HU225433B1

HU225433B1 - Hybrid winter oilseed rape and methods for producing same

Info

Publication number: HU225433B1
Application number: HU0203347A
Authority: HU
Inventors: Both Greta De; Beuckeleer Marc De
Original assignee: Bayer Bioscience Nv
Priority date: 1999-12-08
Filing date: 2000-12-06
Publication date: 2006-11-28
Also published as: CN1409594A; CN1690211A; US20100248232A1; DE60027469D1; US20010029620A1; CZ306357B6; HK1051295A1; US8026352B2; HUP0203347A2; AU783406B2; CZ20022367A3; CN1690211B; UA88861C2; DK1244348T3; AU3013301A; PL356533A1; EP1244348A1; US6506963B1; US8309699B2; HK1084415A1

Description

A találmány tárgyát téli olajrepce („winter oilseed rape”, WOSR), közelebbről hibrid vetőmag előállítására különösen alkalmas téli olajrepce növénypár képezi. Még közelebbről, az említett növénypár egyik tagja a genomjában található hímsterilitásgén hatására hímsteril, míg a másik fertilitás-helyreállító gént hordoz, amely képes megakadályozni a hímsterilitásgén hatását. A találmány szerinti WOSR növénypárban a hibrid vetőmag előállításának képessége optimális általános termelési teljesítménnyel, genetikai stabilitással és különféle genetikai hátterekhez történő adaptációs képességgel kombinálódik.

A leírásban hivatkozott dokumentumok mindegyike teljes egészében a kitanítás részét képezi.

Egy transzgén növénybeli fenotípusos expresszióját a gén szerkezete, valamint növénygenombeli elhelyezkedése határozza meg. A genom eltérő helyein található transzgén ugyanakkor különböző módokon befolyásolja a növény fenotípusát. Egy kereskedelmi szempontból érdekes tulajdonság genetikai manipulációval, mezőgazdasági vagy ipari szempontból sikeres módon növénybe történő juttatása hosszadalmas eljárás eredménye, amely különböző tényezők függvénye. A genetikailag módosított növények esetében maga a transzformáció és regeneráció csupán az első a szelekciós lépések sorozatában, amelyek kiterjedt genetikai jellemzést, tenyésztést és üzemi kipróbálási kísérletekkel történő értékelést foglalnak magukban.

Az olajrepce („oilseed rape”, OSR) (Brassica napus, AACC, 2n=38) a káposztarepce („colé”; Brassica oleracea, CC, 2n=18), valamint a réparepce („tumip”; Brassica campestris, AA, 2n=20) faj közötti hibridizációjának eredményeként létrejött természetes hibrid. A téli olajrepcét augusztus utolsó és szeptember első 10 napjában vetik, majd mérsékelt hőmérsékleti viszonyok közötti előérlelés után júliusban aratják. A gyorsabban növekvő tavaszi repcét késő márciusban, kora áprilisban vetik, majd augusztus közepétől szeptemberig aratják. Az olajrepcének jelenleg alacsony és magas erukasav-tartalmú változatait termesztik. A „duplanullás” („double low”) változatok alacsony (jellemzően 1 % alatti) mennyiségben tartalmaznak (az ember által nehezen emészthető) erukasavat, továbbá alacsony mennyiségben tartalmaznak (a repceolajdara mellékterméket állatok számára emészthetetlenné tevő) glükózinolátokat. A dupla nullás változatokat jelenleg emberi felhasználásra szánt olaj és állati takarmányozásra szolgáló magas fehérjetartalmú dara előállítására veszik igénybe, az iparban gyógyászati termékek alapanyagaként és hidraulikaolajként alkalmazzák. A magas erukasav-tartalmú repceváltozatokat („high erucic acid rape”, HEAR) magas, jellemzően 50-60%-os erukasav-tartalmukért termesztik. A folyamat végterméke az erukamid, a polietán-előállításban alkalmazott „csúsztatóágens” („slip agent”). Kisebb arányban veszik igénybe ezt a repcefajtát nyers, viaszos ásványolaj folyóképességének javítására alkalmazott behenil-alkohol előállítására.

Az olajrepce növények kétivarúak, jellemzően 60-70%-uk önporzó. A hibridek előállítása és a szelekció alapjául szolgáló genetikai változatosság kialakítása korábban természetes körülmények között előforduló jelenségek, például az ön-összeférhetetlenség és a citoplazmatikus hímsterilitás kihasználásán alapult. A beporzást szabályozó mesterséges beavatkozások, például a kézi ivartalanítás vagy a gametocid szerek alkalmazása korlátozott gyakorlati értékük, valamint költségességük miatt nem terjedt el az olajrepce-termesztésben.

A hagyományos technikák figyelemre méltó alternatívájaként transzgenikus eljárásokat dolgoztak ki hím- vagy nőivarú steril növények előállítására.

Az EP 0344029 számú európai közzétételi irat mageredetű hímsterilitás kialakítására szolgáló eljárást ismertet. Ennek során növények például PTA29 jelű tapetumspecifikus promoter szabályozása alatt álló barnázt kódoló DNS-t tartalmazó hímsterilitásgénnel történő transzformálására kerül sor, amely a tapetumsejtek szelektív pusztulását eredményezi. Dohány és olajrepce említett kiméragénnel történő transzformálása teljes mértékben meggátolta a növények pollen képződését [Mariani és munkatársai: Natúré 347, 737 (1990)].

Hímsteril növény utódai fertilitásának helyreállításához olyan rendszert dolgoztak ki, amelyben a hímsteril növényt a hímsterilitásért felelős gén működésének meggátlására vagy megelőzésére képes fertilitás-helyreállító gént hordozó transzgenikus növénnyel keresztezik (5689041 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat, 5792929 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat). A fertilitás-helyreállító gént szabályozó promoter legalább azokban a sejtekben képes expressziót irányítani, amelyekben a hímsterilitásgén expresszálódik. Mariani és munkatársai kimutatták, hogy olajrepce esetében a pTA29:bamáz gén előidézte sterilitás a pTA29:barstargén segítségével megszüntethető [Mariani és munkatársai: Natúré 357, 384 (1992)].

A kiméra pTA29:barnáz gént önmagában vagy a pTA29:barstar génnel együtt tartalmazó Brassica napus növények portokfejlődésének citokémiai és hisztokémiai elemzését De Block és De Brouwer közleménye mutatja be (De Block és De Brouwer: Planta 189, 218 (1993)].

Már számos eljárással sikerrel transzformáltak Brassica fajokat, így például Agrobacteríum-fedözéssel (például EP 0116718 számú európai közzétételi irat; EP 0270882 számú európai közzétételi irat), mikrolövedékbombázással [például Chen és munkatársai: Theor. Appl. Génét. 88, 187 (1994)], valamint közvetlen DNS-felvétellel [például De Block és munkatársai: Plánt Physiol. 914, 694 (1989); Poulsen: Plánt Breeding 115, 209(1996)].

A fentiekben említett közlemények azonban nem ismertetik a találmány szerinti megoldást, és arra vonatkozó utalást sem tartalmaznak.

A találmány tárgyát hibrid vetőmag előállítására különösen alkalmas WOSR növénypár képezi. Közelebbről, a találmány tárgyát képezi egy hímsterilitásgént magában foglaló expressziós kazettát genomjába integráltan tartalmazó első transzgenikus WOSR nö2

HU 225 433 Β1 vény, vagy annak magja, sejtjei vagy szövetei, valamint egy fertilitás-helyreállító gént magában foglaló expressziós kazettát genomjába integráltan tartalmazó második transzgenikus WOSR növény, vagy annak magja, sejtjei vagy szövetei, továbbá az első és a második növény keresztezésével nyert, a hímsterilitásgént és/vagy a fertilitás-helyreállító gént genomjába integráltan tartalmazó hibrid vetőmag.

A találmány egy megvalósítási módjában az első transzgenikus WOSR növény, vagy annak magja, sejtjei vagy szövetei a pTHW107 jelű expressziós kazettát tartalmazzák. A találmány előnyös megvalósítási módjában az első transzgenikus WOSR növény, vagy annak magja, sejtjei vagy szövetei az MS-BN1 jelű eseményt tartalmazzák. A találmány egy másik megvalósítási módjában a második transzgenikus WOSR növény, vagy annak magja, sejtjei vagy szövetei a pTHW1118 jelű expressziós kazettát tartalmazzák. A találmány előnyös megvalósítási módjában WOSR növény, vagy annak magja, sejtjei vagy szövetei az RF-BN1 jelű eseményt tartalmazzák. A találmány egy különösen előnyös megvalósítási módjában az első WOSR növény az MS-BN1, a második WOSR növény pedig az RF-BN1 eseményt tartalmazza, a belőlük nyert hibrid vetőmag pedig vagy az MS-BN1 és az RF-BN1, vagy csupán az RF-BN1 eseményt tartalmazza.

A találmány tárgyát transzgenikus WOSR vetőmag vagy belőle nyerhető növény képezi, amelynek genomi DNS-e a következők közül eggyel vagy többel jellemezhető:

a) a genomi DNS-ből az alábbiakban felsoroltak közül legalább kettő, előnyösen legalább három, előnyösebben legalább négy, legelőnyösebben pedig legalább öt restrikciósfragmens-sorozat nyerhető:

i) két EcoRI fragmensből álló sorozat, amelyek közül az egyik 2140 és 2450 bp közötti nagyságú, előnyösen mintegy 2266 bp-os, a másik pedig 14 000 bp-osnál nagyobb;

ii) két EcoRVfragmensből álló sorozat, amelyek közül az egyik 1159 és 1700 bp közötti nagyságú, előnyösen mintegy 1400 bp-os, a másik pedig 14 000 bp-osnáf nagyobb;

iii) két Hpa1 fragmensből álló sorozat, amelyek közül az egyik 1986 és 2140 bp közötti nagyságú, előnyösen mintegy 1990 bp-os, a másik pedig 2140 és 2450 bp közötti nagyságú, előnyösen mintegy 2229 bp-os;

iv) három Afllll fragmensből álló sorozat, amelyek közül az egyik 514 és 805 bp közötti nagyságú, előnyösen mintegy 522 bp-os, a másik 2140 és 2450 bp közötti nagyságú, előnyösen mintegy 2250 bp-os, a harmadik pedig 2450 és 2838 bp közötti nagyságú, előnyösen mintegy 2477 bp-os;

v) két Nde\ fragmensből álló sorozat, amelyek mindegyike 5077 és 14 057 bp közötti nagyságú, egyikük előnyösen mintegy 6500 bp-os, a másik pedig mintegy 10 000 bp-os;

ahol a restrikciós fragmensek mindegyike standard sztringensségű körülmények között hibridizálni képes a találmány szerinti pTHW107 jelű plazmid H/ndlII emésztésével nyert PTA29-barnáz szekvenciát tartalmazó 3942 bp-os fragmenssel, és/vagy

b) a genomi DNS-ből az alábbiakban felsoroltak közül legalább kettő, előnyösen legalább három, előnyösebben pedig legalább négy restrikciósfragmens-sorozat nyerhető:

i) három BamH\ fragmensből álló sorozat, amelyek közül az egyik 805 és 1099 bp közötti nagyságú, előnyösen mintegy 814 bp-os, a másik 1700 és 1986 bp közötti nagyságú, előnyösen mintegy 1849 bp-os, a harmadik pedig 5077 és 14 057 bp közötti nagyságú, előnyösen mintegy 6500 bp-os;

ii) négy EcoRI fragmensből álló sorozat, amelyek közül az egyik 805 és 1159 bp közötti nagyságú, előnyösen mintegy 1094 bp-os, egy másik 1986 és 2450 bp közötti nagyságú, előnyösen mintegy 2149 bp-os, kettőjük pedig 5077 és 14 057 bp közötti nagyságú, egyikük előnyösen mintegy 7000 bp-os, a másik pedig mintegy 10 000 bp-os;

iii) két EcoRV fragmensből álló sorozat, amelyek mindegyike 5077 és 14 057 bp közötti nagyságú, egyikük előnyösen mintegy 5400 bp-os, a másik pedig mintegy 8000 bp-os;

iv) három H/ndlII fragmensből álló sorozat, amelyek közül az egyik 1700 és 2140 bp közötti nagyságú, előnyösen mintegy 1969 bp-os, kettőjük pedig 2450 és 2838 bp közötti nagyságú, közülük az egyik előnyösen mintegy 2565 bp-os, a másik pedig mintegy 2635 bp-os;

ahol a restrikciós fragmensek mindegyike standard sztringensségű körülmények között hibridizálni képes a találmány szerinti pTHW118 jelű plazmid Hpa\ emésztésével nyert PTA29-barstar szekvenciát tartalmazó 2182 bp-os fragmenssel.

A találmány tárgyát WOSR növény magja, vagy az ebből a magból származó növény, vagy annak sejtjei vagy szövetei képezik, amelynek genomi DNS-e a következő jellemzők közül eggyel vagy mindkettővel rendelkezik:

a) a genomi DNS-ből a fenti a) pont i), ii), iii), iv) és

v) alpontjaiban felsorolt restrikciósfragmens-sorozatok közül legalább kettő, előnyösen legalább három, például legalább négy, még előnyösebben pedig legalább öt nyerhető, amelyek az a) pontbeli i), ii), iii), iv) és v) sorozatok tetszőleges kombinációi lehetnek; és/vagy

b) a genomi DNS-ből a fenti b) pont i), ii), iii), iv) és v) alpontjaiban felsorolt restrikciósfragmens-sorozatok közül legalább kettő, előnyösebben legalább három, legelőnyösebben pedig négy nyerhető, amelyek a b) pontbeli i), ii), iii), iv) és v) sorozatok tetszőleges kombinációi lehetnek.

A találmány tárgyát képezi továbbá WOSR-mag vagy az abból származó növény, amelynek genomi DNS-e a következő jellemzők közül eggyel vagy mindkettővel rendelkezik:

c) a 12. azonosító számú szekvencia és a 19. azonosító számú szekvencia szerinti nukleotidszekvenciájú láncindítókkal végzett polimeráz-láncreakcióban a genomi DNS-sel egy 260 és 300 bp közötti nagyságú,

HU 225 433 Β1 előnyösen mintegy 280 bp-os DNS-fragmens amplifikálható; és/vagy

d) a 23. azonosító számú szekvencia és a 41. azonosító számú szekvencia szerinti nukleotidszekvenciájú láncindítókkal végzett polimeráz-láncreakcióban a genomi DNS-sel egy 195 és 235 bp közötti nagyságú, előnyösen mintegy 215 bp-os DNS-fragmens amplifikálható.

A találmány tárgyát képezi továbbá WOSR-mag vagy az abból származó növény, amelynek genomi DNS-e a fenti a) és c) és/vagy b) és d) pontokban ismertetett jellemzőkkel rendelkezik.

A találmány tárgyát transzgenikus WOSR-mag vagy belőle nyerhető növény képezi, amelynek genomi DNS-e a következők közül eggyel vagy többel jellemezhető:

i) két EcoR\ fragmensből álló sorozat, amelyek közül az egyik 2140 és 2450 bp közötti nagyságú, előnyösen mintegy 2266 bp-os, a másik pedig 14 000 bp-osnál nagyobb;

ii) két EcoRV fragmensből álló sorozat, amelyek közül az egyik 1159 és 1700 bp közötti nagyságú, előnyösen mintegy 1400 bp-os, a másik pedig 14 000 bp-osnál nagyobb;

iv) három Afflll fragmensből álló sorozat, amelyek közül az egyik 514 és 805 bp közötti nagyságú, előnyösen mintegy 522 bp-os, a másik 2140 és 2450 bp közötti nagyságú, előnyösen mintegy 2250 bp-os, a harmadik pedig 2450 és 2838 bp közötti nagyságú, előnyösen mintegy 2477 bp-os;

v) két Ndel fragmensből álló sorozat, amelyek mindegyike 5077 és 14 057 bp közötti nagyságú, egyikük előnyösen mintegy 6500 bp-os, a másik pedig mintegy 10 000 bp-os;

ahol a restrikciós fragmensek mindegyike standard sztringensségű körülmények között hibridizálni képes a találmány szerinti pTHW107 jelű plazmid Hind/// emésztésével nyert PTA29-barnáz szekvenciát tartalmazó 3942 bp-os fragmenssel; és/vagy

c) a 12. azonosító számú szekvencia és a 19. azonosító számú szekvencia szerinti nukleotidszekvenciájú láncindítókkal végzett polimeráz-láncreakcióban a genomi DNS-sel egy 260 és 300 bp közötti nagyságú, előnyösen mintegy 280 bp-os DNS-fragmens amplifikálható.

A találmány tárgyát előnyösen hímsteril WOSR növény magja, vagy a magból származó növény, vagy annak sejtjei vagy szövetei képezik, amelynek genomi DNS-éből a fenti i), ii), iii), iv) és v) alpontokban felsorolt restrikciósfragmens-sorozatok közül legalább kettő, előnyösen legalább három, még előnyösebben pedig legalább öt nyerhető, amelyek az I), ii), iii), iv) és v) alpontbeli sorozatok tetszőleges kombinációi lehetnek.

A találmány tárgyát WOSR növény magja, vagy az ebből a magból származó növény képezi, amelynek genomi DNS-e a következő jellemzők közül eggyel vagy mindkettővel rendelkezik:

b) a genomi DNS-ből az alábbiakban felsoroltak közül legalább kettő, előnyösen legalább három, előnyösebben pedig legalább négy restrikclósfragmens-sorozat nyerhető:

i) három BamHI fragmensből álló sorozat, amelyek közül az egyik 805 és 1099 bp közötti nagyságú, előnyösen mintegy 814 bp-os, a másik 1700 és 1986 bp közötti nagyságú, előnyösen mintegy 1849 bp-os (egy másik 2450 és 2838 bp közötti nagyságú, előnyösen 2607 bp-os); a harmadik pedig 5077 és 14 057 bp közötti nagyságú, előnyösen mintegy 6500 bp-os;

iii) két EcoFN fragmensből álló sorozat, amelyek mindegyike 5077 és 14 057 bp közötti nagyságú, egyikük előnyösen mintegy 5400 bp-os, a másik pedig mintegy 8000 bp-os;

iv) három H/ncflII fragmensből álló sorozat, amelyek közül az egyik 1700 és 2140 bp közötti nagyságú, előnyösen mintegy 1969 bp-os, kettőjük pedig 2450 és 2838 bp közötti nagyságú, közülük az egyik előnyösen mintegy 2565 bp-os, a másik pedig mintegy 2635 bp-os;

ahol a restrikciós fragmensek mindegyike standard sztringensségű körülmények között hibridizálni képes a találmány szerinti pTHW118 jelű plazmid Hpal emésztésével nyert PTA29-barstar szekvenciát tartalmazó 2182 bp-os fragmenssel; és/vagy

A találmány tárgyát előnyösen fertilitás-helyreállító WOSR növény magja, vagy a magból származó növény, vagy annak sejtjei vagy szövetei képezik, amelynek genomi DNS-éből a fenti b) pontbeli I), ii), iii) és iv) alpontokban felsorolt restrikciósfragmens-sorozatok közül legalább kettő, előnyösen legalább három, legelőnyösebben pedig négy nyerhető, amelyek az i), ii), iii), iv) és v) alpontbeli sorozatok tetszőleges kombinációi lehetnek.

A találmány tárgyát transzgenikus WOSR növények, azok sejtjei, szövetei vagy magjai képezik, amelyek előnyösen a fenti b) és/vagy d) pontokban ismertetett jellemzőkkel rendelkeznek.

A találmány tárgyát képezik továbbá a fentiekben ismertetett jellemzőkkel rendelkező hímsteril növény és a

HU 225 433 Β1 találmány szerinti fertilitás-helyreállító növény keresztezésével nyert transzgenikus, előnyösen hibrid, helyreállított fertilitású WOSR növények, azok sejtjei, szövetei vagy magjai, ahol a helyreállított fertilitású növények, azok sejtjei, szövetei vagy magjai a fentiekben ismertetett hímsteril és a fertilitás-helyreállító WOSR növények molekuláris jellemzőivel rendelkeznek. A találmány tárgyát képezik továbbá a fentiekben ismertetett molekuláris jellemzőkkel rendelkező hímsteril növény és a találmány szerinti fertilitás-helyreállító növény keresztezésével nyert transzgenikus, előnyösen hibrid WOSR növények, azok sejtjei, szövetei vagy magjai, ahol a hibrid növények, azok sejtjei, szövetei vagy magjai a fentiekben ismertetett fertilitás-helyreállító WOSR növény molekuláris jellemzőivel rendelkeznek.

A találmány tárgyát képezi továbbá az ATCC-nél PTA-730 deponálási szám alatt elhelyezett mag, a belőle kinőtt növény, valamint a belőle kinőtt növény sejtjei és szövetei. A találmány tárgyát képezik továbbá az ATCC-nél PTA-730 deponálási szám alatt elhelyezett magból kinőtt WOSR növény szaporításával és/vagy a vele történő tenyésztéssel előállítható növények.

A találmány tárgyát mindezeken túl hibrid WOSR-mag előállításának folyamata képezi, amelyben a találmány szerinti hímsteril WOSR növény és a találmány szerinti fertilitás-helyreállító WOSR növény keresztezésére kerül sor.

A találmány tárgyát képezi továbbá WOSR növény, növényi sejt, növényi szövet vagy mag, amely a kromoszomális DNS 22. azonosító számú szekvenciának megfelelő részébe integrált, legalább egy transzgént tartalmazó rekombináns DNS-t foglal magában és/vagy a kromoszomális DNS 34. azonosító számú szekvenciának megfelelő részébe integrált, legalább egy transzgént tartalmazó rekombináns DNS-t foglal magában.

A találmány tárgyát képezi továbbá egy WOSR növény vagy belőle származó növény transzgenikus sejtjének előállítására szolgáló folyamat, amelyben WOSRsejt kromoszomális DNS-ének 22. azonosító számú szekvenciának megfelelő részébe rekombináns-DNSmolekula inszerciójára, és adott esetben a transzformált WOSR-sejtből WOSR növény regenerációjára kerül sor.

A találmány tárgyát képezi továbbá egy WOSR növény vagy belőle származó növény transzgenikus sejtjének előállítására szolgáló folyamat, amelyben WOSR-sejt kromoszomális DNS-ének 22. azonosító számú szekvenciának megfelelő részébe rekombináns-DNS-molekula inszerciójára, és adott esetben a transzformált WOSR-sejtből WOSR növény regenerációjára kerül sor.

A találmány tárgyát képezi továbbá a találmány szerinti MS-BN1 elit eseményt tartalmazó transzgenikus növény, vagy annak sejtjei vagy szövetei azonosítására szolgáló eljárás, amely során a transzgenikus növény, vagy annak sejtjei vagy szövetei genomi DNS-ére vonatkozóan a következőkben felsorolt egyik vagy mindkét jellemző megállapításra kerül:

ii) két EcoRN fragmensből álló sorozat, amelyek közül az egyik 1159 és 1700 bp közötti nagyságú, előnyösen mintegy 1400 bp-os, a másik pedig 14 000 bp-osnál nagyobb;

iii) két Hpal fragmensből álló sorozat, amelyek közül az egyik 1986 és 2140 bp közötti nagyságú, előnyösen mintegy 1990 bp-os, a másik pedig 2140 és 2450 bp közötti nagyságú, előnyösen mintegy 2229 bp-os;

ahol a restrikciós fragmensek mindegyike standard sztringensségű körülmények között hibridizálni képes a találmány szerinti pTHW107 jelű plazmid Hindin emésztésével nyert PTA29-barnáz szekvenciát tartalmazó 3942 bp-os fragmenssel; és/vagy az elit eseményt azonosító 12. és 19. azonosító számú szekvencia szerinti nukleotidszekvenciájú láncindítókkal a találmány szerinti PCR azonosítási eljárásnak megfelelően a genomi DNS alkalmazásával egy 260 és 300 bp közötti nagyságú, előnyösen mintegy 280 bp-os DNS-fragmens amplifikálható.

