PL205071B1 - Roślina ozimego rzepaku oleistego, nasiono, sposób wytwarzania nasion hybrydowych, sposób identyfikacji transgenicznej rośliny albo jej komórek albo tkanek, zestaw do identyfikacji rośliny transgenicznej, jej komórek albo tkanek, zestaw do identyfikacji elitarnego zdarzenia MS-BN1 lub RF-BN1 w próbkach biologicznych, sposób potwierdzania czystości nasion, sposób przesiewowego badania nasion pod kątem występowania MS-BN1 i RF-BN1 - Google Patents
Roślina ozimego rzepaku oleistego, nasiono, sposób wytwarzania nasion hybrydowych, sposób identyfikacji transgenicznej rośliny albo jej komórek albo tkanek, zestaw do identyfikacji rośliny transgenicznej, jej komórek albo tkanek, zestaw do identyfikacji elitarnego zdarzenia MS-BN1 lub RF-BN1 w próbkach biologicznych, sposób potwierdzania czystości nasion, sposób przesiewowego badania nasion pod kątem występowania MS-BN1 i RF-BN1Info
- Publication number
- PL205071B1 PL205071B1 PL356533A PL35653300A PL205071B1 PL 205071 B1 PL205071 B1 PL 205071B1 PL 356533 A PL356533 A PL 356533A PL 35653300 A PL35653300 A PL 35653300A PL 205071 B1 PL205071 B1 PL 205071B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- seq
- sequence
- dna
- plant
- seed
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 73
- 235000006008 Brassica napus var napus Nutrition 0.000 title claims abstract description 39
- 240000000385 Brassica napus var. napus Species 0.000 title 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 246
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 87
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 claims abstract description 75
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims abstract description 54
- 206010021929 Infertility male Diseases 0.000 claims abstract description 23
- 208000007466 Male Infertility Diseases 0.000 claims abstract description 23
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 17
- 101000708283 Oryza sativa subsp. indica Protein Rf1, mitochondrial Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 282
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 118
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 65
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 60
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 60
- 230000035558 fertility Effects 0.000 claims description 36
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 32
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 25
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 25
- 108020005029 5' Flanking Region Proteins 0.000 claims description 22
- 108020005065 3' Flanking Region Proteins 0.000 claims description 13
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 13
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 5
- 101710141795 Ribonuclease inhibitor Proteins 0.000 claims description 2
- 229940122208 Ribonuclease inhibitor Drugs 0.000 claims description 2
- 102100037968 Ribonuclease inhibitor Human genes 0.000 claims description 2
- 239000012297 crystallization seed Substances 0.000 claims description 2
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 claims description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 32
- 230000009418 agronomic effect Effects 0.000 abstract description 19
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 abstract description 16
- 230000009466 transformation Effects 0.000 abstract description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 2
- 239000010773 plant oil Substances 0.000 abstract 1
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 131
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 51
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 34
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 31
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 28
- 108020005120 Plant DNA Proteins 0.000 description 21
- 108010016529 Bacillus amyloliquefaciens ribonuclease Proteins 0.000 description 19
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 19
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 19
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 18
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 18
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 18
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 17
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 17
- 239000000047 product Substances 0.000 description 15
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 14
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 13
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 12
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 12
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 12
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 12
- 235000011293 Brassica napus Nutrition 0.000 description 11
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- 101710183938 Barstar Proteins 0.000 description 10
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 10
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 10
- IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N Phosphinothricin Natural products CP(O)(=O)CCC(N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 9
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 9
- 208000021267 infertility disease Diseases 0.000 description 9
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 9
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 8
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 8
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 7
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 7
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 6
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 6
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 6
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 6
- 239000005561 Glufosinate Substances 0.000 description 5
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 5
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 5
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 5
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- -1 polyethylene Polymers 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 241000193744 Bacillus amyloliquefaciens Species 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 4
- DPUOLQHDNGRHBS-KTKRTIGZSA-N erucic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCCCCC(O)=O DPUOLQHDNGRHBS-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 4
- IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N glufosinate-P Chemical compound CP(O)(=O)CC[C@H](N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 3
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 3
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 3
- 241000219198 Brassica Species 0.000 description 3
- DPUOLQHDNGRHBS-UHFFFAOYSA-N Brassidinsaeure Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCCCCCC(O)=O DPUOLQHDNGRHBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- URXZXNYJPAJJOQ-UHFFFAOYSA-N Erucic acid Natural products CCCCCCC=CCCCCCCCCCCCC(O)=O URXZXNYJPAJJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 3
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 3
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 3
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 3
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 3
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 108010082527 phosphinothricin N-acetyltransferase Proteins 0.000 description 3
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- ZBMRKNMTMPPMMK-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4-[hydroxy(methyl)phosphoryl]butanoic acid;azane Chemical compound [NH4+].CP(O)(=O)CCC(N)C([O-])=O ZBMRKNMTMPPMMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 2
- 244000060924 Brassica campestris Species 0.000 description 2
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 description 2
- LMKYZBGVKHTLTN-NKWVEPMBSA-N D-nopaline Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(O)=O)N[C@@H](C(O)=O)CCC(O)=O LMKYZBGVKHTLTN-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 2
- YAHZABJORDUQGO-NQXXGFSBSA-N D-ribulose 1,5-bisphosphate Chemical compound OP(=O)(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)C(=O)COP(O)(O)=O YAHZABJORDUQGO-NQXXGFSBSA-N 0.000 description 2
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 241000187391 Streptomyces hygroscopicus Species 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 2
- 101150103518 bar gene Proteins 0.000 description 2
- GINJFDRNADDBIN-FXQIFTODSA-N bilanafos Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCP(C)(O)=O GINJFDRNADDBIN-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- 244000309464 bull Species 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- NOPFSRXAKWQILS-UHFFFAOYSA-N docosan-1-ol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCO NOPFSRXAKWQILS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000024346 drought recovery Effects 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 231100001222 nononcogenic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 2
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- SNBCLPGEMZEWLU-QXFUBDJGSA-N 2-chloro-n-[[(2r,3s,5r)-3-hydroxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl]acetamide Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CNC(=O)CCl)[C@@H](O)C1 SNBCLPGEMZEWLU-QXFUBDJGSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 235000011331 Brassica Nutrition 0.000 description 1
- 235000011303 Brassica alboglabra Nutrition 0.000 description 1
- 235000005637 Brassica campestris Nutrition 0.000 description 1
- 235000011302 Brassica oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 235000003899 Brassica oleracea var acephala Nutrition 0.000 description 1
- 235000011301 Brassica oleracea var capitata Nutrition 0.000 description 1
- 235000001169 Brassica oleracea var oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 101100094921 Caenorhabditis elegans rft-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- UAUDZVJPLUQNMU-UHFFFAOYSA-N Erucasaeureamid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCCCCCC(N)=O UAUDZVJPLUQNMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010046276 FLP recombinase Proteins 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 241001123946 Gaga Species 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 1
- 241000221662 Sclerotinia Species 0.000 description 1
- 208000037065 Subacute sclerosing leukoencephalitis Diseases 0.000 description 1
- 206010042297 Subacute sclerosing panencephalitis Diseases 0.000 description 1
- 241000235033 Zygosaccharomyces rouxii Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 235000019730 animal feed additive Nutrition 0.000 description 1
- 230000007152 anther development Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 239000008162 cooking oil Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000000093 cytochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 229960000735 docosanol Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- UAUDZVJPLUQNMU-KTKRTIGZSA-N erucamide Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCCCCC(N)=O UAUDZVJPLUQNMU-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007614 genetic variation Effects 0.000 description 1
- 102000005396 glutamine synthetase Human genes 0.000 description 1
- 108020002326 glutamine synthetase Proteins 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 239000010720 hydraulic oil Substances 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012184 mineral wax Substances 0.000 description 1
- 238000007479 molecular analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 238000003976 plant breeding Methods 0.000 description 1
- 230000010152 pollination Effects 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000005849 recognition of pollen Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
- 101150085703 vir gene Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8287—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for fertility modification, e.g. apomixis
- C12N15/8289—Male sterility
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
- C12Q1/683—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism involving restriction enzymes, e.g. restriction fragment length polymorphism [RFLP]
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Botany (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Springs (AREA)
- Bending Of Plates, Rods, And Pipes (AREA)
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest roślina ozimego rzepaku oleistego, nasiono ozimego rzepaku oleistego, sposób wytwarzania nasion hybrydowych, sposób identyfikacji transgenicznej rośliny albo jej komórek albo tkanek, zestaw do identyfikacji rośliny transgenicznej, jej komórek albo tkanek, zestaw do identyfikacji elitarnego zdarzenia MS-BN1 lub RF-BN1 w próbkach biologicznych, sposób potwierdzania czystości nasion, sposób przesiewowego badania nasion pod kątem występowania MS-BN1 i RF-BN1.
Rośliny ozimego rzepaku oleistego (ang. winter oilseed rape - WOSR), konkretnie pary roślin ozimego rzepaku oleistego są szczególnie użyteczne do wytwarzania nasion hybrydowych. Jedna z takich roślin jest sterylna względem gamet męskich z powodu występowania w jej genomie genu sterylności gamet męskich, podczas gdy druga niesie gen odtwarzający płodność, zdolny do zapobiegania działaniu genu sterylności względem gamet męskich. Taka para roślin WOSR łączy zdolność do tworzenia nasion hybrydowych z ogólnymi właściwościami agronomicznymi, stabilnością genetyczną i zdolnoś cią do adaptacji do róż nego podł o ż a genetycznego.
Wszystkie cytowane tu dokumenty jednocześnie stanowią odniesienia literaturowe.
Wyrażenie się fenotypu transgenicznej rośliny jest określone zarówno przez strukturę samego genu jak i jego umiejscowienie w genomie rośliny. Jednocześnie występowanie transgenu w różnych miejscach genomu będzie wpływało, w różny sposób na fenotyp rośliny. Pomyślne agronomiczne lub przemysłowe wprowadzenie komercyjnie interesującego szczepu rośliny przez manipulację genetyczną może być długą, zależną od różnych czynników procedurą. W rzeczywistości transformacja i regeneracja genetycznie stransformowanych roślin są jedynie pierwszymi etapami z szeregu selekcji obejmujących wszechstronną charakterystykę genetyczną, hodowlę i ocenę w testach polowych.
Rzepak oleisty (OSR) (Brassica napus, AACC, 2n=38) jest naturalną hybrydą uzyskaną z międzygatunkowej krzyżówki pomiędzy kapustą warzywną (Brassica oleracea, CC, 2n=18) i kapustą polną (Brassica campestris, AA, 2n=20). Ozimy rzepak oleisty siany w ciągu dziesięciu ostatnich dni sierpnia i pierwszych dziesięciu dni września i zbierany począwszy od lipca, wymaga działania odpowiedniej temperatury przez określony czas dla wernalizacji. Szybko rosnące odmiany jare siane pod koniec marca i na początku kwietnia, zbierane są od połowy sierpnia do września. Obecnie uprawiane rodzaje OSR są odmianami o niskiej i wysokiej zawartości kwasu erukowego. Podwójnie ubogie (00) odmiany zawierają bardzo małą ilość (typowo mniej niż 1%) kwasów erukowych (ciężko strawnych dla człowieka) i bardzo mało glukozynianów (które powodują, że dodatek do pokarmu dla zwierząt jest niestrawny). Obecne zastosowanie odmian „00 obejmuje olej spożywczy dla ludzi i wysoko białkowy pokarm dla zwierząt. Zastosowania przemysłowe obejmują użycie jako produkt wyjściowy dla farmaceutyków i olejów hydraulicznych. Odmiany rzepaku o wysokiej zawartości kwasu erukowego (HEAR) są uprawiane specjalnie z uwagi na wysoką zawartość kwasu erukowego - typowo 50-60% oleju. Typowym, końcowym zastosowaniem HEAR jest produkcja erukamidu „czynnika ślizgowego stosowanego w produkcji polietanu. Mała ilość jest używana dla produkcji alkoholu behenylowego, który dodany do nieoczyszczonego wosku mineralnego zwiększa jego płynność.
Rośliny rzepaku oleistego są obupłciowe i typowo 60-70% ulega samozapyleniu. Wytwarzanie hybryd i wprowadzenie zmienności genetycznej jako podstawy dla selekcji tradycyjnie zależało od wykorzystania naturalnie występującego zjawiska, takiego jak samo niezgodność i warunkowana cytoplazmatycznie męskosterylność. Sposoby kontroli sztucznego zapylenia, takie jak ręczne kastrowanie lub stosowanie środków gametobójczych nie są szeroko stosowane w hodowli OSR z uwagi, odpowiednio, na ich ograniczoną praktyczność i wysoki koszt.
Sposoby otrzymywania transgenicznych roślin zostały opracowane dla wytworzenia męsko lub żeńsko sterylnych roślin dostarczając interesujących alternatyw dla tradycyjnych sposobów. EP 0,344,029 opisuje system uzyskania jądrowo warunkowanej sterylności względem gamet męskich, w którym rośliny są transformowane genem warunkującym sterylność gamet męskich, który zawiera przykładowo DNA kodujący gen barnase, znajdujący się pod kontrolą specyficznego dla tapetum promotora PTA29, który gdy jest włączony do rośliny daje pewność selektywnego niszczenia komórek tapetum. Transformacja tytoniu i roślin rzepaku oleistego takim genem daje rośliny, u których całkowicie zapobiega się wytwarzaniu pyłku (Mariani i wsp., 1990, Nature 347: 737-741). Dla odtworzenia płodności u potomstwa męsko sterylnej rośliny, opracowano system w którym roślina sterylna względem gamet męskich jest krzyżowana z transgeniczną rośliną niosąca gen odtwarzający płodność, który gdy ulega ekspresji jest zdolny do hamowania lub przeciwdziałania aktywności genu sterylności
PL 205 071 B1 względem gamet męskich (US 5,689,041; US 5,792,929). Taki gen odtwarzający płodność jest umieszczony pod kontrolą promotora powodującego ekspresję przynajmniej w komórkach, w których wyrażany jest gen męsko sterylności. Mariani i wsp. (1992, Nature 357: 384-387) pokazali, że sterylność kodowana przez pTA29:barnase, może być u rzepaku oleistego zniesiona przez chimerowy konstrukt pTA29:barstar.
Cytochemiczne i histochemiczne badania rozwoju pylnika roślin Brassica napus niosących chimerowy konstrukt pTA29:barnase, sam lub z pTA29:barstar, są opisane przez De Block i De Brouwer (1993, Planta 189: 218-225).
Pomyślną transformację gatunków Brassica uzyskano stosując szereg sposobów włącznie z infekcją Agrobacterium (jak przykładowo opisano w EP 0,116,718 i EP 0,270,882), bombardowanie mikro pociskami (jak opisano przykładowo przez Chen i wsp., 1994, Theor. Appl. Genet. 88: 187-192) i bezpoś rednie wprowadzenie DNA (jak przykł adowo opisano przez De Block i wsp., 1989, Plany Physiol. 914: 694-701; Poulsen, 1996, Plant Breeding 115: 209-225). Jednakże, wspomniane dokumenty nie sugerują, ani nie nauczają tego co jest zawarte w niniejszym wynalazku.
Niniejszy wynalazek dotyczy rośliny ozimego rzepaku oleistego obejmującej elitarne wydarzenie RF-BN1, które charakteryzuje się tym, że genomowy DNA może być zastosowany do amplifikacji fragmentu DNA o długości pomiędzy 195 a 235 par zasad, w reakcji łańcuchowej polimerazy z dwoma starterami o sekwencji nukleotydowej z SEK NR ID: 23 i SEK NR ID: 41 odpowiednio, przy czym roślinę można uzyskać z nasion zdeponowanych zgodnie z ATCC pod numerem dostępu PTA-730. W korzystnej roślinie genomowy DNA może być użyty do amplifikacji fragmentu DNA o długości około 215 par zasad w reakcji łańcuchowej polimerazy z dwoma starterami o sekwencji nukleotydowej z SEK NR ID: 23 i SEK NR ID: 41 odpowiednio. Korzystnie roś lina ponadto obejmuje elitarne wydarzenie MS-BN1, które charakteryzuje się tym, że genomowy DNA może być zastosowany do amplifikacji fragmentu DNA o długości pomiędzy 260 a 300 par zasad w reakcji łańcuchowej polimerazy z dwoma starterami o sekwencji nukleotydowej z SEK NR ID: 12 i SEK NR ID: 19 odpowiednio.
