經取代之－１，２，４－二唑－５（２ｈ）－酮衍生物 |
| JP6002242B2 (ja) | 2011-12-29 | 2016-10-05 | バイエル・インテレクチュアル・プロパティ・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツングＢａｙｅｒ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ ＧｍｂＨ | 殺菌性３−［（ピリジン−２−イルメトキシイミノ）（フェニル）メチル］−２−置換−１，２，４−オキサジアゾール−５（２ｈ）−オン誘導体 |
| US20150011389A1 (en) | 2012-01-25 | 2015-01-08 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Active Compound Combinations Containing Fluopyram and Biological Control Agent |
| CN104507314B (zh) | 2012-01-25 | 2018-01-09 | 拜耳知识产权有限责任公司 | 含有氟吡菌酰胺芽孢杆菌和生物防治剂的活性化合物结合物 |
| PE20190344A1 (es) | 2012-02-27 | 2019-03-07 | Bayer Ip Gmbh | Combinaciones de compuestos activos |
| WO2013139949A1 (en) | 2012-03-23 | 2013-09-26 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Compositions comprising a strigolactame compound for enhanced plant growth and yield |
| CN104245687B (zh) | 2012-04-12 | 2016-12-14 | 拜尔农科股份公司 | 作为杀真菌剂的n-酰基-2-(环)烷基吡咯烷和哌啶 |
| CN104244717A (zh) | 2012-04-20 | 2014-12-24 | 拜尔农科股份公司 | N-环烷基-n-[(三取代的甲硅烷基苯基)亚甲基]-(硫代)羧酰胺衍生物 |
| CA2865599C (en) | 2012-04-20 | 2020-10-27 | Bayer Cropscience Ag | N-cycloalkyl-n-[(heterocyclylphenyl)methylene]-(thio)carboxamide derivatives |
| EP2662362A1 (en) | 2012-05-09 | 2013-11-13 | Bayer CropScience AG | Pyrazole indanyl carboxamides |
| MX2014013497A (es) | 2012-05-09 | 2015-02-10 | Bayer Cropscience Ag | Pirazol indanil carboxamidas. |
| EP2662364A1 (en) | 2012-05-09 | 2013-11-13 | Bayer CropScience AG | Pyrazole tetrahydronaphthyl carboxamides |
| WO2013167544A1 (en) | 2012-05-09 | 2013-11-14 | Bayer Cropscience Ag | 5-halogenopyrazole indanyl carboxamides |
| EP2662363A1 (en) | 2012-05-09 | 2013-11-13 | Bayer CropScience AG | 5-Halogenopyrazole biphenylcarboxamides |
| EP2662360A1 (en) | 2012-05-09 | 2013-11-13 | Bayer CropScience AG | 5-Halogenopyrazole indanyl carboxamides |
| EP2662370A1 (en) | 2012-05-09 | 2013-11-13 | Bayer CropScience AG | 5-Halogenopyrazole benzofuranyl carboxamides |
| EP2662361A1 (en) | 2012-05-09 | 2013-11-13 | Bayer CropScience AG | Pyrazol indanyl carboxamides |
| AR091104A1 (es) | 2012-05-22 | 2015-01-14 | Bayer Cropscience Ag | Combinaciones de compuestos activos que comprenden un derivado lipo-quitooligosacarido y un compuesto nematicida, insecticida o fungicida |
| EP3360418A1 (en) | 2012-05-30 | 2018-08-15 | Bayer CropScience Aktiengesellschaft | Composition comprising a biological control agent and a fungicide |
| WO2013178662A1 (en) | 2012-05-30 | 2013-12-05 | Bayer Cropscience Ag | Compositions comprising a biological control agent and an insecticide |
| JP6285423B2 (ja) | 2012-05-30 | 2018-02-28 | バイエル・クロップサイエンス・アクチェンゲゼルシャフト | 生物農薬および殺虫剤を含む組成物 |
| WO2013178655A1 (en) | 2012-05-30 | 2013-12-05 | Bayer Cropscience Ag | Composition comprising a biological control agent and a fungicide selected from inhibitors of the lipid membrane synthesis, the melanine biosynthesis, the nucleic acid synthesis or the signal transduction |
| EP2854550B1 (en) | 2012-05-30 | 2018-07-04 | Bayer Cropscience AG | Composition comprising a biological control agent and a fungicide |
| AR091197A1 (es) | 2012-05-30 | 2015-01-21 | Bayer Cropscience Ag | Composicion que comprende un agente de control biologico y un fungicida |
| MX356529B (es) | 2012-05-30 | 2018-06-01 | Bayer Cropscience Ag | Una composicion que comprende un agente de control biologico y un fungicida seleccionado de inhibidores de la mitosis y la division celular y compuestos capaces de tener una accion en multiples sitios. |
| EP2854551A1 (en) | 2012-05-30 | 2015-04-08 | Bayer Cropscience AG | Compositions comprising a biological control agent and a fungicide from the group consisting of inhibitors of the respiratory chain at complex i or ii. |
| CN104602520A (zh) | 2012-07-31 | 2015-05-06 | 拜尔农作物科学股份公司 | 包括杀虫萜烯混合物和杀虫剂的组合物 |
| WO2014043435A1 (en) | 2012-09-14 | 2014-03-20 | Bayer Cropscience Lp | Hppd variants and methods of use |
| EP2719280A1 (en) | 2012-10-11 | 2014-04-16 | Bayer CropScience AG | Use of N-phenylethylpyrazole carboxamide derivatives or salts thereof for resistance management of phytopathogenic fungi |
| CN105357968A (zh) | 2012-10-19 | 2016-02-24 | 拜尔农科股份公司 | 包含羧酰胺衍生物的活性化合物复配物 |
| EA025862B1 (ru) | 2012-10-19 | 2017-02-28 | Байер Кропсайенс Аг | Способ повышения устойчивости к абиотическому стрессу в растениях с использованием производных карбоксамида или тиокарбоксамида |
| PL2908640T3 (pl) | 2012-10-19 | 2020-06-29 | Bayer Cropscience Ag | Sposób stymulowania wzrostu roślin przy pomocy pochodnych karboksamidu |
| US9668480B2 (en) | 2012-10-19 | 2017-06-06 | Bayer Cropscience Ag | Method for treating plants against fungi resistant to fungicides using carboxamide or thiocarboxamide derivatives |