A találmány tárgyát képezi továbbá a találmány szerinti MS-BN1 elit eseményt tartalmazó növények azonosítására szolgáló, a 12. és 19. azonosító számú szekvencia szerinti nukleotidszekvenciájú PCR-próbákat tartalmazó reagenskészlet.

A találmány tárgyát képezi továbbá a találmány szerinti RF-BN1 elit eseményt tartalmazó növények azonosítására szolgáló, a 23. és 41. azonosító számú szekvencia szerinti nukleotidszekvenciájú PCR-próbákat tartalmazó reagenskészlet.

A találmány tárgyát képezi továbbá az MS-BN1 és/vagy RF-BN1 elit események biológiai mintákból történő azonosítására szolgáló reagenskészlet, amely legalább egy specifikus láncindítót vagy próbát tartalmaz, amelynek szekvenciája megegyezik (vagy komplementer) egy, az MS-BN1 egy specifikus régiójával 80% és 100% közötti mértékben azonos szekvenciával és/vagy legalább egy specifikus láncindítót vagy próbát tartalmaz, amelynek szekvenciája megegyezik (vagy komplementer) egy, az RF-BN1 egy specifikus régiójával 80% és 100% közötti mértékben azonos szekvenciával. A próba szekvenciája előnyösen az MS-BN1 és/vagy RF-BN1 5’ vagy 3’ szegélyezőrégiójának egy részét magában foglaló specifikus ré5

HU 225 433 Β1 giónak felel meg. A specifikus próba legelőnyösebben az MS-BN1 esetében a 36. vagy 38. azonosító számú szekvencia szerinti szekvenciának megfelelő növényi DNS-szekvenciával, az RF-BN1 esetében a 39. vagy 40. azonosító számú szekvencia szerinti szekvenciának megfelelő növényi DNS-szekvenciával 80% és 100% közötti mértékben azonos szekvenciát tartalmaz (vagy azzal komplementer).

A találmány szerinti reagenskészlet az MS-BN1 és/vagy az RF-BN1 5' vagy 3’ szegélyezőrégióit specifikusan felismerő láncindító mellett PCR azonosítási eljárásban történő alkalmazás céljából előnyösen tartalmaz egy, az MS-BN1- és/vagy az RF-BN1-beli idegen DNS-ben egy szekvenciát specifikusan felismerő második láncindítót is.

A találmány szerinti reagenskészlet előnyösen két (vagy több) specifikus láncindítót tartalmaz, melyek közül az egyik az MS-BN1 és/vagy az RF-BN1 3’ szegélyezőrégióján belüli szekvenciát, legelőnyösebben az MS-BN1 esetében a 36. vagy 38. azonosító számú szekvencia szerinti szekvenciának megfelelő növényi DNS-régión belüli szekvenciát vagy az RF-BN1 esetében a 39. vagy 40. azonosító számú szekvencia szerinti szekvenciának megfelelő növényi DNS-régión belüli szekvenciát, a másik pedig az MS-BN1- és/vagy az RF-BN1-beli idegen DNS-szekvenciát ismer fel. Az MS-BN1 5’ szegélyezőrégióján belüli növényi DNSszekvenciát felismerő láncindító különösen előnyösen a 19. azonosító számú szekvencia szerinti nukleotidszekvenciát tartalmazza. Közelebbről, az MS-BN1 5’ szegélyezőrégióján belüli növényi DNS-szekvenciát felismerő láncindító a 19. azonosító számú szekvencia szerinti nukleotidszekvenciát, az MS-BN1-beli idegen DNS-t felismerő láncindító pedig a találmány szerinti 12. azonosító számú szekvenciának megfelelő nukleotidszekvenciát tartalmazza. Az RF-BN1 5’ szegélyezőrégióján belüli növényi DNS-szekvenciát felismerő láncindító különösen előnyösen a 41. azonosító számú szekvencia szerinti nukleotidszekvenciát tartalmazza. Közelebbről, az MS-BN1 5’ szegélyezőrégióján belüli növényi DNS-szekvenciát felismerő láncindító a 41. azonosító számú szekvencia szerinti nukleotidszekvenciát, az RF-BN1-belí idegen DNS-t felismerő láncindító pedig a találmány szerinti 23. azonosító számú szekvenciának megfelelő nukleotidszekvenciát tartalmazza.

A találmány szerinti eljárások és reagenskészletek többek között, de nem kizárólag a következő célokra alkalmazhatók: MS-BN1 és/vagy RF-BN1 növényből, növényi anyagból vagy különféle termékekből, többek között növényi anyagból származó (friss vagy feldolgozott) élelmiszerből vagy állati takarmányból történő kimutatása; a találmány szerinti eljárások és reagenskészletek emellett vagy ehelyett felhasználhatók transzgenikus növényi anyag azonosítására transzgenikus és nem transzgenikus anyagok elkülönítése céljából; a találmány szerinti eljárások és reagenskészletek emellett vagy ehelyett igénybe vehetők az MS-BN1-et és/vagy RF-BN1-et tartalmazó növényi anyag minőségének (százalékos tiszta anyag tartalmának) meghatározására is.

A találmány konkrét megvalósítási módjainak leírását a vonatkozó szabadalmi igénypontok tartalmazzák.

Az alábbiakban az ábrák rövid leírását közöljük.

Az alábbiakban közzétett részletes, példaértékű, de a találmányt specifikus megvalósítási módokra nem korlátozó leírás megértését a következő, a kitanítás részét képező ábrák segítik.

1. ábra: A pVE113 plazmid térképe.

2. ábra: Az MS-BN1 genomi DNS emésztésével nyert restrikciós térkép.

A Southem-blot-eljárással vizsgált gél feltöltési sorrendje: 1. sáv: EcoR\-gyel emésztett MS-BN1 DNS; 2. sáv: EcoRV-tel emésztett MS-BN1 DNS; 3. sáv: Hpal-gyel emésztett MS-BN1 DNS; 4. sáv: Afflll-mal emésztett MS-BN1 DNS; 5. sáv: Λ/del-gyel emésztett MS-BN1 DNS; 6. sáv: BamHI-gyel emésztett nem transzgenikus WOSR DNS; 7. sáv: BamHI-gyel emésztett nem transzgenikus WOSR DNS + BamHI-gyel emésztett pTHW107 kontroll plazmid DNS.

3. ábra: Az RF-BN1 genomi DNS emésztésével nyert restrikciós térkép.

A Southem-blot-eljárással vizsgált gél feltöltési sorrendje: 1. sáv: BamHI-gyel emésztett RF-MS1 DNS; 2. sáv: EcoRI-gye\ emésztett RF-BN1 DNS; 3. sáv: EcoRV-tel emésztett RF-BN1 DNS; 4. sáv: Hind\ ll-mal emésztett RF-BN1 DNS; 5. sáv: BamHI-gyel emésztett nem transzgenikus WOSR DNS; 6. sáv: BamHI-gyel emésztett nem transzgenikus WOSR DNS+BamHl-gyel emésztett pTHW118 kontroll plazmid DNS.

4. ábra: A különböző sávok MS-BN1 PCR azonosítási eljárással végzett PCR-elemzése.

A gél feltöltési sorrendje: 1. sáv: az MS-BN1 transzgenikus eseményt tartalmazó olajrepce növény DNS-mintája; 2. sáv: egy másik transzgenikus eseményt tartalmazó olajrepce növény DNS-mintája; 3. sáv: vad típusú olajrepcéből származó DNS-minta; 4. sáv: negatív kontroll (víz); 5. sáv: molekulatömeg-marker (100 bp-os ladder).

5. ábra: A különböző sávok RF-BN1 PCR azonosítási eljárással végzett PCR-elemzése.

A gél feltöltési sorrendje: 1. sáv: az RF-BN1 transzgenikus eseményt tartalmazó olajrepce növény DNS-mintája; 2. sáv: egy másik transzgenikus eseményt tartalmazó olajrepce növény DNS-mintája; 3. sáv: vad típusú olajrepcéből származó DNS-minta; 4. sáv: negatív kontroll (víz); 5. sáv: molekulatömeg-marker (100 bp-os ladder).

Az alábbiakban részletesen ismertetjük a találmány szerinti megoldást.

„Gén” lehet bármely DNS-szekvencia, amely több működőképesen kapcsolt DNS-fragmenst, például együttesen promoterrégiót kialakító promotert és 5' nem transziáit régiót („untranslated region”, UTR), egy (proteint kódoló vagy nemkódoló) kódolórégiót, továbbá poliadenilációs helyet magában foglaló nem transziáit 3’ régiót tartalmaz. Növényi sejtekben jellemzően az 5’ UTR, a kódolórégió és a 3' UTR transzkripciójával RNS jön létre, amelynek transzlációja proteint kódoló gén esetében az adott proteint eredményezi. A gén tartalmazhat további DNS-fragmenseket, például introno6

HU 225 433 Β1 kát is. Génlokusz alatt egy adott gén egy növény genomján belüli elhelyezkedését értjük.

Génnel vagy DNS-szekvenciával kapcsolatban a „kiméra” megjelölés arra utal, hogy a gén vagy DNS-szekvencia legalább két, működés szempontjából lényeges DNS-fragmenst (például promotert, 5’ UTR-t, kódolórégiót, 3’ UTR-t, intront) tartalmaz, amelyek természetes körülmények között nem állnak egymással kapcsolatban és például különböző forrásból származnak. Növényfaj esetében egy génnel vagy DNS-szekvenciával kapcsolatban az „idegen” kifejezés arra utal, hogy a gén vagy DNS-szekvencia természetes körülmények között nem fordul elő az adott növényfajban, vagy természetes körülmények között nem fordul elő a kérdéses növényfaj adott génlokuszán. Az „idegen DNS kifejezés alatt transzformáció eredményeként növényi genomba inkorporálódott DNS-szekvenciát értünk. A „transzformáló DNS” megjelölés alatt transzformáció céljából igénybe vett rekombináns-DNS-molekulát értünk. A transzformáló DNS általában legalább egy „lényeges gént” (például kiméragént) tartalmaz, amely egy vagy több meghatározott jellemzővel képes ellátni a transzformált növényt. A „rekombináns-DNS-molekula” megnevezést izolált nukleinsavmolekula példájaként alkalmazzuk, amely DNS is lehet, és amely rekombináns vagy egyéb eljárások eredményeként nyerhető.

A „transzgén” kifejezés egy növény genomjába ínkorporált lényeges gént jelöl. A „transzgenikus növény” olyan növény, amely mindegyik sejtjének genomja legalább egy transzgént tartalmaz.

A találmány szerinti növényekben jelen lévő idegen DNS előnyösen két lényeges gént tartalmaz, közelebbről vagy egy hímsterilitásgént és egy herbicidrezisztencia-gént, vagy egy fertilitás-helyreállító gént és egy herbicidrezisztencia-gént foglal magában.

„Hímsterilitásgén” alatt növénybeli expressziója eredményeként a növényt fertilis, életképes pollen termelésére alkalmatlanná tevő gént értünk. Hímsterilitásgén például a tapetumsejtbeli expressziót irányító promoter szabályozása alatt álló, barnázt kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó gén. Közelebbről, a találmány szerinti hímsterilitásgén a „TA29-barnáz”.

„Fertilitás-helyreállító” gén alatt hímsterilitásgént tartalmazó növénybeli expressziója eredményeként a hímsterilitásgén fenotípusos expresszióját meggátolni, így a növény fertilitását helyreállítani képes gént értünk. Közelebbről, a fertilitás-helyreállító gén a legalább a hímsterilitásgént expresszáló sejtekben expressziót irányító promoter szabályozása alatt álló, a hímsterilitásgén fenotípusos expressziójának megakadályozására képes proteint vagy polipeptidet kódoló DNS-t tartalmaz. Közelebbről, a találmány szerinti fertilitás-helyreállító gén a „TA29-barstar”.

Egy rekombináns-DNS-molekula növényi genomba történő inkorporációja jellemzően sejt- vagy szövettranszformáció (vagy egyéb genetikai manipuláció) eredménye. Az inkorporáció helye vagy véletlenszerű, vagy (célzott integráció alkalmazásakor) előre meghatározott.

Az idegen DNS a rekombináns-DNS-molekula növényi genomba történt inkorporációjának helyével és annak konfigurációval jellemezhető. A rekombinánsDNS-molekula növényi genombeli inszerciójának helyét „inszerciós helynek vagy „célhelynek” nevezzük. A transzgén növényi genomba történő inszertálása együtt járhat a növényi DNS deléciójával is, ezt „célhelydeléciónak” nevezzük. „Szegélyezőrégió’' vagy „szegélyezőszekvencia” alatt a növényi genomnak az idegen DNS-től közvetlenül 5’-irányban elhelyezkedő és azzal egybefüggő, vagy az idegen DNS-től közvetlenül 3'-irányban elhelyezkedő és azzal egybefüggő, legalább 20 bp-os, előnyösen legalább 50 bp-os és 5000 bp-nál nem nagyobb szekvenciáját értjük. Az idegen DNS véletlenszerű integrációját eredményező transzformációs eljárások eltérő, jellegzetesen egyedi szegélyezőrégiókkal rendelkező transzformánsokat hoznak létre. Ha hagyományos keresztezéssel kerül sor a transzgén növénybe juttatására, annak növénygenombeli inszerciós helye vagy szegélyezőrégiói általában nem változnak meg. „Inszerciós régió alatt a (nem transzformált) növényi genomban egy transzgén 5' és 3’ szegélyezőrégiói által behatárolt, az inszerciós helyet (és esetleg célhelydeléciót) tartalmazó, legalább 40 bp-os, előnyösen legalább 100 bp-os, és akár 10 000 bp-nál is nagyobb régiót értünk. Az egy fajon belüli mutációk következtében kialakuló apró különbségek figyelembevételével egy inszerciós régió egy faj adott növényében található idegen DNS 5’ és 3’ szegélyezőrégióit tartalmazó szekvenciával legalább 85%-os, előnyösen 90%-os, előnyösebben 95%-os, legelőnyösebben pedig 100%-os szekvenciaazonosságot mutat.

Egy kérdéses gén expressziója azt jelenti, hogy a transzformáció során alkalmazott rekombináns-DNSmolekula (a transzformáló DNS) beépítése a [kérdéses gén(ek) egy részének vagy egészének szerkezete és funkciója alapján] kialakítani szándékozott egy vagy több fenotípusos tulajdonsággal (például herbicidtoleranciával) ruházta fel a növényt.

„Esemény” alatt (mesterséges) génlokuszt értünk, amely genetikai manipuláció eredményeként a kérdéses gének legalább egy másolatát tartalmazó idegen DNS-t hordoz. Egy esemény jellemző allélállapotai az idegen DNS jelenlétét vagy hiányát jelentik. A találmány szerinti megoldásban „MS”-esemény és „RF”-esemény alatt a „TA29-bamáz” és a „TA29-barstar” transzgéneket tartalmazó eseményeket értjük. Egy eseményt fenotípusosan egy vagy több transzgén expressziója jellemez. Génszinten az esemény egy növény génkészletének részét képezi. Molekuláris szinten az esemény a restrikciós térképpel és/vagy a transzgén 5’ és/vagy 3’ szegélyezőszekvenciáival és/vagy a transzgén molekuláris konfigurációjával jellemezhető. Egy növény legalább egy kérdéses gént tartalmazó transzformáló DNS-sel történő transzformálása általában számos egyedi eseményt eredményez.

A találmány szerinti megoldásban az ugyanazon transzformáló DNS-sel végzett transzformációval vagy az ily módon nyert növények visszakeresztezésével kapott események közül azokat nevezzük „elit ese7

HU 225 433 Β1 mény”-nek, amelyeknél a transzgén expressziója és stabilitása megfelelő, valamint a transzgén jelenléte összeegyeztethető az azt tartalmazó növény optimális agronómiái tulajdonságaival. Az elit esemény a következők közül egy vagy több, előnyösen kettő vagy több, még előnyösebben mindegyik kritériumnak megfelel:

a) a transzgén jelenléte nem befolyásolja kedvezőtlenül a növény egyéb előnyös, például agronómiái teljesítménnyel vagy kereskedelmi értékkel kapcsolatos tulajdonságait;

b) az esemény jól meghatározható, stabilan öröklődő molekuláris konfigurációval jellemezhető, amely azonosságának ellenőrzésére megfelelő diagnosztikai eszközök állíthatók elő;

c) a transzgénbeli kérdéses gén(ek) az esemény heterozigóta (vagy hemizigóta) és homozigóta alakjában egyaránt szabályos, megfelelő helyen és időben történő, az eseményt hordozó növény megszokott mezőgazdasági alkalmazása során valószínűleg előforduló környezeti feltételek között kereskedelmi szempontból elfogadható mértékű stabil fenotípusos expressziét mutatnak.

Előnyös, ha az idegen DNS a növényi genom olyan pozíciójában fordul elő, amely lehetővé teszi a kereskedelmi forgalomban elérhető, kívánt génösszetételű növénybe történő introgressziót.

Az esemény „elit” volta az alapján állapítható meg, hogy az esemény különböző, adott szempontból lényeges génösszetételű növényekbe történő introgressziójának eredménye megfelel-e az idevonatkozó egy, kettő vagy három kritériumnak, például a fenti a), b) és c) pontokban felsoroltaknak.

Mindemellett a találmány szerinti, hímsterilitást és fertilitás-helyreállítást kódoló transzgének esetében az elit esemény kiválasztása függ az események kompatibilitásától is, vagyis attól, hogy egy hímsterilitás-eseményt és egy fertilitás-helyreállító eseményt tartalmazó növény keresztezéséből származó, mindkét eseményt hordozó utódnövény rendelkezik-e a következő jellemzőkkel:

a) a helyreállított fertilitású fenotípus (vagyis a hímivarú fertilitás) megfelelő mértékű fenotípusos expressziója; és

b) a két eseményt hordozó növény megszokott mezőgazdasági alkalmazása során valószínűleg előforduló környezeti feltételek közötti, kereskedelmi szempontból elfogadható mértékű stabil fenotípusos expresszié.

„Elit esemény” kifejezés alatt tehát a fenti kritériumoknak megfelelő, transzgént tartalmazó génlokuszt értjük. Egy növény, növényi anyag, vagy növényutód, például mag egy vagy több elit eseményt tartalmazhat genomjában.

Az elit esemény, vagy az elit eseményt tartalmazó növény vagy növényi anyag azonosítására kifejlesztett „diagnosztikai eszközök az elit esemény specifikus genomi jellemzőin, például az idegen DNS-t tartalmazó genomi régió specifikus restrikciós térképén és/vagy a transzgén szegélyezőrégiójának/régióinak szekvenciáján alapulnak. „Restrikciós térkép” alatt növényi genomi DNS meghatározott restrikciós enzimmel vagy enzimsorozattal végzett hasításával és a transzgénnel szekvenciahasonlóságot mutató próbával standard sztringensségű körülmények között végzett hibridizációjával nyert Southern-blot-mintázatokat értünk. Standard sztringensségű körülményeknek tekintjük a találmány szerinti hibridizációs körülményeket vagy a Sambrook és munkatársai által leírt hagyományos hibridizációs körülményeket [Sambrook és munkatársai: „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2. kiadás, kiad.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)]. A standard sztringensségű körülmények között végzett hibridizáció például a következő lépésekből állhat: 1. növényi genomi fragmensek szűrőre rögzítése, 2. a szűrő előhibridizálása 50%-os formamid, 5*SSPE, 2*Denhardt-reagens és 0,1% SDS oldatában 42 °C-on 1-2 órán át vagy 6X SSC, 2*Denhardt-reagens és 0,1% SDS oldatában 68 °C-on 1-2 órán át, 3. a jelzett hibridizációs próba hozzáadása, 4. 16-24 órás inkubálás, 5. a szűrő mosása 1X SSC, 0,1% SDS oldatban szobahőmérsékleten 20 percig, 6. a filter mosása három alkalommal 0,2*SSC, 0,1% SDS oldatban 68 °C-on, alkalmanként 20 percig, 7. erősítőernyő alkalmazásával röntgenfilm exponálása a szűrővel -70 °C-on 24-48 órán keresztül.

Az egy növény genomjában az idegen DNS inkorporálását megelőzően jelen lévő (endogén) restrikciós helyeknek köszönhetően az idegen DNS inszerciója megváltoztatja az adott genom specifikus restrikciós térképét. Ennek megfelelően egy adott transzformáns vagy annak utóda egy vagy több specifikus restrikciós mintázat alapjáén azonosítható. Egy esemény restrikciós térképének meghatározására alkalmas feltételeket a „restrikcióstérkép-azonosítási protokoll” tartalmazza. Más módon, amennyiben megtörtént a transzgén egyik vagy mindkét szegélyezőrégiójának szekvenálása, olyan PCR-próbák állíthatók elő, amelyek egy „PCR azonosítási eljárásinak megfelelően specifikusan felismerik ezt a szekvenciát vagy ezeket a szekvenciákat. Az elit eseményt tartalmazó növény vagy növényi anyag az említett specifikus láncindítók PCR azonosítási eljárásnak megfelelő alkalmazásával azonosítható.

„Biológiai minta” alatt növényből, növényi anyagból vagy növényi anyagot tartalmazó termékből származó mintát értünk. „Növény” alatt WOSR növény (Brassica napus) bármely érési fázisban lévő szövetét, valamint ilyen növényből nyert vagy belőle származó bármely sejtet, szövetet vagy szervet, így többek között, de nem kizárólag magot, levelet, szárat, virágot, gyökeret, egyedi sejtet, ivarsejtet, sejttenyészetet, szövettenyészetet vagy protoplasztot értünk. A „növényi anyag” megnevezés a találmány szerinti megoldásban növényből kinyert vagy belőle származó anyagot jelent. A növényi anyagot tartalmazó termék olyan élelmiszer, állati takarmány vagy egyéb termék, amelynek előállítása növényi anyag felhasználásával történt, vagy amelyet növényi anyag szennyezhet. A találmány szerinti megoldással összefüggésben az említett biológiai minták MS-BN1- és/vagy RF-BN1-specifikus nukleinsavak jelenlétére történő vizsgálatára kerül sor, ami feltételezi a minta nukleinsavtartalmát. Ennek megfele8

HU 225 433 Β1 lően az MS-BN1 és/vagy RF-BN1 elit események biológiai mintákból történő kimutatására szolgáló találmány szerinti eljárások előnyösen az elit eseményt tartalmazó nukleinsavak biológiai mintákból történő kimutatására vonatkoznak.