W korzystnej roślinie genomowy DNA może być zastosowany do amplifikacji fragmentu DNA o dł ugości okoł o 280 par zasad w reakcji ł a ń cuchowej polimerazy z dwoma starterami o sekwencji nukleotydowej z SEK NR ID: 12 i SEK NR ID: 19 odpowiednio. Korzystnie roślina może być otrzymana przez skrzyżowanie rośliny z rośliną ozimego rzepaku oleistego uzyskaną z nasion złożonych w ATCC pod numerem dostępu PTA-730. Korzystna roślina jest rośliną hybrydową.
Wynalazek dotyczy również rośliny ozimego rzepaku oleistego, obejmującej elitarne wydarzenie MS-BN1, które charakteryzuje się tym, że genomowy DNA może być zastosowany do amplifikacji fragmentu DNA o długości pomiędzy 260 a 300 par zasad w reakcji łańcuchowej polimerazy z dwoma starterami o sekwencji nukleotydowej z SEK NR ID: 12 i SEK NR ID: 19 odpowiednio, przy czym roślinę można uzyskać z nasion zdeponowanych zgodnie z ATCC pod numerem dostępu PTA-730. W korzystnej roślinie genomowy DNA może być zastosowany do amplifikacji fragmentu DNA o długości około 280 par zasad w reakcji łańcuchowej polimerazy z dwoma starterami o sekwencji nukleotydowej z SEK NR ID: 12 i SEK NR ID: 19, odpowiednio.
Ponadto wynalazek dotyczy nasiona ozimego rzepaku oleistego, które obejmuje elitarne wydarzenie RF-BN1, charakteryzujące się tym, że genomowy DNA może być zastosowany do amplifikacji fragmentu DNA o długości pomiędzy 195 a 235 par zasad w reakcji łańcuchowej polimerazy z dwoma starterami o sekwencji nukleotydowej z SEK NR ID: 23 i SEK NR ID: 41 odpowiednio, przy czym nasiono można uzyskać z nasion zdeponowanych zgodnie w ATCC pod numerem dostępu PTA-730. Korzystnie nasiono ponadto obejmuje elitarne wydarzenie MS-BN1, charakteryzujące się tym, że genomowy DNA może być zastosowany do amplifikacji fragmentu DNA o długości pomiędzy 260 a 300 par zasad w reakcji łańcuchowej polimerazy z dwoma starterami o sekwencji nukleotydowej z SEK NR ID: 12 i SEK NR ID: 19 odpowiednio.
Nasiono korzystnie jest nasionem hybrydowym.
Wynalazek również dotyczy nasiona ozimego rzepaku oleistego obejmującego elitarne wydarzenie MS-BN1, które charakteryzuje się tym, że genomowy DNA może być zastosowany do amplifikacji fragmentu DNA o długości pomiędzy 260 a 300 par zasad w reakcji łańcuchowej polimerazy z dwoma starterami o sekwencji nukleotydowej z SEK NR ID: 12 i SEK NR ID: 19 odpowiednio, przy czym nasiono można uzyskać z nasion zdeponowanych zgodnie z ATCC pod numerem dostępu PTA-730. Nasiono korzystnie jest nasionem hybrydowym.
PL 205 071 B1
Ponadto wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania nasion hybrydowych, który obejmuje etapy
a) identyfikowania transgenicznej, sterylnej względem gamet męskich rośliny ozimego rzepaku oleistego, obejmującego elitarne wydarzenie MS-BN1, które charakteryzuje się tym, że genomowy DNA może być zastosowany do amplifikacji fragmentu DNA o długości pomiędzy 260 a 300 par zasad w reakcji łańcuchowej polimerazy z dwoma starterami o sekwencji nukleotydowej z SEK NR ID: 12 i SEK NR ID: 19 odpowiednio, przy czym transgeniczną sterylną względem gamet męskich roślinę ozimego rzepaku oleistego można uzyskać z nasion zdeponowanych zgodnie z ATCC pod numerem dostępu PTA-730,
b) krzyżowania transgenicznej sterylnej względem gamet męskich rośliny ozimego rzepaku oleistego zidentyfikowanej w etapie a) z rośliną ozimego rzepaku oleistego odtwarzającą płodność, zawierającą stabilnie wbudowany do genomu gen odtwarzający płodność obejmujący:
DNA kodujący inhibitor rybonukleazy pod kontrolą promotora odpowiedzialnego za ekspresję tego DNA co najmniej w komórkach, w których wyrażany jest gen sterylności względem gamet męskich z elitarnego wydarzenia MS-BN1; i
c) zbierania nasion hybrydowych z sterylnych względem gamet męskich roślin ozimego rzepaku oleistego.
W korzystnym sposobie roślina odtwarzająca płodność obejmuje elitarne wydarzenie RF-BN1, które charakteryzuje tym, że genomowy DNA może być zastosowany do amplifikacji fragmentu DNA o dł ugoś ci okoł o 215 par zasad przy pomocy reakcji ł a ń cuchowej polimerazy i dwóch starterów o sekwencji nukleotydowej z SEK NR ID: 23 i SEK NR ID: 41 odpowiednio, przy czym odtwarzającą płodność roślinę ozimego rzepaku oleistego można uzyskać z nasion zdeponowanych zgodnie z ATCC pod numerem dostępu PTA-730.
W zakres wynalazku wchodzi równie ż sposób identyfikacji transgenicznej roś liny albo jej komórek albo tkanek obejmujących elitarne zdarzenie MS-BN1, który obejmuje ustalenie czy genomowy DNA może być zastosowany do amplifikacji fragmentu DNA o długości pomiędzy 260 a 300 par zasad w reakcji łańcuchowej polimerazy z dwoma starterami o sekwencji nukleotydowej z SEK NR ID: 12 i SEK NR ID: 19 odpowiednio.
Korzystny sposób obejmuje ustalenie czy genomowy DNA rośliny transgenicznej albo jej komórek albo tkanek może być zastosowany do amplifikacji fragmentu DNA o długości 280 par zasad w reakcji łańcuchowej polimerazy z dwoma starterami o sekwencji nukleotydowej z SEK NR ID: 12 i SEK NR ID: 19 odpowiednio.
Wynalazek ponadto dotyczy zestawu do identyfikacji rośliny transgenicznej, jej komórek albo tkanek obejmujących elitarne zdarzenie MS-BN1, który obejmuje startery do PCR, z których jeden rozpoznaje obce DNA sekwencji MS-BN1 w obrębie sekwencji z SEK NR ID: 1, a drugi rozpoznaje 5' flankujący DNA sekwencji MS-BN1 w obrębie sekwencji z SEK NR ID: 13 albo 3' flankujący DNA sekwencji MSBN1 w obrębie sekwencji z SEK NR ID: 18, do zastosowania w protokole identyfikacji przez PCR.
W korzystnym zestawie starter rozpoznają cy obcy DNA z sekwencji MS-BN1 rozpoznaje obcy DNA sekwencji MS-BN1 w obrębie sekwencji przedstawionej na SEK NR ID: 13 albo SEK NR ID: 18.
W innym korzystnym zestawie startery do PCR obejmują sekwencję nukleotydową z SEK NR ID: 12 i SEK NR ID: 19, odpowiednio.
Ponadto wynalazek dotyczy sposobu identyfikacji rośliny transgenicznej, jej komórek albo tkanek obejmujących elitarne zdarzenie RF-BN1, który obejmuje ustalenie czy genomowy DNA może być wykorzystany do amplifikacji fragmentu DNA o długości pomiędzy 195 a 235 par zasad w reakcji łańcuchowej polimerazy z dwoma starterami o sekwencji nukleotydowej z SEK NR ID: 23 i SEK NR ID: 41, odpowiednio.
Korzystny sposób obejmuje ustalenie czy genomowy DNA transgenicznej rośliny albo jej komórek albo tkanek może być wykorzystany do amplifikacji fragmentu DNA o długości około 215 par zasad w reakcji łańcuchowej polimerazy z dwoma starterami o sekwencji nukleotydowej z SEK NR ID: 23 i SEK NR ID: 41, odpowiednio.
W zakres wynalazku wchodzi również zestaw do identyfikacji rośliny transgenicznej, jej komórek albo tkanek obejmujących elitarne zdarzenie RF-BN1, który obejmuje startery PCR, z których jeden rozpoznaje obcy DNA sekwencji RF-BN1 w obrębie sekwencji z SEK NR ID: 2, a drugi rozpoznaje 5' flankujący DNA sekwencji RF-BN1 w obrębie sekwencji z SEK NR ID: 24 albo 3' flankujący DNA sekwencji RF-BN1 w obrębie sekwencji z SEK NR ID: 30, do zastosowania w protokole identyfikacji przez PCR.
W korzystnym zestawie starter rozpoznają cy obcy DNA z sekwencji RF-BN1 rozpoznaje obcy DNA sekwencji RF-BN1 w obrębie sekwencji przedstawionej na SEK NR ID: 24 albo SEK NR ID: 30.
PL 205 071 B1
W korzystnym zestawie startery do PCR obejmują sekwencję nukleotydową z SEK NR ID: 23 i SEK NR ID: 41, odpowiednio.
Wynalazek również dotyczy zestawu do identyfikacji elitarnego zdarzenia MS-BN1 w próbkach biologicznych, który obejmuje przynajmniej jeden starter dla PCR albo sondę rozpoznające 5' flankujący DNA sekwencji MS-BN1 w obrębie sekwencji przedstawionej na SEK NR ID: 13 albo 3' flankujący DNA sekwencji MS-BN1 w obrębie sekwencji z SEK NR ID: 18. W korzystnym zestawie starter dla PCR lub sonda rozpoznaje 5' flankującą sekwencję MS-BN1 obejmującą sekwencję SEK NR ID: 19.
Zestaw korzystnie ponadto obejmuje przynajmniej drugi starter do PCR albo sondę rozpoznającą sekwencję obcego DNA MS-BN1 w obrębie sekwencji przedstawionej na SEK NR ID: 1, korzystniej drugi starter do PCR lub sonda rozpoznaje obcy DNA sekwencji MS-BN1 w obrębie sekwencji przedstawionej na SEK NR ID: 13 lub na SEK NR ID: 18, równie korzystnie drugi starter do PCR lub sonda obejmuje sekwencję SEK NR ID: 12.
Wynalazek również dotyczy sposobu potwierdzania czystości nasion, który obejmuje wykrycie w próbkach nasion sekwencji DNA specyficznej dla MS-BN1 przy uż yciu specyficznego startera albo sondy specyficznie rozpoznającej 5' flankującą sekwencję MS-BN1 w obrębie sekwencji przedstawionej na SEK NR ID: 13 lub 3' flankującą sekwencję MS-BN1 w obrębie sekwencji przedstawionej na SEK NR ID: 18.
Wynalazek ponadto dotyczy sposobu przesiewowego badania nasion pod kątem występowania MS-BN1, który obejmuje wykrycie w próbce z partii nasion sekwencji DNA specyficznej dla MS-BN1 przy użyciu specyficznego startera albo sondy specyficznie rozpoznającej 5' flankującą sekwencję MS-BN1 w obrębie sekwencji przedstawionej na SEK NR ID: 13 lub 3' flankującą sekwencję MS-BN1 w obrę bie sekwencji przedstawionej na SEK NR ID: 18.
Zestaw do identyfikacji zdarzenia elitarnego RF-BN1 w próbkach biologicznych, który zawiera przynajmniej jeden starter do PCR, albo sondę rozpoznającą 5' flankującą sekwencję RF-BN1 w obrębie sekwencji z SEK NR ID: 24 albo 3' flankującą sekwencję RF-BN1 w obrębie sekwencji z SEK NR ID: 30, również wchodzi w zakres wynalazku.
W korzystnym zestawie starter do PCR lub sonda rozpoznaje 5' flankują c ą sekwencję RF-BN1 zawierającą sekwencję przedstawioną na SEK NR ID: 41.
Korzystnie zestaw ponadto zawiera przynajmniej drugi starter do PCR albo sondę rozpoznającą obce DNA sekwencji RF-BN1 w obrębie sekwencji przedstawionej na SEK NR ID: 2, korzystniej drugi starter do PCR albo sonda rozpoznaje sekwencję obcego DNA RF-BN1 w obrębie sekwencji przedstawionej na SEK NR ID: 24 albo na SEK NR ID: 30, również korzystniej drugi starter do PCR albo sonda obejmuje sekwencję przedstawioną na SEK NR ID: 23.
Zakresem wynalazku jest również objęty sposób potwierdzenia czystości nasion, który obejmuje wykrywanie w próbkach nasion specyficznej dla RF-BN1 sekwencji DNA przy użyciu specyficznego startera albo sondy specyficznie rozpoznającej region flankujący 5' dla RF-BN1 w obrębie sekwencji przedstawionej na SEK NR ID: 24 albo region flankujący 3' dla RF-BN1 w obrębie sekwencji przedstawionej na SEK NR ID: 30.
Wynalazek dotyczy również sposobu przesiewowego badania nasion pod kątem występowania RF-BN1, który obejmuje wykrywanie w próbce z partii nasion specyficznej dla RF-BN1 sekwencji DNA, przy użyciu specyficznego startera albo sondy specyficznie rozpoznającej region flankujący 5' dla RF-BN1, w obrębie sekwencji przedstawionej na SEK NR ID: 24 albo region flankujący 3' dla RF-BN1 w obrębie sekwencji przedstawionej na SEK NR ID: 30.
Rozwiązania według wynalazku pozwalają na uzyskanie transgenicznej rośliny ozimego rzepaku oleistego (WOSR) lub jej nasion, komórek lub tkanek zawierających wbudowaną do genomu kasetkę ekspresyjną obejmującą gen sterylności względem gamet męskich i drugiej transgenicznej rośliny WOSR, lub jej nasion, komórki lub tkanki zawierającej wbudowaną do genomu kasetkę ekspresyjną niosącą gen odtwarzający płodność i nasiona hybrydowe, uzyskane przez krzyżowanie pierwszej i drugiej rośliny, która zawiera gen sterylności względem gamet męskich i/lub gen odtwarzający płodność wbudowany do genomu.
Rozwiązania według wynalazku umożliwiają również wytworzenie zestawu do identyfikacji wydarzenia elitarnego MS-BN1 i/lub RF-BN1 w próbkach biologicznych, który to zestaw zawiera przynajmniej jeden specyficzny starter lub sondę posiadającą sekwencję odpowiadającą (lub komplementarną do) sekwencji posiadającej pomiędzy 80% i 100% identyczności sekwencji ze specyficznym regionem MS-BN1 i/lub przynajmniej jeden specyficzny starter lub sondę posiadającą sekwencję odpowiadającą (lub komplementarna do) sekwencji o 80% do 100% identyczności sekwencji ze specy6
PL 205 071 B1 ficznym regionem RF-BN1. Korzystnie sekwencja sondy odpowiada specyficznemu obszarowi obejmującemu część regionu flankującego 5' lub 3' MS-BN1 i/lub RF-BN1. Bardziej korzystna specyficzna sonda posiada (lub jest komplementarna do) sekwencję o 80% do 100% identyczności z roślinną sekwencją DNA z SEK NR ID. 36 lub SEK NR ID. 38 dla MS-BN1 lub z roślinną sekwencją DNA w obrębie SEK NR ID. 39 lub SEK NR ID. 40 dla RF-BN1.
Korzystnie zestaw taki zawiera poza starterem specyficznie rozpoznającym region flankujący 5' lub 3' MS-BN1 i/lub RF-BN1 i drugi starter specyficznie rozpoznający sekwencję w obrębie obcego DNA MS-BN1 i/lub RF-BN1 do zastosowania w protokole identyfikacji przez PCR. Taki zestaw może zawierać dwa (lub więcej) specyficznych starterów, z których jeden rozpoznaje sekwencję w regionie flankującym 3' MS-BN1 i/lub RF-BN1, najkorzystniej sekwencję z roślinnego DNA regionu SEK NR ID. 36 lub SEK NR ID. 38 dla MS-BN1 lub sekwencji roślinnego DNA z SEK NR ID. 39 lub SEK NR ID. 40 dla RF-BN1 i kolejny, który rozpoznaje sekwencję w obrębie obcego DNA odpowiednio MS-BN1 i/lub RF-BN1. Szczególnie korzystnie starter rozpoznaje sekwencję roślinnego DNA w obrębie regionu flankującego 5' MS-BN1 zawierającą sekwencję nukleotydową SEK NR ID. 19. Szczególnie starter rozpoznający roślinną sekwencję DNA w obrębie regionu flankującego 5' MS-BN1 zawiera sekwencję nukleotydową SEK NR ID. 19 i starter rozpoznający obcy DNA MS-BN1 rozpoznaje sekwencję nukleotydową SEK NR ID. 12, którą tu opisano. Szczególnie korzystnie starter rozpoznaje roślinną sekwencję DNA w obrębie regionu flankującego 5' RF-BN1 zawierająca sekwencję nukleotydową SEK NR ID. 21. Szczególnie starter rozpoznaje sekwencję roślinnego DNA w obrębie regionu flankującego 5' MS-BN1 zawierającego sekwencję nukleotydową SEK NR ID. 41 i starter rozpoznający obcy DNA RF-BN1 zawierający opisaną tu sekwencję nukleotydową SEK NR ID. 23.