| EP2735231A1 (en) | 2012-11-23 | 2014-05-28 | Bayer CropScience AG | Active compound combinations |
| EP2925137A1 (en) | 2012-11-30 | 2015-10-07 | Bayer CropScience AG | Binary fungicidal or pesticidal mixture |
| BR112015012519A2 (pt) | 2012-11-30 | 2017-07-11 | Bayer Cropscience Ag | misturas ternárias fungicidas e pesticidas |
| CN104994736B (zh) | 2012-11-30 | 2018-02-06 | 拜耳作物科学股份公司 | 二元农药和杀真菌混合物 |
| CN104981162B (zh) | 2012-11-30 | 2017-11-28 | 拜耳作物科学股份公司 | 三元杀真菌混合物 |
| CA3082683A1 (en) | 2012-11-30 | 2014-06-05 | Bayer Cropscience Ag | Binary fungicidal mixtures |
| US9867377B2 (en) | 2012-12-03 | 2018-01-16 | Bayer Cropscience Ag | Composition comprising a biological control agent and an insecticide |
| US20150289518A1 (en) | 2012-12-03 | 2015-10-15 | Bayer Cropscience Ag | Composition comprising a biological control agent and an insecticide |
| EP2925141A2 (en) | 2012-12-03 | 2015-10-07 | Bayer CropScience AG | Composition comprising a biological control agent and a fungicide |
| CA2893083A1 (en) | 2012-12-03 | 2014-06-12 | Bayer Cropscience Ag | Composition comprising a biological control agent and an insecticide |
| EP2925146A2 (en) | 2012-12-03 | 2015-10-07 | Bayer CropScience AG | Composition comprising a biological control agent and a fungicide |
| WO2014086753A2 (en) | 2012-12-03 | 2014-06-12 | Bayer Cropscience Ag | Composition comprising biological control agents |
| BR112015012702A2 (pt) | 2012-12-03 | 2017-07-11 | Bayer Cropscience Ag | composição que compreende um agente de controle biológico e um fungicida |
| EP2925145A2 (en) | 2012-12-03 | 2015-10-07 | Bayer CropScience AG | Composition comprising biological control agents |
| WO2014090765A1 (en) | 2012-12-12 | 2014-06-19 | Bayer Cropscience Ag | Use of 1-[2-fluoro-4-methyl-5-(2,2,2-trifluoroethylsulfinyl)phenyl]-5-amino-3-trifluoromethyl)-1 h-1,2,4 tfia zole for controlling nematodes in nematode-resistant crops |
| AR093996A1 (es) | 2012-12-18 | 2015-07-01 | Bayer Cropscience Ag | Combinaciones bactericidas y fungicidas binarias |
| BR112015014307A2 (pt) | 2012-12-19 | 2017-07-11 | Bayer Cropscience Ag | difluorometil-nicotínico- tetrahidronaftil carboxamidas |
| US20150366199A1 (en) | 2013-02-11 | 2015-12-24 | Bayer Cropscience Lp | Compositions comprising gougerotin and an insecticide |
| BR112015018676A2 (pt) | 2013-02-11 | 2017-07-18 | Bayer Cropscience Lp | composições que compreendem gougerotina e um agente de controle biológico |
| WO2014124368A1 (en) | 2013-02-11 | 2014-08-14 | Bayer Cropscience Lp | Compositions comprising gougerotin and a fungicide |
| UA122046C2 (uk) | 2013-03-07 | 2020-09-10 | Атенікс Корп. | Рекомбінантний поліпептид із інсектицидною активністю |
| EP2986117A1 (en) | 2013-04-19 | 2016-02-24 | Bayer CropScience Aktiengesellschaft | Binary insecticidal or pesticidal mixture |
| WO2014170387A1 (en) * | 2013-04-19 | 2014-10-23 | Bayer Cropscience Nv | Hybrid brassica plants and methods for producing same |
| MX358633B (es) | 2013-04-19 | 2018-08-28 | Bayer Cropscience Ag | Metodo de uso mejorado del potencial de produccion de plantas transgenicas. |
| WO2014177514A1 (en) | 2013-04-30 | 2014-11-06 | Bayer Cropscience Ag | Nematicidal n-substituted phenethylcarboxamides |
| TW201507722A (zh) | 2013-04-30 | 2015-03-01 | Bayer Cropscience Ag | 做為殺線蟲劑及殺體內寄生蟲劑的ｎ－（２－鹵素－２－苯乙基）－羧醯胺類 |
| US9770022B2 (en) | 2013-06-26 | 2017-09-26 | Bayer Cropscience Ag | N-cycloalkyl-N-[(bicyclylphenyl)methylene]-(thio)carboxamide derivatives |
| EP3077378B1 (en) | 2013-12-05 | 2018-11-07 | Bayer CropScience Aktiengesellschaft | N-cyclopropyl-n-{[2-(1-substitutedcyclopropyl)phenyl]methylene}-(thio)carboxamide derivatives |
| CN105873907B (zh) | 2013-12-05 | 2019-03-12 | 拜耳作物科学股份公司 | N-环烷基-n-{[2-(1-取代的环烷基)苯基]亚甲基}-(硫代)甲酰胺衍生物 |
| EP2885970A1 (en) | 2013-12-21 | 2015-06-24 | Bayer CropScience AG | Fungicide compositions comprising compound I, at least one succinate dehydrogenase (SDH) inhibitor and at least one triazole fungicide |
| BR112016020889B1 (pt) | 2014-03-11 | 2022-10-04 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Molécula de ácido nucleico recombinante, célula hospedeira bacteriana, proteína hppd recombinante, uso do ácido nucleico recombinante e produto de base |
| WO2015160620A1 (en) | 2014-04-16 | 2015-10-22 | Bayer Cropscience Lp | Compositions comprising ningnanmycin and an insecticide |
| WO2015160618A1 (en) | 2014-04-16 | 2015-10-22 | Bayer Cropscience Lp | Compositions comprising ningnanmycin and a biological control agent |
| WO2015160619A1 (en) | 2014-04-16 | 2015-10-22 | Bayer Cropscience Lp | Compositions comprising ningnanmycin and a fungicide |
| EP3283476B1 (en) | 2015-04-13 | 2019-08-14 | Bayer Cropscience AG | N-cycloalkyl-n-(biheterocyclyethylene)-(thio)carboxamide derivatives |