A találmány szerinti megoldásban „reagenskészlet” alatt a találmány szerinti eljárás megvalósítására, közelebbről az MS-BN1 és/vagy RF-BN1 elit események biológiai mintákból történő kimutatására szolgáló reagensek sorozatát értjük. Még közelebbről, a találmány szerinti reagenskészlet egy előnyös megvalósítási módja legalább egy vagy kettő, a fentieknek megfelelő specifikus láncindítót tartalmaz. Adott esetben a reagenskészlet ezenkívül tartalmazhat bármely egyéb, a találmány szerinti PCR azonosítási eljárásban bemutatott reagenst is. Alternatív módon, a találmány egy másik megvalósítási módjában a reagenskészlet az MS-BN1 és/vagy az RF-BN1 biológiai mintabeli nukleinsavban való jelenlétének kimutatása érdekében a nukleinsawal specifikusan hibridizáló, a fentiekben ismertetett specifikus próbát is tartalmazhat. Adott esetben a reagenskészlet ezenkívül tartalmazhat az MS-BN1 és/vagy az RF-BN1 biológiai mintából történő, a specifikus próbával végzett kimutatására alkalmas bármely egyéb reagenst (például de nem kizárólag hibridizálópuffert, jelzőanyagot) is.

A találmány szerinti reagenskészlet minőség-ellenőrzési célokra (például vetőmagtételek tisztaságának ellenőrzésére), továbbá elit esemény növényi anyagbeli vagy növényi anyagot tartalmazó vagy abból származó anyagbeli, például de nem kizárólag élelmiszer-termékbeli vagy állati takarmánybeli jelenlétének kimutatására Is igénybe vehető, ekkor összetevői az adott célnak megfelelően specifikusan módosíthatók.

A találmány tárgyát MS-BN1 és RF-BN1 elit események WOSR-beli kialakítása, az említett eseményeket tartalmazó növények, a növények keresztezéséből származó utódok, valamint az eseményekből származó növényi sejtek vagy növényi anyag képezi. Az MS-BN1 elit eseményt tartalmazó növények előállítása az 1. példában leírt módon, pTHW107-tel végzett transzformálással történt. Az RF-BN1 elit eseményt tartalmazó növények előállítása a szintén az 1. példában leírt módon, pTHW118-cal végzett transzformálással történt.

Az MS-BN1 elit esemény előállítására igénybe vett rekombináns-DNS-molekula szelektíven tapetumsejtbeli expressziót vezérlő („TA29-barnáz”) promoter szabályozása alatt álló, barnáz-molekulát kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz. A TA29 promoter olajrepcében tapetumspecifikus expressziós mintázatot mutat [De Block és Debrouwer: Planta 189, 218 (1993)]. WOSR növényekben a TA29-barnáz gén expressziója a tapetum pusztulását okozza, ami a növények hímsterilitásához vezet [Marianai és munkatársai lásd fentebb (1990)]. Az RF-BN1 elit esemény előállítására igénybe vett rekombináns-DNS-molekula szelektíven tapetumsejtbeli expressziót vezérlő („TA29-barstar”) promoter szabályozása alatt álló, barstar-molekulát kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz. WOSR növényekben a TA29-barstar gén expressziója a TA29-barnáz gén növénybeli jelenlétében megakadályozza a barnáz tapetumsejtekbeli aktivitását és a tapetum pusztulását, helyreállítva ezáltal a növény fertilitását [Marianai és munkatársai lásd fentebb (1992)].

Az MS-BN1 és az RF-BN1 elit események előállítására igénybe vett rekombináns-DNS-molekulák a fentiek mellett foszfinotricin-acetil-transzferáz enzimet kódoló DNS-szekvenciát és karfiol-mozaikvírus 35S promotert tartalmaznak. A foszfinotricin-acetil-transzferáz enzimet kódoló szekvencia a („35S-bar”-nak nevezett) 35S promoter szabályozása alatt áll. A 35S promoter olajrepcében konstitutív expressziós mintázattal rendelkezik, vagyis a legtöbb sejttípusban, a növény életciklusának túlnyomó részében lényeges mértékben expresszálódik. A 35S-bar gén olajrepcebeli expressziója foszfinotricin vagy bialafosz vagy glüfozinát elnevezésű herbicid vegyületekkel, általánosabban glutaminszintetáz-gátlókkal vagy azok sóival vagy optikai izomereivel szemben rezisztenssé teszi a növényt.

Az MS-BN1-et tartalmazó WOSR növények vagy növényi anyagok az 5. példában az MS-BN1-gyel kapcsolatban bemutatott restrikcióstérkép-azonosltási protokollnak megfelelően azonosíthatók. Röviden összefoglalva, WOSR genomi DNS-t az EcoRI, EcoRV, Ndel, Hpal és Afllll közül kiválasztott restrikciós enzimekkel (előnyösen 2-5 enzimmel) emésztünk, majd nejlonmembránra visszük és a pTHW107 plazmid (vagy az abban található T-DNS) 3942 bp-os Hind/// fragmensével hibridizáljuk. Ezután mindegyik alkalmazott restrikciós enzim esetében megállapítjuk, hogy azonosíthatók-e a következő fragmensek:

EcoRI: egy 2140 és egy 2450 bp közötti nagyságú, előnyösen mintegy 2266 bp-os fragmens és egy 14 000 bp-osnál nagyobb fragmens;

EcoRV: egy 1159 és 1700 bp közötti nagyságú, előnyösen mintegy 1400 bp-os fragmens és egy 14 000 bp-osnál nagyobb fragmens;

Hpal: egy 1986 és 2140 bp közötti nagyságú, előnyösen mintegy 1990 bp-os fragmens és egy 2140 és 2450 bp közötti nagyságú, előnyösen mintegy 2229 bp-os fragmens;

Afllll: egy 514 és 805 bp közötti nagyságú, előnyösen mintegy 522 bp-os fragmens, egy 2140 és 2450 bp közötti nagyságú, előnyösen mintegy 2250 bp-os fragmens, valamint egy 2450 és 2838 bp közötti nagyságú, előnyösen mintegy 2477 bp-os fragmens;

Ndel: 5077 és 14 057 bp közötti nagyságú fragmensek, amelyek egyike előnyösen mintegy 6500 bp-os, a másik pedig mintegy 10 000 bp-os.

A DNS-fragmensek nagysága ismert nagyságú DNS-fragmensek, például a lambda-fág-DNS Psfl-fragmenseinek sorozatával történő összehasonlítással határozható meg. A 14 000 bp-nál nagyobb fragmens becsült nagysága a Dellaporta és munkatársai eljárása szerint végzett DNS-kivonás esetén 14 000 bp és 40 000 bp közötti [Dellaporta és munkatársai: Plánt Molecular Biology Reporter 3, 19 (1983)].

Amennyiben a növényi anyag legalább kettő, előnyösen legalább három, közelebbről négy, még közelebbről az összes említett restrikciós enzimmel végzett

HU 225 433 Β1 emésztése a fentiekben meghatározott nagyságú DNS-fragmenseket eredményezi, akkor a WOSR növény az MS-BN1 elit eseményt hordozza.

Az MS-BN1-et tartalmazó növények vagy növényi anyagok az 5. példában az MS-BN 1-gyel kapcsolatban bemutatott PCR azonosítási eljárás segítségével is azonosíthatók. Röviden összefoglalva, a WOSR genomi DNS-t az MS-BN1 egy szegélyezőszekvenciáját előnyösen az MS-BN 1 találmány szerinti 5’ vagy 3’ szegélyezőszekvenciáját specifikusan felismerő láncindító, közelebbről a 19. azonosító számú szekvenciának megfelelő láncindító, valamint egy transzgénbeli szekvenciát felismerő láncindító, közelebbről a 12. azonosító számú szekvenciának megfelelő láncindító alkalmazásával PCR-amplifikáljuk. Kontrollként endogén WOSR láncindítókat alkalmazunk. Ha a növényi anyagból 260 és 300 bp közötti nagyságú, előnyösen mintegy 280 bp-os fragmenst nyerünk, akkor a WOSR növény az MS-BN1 elit eseményt hordozza.

Az MS-BN1-et hordozó növények fenotípusosan hímsterilek, amennyiben genomjuk nem tartalmaz fertilitás-helyreállító gént. A hímsteril növény fertilis, életképes pollen termelésére alkalmatlan.

MS-BN1-et tartalmazó növények nyerhetők például az ATCC-nél PTA-730 deponálási szám alatt letétbe helyezett MS-BN 1-tartalmú magokból. Az ilyen növények továbbszaporításával a találmány szerinti elit esemény ugyanazon növényfaj különféle nemesített formáiba („cultivars) is bejuttatható.

Az RF-BN1-et tartalmazó WOSR növények vagy növényi anyagok az 5. példában az RF-BN 1-gyel kapcsolatban bemutatott restrikcióstérkép-azonosítási protokollnak megfelelően azonosíthatók. Röviden összefoglalva, WOSR genomi DNS-t a BamH\, EcoR\, EcoRV és H/ndlII közül kiválasztott restrikciós enzimekkel (előnyösen 2-4 enzimmel) emésztünk, majd nejlonmembránra visszük és a pTHW118 plazmid (vagy az abban található T-DNS) 2182 bp-os Hpa\ fragmensével hibridizáljuk. Ezután mindegyik alkalmazott restrikciós enzim esetében megállapítjuk, hogy azonosíthatók-e a következő fragmensek:

BamH\·. egy 805 és 1099 bp közötti nagyságú, előnyösen mintegy 814 bp-os fragmens, egy 1700 és 1986 bp közötti nagyságú, előnyösen mintegy 1849 bp-os fragmens, egy 2450 és 2838 bp közötti nagyságú, előnyösen mintegy 2607 bp-os fragmens, valamint egy 5077 és 14 057 bp közötti nagyságú, előnyösen mintegy 6500 bp-os fragmens;

EcoR\: egy 805 és 1159 bp közötti nagyságú, előnyösen mintegy 1094 bp-os fragmens, egy 1986 és 2450 bp közötti nagyságú, előnyösen mintegy 2149 bp-os fragmens, valamint két 5077 és 14 057 bp közötti nagyságú fragmens, amelyek közül az egyik előnyösen mintegy 7000 bp-os, a másik pedig mintegy 10 000 bp-os;

EcoRV: két 5077 és 14 057 bp közötti nagyságú fragmens, amelyek közül az egyik előnyösen mintegy 5400 bp-os, a másik pedig mintegy 8000 bp-os;

H/ndlll: egy 1700 és 1986 bp közötti nagyságú, előnyösen mintegy 1969 bp-os fragmens, és két 2450 és

2838 bp közötti nagyságú fragmens, amelyek közül az egyik előnyösen mintegy 2565 bp-os, a másik pedig mintegy 2635 bp-os.

A DNS-fragmensek nagysága ismert nagyságú DNS-fragmensek, például a lambda-fág-DNS Psfl-fragmenseinek sorozatával történő összehasonlítással határozható meg.

Amennyiben a növényi anyag legalább kettő, előnyösen legalább három, közelebbről az összes említett restrikciós enzimmel végzett emésztése a fentiekben meghatározott nagyságú DNS-fragmenseket eredményezi, akkor a WOSR növény az RF-BN1 elit eseményt hordozza.

Az RF-BN1-et tartalmazó növények vagy növényi anyagok az 5. példában az RF-BN1-gyel kapcsolatban bemutatott PCR azonosítási eljárás segítségével is azonosíthatók. Röviden összefoglalva, a WOSR genomi DNS-t az RF-BN 1 egy szegélyezőszekvenciáját, előnyösen az RF-BN1 találmány szerinti 5’ vagy 3’ szegélyezőszekvenciáját specifikusan felismerő láncindító, közelebbről a 41. azonosító számú szekvenciának megfelelő láncindító, valamint egy transzgénbeli szekvenciát felismerő láncindító, közelebbről a 23. azonosító számú szekvenciának megfelelő láncindító alkalmazásával PCR-amplifikáljuk. Kontrollként endogén WOSR láncindítókat alkalmazunk. Ha a növényi anyagból 195 és 235 bp közötti nagyságú, előnyösen mintegy 215 bp-os fragmenst nyerünk, akkor a WOSR növény az RF-BN 1 elit eseményt hordozza.

Az RF-BN 1-et hordozó növények tapetumának sejtjeiben barstar expresszálódik. A növény tapetumában bekövetkező barstartermelődésről kimutatták, hogy sem pozitív, sem negatív hatása nincs a pollenképződésre [Mariani és munkatársai (1992)]. (gy ha a növény genomjában nincs hímsterilitásgén, a TA29-barstar gén nem okoz észrevehető fenotfpusbeli változást. Amennyiben a növény genomjában hímsterilitásgént hordoz, a TA29-barstar gén jelenléte helyreállított fertilitású, vagyis fertilis fenotípust eredményez. A helyreállított fertilitású fenotípussal rendelkező növény egy hímsterilitásgén genombeli jelenléte ellenére alkalmas fertilis, életképes pollen termelésére.

RF-BN 1-et tartalmazó növények nyerhetők például az ATCC-nél PTA-730 deponálási szám alatt letétbe helyezett magokból. Az ilyen növények továbbszaporításával a találmány szerinti elit esemény ugyanazon növényfaj különféle nemesített formáiba („cultivars”) is bejuttatható.

Az MS-BN 1-et vagy RF-BN 1-et tartalmazó növények közös jellemzője a glufozináttolerancia, ami a találmány szerinti megoldásban a növények „Liberty™” herbiciddel szembeni toleranciáját jelenti. A „Liberty™ ”-vel szembeni tolerancia kritériuma, hogy a fenti szer legalább 200 g aktív hatóanyag/hektár, előnyösen 400 g aktív hatóanyag/hektár és legfeljebb 1600 g aktív hatóanyag/hektár mennyiségével bepermetezett 3-4 leveles (3V-4V) stádiumú növények nem pusztulnak el. Az MS-BN1-et vagy RF-BN1-et tartalmazó növények közös jellemzője továbbá, hogy sejtjeik10

HU 225 433 Β1 ben PAT vizsgálati eljárással kimutathatóan [De Block és munkatársai, lásd fentebb (1987)] foszfinotricin-acetil-transzferázt tartalmaznak.

A találmány szerinti WOSR növények hagyományos módon termeszthetők. A 35S-bar gén jelenléte miatt a növények glüfozináttoleránsak. Ennek köszönhetően a WOSR növények termesztésére használt földterületeken a gyomnövekedés aktív hatóanyagként glüfozinátot tartalmazó herbicidekkel (például „Liberty™”-vel) szabályozható.

Az MS-BN1-et és/vagy RF-BN1-et tartalmazó növények az USA-ban kereskedelmi forgalomban elérhető WOSR-változatokéval összehasonlítható agronómiái tulajdonságokkal rendelkeznek. Lényeges agronómiái jellemzők a növény magassága, a szalma erőssége/merevsége, a megdőlésre való hajlam, a télállóság, a pergésállóság, a szárazságtűrés, a megbetegedésekkel [a torzsarothadással („blackleg”), a világos levélfoltosodással („light leafspot”), a sclerotiniával)] szembeni ellenálló képesség, valamint a magtermelés és annak mennyisége.

Megfigyelték, hogy a találmány szerinti Brassica napus WOSR növény genomjának inszerciós régióiban, közelebbről a Brassica napus WOSR növény genomjának említett inszerciós helyein lévő idegen DNS rendkívül érdekes fenotipusos és molekuláris jellegzetességeket kölcsönöz a fenti eseményeket tartalmazó növényeknek. Közelebbről, az idegen DNS-nek a növények genomjának említett régióiban való jelenléte a transzgének stabil fenotipusos expresszióját idézi elő anélkül, hogy lényeges mértékben veszélyeztetné a növények kívánt agronómiái tulajdonságait, ezáltal hibrid WOSR előállítására különösen alkalmassá teszi azokat. Ez alapján a 22. azonosító számú szekvenciának és a 34. azonosító számú szekvenciának megfelelő inszerciós régiók, közelebbről azokon belül az MS-BN1 és az RF-BN1 inszerciós helyei különösen alkalmasak valamilyen szempontból fontos gén(ek) inszerciójára. Közelebbről, az MS-BN1 és az RF-BN1 inszerciós régiói (22. azonosító számú szekvencia, valamint 34. azonosító számú szekvencia), vagy azokon belül az MA-BN1 és az RF-BN1 inszerciós helyei különösen alkalmasak hlmsterilitást okozó gént, valamint fertilitás-helyreállitó gént magukban foglaló plazmidok beépítésére, mert egy növény agronómiái teljesítményének veszélyeztetése nélkül teszik lehetővé egyik vagy mindkét említett gén növénybeli optimális expresszióját.

Egy rekombináns-DNS-molekula adott inszerciós régióba történő specifikus inszertálására célzott inszerciós eljárások vehetők igénybe. Ezen, szakember számára jól ismert eljárások közé tartozik többek között a rekombináz enzimet, például, de nem kizárólag a Saccharomyces cerevisiae FLP rekombinázát (5527695 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat), az Escherichia coli CRE rekombinázát (WO 9109957 számú nemzetközi közzétételi irat), a Saccharomyces rouxii pSRI-ből származó rekombinázt [Araki és munkatársai: J. Mól. Bioi. 182, 191 (1985)] vagya lambda-fág rekombináns rendszert (4673640 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat) alkalmazó homológ rekombináció.

Nukleotidszekvenciákkal (DNS- vagy RNS-szekvenciákkal) kapcsolatban a találmány szerinti megoldásban „szekvenciaazonosság” alatt az azonos nukleotidokat tartalmazó pozíciók számának és a két szekvencia közül a rövidebb nukleotidjai számának hányadosát értjük. A két nukleotidszekvencia egymás alá rendezését 20 nukleotidos ablakméretet, 4 nukleotidos szóhosszt és hézagonként 4 büntetéspontot alkalmazva, Wilbur és Lipmann algoritmusa szerint végezzük [Wilbur és Lipmann (1983)]. A szekvenciaadatok számítógép-segített elemzése és értékelése, ideértve a fentiekben ismertetett szekvencia egymás alá rendezést is egyszerűen megvalósítható például az „Intelligenetics™” programcsomag (Intelligenetics Inc., CA) programjaival. A szekvenciákat alapvetően hasonlónak („essentially similar”) tekintjük, ha szekvenciaazonosságuk legalább mintegy 75%-os, közelebbről legalább mintegy 80%-os, még közelebbről legalább mintegy 85%-os, főként, ha mintegy 90%-os, különösen, ha mintegy 95%-os, még inkább különösen, ha mintegy 100%-os, és leginkább, ha azok teljesen azonosak. Egyértelmű, hogy ha egy RNS-szekvenciát egy DNS-szekvenciához alapvetően hasonlónak nevezünk, vagy azok bizonyos fokú szekvenciaazonosságáról beszélünk, akkor a DNS-szekvenciabeli timint (T) az RNS-szekvenciabeli uracillal (U) egyenértékűnek tekintjük.

A találmány szerinti megoldásban a „tartalmaz” kifejezés alatt az adott jellemzők, összességek, lépések vagy összetevők jelenlétét értjük, ami azonban nem zárja ki egy vagy több további jellemző, összesség, lépés vagy összetevő, vagy mindezek csoportjainak jelenlétét vagy hozzáadását. így például egy nukleotidvagy aminosavszekvenciát tartalmazó nukleinsav vagy protein a megnevezetteken kívül tartalmazhat további nukleotidokat vagy aminosavakat, vagyis helyeződhet egy nagyobb nukleinsavban vagy proteinben is. Egy funkcionálisan vagy szerkezetét tekintve meghatározott DNS-szekvenciát tartalmazó kiméragén tartalmazhat további DNS-szekvenciákat is stb.

A következő példák az MS-BN1 és RF-BN1 elit eseményeket tartalmazó WOSR növények előállítását és jellemzőit szemléltetik.

Ellenkező értelmű megjegyzés hiányában az összes rekombináns-DNS-technikát standard protokollok szerint végeztük [lásd például Sambrook és munkatársai: „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2. kiadás, kiad.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989) és Ausubel és munkatársai: „Current Protocols in Molecular Biology”, 1. és 2. kötet, kiad.: Current Protocols, USA (1994)]. Növényekkel kapcsolatos molekuláris biológiai kutatásokhoz szükséges standard anyagokat és eljárásokat ismertet például a Plánt Molecular Biology Labfax, szerk.: Cray, R. D. D., kiad.: BIOS Scientific Publications Ltd (UK) és Blackwell Scientific Publications (UK) (1993).

A találmány szerinti leírás és a példák a következő szekvenciákra vonatkozó utalásokat tartalmaznak:

HU 225 433 Β1

1. azonosító számú szekvencia	pTHW107jelű plazmid
2. azonosító számú szekvencia	PTHW118jelű plazmid
3. azonosító számú szekvencia	248-as láncindító
4. azonosító számú szekvencia	249-es láncindító
5. azonosító számú szekvencia	247-es láncindító
6. azonosító számú szekvencia	250-es láncindító
7. azonosító számú szekvencia	251-es láncindító
8. azonosító számú szekvencia	254-es láncindító
9. azonosító számú szekvencia	258-as láncindító
10. azonosító számú szekvencia	SP6-os láncindító
11. azonosító számú szekvencia	T7-es láncindító
12. azonosító számú szekvencia	201-es láncindító (BNA01)
13. azonosító számú szekvencia	az MS-BN1 5’ szegélyezőrégióját tartalmazó szekvencia
14. azonosító számú szekvencia	611-es láncindító
15. azonosító számú szekvencia	259-es láncindító
16. azonosító számú szekvencia	260-as láncindító
17. azonosító számú szekvencia	24-es láncindító
18. azonosító számú szekvencia	az MS-BN1 3’ szegélyezőrégióját tartalmazó szekvencia
19. azonosító számú szekvencia	51-es láncindító (BNA02)
20. azonosító számú szekvencia	48-as láncindító
21. azonosító számú szekvencia	az MS-BN1 célhelydelécióját tartalmazó szekvencia
22. azonosító számú szekvencia	MS-BN1 inszerciós régió
23. azonosító számú szekvencia	193-as láncindító (BNA03)
24. azonosító számú szekvencia	az RF-BN1 5' szegélyezőrégióját tartalmazó szekvencia
25. azonosító számú szekvencia	286-os láncindító
26. azonosító számú szekvencia	314-es láncindító
27. azonosító számú szekvencia	315-ös láncindító
28. azonosító számú szekvencia	316-os láncindító
29. azonosító számú szekvencia	288-as láncindító
30. azonosító számú szekvencia	az RF-BN1 3’ szegélyezőrégióját tartalmazó szekvencia
31. azonosító számú szekvencia	269-es láncindító
32. azonosító számú szekvencia	283-as láncindító
33. azonosító számú szekvencia	284-es láncindító
34. azonosító számú szekvencia	RF-BN1 integrációs régió
35. azonosító számú szekvencia	57-es láncindító
36. azonosító számú szekvencia	WOSR-ben az MS-BN1 5’ szegélyezőrégióját tartalmazó szekvencia
37. azonosító számú szekvencia	68-as láncindító
38. azonosító számú szekvencia	WOSR-ben az MS-BN1 3' szegélyezőrégióját tartalmazó szekvencia
39. azonosító számú szekvencia	WOSR-ben az MS-BN1 5’ szegélyezőrégióját tartalmazó szekvencia
40. azonosító számú szekvencia	WOSR-ben az MS-BN1 3’ szegélyezőrégióját tartalmazó szekvencia
41. azonosító számú szekvencia	268-as láncindító
42. azonosító számú szekvencia	BNA05-ÖS láncindító
43. azonosító számú szekvencia	BNA06-ÖS láncindító

HU 225 433 Β1

1. példa

Brassica napus transzformálása hímsterilitást okozó és fertilitás-helyreállító génnel

a) Tapetumspecifikus promoter (pTHW107) szabályozása alatt álló barnáz gént tartalmazó kiméra-DNS előállítása

A pTHW107 jelű plazmid (1. azonosító számú szekvencia) eredetileg a pGSV1 jelű köztes vektorból, az pedig a pGSC1700-ból származik [Cornelissen és Vandewielle (1989)]. A pGSV1 egy mesterséges T-régiót tartalmaz, amely pTiB6S3-eredetű TL-DNS bal és jobb oldali határolószekvenciáiból, valamint kiméragének T-DNS határismétlődések közé történő inszertálását lehetővé tevő, több kapcsolószekvenciás klónozó5 helyekből áll. A pGSV1 vektorplazmid váza E. coliban történő expresszióra szolgáló szabályozószignálokkal rendelkező barstar gént tartalmaz.