Sposoby i zestawy tutaj opisane mogą być wykorzystane do różnych celów, takich jak, lecz nie tylko: identyfikowanie MS-BN1 i/lub RF-BN1 w roślinach, materiale roślinnym lub w produktach takich jak, lecz nieograniczonych do pokarmu lub produktów spożywczych (świeżych lub poddanych obróbce) zawierających lub pochodzących z materiału roślinnego. Dodatkowo lub alternatywnie takie sposoby i zestawy mogą być użyte dla identyfikacji materiału z transgenicznej rośliny, celem segregacji transgenicznego i nie transgenicznego materiału. Dodatkowo lub alternatywnie takie sposoby i zestawy mogą być użyte dla określenia jakości (tj. procentowej czystości materiału) materiału roślinnego zawierającego MS-BN1 i/lub RF-BN1.
Krótki opis rysunków
Poniższy szczegółowy opis przedstawiony jest jedynie jako przykład, bez zamiaru ograniczenia wynalazku do specyficznej opisanej postaci wykonania i łatwiej będzie zrozumiany w połączeniu z towarzyszącymi Figurami włączonymi tu przez odniesienie, w których:
Fig. 1 Mapa plazmidu pVE113.
Fig. 2 Mapa restrykcyjna otrzymana po trawieniu genomowego DNA MS-BN1.
Sekwencje rozdzielone w żelu analizowano metodą hybrydyzacji typu Southern (Southern blot): ścieżka 1, DNA MS-BN1 strawiony EcoRI, ścieżka 2, DNA MS-BN1 strawiony EcoRV, ścieżka 3 DNA MS-BN1 strawiony Hpal, ścieżka 4 DNA MS-BN1 strawiony AfIIII, ścieżka 5 DNA MS-BN1 strawiony Ndel, ścieżka 6 nie transgeniczny DNA WOSR strawiony BamHI, ścieżka 7 nie transgeniczny DNA WOSR strawiony BamHI + kontrolny DNA plazmidu pTHW107 strawionego BamHI.
Fig. 3 Mapa restrykcyjna otrzymana po trawieniu genomowego DNA RF-BN1.
Sekwencje rozdzielone w żelu analizowano metodą Southern blot: ścieżka 1, DNA RF-BN1 strawiony BamHI, ścieżka 2, DNA RF-BN1 strawiony EcoRI, ścieżka 3 DNA RF-BN1 strawiony EcoRV, ścieżka 4 DNA RF-BN1 strawiony Hindlll, ścieżka 5 nie transgeniczny DNA WOSR strawiony BamHI, ścieżka 6 nie transgeniczny DNA WOSR strawiony BamHI + kontrolny DNA plazmidu pTHW118 strawionego BamHI.
Fig. 4 Analiza PCR różnych ścieżek przy pomocy protokołu identyfikacji przez PCR MS-BN1.
Sekwencje rozdzielone w żelu: ścieżka 1, próbka DNA z rośliny OSR zawierającej transgen MS-BN1, ścieżka 2, próbka DNA z rośliny OSR zawierająca inny transgen, ścieżka 3, DNA z OSR typu dzikiego, ścieżka 4, kontrola negatywna (woda), ścieżka 5, znacznik masy cząsteczkowej (100 par zasad ladder).
Fig. 5 Analiza PCR różnych ścieżek przy pomocy protokołu identyfikacji przez PCR RF-BN1.
Sekwencje rozdzielone w żelu: ścieżka 1, próbka DNA z rośliny OSR zawierającej transgen RF-BN1, ścieżka 2, próbka DNA z rośliny OSR zawierająca inny transgen, ścieżka 3, DNA z OSR typu dzikiego, ścieżka 4, kontrola negatywna (woda), ścieżka 5, znacznik masy cząsteczkowej (100 par zasad ladder).
PL 205 071 B1
Termin „gen w użytym tu znaczeniu określa jakąkolwiek sekwencję DNA obejmującą kilka funkcjonalnie połączonych fragmentów DNA, takich jak promotor i 5' obszar nieulegający translacji (5'UTR), które razem tworzą obszar promotora i obszar kodujący (który może lub nie kodować białko) i 3' obszar nieulegający translacji (3'UTR) zawierający miejsce poliadenylacji. Typowo w komórkach roślinnych 5'UTR, obszar kodujący i 3'UTR są transkrybowane do RNA, który w przypadku białka kodującego gen ulega translacji do białka. Gen może zawierać dodatkowe fragmenty DNA, takie jak przykładowo introny. W użytym tu znaczeniu locus genetyczny jest miejscem danego genu w genomie rośliny.
Termin „chimerowy gdy odnosi się do genu lub sekwencji DNA jest użyty aby wskazać, że gen lub sekwencja DNA zawiera przynajmniej dwa fragmenty DNA (takie jak promotor, 5'UTR, obszar kodujący, 3'UTR, intron), które w sposób naturalny są związane ze sobą i pochodzą przykładowo z różnych źródeł. „Obcy odnosi się do genu lub sekwencji DNA w odniesieniu do gatunków zwierząt i jest uż yty aby wskazać , ż e gen lub sekwencja DNA nie wystę puje w naturze w tych gatunkach roś lin lub nie jest w naturze znajdowana w tym locus genetycznym u danych gatunków roślin. Termin „obcy DNA będzie tu użyty dla określenia sekwencji DNA, jaka jest wbudowana do genomu rośliny w wyniku transformacji. „Transformujący DNA w użytym tu znaczeniu dotyczy cząsteczki zrekombinowanego DNA użytego do transformacji. Transformujący DNA zazwyczaj zawiera przynajmniej jeden „interesujący gen (np. gen chimerowy), który jest zdolny do ustanowienia jednej lub większej liczby specyficznych właściwości stransformowanej rośliny. Termin „zrekombinowana cząsteczka DNA jest użyty przykładowo i co za tym idzie może obejmować wyizolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego, którą może być DNA i która może być otrzymana przez rekombinowanie lub innymi sposobami.
W użytym tu znaczeniu termin „transgen określa interesujący gen włączony do genomu rośliny. „Transgeniczna roślina określa roślinę zawierającą przynajmniej jeden transgen w genomie wszystkich jej komórek.
Obcy DNA występujący w roślinach z niniejszego wynalazku będzie korzystnie zawierał dwa interesujące geny, dokładniej zarówno gen męskiej sterylności jak i gen odporności na herbicyd, lub gen odtwarzający płodność i gen odporności na herbicyd.
„Gen sterylności względem gamet męskich (męskosterylności) w użytym tu znaczeniu określa gen, który gdy ulega ekspresji w roślinie czyni ją niezdolną do wytwarzania płodnego, żywotnego pyłku. Przykładem genu sterylności względem gamet męskich jest gen zawierający sekwencję DNA kodującą barnase pod kontrolą promotora powodującego ekspresję w komórkach tapetum. Dokładniej, zgodnie z niniejszym wynalazkiem, jak opisano genem męskosterylności jest „TA29-barnase.
„Gen odtwarzający płodność w użytym tu znaczeniu określa gen, który ulegając ekspresji w roślinie posiadającej gen sterylności względem gamet męskich jest zdolny do zapobieżenia ekspresji fenotypu warunkowanego przez gen męskosterylności, odtwarzając płodność rośliny. Dokładniej, jak zostało to opisane genem odtwarzającym płodność jest „TA2 9-barstar.
Wbudowanie zrekombinowanej cząsteczki DNA do genomu rośliny typowo uzyskuje się przez transformację komórki lub tkanki (lub przez inną manipulację genetyczną). Konkretne miejsce wbudowania fragmentu zależy od przypadku lub jest wstępnie określone (jeśli użyty jest proces integracji do określonego miejsca - adresowanej integracji).
Obcy DNA może być scharakteryzowany przez umiejscowienie i konfigurację w miejscu wbudowania zrekombinowanej cząsteczki DNA w genomie rośliny. Miejsce w genomie rośliny gdzie wbudowany jest zrekombinowany DNA jest również określone jako „miejsce wbudowania lub „miejsce docelowe. Wbudowanie transgenu do genomu rośliny może być związane z delecją roślinnego DNA określaną tu jako „delecja docelowego miejsca. „Obszar otaczający lub „sekwencja, obszar flankująca/y w użytym tu znaczeniu dotyczy sekwencji o długości przynajmniej 20 par zasad, korzystnie przynajmniej 50 par zasad i do 5 tys. par zasad genomu rośliny, która jest zlokalizowana zarówno bezpośrednio przed, będąc połączoną w ciąg, lub bezpośrednio za, będąc połączoną w ciąg z obcym DNA. Procedury transformacji prowadzące do losowej integracji obcego DNA dadzą transformanty o różnych obszarach otaczających, które są charakterystyczne i unikalne dla każdego transformanta. Gdy transgen jest wprowadzony do rośliny przez tradycyjne krzyżowanie, to jego miejsce wbudowania do genomu rośliny lub otaczające go obszary ogólnie nie będą zmienione. „Obszar wbudowania w użytym tu znaczeniu określa obszar odpowiadający regionowi i długości przynajmniej 40 par zasad, korzystnie przynajmniej 100 par zasad i aż do więcej niż 10 tys. par zasad, otoczony otaczającymi regionami transgenu z genomu (nie stransformowanej) rośliny i obejmujący miejsce wbudowania (i przypuszczalnie delecję w docelowym miejscu). Biorąc pod uwagę mniejsze różnice spowodowane mutacjami u gatunków, miejsce insercji zachowa przynajmniej 85%, korzystnie 90%, korzystniej 95%
PL 205 071 B1 i najkorzystniej 100% identyczności sekwencji z sekwencją obejmującą obszary otaczające obcy DNA u danej roś liny tego gatunku.
Ekspresja interesującego genu odnosi się do faktu, że gen ustanawia jedną lub więcej cech fenotypowych rośliny (np. tolerowanie herbicydu), które są pomyślane tak, aby były ustanawiane przez wprowadzenie zrekombinowanej cząsteczki DNA - transformacja DNA - użytej podczas transformacji (na zasadzie struktury i funkcji części lub całego interesującego genu(ów)).
„Zdarzenie jest definiowane jako locus genetyczne (sztuczne), które w wyniku manipulacji genetycznej niesie obcy DNA zawierający przynajmniej jedną kopię interesującego genu(ów). Typowym allelicznym stanem zdarzenia jest występowanie lub brak obcego DNA. W użytym tu znaczeniu zdarzenie „MS i zdarzenia „RF będzie określało zdarzenia niosące odpowiednio transgeny „TA29-barnase i „TA29-barstar. Zdarzenie jest charakteryzowane fenotypowo przez ekspresję jednego lub większej liczby transgenów. Na poziomie genetycznym, zdarzenie jest częścią genetycznego zestawu rośliny. Na poziomie molekularnym zdarzenie jest scharakteryzowane przez mapę restrykcyjną (np. jak określono metodą Southern blot) i/lub przez poprzedzające, i/lub następujące po nim sekwencje otaczające transgen, i/lub molekularną konfiguracje transgenu. Zazwyczaj transformacja rośliny transformującym DNA obejmuje przynajmniej jeden interesujący gen, co prowadzi do wielu zdarzeń, z których każde jest unikalne.
„Elitarne zdarzenie w użytym tu znaczeniu jest zdarzeniem z grupy zdarzeń uzyskanych przez transformację samym transformującym DNA lub przez krzyżówkę wsteczną z roślinami uzyskanymi przez taką transformację, opierając się na ekspresji i stabilności transgenu i zgodności z optymalnymi cechami agronomicznymi zawierającej go rośliny.
Tak więc kryterium dla selekcji elitarnego zdarzenia są jedno lub więcej, korzystnie dwa lub więcej, najkorzystniej wszystkie z poniższych:
a) obecność transgenu nie zaburza innych, pożądanych właściwości rośliny, takich jak dotyczące cech agronomicznych lub wartości komercyjnych;
b) zdarzenie charakteryzowane jest przez dobrze określoną konfigurację molekularną, która dziedziczy się stabilnie i dla której mogą być opracowane odpowiednie narzędzia diagnostyczne dla kontroli jej identyczności;
c) interesujący gen(y) w transgenie ujawnia(ją) odpowiednią i stabilną miejscowo i czasowo ekspresję fenotypu zarówno w heterozygotach (lub hemizygotach) i homozygotach pod względem zdarzenia na komercyjnie akceptowanym poziomie, w warunkach środowiskowych, na które przypuszczalnie wystawione będą rośliny niosące zdarzenie w czasie uprawy.
Jest korzystnym, aby obcy DNA był związany z miejscem w genomie rośliny pozwalającym na wprowadzenie do komercyjnie pożądanego tła genetycznego.
Status zdarzenia jako zdarzenie elitarne jest potwierdzony przez wprowadzenie zdarzenia elitarnego w różne, odpowiednie tła genetyczne i obserwowanie realizacji jednego, dwóch lub wszystkich podanych powyżej kryteriów, np. a), b) i c).
Ponadto, dla transgenów kodujących opisaną tu męską sterylność i odtwarzanie płodności określona będzie również selekcja zdarzeń elitarnych na bazie zgodności tych zdarzeń. Dokładniej, potomstwo otrzymane przez krzyżowanie roślin niosących zdarzenie męskosterylności i rośliny niosącej zdarzenie odtwarzające płodność, gdy występują oba zdarzenia, będzie posiadało poniższe właściwości:
a) odpowiednia ekspresja fenotypu odtwarzającego płodność, tj. męską płodność, i
b) ekspresja fenotypu na komercyjnie akceptowalnym poziomie w zakresie warunków środowiskowych, na które rośliny niosące te dwa zdarzenia są przypuszczalnie wystawione podczas uprawy.
Tak więc „zdarzenie elitarne określa locus genetyczne zawierające transgen spełniający wyżej opisane kryteria. Roślina, materiał roślinny lub potomstwo, takie jak nasiona, może w swoim genomie zawierać jedno lub więcej zdarzeń elitarnych.
„Narzędzia diagnostyczne opracowane dla identyfikacji zdarzenia elitarnego lub rośliny, lub materiału roślinnego zawierającego zdarzenie elitarne opierają się na specyficznych właściwościach zdarzenia elitarnego w genomie, takich jak specyficzna mapa restrykcyjna rejonu genomu zawierającego obcy DNA i/lub sekwencja obszaru(ów) otaczających transgen. „Mapa restrykcyjna w użytym tu znaczeniu określa zestaw wzorów w Southern blot otrzymanych po cięciu genomowego DNA rośliny określonym enzymem restrykcyjnym, lub zestawem enzymów restrykcyjnych i hybrydyzacją z sondą o sekwencji podobnej do transgenu, w typowych warunkach ostrości hybrydyzacji. W użytym tu znaczeniu typowe warunki ostrości hybrydyzacji dotyczą warunków dla opisanej tu hybrydyzacji lub tradycyjnych warunków hybrydyzacji opisanych przez Sambrook i wsp. (1989) (Molecular Cloning: A LaboPL 205 071 B1 ratory Manual, wydanie 2-gie, Cold Spring Harbor Laboratory Press NY), które przykładowo mogą obejmować poniższe etapy: 1) unieruchomienie genomowych fragmentów DNA rośliny na filtrze, 2) wstępna hybrydyzacja filtra przez 1 do 2 godzin w 42°C w 50% formamidzie, 5 x SSPE, 2x odczynnik Denhardf'a i 0,1% SDS, lub przez 1 do 2 godzin w 68°C w 6 x SSC, 2x odczynnik Denhardf'a i 0,1% SDS, 3) dodanie sondy dla hybrydyzacji, która jest wyznakowana, 4) inkubowanie przez 16 do 24 godzin, 5) płukanie filtra przez 20 min. w temp. pokojowej w 1 x SSC, 0,1% SDS, 6) trzykrotne płukanie filtra, za każdym razem 20 min w 68°C w 0,2 x SSC, 0,1% SDS i 7) eksponowanie filtra przez 24 do 48 godzin wobec błony rentgenowskiej w -70°C z ekranem wzmacniającym.