| EP3097782A1 (en) | 2015-05-29 | 2016-11-30 | Bayer CropScience Aktiengesellschaft | Methods for controlling phytopathogenic nematodes by combination of fluopyram and biological control agents |
| WO2017039452A1 (en) | 2015-09-04 | 2017-03-09 | Keygene N.V. | Diplospory gene |
| MX2018003044A (es) | 2015-09-11 | 2018-04-11 | Bayer Cropscience Ag | Variantes de hppd y metodos de uso. |
| WO2017049379A1 (en) | 2015-09-22 | 2017-03-30 | Bayer Cropscience Inc. | Method for enhancing crop performance in brassica |
| AU2017230275B2 (en) | 2016-03-08 | 2021-02-18 | Bayer Cropscience Aktiengesellschaft | Herbicidal compositions comprising carfentrazone-ethyl and bromoxynil |
| BR112019001764A2 (pt) | 2016-07-29 | 2019-05-07 | Bayer Cropscience Ag | combinações de compostos ativos e métodos para proteção de material de propagação de plantas |
| EP3544991A1 (en) | 2016-11-23 | 2019-10-02 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Axmi669 and axmi991 toxin genes and methods for their use |
| US20190322631A1 (en) | 2016-12-19 | 2019-10-24 | Basf Se | Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi |
| US11286498B2 (en) | 2017-01-18 | 2022-03-29 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Use of BP005 for the control of plant pathogens |
| UY37571A (es) | 2017-01-18 | 2018-08-31 | Bayer Cropscience Lp | Gen de toxina bp005 y procedimientos para su uso |
| EP3585773B1 (en) | 2017-02-21 | 2021-04-07 | Basf Se | Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi |
| US11708565B2 (en) | 2017-03-07 | 2023-07-25 | BASF Agricultural Solutions Seesi US LLC | HPPD variants and methods of use |
| WO2018184970A1 (en) | 2017-04-07 | 2018-10-11 | Basf Se | Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi |
| WO2018188962A1 (en) | 2017-04-11 | 2018-10-18 | Basf Se | Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi |
| MX2019012543A (es) | 2017-04-21 | 2019-12-02 | Bayer Cropscience Lp | Metodo para mejorar la seguridad de los cultivos. |
| CN110621669A (zh) | 2017-05-04 | 2019-12-27 | 巴斯夫欧洲公司 | 防除植物病原性真菌的取代5-卤代烷基-5-羟基异噁唑类 |
| WO2018202491A1 (en) | 2017-05-04 | 2018-11-08 | Basf Se | Substituted trifluoromethyloxadiazoles for combating phytopathogenic fungi |
| WO2018219797A1 (en) | 2017-06-02 | 2018-12-06 | Basf Se | Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi |
| EP3642187A1 (en) | 2017-06-19 | 2020-04-29 | Basf Se | 2-[[5-(trifluoromethyl)-1,2,4-oxadiazol-3-yl]aryloxy](thio)acetamides for combating phytopathogenic fungi |
| US20210127681A1 (en) | 2017-07-27 | 2021-05-06 | Basf Se | Use of herbicidal compositions based on l-glufosinate in tolerant field crops |
| WO2019025250A1 (en) | 2017-08-04 | 2019-02-07 | Basf Se | SUBSTITUTED TRIFLUOROMETHYLOXADIAZOLES FOR COMBATING PHYTOPATHOGENIC FUNGI |
| WO2019038042A1 (en) | 2017-08-21 | 2019-02-28 | Basf Se | SUBSTITUTED TRIFLUOROMETHYLOXADIAZOLES FOR THE CONTROL OF PHYTOPATHOGENIC FUNGI |
| US11076596B2 (en) | 2017-09-18 | 2021-08-03 | Basf Se | Substituted trifluoromethyloxadiazoles for combating phytopathogenic fungi |
| WO2019068811A1 (en) | 2017-10-06 | 2019-04-11 | Bayer Aktiengesellschaft | COMPOSITIONS COMPRISING FLUOPYRAM AND TIOXAZAFENE |
| BR112020008096A2 (pt) | 2017-10-24 | 2020-11-03 | Basf Se | método para conferir tolerância a um herbicida e planta de soja transgênica |
| BR112020008092A2 (pt) | 2017-10-24 | 2020-09-15 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | método para conferir tolerância a um herbicida e planta de soja transgênica |
| EP3713936B1 (en) | 2017-11-23 | 2021-10-20 | Basf Se | Substituted trifluoromethyloxadiazoles for combating phytopathogenic fungi |
| WO2019121143A1 (en) | 2017-12-20 | 2019-06-27 | Basf Se | Substituted cyclopropyl derivatives |
| WO2019137995A1 (en) | 2018-01-11 | 2019-07-18 | Basf Se | Novel pyridazine compounds for controlling invertebrate pests |
| CN111669972A (zh) | 2018-01-29 | 2020-09-15 | 巴斯夫农业公司 | 新农业化学制剂 |
| KR20200118091A (ko) | 2018-02-07 | 2020-10-14 | 바스프 에스이 | 신규의 피리딘 카르복스아미드 |
| WO2019154665A1 (en) | 2018-02-07 | 2019-08-15 | Basf Se | New pyridine carboxamides |
| CN111801014B (zh) | 2018-03-01 | 2022-05-27 | 巴斯夫农业公司 | 氯氟醚菌唑的杀真菌组合物 |
| WO2019219464A1 (en) | 2018-05-15 | 2019-11-21 | Basf Se | Substituted trifluoromethyloxadiazoles for combating phytopathogenic fungi |
| WO2019224092A1 (en) | 2018-05-22 | 2019-11-28 | Basf Se | Pesticidally active c15-derivatives of ginkgolides |
| EP3802521A1 (de) | 2018-06-04 | 2021-04-14 | Bayer Aktiengesellschaft | Herbizid wirksame bizyklische benzoylpyrazole |
| CN112689457A (zh) | 2018-07-26 | 2021-04-20 | 拜耳公司 | 琥珀酸脱氢酶抑制剂氟吡菌酰胺用于防治十字花科物种中由立枯丝核菌、镰刀菌属种和腐霉菌属种引起的根腐病复合症和/或苗期病害复合症的用途 |