A pTHW107 határismétlődései közötti DNS részletes leírását az 1. táblázat tartalmazza.

1. táblázat

A pTHW107 plazmid T-DNS-e

Nukleotidpozlciók	Irányultság	Leírás és hivatkozások
1-25		A pTiB6S3 TL-DNS-ének jobb oldali határismétlődése [Gielen és munkatársai: The EMBO Journal 3, 835 (1984)].
26-97		Szintetikus többszörös kapcsolószekvencia-eredetű szekvenciák.
309-98	Óramutató járásával ellenkező	A pTiB6S3 TL-DNS 7. génjének 3’ nem transziáit vége (3’g7) [Velten és Schell: Nucleic Acids Research 13, 6981 (1985); Dhaese és munkatársai: The EMBO Journal 3, 835(1983)].
310-330		Szintetikus többszörös kapcsolószekvencia-eredetü szekvenciák.
882-331	Óramutató járásával ellenkező	A Streptomyces hygroscopicus bar génjének kódolószekvenciája [Thompson és munkatársai: The EMBO Journal 6, 2519 (1987)]. A vad típusú bar kódolórégió két N-terminális végkodonját ATG és GAC kodonokkal helyettesítettük.
2608-883	Óramutató járásával ellenkező	Az Arabidopsis thaliana atS1A ribulóz-1,5-bifoszfát-karboxiláz kis alegység génjének promotere (PssuAra) [Krebbers és munkatársai: Plánt Molecular Biology 11, 745(1988)].
2609-2658		Szintetikus többszörös kapcsolószekvencia-eredetü szekvenciák.
2919-2659	Óramutató járásával ellenkező	A pTÍT37 T-DNS-éből származó nopalin-szintáz gén 3’ nem transziáit végének (3’nos) növényi poliadenilációs szignálokat tartalmazó 260 bp-os Tagl-fragmense [Depicker és munkatársai: Journal of Molecular and Applied Genetics 1, 561 (1982)].
2920-3031		A B, amyloliquefaciens barnáz kódolószekvenciájától 3’-irányban elhelyezkedő 3’ nem transziáit régió.
3367-3032	Óramutató járásával ellenkező	A Bacillus amyloliquefaciens barnáz génjének kódolórégiója [Hartley: Journal of Molecular Biology 202, 913 (1988)].
4877-3368	Óramutató járásával ellenkező	A Nicotiana tabacum TA29 jelzésű portokspecifikus génjének promoterrégiója. A promoter a szekvencia ATG kezdőkodontól 5’-irányban helyeződő 1500 bp-os szakaszát tartalmazza [Seurinck és munkatársai: Nucleic Acids Research 18, 3403 (1990)].
4878-4921		Szintetikus többszörös kapcsolószekvencia-eredetü szekvenciák.
4922-4946		A pTiB6S3 TL-DNS-ének bal oldali határismétlődése [Gielen és munkatársai: The EMBO Journal 3, 835 (1984)].

HU 225 433 Β1

b) Konstitutív promoter (pTHW118) szabályozása alatt álló barstar gént tartalmazó kiméra-DNS előállítása

A pTHW118 jelű plazmid (2. azonosító számú szekvencia) eredetileg szintén a fentiekben ismertetett pGSV1 jelű köztes vektorból származott. A pTHW118 határismétlődései közötti DNS részletes leírását a 2. táblázat tartalmazza.

2. táblázat

A pTHW118 plazmid T-DNS-e

Nukleotidpozíciók	Irányultság	Leírás és hivatkozások
1-25		A pTiB6S3 TL-DNS-ének jobb oldali határismétlődése [Gielen és munkatársai: The EMBO Journal 3, 835 (1984)].
26-53		Szintetikus többszörös kapcsolószekvencia-eredetű szekvenciák.
54-90		Reziduális szekvencia a TL-DNS jobb oldali határismétlődéséből.
91-97		Szintetikus többszörös kapcsolószekvencia-eredetű szekvenciák.
309-98	Óramutató járásával ellenkező	A pTiB6S3 TL-DNS 7. génjének 3’ nem transziáit vége (3’g7) [Velten és Schell: Nucleic Acids Research 13, 6981 (1985); Dhaese és munkatársai: The EMBO Journal 3, 835 (1983)].
310-330		Szintetikus többszörös kapcsolószekvencia-eredetű szekvenciák.
883-331	Óramutató járásával ellenkező	A Streptomyces hygroscopicus bialafosz rezisztencia (bar) génjének kódolószekvenciája [Thompson és munkatársai: The EMBO Journal 6, 2519 (1987)]. A vad típusú bar kódolórégió két N-terminális végkodonját ATG és GAC kodonokkal helyettesítettük.
2608-883	Óramutató járásával ellenkező	Az Arabidopsis thaliana atS1A ribulóz-1,5-bifoszfát-karboxiláz kis alegység génjének promotere (PssuAra) [Krebbers és munkatársai: Plánt Molecular Biology 11, 745(1988)].
2609-2658		Szintetikus többszörös kapcsolószekvencia-eredetű szekvenciák.
2919-2659	Óramutató járásával ellenkező	A pTiT37 T-DNS-éből származó nopalin-szintáz gén 3’ nem transziáit végének (3’nos) növényi poliadenilációs szignálokat tartalmazó 260 bp-os Tagl-fragmense [Depicker és munkatársai: Journal of Molecular and Applied Genetics 1, 561 (1982)].
2920-2940		Szintetikus többszörös kapcsolószekvencia-eredetű szekvenciák.
2941-2980		A Bacillus amyloliquefaciens barstar kódolószekvenciájától 3’-irányban elhelyezkedő 3’ nem transziáit régió.
3253-2981	Óramutató járásával ellenkező	A Bacillus amyloliquefaciens barstar génjének kódolórégiója [Hartley: Journal of Molecular Biology 202, 913 (1988)].
4762-3254	Óramutató járásával ellenkező	A Nicotiana tabacum TA29 jelzésű portokspecifikus génjének promoterrégiója. A promoter a szekvencia ATG kezdőkodontól 5’-irányban helyeződő 1500 bp-os szakaszát tartalmazza [Seurinck és munkatársai: Nucleic Acids Research 18, 3403 (1990)].
4763—4807		Szintetikus többszörös kapcsolószekvencia-eredetű szekvenciák.
4808-4832		A pTiB6S3 TL-DNS-ének bal oldali határismétlődése [Gielen és munkatársai: The EMBO Journal 3, 835 (1984)].

HU 225 433 Β1

c) Brassica napus transzformációja

A Brassica napus transzformálására a Deblare és munkatársai (1985, 1987) által leírt vektorrendszert vettük igénybe. A vektorrendszer Agrobacterium törzset és két plazmidösszetevőt tartalmaz: 1. egy nem onkogén Ti-plazmidot (pGV4000) és 2. egy pGSV1 plazmidon alapuló köztes klónozóvektort. A T-régió nélküli nem onkogén Ti-plazmid került hordozza a második plazmidba klónozott mesterséges T-DNS növénygenomba történő átviteléhez szükséges a vir géneket. Az említett összetevők háromszülős párosításából származó Agrobacterium törzsek növények transzformációjára alkalmazhatók.

A szelekciót a növénykék regenerációjának kivételével mindegyik fejlődési fázisban foszfinotricin (PPT) jelenlétében végeztük. A növénykék regenerációját növekedésük elősegítése érdekében PPT hiányában folytattuk. Az említett folyamat eredményeként elsődleges transzformánssorozatot nyertünk (T_o növénygeneráció).

2. példa

Események kialakítása

2.1. A transzgenikus események jellemzése

2.1.1. MS-események Southern-blot-elemzése

A transzgén jelenlétét és a géninszerciók számát standard Southern-blot-elemzéssel ellenőriztük. Egy gramm hajtásszövetből Dellaporta vagy Doyle és munkatársai eljárása szerint [Dellaporta: Plánt Molecular Biology Reporter, 3, 19 (1983); Doyle és munkatársai: Phytocem. Bull. 19, 11 (1987)] összes genomi DNS-t vontunk ki, majd azt Sacl restrikciós enzimmel emésztettük. A Sacl egy, a T-DNS-fragmensen belül a barnáz- és bar-szerkezetek között helyeződő egyedi restrikciós hellyel rendelkezik. A Southern-elemzést a következő próbák alkalmazásával végeztük:

„barnáz”-próba: a pVE113 jelű plazmid 478 bp-os Psti-EcoRI fragmense, „bar-próba: a pDE110 jelű plazmid 546 bp-os Λ/col-Sg/ll fragmense.

A pVe113 és a pDE110 jelű plazmidok leírását az 1. ábra, valamint a WO 92/09696 számú nemzetközi közzétételi irat ismerteti. Az MS események barnázpróbával történt hibridizációja 12 000 bp-os csíkot, bar-próbával végzett hibridizációja pedig 14 000 bp-os fragmenst eredményezett. A csíkok relatív erőssége a növények transzgenikus lokuszra vonatkozó homovagy hemizigótaságára utalt. Szimpla inszerciót két esemény tartalmazott. Ezt az is megerősítette, hogy a transzgén szegregációs mintázata megfelelt egy szimpla lokusz Mendel-féle öröklésmenetének.

2.1.2. RF-események Southern-blot-elemzése

A transzgén jelenlétét és a géninszerciók számát standard Southern-blot-elemzéssel ellenőriztük. Egy gramm hajtásszövetből Doyle és munkatársai eljárása szerint [Doyle és munkatársai: Phytocem. Bull. 19, 11 (1987)] összes genomi DNS-t vontunk ki, majd azt Sacl restrikciós enzimmel emésztettük. A Sacl egy, a T-DNS-fragmensen belül a barnáz- és bar-szerkezetek között helyeződő egyedi restrikciós hellyel rendelkezik.

A Southern-elemzést a következő próbák alkalmazásával végeztük:

„barstar”-próba: a pVE113 jelű plazmid 436 bp-os Hind\\\-Psti fragmense, „bar”-próba: a pDE110 jelű plazmid 546 bp-os Ncol-Bglll fragmense.

Az RF-események barstar-próbával történt hibridizációja 3000 bp-os csíkot, bar-próbával végzett hibridizációja pedig 14 000 bp-os fragmenst eredményezett. A csíkok relatív erőssége a növények transzgenikus lokuszra vonatkozó homo- vagy hemizigótaságára utalt. Számos esemény tartalmazott szimpla inszerciót. Ezt az is megerősítette, hogy a transzgén szegregációs mintázata megfelelt egy szimpla lokusz Mendel-féle öröklésmenetének.

2.1.3. A növények általános fenotípusa és agronómiái teljesítménye

Az MS- és RF-eseményeket tartalmazó T-ι növényeket számos fenotípusos jellemző szempontjából értékeltük, ilyenek voltak például a növény magassága, a szalma erőssége/merevsége, a megdőlésre való hajlam, a pergésállóság, a szárazságtűrés, a megbetegedésekkel [a torzsarothadással („blackleg”), a világos levélfoltosodással („light leafspot”), a sclerotiniával)] szembeni ellenálló képesség, valamint a magtermelés és annak mennyisége.

Az értékelt vonalak a nem transzformált változathoz és több nemesített olajrepcéhez hasonló (vagy jobb) agronómiái tulajdonságokkal rendelkeztek. Bizonyos eseményekben a növények a fent említett tulajdonságok közül egy vagy több szempontjából szomatikus variánsokra különültek el. Amennyiben ez nem járt kereskedelmi szempontból értékes fenotípusos tulajdonság kialakulásával, az említett növényeket kiselejteztük.

2.2. Az MS- vagy RF-tulajdonságokat hordozó vonalak kialakítása

A szövettenyészetből származó különböző hemizigóta T_o növénykéket („Ms/- vagy „Rf/-”) üvegházi talajba ültettük át. A transzgén jelenlétét és másolatszámát Southern-blot-elemzéssel ellenőriztük (lásd fentebb). Lehetővé tettük növények virágzását, majd elbíráltuk a virágok sterilitását vagy fertilitását. A T_o növények vad típusú (-/-) növényekkel történő keresztezésével T·] magokat (MsT1 és RfT1) állítottunk elő. A T-, magokat elültettük, majd a növényeket üvegházban neveltük. Megvizsgáltuk a növények glüfozinát-ammóniummal szembeni toleranciáját. Az Ms-T1 (nem permetezett) növényeket sterilitás/fertilitás szegregáció, míg az Rf-T1 növényeket fertilis virágok jelenléte szempontjából vizsgáltuk.

A transzgént tartalmazó Ms-T 1 növények fertilitáshelyreállító génre homozigóta (Rf/Rf) tesztnövénnyel történő keresztezésével MsRf-F1 magvakat állítottunk elő. Ezeket a magvakat (Ms/-, Rf/- és -/-, Rf/—) üvegházban elültettük, majd „Liberty™-vel permeteztük. A megmaradt F1 utódok fertilítás/sterilítás szegregációjának vizsgálatával megállapítottuk, hogy sikerült-e Brassica napus esetében megszüntetni a hímsterilitást (sikerült-e 100% körüli fertilitást elérni).

HU 225 433 Β1

További vizsgálatok céljából kiválogattuk a legjobb eseményeket. Az Ms-T1 növényeket homozigóta fertilitás-helyreállító növénnyel kereszteztük, majd a magokat szántóföldön elvetettük. A növényeket „Liberty™” herbiciddel szembeni tolerancia (800 g aktív hatóanyag/hektár adagban, a termelőknek ajánlott felhasználási dózis 400 g aktív hatóanyag/hektár), fertilitás/sterilitás szegregáció és általános fenotípusos jellemzők szempontjából vizsgáltuk. Azokat a növényeket szelektáltuk, amelyek esetében a fertilitás 100%ban helyreállt, és ez a vad típusú izogenikus kontrolihoz képest nem ment a fenotípus vagy az agronómiái teljesítmény [részletesebben lásd a d) pont alatt] rovására.

A transzgént tartalmazó Rf-T 1 növények hímsterilitásgént hordozó (Ms/-) tesztnövénnyel történő keresztezésével F1 magvakat állítottunk elő. Ezeket a magvakat üvegházban elültettük, „Liberty™-vel permeteztük, majd értékeltük a fertilitás (100%-hoz közeli) helyreállítását.

Időközben Rf-T1 növények öntermékenyítésével S1 növényeket állítottunk elő. Az S1 növényeket üvegházban neveltük, „Liberty™”-vel permeteztük, majd ismételt öntermékenyítésükkel S2 növényeket állítottunk elő, amelyek közül homozigóta egyedeket szelektáltunk.

2.3. MS- és RF-események kombinálása

A fertilitás helyreállításának vizsgálata érdekében a kiválasztott Ms-T1 növényeket a kiválasztott Rf-S2 eseményekkel üvegházban kereszteztük. Az így nyert magokat is üvegházban ültettük el, a növényeket „Liberty™”-vel permeteztük, majd ellenőriztük a virágok fertilitását.

2.4. MS- és RF-események vizsgálata különféle génösszetételű növényekben és különböző termőhelyeken

A kiválasztott eseményeket két különféle génösszetételű, heterotikusan eltérő növénybe juttattuk annak bizonyítása érdekében, hogy az MS- és az RFesemények megfelelően működnek és egyik génösszetétel esetében sincsenek negatív hatással a termésmennyiségre vagy -minőségre.

Ezzel egy időben a környezet és az MS- vagy RFesemény közötti negatív kölcsönhatás kizárása érdekében a kiválasztott MS- és RF-eseményeket 4-5 különféle környezetben teszteltük.

A következő lépcsőben a kiválasztott MS- és RFesemények alkalmazásával történő hibrid vetőmagtermelést vizsgáltuk szántóföldi körülmények között. Az eredeti és két különböző, heterotikusan eltérő génösszetételű növénybeli kiválasztott MS-eseményt az eredeti és két különböző, heterotikusan eltérő génösszetételű növénybeli kiválasztott RF-eseménnyel kereszteztük. Az így nyert F1 hibridet „Liberty™”-vel szembeni rezisztencia, fertilitás és általános agronómiái teljesítmény (termésmennyiség és -minőség) szempontjából vizsgáltuk.

2.5. Elit események szelekciója

A transzgenikus MS-vonalak kialakítása során a fentiek szerint végzett szelekcióval számos, optimális transzgénexpressziót mutató, vagyis glüfozinát-ammóniummal szemben rezisztens, hímsteril fenotípusú és homozigóta helyreállító vonallal, közelebbről a kiválasztott RF elit eseménnyel történő fertilitás-helyreállítással szemben fogékony elit eseményt nyertünk.

A transzgenikus RF-vonalak kialakítása során a fentiek szerint végzett szelekcióval számos, optimális transzgénexpressziót mutató, vagyis glüfozinát-ammóniummal szemben rezisztens és hímsterilitásgént hordozó növénnyel, közelebbről a kiválasztott MS elit eseménnyel keresztezve az F1 fertilitásának helyreállítására képes elit eseményt nyertünk.

3. példa

A kiválasztott elitesemény-jelöltek WOSR-be juttatása

Számos, a fentieknek megfelelően B. napus-ban előállított MS és RF elit eseményt Drakkar növényváltozatok ismételt visszakeresztezésével nemesített WOSR növénybe juttattunk.

Az így nyert növények vizsgálata alapján a következőket állapítottuk meg:

a) az idegen DNS jelenléte nem befolyásolta kedvezőtlenül a növény egyéb előnyös, például agronómiái teljesítménnyel vagy kereskedelmi értékkel kapcsolatos tulajdonságait;

b) az esemény jól meghatározható, stabilan öröklődő molekuláris konfigurációval volt jellemezhető;

c) az idegen DNS-beli kérdéses gén(ek) az esemény heterozigóta (vagy hemizigóta) és homozigóta alakjában egyaránt szabályos, megfelelő helyen és időben történő, az eseményt hordozó növény megszokott mezőgazdasági alkalmazása során valószínűleg előforduló környezeti feltételek között kereskedelmi szempontból elfogadható mértékű stabil fenotípusos expressziót mutatnak.

Mindezek mellett vad típusú WOSR-fajtákkal történő összehasonlítással értékeltük a növények agronómiái tulajdonságait és teljesítményét.

Szántóföldi körülmények között végzett kiterjedt vizsgálatokkal megállapítottuk, hogy tavaszi olajrepce bizonyos elitesemény-jelöltjeinek WOSR-be juttatása optimális agronómiái teljesítménnyel rendelkező és az idegen DNS-beli kérdéses gének megfelelő mértékű expresszióját mutató növényeket eredményezett. Ezeket a WOSR-beli elit MS- és RF-eseményeket kiválasztottuk, és MS-BN1-nek, valamint RF-BN1-nek neveztük el.

4. példa

Az MS-BN1 és az RF-BN1 elit események jellemzése

Miután megállapítottuk, hogy az MS-BN1 és az RF-BN1 eseményeknél az adott transzgének expressziója és általános agronómiái teljesítménye egyaránt optimális, így azok elit eseménynek tekinthetők, elvégeztük a transzgének lokuszainak részletes, molekuláris szintű elemzését. Ez (több restrikciós enzimet alkalmazó) részletes Southern-blot-elemzésből és a transzgén szegélyezőrégióinak szekvenálásából állt.

HU 225 433 Β1

4.1. Több restrikciós enzimet alkalmazó Southern-blot-elemzés

Transzgenikus és kontrollnövényekből levélszövetet nyertünk. A levélszövetből Dellaporta és munkatársai eljárása szerint összes genomi DNS-t nyertünk 5 [Dellaporta és munkatársai: Plánt Molecular Biology Reporter 3, 19 (1983)]. Az így kapott készítmények DNS-koncentrációját optikai sűrűségük 260 nm-es hullámhosszon, spektrofotométerrel történt megállapításával határoztuk meg. 10 pg genomi DNS-t a gyártó utasításainak megfelelő körülmények között, 40 pl végső reakció-térfogatban restrikciós enzimmel emésztettünk. Az emésztés időtartamát és/vagy az alkalmazott restrikciós enzim mennyiségét úgy szabályoztuk, hogy az a nemspecifi- 15 kus bomlás elkerülése mellett a genomi DNS-minták tökéletes emésztését tegye lehetővé. Az emésztést követően az emésztett DNS-mintákhoz 4 μΙ feltöltőfestéket adtunk, majd azokat 1 %-os agarózgélre vittük.

A következő kontroll-DNS-eket szintén a gélre vit- 20 tűk:

- nem transzgenikus Brassica növényből származó genomi DNS-t tartalmazó negatív kontroll. Ezt a negatív kontrollt a háttér-hibridizáció hiányának igazolására vettük igénybe; 25

- pozitív kontroll-DNS: A Brassica napus genomjába integrált egy heterozigóta transzgénmásolat esetén 10 mg genomi DNS molekula-egyenértéke megegyezik a pTHW118 DNS 1501 bp-os Pvu\-Hind\\\ fragmensének ±19 pikogrammjával 30 (a Brassica napus diploid genom mérete 0,8*10⁹bp). A genomonként egy plazmidmásolatnak megfelelő mennyiséget 1 pg emésztett nem transzgenikus Brassica napus DNS-hez adtuk. Ezzel a rekonstitúciós mintával azt igazoltuk, 35 hogy a hibridizációs körülmények lehetővé tették a próba célszekvenciával történő hibridizációját.

Méretstandardként Psíl-gyel emésztett lambda-fág DNS-t (Clind ts 857 Sam 7 törzs, Life Technologies) alkalmaztunk. 40

Az elektroforézist követően a DNS-mintákat (az emésztett Brassica genomi DNS-t, a kontrollokat és a méretstandard DNS-t) kapillárisblotolással 12-16 óra alatt nejlonmembránra vittük.

Az MS-BN1 eseménynek megfelelő próbák előállítására alkalmazott DNS-templátokat a PTW107 Hincflll-mal végzett restrikciós emésztésével nyertük. Ennek eredményeként a transzformáló DNS megfelelő szakaszát (a PSSUARA egy részét, a 3’nos-t, a barnázt, a PTA29-et) tartalmazó 3942 bp-os DNS-fragmenst kaptunk.

Az RF-BN1 eseménynek megfelelő próbák előállítására alkalmazott DNS-templátokat a PTW118 Hpal-gyel végzett restrikciós emésztésével nyertük. Ennek eredményeként a transzformáló DNS megfelelő szakaszát (a PSSUARA egy részét, a 3’nos-t, a barstart, a PTA29-et) tartalmazó 2182 bp-os DNS-fragmenst kaptunk.

Tisztítást követően a DNS-fragmenseket standardeljárások alkalmazásával jelöltük, majd hibridizáltuk a membránnal.