Zależnie od (wewnętrznych) miejsc restrykcyjnych występujących w genomie przed włączeniem obcego DNA, wbudowanie obcego DNA zmieni specyficzną mapę restrykcyjną tego genomu. Co za tym idzie określony transformant lub jego potomstwo może być zidentyfikowany przez jeden lub więcej specyficznych wzorów restrykcyjnych. Warunki dla określenia mapy restrykcyjnej zdarzenia są podane w „protokole identyfikacji mapy restrykcyjnej. Alternatywnie, gdy został a ustalona sekwencja nukleotydowa jednego lub obu obszarów otaczających transgen opracowane mogą być PCR-sondy specyficznie rozpoznające tą(e) sekwencję(e) dzięki „protokołowi identyfikacji przez PCR. Rośliny lub materiał roślinny zawierający elitarne zdarzenie może być zidentyfikowany przez testowanie według protokołu identyfikacji PCR, przy pomocy tych specyficznych starterów.
W uż ytym tu znaczeniu „próbka biologiczna oznacza, ż e jest próbką roś liny, materiał u roś linnego, lub produktów zawierających materiał roślinny. Termin „roślina w znaczeniu swym obejmuje roślinę ozimego rzepaku oleistego - WOSR (Brassica napus), tkanki roślinne na jakimkolwiek stadium dojrzałości, jak również jakiekolwiek komórki, tkanki lub organy pobrane z, lub pochodzące od, jakiejkolwiek rośliny obejmując bez ograniczeń nasiona, liście, łodygi, kwiaty, korzenie, pojedyncze komórki, gamety, hodowle komórkowe, kultury tkankowe lub protoplasty. „Materiał roślinny w użytym tu znaczeniu określa materiał, który jest otrzymany lub pochodzi z rośliny. Produkty zawierające materiał roślinny dotyczą pokarmu, pożywienia lub innych produktów, które są wytworzone przy pomocy materiału roślinnego, lub mogą być zanieczyszczone materiałem roślinnym. W kontekście obecnego wynalazku jest zrozumiałym, że takie próbki biologiczne są korzystnie testowane z uwagi na obecność kwasów nukleinowych specyficznych dla MS-BN1 i/lub RF-BN1 sugerujących występowanie w próbkach kwasów nukleinowych. Co za tym idzie sposoby określone tu dla identyfikacji zdarzenia elitarnego MS-BN1 i/lub RF-BN1 w próbkach biologicznych korzystnie dotyczą identyfikacji w próbkach biologicznych kwasów nukleinowych zawierających zdarzenie elitarne.
„Zestaw w użytym tu znaczeniu dotyczy zestawu odczynników dla realizacji sposobu z wynalazku, dokładniej identyfikacji zdarzenia elitarnego MS-BN1 i/lub RF-BN1 w próbkach biologicznych. Dokładniej, korzystna postać zestawu z wynalazku obejmuje przynajmniej jeden lub dwa specyficzne startery, jakie opisano powyżej. Ewentualnie zestaw może ponadto zawierać jakikolwiek inny odczynnik opisany w protokole identyfikacji przez PCR. Alternatywnie, zgodnie z inną postacią tego wynalazku zestaw może zawierać specyficzną sondę, jak opisano powyżej, która hybrydyzuje specyficznie z kwasem nukleinowym próbek biologicznych identyfikując występowanie w nich MS-BN1 i/lub RF-BN1. Warunkowo, zestaw może ponadto zawierać jakikolwiek inny odczynnik (taki jak, lecz nieograniczony do buforu dla hybrydyzacji, znacznika) dla identyfikacji w próbkach biologicznych, przy pomocy specyficznej sondy, MS-BN1 i/lub RF-BN1.
Zestaw z wynalazku może być użyty, a jego składniki mogą być specyficznie dostosowane celem kontroli jakości (np. czystość porcji nasion), wykrycia zdarzenia elitarnego w materiale roślinnym lub materiale zawierającym, lub pochodzącym z materiału roślinnego, takim jak, lecz nieograniczonym do pokarmu i produktów spożywczych.
Niniejszy wynalazek dotyczy opracowania zestawu zdarzeń elitarnych w WOSR, MS-BN1 i RF-BN1 dla roślin zawierają cych te zdarzenia, potomstwa otrzymanego przez krzyżowanie tych roślin i komórek roślinnych lub materiału roślinnego pochodzącego z tych zdarzeń. Rośliny zawierające zdarzenia elitarne MS-BN1 były otrzymane przez transformowanie przy pomocy pTHW108, jak opisano w Przykładzie 1. Rośliny zawierające zdarzenie elitarne RF-BN1 otrzymano przez transformacje przy pomocy THW118 również jak opisano w Przykładzie 1.
Zrekombinowane cząsteczki DNA użyte dla wytworzenia zdarzenia elitarnego MS-BN1 zawierają sekwencję DNA kodującą cząsteczkę barnase, pod kontrolą promotora wybiórczo działającego w komórkach tapetum (okreś lone jako „TA29-barnase). Promotor TA29 daje w OSR wzór ekspresji specyficzny dla tapetum (De Block i Debrouwer, Planta 189: 218-225, 1993). Ekspresja genu TA29barnase w roślinach WOSR powoduje zniszczenie tapetum, a w konsekwencji męską sterylność (Ma10
PL 205 071 B1 riani i wsp., 1990, powyżej). Zrekombinowana cząsteczka DNA użyta dla wytworzenia zdarzenia elitarnego RF-BN1 zawiera sekwencję DNA kodującą cząsteczkę barstar która jest pod kontrolą promotora specyficznego dla tapetum (określonego „PTA29-barstar). Ekspresja genu TA29-barstar w roślinach WOSR będzie w obecności genu „TA29-barnase zapobiegała aktywności barnase w komórkach tapetum rośliny, zapobiegając zniszczeniu tapetum i co za tym idzie odtwarzając u tych roślin płodność (Mariani i wsp., 1992, powyżej).
Zrekombinowany DNA dla wytworzenia zdarzenia elitarnego MS-BN1 i RF-BN1 dodatkowo zawiera sekwencję DNA kodującą enzym acetylotransferazę fosfinotrycyny i promotor 35S z wirusa mozaiki kalafiora charakteryzujący się tym, że sekwencja kodująca acetylotransferazę fosfinotrycyny jest pod kontrolą promotora 35S (określony „35S-bar). Promotor 35S posiada w OSR „konstytutywny wzór ekspresji, co znaczy że ulega znaczącej ekspresji w większości rodzajów komórek przez większość cyklu życiowego rośliny. Wyrażenie genu 35S-bar w roślinach OSR warunkuje odporność na związki chwastobójcze fosfinotrycyny lub bialafos lub glufosinat, lub bardziej ogólnie inhibitory syntetazy glutaminy, lub ich sole, lub izomery optyczne.
Rośliny WOSR lub materiał roślinny zawierający MS-BN1 może być zidentyfikowany zgodnie z protokołem identyfikacji mapy restrykcyjnej opisanym w Przykładzie 5 dla MS-BN1. Krótko, genomowy DNA WOSR jest trawiony kombinacją (korzystnie dwóch do pięciu) następujących enzymów restrykcyjnych: EcoRI, EcoRV, Ndel, Hpal, AfIIII, przeniesiony na błony nylonowe i hybrydyzowany z fragmentem Hindlll o wielkoś ci 3942 par zasad z plazmidu pTHW107 (lub zawierają cego go T-DNA). Następnie dla każdego użytego enzymu restrykcyjnego określono czy mogą być zidentyfikowane poniższe fragmenty:
- EcoRI: o dł ugoś ci pomiędzy 2140 i 2450 par zasad, korzystnie 2266 par zasad i jeden fragment większy niż 14 tys. par zasad;
- EcoRV: jeden fragment o wielkoś ci pomię dzy 1159 i 1700 par zasad korzystnie okoł o 1,4 tys. par zasad i jeden fragment większy niż 14 tys. par zasad;
- Hpal: jeden fragment o wielkoś ci pomię dzy 1986 i 2140 par zasad, korzystnie oko ł o 1990 par zasad i jeden fragment o wielkości pomiędzy 2140 i 2450 par zasad korzystnie około 2229 par zasad;
- AfIIII: jeden fragment pomiędzy 514 i 805 par zasad, korzystnie około 522 par zasad, jeden fragment pomiędzy 2140 i 2450 par zasad, korzystnie około 2250 par zasad i jeden fragment o wielkości pomiędzy 2450 i 2838 par zasad, korzystnie około 2477 par zasad;
- Ndel: dwa fragmenty o długości pomię dzy 5077 i 14057 par zasad, korzystnie jeden około 6500 par zasad i jeden o długości około 10 tys. par zasad;
Długości fragmentów DNA są określone przez porównanie z zestawem fragmentów DNA o znanej długości, szczególnie fragmentów Pstl dla DNA bakteriofaga lambda. W przypadku fragmentów dłuższych niż 14 tys. par zasad szacuje się, że mają długość pomiędzy 14 tys. par zasad i 40 tys. par zasad gdy ekstrakcję DNA wykonano zgodnie ze sposobem Dellaporta i wsp. (1983, Plant Molecular Biology Reporter, 1, tom 3 str. 1921).
Jeśli materiał roślinny po trawieniu przynajmniej dwoma, korzystnie przynajmniej trzema, szczególnie przynajmniej czterema, szczególniej przynajmniej wszystkimi tymi enzymami daje fragmenty DNA o takiej samej długości jak te opisane powyżej, to roślina WOSR jest określona jako niosąca zdarzenie elitarne MS-BN1.
Rośliny lub materiał roślinny zawierający MS-BN1 mogą również być zidentyfikowane zgodnie z protokołem identyfikacji przez PCR dla MS-BN1 podanego tu w Przykładzie 5. Krótko, genomowy DNA WOSR jest amplifikowany przez PCR przy pomocy startera, który specyficznie rozpoznaje sekwencję otaczającą MS-BN1, korzystnie rozpoznającą 5' lub 3' sekwencję otaczającą MS-BN1, którą tu opisano, szczególnie starter o sekwencji SEK NR ID: 19 i starter rozpoznający sekwencje w transgenie, szczególnie starter o sekwencji SEK NR ID: 12. Jako kontrole użyto endogenne startery WOSR. Jeśli materiał roślinny daje fragment o wielkości pomiędzy 260 i 300 par zasad korzystnie około 280 par zasad, to roślina jest określona jako niosąca elitarne zdarzenie MS-BN1.
Rośliny niosące MS-BN1 są fenotypowo charakteryzowane przez fakt, że przy braku genu odtwarzającego w ich genomie są męsko sterylne. Męska sterylność jest zdefiniowana jako niezdolność do wytworzenia płodnego, żywotnego pyłku.
Rośliny niosące MS-BN1 mogą przykładowo, być otrzymane z nasion zawierających MS-BN1 złożonych w ATCC pod numerem dostępu PTA-730. Rośliny takie mogą następnie być rozmnożone dla wprowadzenia elitarnego zdarzenia według wynalazku do innych odmian hodowlanych roślin tego samego gatunku.
PL 205 071 B1
Rośliny WOSR lub materiał roślinny zawierający RF-BN1 może być zidentyfikowany na podstawie mapy restrykcyjnej zgodnie z protokołem identyfikacji opisanym dla RF-BN1 w Przykładzie 5. Krótko, genomowy DNA WOSR jest trawiony wybranymi (korzystnie dwoma do czterech) następującymi enzymami restrykcyjnymi: BamHI, EcoRI, EcoRV i Hindlll i jest następnie przeniesiony na filtry nitrocelulozowe i hybrydyzowany z fragmentem Hpal o wielkości 2182 par zasad z plazmidu pTHW118 (lub zawierającym go T-DNA). Następnie, dla każdego użytego enzymu restrykcyjnego jest określone czy mogą być zidentyfikowane następujące fragmenty DNA:
- BamHI: jeden fragment o wielkoś ci pomię dzy 805 i 1099 par zasad, korzystnie okoł o 814 par zasad, jeden fragment o wielkości pomiędzy 1700 i 1968 par zasad, korzystnie około 1849 par zasad, jeden fragment o wielkości pomiędzy 2450 i 2838 par zasad, korzystnie około 2607 par zasad i jeden fragment o wielkości pomiędzy 5077 i 14057 par zasad, korzystnie około 6500 par zasad;
- EcoRI: jeden fragment o wielkoś ci pomię dzy 805 i 1159 par zasad, korzystnie okoł o 1094 pary zasad, jeden fragment o wielkości pomiędzy 1986 i 2450 par zasad, korzystnie około 2149 par zasad i dwa fragmenty o wielkości pomiędzy 5077 i 14057 par zasad, korzystnie jeden około 7000 par zasad i jeden około 10 tysięcy par zasad;
- EcoRV: dwa fragmenty o wielkoś ci pomię dzy 5077 i 14057 par zasad, korzystnie jeden okoł o 5,4 tys. par zasad i około 8 tys. par zasad;
- Hindlll: jeden fragment o wielkości pomiędzy 1700 i 1986 par zasad, korzystnie około 1969 par zasad i dwa fragmenty o wielkości pomiędzy 2450 i 2838 par zasad, korzystnie jeden około 2565 par zasad i jeden około 2635 par zasad;
Długości fragmentów DNA są określone przez porównanie z zestawem fragmentów DNA o znanej długości, szczególnie fragmentów uzyskanych przez trawienie Pstl DNA bakteriofaga lambda.
Jeśli materiał roślinny po trawieniu przynajmniej dwoma, korzystnie przynajmniej trzema, szczególnie przynajmniej czterema, szczególniej przynajmniej wszystkimi tymi enzymami daje fragmenty DNA o takiej samej długości jak te opisane powyżej, to roślina WOSR jest określona jako niosąca zdarzenie elitarne RF-BN1.
Rośliny lub materiał roślinny zawierający RF-BN1 mogą również być zidentyfikowane zgodnie z protokoł em identyfikacji przez PCR dla RF-BN1, który jest opisany w Przykł adzie 5. Krótko, genomowy DNA WOSR jest amplifikowany przez PCR przy pomocy startera, który specyficznie rozpoznaje sekwencję otaczającą RF-BN1, korzystnie rozpoznającą 5' lub 3' sekwencję otaczającą RF-BN1, którą tu opisano, szczególnie starter o sekwencji SEK NR ID. 41 i starter rozpoznający sekwencje w transgenie, szczególnie starter o sekwencji SEK NR ID 23. Jako kontrole użyto endogenne startery dla WOSR. Jeśli materiał roślinny daje fragment o wielkości pomiędzy 195 i 230 par zasad korzystnie około 215 par zasad, to roślina jest określona jako niosąca elitarne zdarzenie RF-BN1.
Rośliny niosące RF-BN1 charakteryzuje fakt, że gen barstar ulega ekspresji w komórkach tapetum. Wytwarzanie barstar w komórkach tapetum rośliny okazało się, że nie jest korzystne ani szkodliwe dla wytwarzania pyłku (Mariani i wsp., 1992, powyżej). Tak, więc pod nieobecność genu męskiej sterylności w genomie rośliny, gen TA29-barstar nie będzie dawał fenotypu, który można zaobserwować. W obecności genu na męską sterylność w genomie rośliny gen TA29-barstar będzie powodował odtworzenie płodności tj. fenotyp płodny. Roślina z odtworzonym płodnym fenotypem jest zdefiniowana jako roślina, która niezależnie od występowania w jej genomie genu męskiej sterylności jest zdolna do produkcji płodnego, żywotnego pyłku.
Rośliny niosące RF-BN1 mogą przykładowo być otrzymane z nasion złożonych w ATCC pod numerem dostępu PTA-730. Takie rośliny mogą być ponadto rozmnożone i/lub użyte w tradycyjnym schemacie hodowli, dla wprowadzenia zdarzenia elitarnego z wynalazku do innych odmian uprawnych, tych samych gatunków rośli.