| EP3613736A1 (en) | 2018-08-22 | 2020-02-26 | Basf Se | Substituted glutarimide derivatives |
| EP3628158A1 (en) | 2018-09-28 | 2020-04-01 | Basf Se | Pesticidal mixture comprising a mesoionic compound and a biopesticide |
| US20210347777A1 (en) | 2018-10-23 | 2021-11-11 | Basf Se | Tricyclic pesticidal compounds |
| EP3643705A1 (en) | 2018-10-24 | 2020-04-29 | Basf Se | Pesticidal compounds |
| EP3670501A1 (en) | 2018-12-17 | 2020-06-24 | Basf Se | Substituted [1,2,4]triazole compounds as fungicides |
| SI3908584T1 (sl) | 2019-01-11 | 2023-07-31 | Basf Se | Kristalne oblike 1-(1,2-dimetilpropil)-n-etil-5-metil-n-piridazin-4-il -pirazol-4-karboksamida |
| EP3696177A1 (en) | 2019-02-12 | 2020-08-19 | Basf Se | Heterocyclic compounds for the control of invertebrate pests |
| CA3139524A1 (en) | 2019-05-10 | 2020-11-19 | Bayer Cropscience Lp | Active compound combinations |
| EP3769623A1 (en) | 2019-07-22 | 2021-01-27 | Basf Se | Mesoionic imidazolium compounds and derivatives for combating animal pests |
| EP3975718A1 (en) | 2019-05-29 | 2022-04-06 | Basf Se | Mesoionic imidazolium compounds and derivatives for combating animal pests |
| WO2020239984A1 (en) | 2019-05-29 | 2020-12-03 | Keygene N.V. | Gene for parthenogenesis |
| WO2020244969A1 (en) | 2019-06-06 | 2020-12-10 | Basf Se | Pyridine derivatives and their use as fungicides |
| BR112021021028A2 (pt) | 2019-06-06 | 2021-12-14 | Basf Se | Uso dos compostos de fórmula i, compostos da fórmula i, composição e método para combater fungos fitopatogênicos |
| WO2020244970A1 (en) | 2019-06-06 | 2020-12-10 | Basf Se | New carbocyclic pyridine carboxamides |
| EP3766879A1 (en) | 2019-07-19 | 2021-01-20 | Basf Se | Pesticidal pyrazole derivatives |
| KR20220035939A (ko) | 2019-07-22 | 2022-03-22 | 바이엘 악티엔게젤샤프트 | 살충제로서의 5-아미노-치환된 피라졸 및 트리아졸 |
| CA3148209A1 (en) | 2019-07-23 | 2021-01-28 | Bayer Aktiengesellschaft | Novel heteroaryl-triazole compounds as pesticides |
| BR112022000915A2 (pt) | 2019-07-23 | 2022-05-17 | Bayer Ag | Compostos de heteroaril-triazol como pesticidas |
| WO2021022069A1 (en) | 2019-08-01 | 2021-02-04 | Bayer Cropscience Lp | Method of improving cold stress tolerance and crop safety |
| EP3701796A1 (en) | 2019-08-08 | 2020-09-02 | Bayer AG | Active compound combinations |
| US20220403410A1 (en) | 2019-09-26 | 2022-12-22 | Bayer Aktiengesellschaft | Rnai-mediated pest control |
| JP2022550564A (ja) | 2019-10-02 | 2022-12-02 | バイエル・アクチエンゲゼルシヤフト | 脂肪酸を含んでいる活性化合物組み合わせ |
| WO2021063735A1 (en) | 2019-10-02 | 2021-04-08 | Basf Se | New bicyclic pyridine derivatives |
| WO2021063736A1 (en) | 2019-10-02 | 2021-04-08 | Basf Se | Bicyclic pyridine derivatives |
| EP4041721B1 (en) | 2019-10-09 | 2024-03-06 | Bayer Aktiengesellschaft | Novel heteroaryl-triazole compounds as pesticides |
| KR20220081359A (ko) | 2019-10-09 | 2022-06-15 | 바이엘 악티엔게젤샤프트 | 살충제로서의 신규 헤테로아릴-트리아졸 화합물 |
| JP2023501978A (ja) | 2019-11-07 | 2023-01-20 | バイエル・アクチエンゲゼルシヤフト | 動物害虫駆除用の置換スルホニルアミド |
| WO2021097162A1 (en) | 2019-11-13 | 2021-05-20 | Bayer Cropscience Lp | Beneficial combinations with paenibacillus |
| TW202134226A (zh) | 2019-11-18 | 2021-09-16 | 德商拜耳廠股份有限公司 | 作為殺蟲劑之新穎雜芳基-三唑化合物 |
| WO2021099271A1 (en) | 2019-11-18 | 2021-05-27 | Bayer Aktiengesellschaft | Active compound combinations comprising fatty acids |
| TW202136248A (zh) | 2019-11-25 | 2021-10-01 | 德商拜耳廠股份有限公司 | 作為殺蟲劑之新穎雜芳基-三唑化合物 |
| UY39058A (es) | 2020-01-31 | 2021-08-31 | Pairwise Plants Services Inc | Suppresión de la respuesta de evasión a la sombra en plantas |
| MX2022010059A (es) | 2020-02-18 | 2022-08-25 | Bayer Ag | Nuevos compuestos de heteroaril-triazol como pesticidas. |
| EP3708565A1 (en) | 2020-03-04 | 2020-09-16 | Bayer AG | Pyrimidinyloxyphenylamidines and the use thereof as fungicides |
| CA3180157A1 (en) | 2020-04-16 | 2021-10-21 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods for controlling meristem size for crop improvement |
| WO2021209490A1 (en) | 2020-04-16 | 2021-10-21 | Bayer Aktiengesellschaft | Cyclaminephenylaminoquinolines as fungicides |
| BR112022021264A2 (pt) | 2020-04-21 | 2023-02-14 | Bayer Ag | Derivados heterocíclicos fundidos substituídos por 2-(het)aril como pesticidas |
| WO2021219513A1 (en) | 2020-04-28 | 2021-11-04 | Basf Se | Pesticidal compounds |
| EP3903583A1 (en) | 2020-04-28 | 2021-11-03 | Basf Se | Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors iii |
| EP3903581A1 (en) | 2020-04-28 | 2021-11-03 | Basf Se | Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors i |
| EP3903582A1 (en) | 2020-04-28 | 2021-11-03 | Basf Se | Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors ii |
| EP3903584A1 (en) | 2020-04-28 | 2021-11-03 | Basf Se | Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors iv |