A hibridizációt standardsztringensségű körülmények között végeztük. A jelzett próbát 95-100 °C-os vízfürdőben történt 5-10 perces melegítéssel, majd jégen történt 5-10 perces lehűtéssel denaturáltuk, majd a hibridizációs oldathoz [6X SSC (20*SSC=3,0 M NaCI, 0,3 M Na-citrát, pH=7,0), 5*Denhardt-oldat (100*Denhardt-oldat=2% Ficoll, 2% poli(vinil-pirrolidon), 2% szarvasmarha-szérumalbumin), 0,5% SDS és 20 mg/ml denaturált hordozó-DNS (átlagosan 120-3000 nukleotidnagyságú szimpla szálú halsperma DNS)] adtuk. A hibridizációt 65 °C-on egy éjszakán át végeztük. A biotokat 65 °C-on három alkalommal 20-40 percig mosóoldattal (2*SSC, 0,1% SDS) mostuk.

Az autoradiográfiás filmeket elektronikus úton olvastuk le.

4.1.1. MS-BN1

Az MS-BN1 genomi DNS különböző restrikciós enzimekkel végzett emésztésével nyert restrikciós mintázatokat a 2. ábrán, összefoglalva pedig a 3. táblázatban mutatjuk be.

3. táblázat

Az MS-BN1 restrikciós térképe

Sáv no.	DNS	A hibridizáló DNS-fragmensek elmozdulási határainak megfelelő méretjelző csíkok	A hibridizáló DNS-fragmensek becsült nagysága
alsó határa	felső határa
1	MS-BN1-EcoRI	2 140 14 057	2450	2 266 bp (*) >14 000 bp
2	MS-BN1-EcoRV	1 159 14 057	1 700	1 400 bp (*) >14 000 bp
4	MS-BN1-Hpal	1 986 2 140	2 140 2 450	1 990 bp 2 229 bp
5	MS-BN1-A/7III	2 450 2 140 514	2 838 2 450 805	2 477 bp () 2 250 bp 552 bp ()

HU 225 433 Β1

3. táblázat (folytatás)

Sáv no.	DNS	A hibridizáló DNS-fragmensek elmozdulási határainak megfelelő méretjelző csíkok	A hibridizáló DNS-fragmensek becsült nagysága
alsó határa	felső határa
6	MS-BN1-/Vcfel	5 077	14 057	10 000 bp
		5 077	14 057	6 510bp
7	nem transzgenikus WOSR	-	-	-
8	Kontroll plazmid DNS - BamHI	1 700	1 986	1 966 bp (*)
		2 450	2 838	2 607 bp (*)

(*) ezen fragmensek nagysága megfelel a pTHW107 plazmid restrikciós térképe alapján előre jelzettnek

4.1.2. RF-BN1 zatokat a 3. ábrán, összefoglalva pedig a 4. táblázatAz RF-BN1 genomi DNS különböző restrikciós en- 20 bán mutatjuk be.

zimekkel végzett emésztésével nyert restrikciós mintá4. táblázat

Az RF-BN1 restrikciós térképe

Sáv no.	DNS	A hibridizáló DNS-fragmensek elmozdulási határainak megfelelő méretjelzö csíkok	A hibridizáló DNS-fragmensek becsült nagysága
alsó határa	felső határa
1	MS-BNI-BamHI	805	1 099	814 bp
		1 700	1 986	1 849 bp (*)
		2 450	2 838	2 607 bp (·)
		5 077	14 057	6 580 bp
2	MS-BNI-EcoRI	805	1 159	1 094 bp
		1 986	2 450	2 149 bp
		5 077	14 057	7 000 bp
		5 077	14 057	10 000 bp
3	MS-BN1 -EcoRV	5 077	14 057	5 400 bp
		5 077	14 057	8 000 bp
4	MS-BN1-H/ndlll	1 700	2 140	1 969 bp
		2 450	2 838	2 565 bp
		2 450	2 838	2 635 bp
6	nem transzgenikus WOSR	-	-	-
5	Kontroll plazmid DNS - BamHI	1 700	1 986	1 849 bp (*)
		2 450	2 838	2 607 bp (*}
		5 077	14 057	8 100 bp

(*) ezen fragmensek nagysága megfelel a pTHW118 vektor SamHI-gyel készített restrikciós térképe alapján előre jelzettnek

HU 225 433 Β1

4.2. A szegélyezőrégiók azonosítása

Az MS-BN1 és az RF-BN1 elit események szegélyezőrégióit először a kialakításukra igénybe vett tavaszi olajrepcében, majd WOSR növényben azonosítottuk.

4.2.1. Az MS-BN1 szegélyezőrégiójának azonosí- 5 tása

4.2.1.1. Jobb oldali (5’) szegélyezőrégió

A vizsgálatot az MS-BN1 jobb oldali szegélyezőrégió szekvenciája és lánchosszabbító-befogást [Törmanen és munkatársai: NAR 20, 5487 (1993)] tartalmazó 10 kapcsolásközvetített polimeráz-láncreakció [Mueller és munkatársai: Science 780 (1989); Maxine és munkatársai: „PCR Methods and Applications”, pp. 71-75. (1994)] alkalmazásával végeztük.

A kapcsolószekvenciák előállítására a következő oligonukleotidokat vettük igénybe:

MDB248: (3. azonosító számú szekvencia)

5'CAT.GCC.CTG.ACC.CAG.GCT.AAG.TAT.TTT. AAC.TTT.AAC.CAC. TTT.GCT.CCG.ACA.GTC.CCA. TTG

MDB249: (4. azonosító számú szekvencia)

5’CAA.TGG.GAC.TGT.CGG.AGG.ACT.GAG.GGC. CAA.AGC.TTG.GCT. CTT.AGC.CTG.GGT.CAG.GGC. ATG

A kapcsolószekvencia elkészítését követően Λ/col-gyel emésztett MS-BN1 genomi DNS-ből biotinilált génspecifikus láncindító segítségével első szál szintézist végeztünk.

	Szekvencia (5’—>3’)	pTHW107-beli pozíció
MDB247 biotinilált láncindító	CCG.TCA.CCG.AGA.TCT.GAT.CTC.ACG.CG (5. azonosító számú szekvencia)	322<-347

A kapcsolószekvenciát ezután az első szál DNS-hez kötöttük, amelyet ezután mágneses gyöngyökhöz kapcsoltunk és eluáltuk a nem biotinilált szálat. Ezt a DNS ezután a következő láncindítókat alkalmazó méretnövelt PCR-amplifikáciőban használtuk:

	Szekvencia (5’—>3’)	pTHW107-beli pozíció
MDB250 kapcsolt láncindító	GCACTGAGGGCCAAAGCTTGGCTC (6. azonosító számú szekvencia)
MDB251 T-DNS láncindító	GGA.TCC.CCC.GAT.GAG.CTA.AGC.TAG.C (7. azonosító számú szekvencia)	293<-317

A fenti PCR-rel egy mintegy 1150 bp-os fragmenst 35 ző láncindítók igénybevételével „nested PCR-nek venyertünk. Ezt a jobb oldali fragmenst eluáltuk az aga- tettük alá: rózgélből, majd a DNS 100-szoros hígítását a követke-

	Szekvencia (5’->3’)	pTHW107-beli pozíció
MDB254 kapcsolt „nested” láncindító	CTTAGCCTGGGTCAGGGCATG (8. azonosító számú szekvencia)
MDB258 T-DNS láncindító	CTA.CGG.CAA.TGT.ACC.AGC.TG (9. azonosító számú szekvencia)	224<-243

Ez a reakció egy mintegy 1000 bp-os fragmenst kombináns plazmid DNS-t a következő láncindítókat aleredményezett, amelyet eluáltunk az agarózgélről, ki- kalmazó standard-PCR-rel szkríneltük:

tisztítottunk, majd a pGem®-T vektorba ligáltuk. A re- 50

	Szekvencia (5’->3’)	pTHW107-beli pozíció
SP6 láncindító	TAA.TAC.GAC.TCA.CTA.TAG.GGC.GA (10. azonosító számú szekvencia)	(pGem®-T vektorbeli SP6 promoter
T7 láncindító	TTT.AGG.TGA.CAC.TAT.AGA.ATA.C (11. azonosító számú szekvencia)	(pGem®-T vektorbeli T7 promoter
MDB201 T-DNS láncindító	gCT.TGG.ACT.ATA.ATA.CCT.GAC (12. azonosító számú szekvencia)	143<-163

HU 225 433 Β1

A reakció a következő fragmenseket eredményezte:

SP6-T7: 1224 bp

SP6-MDB201: 1068 bp

T7-MDB201: 1044 bp

A jobb oldali fragmens kitisztítást követő szekvenálá- 5 sa (13. azonosító számú szekvencia) egy 963 bp-os fragmenst eredményezett, amelynek 1-867. pozíciói növényi DNS-nek, 868-953. poziciói pedig a pTW107 TDNS-ének felelnek meg.

4.2.1.2. Az MS-BN1 bal oldali (3’) szegélyezőré- 10 giója

Az MS-BN1 eseményben az inszertált transzgént szegélyező bal oldali határrégió szekvenciáját hőmérsékletfüggő aszimmetrikus keresztezett („thermal asymmetric interlaced”, TAIL) PCR-rel állapítottuk meg [Liu 15 és munkatársai: The Plánt Journal 8(3), 457 (1995)]. Az említett eljárás egymást követő reakciókban három specifikus „nested” láncindítót és egy rövidebb tetszőleges degenerált („arbitrary degenerate”, AD) láncindítót alkalmaz, aminek köszönhetően a specifikus és nemspecifikus termékek sokszorozási hatékonysága hőmérsékletfüggő módon szabályozható. A transzgén határszekvenciájához hibridizáló specifikus láncindítók kiválasztását azok hibridizálási körülményeire alapoztuk. Kis mennyiségű (5 μΙ) tisztítatlan másodlagos és harmadlagos PCR-temnéket 1 %-os agarózgélen futtattunk. A harmadlagos PCR-terméken preparatív sokszorozást végeztünk, majd kitisztítottuk és automatizált szekvenálóberendezésben „DyeDeoxy terminator cycle reagenskészlet segítségével szekvenáltuk.

A reakcióban a következő láncindítókat alkalmaztuk:

	Szekvencia (5 —>3’)	pTHW107-beli pozíció
MDB611 degenerált láncindító	NgT.CgA.SWg.TNT.WCA.A (14. azonosító számú szekvencia)
MDB259 elsődleges TAIL	gTg.Cag.ggA.AgC.ggT.TAA.CTg.g (15. azonosító számú szekvencia)	7164-44186
MDB260 másodlagos TAIL	CCT.TTg.gAg.TAA.Atg.gTg.TTg.g (16. azonosító számú szekvencia)	4346->4366
HCA24 harmadlagos TAIL	gCg.AAT.gTA.TAT.TAT.Atg.CA (17. azonosító számú szekvencia)	4738—>4757

ahol N=A, C, T vagy g; S=C vagy g; W=A vagy T

A HCA24-MDB611-gyel amplifikált 540 bp-os fragmensből egy 537 bp-os szakaszt szekvenáltunk (3’ szegélyezőszekvencia: 18. azonosító számú szekven- 35 cia). Az említett szekvenciában az 1-180. pozíciók közötti szekvencia pTHW107 DNS-t tartalmazott, míg a 181-537. pozíciók közötti szekvencia növényi DNS-nek felelt meg.

4.2.1.3. Célhelydeléció azonosítása A vad típusú Brassica napus var. drakkarbeli transzgén (mint templát) szegélyezőrégióin belüli szekvenciáknak megfelelő láncindítók alkalmazásával azonosítottuk a transzgén inszerciós helyét.

A reakcióban a következő láncindítókat alkalmaztuk:

	Szekvencia (5’—>3’)	5’ szegélyezőszekvencia (13. azonosító számú szekvencia) pozíció	3’ szegélyezőszekvencia (18. azonosító számú szekvencia) pozíció
VDS51	TgA.CAC.TTT.gAg.CCA.CTC.g (19. azonosító számú szekvencia)	733->751
HCA48	GgA.ggg.TgT.TTT.Tgg.TTA.TC (20. azonosító számú szekvencia)		189<-208

A fenti reakció eredményeként kapott 178 bp-os fragmensben (21. azonosító számú szekvencia) a 132-150. pozíció célhelydeléciónak felel meg.

4.2.1.4. Az MS-BN1 inszerciós régiójának azonosítása 55

A szegélyezőrégiók, valamint a célhelydeléció azonosítása alapján meghatároztuk az MS-BN1 inszerciós régióját (22. azonosító számú szekvencia):

1-822: 5’ szegélyezőrégió a 13. azonosító számú szekvencia 46-867. bázispárjai, 60

823-841: célhelydeléció a 21. azonosító számú szekvencia 132-150. bázispárjai,

842-1198: 3’ szegélyezőrégió a 18. azonosító számú szekvencia 181-537. bázispárjai.

4.2.2. Az RF-BN1 szegélyezőrégióinak azonosítása Az RF-BN1 szegélyező határrégióit „Vectorette”PCR-rel („Use of Vectorette and Subvectorette PCR to isolate transgene flanking DNA”, PCR Methods and Applications, 4, pp. 71-75, szerk.: Maxine J. Allén, Andrew Collick és Alec J. Jeffrey (1994)], templátként

HU 225 433 Β1

Η/ndlll-mal emésztett RF-BN1 genomi DNS-t alkalmazva határoztuk meg. A „vectorette” kapcsolószekvenciát a fentiekben leírt MDB248 (3. azonosító számú szekvencia) és MDB249 (4. azonosító számú szekvencia) jelű láncindítókkal állítottuk elő. 5

4.2.2.1. Az RF-BN1 jobb oldali (5’) szegélyezőrégiója

A reakcióhoz a következő láncindítókat vettük igénybe:

	Szekvencia (5’->3’)	pTHW118-beli pozíció
MDB250 „vectorette” láncindító	GCA.CTG.AGG.GCC.AAA.GCT.TGG.CTC (6. azonosító számú szekvencia)
MDB254 „vectorette” láncindító	CTT.AGC.CTG.GGT.CAG.GGC.ATG (8. azonosító számú szekvencia)
MDB251 T-DNS láncindító	GGA.TCC.CCC.GAT.GAG.CTA.AGC.TAG.C (7. azonosító számú szekvencia)	293<-317
MDB193 T-DNS láncindító	CTA.CGG.CAA.TGT.ACC.AGC (23. azonosító számú szekvencia)	226<-243
MDB258 T-DNS láncindító	CTA.CGG.CAA.TGT.ACC.AGC.TG (9. azonosító számú szekvencia)	224<-243
MDB201 T-DNS láncindító	GCT.TGG.ACT.ATA.ATA.CCT.GAC (12. azonosító számú szekvencia)	143<-163

A fentiek egy 1077 bp-os fragmenst eredményeztek 25 (24. azonosító számú szekvencia), amelynek 1-881. pozíciói növényi DNS-nek, 882-1077. pozíciói pedig a pTW118 T-DNS-ének felelnek meg.

4.2.1.2. Az RF-BN1 bal oldali (3’) szegélyezőrégiója 30

Az RF-BN1 elit esemény 3’ szegélyezőrégiójának azonosítása érdekében a fentiekben leírtaknak megfelelően, egy tetszőleges degenerált láncindító és a T-DNS-ben a bal oldali határrégió közelében található láncindítók alkalmazásával TAIL-PCR-t végeztünk. 35

A reakcióhoz a következő láncindítókat vettük igénybe.

Tetszőleges degenerált láncindító:

MDB286 NTg.CgA.SWg.ANA.WgA.A (25. azonosító számú szekvencia) 40 ahol N=A, C, T vagy g; S=C vagy g; W=A vagy T T-DNS láncindítók:

MDB314 gTA.ggA.ggT.Tgg.gAA.gAC.C (26. azonosító számú szekvencia)

MDB315 ggg.CTT.TCT.ACT.AgA.AAg.CTC.TCg.g (27. 45 azonosító számú szekvencia)

MDB316 CCg.ATA.ggg.AAg.TgA.TgT.Agg.Agg (28. azonosító számú szekvencia)

A fentiek alkalmazásával egy mintegy 2000 bp-os fragmenst kaptunk. Ezt pGem®-T vektorba klónoztuk, 50 majd a következő láncindítókat alkalmazó PCR-ben templátként vettük igénybe.

Növényi DNS láncindító:

MDB288 Atg.Cag.CAA.gAA.gCT.Tgg.Agg. (29. azonosító számú szekvencia) 55

T-DNS láncindító:

MDB314 gTA.ggA.ggT.Tgg.gAA.gAC.C (26. azonosító számú szekvencia)

A fentiek egy 1500 bp-os fragmenst eredményeztek (30. azonosító számú szekvencia), amelynek 1-166. 60 pozíciói a pTW118 jelű plazmid T-DNS-ének, 167-1441. pozíciói pedig növényi DNS-nek felelnek meg.

4.2.2.3. A célhelydeléció molekuláris elemzése

A célhelydeléciót (a fentiekben ismertetett) TAILPCR eljárással, vad típusú genomi DNS- és a T-DNSinszerttől 5’-irányban helyeződő, az inszert felé irányuló növényi-DNS-specifikus láncindítók alkalmazásával klónoztuk.

Tetszőleges degenerált láncindító:

MDB286 NTg.CgA.SWg.ANA.WgA.A (25. azonosító számú szekvencia) ahol N=A, C, T vagy g; S=C vagy g; W=A vagy T

Növényi T-DNS láncindítók:

MDB269 ggTTTTCggAggTCCgAgACg (31. azonosító számú szekvencia)

MDB283 CTTggACCCCTAggTAAATgC (32. azonosító számú szekvencia)

MDB284 gTACAAAACTTggACCCCTAgg (33. azonosító számú szekvencia)

A fenti reakcióval egy 1068 bp-os fragmenst (34. azonosító számú szekvencia) nyertünk, amelyben:

53-83: 5’ szegélyezőrégió,

84-133: célhelydeléció,

134-1055: 3’szegélyezőrégió.

A T-DNS inszerciójának eredményeként a célhely egy 51 bp-os szakasza delécióra került. A vad típusú lokusz szekvenciáját az Rf3 lokuszéval összehasonlítva a jobb oldali határrégió kapcsolódásánál egy hézagkitöltő („fillér”) DNS jelenlétét mutattuk ki. A jobb oldali határrégiónál a TCTCG hézagkitöltő szekvenciát az 5’-végen TCA, a 3’-végen CGA szegélyezi. Ezek a triplettek megtalálhatók a célhelydeléció, valamint a T-DNS töréspontjánál („breakpoint”) is. Távolabbi növényi szekvenciákon belüli kereséssel azonosítottuk az említett hézagkitöltő szekvencia valószínű eredetét. A TCA.TCTCG.CGA szekvencia a növényi DNS-ben

HU 225 433 Β1 szintén a célhelydeléció 3’-végénél helyeződik. Ez a magszekvenciája a célhelydeléció töréspontjától 209 bp-ra 3’-irányban helyeződő két 13 bp-os megegyező ismétlődésnek.

Az RF-NB1 inszerciós régiója bal oldali szegélyezőrégiót, célhelydeléciót és jobb oldali szegélyezőrégiót tartalmaz, a következők szerint:

1-881: 5’ szegélyezőrégió a 24. azonosító számú szekvencia 1-881. bázispárjai,

882-932: célhelydeléció a 34. azonosító számú szekvencia 882-932. bázispárjai,

933-2207: 3’ szegélyezőrégió a 30. azonosító számú szekvencia 933-2207. bázispárjai.

4.3. A lokusz génelemzése

A két eseménynél az inszertek genetikai stabilitását több utódnövény-nemzedékre vonatkozóan molekuláris és fenotípuselemzéssel ellenőriztük.

A T_o, T₁ és T₂ generációbeli növények Southernblot-elemzéseinek eredményét az MS-BN1 és az RF-BN1 eseményekre vonatkozóan egyaránt összehasonlítottuk. A különböző generációk esetében nyert mintázatok mindkét eseménynél azonosnak bizonyultak. Ez alapján az MS-BN1- és az RF-BN1-tartalmú növényekben a transzgének molekuláris konfigurációja stabilnak tekinthető.

Az MS-BN1 és az RF-BN1 események transzgénjei különálló genetikai lokuszként Mendel-féle szegregációt mutattak legalább három egymást követő generációban, ami az inszertek stabilitását bizonyította.

A fenti eredmények alapján az MS-BN1 és az RF-BN1 elit eseménynek tekinthetők.

4.4. Az MS-BN1 és az RF-BN1 szegélyezőszekvenciáinak azonosítása WOSR növényben

Az MS-BN1 és az RF-BN1 elit események WOSR-beli szegélyezőszekvenciáit az említett események tavaszi olajrepcében meghatározott szegélyezőszekvenciáin alapuló láncindítókkal azonosítottuk.

A WOSR MS-BN1 jobb oldali (5’) szegélyezőszekvenciáját T-DNS láncindító (12. azonosító számú szekvencia) és az MS-BN1 jobb oldali határoló növényi DNS-ében helyeződő láncindító:

VDS57: 5’-gCA.TgA.TCT.gCT.Cgg.gAT.ggC-3’ (35. azonosító számú szekvencia) segítségével állapítottuk meg.

Ennek eredményeként egy 909 bp-os fragmenst (36. azonosító számú szekvencia) nyertünk, amelynek szekvenciája (a 98. nukleotidtól kezdődően) alapvetően hasonló a 13. azonosító számú szekvenciához.

A WOSR MS-BN1 bal oldali (3') szegélyezőszekvenciáját T-DNS láncindító (17. azonosító számú szekvencia) és az MS-BN1 bal oldali határoló növényi DNS-ében helyeződő láncindító:

HCA68: 5’-CCA.TAT.Acg.CCA.gAg.Agg.AC-3’ (37. azonosító számú szekvencia) segítségével állapítottuk meg.

Ennek eredményeként egy 522 bp-os fragmenst (38. azonosító számú szekvencia) nyertünk, amelynek szekvenciája alapvetően hasonló a 18. azonosító számú szekvenciához.

A WOSR RF-BN1 jobb oldali (5’) szegélyezőszekvenciáját T-DNS láncindító (12. azonosító számú szekvencia) és az RF-BN1 jobb oldali határoló növényi DNS-ében helyeződő láncindító (31. azonosító számú szekvencia) segítségével állapítottuk meg. Ennek eredményeként egy 694 bp-os fragmenst (39. azonosító számú szekvencia) nyertünk, amelynek szekvenciája (a 293-980. nukleotidok között) alapvetően hasonló a 24. azonosító számú szekvenciához.

A WOSR RF-BN1 bal oldali (3') szegélyezőszekvenciáját T-DNS láncindító (26. azonosító számú szekvencia) és az RF-BN1 bal oldali határoló növényi DNS-ében helyeződő láncindító (29. azonosító számú szekvencia) segítségével állapítottuk meg.

Ennek eredményeként egy 1450 bp-os fragmenst nyertünk, amelyből 1279 bp-t szekvenáltunk (40. azonosító számú szekvencia). Az így megállapított szekvencia (a 141-1421. nukleotidok között) alapvetően hasonló a 30. azonosító számú szekvenciához.

Mindezek alapján az MS-BN1 és az RF-BN1 elit események bal és jobb oldali határszekvenciái tavaszi és téli olajrepce esetében alapvetően hasonlónak bizonyultak.

5. példa

Azonosság-ellenőrzésre szolgáló eszközök kifejlesztése

A következő protokollokat dolgoztuk ki az MS-BN1 elit eseményt tartalmazó tetszőleges WOSReredetű növényi anyagok azonosítása céljából.