Rośliny niosące MS-BN1 i/lub RF-BN1 charakteryzują się również tolerancją na glufosinat takie, które w kontekście niniejszego wynalazku obejmują rośliny tolerujące herbicyd Liberty™. Tolerancja na Liberty™ jest zdefiniowana przez kryterium, że oprysk roślin w stadium trzech do czterech liści (3V do 4V) przynajmniej 200 g aktywnego składnika na hektar (g.a.i./ha), korzystnie 400 g.a.i./ha i przypuszczalnie do 1600 g.a.i./ha nie zabija roślin. Rośliny niosące MS-BN1 i/lub RF-BN1 mogą ponadto być scharakteryzowane przez występowanie w ich komórkach acetylotransferazy fosfinotrycyny jak to określono przez oznaczenie PAT (DeBlock i wsp., 1987, powyżej).
Rośliny WOSR według niniejszego wynalazku mogą być hodowane w tradycyjny sposób. Występowanie genu 35S-bar daje pewność, że tolerują one glufosinat. Co za tym idzie chwasty na polu,
PL 205 071 B1 gdzie uprawia się WOSR mogą być kontrolowane przez zastosowanie herbicydów zawierających jako czynny składnik glufosinat (takich jak Liberty™).
Rośliny niosące MS-BN1 i/lub RF-BN1 są charakteryzowane również przez posiadanie cech agronomicznych, które są zgodne z komercyjnie dostępnymi w USA odmianami WOSR. Odpowiednie cechy agronomiczne to: wysokość rośliny, siła, sztywność pędu, skłonność do wykładania, zimotrwałość, odporność na łamanie, tolerancja suszy, odporność na choroby (czarna nóżka, plamistość liści, Sclerotinia), wytwarzanie ziarna i plon.
Obserwowano, że występowanie obcego DNA w miejscach insercji, w opisanym tu genomie rośliny WOSR Brassica napus, dokładniej w miejscach insercji w genomie rośliny WOSR Brassica napus, ustala szczególnie korzystny fenotyp i charakterystykę molekularną roślin posiadających te zdarzenia. Dokładniej, obecność obcego DNA w tych szczególnych regionach genomu roślin daje stabilną ekspresję fenotypu transgenu bez znaczącego upośledzania właściwości agronomicznych roślin, czyniąc je szczególnie użytecznymi dla wytwarzania hybryd WOSR. Tak więc, regiony insercji odpowiadające SEK NR ID 22 i SEK NR ID 34, dokładniej miejsce insercji MS-BN1 i RF-BN1 są jak pokazano szczególnie użyteczne dla wprowadzenia interesującego(ych) genu(ów). Dokładniej, obszary insercji MS-BN1 (SEK NR ID 22) i RF-BN1 (SEK NR ID 34) lub miejsca insercji odpowiednio MS-BN1 i RF-BN1 są szczególnie uż yteczne dla wprowadzenia plazmidów zawierają cych, odpowiednio, gen męsko sterylności i gen odtwarzający płodność, zapewniając optymalną ekspresję każdego z tych genów, lub obu genów w roślinie, nie zaburzając jej agronomicznych właściwości.
Dokładniej, zrekombinowana cząsteczka DNA może być wbudowana do obszaru insercji przy pomocy sposobów przewidzianych dla insercji adresowanej. Sposoby takie są dobrze znane specjalistom i obejmują przykładowo homologiczną rekombinację przy pomocy rekombinazy, takiej jak lecz nie tylko, rekombinaza FLP z Saccharomyces cerevisiae (patent US 5,527,695), rekombinaza CRE z faga P1 Escherichia coli (publikacja PCT zgł oszenia WO 9109957), rekombinaza z pSRI z Saccharomyces rouxii (Araki i wsp., 1985, J. Mol. Biol. 182:191-203) lub system rekombinacji faga lambda taki jaki opisano w patencie US 4,673,640.
W użytym tu znaczeniu „identyczność sekwencji w odniesieniu do sekwencji nukleotydowych (DNA lub RNA) określa liczbę miejsc o identycznych nukleotydach podzieloną przez liczbę nukleotydów występującą w krótszej z dwóch sekwencji. Przyrównanie dwóch sekwencji nukleotydowych przeprowadzono przy pomocy algorytmu Wilbur i Lipmann (Wilbur i Lipmann, 1983) używając okna o wielkoś ci 20 nukleotydów, słowa o długości 4 nukleotydów przy karze za lukę równej cztery. Analizy komputerowe i interpretacja danych z sekwencji obejmuje opisane powyżej przyrównanie sekwencji, np. przeprowadzone Intelligentic TM Sweet (Intelligentics Inc., CA). Sekwencje są podane jako „zasadniczo podobne, gdy identyczność takich sekwencji wynosi około 75%, korzystnie przynajmniej około 80%, korzystniej przynajmniej około 85%, jeszcze korzystniej około 90%, zwłaszcza około 90%, a zwłaszcza około 100%, a najbardziej gdy są identyczne. Jest zrozumiałym, że gdy sekwencje RNA są określone jako zasadniczo podobne lub wykazują określony poziom identyczności z sekwencjami DNA to tymina (T) w DNA jest odpowiednikiem uracylu (U) w sekwencji RNA. W użytym tu znaczeniu „zawierający jest interpretowany jako określenie występowania określonej cechy, wartości, etapu lub składników odnoszących się do, lecz niewykluczających występowania lub dodania jednej lub więcej cech, wartości, etapów lub składników lub ich grup. Tak np. kwas nukleinowy lub białko zawierające sekwencje nukleotydowe lub aminokwasowe może zawierać więcej nukleotydów lub aminokwasów niż to, które jest aktualnie cytowane, tj. występujący w większej cząsteczce kwasu nukleinowego lub białka. Chimerowy gen zawierający sekwencję DNA, która jest określona funkcjonalnie lub strukturalnie, może zawierać dodatkowe sekwencje DNA, itd.
Poniższe przykłady opisują otrzymanie i właściwości roślin ozimego rzepaku oleistego (WOSR) niosących elitarne zdarzenia MS-BN1 i RF-BN1.
Jeśli nie będzie podane inaczej to wszystkie techniki rekombinowania DNA są przeprowadzone zgodnie ze standardowymi protokołami opisanymi w Sambrook i wsp., (1989) Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2 wyd., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY i w tomach 1 i 2 Ausubel i wsp. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA. Typowe materiały i metody dla pracy molekularnej na roślinach są opisane w Plant Molecular Biology Labfax (1993) przez R.D.D. Croy opublikowanego przez BIOS Scientific Publications Ltd. (UK) i Blackwell Scientific Publications UK.
W opisie przykłady i referencje odnoszą się do poniższych sekwencji:
SEK NR ID: 1: plazmid pTHW107
SEK NR ID: 2: plazmid pTHW118
PL 205 071 B1
SEK NR SEK NR SEK NR SEK NR SEK NR SEK NR SEK NR SEK NR SEK NR SEK NR SEK NR SEK NR SEK NR SEK NR SEK NR SEK NR SEK NR SEK NR SEK NR SEK NR SEK NR SEK NR SEK NR SEK NR SEK NR SEK NR
SEK NR SEK NR SEK NR SEK NR SEK NR SEK NR SEK NR SEK NR SEK NR SEK NR SEK NR SEK NR SEK NR SEK NR SEK NR
3: starter 248
4: starter 249
5: starter 247
6: starter 250
7: starter 251
8: starter 254
9: starter 258
10: starter SP6
11: starter T7
12: starter 201 (BNA01)
13: sekwencja zawierająca 5' obszar otaczający MS-BN1 14: starter 611 15: starter 259 16: starter 260 17: starter 24
18: sekwencja zawierająca 3' obszar otaczający MS-BN1 19: starter 51 (BNA02)
20: starter 48
21: sekwencja zawierają ca docelowe miejsce delecji MS-BN1 22: obszar insercji MS-BN1 23: starter 193 (BNA03)
24: sekwencja zawierają ca 5' obszar otaczają cy RF-BN1 25: starter 286 26: starter 314
27: starter 315 28: starter 316
ID 29:
starter 288 sekwencja zawierają ca 3' obszar otaczają cy RF-BN1 starter 269 starter 283 starter 284 obszar integracji RF-BN1 starter 57 sekwencja zawierają ca 5' obszar otaczają cy MS-BN1 w WOSR starter 68 sekwencja zawierają ca 3' obszar otaczają cy MS-BN1 w WOSR sekwencja zawierają ca 5' obszar otaczają cy RF-BN1 w WOSR sekwencja zawierają ca 3' obszar otaczają cy RF-BN1 w WOSR starter 268 (BNA04) starter BNA05 starter BNA06
P r z y k ł a d y
P r z y k ł a d 1. Transformacja Brassica napus genem na męską sterylność i genem odtwarzającym płodność.
a) Konstrukcja chimerowego DNA zawierającego gen barnase pod kontrolą promotora specyficznego dla tapetum (pTHW107).
Plazmid pTHW107 (SEK NR ID. 1) był zasadniczo dostarczony z pośredniego wektora pGSV1. Sam pGSV1 pochodzi od pGSC1700 (Cornelissen i Vandewielle, 1989), lecz zawiera sztuczny region T zawierający lewą i prawą sekwencję graniczną z TL-DNA z pTiB6S3 i miejsce wielokrotnego klonowania pozwalające na wbudowanie chimerowych genów pomiędzy granicznymi powtórzeniami T-DNA. Wektor pGSV1 jest dostarczony z genem barstar w głównej ramce plazmidu, z sygnałami regulatorowymi dla ekspresji w E.coli.
Pełen opis DNA zawartego pomiędzy granicznymi powtórzeniami pTHW107 podano w Tabeli 1:
PL 205 071 B1
T a b e l a 1: T-DNA plazmidu pTHW107
| Pozycja nukleotydów | Orientacja | Opis i literatura |
| 1-25 | Prawe powtórzenie graniczne z TL-DNA z pTiB6S3 (Gielen i wsp. (1984) The EMBO Journal 3: 835-846). | |
| 26-97 | Sekwencje pochodzące z syntetycznego polilinkera. | |
| 309-98 | przeciwnie do ruchu wskazówek zegara | 3' nieulegający translacji obszar z genu 7 (3'g7) TL-DNA z pTiB6S3 (Velten i Schell (1985) Nucleic Acids Research 13: 6981-6998; Dhaese i wsp. (1983) The EMBO Journal 3: 835-846). |
| 310-330 | Sekwencje pochodzące z syntetycznego polilinkera. | |
| 882-331 | przeciwnie do ruchu wskazówek zegara | Sekwencja kodująca genu bar z Streptomyces hygroscopicus (Thompson i wsp. (1987) The EMBO Journal 6: 2519-2523). N-końcowe dwa kodony dzikiego typu regionu kodującego bar zostały podstawione odpowiednio kodonami ATG i GAC. |
| 2608-883 | przeciwnie do ruchu wskazówek zegara | Promotor z genu dla atS1A małej podjednostki karboksylazy rybulozo-1,5-bifosforanu z Arabidopsis thaliana (PssuAra) (Krebbers i wsp. (1988) Plant Molecular Biology 11: 745-759). |
| 2609-2658 | Sekwencje pochodzące z syntetycznego polilinkera. | |
| 2919-2659 | przeciwnie do ruchu wskazówek zegara | Fragment Taql o długości 260 par zasad z 3' nieulegającego translacji końca genu syntetazy nopaliny (3'nos) z T-DNA z pTiT37 zawierający roślinny sygnał poliadenylacji (Depicker i wsp. (1982) Journal of Molecular and Applied Genetics 1: 561-573). |
| 2920-3031 | 3' nieulegający translacji obszar poniżej sekwencji kodującej barnase z B. amyloliquefaciens. | |
| 3367-3032 | przeciwnie do ruchu wskazówek zegara | Obszar kodujący genu barnase z Bacillus amyloliquefaciens (Hartley (1988) Journal of Molecular Biology 202: 913-915). |
| 4877-3368 | przeciwnie do ruchu wskazówek zegara | Obszar promotora genu TA29, specyficznego dla pylników z Nicotiana tabacum. Promotor zawiera 1,5 tyś. par zasad sekwencji powyżej kodonu inicjacji translacji ATG (Seurinck i wsp. (1990) Nucleic Acids Research 18: 3403). |
| 4878-4921 | Sekwencje pochodzące z syntetycznego polilinkera. | |
| 4922-4946 | Lewe graniczne powtórzenie z TL-DNA z pTiB6S3 (Gielen i wsp. (1984) The EMBO Journal 3: 835-846). |
b) Konstrukcja chimerowego DNA zawierającego gen barstar pod kontrolą promotora konstytutywnego (pTHW118).
Plazmid pTHW118 (SEK NR ID. 2) był zasadniczo dostarczony z pośredniego wektora pGSV1 (opisany powyżej). Pełen opis DNA zawartego pomiędzy granicznymi powtórzeniami pTHW118 podano w Tabeli 2:
T a b e l a 2: T-DNA plazmidu pTHW118
| Pozycja nukleotydów | Orientacja | Opis i literatura |
| 1 | 2 | 3 |
| 1-25 | Prawe powtórzenie graniczne z TL-DNA z pTiB6S3 (Gielen i wsp. (1984) The EMBO Journal 3: 835-846). | |
| 26-53 | Sekwencje pochodzące z syntetycznego polilinkera. |
PL 205 071 B1 cd. tabeli 2
| 1 | 2 | 3 |
| 54-90 | Pozostałość sekwencji TL-DNA w prawym granicznym powtórzeniu. | |
| 91-97 | Sekwencje pochodzące z syntetycznego polilinkera. | |
| 309-98 | przeciwnie do ruchu wskazówek zegara | 3' nieulegający translacji obszar z genu 7 (3'g7) TL-DNA z pTiB6S3 (Velten i Schell (1985) Nucleic Acids Research 13: 6981-6998; Dhaese i wsp. (1983) The EMBO Journal 3: 835-846). |
| 310-330 | Sekwencje pochodzące z syntetycznego polilinkera. | |
| 883-331 | przeciwnie do ruchu wskazówek zegara | Sekwencja kodująca odporność na bialafos (gen bar) z Streptomyces hygroscopicus (Thompson i wsp. (1987) The EMBO Journal 6: 2519-2523). N-końcowe dwa kodony dzikiego typu regionu kodującego bar zostały podstawione odpowiednio kodonami ATG i GAC. |
| 2608-883 | przeciwnie do ruchu wskazówek zegara | Promotor z genu dla atS1A małej podjednostki karboksylazy rybulozo1,5-bifosforanu z Arabidopsis thaliana (PssuAra) (Krebbers i wsp. (1988) Plant Molecular Biology 11: 745-759). |
| 2609-2658 | Sekwencje pochodzące z syntetycznego polilinkera | |
| 2919-2659 | przeciwnie do ruchu wskazówek zegara | Fragment Taql o długości 260 par zasad z 3' nieulegającego translacji końca genu syntetazy nopaliny (3'nos) z T-DNA z pTiT37 zawierający roślinny sygnał poliadenylacji (Depicker i wsp. (1982) Journal of Molecular and Applied Genetics 1: 561-573). |
| 2920-2940 | Sekwencje pochodzące z syntetycznego polilinkera | |
| 2941-2980 | 3' nieulegający translacji obszar poniżej sekwencji kodującej barstar z Bacillus amyloliquefaciens. | |
| 3253-2981 | przeciwnie do ruchu wskazówek zegara | Obszar kodujący genu barstar z Bacillus amyloliquefaciens (Hartley (1988) Journal of Molecular Biology 202: 913-915). |
| 4762-3254 | przeciwnie do ruchu wskazówek zegara | Obszar promotora genu TA29, specyficznego dla pylników z Nicotiana tabacum. Promotor zawiera 1,5 tyś. par zasad sekwencji powyżej kodonu inicjacji translacji ATG (Seurinck i wsp. (1990) Nucleic Acids Research 18: 3403). |
| 4763-4807 | Sekwencje pochodzące z syntetycznego polilinkera | |
| 4808-4832 | Lewe graniczne powtórzenie z TL-DNA z pTiB6S3 (Gielen i wsp. (1984) The EMBO Journal 3: 835-846). |
c) Transformacja Brassica napus.
Do transformacji Brassica napus użyto systemu wektora opisanego przez Deblaere i wsp. (1985, 1987). System wektora obejmuje szczep Agrobacterium i dwa plazmidy 1) nie onkogenny plazmid Ti (pGV4000) i 2) pośredni wektor dla klonowania, oparty na plazmidzie pGSV1. Nie onkogenny plazmid Ti z którego usunięto obszar T niesie gen vir wymagany dla przeniesienia sztucznego T-DNA sklonowanego na drugim plazmidzie do genomu rośliny. Szczepy Agrobacterium otrzymane z krzyżówki trójrodzicielskiej, pomiędzy tymi składnikami, nogą być użyte dla transformacji rośliny.