| CN115915941A (zh) | 2020-05-06 | 2023-04-04 | 拜耳公司 | 作为杀真菌化合物的吡啶（硫代）酰胺 |
| TW202208347A (zh) | 2020-05-06 | 2022-03-01 | 德商拜耳廠股份有限公司 | 作為殺蟲劑之新穎雜芳基三唑化合物 |
| BR112022023012A2 (pt) | 2020-05-12 | 2022-12-20 | Bayer Ag | (tio)amidas de triazina e pirimidina como compostos fungicidas |
| EP3909950A1 (en) | 2020-05-13 | 2021-11-17 | Basf Se | Heterocyclic compounds for the control of invertebrate pests |
| JP2023529294A (ja) | 2020-05-19 | 2023-07-10 | バイエル、アクチエンゲゼルシャフト、（ディビジョン、クロップサイエンス） | 殺真菌性化合物としてのアザ二環式（チオ）アミド |
| BR112022024489A2 (pt) | 2020-06-02 | 2023-01-31 | Pairwise Plants Services Inc | Métodos para o controle do tamanho do meristema para melhora da cultura agrícola |
| EP4161906A1 (en) | 2020-06-04 | 2023-04-12 | Bayer Aktiengesellschaft | Heterocyclyl pyrimidines and triazines as novel fungicides |
| WO2021249800A1 (en) | 2020-06-10 | 2021-12-16 | Basf Se | Substituted [1,2,4]triazole compounds as fungicides |
| JP2023529475A (ja) | 2020-06-10 | 2023-07-10 | バイエル、アクチエンゲゼルシャフト | 新規殺菌剤としてのアザビシクリル置換複素環 |
| EP3945089A1 (en) | 2020-07-31 | 2022-02-02 | Basf Se | Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors v |
| MX2022015896A (es) | 2020-06-17 | 2023-02-22 | Pairwise Plants Services Inc | Métodos para el control del tamaño del meristemo para la mejora de cultivos. |
| CA3187291A1 (en) | 2020-06-18 | 2021-12-23 | Bayer Aktiengesellschaft | Composition for use in agriculture |
| BR112022025941A2 (pt) | 2020-06-18 | 2023-01-10 | Bayer Ag | Derivados de 3-(piridazin-4-il)-5,6-di-hidro-4h-1,2,4-oxadiazina como fungicidas para proteção de cultura |
| BR112022025710A2 (pt) | 2020-06-19 | 2023-03-07 | Bayer Ag | 1,3,4-oxadiazol pirimidinas e 1,3,4-oxadiazol piridinas como fungicidas |
| UY39276A (es) | 2020-06-19 | 2022-01-31 | Bayer Ag | Uso de compuestos de 1,3,4–oxadiazol–2–ilpirimidina para controlar microorganismos fitopatógenos, métodos de uso y composiciones. |
| WO2021255091A1 (en) | 2020-06-19 | 2021-12-23 | Bayer Aktiengesellschaft | 1,3,4-oxadiazoles and their derivatives as fungicides |
| UY39275A (es) | 2020-06-19 | 2022-01-31 | Bayer Ag | 1,3,4-oxadiazol pirimidinas como fungicidas, procesos e intermediarios para su preparación, métodos de uso y usos de los mismos |
| EP3929189A1 (en) | 2020-06-25 | 2021-12-29 | Bayer Animal Health GmbH | Novel heteroaryl-substituted pyrazine derivatives as pesticides |
| BR112022026904A2 (pt) | 2020-07-02 | 2023-01-24 | Bayer Ag | Derivados de heterocicleno como agentes de controle de pragas |
| EP3939961A1 (en) | 2020-07-16 | 2022-01-19 | Basf Se | Strobilurin type compounds and their use for combating phytopathogenic fungi |
| WO2022017836A1 (en) | 2020-07-20 | 2022-01-27 | BASF Agro B.V. | Fungicidal compositions comprising (r)-2-[4-(4-chlorophenoxy)-2-(trifluoromethyl)phenyl]-1- (1,2,4-triazol-1-yl)propan-2-ol |
| EP3970494A1 (en) | 2020-09-21 | 2022-03-23 | Basf Se | Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors viii |
| WO2022033991A1 (de) | 2020-08-13 | 2022-02-17 | Bayer Aktiengesellschaft | 5-amino substituierte triazole als schädlingsbekämpfungsmittel |
| WO2022053453A1 (de) | 2020-09-09 | 2022-03-17 | Bayer Aktiengesellschaft | Azolcarboxamide als schädlingsbekämpfungsmittel |
| WO2022058327A1 (en) | 2020-09-15 | 2022-03-24 | Bayer Aktiengesellschaft | Substituted ureas and derivatives as new antifungal agents |
| EP3974414A1 (de) | 2020-09-25 | 2022-03-30 | Bayer AG | 5-amino substituierte pyrazole und triazole als schädlingsbekämpfungsmittel |
| IL301700A (en) | 2020-10-13 | 2023-05-01 | Keygene Nv | Adapted promoter of parthenogenesis gene |
| US20230397607A1 (en) | 2020-10-27 | 2023-12-14 | BASF Agro B.V. | Compositions comprising mefentrifluconazole |
| WO2022090069A1 (en) | 2020-11-02 | 2022-05-05 | Basf Se | Compositions comprising mefenpyr-diethyl |
| WO2022090071A1 (en) | 2020-11-02 | 2022-05-05 | Basf Se | Use of mefenpyr-diethyl for controlling phytopathogenic fungi |
| WO2022106304A1 (en) | 2020-11-23 | 2022-05-27 | BASF Agro B.V. | Compositions comprising mefentrifluconazole |
| AU2021403544A1 (en) | 2020-12-14 | 2023-06-29 | Basf Se | Sulfoximine pesticides |
| EP3915971A1 (en) | 2020-12-16 | 2021-12-01 | Bayer Aktiengesellschaft | Phenyl-s(o)n-phenylamidines and the use thereof as fungicides |
| WO2022129196A1 (en) | 2020-12-18 | 2022-06-23 | Bayer Aktiengesellschaft | Heterobicycle substituted 1,2,4-oxadiazoles as fungicides |
| KR20230121792A (ko) | 2020-12-18 | 2023-08-21 | 바이엘 악티엔게젤샤프트 | 작물에서 저항성 식물병원성 진균을 방제하기 위한dhodh 억제제의 용도 |
| WO2022129190A1 (en) | 2020-12-18 | 2022-06-23 | Bayer Aktiengesellschaft | (hetero)aryl substituted 1,2,4-oxadiazoles as fungicides |
| WO2022129188A1 (en) | 2020-12-18 | 2022-06-23 | Bayer Aktiengesellschaft | 1,2,4-oxadiazol-3-yl pyrimidines as fungicides |