5.1. MS-BN1 és RF-BN1 elit események restrikciós térképének azonosítási protokollja

Az MS-BN1 elit eseményt tartalmazó WOSR növények a 4.1. példában leírt eljárással alapvetően megegyező Southern-blot-elemzéssel azonosíthatók. Ennek megfelelően WOSR genomi DNS-t 1. a következő restrikciós enzimek közül legalább kettővel, előnyösen legalább hárommal, közelebbről legalább néggyel, még közelebbről az összessel emésztünk: EcoRI, EcoRM, Ndel, Hpal vagy Afll11, 2. a kapott anyagot nejlonmembránokra visszük, majd 3. a pTHW107 jelű plazmid 3942 bp-os Hindin fragmensével hibridizáljuk. Amennyiben a restrikciós enzimek közül legalább kettő alkalmazása esetén a 4.1.1. példabeli 3. táblázatban felsorolt megfelelő DNS-fragmensekkel megegyező nagyságú fragmenseket kapunk, akkor a WOSR növény az MS-BN1 elit eseményt hordozza.

Az RF-BN1 elit eseményt tartalmazó WOSR növények a 4.1. példában leírt eljárással alapvetően megegyező Southern-blot-elemzéssel azonosíthatók. Ennek megfelelően WOSR genomi DNS-t 1. a következő restrikciós enzimek közül legalább kettővel, előnyösen legalább hárommal, legelőnyösebben az összessel emésztünk: BamHI, EcoRI, EcoRN, Hindlll, 2. a kapott anyagot nejlonmembránokra visszük, majd 3. a pTHW118 jelű plazmid 2182 bp-os Hpal fragmensével hibridizáljuk. Amennyiben a restrikciós enzimek közül legalább kettő alkalmazása esetén a 4.1.2. példabeli 4. táblázatban felsorolt megfelelő DNS-fragmensekkel megegyező nagyságú fragmenseket kapunk, akkor a WOSR növény az RF-BN1 elit eseményt hordozza.

HU 225 433 Β1

5.2. MS-BN1 és RF-BN1 elit események polimeráz-láncreakciós azonosítási protokollja Ismeretlen anyagok szkrínelésekor megfelelő kontroliokkal végzett próbafuttatásra van szükség. Az itt ismertetett protokoll az egyes laboratóriumok szerint eltérő összetevők (például templát DNS preparátum, Taq DNS-polimeráz, a láncindítók minősége, dNTP, „thermocycler” stb.) tekintetében optimalizálásra szorulhat.

Az endogén szekvencia amplifikálása a protokoll kiemelten fontos lépése. Ismert transzgenikus genomi DNS templát esetében az endogén és a transzgenikus szekvencia ekvimoláris mennyiségeit amplifikáló PCR-körülmények kialakítására kell törekedni. Amennyiben a kívánt endogén fragmens nem amplifikálódik, vagy az agarózgél-elektroforézis során a kívánt szekvenciák nem azonos erősségű etidium-bromid-festődést mutatnak, a PCR körülményeinek optimalizálására lehet szükség.

5.2.1. Templát DNS

A templát DNS-t levélbioptátumból vagy egy magból Edwards és munkatársai eljárása szerint állítjuk elő [Edwards és munkatársai: Nucleic Acid Research 19, 1349 (1991)]. Egyéb eljárásokkal előállított DNS esetében különböző templátmennyiségekkel végzett próbafuttatást kell végezni. Általában 50 ng genomi templát DNS alkalmazásával érhető el a legjobb eredmény.

5.2.2. Pozitív és negatív kontrollok

- „Master Mix” kontroll (DNS-negatív kontroll). Ebben a PCR-ben nem adunk DNS-t a reakciókeverékhez. A várt eredmény (PCR-termékek hiánya) esetében a PCR-keverék nem volt cél-DNS-sel szennyezett.

- DNS-pozitív kontroll (a transzgenikus szekvenciákat ismerten tartalmazó genomi DNS-minta). E pozitív kontroll sikeres amplifikációja azt bizonyítja, hogy a PCR körülményei lehetővé teszik a célszekvenciák amplifikálását.

- Vad típusú DNS-kontroll. Ebben a PCR-ben templát DNS-ként nem transzgenikus növényből előállított genomi DNS-t alkalmazunk. A várt eredmény, vagyis a transzgenikus PCR-termék amplifikációjának hiánya és az endogén PCR-termék amplifikációja azt bizonyítja, hogy a genomi DNS-mintában nincs kimutatható mennyiségű transzgén háttér-amplifikáció.

5.2.3. Láncindítók

A reakciókban a következő, a transzgént és egy szegélyezőszekvenciát specifikusan felismerő láncindltókat alkalmazzuk:

BNA01 5’-gCT.Tgg.ACT.ATA.ATA.CCT.gAC-3’ (12. azonosító számú szekvencia) (MDB201) (célpont: transzgén)

BNA02 5’-TgA.CAC.TTT.gAg.CCA.CTC.g-3’ (19. azonosító számú szekvencia) (VDS51) (célpont: növényi DNS)

Az RF-BN1-et tartalmazó növényi anyag azonosításához a következő, a transzgént és az RF-BN1 egy szegélyezőszekvenciáját specifikusan felismerő láncindítókat alkalmazzuk:

BNA03: 5’-TCA.TCT.ACg.gCA.Atg.TAC.Cag-3' (23. azonosító számú szekvencia) (MDB193) (célpont: transzgén)

BNA04: 5’-Tgg.ACC.CCT.Agg.TAA.Atg.CC-3’ (41. azonosító számú szekvencia) (MDB268) (célpont: növényi DNS)

A PCR-koktél minden esetben tartalmaz endogén szekvenciát amplifikáló láncindítókat is. Ezek ismeretlen minták és a DNS-pozitív kontroll esetében belső kontrollként szolgálnak. Az endogén láncindltó párral kapott pozitív eredmény arra utal, hogy a genomi DNS-preparátum PCR-termék előállításához elegendő mennyiségű és megfelelő minőségű DNS-t tartalmaz. A következő endogén láncindítókat alkalmazzuk:

BNA03: 5’-AAC.gAg.TgT.Cag.CTA.gAC.Cag.C-3’ (42. azonosító számú szekvencia)

BNA06: 5-CgC.AgT.TCT.gTg.AAC.ATC.gAC.C-3’ (43. azonosító számú szekvencia)

5.2.4. Amplifikált fragmensek

A PCR várhatóan a következő fragmensek amplifikálását eredményezi:

BNA05-BNA06 láncindító pár: 394 bp (endogén kontroll)

BNA01-BNA02 láncindító pár: 280 bp (MS-BN1 elit esemény)

BNA03-BNA04 láncindító pár: 215 bp (RF-BN1 elit esemény)

5.2.5. PCR-körülmények
50 μΙ	PCR-reakciókeverék a következőket tartalmazza:
5 μΙ	templát DNS
5 μΙ	lOxamplifikáló puffer (Tag-polimeráz része)
1 μΙ	10 mM dNTP
1 μΙ	BNA01 (MS-BN1) vagy BNA03 (RF-BN1) (10 pmol/μΙ)
1μΙ	BNA02 (MS-BN1) vagy BNA04 (RF-BN1) (10 pmol/μΙ)
0,5 μΙ	BNA05 (10 pmol/μΙ)
0,5 μΙ	BNA06 (10 pmol/μΙ)
0,2 μΙ	Tag DNS-polimeráz (5 egység/μΙ) víz ad 50 μΙ

Optimális eredmények eléréséhez a következő futtatási profil alkalmazására van szükség:

°C 4 perc ezután 5 cikluson át 95 °C 1 perc 57 °C 1 perc 72 °C 2 perc majd 22-25 cikluson át 92 °C 30 másodperc 57 °C 30 másodperc 72 °C 1 perc végül °C 5 perc

5.2.6. Agarózgél-elemzés

A PCR-minták 10-20 μΙ közötti mennyiségét kell 1,5%-os agarózgélre vinni (tris-borát-pufferben) megfelelő molekulatömeg-markerrel együtt (például 100 bp-os ladder, PHARMACIA).

HU 225 433 Β1

5.2.7 Az eredmények érvényesítése

Az egy PCR-futtatással, egy PCR-koktél alkalmazásával transzgenikus növényi DNS-mintákból nyert adatok csak akkor tekinthetők elfogadhatónak, ha 1. a DNS-pozitív kontroll a várt PCR-termékeket (transzgenikus és endogén fragmenseket) eredményezte, 2. a DNS-negatív kontroll PCR-amplifikációja negatív eredményű volt (nem eredményezett fragmenseket), valamint 3. a vad típusú DNS-kontroll amplifikációja a várt eredménnyel (endogén fragmens amplifikációval) járt.

A várt nagyságú transzgenikus és endogén PCR-termékek látható mennyiségét tartalmazó sávok arra utalnak, hogy az adott genomi templát DNS előállítására igénybe vett növény az MS-BN1 és/vagy az RF-BN1 elit eseményt hordozta. A látható mennyiségben egy transzgenikus PCR-terméket sem tartalmazó, endogén PCR-terméket viszont tartalmazó sávok arra utalnak, hogy az adott genomi templát DNS előállítására igénybe vett növény nem hordozza az elit eseményt. A látható mennyiségben sem transzgenikus PCR-terméket, sem endogén PCR-terméket nem tartalmazó sávok arra utalnak, hogy a genomi DNS minősége és/vagy mennyisége nem tette lehetővé PCR-termék képződését. Ezeket a növényeket nem lehet értékelni. Ebben az esetben a genomi DNS-mintát újból elő kell állítani, és a megfelelő kontrollok alkalmazásával újra kell futtatni a PCR-t.

5.2.8. Elkülönítő PCR-protokoll alkalmazása

MS-BN1 és RF-BN1 elkülönítésére

MS-BN1-et, RF-BN1-et vagy egyéb transzgenikus eseményt tartalmazó WOSR növények leveléből származó anyagmintákat a fentiekben ismertetett protokollnak megfelelően vizsgáltunk. Negatív kontrollként vad típusú WOSR-ből származó mintákat alkalmaztunk.

A PCR-elemzés eredményeit a 4. és 5. ábra tartalmazza.

A 4. ábra az MS-BN1 elit esemény azonosítására szolgáló PCR-protokoll két WOSR-minta (1. és 2. sáv) esetében kapott eredményét szemlélteti. Az 1. sávbeli minta a 280 bp-os csík jelenléte alapján tartalmazta az elit eseményt, míg a 2. sávbeli minta nem tartalmazott MS-BN1-et.

Az 5. ábra az RF-BN1 elit esemény azonosítására szolgáló PCR-protokoll két WOSR-minta (1. és 2. sáv) esetében kapott eredményét szemlélteti. Az 1. sávbeli minta a 215 bp-os csík jelenléte alapján tartalmazta az elit eseményt, míg a 2. sávbeli minta nem tartalmazott RF-BN1-et.

6. példa

Hibrid magvak előállítása MS-BN1-et és RF-BN1-et tartalmazó WOSR növényekkel

MS-BN1-et tartalmazó hímsteril WOSR növényeket RF-BN1-re homozigóta WOSR növényekkel kereszteztünk. AZ MS-BN1-et tartalmazó növényekből származó hibrid magokat ΡΤΑ-730-as deponálási számon letétbe helyeztük az ATCC-nél.

Az említett hibrid magot szántóföldi körülmények között elültettük. A belőle származó növények 100%-os fertilitásúnak és optimális agronómiái tulajdonságokat hordozónak bizonyultak. A hibrid növények vagy együttesen az MS-BN1-et és az RF-BN1-et, vagy csak önmagában az RF-BN1-et tartalmazták.

7. példa

Az MS-BN1 és az RF-BN1 beépítése WOSR előnyös nemesített változataiba

Az MS-BN1 és RF-BN1 elit eseményeket az azokat tartalmazó növények ismételt visszakeresztezésével mezőgazdasági szempontból lényeges nemesített WOSR-változatokba juttattuk.

Megfigyeltük, hogy az elit események említett nemesített változatokba történő beépítése nem befolyásolta lényeges mértékben azok egyetlen kívánt fenotípusos vagy agronómiái jellemzőjét [kapcsolt gátlás („linkage drag”) hiánya], a transzgén (glüfozináttolerancia alapján megállapított) expressziója ugyanakkor kereskedelmi szempontból elfogadható mértéket ért el. Mindezek megerősítették az MS-BN1 és RF-BN1 események elit esemény voltát.

Az alábbi szabadalmi igénypontokban egyértelmű ellenkező jelölés hiányában „növény” megnevezés alatt bármely érési fázisban lévő növényi szövetet, valamint ilyen növényből nyert vagy belőle származó bármely sejtet, szövetet vagy szervet, így többek között, de nem kizárólag magot, levelet, szárat, virágot, gyökeret, egyedi sejtet, ivarsejtet, sejttenyészetet, szövettenyészetet vagy protoplasztot értünk.

Az MS-BN1 és az RF-BN1 vagy csak önmagában az RF-BN1 elit eseményt tartalmazó magokat ΡΤΑ-730-as deponálási számon helyeztük letétbe az American Tissue Culture Collectionnél.

SZEKVENCIALISTA <210> 1 <211 >4946 <212> DNS <213> mesterséges szekvencia <220>

<223> Mesterséges szekvencia leírása: a pTHW107 plazmid T-DNS-e <220>

<221 > vegyes sajátság <222> (964)...(4906) <223> Hindlll fragmens <400> 1

HU 225 433 Β1 aattacaacg gtatatatcc tgccagtact cggccgtcga actcggccgt cgagtacatg 60 gtcgataaga aaaggcaatt tgtagatgtt aattcccatc ttgaaagaaa tatagtttaa 120 atatttattg ataaaataac aagtcaggta ttatagtcca agcaaaaaca taaatttatt 180 gatgcaagtt taaattcaga aatatttcaa taactgatta tatcagctgg tacattgccg 240 tagatgaaag actgagtgcg atattatgtg taatacataa attgatgata tagctagctt 300 agctcatcgg gggatcctag acgcgtgaga tcagatctcg gtgacgggca ggaccggacg 360 gggcggtacc ggcaggctga agtccagctg ccagaaaccc acgtcatgcc agttcccgtg 420 cttgaagccg gccgcccgca gcatgccgcg gggggcatat ccgagcgcct cgtgcatgcg 480 cacgctcggg tcgttgggca gcccgatgac agcgaccacg ctcttgaagc cctgtgcctc 540 cagggacttc agcaggtggg tgtagagcgt ggagcccagt cccgtccgct ggtggcgggg 600 ggagacgtac acggtcgact cggccgtcca gtcgtaggcg ttgcgtgcct tccaggggcc 660 cgcgtaggcg atgccggcga cctcgccgtc cacctcggcg acgagccagg gatagcgctc 720 ccgcagacgg acgaggtcgt ccgtccactc ctgcggttcc tgcggctcgg tacggaagtt 780 gaccgtgctt gtctcgatgt agtggttgac gatggtgcag accgccggca tgtccgcctc 840 ggtggcacgg cggatgtcgg ccgggcgtcg ttctgggtcc attgttcttc tttactcttt 900 gtgtgactga ggtttggtct agtgctttgg tcatctatat ataatgataa caacaatgag 960 aacaagcttt ggagtgatcg gagggtctag gatacatgag attcaagtgg actaggatct 1020 acaccgttgg attttgagtg tggatatgtg tgaggttaat tttacttggt aacggccaca 1080 aaggcctaag gagaggtgtt gagaccctta tcggcttgaa ccgctggaat aatgccacgt 1140 ggaagataat tccatgaatc ttatcgttat ctatgagtga aattgtgtga tggtggagtg 1200 gtgcttgctc attttacttg cctggtggac ttggcccttt ccttatgggg aatttatatt 1260 ttacttacta tagagctttc ataccttttt tttaccttgg atttagttaa tatataatgg 1320 tatgattcat gaataaaaat gggaaatttt tgaatttgta ctgctaaatg cataagatta 1380 ggtgaaactg tggaatatat atttttttca tttaaaagca aaatttgcct tttactagaa 1440 ttataaatat agaaaaatat ataacattca aataaaaatg aaaataagaa ctttcaaaaa 1500 acagaactat gtttaatgtg taaagattag tcgcacatca agtcatctgt tacaatatgt 1560 tacaacaagt cataagccca acaaagttag cacgtctaaa taaactaaag agtccacgaa 1620 aatattacaa atcataagcc caacaaagtt attgatcaaa aaaaaaaaac gcccaacaaa 1680 gctaaacaaa gtccaaaaaa aacttctcaa gtctccatct tcctttatga acattgaaaa 1740 ctatacacaa aacaagtcag ataaatctct ttctgggcct gtcttcccaa cctcctacat 1800 cacttcccta tcggattgaa tgttttactt gtaccttttc cgttgcaatg atattgatag 1860 tatgtttgtg aaaactaata gggttaacaa tcgaagtcat ggaatatgga tttggtccaa 1920 gattttccga gagctttcta gtagaaagcc catcaccaga aatttactag taaaataaat 1980 caccaattag gtttcttatt atgtgccaaa ttcaatataa ttatagagga tatttcaaat 2040 gaaaacgtat gaatgttatt agtaaatggt caggtaagac attaaaaaaa tcctacgtca 2100 gatattcaac tttaaaaatt cgatcagtgt ggaattgtac aaaaatttgg gatctactat 2160 atatatataa tgctttacaa cacttggatt tttttttgga ggctggaatt tttaatctac 2220 atatttgttt tggccatgca ccaactcatt gtttagtgta atactttgat tttgtcaaat 2280 atatgtgttc gtgtatattt gtataagaat ttctttgacc atatacacac acacatatat 2340 atatatatat atatattata tatcatgcac ttttaattga aaaaataata tatatatata 2400 tagtgcattt tttctaacaa ccatatatgt tgcgattgat ctgcaaaaat actgctagag 2460 taatgaaaaa tataatctat tgctgaaatt atctcagatg ttaagatttt cttaaagtaa 2520 attctttcaa attttagcta aaagtcttgt aataactaaa gaataataca caatctcgac 2580 cacggaaaaa aaacacataa taaatttgaa tttcgaccgc ggtacccgga attcgagctc 2640 ggtacccggg gatcttcccg atctagtaac atagatgaca ccgcgcgcga taatttatcc 2700 tagtttgcgc gctatatttt gttttctatc gcgtattaaa tgtataattg cgggactcta 2760 atcataaaaa cccatctcat aaataacgtc atgcattaca tgttaattat tacatgctta 2820 acgtaattca acagaaatta tatgataatc atcgcaagac cggcaacagg attcaatctt 2880 aagaaacttt attgccaaat gtttgaacga tctgcttcgg atcctctaga gccggaaagt 2940 gaaattgacc gatcagagtt tgaagaaaaa tttattacac actttatgta aagctgaaaa 3000 aaacggcctc cgcaggaagc cgtttttttc gttatctgat ttttgtaaag gtctgataat 3060 ggtccgttgt tttgtaaatc agccagtcgc ttgagtaaag aatccggtct gaatttctga 3120 agcctgatgt atagttaata tccgcttcac gccatgttcg tccgcttttg cccgggagtt 3180 tgccttccct gtttgagaag atgtctccgc cgatgctttt ccccggagcg acgtctgcaa 3240 ggttcccttt tgatgccacc cagccgaggg cttgtgcttc tgattttgta atgtaattat 3300 caggtagctt atgatatgtc tgaagataat ccgcaacccc gtcaaacgtg ttgataaccg 3360 gtaccatggt agctaatttc tttaagtaaa aactttgatt tgagtgatga tgttgtactg 3420 ttacacttgc accacaaggg catatataga gcacaagaca tacacaacaa cttgcaaaac 3480 taacttttgt tggagcattt cgaggaaaat ggggagtagc aggctaatct gagggtaaca 3540 ttaaggtttc atgtattaat ttgttgcaaa catggactta gtgtgaggaa aaagtaccaa 3600

HU 225 433 Β1 aattttgtct caccctgatt tcagttatgg aaattacatt atgaagctgt gctagagaag 3660 atgtttattc tagtccagcc acccacctta tgcaagtctg cttttagctt gattcaaaaa 3720 ctgatttaat ttacattgct aaatgtgcat acttcgagcc tatgtcgctt taattcgagt 3780 aggatgtata tattagtaca taaaaaatca tgtttgaatc atctttcata aagtgacaag 3840 tcaattgtcc cttcttgttt ggcactatat tcaatctgtt aatgcaaatt atccagttat 3900 acttagctag atatccaatt ttgaataaaa atagctcttg attagtaaac cggatagtga 3960 caaagtcaca tatccatcaa acttctggtg ctcgtggcta agttctgatc gacatggggt 4020 taaaatttaa attgggacac ataaatagcc tatttgtgca aatctcccca tcgaaaatga 4080 cagattgtta catggaaaac aaaaagtcct ctgatagaag tcgcaaagta tcacaatttt 4140 ctatcgagag atagattgaa agaagtgcag ggaagcggtt aactggaaca taacacaatg 4200 tctaaattaa ttgcattcgc taaccaaaaa gtgtattact ctctccggtc cacaataagt 4260 tattttttgg cccttttttt atggtccaaa ataagtgagt tttttagatt tcaaaaatga 4320 tttaattatt tttttactac agtgcccttg gagtaaatgg tgttggagta tgtgttagaa 4380 atgtttatgt gaagaaatag taaaggttaa tatgatcaat ttcattgcta tttaatgtta 4440 aaatgtgaat ttcttaatct gtgtgaaaac aaccaaaaaa tcacttattg tggaccggag 4500 aaagtatata aatatatatt tggaagcgac taaaaataaa cttttctcat attatacgaa 4560 cctaaaaaca gcatatggta gtttctaggg aatctaaatc actaaaatta ataaaagaag 4620 caacaagtat caatacatat gatttacacc gtcaaacacg aaattcgtaa atatttaata 4680 taataaagaa ttaatccaaa tagcctccca ccctataact taaactaaaa ataaccagcg 4740 aatgtatatt atatgcataa tttatatatt aaatgtgtat aatcatgtat aatcaatgta 4800 taatctatgt atatggttag aaaaagtaaa caattaatat agccggctat ttgtgtaaaa 4860 atccctaata taatcgcgac ggatccccgg gaattccggg gaagcttaga tccatggagc 4920 catttacaat tgaatatatc ctgccg 4946 <210> 2 <211 >4832 <212> DNS <213> mesterséges szekvencia <220>