Selekcję przeprowadzono na fosfinotrycynie (PPT), na wszystkich etapach, z wyjątkiem regeneracji wyszczepek, którą prowadzono bez PPT, celem przyśpieszenia wzrostu. W wyniku uzyskano zestaw pierwotnych transformantów (rośliny pokolenia T0).
P r z y k ł a d 2. Uzyskiwanie zdarzeń.
2.1 Charakteryzowanie transgenicznych zdarzeń
2.1.1 Analiza Southern blot zdarzeń MS
Występowanie transgenu i liczby insercji genu sprawdzano typową analizą Southern blot. Całkowity genomowy DNA wyizolowano z 1g tkanki kiełków zgodnie z Dellaport (1983, Plant Molecular Biology Reporter, 1 tom 3, str. 19-21 lub Doyle i wsp. 1987, Photochem. Bull. 19:11) i strawiono enzymem restrykcyjnym Sacl. SacI posiada unikalne miejsce restrykcyjne we fragmencie T-DNA umiej16
PL 205 071 B1 scowionym pomiędzy barnase i konstruktami bar. Analizy Southern przeprowadzono z dwoma następującymi sondami:
sonda „barnase: fragment Pstl-EcoRI o wielkości 478 par zasad z plazmidu pVE113 sonda „bar: fragment Ncol-BgIII o wielkości 546 par zasad z plazmidu pDE110.
Plazmid pVE113 i pDW110 są odpowiednio opisane na Fig. 1 i w WO 92/09696. Hybrydyzacja zdarzeń MS z sondą barnase dała 12 tyś par zasad, podczas gdy hybrydyzacja z sondą bar dała fragment 14 tyś. par zasad.
Względna intensywność pasma dała wskazówkę czy rośliny były homozygotyczne lub hemizygotyczne w transgenicznym locus. Znaleziono dwa zdarzenia posiadające proste wstawki. Potwierdzono to przez fakt, że wzór segregacji transgenu może być wytłumaczony przez mendlowskie dziedziczenie pojedynczego locus.
2.1.2. Analiza Southern blot zdarzenia RF.
Występowanie transgenu i liczby insercji genu scharakteryzowano przez typową analizą Southern blot. Całkowity genomowy DNA wyizolowano z 1g tkanki kiełków (zgodnie z Doyle i wsp. 1987, Photochem. Bull. 19:11) i strawiono enzymem restrykcyjnym Sacl. SacI posiada unikalne miejsce restrykcyjne we fragmencie T-DNA umiejscowionym pomiędzy barnase i konstruktami bar. Analizy Southern przeprowadzono z dwoma następującymi sondami:
sonda „barnase: fragment Hindlll-Pstl o wielkości 436 par zasad z plazmidu pVE113 sonda „bar: fragment Ncol-BgIII o wielkości 546 par zasad z plazmidu pDW110.
Hybrydyzacja zdarzeń RF z sondą barnase dała wyznakowane pasmo dla prążka 3 tyś par zasad, podczas gdy hybrydyzacja z sondą bar dała fragment 14 tyś. par zasad.
Względna intensywność prążka dała wskazówkę czy rośliny były homozygotyczne lub hemizygotyczne w transgenicznym locus. Znaleziono dwa zdarzenia posiadające proste wstawki. Potwierdzono to przez fakt, że wzór segregacji transgenu może być wytłumaczony przez mendlowskie dziedziczenie pojedynczego locus.
2.1.3. Ogólny fenotyp rośliny i właściwości agronomiczne.
Rośliny T1 zarówno ze zdarzeniami MS i RF oceniono z uwagi na szereg cech fenotypowych włącznie z wysokością rośliny, siłą/sztywnością źdźbła, skłonnością do wykładania, odpornością na łamanie, tolerancją suszy, odpornością na choroby (czarna nóżka, plamistość liści, Sclerotina) i wytwarzaniem nasion i plennością.
Szczepy oszacowano tak, aby były podobne (lub ulepszone) pod względem właściwości agronomicznych, w porównaniu z niestransformowanymi odmianami, jak również względem szeregu odmian hodowlanych rzepaku oleistego. W pewnych przypadkach, rośliny segregują dając warianty somatyczne z uwagi na jedną lub więcej wyżej wspomnianych cech. Jeśli wynikiem nie było wprowadzenie komercyjnie interesujących cech fenotypowych to rośliny odrzucano.
2.2 Otrzymanie linii niosących cechy MS lub RF.
Różne hemizygotyczne wyszczepki T0 („Ms/-„ lub „Rf/-„) pochodzące z hodowli tkankowej wysadzano do gleby w szklarni. Występowanie transgenu i liczby kopii sprawdzano analizą Southern blot (opisana powyżej). Roślinom pozwolono zakwitnąć i oceniono odpowiednio sterylność lub płodność kwiatów. Rośliny T0 krzyżowano z roślinami typu dzikiego (-/-) wytwarzając nasiona T1 (MsT1 i RfT1). Nasiona T1 wysadzono i hodowano w szklarni. Rośliny oceniano z uwagi na tolerowanie glufosinatu amonu. Rośliny Ms-T1 oceniano również pod względem segregacji sterylności/płodności (nieopryskiwanych roślin), podczas gdy rośliny Rf-T1 sprawdzano pod względem płodności kwiatów.
Rośliny Ms-T1 zawierające transgen skrzyżowano z testową rośliną homozygotyczną pod względem genu odtwarzającego płodność (Rf/Rf), dla wytworzenia nasion MsRf-Fl. Nasiona te (Ms/-, Rf/- i -/-, Rf/-) wysadzano w szklarni i opryskano Liberty™. Pozostałe potomstwo F1 oceniano pod względem segregacji płodności/sterylności testując, czy cecha męskosterylności może być odpowiednio odtworzona w Brassica napus (płodność zbliżona do 100%).
Najlepsze zdarzenia wybrano dla dalszych testów. Rośliny MsT1 krzyżowano z rośliną homozygotyczną odtwarzającą płodność i nasiona wysiewano w polu. Rośliny oceniano z uwagi na tolerowanie herbicydu Liberty™ (800 gramów aktywnego składnika na hektar (g.a.i./ha), dawka zalecana rolnikom wynosi 400 g.a.i./ha), z uwagi na segregację płodności/sterylności i ogólną charakteryzację fenotypu. Wybierano linie, w których płodność była odtworzona w 100% i w których nie pojawiły się negatywne zmiany fenotypu lub właściwości agronomicznych (wyszczególnione jako(d)) w porównaniu z izogenicznymi kontrolami typu dzikiego.
PL 205 071 B1
Rośliny Rf-T1 zawierające transgen krzyżowano z testowymi roślinami zawierającymi gen męsko sterylności (Ms/-) dla wytworzenia nasion F1. Nasiona te wysiewano w szklarni, opryskiwano Liberty™ i oceniono odtworzenie płodności (prawie 100%).
Równocześnie rośliny Rf-T1 są krzyżowane wsobnie dla wytworzenia S1. Rośliny S1 hodowano w szklarni, opryskiwano Liberty™ i ponownie krzyż owano wsobnie dla uzyskania S2, a z S2 selekcjonowano homozygotyczne jednostki.
2.3. kombinacja zdarzeń MS i RF
Celem sprawdzenia odtworzenia płodności, wybrane rośliny Ms-T1 krzyżowano w szklarni z wybranymi zdarzeniami Rf-S2. Nasiona pikowano w szklarni, roś liny opryskano Liberty™ i sprawdzano płodność i kwiaty.
2.4. testowanie zdarzeń MS i RF w różnym tle genetycznym i w różnych miejscach
Wyselekcjonowane zdarzenia wprowadzono w dwa znaczące różne tła genetyczne, celem potwierdzenia, że zdarzenia MS i RF funkcjonują dobrze i nie mają ujemnego wpływu na plon lub jakość w jakimkolwiek testowanym tle.
W tym samym czasie wyselekcjonowane zdarzenia MS i RF są testowane w czterech do pię ciu różnych środowiskach dając pewność, że nie ma negatywnych oddziaływań pomiędzy środowiskiem i zdarzeniami MS lub RF.
W nastę pnym etapie bardziej intensywnie testowano w polu wytwarzanie hybrydowych nasion używając wyselekcjonowanych zdarzeń MS i RF.
Wybrane zdarzenie MS w oryginalnym tle i w dwóch różnych i heterozygotycznie odmiennych tłach krzyżowano z dwoma wybranymi zdarzeniami RF w ich oryginalnym tle i dwóch różnych, heterozygotycznie odmiennych tłach. Hybrydę F1 oceniono z uwagi na odporność na Liberty™, z uwagi na płodność, jak również ogólne właściwości agronomiczne (wydajność i jakość).
2.5. selekcja elitarnych zdarzeń
Powyżej opisana procedura selekcji służąca do wytworzenia transgenicznej linii MS dała szereg elitarnych zdarzeń, które ujawniają optymalną ekspresję transgenu, to jest odporność na glufosinat amonu, fenotyp męsko sterylności i podatności na pełne odtworzenie płodności z homozygotyczną linią odtwarzającą płodność, dokładniej z wybranym elitarnym zdarzeniem RF.
P r z y k ł a d 3: wprowadzenie kandydatów na elitarne zdarzenie do WOSR.
Szereg elitarnych zdarzeń MS i RF, które otrzymano w B. napus jak to opisano powyżej, wprowadzono przez kolejne krzyżowania z roślinami Drakkar do odmian hodowlanych ozimego rzepaku oleistego WOSR.
Rośliny sprawdzano i ustalono, że:
a) obecność obcego DNA nie upośledza innych pożądanych cech roślin takich, jak właściwości agronomiczne lub właściwości komercyjne;
b) zdarzenie scharakteryzowano przez dobrze zdefiniowaną konfigurację molekularną, która dziedziczy się stabilnie;
c) interesujące gen(y) w obcym DNA pokazały prawidłowy, odpowiedni i stabilny przestrzennie i czasowo fenotyp ekspresji, zarówno w heterozygocie (lub hemizygocie) i homozygocie pod wzglę dem zdarzenia, na komercyjnie akceptowalnym poziomie, w zakresie warunków środowiskowych na które rośliny niosące zdarzenie prawdopodobnie będą wystawione w czasie normalnej uprawy.
Ponadto, rośliny były ocenione pod względem ich charakterystyki agronomicznej i zachowania w porównaniu z gatunkami WOSR typu dzikiego.
Intensywne badania polowe pokazały, że określone kandydujące zdarzenia elitarne jarego rzepaku oleistego, gdy są wprowadzone do ozimego rzepaku oleistego WOSR dają rośliny ujawniające odpowiednią ekspresję genów w obcym DNA, w połączeniu z optymalnymi właściwościami agronomicznymi. Zdarzenia te wyselekcjonowano jako elitarne zdarzenia MS i RF w WOSR i nazwano odpowiednio MS-BN1 i RF-BN1.
P r z y k ł a d 4. Charakteryzowanie elitarnych zdarzeń Ms-BN-1 i RF-BN1.
Gdy MS-BN1 i RF-BN1 zostały zidentyfikowane jako zdarzenia elitarne, w których ekspresja odpowiednich transgenów, jak również ogólne właściwości agronomiczne były optymalne to loci transgenu zbadano szczegółowo na poziomie molekularnym. Obejmuje to szczegółowe badanie Southern blot (przy pomocy wielu enzymów restrykcyjnych) i sekwencjonowania rejonów otaczających transgen.
PL 205 071 B1
4.1 Analiza Southern blot przy pomocy wielu enzymów restrykcyjnych.
Tkankę liścia zebrano z roślin transgenicznych i kontrolnych. Całkowity genomowy DNA wyizolowano z tkanki liścia zgodnie z Dellaporta i wsp. (1983, Plant Molecular Biology Report, 1, tom 3 str. 19-21). Stężenie DNA w każdym preparacie określono przez pomiar gęstości optycznej w spektrofotometrze przy długości fali 260 nm.
gg genomowego DNA strawiono enzymem restrykcyjnym w ostatecznej objętości reakcji 40 gl, stosując warunki reakcji zalecane przez producenta. Czas trawienia i/lub ilość enzymu restrykcyjnego ustalono tak, aby być pewnym całkowitego strawienia próbek genomowego DNA bez niespecyficznej degradacji. Po trawieniu 4 gl barwnika do nanoszenia dodawano do strawionych próbek DNA i nanoszono je na 1% żel agarozowy.
Na żel naniesiono również następujący kontrolny DNA:
- kontrola negatywna z preparatu genomowego DNA z nie transgenicznej rośliny Brassica. Ta kontrola negatywna jest użyta dla potwierdzenia braku tła hybrydyzacji.
- DNA kontroli pozytywnej: z heterozygoty z wbudowaną pojedynczą kopią transgenu do genomu Brassica napus, 10 gq genomowego DNA zawiera tą sama ilość równoważników cząsteczki co ± 19 pikogramów fragmentu PvuI-HindIII o wielkości 1501 par zasad z DNA pTHW118 (wielkość diploidalnego genomu Brassica napus: 0,8x109 par zasad). Ilość odpowiadająca jednej kopii plazmidu na genom jest dodana do 1 gq strawionego, nie transgenicznego DNA Brassica napus. Zrekonstruowana próbka jest użyta dla pokazania, że hybrydyzacje są przeprowadzone w warunkach pozwalających na hybrydyzację sondy z sekwencjami docelowymi.
Jako standard wielkości użyto DNA faga lambda (szczep Clind 1 ts 857 Sam 7, Life Technologies) strawionego Pstl.
Po elektroforezie próbek DNA (strawiony genomowy DNA Brassica, kontroli i DNA standardów wielkości) przenoszono je na błonę Nylonową przez blotowanie kapilarne trwające 12 do 16 godzin.
Matryce DNA użyte do przygotowania sondy dla zdarzeń MS-BN1 przygotowano przez trawienia restrykcyjne Hindlll PTW107. Uwalnia ono fragment DNA o wielkości 3942 par zasad zawierający odpowiednią część transformującego DNA (część PSSUARA, 3'nos, barnase, PTA29).
Matryce DNA użyte dla przygotowania sondy dla zdarzeń RF-BN1 przygotowano przez trawienia restrykcyjne Hpal PTW118. Uwalnia ono fragment DNA o wielkości 2182 par zasad zawierający odpowiednią część transformującego DNA (część PSSUARA, 3'nos, barstar, PTA29).
Po oczyszczeniu fragmenty DNA wyznakowano według typowej procedury i użyto dla hybrydyzacji z filtrem.
Hybrydyzację przeprowadzono w warunkach o typowej ostrości. Wyznakowane sondy denaturowano przez ogrzanie przez 5 do 10 minut w łaźni wodnej o temperaturze 95°C do 100°C i schłodzenie w lodzie przez 5 do 10 minut i dodanie do roztworu dla hybrydyzacji (6XSSC (20X SSC to 3,0 M NaCl, 0,3 M cytrynian sodu, pH 7,0), 5X roztwór Denhardt (100X roztwór Denhardt = 2% Ficoll, 2% poliwinylo pyrolidon, 2% albumina z surowicy wołu), 0,5% SDS i 20 gq/ml zdenaturowanego nośnikowego DNA (jednoniciowy DNA ze spermy rybiej, o średniej długości 120-3000 nukleotydów). Hybrydyzację przeprowadzono przez noc w 65°C. Filtry płukano trzykrotnie przez 20 do 40 minut w 65°C roztworem do płukania (2X SSC, 0,1% SDS).
Autoradiogramy skanowano elektronicznie.
4.1.1. MS-BN1.
Wzory restrykcyjne otrzymane po trawieniu genomowego DNA MS-BN1 różnymi enzymami restrykcyjnymi przedstawiono na Fig. 2 i podsumowano w Tabeli 3.