| WO2022140762A1 (en) | 2020-12-21 | 2022-06-30 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Brassica napus plants comprising an improved fertility restorer |
| EP4036083A1 (de) | 2021-02-02 | 2022-08-03 | Bayer Aktiengesellschaft | 5-oxy substituierte hetereozyklen, als schädlingsbekämpfungsmittel |
| WO2022173885A1 (en) | 2021-02-11 | 2022-08-18 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for modifying cytokinin oxidase levels in plants |
| EP4043444A1 (en) | 2021-02-11 | 2022-08-17 | Basf Se | Substituted isoxazoline derivatives |
| US20220380792A1 (en) | 2021-02-25 | 2022-12-01 | Pairwise Plants Services, Inc | Methods and compositions for modifying root architecture in plants |
| BR112023019788A2 (pt) | 2021-03-30 | 2023-11-07 | Bayer Ag | 3-(hetero)aril-5-clorodifluorometil-1,2,4-oxadiazol como fungicida |
| BR112023019400A2 (pt) | 2021-03-30 | 2023-12-05 | Bayer Ag | 3-(hetero)aril-5-clorodifluorometil-1,2,4-oxadiazol como fungicida |
| EP4333616A1 (en) | 2021-05-03 | 2024-03-13 | Basf Se | Additives for enhancing the pesticidal effectiveness of pesticidal microorganisms |
| CN117597344A (zh) | 2021-05-06 | 2024-02-23 | 拜耳公司 | 烷基酰胺取代的环状咪唑及其作为杀虫剂的用途 |
| JP2024517305A (ja) | 2021-05-12 | 2024-04-19 | バイエル・アクチエンゲゼルシヤフト | 有害生物防除剤としての２－（ヘテロ）アリール置換縮合複素環誘導体 |
| EP4091451A1 (en) | 2021-05-17 | 2022-11-23 | BASF Agro B.V. | Compositions comprising mefentrifluconazole |
| BR112023023989A2 (pt) | 2021-05-18 | 2024-01-30 | Basf Se | Compostos, composição, método para combater fungos fitopatogênicos e semente |
| CN117355519A (zh) | 2021-05-18 | 2024-01-05 | 巴斯夫欧洲公司 | 用作杀真菌剂的新型取代吡啶类 |
| WO2022243107A1 (en) | 2021-05-18 | 2022-11-24 | Basf Se | New substituted pyridines as fungicides |
| CA3223995A1 (en) | 2021-06-17 | 2022-12-22 | Pairwise Plants Services, Inc. | Modification of growth regulating factor family transcription factors in soybean |
| UY39827A (es) | 2021-06-24 | 2023-01-31 | Pairwise Plants Services Inc | Modificación de genes de ubiquitina ligasa e3 hect para mejorar los rasgos de rendimiento |
| WO2023278651A1 (en) | 2021-07-01 | 2023-01-05 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for enhancing root system development |
| EP4119547A1 (en) | 2021-07-12 | 2023-01-18 | Basf Se | Triazole compounds for the control of invertebrate pests |
| AU2022321882A1 (en) | 2021-08-02 | 2024-02-15 | Basf Se | (3-pirydyl)-quinazoline |
| AU2022323668A1 (en) | 2021-08-02 | 2024-02-15 | Basf Se | (3-quinolyl)-quinazoline |
| US20230078990A1 (en) | 2021-08-12 | 2023-03-16 | Pairwise Plants Services, Inc. | Modification of brassinosteroid receptor genes to improve yield traits |
| WO2023017120A1 (en) | 2021-08-13 | 2023-02-16 | Bayer Aktiengesellschaft | Active compound combinations and fungicide compositions comprising those |
| AR126798A1 (es) | 2021-08-17 | 2023-11-15 | Pairwise Plants Services Inc | Métodos y composiciones para modificar genes de histidina quinasa receptores de citoquinina en plantas |
| EP4140986A1 (en) | 2021-08-23 | 2023-03-01 | Basf Se | Pyrazine compounds for the control of invertebrate pests |
| KR20240051198A (ko) | 2021-08-25 | 2024-04-19 | 바이엘 악티엔게젤샤프트 | 농약제로서 신규 피라지닐-트리아졸 화합물 |
| EP4140995A1 (en) | 2021-08-27 | 2023-03-01 | Basf Se | Pyrazine compounds for the control of invertebrate pests |
| US20230074699A1 (en) | 2021-08-30 | 2023-03-09 | Pairwise Plants Services, Inc. | Modification of ubiquitin binding peptidase genes in plants for yield trait improvement |
| AR126938A1 (es) | 2021-09-02 | 2023-11-29 | Pairwise Plants Services Inc | Métodos y composiciones para mejorar la arquitectura de las plantas y los rasgos de rendimiento |
| EP4144739A1 (de) | 2021-09-02 | 2023-03-08 | Bayer Aktiengesellschaft | Anellierte pyrazole als schädlingsbekämpfungsmittel |
| EP4151631A1 (en) | 2021-09-20 | 2023-03-22 | Basf Se | Heterocyclic compounds for the control of invertebrate pests |
| CA3232804A1 (en) | 2021-09-21 | 2023-03-30 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for reducing pod shatter in canola |
| US20230108968A1 (en) | 2021-10-04 | 2023-04-06 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods for improving floret fertility and seed yield |
| US20230116819A1 (en) | 2021-10-07 | 2023-04-13 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods for improving floret fertility and seed yield |
| WO2023072671A1 (en) | 2021-10-28 | 2023-05-04 | Basf Se | Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors ix |
| WO2023072670A1 (en) | 2021-10-28 | 2023-05-04 | Basf Se | Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors x |
| WO2023078915A1 (en) | 2021-11-03 | 2023-05-11 | Bayer Aktiengesellschaft | Bis(hetero)aryl thioether (thio)amides as fungicidal compounds |