<223> Mesterséges szekvencia leírása: a pTHW118 plazmid T-DNS-e <220>

<221 > vegyes sajátság <222> (1883)...(4065) <223> Hpal restrikciós fragmens <400> 2 aattacaacg gtatatatcc tgccagtact cggccgtcga actcggccgt cgagtacatg 60 gtcgataaga aaaggcaatt tgtagatgtt aattcccatc ttgaaagaaa tatagtttaa 120 atatttattg ataaaataac aagtcaggta ttatagtcca agcaaaaaca taaatttatt 180 gatgcaagtt taaattcaga aatatttcaa taactgatta tatcagctgg tacattgccg 240 tagatgaaag actgagtgcg atattatgtg taatacataa attgatgata tagctagctt 300 agctcatcgg gggatcctag acgcgtgaga tcagatctcg gtgacgggca ggaccggacg 360 gggcggtacc ggcaggctga agtccagctg ccagaaaccc acgtcatgcc agttcccgtg 420 cttgaagccg gccgcccgca gcatgccgcg gggggcatat ccgagcgcct cgtgcatgcg 480 cacgctcggg tcgttgggca gcccgatgac agcgaccacg ctcttgaagc cctgtgcctc 540 cagggacttc agcaggtggg tgtagagcgt ggagcccagt cccgtccgct ggtggcgggg 600 ggagacgtac acggtcgact cggccgtcca gtcgtaggcg ttgcgtgcct tccaggggcc 660 cgcgtaggcg atgccggcga cctcgccgtc cacctcggcg acgagccagg gatagcgctc 720 ccgcagacgg acgaggtcgt ccgtccactc ctgcggttcc tgcggctcgg tacggaagtt 780 gaccgtgctt gtctcgatgt agtggttgac gatggtgcag accgccggca tgtccgcctc 840 ggtggcacgg cggatgtcgg ccgggcgtcg ttctgggtcc attgttcttc tttactcttt 900 gtgtgactga ggtttggtct agtgctttgg tcatctatat ataatgataa caacaatgag 960 aacaagcttt ggagtgatcg gagggtctag gatacatgag attcaagtgg actaggatct 1020 acaccgttgg attttgagtg tggatatgtg tgaggttaat tttacttggt aacggccaca 1080 aaggcctaag gagaggtgtt gagaccctta tcggcttgaa ccgctggaat aatgccacgt 1140 ggaagataat tccatgaatc ttatcgttat ctatgagtga aattgtgtga tggtggagtg 1200 gtgcttgctc attttacttg cctggtggac ttggcccttt ccttatgggg aatttatatt 1260 ttacttacta tagagctttc ataccttttt tttaccttgg atttagttaa tatataatgg 1320 tatgattcat gaataaaaat gggaaatttt tgaatttgta ctgctaaatg cataagatta 1380 ggtgaaactg tggaatatat atttttttca tttaaaagca aaatttgcct tttactagaa 1440 ttataaatat agaaaaatat ataacattca aataaaaatg aaaataagaa ctttcaaaaa 1500

HU 225 433 Β1 acagaactat gtttaatgtg taaagattag tcgcacatca agtcatctgt tacaatatgt 1560 tacaacaagt cataagccca acaaagttag cacgtctaaa taaactaaag agtccacgaa 1620 aatattacaa atcataagcc caacaaagtt attgatcaaa aaaaaaaaac gcccaacaaa 1680 gctaaacaaa gtccaaaaaa aacttctcaa gtctccatct tcctttatga acattgaaaa 1740 ctatacacaa aacaagtcag ataaatctct ttctgggcct gtcttcccaa cctcctacat 1800 cacttcccta tcggattgaa tgttttactt gtaccttttc cgttgcaatg atattgatag 1860 tatgtttgtg aaaactaata gggttaacaa tcgaagtcat ggaatatgga tttggtccaa 1920 gattttccga gagctttcta gtagaaagcc catcaccaga aatttactag taaaataaat 1980 caccaattag gtttcttatt atgtgccaaa ttcaatataa ttatagagga tatttcaaat 2040 gaaaacgtat gaatgttatt agtaaatggt caggtaagac attaaaaaaa tcctacgtca 2100 gatattcaac tttaaaaatt cgatcagtgt ggaattgtac aaaaatttgg gatctactat 2160 atatatataa tgctttacaa cacttggatt tttttttgga ggctggaatt tttaatctac 2220 atatttgttt tggccatgca ccaactcatt gtttagtgta atactttgat tttgtcaaat 2280 atatgtgttc gtgtatattt gtataagaat ttctttgacc atatacacac acacatatat 2340 atatatatat atatattata tatcatgcac ttttaattga aaaaataata tatatatata 2400 tagtgcattt tttctaacaa ccatatatgt tgcgattgat ctgcaaaaat actgctagag 2460 taatgaaaaa tataatctat tgctgaaatt atctcagatg ttaagatttt cttaaagtaa 2520 attctttcaa attttagcta aaagtcttgt aataactaaa gaataataca caatctcgac 2580 cacggaaaaa aaacacataa taaatttgaa tttcgaccgc ggtacccgga attcgagctc 2640 ggtacccggg gatcttcccg atctagtaac atagatgaca ccgcgcgcga taatttatcc 2700 tagtttgcgc gctatatttt gttttctatc gcgtattaaa tgtataattg cgggactcta 2760 atcataaaaa cccatctcat aaataacgtc atgcattaca tgttaattat tacatgctta 2820 acgtaattca acagaaatta tatgataatc atcgcaagac cggcaacagg attcaatctt 2880 aagaaacttt attgccaaat gtttgaacga tctgcttcgg atcctctaga ccaagcttgc 2940 gggtttgtgt ttccatattg ttcatctccc attgatcgta ttaagaaagt atgatggtga 3000 tgtcgcagcc ttccgctttc gcttcacgga aaacctgaag cacactctcg gcgccatttt 3060 cagtcagctg cttgctttgt tcaaactgcc tccattccaa aacgagcggg tactccaccc 3120 atccggtcag acaatcccat aaagcgtcca ggttttcacc gtagtattcc ggaagggcaa 3180 gctccttttt caatgtctgg tggaggtcgc tgatacttct gatttgttcc ccgttaatga 3240 ctgctttttt catcggtagc taatttcttt aagtaaaaac tttgatttga gtgatgatgt 3300 tgtactgtta cacttgcacc acaagggcat atatagagca caagacatac acaacaactt 3360 gcaaaactaa cttttgttgg agcatttcga ggaaaatggg gagtagcagg ctaatctgag 3420 ggtaacatta aggtttcatg tattaatttg ttgcaaacat ggacttagtg tgaggaaaaa 3480 gtaccaaaat tttgtctcac cctgatttca gttatggaaa ttacattatg aagctgtgct 3540 agagaagatg tttattctag tccagccacc caccttatgc aagtctgctt ttagcttgat 3600 tcaaaaactg atttaattta cattgctaaa tgtgcatact tcgagcctat gtcgctttaa 3660 ttcgagtagg atgtatatat tagtacataa aaaatcatgt ttgaatcatc tttcataaag 3720 tgacaagtca attgtccctt cttgtttggc actatattca atctgttaat gcaaattatc 3780 cagttatact tagctagata tccaattttg aataaaaata gctcttgatt agtaaaccgg 3840 atagtgacaa agtcacatat ccatcaaact tctggtgctc gtggctaagt tctgatcgac 3900 atggggttaa aatttaaatt gggacacata aatagcctat ttgtgcaaat ctccccatcg 3960 aaaatgacag attgttacat ggaaaacaaa aagtcctctg atagaagtcg caaagtatca 4020 caattttcta tcgagagata gattgaaaga agtgcaggga agcggttaac tggaacataa 4080 cacaatgtct aaattaattg cattcgctaa ccaaaaagtg tattactctc tccggtccac 4140 aataagttat tttttggccc tttttttatg gtccaaaata agtgagtttt ttagatttca 4200 aaaatgattt aattattttt ttactacagt gcccttggag taaatggtgt tggagtatgt 4260 gttagaaatg tttatgtgaa gaaatagtaa aggttaatat gatcaatttc attgctattt 4320 aatgttaaaa tgtgaatttc ttaatctgtg tgaaaacacc aaaaaatcac ttattgtgga 4380 ccggagaaag tatataaata tatatttgga agcgactaaa aataaacttt tctcatatta 4440 tacgaaccta aaaacagcat atggtagttt ctagggaatc taaatcacta aaattaataa 4500 aagaagcaac aagtatcaat acatatgatt tacaccgtca aacacgaaat tcgtaaatat 4560 ttaatataat aaagaattaa tccaaatagc ctcccaccct atkacttaaa ctaaaaataa 4620 ccagcgaatg tatattatat gcataattta tatattaaat gtgtataatc atgtataatc 4680 aatgtataat ctatgtatat ggttagaaaa agtaaacaat taatatagcc ggctatttgt 4740 gtaaaaatcc ctaatataat cgcgacggat ccccgggaat tccggggaag cttagatcca 4800 tggagccatt tacaattgaa tatatcctgc cg 4832 <210> 3 <211 >60 <212> DNS

HU 225 433 Β1 <213> mesterséges szekvencia <220>

<223> Mesterséges szekvencia leírása: primer 248 <400>3 catgccctga cccaggctaa gtattttaac tttaaccact ttgctccgac agtcccattg 60 <210 4 <211 >60 <212> DNS <213> mesterséges szekvencia <220>

<223> Mesterséges szekvencia leírása: primer 249 <400> 4 caatgggact gtcggaggac tgagggccaa agcttggctc ttagcctggg tcagggcatg 60 <210>5 <211 >26 <212> DNS <213> mesterséges szekvencia <220>

<223> Mesterséges szekvencia leírása: primer 247 <400> 5 ccgtcaccga gatctgatct cacgcg 26 <210>6 <211 >24 <212> DNS <213> mesterséges szekvencia <220>

<223> Mesterséges szekvencia leírása: primer 250 <400> 6 gcactgaggg ccaaagcttg gctc 24 <210>7 <211 >25 <212> DNS <213> mesterséges szekvencia <220>

<223> Mesterséges szekvencia leírása: primer 251 <400> 7 ggatcccccg atgagctaag ctagc 25 <210>8 <211 >21 <212> DNS <213> mesterséges szekvencia <220>

<223> Mesterséges szekvencia leírása: primer 254 <400> 8 cttagcctgg gtcagggcat g 21 <210>9 <211 >20 <212> DNS <213> mesterséges szekvencia <220>

<223> Mesterséges szekvencia leírása: primer 258 <400> 9 ctacggcaat gtaccagctg 20

HU 225 433 Β1 <210> 10 <211 >23 <212> DNS <213> mesterséges szekvencia <220>

<223> Mesterséges szekvencia leírása: primer SP6 <400> 10 taatacgact cactataggg cga 23 <210> 11 <211 >22 <212> DNS <213> mesterséges szekvencia <220>

<223> Mesterséges szekvencia leírása: primer T7 <400> 11 tttaggtgac actatagaat ac 22 <210> 12 <211> 21 <212> DNS <213> mesterséges szekvencia <220>

<223> Mesterséges szekvencia leírása: primer 201 <400> 12 gcttggacta taatacctga c 21 <210> 13 <211> 953 <212> DNS <213> mesterséges szekvencia <220>

<223> Mesterséges szekvencia leírása: az MS-BN1 5’-végi szegélyezőrégióját tartalmazó szekvencia <220>

<221> vegyes sajátság <222> (1)...(24) <223> pGEM®-T vektor <400> 13 cccngccgcc atggccgcgg gattcttagc ctgggtcagg gcatgcatgg tgtgatccaa 60 agactttctc ggcccaaata ctaatcatca caagtcatgc atgatctgct cgggatggcc 120 aagaaaaatc gaacccatga caatattcac agttgtaagt tttttaccag tagacaaata 180 ccacttggtt taacatattg taaacttaat atatagaaga tgttcctatt cagaaaataa 240 tatatgtata tatataaaat tttattggcg actcgaggat gcacagaaat ataaaatgtt 300 ggtcgcttag accatctcca atgtatttct ctatttttac ctctaaaata aaggagctct 360 ataatagagg tgggttttgc tccaatgtat ttctttaaaa tagagatctc tacatataga 420 gcaaaatata gaggaatgtt atttcttcct ctataaatag aggagaaaat agcaatctct 480 attttagagg caaaaataga gatbsgttgg agtgattttg cctctaaatg ctattataga 540 ggtagaaata gaggtgggtt ggagatgctc ttactatttt catagtaggt gaaaacttga 600 aactagaaag ctttggagtg tacgagtgga aaacctctct ttgtagaaac atacacatgc 660 catttagtta actagttgac atagattttt gagtcagata actttaagaa tatatatgtt 720 tggatgagag tttgacactt tgagccactc gaaggacaaa ttttaaaaac ttgtgggatg 780 ctgtggccat aaaccttgag gacvstttga tcatattcta ttaactacag tacgaatatg 840 attcgacctt tgcaattttc tcttcaggta ctcggccgtc gaactcggcc gtcgagtaca 900 tggtcgataa gaaaaggcaa tttgtagatg ttaattccca tcttgaaaga aat 953 <210> 14 <211> 16 <212> DNS <213> mesterséges szekvencia <220>

HU 225 433 Β1 <223> Mesterséges szekvencia leírása: primer 611 <400> 14 ngtcgaswgt ntwcaa 16 <210> 15 <211 >22 <212> DNS <213> mesterséges szekvencia <220>

<223> Mesterséges szekvencia leírása: primer 259 <400> 15 gtgcagggaa gcggttaact gg 22 <210> 16 <211 >22 <212> DNS <213> mesterséges szekvencia <220>

<223> Mesterséges szekvencia leírása: primer 260 <400> 16 cctttggagt aaatggtgtt gg 22 <210> 17 <211 >20 <212> DNS <213> mesterséges szekvencia <220>

<223> Mesterséges szekvencia leírása: primer 24 <400> 17 gcgaatgtat attatatgca 20 <210> 18 <211 >537 <212> DNS <213> mesterséges szekvencia <220>

<223> Mesterséges szekvencia leírása: az MS-BN1 3'-végi szegélyezőrégióját tartalmazó szekvencia <400> 18 gcgaatgtat attatatgca taatttatat attaaatgtg tataatcatg tataatcaat 60 gtataatcta tgtatatggt tagaaaaagt aaacaattaa tatagccggc tatttgtgta 120 aaaatcccta atataatcga cggatccccg ggaattccgg gggaagctta gatccatgga 180 tttgttatga taaccaaaaa caccctcctt tttattataa aggtagggat agctaatctg 240 ttattcggtt ttgattagag atattaatcc cgttttatca agtacagttt gatgtatttt 300 tttgttcgtt ttcattacaa tccaagacaa gttaggttta ttacatttta ccaaaaaaaa 360 aggtttggtt tattgtgaac attgctgcgg tttatttaaa tttgattcta ttcaaaggtc 420 aatccgtatt taacaagtaa actagtcttt atataatctt aaatctaacg atctttgatt 480 tttaaattgc atttanctat gtcctctctg gcgtatatgg tctctttgaa aacactc 537 <210> 19 <211> 19 <212> DNS <213> mesterséges szekvencia <220>

<223> Mesterséges szekvencia leírása: primer 51 <400> 19 tgacactttg agccactcg 19 <210> 20 <211>20 <212> DNS

HU 225 433 Β1 <213> mesterséges szekvencia <220>

<223> Mesterséges szekvencia leírása: primer 48 <400> 20 ggagggtgtt tttggttatc 20 <210> 21 <211> 178 <212> DNS <213> mesterséges szekvencia <220>

<223> Mesterséges szekvencia leírása: az MS-BN1 célhely delécióját tartalmazó szekvencia <400> 21 gacactttga gccactcgaa ggacaaattt taaaaacttg tgggatgctg tggccataaa 60 ccttgaggac gctttgatca tattctatta actacagtac gaatatgatt cgacctttgc 120 aattttctct tgttttctaa ttcatatgga tttgttatga taaccaaaaa caccctcc 178 <210> 22 <211> 1198 <212> DNS <213> mesterséges szekvencia <220>

<223> Mesterséges szekvencia leírása: az MS-BN1 inszerciós régió <400> 22 catggtgtga tccaaagact ttctcggccc aaatactaat catcacaagt catgcatgat 60 ctgctcggga tggccaagaa aaatcgaacc catgacaata ttcacagttg taagtttttt 120 accagtagac aaataccact tggtttaaca tattgtaaac ttaatatata gaagatgttc 180 ctattcagaa aataatatat gtatatatat aaaattttat tggcgactcg aggatgcaca 240 gaaatataaa atgttggtcg cttagaccat ctccaatgta tttctctatt tttacctcta 300 aaataaagga gctctataat agaggtgggt tttgctccaa tgtatttctt taaaatagag 360 atctctacat atagagcaaa atatagagga atgttatttc ttcctctata aatagaggag 420 aaaatagcaa tctctatttt agaggcaaaa atagagatbs gttggagtga ttttgcctct 480 aaatgctatt atagaggtag aaatagaggt gggttggaga tgctcttact attttcatag 540 taggtgaaaa cttgaaacta gaaagctttg gagtgtacga gtggaaaacc tctctttgta 600 gaaacataca catgccattt agttaactag ttgacataga tttttgagtc agataacttt 660 aagaatatat atgtttggat gagagtttga cactttgagc cactcgaagg acaaatttta 720 aaaacttgtg ggatgctgtg gccataaacc ttgaggacvs tttgatcata ttctattaac 780 tacagtacga atatgattcg acctttgcaa ttttctcttc aggttttcta attcatatgg 840 atttgttatg ataaccaaaa acaccctcct ttttattata aaggtaggga tagctaatct 900 gttattcggt tttgattaga gatattaatc ccgttttatc aagtacagtt tgatgtattt 960 ttttgttcgt tttcattaca atccaagaca agttaggttt attacatttt accaaaaaaa 1020 aaggtttggt ttattgtgaa cattgctgcg gtttatttaa atttgattct attcaaaggt 1080 caatccgtat ttaacaagta aactagtctt tatataatct taaatctaac gatctttgat 1140 ttttaaattg catttancta tgtcctctct ggcgtatatg gtctctttga aaacactc 1198 <210> 23 <211 >22 <212> DNS <213> mesterséges szekvencia <220>

<223> Mesterséges szekvencia leírása: primer 193 <400> 23 tcatctacgg caatgtacca gc 22 <210> 24 <211> 1077 <212> DNS <213> mesterséges szekvencia <220>

<223> Mesterséges szekvencia leírása: az RF-BN 1 5’-végi szegélyezőrégióját tartalmazó szekvencia

HU 225 433 Β1 <220>

<221 > vegyes sajátság <222> (1)...(45) <223> pGEM®-T vektor <220>

<221 > vegyes sajátság <222> (1061)...(1077) <223> pGEM®-T vektor <400> 24 gagctctccc atatggtcga cctgcaggcg gccgcactag tgattcttag cctgggtcag 60 ggcatggcat gtctgatggt acatgctaaa tgctatattt cctgtttaaa gtgttaaaat 120 cattttctga tggaactaaa tccagtttta agagtaactg acaagtacaa ttaagcacaa 180 caatataata gtagtaattg gcatctttga ttgttaaata tcaaaacagt aaagttacaa 240 aaaaaaatac caaaccaata atgaagactt ggcggagaca gtgccgtgcg aaggttttcg 300 gaggtccgag acgagttcaa aaatacattt tacataatat atttttcata tatatatata 360 tataacattc aaaagtttga attattacat aaacgttttc taaattttct tcaccaaaat 420 tttataaact aaatttttaa atcatgaaca aaaagtatga atttgtaata taaatacaaa 480 gatacaaatt tttgattgaa atattggtag ctgtcaaaaa agtaaatctt agaatttaaa 540 ttaactatag taaactatat attgaaaata ttataaattt ttatcaaatt ctcataaata 600 tataaaataa atctaactca tagcatataa aaagaagact aatgtggatc aaaatattta 660 acctagttay ttaaggagaa gtccaattca aaatcaaata aaaataaaat ctatctaaaa 780 aaatatgtta actaccatgc aaaagtattt tttttgtaat tagaaaccct gaaatttgta 840 caaaacttgg acccctaggt aaatgccttt ttcatctcgc gataagaaaa ggcaatttgt 900 agatgttaat tcccatcttg aaagaaatat agtttaaata tttattgata aaataacaag 960 tcaggtatta tagtccaagc aaaaacataa atttattgat gcaagtttaa attcagaaat 1020 atttcaataa ctgattatat cagctggtac atcgccgtag aatcccgcgc catggcg 1077 <210> 25 <211> 16 <212> DNS <213> mesterséges szekvencia <220>

<223> Mesterséges szekvencia leírása: primer 286 <400> 25 ntgcgaswga nawgaa 16 <210> 26 <211> 19 <212> DNS <213> mesterséges szekvencia <220>

<223> Mesterséges szekvencia leírása: primer 314 <400> 26 gtaggaggtt gggaagacc 19 <210> 27 <211 >25 <212> DNS <213> mesterséges szekvencia <220>

<223> Mesterséges szekvencia leírása: primer 315 <400> 27 gggctttcta ctagaaagct ctcgg 25 <210> 28 <211 >24 <212> DNS <213> mesterséges szekvencia <220>

<223> Mesterséges szekvencia leírása: primer 316

HU 225 433 Β1 <400 28 ccgataggga agtgatgtag gagg 24 <210 29 <211> 21 <212> DNS <213> mesterséges szekvencia <220 <223> Mesterséges szekvencia leírása: primer 288 <400 29 atgcagcaag aagcttggag g 21 <210> 30 <211>1501 <212> DNS <213> mesterséges szekvencia <220>

<223> Mesterséges szekvencia leírása: az RF-BN1 3’-végi szegélyezőrégióját tartalmazó szekvencia <220>

<221 > vegyes sajátság <222> (1)...(16) <223> pGEM®-T vektor <220>

<221 > vegyes sajátság <222> (1458)...(1501) <223> pGEM®-T vektor <400> 30 ccatggccgc gggattgtag gaggttggga agacaggccc agaaagagat ttatctgact 60 cgttttgtgt atagttttca atgttcataa aggaagatgg agacttgaga agtttttttt 120 ggactttgtt tagctttgtt gggcgttttt tttttttgat caataacttt gttgggctta 180 tggtcgataa gcgtgcgcat gtctgatggt acatgctaaa tgctatattt ctgtttaaag 240 tgttaaaatc attttctgat ggaactaaat ccagttttaa gagtaactga caagtacaat 300 taagcacaac aataaaatag tagtaattgg catctttgat tgttaaatat caaaacaata 360 aagttacaaa aaaaaatacc aaaccaataa tgaagacttg gcggagacag tgccgtgcga 420 aggttttcgg aggtccgaga cgagttcaaa aatacatttt acataatata tttttcatat 480 atatatatat atataacatt caaaagtttg aattattaca taaacgtttt ctaaattttc 540 ttcaccaaaa ttttataaac taaaattttt raaatcatgaa caaaaagtat gaatttgtaa 600 tataaatacm aagatacaaa tttttgattg aaatattggt agctgtcaaa aaagtaaatc 660 ttagaattta aattaactat agtaaactat atatggaaaa tattataaat ttttatcaaa 720 ttctcataaa tatataaaat aaatctaact catagcatat aaaaagaaga ctaatgtgga 780 tcaaratatt tacagttttt tagaagtaga atctctatag ttttatttaa aatatagcaa 840 aaatgatcac aaacctagtt actttaacca gaagtccaat tcaaaatcaa ataaaaataa 900 aaatctatct aaaaaaatat gttaactacc atgcaaaagt attttttttt gtaattagaa 960 accctgaaat ttgtacaaaa cttggacccc taggtaaatt ccctagaaag tatcctatta 1020 gcgtcgacaa actgttgctc atatttttct ctccttactt tatatcatac actaatatan 1080 gnagatgatc taattaatta ttcatttcca tgctagctaa ttcaagaaaa agaaaaaaaa 1140 ctattatcta aacttatatt cgagcaacac ctcggagata acaggatata tgtcattaat 1200 gaatgcttga actcatctcg cgaactcatc tcgcatcgct tatagccaca aagatccaac 1260 ccctctcttc aatcatatat cagtagtaca atacaaatag atattgtgag cacatatgcc 1320 gtctagtact gatgtgtaca tgtagaggag ccgcaaatgt ttagtcactc caacaaatga 1380 gcatgaccac gcatcttctg atgatgtaca gccgtccctt ttgctctctc aaatatcctc 1440 caagcttctt gctgcataaa tcactagtgc ggccgcctgc aggtcgacca tatgggagag 1500 c 1501 <210> 31 <211> 21 <212> DNS <213> mesterséges szekvencia <220>

<223> Mesterséges szekvencia leírása: primer 269

HU 225 433 Β1 <400 31 ggttttcgga ggtccgagac g 21 <210> 32 <211 >21 <212> DNS <213> mesterséges szekvencia <220>