T a b e l a 3: Mapa restrykcyjna MS-BN1
| Nr ścieżki | Naniesiony DNA | Migracja hybrydyzujących fragmentów DNA pomiędzy pasmami znacznika wielkości | Oszacowana długość hybrydy- zujących fragmentów DNA | |
| Większy niż | Mniejszy niż | |||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 1 | MS-BN1-EcoRI | 2140 | 2450 | 2666 par zasad (*) |
| 14057 | >14 tys. par zasad | |||
| 2 | MS-BN1-EcoRV | 1159 | 1700 | 1,4 tyś. par zasad (*) |
| 14057 | - | >14 tyś. par zasad |
PL 205 071 B1 cd. tabeli 3
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 4 | MS-BN1-Hpal | 1986 2140 | 2140 2450 | 1990 par zasad 2229 par zasad |
| 2450 | 2838 | 2477 par zasad (*) | ||
| 5 | MS-BN1-Afllll | 2140 | 2450 | 2250 par zasad |
| 514 | 805 | 552 par zasad (*) | ||
| 6 | MS-BN1-Ndel | 5077 | 14057 | 10 tyś. par zasad |
| 5077 | 14057 | 6510 tyś. par zasad | ||
| 7 | nietransgeniczny WOSR | - | - | - |
| 8 | DNA plazmidu kontrol- | 1700 | 1986 | 1966 par zasad (*) |
| nego - BamHI | 2450 | 2838 | 2607 par zasad (*) |
(*) długości tych fragmentów są tymi, które wyznaczono na podstawie mapy restrykcyjnej plazmidu pTHW107.
4.1.2. RF-BN1
Wzory restrykcyjne otrzymane po trawieniu genomowego DNA RF-BN1 różnymi enzymami restrykcyjnymi przedstawiono na Fig. 3 i podsumowano w Tabeli 4.
T a b e l a 4: Mapa restrykcyjna RF-BN1
| Numer ścieżki | Naniesiony DNA | Migracja hybrydyzujących fragmentów DNA pomiędzy pasmami znacznika wielkości | Oszacowana długość hybrydyzujących fragmentów DNA | |
| Większy niż | Mniejszy niż | |||
| 805 | 1099 | 814 par zasad | ||
| 1 | MS-BN1-BamHI | 1700 | 1986 | 1849 par zasad (*) |
| 2450 | 2838 | 2607 par zasad (*) | ||
| 5077 | 14057 | 6580 tys. par zasad | ||
| 805 | 1159 | 1094 par zasad | ||
| 2 | MS-BN1-EcoRI | 1986 | 2450 | 2149 par zasad |
| 5077 | 14057 | 7000 par zasad | ||
| 5077 | 14057 | 10 tys. par zasad | ||
| 3 | MS-BN1-EcoRV | 5077 | 14057 | 5,4 tys. par zasad |
| 5077 | 14057 | 8 tys. par zasad | ||
| 1700 | 2140 | 1969 par zasad | ||
| 4 | MS-BN1-Hindlll | 2450 | 2838 | 2565 par zasad |
| 2450 | 2838 | 2635 par zasad | ||
| 5 | Nie transgeniczny WOSR | - | - | - |
| 6 | DNA plazmidu kontrolnego - BamHI | 1700 2450 5077 | 1986 2838 14057 | 1849 par zasad (*) 2607 par zasad(*) 8100 par zasad |
(*) długości tych fragmentów są tymi które wyznaczono z mapy restrykcyjnej plazmidu pTHW118 dla BamH1.
4.2. Identyfikacja obszarów otaczających/flankujących.
Obszary otaczające elitarne wydarzenia MS-BN1 i RF-BN1 najpierw zidentyfikowano dla jarego rzepaku oleistego OSR, w których powstały zdarzenia i następnie sprawdzane dla ozimego rzepaku oleistego WOSR.
4.2.1. Identyfikacja rejonów otaczających MS-BN1
4.2.1.1. Prawy (5') rejon otaczający
Użyto sekwencję prawego obszaru granicznego MS-BN1, reakcję łączenia przy pomocy reakcji łańcuchowej polimerazy (Mueller i wsp. 1989, Science 780-786; Maxine i wsp., 1994, PCR Methods and Applications, 71-75) z wyłapywaniem wydłużonych cząsteczek (Tormanen i wsp., 1993, NAR
20:5487-5488).
PL 205 071 B1
Oligonukleotydami użytymi dla przygotowania łącznika były:
MDB248: (SEK NR ID. 3)
5'CAT GCC CTG ACC CAG GCT AAG TAT TTT AAC TTT AAC CAC TTT GCT CCG ACA GTC CCA TTG
MDB249: (SEK NR ID. 4)
5'CAA TGG GAC TGT CGG AGG ACT GAG GGC CAA AGC TTG GCT CTT AGC CTG GGT CAG GGC ATG
Przygotowanie łącznika poprzedziła synteza pierwszej nici z genomowego DNA MS-BN1 strawionego Ncol, przy pomocy biotynylowanych starterów specyficznych dla genu:
| Sekwencja (5'^3') | Miejsce w pTHW107 | |
| biotynylowany starter MDB247 | CCG TCA CCG AGA TCT GAT CTC ACG CG (SEK NR ID. 5) | 322 347 |
Łącznik jest następnie łączony z pierwszą nicią DNA, która następnie jest przyłączona do ziaren magnetycznych, z których nie biotynylowane nici są wymywane. DNA został użyty amplifikacji przez PCR na większą skalę przy pomocy poniższych starterów:
| Sekwencja (5^3') | Miejsce w pTHW107 | |
| starter łącznikowy MDB250 | GCACTGAGGGCCAAAGCTTGGCTC (SEK NR ID. 6) | - |
| T-DNA starter MDB251 | GGATCCCCCGATGAGCTAAGCTAGC (SEK NR ID. 7) | 293 317 |
PCR daje fragment o wielkości około 1150 par zasad. Fragment prawego ogranicznika oczyszczano z żelu agarozowego i przeprowadzono następny PCR na 100 razy rozcieńczonym DNA przy pomocy następujących starterów:
| Sekwencja (5^3') | Miejsce w pTHW107 | |
| starter łącznikowy MDB254 | CTTAGCCTGGGTCAGGGCATG (SEK NR ID. 8) | - |
| T-DNA starter MDB258 | CTACGGCAATGTACCAGCTG (SEK NR ID. 9) | 224 243 |
Otrzymany fragment o długości około 1000 par zasad wymywano z żelu agarozowego, oczyszczano i łączono ligazą z wektorem pGem®-T. Zrekombinowany plazmidowy DNA wyszukiwano stosując typową reakcję PCR z poniższymi starterami:
| Sekwencja (5'^3') | Miejsce w pTHW107 | |
| starter SP6 | TAATACGACTCACTATAGGGCGA (SEK NR ID. 10 | (SP6 promotor w wektorze pGem®-T) |
| starter T7 | TTTAGGTGACACTATAGAATAC (SEK NR ID. 11) | (T7 promotor w wektorze pGem®-T) |
| T-DNA starter MDB201 | gCTTGGACTATAATACCTGAC (SEK NR ID. 12) | 143 163 |
Otrzymano następujące fragmenty:
SP6-T7: 1224 par zasad
SP6-MDB201: 1068 par zasad
T7-MDB201: 1044 par zasad.
Prawy graniczny fragment oczyszczono i oznaczono jego sekwencję nukleotydową (SEK NR ID. 13) uzyskując fragment o długości 963 par zasad z którego 1-867 odpowiada roślinnemu DNA i pary zasad 868 do 953 odpowiada T-DNA pTW107.
4.2.1.2. Lewy (3') obszar otaczający MS-BN1
Sekwencję nukleotydową lewego granicznego obszaru otaczającego transgen w zdarzeniu MS-BN1 określono przy pomocy metody (TAIL-) PCR jak to opisali Liu i wsp. (1995, The Plant JourPL 205 071 B1 nal 8(3): 457-463). Sposób wykorzystuje trzy specyficzne zagnieżdżone startery w kolejnych reakcjach wraz z krótszym arbitralnie zdegenerowanym (AD) starterem tak, że względna wydajność amplifikacji specyficznej i niespecyficznej może być kontrolowana termicznie. Specyficzne startery były wybrane tak, aby przyłączały się do sekwencji granicznych transgenu w oparciu o warunki ich przyłączenia. Małą ilość (5 μί) nieoczyszczonego drugorzędowego i trzeciorzędowego produktu PCR analizowano w 1% żelu agarozowym. Trzeciorzędowy produkt reakcji użyty dla preparatywnej amplifikacji, oczyszczono i oznaczono jego sekwencję nukleotydową przy pomocy automatycznego urządzenia do oznaczania sekwencji nukleotydowej i zestawu DyeDeoxy Terminator cycle kit.
Użyto następujących starterów:
| Sekwencja (5'^-3') | Miejsce w pTHW107 | |
| Zdegenerowany starter MDB611 | NgTCgASWgTNTWCAA (SEK NR ID. 14) | - |
| Pierwszorzędowy starter TAIL MDB259 | gTgCAGGGAAgCggTTAACTgg (SEK NR ID. 15) | 7164 4186 |
| Drugorzędowy starter TAIL MDB260 | CCTTTggAgTAAATggTgTTgg (SEK NR ID. 16) | 4346 4366 |
| Trzeciorzędowy starter TAIL HCA24 | gCTTGGACTATAATACCTGAC (SEK NR ID. 17) | 4738 4757 |
gdzie N=A< C< T lub g; S=C lub g; W=A lub T
Fragment namnożony przy pomocy HCA24-MDB611 miał 540 par zasad, z których sekwencję nukleotydową oznaczono dla 537 par zasad (3' otoczenie SEK NR ID 18). Sekwencja pomiędzy zasadą 1 i 180 obejmuje DNA pTHW107, podczas gdy sekwencja pomiędzy 181 a 537 odpowiada roślinnemu DNA.
4.2.1.3. Identyfikacja ukierunkowanej delecji.
Stosując startery odpowiadające sekwencjom otaczającym regiony transgenu i jako matrycę Brassica napus var. Drakkar typu dzikiego zidentyfikowano miejsce wbudowania transgenu.
Stosowano następujące startery:
| Sekwencja (5'^-3') | Miejsce w 5' otoczeniu (SEK NR ID. 13) | Miejsce w 3' otoczeniu (SEK NR ID. 18) | |
| VDS51 | TgACACTTTgAgCCACTCg (SEK NR ID. 19) | 733 751 | - |
| HCA48 | GgAgggTgTTTTTggTTATC (SEK NR ID. 20) | - | 189 208 |
Dało to fragment o wielkości 178 par zasad (SEK NR ID. 21) w którym zasady 132 do 150 odpowiadają docelowemu miejscu delecji.
4.2.1.4. Identyfikacja miejsca insercji MS-BN1.
Opierając się na identyfikacji obszarów otaczających i docelowego miejsca delecji określony może być region insercji MS-BN1 (SEK NR ID. 22):
1-822 5' otaczający obszar zasady 46-867 z SEK NR ID. 13
823-841 docelowe miejsce delecji zasady 132-150 z SEK NR ID. 21
842-1198 3' otaczający obszar zasady 181 do 537 z SEK NR ID. 18
4.2.2. Identyfikacja obszaru otaczającego region RF-BN1.
Graniczne regiony otaczające RF-BN1 określono przez Vectorette-PCR (Use of Vectorette and Subvectorette PCR to isolate transgene flanking DNA, Maxine J. Allen, Andrew Collick i Alec J. Jeffreys PCR Methods and Applications - 1994 (4) strony 71-75) stosując jako matrycę genomowy DNA RF-BN1 strawiony Hindlll. Łącznik „vectorette został sporządzony przy pomocy wyżej opisanych starterów MDB248 (SEK NR ID. 3) i MDB249 (SEK NR ID.4).
PL 205 071 B1
4.2.2.1. Prawy (5') rejon otaczający BN-RF1. Użyto następujących starterów:
| Sekwencja (5'^3') | Pozycja w pTHW118 | |
| Starter Vectorette MDB250 | GCACTGAGGGCCAAAGCTTGGCTC (SEK NR ID. 6) | - |
| Starter Vectorette MDB254 | CTTAGCCTGGGTCAGGGCATG (SEK NR ID. 8) | - |
| Starter T-DNA MDB251 | GGATCCCCCGATGAGCTAAGCTAGC (SEK NR ID. 7) | 293 317 |
| Starter T-DNA MDB193 | CTACGGCAATGTACCAGC (SEK NR ID. 23) | 226 243 |
| Starter T-DNA MDB258 | CTACGGCAATGTACCAGCTG (SEK NR ID. 9) | 224 243 |
| Starter T-DNA MDB201 | GCTTGGACTATAATACCTGAC (SEK NR ID. 12) | 143 163 |
Otrzymano fragment o wielkości 1077 par zasad (SEK NR ID. 24) w którym zasady 1-881 odpowiadają DNA rośliny, a pary zasad 882-1077 odpowiadają T-DNA z pTW118.
4.2.2.2. Lewy obszar otaczający BN-RF1
Dla zidentyfikowania 3' otaczającego obszaru zdarzenia elitarnego BN-RF1, przeprowadzono TAIL PCR, tak jak to opisano powyżej używając arbitralnie zdegenerowany starter i startery umiejscowione w T-DNA w sąsiedztwie lewego obszaru granicznego.
Użytymi starterami były:
Arbitralnie zdegenerowany starter:
MDB286 NTg.CgA.SWg.ANA.WgA.A gdzie: N=A, C, T lub g; S=C lub g; W=A lub T
T-DNA startery:
MDB314 gTAggAggTTgggAAgACC
MDB315 gggCTTTCTACTAgAAAgCTCTCgg
MDB316 CCgATAgggAAgTgATgTAggAgg (SEK NR ID. 25) (SEK NR ID. 26) (SEK NR ID. 27) (SEK NR ID. 28)
Otrzymano fragment o wielkości około 2000 par zasad. Fragment ten sklonowano w wektorze pGem®-T i użyto jako matrycę dla reakcji PCR prowadzonej przy pomocy poniższych starterów:
Starter dla DNA rośliny:
MDB288 starter T-DNA ATgCAgCAAgAAgCTTggAgg (SEK NR ID. 29)
MDB314 gTAggAggTTgggAAgACC (SEK NR ID. 26)
Otrzymano fragment o wielkości 1500 par zasad (SEK NR ID. 30), w którym pary zasad 1-166 odpowiadają T-DNA z plazmidu pTW118 i 167-1441 odpowiada roślinnemu DNA.
4.2.2.3. Molekularna analiza adresowanej delecji.
Adresowaną delecję sklonowano sposobem TAIL-PCR (opisany powyżej) stosując dzikiego typu genomowy DNA i startery specyficzne dla roślinnego DNA wiążące się powyżej wstawki T-DNA wbudowanej w orientacji do wstawki:
Arbitralny zdegenerowany starter:
MDB286 NTgCgASWgANAWgAA gdzie: N=A, C, T lub g; S=C lub g; W=A lub T
Startery dla DNA roślinnego
MDB269 ggTTTTCggAggTCCgAgACg
MDB283 CTTggACCCCTAggTAAATgC
MDB284 gTACAAAACTTggACCCCTAgg (SEK NR ID. 25) (SEK NR ID. 31) (SEK NR ID. 32) (SEK NR ID. 33)
Otrzymano fragment o długości 1068 par zasad (SEK NR 20 ID. 34) w którym:
53-83:
84-133:
134-1055:
5' region flankujący miejsce docelowe delecji 3' region flankujący
PL 205 071 B1
Po wbudowaniu T-DNA doszło do delecji docelowego miejsca o długości 51 par zasad. Porównanie sekwencji locus typu dzikiego z locus Rf3 ujawniło występowanie wypełniającego DNA na złączu z prawą sekwencją graniczną. Wypełniająca sekwencja TCTCG na prawym obszarze granicznym jest otoczona na 5' końcu przez sekwencję TCA i na 3' końcu przez CGA. Trójki te znaleziono również w odpowiednich miejscach pęknięcia adresowanej delecji i T-DNA. Badanie najbardziej odległych sekwencji roślinnych ujawniło możliwe pochodzenie wypełniającego DNA. Sekwencja TCA.TCTCG.CGA występuje również w roślinnym DNA na 3' końcu miejsca adresowanej delecji. Jest to sekwencja rdzenia 13-nukleotydowych identycznych powtórzeń umiejscowionych 210 par zasad poniżej miejsca adresowanej delecji.
Obszar insercji RF-BN1 może być określony jako zawierający lewy region otaczający miejsce adresowanej delecji i prawy obszar otaczający jak następuje:
1-881: 5' otaczający obszar (1-881 z SEK NR ID. 24)
882-932: docelowe miejsce delecji (84-133 z SEK NR ID. 34)
933-2207: 3' otaczający region (167-1441 z SEK NR ID. 30)
4.3. Genetyczna analiza locus
Genetyczna stabilność insercji dla dwóch zdarzeń była sprawdzana przez analizy molekularne i fenotypowe potomstwa roś lin prowadzone przez szereg pokoleń .