| WO2023099445A1 (en) | 2021-11-30 | 2023-06-08 | Bayer Aktiengesellschaft | Bis(hetero)aryl thioether oxadiazines as fungicidal compounds |
| EP4194453A1 (en) | 2021-12-08 | 2023-06-14 | Basf Se | Pyrazine compounds for the control of invertebrate pests |
| AR127904A1 (es) | 2021-12-09 | 2024-03-06 | Pairwise Plants Services Inc | Métodos para mejorar la fertilidad de floretes y el rendimiento de semillas |
| EP4198033A1 (en) | 2021-12-14 | 2023-06-21 | Basf Se | Heterocyclic compounds for the control of invertebrate pests |
| EP4198023A1 (en) | 2021-12-16 | 2023-06-21 | Basf Se | Pesticidally active thiosemicarbazone compounds |
| AR128372A1 (es) | 2022-01-31 | 2024-04-24 | Pairwise Plants Services Inc | Supresión de la respuesta de evitación de la sombra en las plantas |
| WO2023148028A1 (en) | 2022-02-01 | 2023-08-10 | Globachem Nv | Methods and compositions for controlling pests |
| WO2023148033A1 (en) | 2022-02-01 | 2023-08-10 | Globachem Nv | Methods and compositions for controlling pests in oilseed rape |
| WO2023156402A1 (en) | 2022-02-17 | 2023-08-24 | Basf Se | Pesticidally active thiosemicarbazone compounds |
| TW202342744A (zh) | 2022-03-01 | 2023-11-01 | 美商巴斯夫農業解決方案種子美國有限責任公司 | Ｃａｓ１２ａ切口酶 |
| EP4238971A1 (en) | 2022-03-02 | 2023-09-06 | Basf Se | Substituted isoxazoline derivatives |
| WO2023168217A1 (en) | 2022-03-02 | 2023-09-07 | Pairwise Plants Services, Inc. | Modification of brassinosteroid receptor genes to improve yield traits |
| WO2023192838A1 (en) | 2022-03-31 | 2023-10-05 | Pairwise Plants Services, Inc. | Early flowering rosaceae plants with improved characteristics |
| WO2023196886A1 (en) | 2022-04-07 | 2023-10-12 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for improving resistance to fusarium head blight |
| US20230383305A1 (en) | 2022-04-21 | 2023-11-30 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for improving yield traits |
| US20230348922A1 (en) | 2022-05-02 | 2023-11-02 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for enhancing yield and disease resistance |
| WO2023213670A1 (en) | 2022-05-03 | 2023-11-09 | Bayer Aktiengesellschaft | Crystalline forms of (5s)-3-[3-(3-chloro-2-fluorophenoxy)-6-methylpyridazin-4-yl]-5-(2-chloro-4-methylbenzyl)-5,6-dihydro-4h-1,2,4-oxadiazine |
| WO2023213626A1 (en) | 2022-05-03 | 2023-11-09 | Bayer Aktiengesellschaft | Use of (5s)-3-[3-(3-chloro-2-fluorophenoxy)-6-methylpyridazin-4-yl]-5-(2-chloro-4-methylbenzyl)-5,6-dihydro-4h-1,2,4-oxadiazine for controlling unwanted microorganisms |
| WO2023215809A1 (en) | 2022-05-05 | 2023-11-09 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for modifying root architecture and/or improving plant yield traits |
| US20230416771A1 (en) | 2022-06-27 | 2023-12-28 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for modifying shade avoidance in plants |
| US20240002873A1 (en) | 2022-06-29 | 2024-01-04 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for controlling meristem size for crop improvement |
| US20240000031A1 (en) | 2022-06-29 | 2024-01-04 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for controlling meristem size for crop improvement |
| WO2024028243A1 (en) | 2022-08-02 | 2024-02-08 | Basf Se | Pyrazolo pesticidal compounds |
| US20240043857A1 (en) | 2022-08-04 | 2024-02-08 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for improving yield traits |
| WO2024036240A1 (en) | 2022-08-11 | 2024-02-15 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for controlling meristem size for crop improvement |
| WO2024054880A1 (en) | 2022-09-08 | 2024-03-14 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for improving yield characteristics in plants |
| EP4342885A1 (en) | 2022-09-20 | 2024-03-27 | Basf Se | N-(3-(aminomethyl)-phenyl)-5-(4-phenyl)-5-(trifluoromethyl)-4,5-dihydroisoxazol-3-amine derivatives and similar compounds as pesticides |
| WO2024068518A1 (en) | 2022-09-28 | 2024-04-04 | Bayer Aktiengesellschaft | 3-heteroaryl-5-chlorodifluoromethyl-1,2,4-oxadiazole as fungicide |
| WO2024068519A1 (en) | 2022-09-28 | 2024-04-04 | Bayer Aktiengesellschaft | 3-(hetero)aryl-5-chlorodifluoromethyl-1,2,4-oxadiazole as fungicide |
| WO2024068517A1 (en) | 2022-09-28 | 2024-04-04 | Bayer Aktiengesellschaft | 3-(hetero)aryl-5-chlorodifluoromethyl-1,2,4-oxadiazole as fungicide |
| WO2024068520A1 (en) | 2022-09-28 | 2024-04-04 | Bayer Aktiengesellschaft | 3-(hetero)aryl-5-chlorodifluoromethyl-1,2,4-oxadiazole as fungicide |
| EP4295688A1 (en) | 2022-09-28 | 2023-12-27 | Bayer Aktiengesellschaft | Active compound combination |
| EP4361126A1 (en) | 2022-10-24 | 2024-05-01 | Basf Se | Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors xv |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0290799B9 (en) | 1983-01-13 | 2004-09-01 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Transgenic dicotyledonous plant cells and plants |