<223> Mesterséges szekvencia leírása: primer 283 <400> 32 cttggacccc taggtaaatg c 21 <210> 33 <211 >22 <212> DNS <213> mesterséges szekvencia <220>

<223> Mesterséges szekvencia leírása: primer 284 <400 33 gtacaaaact tggaccccta gg 22 <210> 34 <211> 1068 <212> DNS <213> mesterséges szekvencia <220>

<223> Mesterséges szekvencia leírása: az RF-BN1 célhely delécióját tartalmazó szekvencia <400 34 cgcgttggga gctctcccat atggtcgacc tgcaggcggc cgcactagtg attcttggac 60 ccctaggtaa atgccttttt caaaagcctc taagcacggt tctgggcggg gagtcagcga 120 gaaaaaaaga tatttcccta gaaagtatcc tattagcgtc gacaaactgt tgctcatatt 180 tttctctcct tactttatat catacactaa tataaaaaga tgatctaatt aattattcat 240 ttccatgcta gctaattcaa gaaaaagaaa aaaactatta tctaaactta tattcgagca 300 acacctcgga gataacagga tatatgttat taatgaatgc ttgaactcat ctcgcgaact 360 catctcgcat cgcttatagc cacaaagatc caacccctct cttcaatcat atatcagtag 420 tacaatacaa atagatattg tgagcacata tgccgtctag tactgatgtg tatatgtaga 480 gganngcaaa tgtttagtca ctccaacaaa tgagcatgac nacgcatctt ctgatgatgt 540 acagccgtcc cttttgctct ctcaaatatc ctccaagctt cttgctgcat ggaatcttct 600 tcttggtgtc tttcatgata acaaaatcta acgagagaga aacccttagt caagaaaaaa 660 caaataaaac tctaacgaga gtgtgtgaga aagtagagag tatgtgtgag tgacggagag 720 aaagtgagac cataaagatg ttgtgcaaag agagcaagac ttaacctata tatactcaca 780 tacacgtaca catcataccc attanagata ataaaaagga aaaaggaaca actaacaagg 840 gaactgtatc ccatacttta tctcatcata catgatgcat aatatattct ttcgtatatc 900 aagaaaaatg agcctgatat ttttttattt cgaaactaaa agagtgtcta tttctctctc 960 ttagagatag tgccatgtca aatttctaag aagtagcaag atttacaaag gaatctaaag 1020 caaccccacg cgcattgtgt tcatttctct cgaccatccc gcggccat 1068 <210> 35 <211> 21 <212> DNS <213> mesterséges szekvencia <220>

<223> Mesterséges szekvencia leírása: primer 57 <400> 35 gcatgatctg ctcgggatgg c 21 <210> 36 <211 >909 <212> DNS <213> mesterséges szekvencia

HU 225 433 Β1 <220>

<223> Mesterséges szekvencia leírása: a WOSR-ben található, az MS-BN1 5’-végi szegélyezőrégióját tartalmazó szekvencia <400> 36 tgcatgatct gctcgggatg gccaagaaaa atcgaaccca tgacaatatt cacagttgta 60 agttttttac cagtagacaa ataccacttg gtttaacata ttgtaaactt aatatataga 120 agatgttcct attcagaaaa taatatatgt atatatataa aattttattg gcgactcgag 180 gatgcacaga aatataaaat gttggtcgct tagaccatct ccaatgtatt tctctatttt 240 tacctctaaa ataaaggaac tctataatag aggtgggttt tactccaatg tatttcttta 300 aaatagagat ctctacatat agagcaaaat atagaggaat gttatttctt cctctataaa 360 tagaggagaa aatagcaatc tctattttag aggcaaaaat agagatgggt tggagtgatt 420 ttgcctctaa atgctattat agaggtagaa atagaggtgg gttggagatg ctcttactat 480 tttcatagta ggtgaaaact tgaaactaga aagctttgga gtgtacgagt ggaaaacctc 540 tctttgtaga aacatacaca tgccatttag ttaactagtt gacatagatt tttgagtcag 600 ataactttaa gaatatatat gtttggatga gagtttgaca ctttgagcca ctcgaaggac 660 aaattttaaa aacttgtggg atgctgtggc ccataaacct tgaggacgct ttgatcatat 720 tctattaact acagtacgaa tatgattcga cctttgcaat tttctcttca gtactcggcc 780 gtcgaactcg gccgtcgagt acatggtcga taagaaaagg caatttgtag atgttaattc 840 ccatcttgaa agaaatatag tttaaatatt tattggataa aataacaagt caggtattat 900 agtccaagc 909 <210> 37 <211>20 <212> DNS <213> mesterséges szekvencia <220>

<223> Mesterséges szekvencia leírása: primer 68 <400 37 ccatatacgc cagagaggac 20 <210> 38 <211>522 <212> DNS <213> mesterséges szekvencia <220>

<223> Mesterséges szekvencia leírása: a WOSR-ben található, az MS-BN1 3’-végi szegélyezőrégióját tartalmazó szekvencia <400> 38 gcgaatgtat attatatgca taatttatat attaaatgtg tataatcatg tataatcaat 60 gtataatcta tgtatatggt tagaaaaagt aaacaattaa tatagccggc tatttgtgta 120 aaaatcccta atataatcga cggatccccg ggaattccgg gggaagctta gatccatgga 180 tttgttatga taaccaaaaa caccctcctt tttattataa aggtagggat agctaatctg 240 ttattcggtt ttgattagag atattaatcc cgttttatca agtacagttt gatgtatttt 300 tttgttcgtt ttcattacaa tccaagacaa gttaggttta ttacatttta ccaaaaaaaa 360 aggtttggtt tattgtgaac attgctgcgg ttttatttaa atttgattct attcaaaggt 420 caatccgtat ttaacaagta aactagtctt tatataatct taaatctaac gatacttgga 480 tttttaaatt gcatttagct atgtcctctc tggcgtatat gg 522 <210> 39 <211 >694 <212> DNS <213> mesterséges szekvencia <220>

<223> Mesterséges szekvencia leírása: a WOSR-ben található, az RF-BN1 5’-végi szegélyezőrégióját tartalmazó szekvencia <400> 39 ggttttcgga ggtccgagac gagttcaaaa atacatttta cataatatat ttttcatata 60 tatatatata tataacattc aaaagtttga attattacat aaacgttttc taaattttct 120 tcaccaaaat tttataaact aaaattttta aatcatgaac aaaaagtatg aatttgtaat 180 ataaatacaa agatacaaat ttttgattga aatattggta gctgtcaaaa aagtaaatct 240

HU 225 433 Β1 tagaatttaa attaactata gtaaactata tattgaaaat attataaatt tttatcaaat 300 tctcataaat atataaaata aatctaactc atagcatata aaaagaagac taatgtggat 360 caaaatattt acagtttttt agaagtagaa tctttatagt tttatttaaa atatagcaaa 420 aatgatcaca aacctagtta ctttaaccag aagtccaatt caaaatcaaa taaaaataaa 480 aatctatcta aaaaaatatg ttaactacca tgcaaaagta tttttttttg taattagaaa 540 ccctgaaatt tgtacaaaac ttggacccct aggtaaatgc ctttttcatc tcgcgataag 600 aaaaggcaat ttgtagatgt taattcccat cttgaaagaa atatagttta aatatttatt 660 gataaaataa caagtcaggt attatagtcc aagc 694 <21O> 40 <211>1279 <212> DNS <213> mesterséges szekvencia <220>

<223> Mesterséges szekvencia leírása: a WOSR-ben található, az RF-BN1 3’-végi szegélyezőrégióját tartalmazó szekvencia <400> 40 gggggttttt ttttttgatc aataactttg ttgggcttat ggtcgataag cgtgcgcatg 60 tctgatggta catgctaaat gctatatttc tgtttaaagt gttaaaatca ttttctgatg 120 gaactaaatc cagttttaag agtaactgac aagtacaatt aagcacaaca ataaaatagt 180 agtaattggc atctttgatt gttaaatatc aaacaataaa gttcaaaaaa aaataccaac 240 ccaataatga agacttggcg gagacagtgc cgtgcgaagg ttttcggagg tccgagacga 300 gttcaaaaat acattttaca taatatattt ttcatatata tatatatata taacattcaa 360 aagtttgaat tattacataa acgttttcta aattttcttc accaaaattt tataaactaa 420 aatttttaaa tcatgaacaa aaagtatgaa tttgtaatat aaatacaaag atacaaattt 480 ttgattgaaa tattggtagc tgtcaaaaaa gtaaatctta gaatttaaat taactatagt 540 aaactatata ttgaaaatat tataaatttt tatcaaattc tcataaatat ataaaataaa 600 aagtagaatc tttatagttt tatttaaaat atagcaaaaa tgatcacaaa cctagttact 720 ttaaccagaa gtccaattca aaatcaaata aaaataaaaa tctatctaaa aaaatatgtt 780 aactaccatg caaaagtatt tttttttgta attagaaacc ctgaaatttg tacaaaactt 840 ggacccctag gtaaattccc tagaaagtat cctattagcg tcgacaaact gttgctcata 900 tttttctctc cttactttat atcatacact aatataaaaa gatgatctaa ttaattattc 960 atttccatgc tagctaattc aagaaaaaga aaaaaaactt attatctaaa cttatattcg 1020 agcaacacct cggagataac aggatatatg tcattaatga atgcttgaac tcatctcgcg 1080 aactcatctc gcatcgctta tagccacaaa gatccaaccc ctctcttcaa tcatatatca 1140 gtagtacaat acaaatagat attgtgagca catatgccgt ctagtactga tgtgtatatg 1200 tagaggagcc gcaaatgttt agtcactcca acaaatgagc atgaccacgc atcttctgat 1260 gatgtacagc cgtcccttt 1279 <210> 41 <211 >20 <212> DNS <213> mesterséges szekvencia <220>

<223> Mesterséges szekvencia leírása: primer 268 (BNA04) <400> 41 tggaccccta ggtaaatgcc 20 <210> 42 <211 >22 <212> DNS <213> mesterséges szekvencia <220>

<223> Mesterséges szekvencia leírása: primer BNA05 <400> 42 aacgagtgtc agctagacca gc 22 <210> 43 <211 >22 <212> DNS

HU 225 433 Β1 <213> mesterséges szekvencia <220 <223> Mesterséges szekvencia leírása: primer BNA06 <400 43 cgcagttctg tgaacatcga cc 22

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Téli olajrepce növény, mag, növényi sejt vagy szövet, amely tartalmazza az RF-BN1 jelű elit eseményt, és amelynek genomi DNS-ével és a 23. azonosító számú szekvencia szerinti, valamint a 41. azonosító számú szekvencia szerinti nukleotidszekvenciájú láncindítókkal végzett polimeráz-láncreakcióban egy 195-235 bázispár közötti nagyságú DNS-fragmens amplifikálható.
2. Az 1. igénypont szerinti növény, mag, növényi sejt vagy szövet, amelynek genomi DNS-ével és a 23. azonosító számú szekvencia szerinti, valamint a 41. azonosító számú szekvencia szerinti nukleotidszekvenciájú láncindítókkal végzett polimeráz-láncreakcióban egy mintegy 215 bázispár nagyságú DNS-fragmens amplifikálható.
3. Az 1. igénypont szerinti növény, mag, növényi sejt vagy szövet, amely tartalmazza az MS-BN1 jelű elit eseményt is, és amelynek genomi DNS-ével és a 12. azonosító számú szekvencia szerinti, valamint a 19. azonosító számú szekvencia szerinti nukleotidszekvenciájú láncindítókkal végzett polimeráz-láncreakcióban egy 260 és 300 bázispár közötti nagyságú DNS-fragmens amplifikálható.
4. A 3. igénypont szerinti növény, mag, növényi sejt vagy szövet, amelynek genomi DNS-ével és a 12. azonosító számú szekvencia szerinti, valamint a 19. azonosító számú szekvencia szerinti nukleotidszekvenciájú láncindítókkal végzett polimeráz-láncreakcióban egy mintegy 280 bázispár nagyságú DNS-fragmens amplifikálható.
5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti növény, mag, növényi sejt vagy szövet, amely egy növénynek az ATCC-nél PTA-730 deponálási szám alatt letétbe helyezett magból származó téli olajrepce növénnyel végzett keresztezésével állítható elő.
6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti növény, mag, növényi sejt vagy szövet, amely hibrid növény, mag, vagy hibrid növényi sejt vagy szövet.
7. Téli olajrepce növény, mag, növényi sejt vagy szövet, amely tartalmazza az MS-BN1 jelű elit eseményt, és amelynek genomi DNS-ével és a 12. azonosító számú szekvencia szerinti, valamint a 19. azonosító számú szekvencia szerinti nukleotidszekvenciájú láncindítókkal végzett polimeráz-láncreakcióban egy 260 és 300 bázispár közötti nagyságú DNS-fragmens amplifikálható.
8. A 7. igénypont szerinti növény, mag, növényi sejt vagy szövet, amelynek genomi DNS-ével és a 12. azonosító számú szekvencia szerinti, valamint a 19. azonosító számú szekvencia szerinti nukleotidszekvenciájú láncindítókkal végzett polimeráz-láncreakcióban egy mintegy 280 bázispár nagyságú DNS-fragmens amplifikálható.
9. Eljárás hibrid mag előállítására, azzal jellemezve, hogy

a) transzgenikus hímsteril téli olajrepce növényt, amely tartalmazza az MS-BN1 jelű elit eseményt, és amelynek genomi DNS-ével és a 12. azonosító számú szekvencia szerinti, valamint a 19. azonosító számú szekvencia szerinti nukleotidszekvenciájú láncindítókkal végzett polimeráz-láncreakcióban egy 260 és 300 bázispár közötti nagyságú DNS-fragmens amplifikálható, genomjában stabilan integráltan egy, az expressziót legalább az MS-BN1 jelű elit esemény hfmsterilitási génjét expresszáló sejtekben vezérelni képes promoter vezérlése alatt álló ribonukleázinhibitort kódoló DNS-t magában foglaló fertilitás-helyreállitó gént tartalmazó fertilitás-helyreállító téli olajrepce növénnyel keresztezünk, majd

b) a hímsteril téli olajrepce növényből kinyerjük a hibrid magot.
10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan fertilitás-helyreállitó növényt alkalmazunk, amely tartalmazza az RF-BN1 jelű elit eseményt, és amelynek genomi DNS-ével és a 23. azonosító számú szekvencia szerinti, valamint a 41. azonosító számú szekvencia szerinti nukleotidszekvenciájú láncindítókkal végzett polimeráz-láncreakcióban egy mintegy 215 bázispár nagyságú DNS-fragmens amplifikálható.
11. Transzgenikus hibrid téli olajrepcemag, amely a 9. vagy 10. igénypont szerinti eljárással előállítható.
12. Eljárás az MS-BN1 jelű elit eseményt tartalmazó transzgenikus növény, vagy annak sejtje vagy szövete azonosítására, azzal jellemezve, hogy megállapítjuk, genomi DNS-ével és a 12. azonosító számú szekvencia szerinti, valamint a 19. azonosító számú szekvencia szerinti nukleotidszekvenciájú láncindítókkal végzett polimeráz-láncreakcióban amplifikálható-e egy 260 és 300 bázispár közötti nagyságú DNS-fragmens.
13. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy megállapítjuk, a transzgenikus növényből, vagy annak sejtjéből vagy szövetéből származó genomi DNS-sel és a 12. azonosító számú szekvencia szerinti, valamint a 19. azonosító számú szekvencia szerinti nukleotidszekvenciájú láncindítókkal végzett polimeráz-láncreakcióban amplifikálható-e egy mintegy 280 bázispár nagyságú DNS-fragmens.
14. Reagenskészlet MS-BN1 jelű elit eseményt tartalmazó transzgenikus növény, annak sejtje vagy szövete azonosítására szolgáló PCR azonosítási eljárás37

HU 225 433 Β1 bán történő alkalmazásra, amely reagenskészlet egy, az 1. azonosító számú szekvencián belüli MS-BN1eredetű idegen DNS-szekvenciát felismerő, valamint egy, az MS-BN1 13. azonosító számú szekvencia szerinti 5’ szegélyezőszekvenciájában vagy az MS-BN1 18. azonosító számú szekvencia szerinti 3’ szegélyezőszekvenciájában található szekvenciát felismerő PCR-láncindítót tartalmaz.
15. A 14. igénypont szerinti reagenskészlet, amelyben az idegen DNS-szekvenciát felismerő PCR-láncindító a 13. azonosító számú szekvencián belüli vagy a 18. azonosító számú szekvencián belüli MS-BN1-eredetű idegen DNS-szekvenciát ismer fel.
16. A 14. igénypont szerinti reagenskészlet, amely 12. azonosító számú szekvencia, valamint 19. azonosító számú szekvencia szerinti nukleotidszekvenciát tartalmazó PCR-láncind(tókat tartalmaz.
17. Eljárás az RF-BN1 jelű elit eseményt tartalmazó transzgenikus növény, vagy annak sejtje vagy szövete azonosítására, azzal jellemezve, hogy megállapítjuk, genomi DNS-ével és a 23. azonosító számú szekvencia szerinti, valamint a 41. azonosító számú szekvencia szerinti nukleotidszekvenciájú láncindítókkal végzett polimeráz-láncreakcióban amplifikálható-e egy 195 és 235 bázispár közötti nagyságú DNS-fragmens.
18. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy megállapítjuk, a transzgenikus növényből, vagy annak sejtjéből vagy szövetéből származó genomi DNS-sel és a 23. azonosító számú szekvencia szerinti, valamint a 41. azonosító számú szekvencia szerinti nukleotidszekvenciájú láncindítókkal végzett polimeráz-láncreakcióban amplifikálható-e egy mintegy 215 bázispár nagyságú DNS-fragmens.
19. Reagenskészlet RF-BN1 jelű elit eseményt tartalmazó transzgenikus növény, annak sejtje vagy szövete azonosítására szolgáló PCR azonosítási eljárásban történő alkalmazásra, amely reagenskészlet egy, a 2. azonosító számú szekvencián belüli RF-BN1-eredetű idegen DNS-szekvenciát felismerő, valamint egy, az RF-BN1 24. azonosító számú szekvencia szerinti 5’ szegélyezőszekvenciájában vagy az RF-BN1 30. azonosító számú szekvencia szerinti 3’ szegélyezőszekvenciájában található szekvenciát felismerő PCR-láncindítót tartalmaz.
20. A 19. igénypont szerinti reagenskészlet, amelyben az idegen DNS-szekvenciát felismerő PCR-láncindító a 24. azonosító számú szekvencián belüli vagy a 30. azonosító számú szekvencián belüli MS-BN1-eredetű idegen DNS-szekvenciát ismer fel.
21. A 19. igénypont szerinti reagenskészlet, amely 23. azonosító számú szekvencia, valamint 41. azonosító számú szekvenciát tartalmazó nukleotidszekvenciájú PCR-láncindftókat tartalmaz.
22. Reagenskészlet az MS-BN1 jelű elit esemény biológiai mintákból történő kimutatására, amely reagenskészlet az MS-BN1 13. azonosító számú szekvencián belül található 5’ szegélyezőszekvenciáját vagy az MS-BN1 18. azonosító számú szekvencián belül található 3’ szegélyezőszekvenciáját felismerő legalább egy PCR-láncindítót vagy -próbát tartalmaz.
23. A 22. igénypont szerinti reagenskészlet, amely az MS-BN1 5' szegélyezőszekvenciáját felismerő láncindítóként 19. azonosító számú szekvenciát magában foglaló láncindítót vagy próbát tartalmaz.
24. A 22. vagy 23. igénypont szerinti reagenskészlet, amely a fentieken kívül tartalmaz még legalább egy második, az 1. azonosító számú szekvencián belüli, MS-BN1-eredetű idegen DNS-szekvenciát felismerő PCR-láncindítót vagy -próbát.
25. A 24. igénypont szerinti reagenskészlet, amelyben az idegen DNS-szekvenciát felismerő második PCR-láncindító a 13. azonosító számú szekvencián belüli vagy a 18. azonosító számú szekvencián belüli MS-BN1-eredetű idegen DNS-szekvenciát ismer fel.
26. A 24. igénypont szerinti reagenskészlet, amely második láncindítóként vagy próbaként a 12. azonosító számú szekvenciát magában foglaló láncindltót vagy próbát tartalmaz.
27. Eljárás mag tisztaságának igazolására, azzal jellemezve, hogy az MS-BN1 13. azonosító számú szekvencián belüli 5’ szegélyezőszekvenciáját vagy 18. azonosító számú szekvencián belüli 3’ szegélyezőszekvenciáját specifikusan felismerő láncindítóval vagy próbával magmintából MS-BN1-specifikus DNS-szekvencia jelenlétét mutatjuk ki.
28. Eljárás magok MS-BN1 jelenlétére történő szkrínelésére, azzal jellemezve, hogy az MS-BN1 13. azonosító számú szekvencián belüli 5' szegélyezőszekvenciáját vagy 18. azonosító számú szekvencián belüli 3’ szegélyezőszekvenciáját specifikusan felismerő láncindítóval vagy próbával magmintatételekből MS-BN1specifikus DNS-szekvencia jelenlétét mutatjuk ki.
29. Reagenskészlet RF-BN1 jelű elit esemény biológiai mintákból történő kimutatására, amely reagenskészlet az RF-BN1 24. azonosító számú szekvencián belül található 5’ szegélyezőszekvenciáját vagy az RF-BN1 30. azonosító számú szekvencián belül található 3’ szegélyezőszekvenciáját felismerő legalább egy PCR-láncindítót vagy -próbát tartalmaz.
30. A 29. igénypont szerinti reagenskészlet, amely az RF-BN1 5’ szegélyezőszekvenciáját felismerő láncindítóként vagy próbaként 41. azonosító számú szekvenciát magában foglaló láncindítót vagy próbát tartalmaz.
31. A 29. vagy 30. igénypont szerinti reagenskészlet, amely a 2. azonosító számú szekvencián belüli, RFBN1-eredetű idegen DNS-szekvenciát felismerő legalább egy második PCR-láncindítót vagy -próbát is tartalmaz.
32. A 31. igénypont szerinti reagenskészlet, amelyben az idegen DNS-szekvenciát felismerő második PCR-láncindító a 24. azonosító számú szekvencián belüli vagy a 30. azonosító számú szekvencián belüli RF-BN1-eredetű idegen DNS-szekvenciát ismer fel.
33. A 31. igénypont szerinti reagenskészlet, amely második láncindítóként vagy próbaként 23. azonosító számú szekvenciát magában foglaló láncindítót tartalmaz.
34. Eljárás mag tisztaságának igazolására, azzal jellemezve, hogy az RF-BN1 24. azonosító számú szekvencián belüli 5’ szegélyezőrégióját vagy 30. azonosító számú szekvencián belüli 3’ szegélyezőrégióját

HU 225 433 Β1 specifikusan felismerő specifikus láncindítóval vagy próbával magmintából RF-BN1-specifikus DNS-szekvencia jelenlétét mutatjuk ki.
35. Eljárás magok RF-BN1 jelenlétére történő szkrínelésére, azzal jellemezve, hogy az RF-BN1 24. azonosító számú szekvencián belüli 5’ szegélyezőrégióját vagy 30. azonosító számú szekvencián belüli 3’ szegélyezőrégióját specifikusan felismerő specifikus láncindítóval vagy próbával magmintatételekből RF-BN15 specifikus DNS-szekvencia jelenlétét mutatjuk ki.