| DE3786898T2 (de) | 1986-05-29 | 1994-02-10 | Calgene Inc | TRANSFORMATION UND EXPRESSION EINES FREMDEN GENS IN -i(BRASSICA) SPEZIES. |
| GB8810120D0 (en) | 1988-04-28 | 1988-06-02 | Plant Genetic Systems Nv | Transgenic nuclear male sterile plants |
| DE69034268D1 (de) | 1989-08-10 | 2011-03-03 | Bayer Bioscience Nv | Pflanzen mit modifizierten Blüten |
| US5689041A (en) * | 1989-08-10 | 1997-11-18 | Plant Gentic Systems N.V. | Plants modified with barstar for fertility restoration |
| WO1996026283A1 (en) | 1995-02-21 | 1996-08-29 | Plant Genetic Systems, N.V. | Method to obtain male-sterile plants |
| EP0757102A1 (en) | 1995-08-04 | 1997-02-05 | Plant Genetic Systems N.V. | Genetic transformation using a PARP inhibitor |
| US6506963B1 (en) * | 1999-12-08 | 2003-01-14 | Plant Genetic Systems, N.V. | Hybrid winter oilseed rape and methods for producing same |
-
1999
- 1999-12-08 US US09/457,037 patent/US6506963B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2000
- 2000-12-06 CZ CZ2002-2367A patent/CZ306357B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2000-12-06 CN CN2005100719970A patent/CN1690211B/zh not_active Expired - Lifetime
- 2000-12-06 HU HU0203347A patent/HU225433B1/hu unknown
- 2000-12-06 WO PCT/EP2000/012872 patent/WO2001041558A1/en active IP Right Grant
- 2000-12-06 PL PL356533A patent/PL205071B1/pl unknown
- 2000-12-06 AU AU30133/01A patent/AU783406B2/en not_active Expired
- 2000-12-06 AT AT00990782T patent/ATE323404T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-12-06 UA UA2002075562A patent/UA88861C2/ru unknown
- 2000-12-06 DE DE60027469T patent/DE60027469T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-12-06 EP EP00990782A patent/EP1244348B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-12-06 CN CNB008168806A patent/CN1219065C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2000-12-06 DK DK00990782T patent/DK1244348T3/da active
- 2000-12-08 US US09/733,151 patent/US6563026B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2003
- 2003-02-27 US US10/375,332 patent/US7659095B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-05-26 HK HK03103700A patent/HK1051295A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-04-18 HK HK06104583.9A patent/HK1084415A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2009
- 2009-12-10 US US12/635,215 patent/US8026352B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2011
- 2011-08-17 US US13/211,373 patent/US8309699B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE60027469T2 (de) | 2006-12-14 |
| CN1690211A (zh) | 2005-11-02 |
| EP1244348A1 (en) | 2002-10-02 |
| HUP0203347A2 (hu) | 2003-01-28 |
| PL205071B1 (pl) | 2010-03-31 |
| WO2001041558A1 (en) | 2001-06-14 |
| US20010029620A1 (en) | 2001-10-11 |
| UA88861C2 (ru) | 2009-12-10 |
| CN1219065C (zh) | 2005-09-14 |
| CN1690211B (zh) | 2010-05-12 |
| DE60027469D1 (de) | 2006-05-24 |
| US6563026B2 (en) | 2003-05-13 |
| ATE323404T1 (de) | 2006-05-15 |
| AU3013301A (en) | 2001-06-18 |
| CZ306357B6 (cs) | 2016-12-21 |
| PL356533A1 (en) | 2004-06-28 |
| US8026352B2 (en) | 2011-09-27 |
| AU783406B2 (en) | 2005-10-27 |
| EP1244348B1 (en) | 2006-04-19 |
| DK1244348T3 (da) | 2006-08-21 |
| US20110294133A1 (en) | 2011-12-01 |
| US20100248232A1 (en) | 2010-09-30 |
| US20030188347A1 (en) | 2003-10-02 |
| HK1051295A1 (en) | 2003-08-01 |
| CN1409594A (zh) | 2003-04-09 |
| HUP0203347A3 (en) | 2004-10-28 |
| HU225433B1 (en) | 2006-11-28 |
| HK1084415A1 (en) | 2006-07-28 |
| US6506963B1 (en) | 2003-01-14 |
| US8309699B2 (en) | 2012-11-13 |
| US7659095B2 (en) | 2010-02-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6563026B2 (en) | Hybrid winter oilseed rape and methods for producing same | |
| US6509516B1 (en) | Male-sterile brassica plants and methods for producing same | |
| CN102119216B (zh) | Spt事件侧翼的植物基因组dna及用于鉴定spt事件的方法 | |
| US11363768B2 (en) | Maize cytoplasmic male sterility (CMS) S-type restorer Rf3 gene, molecular markers and their use | |
| KR20120107476A (ko) | 우량 이벤트 ｅｅ－ｇｍ３, 그리고 생물학적 시료에서 이러한 이벤트를 동정하기 위한 방법 및 키트 | |
| AU2016296468A1 (en) | Methods and compositions for selective regulation of protein expression | |
| DK2986727T3 (en) | HYBRID BRASSICA PLANTS AND METHODS OF PRODUCING THEREOF | |
| US20240057538A1 (en) | Methods for identifying and selecting maize plants with cytoplasmatic male sterility restorer gene | |
| CA3201992A1 (en) | Brassica napus plants comprising an improved fertility restorer | |
| US20130198892A1 (en) | Method for modifying the blooming date of a plant |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20201206 |