Wyniki oznaczeń Southern blot pokolenia T0, T1 i T2 porównano dla obu zdarzeń MS-BN1 i RF-BN1. Stwierdzono, ż e otrzymane wzory są identyczne dla każ dego ze zdarzeń w róż nych pokoleniach. Potwierdziło to, że molekularna konfiguracja transgenów była stabilna zarówno w roślinach zawierających MS-BN1 jak i RF-BN1.
Zdarzenia MS-BN1 i RF-BN1 ujawniały mendlowską segregację w przypadku odpowiednich transgenów jako pojedyncze genetyczne loci, przynajmniej w trzech kolejnych pokoleniach wykazując, że wstawki są stabilne.
Na podstawie powyższych wyników MS-BN1 i MS-RF1 zidentyfikowano jako elitarne zdarzenia.
4.4. Identyfikacja sekwencji otaczających MS-BN1 i RF-BN1 w ozimym rzepaku oleistym WOSR.
Sekwencje otaczające zdarzenia elitarne MS-BN1 i RF-BN1 w WOSR określono przy pomocy starterów, które wytworzono na podstawie sekwencji otaczających te zdarzenia w jarym rzepaku oleistym. Prawą (5') sekwencję flankującą MS-BN1 WOSR określono przy pomocy startera T-DNA (SEK NR ID. 12) i startera umiejscowionego w prawym, granicznym dla MS-BN1 DNA rośliny.
VDS57: 5'-gCATgATCTgCTCgggATggC-3' (SEK NR ID. 35)
Otrzymano fragment o długości 909 par zasad (SEK NR ID. 36) o sekwencji zasadniczo podobnej do sekwencji SEK NR ID. 13 (począwszy od nukleotydu 98).
Lewa (3') sekwencja flankująca MS-BN1 WOSR została określona przy pomocy startera T-DNA (SEK NR ID. 17) i startera umiejscowionego w lewej flankującej MS-BN1 sekwencji DNA roślinnego:
HCA68: 5'-CCATATAcgCCAgAgAggAC-3' (SEK NR ID. 37)
Otrzymano fragment o wielkości 522 pary zasad (SEK NR ID. 38) o sekwencji zasadniczo podobnej do sekwencji SEK NR ID. 18.
Prawą (5') sekwencję otaczającą RF-BN1 określono przy pomocy startera T-DNA (SEK NR ID. 12) i startera umiejscowionego w prawym, granicznym dla RF-BN1 DNA roślinnym (SEK NR ID. 31). Otrzymano fragment o wielkości 694 pary zasad (SEK NR ID. 39) o sekwencji zasadniczo podobnej do sekwencji SEK NR ID. 24 (od nukleotydu 293 do 980).
Lewa graniczna sekwencja dla RF-BN WOSR została określona przy pomocy startera T-DNA (SEK NR ID. 26) i startera umiejscowionego w lewym granicznym dla RF-BN1 DNA rośliny (SEK NR ID. 29). Otrzymano fragment o długości 1450 par zasad z czego ustalono sekwencję nukleotydową 1279 par zasad (SEK NR ID. 40). Okazało się, że sekwencja ta jest zasadniczo podobna do sekwencji SEK NR ID. 30 (od nukleotydu 141 do 1421).
Co za tym idzie potwierdzono, że lewa i prawa sekwencje graniczne w zdarzeniach elitarnych MS-BN1 i RF-BN1 są zasadniczo podobne w jarym rzepaku oleistym (SOSR) i ozimym rzepaku oleistym (WOSR).
PL 205 071 B1
P r z y k ł a d 5
Opracowanie narzędzi diagnostycznych dla kontroli identyczności
Opracowano następujące protokoły dla identyfikacji materiału roślinnego WOSR zawierającego elitarne zdarzenie MS-BN1.
5.1 Protokół identyfikacji zdarzenia elitarnego MS-BN1 i RF-BN1 na podstawie mapy restrykcyjnej.
Rośliny WOSR zawierające zdarzenie elitarne MS-BN1 mogą być zidentyfikowane metodą Southern blot wykorzystując zasadniczo takie same procedury, jak opisane w Przykładzie 4.1. Co za tym idzie genomowy DNA WOSR jest 1) strawiony przynajmniej dwoma, korzystnie przynajmniej trzema, szczególnie przynajmniej czterema, szczególnie korzystnie wszystkimi następującymi enzymami restrykcyjnymi: EcoRI, EcoRV, Ndel, Hpal, AfIIII, 2) przeniesienie na filtry nylonowe i 3) hybrydyzowane z fragmentem o długości 3942 par zasad otrzymanym po trawieniu Hindlll plazmidu pTHW107. Jeśli odnośnie przynajmniej dwóch użytych enzymów restrykcyjnych zidentyfikowane fragmenty DNA mają tą samą długość, jak wymienione w Tabeli 3 z Przykładu 4.1.1., to roślina WOSR jest określona jako niosąca elitarne zdarzenie MS-BN1.
Rośliny WOSR zawierające elitarne zdarzenie RF-BN1 mogą być zidentyfikowane metodą Southern blot przy pomocy zasadniczo tej samej procedury jaką opisano w Przykładzie 4.1. Tak więc genomowy DNA WOSR jest 1) trawiony przynajmniej dwoma, korzystnie przynajmniej trzema, korzystniej wszystkimi z następujących enzymów restrykcyjnych: BamHI, EcoRI, EcoRV, Hindlll 2) przenoszony na filtry nylonowe i 3) hybrydyzowany z fragmentem o wielkości 2182 par zasad plazmidu pTHW118 otrzymanego po trawieniu Hpal. Jeśli odnośnie przynajmniej dwóch użytych enzymów restrykcyjnych zidentyfikowane fragmenty DNA mają tą samą długość jak wymienione w Tabeli 4 z Przykł adu 4.1.2., to roś lina WOSR jest okreś lona jako niosą ca elitarne zdarzenie RF-BN1.
5.2 Protokół identyfikacji zdarzenia elitarnego MS-BN1 i RF-BN1 przez łańcuchową reakcję polimerazy.
Przed właściwym badaniem należy przeprowadzić badanie testowe z odpowiednimi reakcjami kontrolnymi. Obecny protokół może wymagać optymalizacji składników, które mogą różnić się pomiędzy laboratoriami (preparaty matrycowego DNA, Taq polimeraza, jakość starterów, d-NTPesy, termocykler itp.).
Amplifikacja endogennych sekwencji odgrywa w tym protokole kluczową rolę. Ktoś może przeprowadzić PCR w warunkach, w których amplifikowane są równo molarne ilości zarówno endogennych jak i transgenicznej sekwencji znanej matrycy, będącej DNA transgenicznego genomu. Ilekroć docelowy, endogenny fragment nie jest amplifikowany, lub ilekroć docelowe sekwencje nie są amplifikowane, tak że dają taką samą intensywność świecenia fragmentów po barwieniu bromkiem etydyny, co osądzono przez elektroforezę w żelu agarozowym, wymagana może być optymalizacja warunków PCR.
5.2.1. Matryca DNA
Matryca DNA jest przygotowana z wycinka liścia lub pojedynczego nasiona zgodnie z Edwards i wsp. (Nucleic Acid Research, 19, str. 1349, 1991). Gdy uż yty DNA przygotowano innymi sposobami to przeprowadzona powinna być testowa reakcja wykorzystująca różne ilości matrycy. Zazwyczaj najlepsze wyniki daje 50 ng matrycy genomowego DNA.
5.2.2. Ustalone pozytywne i negatywne doświadczenia kontrolne
Następujące pozytywne i negatywne doświadczenia kontrolne powinny być uwzględnione w reakcji PCR:
- doś wiadczenie kontrolne z podstawową mieszaniną (kontrola negatywna dla DNA). To reakcja PCR, w której do reakcji nie dodaje się DNA. Gdy obserwowany jest oczekiwany brak produktów PCR to oznacza to, że mieszanina dla PCR nie była zanieczyszczona docelowym DNA.
- kontrola pozytywna dla DNA (próbka genomowego DNA, o którym wiadomo, ze zawiera sekwencję transgenu). Pozytywny wynik reakcji amplifikacji uzyskany dla kontroli pozytywnej wskazuje, że reakcja PCR prowadzona była w warunkach właściwych dla amplifikacji docelowej sekwencji.
- kontrola z dzikim DNA. Taki PCR prowadzi się z matrycowym DNA uzyskanym z genomowego DNA z roślin nietransgenicznych. Jeżeli uzyskuje się spodziewane wyniki, czyli obserwuje się brak amplifikacji w reakcji PCR dla transgenu i uzyskuje się amplifikację endogennego produktu przez PCR wskazuje to, że brak jest oznaczalnego zanieczyszczenia transgenem w próbce genomowego DNA.
PL 205 071 B1
5.2.3. Startery
Użyto następujące startery, które specyficznie rozpoznają transgen i sekwencje otaczającą MS-BN1:
| BNA01: | 5'-gCTTggACTATAATACCTgAC-3' | (SEQ ID 12) |
| (MDB201) | (cel: transgen) | |
| BNA02: | 5'-TgACACTTTgAgCCACTCg-3' | (SEQ ID 19) |
| (VDS51) | (cel: roślinny DNA) | |
| Dla identyfikacji materiału roślinnego zawierającego RF-BN1 użyto poniższe startery, które spe- | ||
| cyficznie rozpoznają transgen i otaczającą sekwencję RF-BN1: | ||
| BNA03: | 5'-TCATCTACggCAATgTACCAg-3' | (SEQ ID 23) |
| (MDB193) | (cel: transgen) | |
| BNA04: | 5'-TggACCCCTAggTAAATgCC-3' | (SEQ ID 41) |
| (MDB268) | (cel: roślinny DNA) |
Startery adresowane do wewnętrznej sekwencji są zawsze uwzględnione w mieszaninie dla PCR. Startery te służą jako wewnętrzna kontrola w nieznanych próbkach i w pozytywnej kontroli DNA. Pozytywny wynik uzyskany dla endogennych par starterów pokazuje, że próbka DNA ma odpowiednią jakość w preparacie genomowego DNA dla uzyskania produktu reakcji PCR. Użytymi endogennymi starterami są:
BNA05: 5'-AACgAgTgTCAgCTAgACCAgC-3' (SEQ ID 42)
BNA06: 5'-CgCAgTTCTgTgAACATCgACC-3' (SEQ ID 43)
5.2.4. Amplifikowane fragmenty.
Oczekiwanymi fragmentami amplifikowanymi w reakcji PCR są:
Dla pary starterów BNA05-BNA06: Dla pary starterów BNA01-BNA02: Dla pary starterów BNA03-BNA04:
394 pary zasad (kontrola endogenna)
280 pary zasad (zdarzenie elitarne MS-BN1) 215 pary zasad (zdarzenie elitarne RF-BN1)
5.2.5. Warunki PCR.
Mieszanina reakcyjna dla PCR o objętości 50 μl zawiera:
il matrycy DNA il 10x stężonego buforu dla amplifikacji (dostarczony z Taq polimerazą) μί 10 mM dNTP-ów μ BNA01 (MS-BN1) lub BNA03 (RF-BN1) (10 ρη^ί/μ!) μ BNA02 (RF-BN1) lub BNA04 (RF-BN1) (10 pmoίi/μί)
0,5 μ BNA05 (10 pmoίi/μί)
0,5 μ BNA06 (10 pmoίi/μί)
0,2 il Taq DNA polimerazy (5 jednostek/il) woda do 50 il.
Dla uzyskania optymalnych wyników profile cykli temperaturowych będą jak następuje:
min w 95°C następnie: 1 min w 95°C min w 57°C min w 72°C przez 5 cykli następnie 30 sek. w 92°C sek. w 57°C 1 min w 72°C przez 22 do 25 cykli następnie 5 minut w 72°C.
5.2.6. Analizy w żelu agarozowym.
Od 10 do 20 il próbki otrzymanej przez PCR powinno być naniesione na 1,5% żel agarozowy (bufor Tris-boran) z molekularnym znacznikiem o odpowiedniej wielkości (np. 100 bp Ladder, PHARMACIA).
PL 205 071 B1
5.2.7. Ocena wyników.
Dane uzyskane dla jednej próbki rośliny transgenicznej, jednej reakcji PCR przeprowadzonej przy użyciu jednej mieszaniny dla PCR nie powinny być zaakceptowane chyba że 1) kontrola pozytywna ujawni oczekiwane produkty PCR (transgeniczny i endogenny fragment), 2) negatywna kontrola DNA jest negatywna dla amplifikacji PCR (brak fragmentów) i 3) kontrola z DNA typu dzikiego daje oczekiwany wynik (amplifikacja endogennych fragmentów).
Ścieżki ujawniające obserwowalne ilości transgenicznych i endogennych produktów PCR o oczekiwanej wielkości, wykazują, że odpowiednia roślina z której została przygotowana matryca genomowego DNA, odziedziczyła elitarne zdarzenie MS-BN1 i/lub RF-BN1. Ścieżki nieujawniające obserwowalnych ilości transgenicznych i endogennych produktów PCR, wykazują, że odpowiednia roślina z której przygotowano genomowy DNA nie zawiera elitarnego zdarzenia. Ścieżki nieujawniające obserwowalnych ilości endogennych i transgenicznych produktów, wykazują, że jakość i/lub ilość genomowego DNA nie pozwala na wytworzenie produktu PCR. Takie rośliny nie mogą być oceniane. Przygotowanie genomowego DNA powinno być powtórzone i przeprowadzona nowa reakcja PCR, z odpowiednimi kontrolami.
5.2.8. Zastosowanie protokołu dyskryminującego PCR dla identyfikacji MS-BN1 i RF-BN1.
Liście WOSR pochodzące zarówno z roślin zawierających MS-BN1, RF-BN1 lub inne zdarzenie transgeniczne testowano według opisanego powyżej protokołu. Jako kontrole negatywne użyto próbki pobrane z WOSR typu dzikiego.
Wyniki analizy PCR przedstawiono na Fig. 4 i 5.
Fig. 4 ilustruje wynik uzyskany zgodnie z protokołem identyfikacji przez PCR zdarzenia elitarnego dla MS-BN1 przeprowadzonego dla dwóch próbek WOSR (ścieżka 1 i 2). Ścieżka 1 jest rozpoznana jako zawierająca zdarzenie elitarne na podstawie wykrycia pasma o wielkości 280 par zasad, podczas gdy próbka 2 nie zawiera MS-BN1.
Fig. 5 ilustruje wynik uzyskany zgodnie z protokołem identyfikacji przez PCR zdarzenia elitarnego dla RF-BN1 przeprowadzonego dla dwóch próbek WOSR (ścieżka 1 i 2).
Ścieżka 1 jest rozpoznana jako zawierająca zdarzenie elitarne na podstawie wykrycia pasma o wielkości 215 par zasad, podczas gdy próbka 2 nie zawiera RF-BN1.
P r z y k ł a d 6: Wytwarzanie hybrydowych nasion w WOSR przy pomocy MS-BN1 i RF-BN1.
Rośliny WOSR zawierające MS-BN1, które były męsko sterylne, skrzyżowano z roślinami WOSR homozygotycznymi pod względem RF-BN1. Hybrydowe nasiona zebrane z MS-BN1 złożono w ATCC pod numerem dostępu ATCC PTA-730.
Nasiona hybrydowe wysiewano w polu. Stwierdzono, że rośliny są w 100% płodne i ujawniają optymalne właściwości agronomiczne. Hybrydowe rośliny zawierały zarówno MS-BN1 i RF-BN1 lub samo zdarzenie RF-BN1.
P r z y k ł a d 7: Wprowadzenie MS-BN1 i RF-BN1 do korzystnych odmian hodowlanych WOSR.
Elitarne zdarzenia MS-BN1 i RF-BN1 wprowadzono, do szeregu ważnych dla upraw odmian hodowlanych WOSR, przez powtarzalne krzyżówki wsteczne roślin zawierających odpowiednio zdarzenie MS-BN1 lub RF-BN1.
Zaobserwowano, że wprowadzenie zdarzeń elitarnych do tych odmian uprawnych nie wpływa znacząco na żadną z pożądanych cech fenotypowych lub właściwości agronomicznych tych odmian uprawnych, zależnych od ekspresji transgenu, co określono na podstawie tolerancji na glufosinat przyjmującej komercyjnie akceptowalne poziomy. Potwierdza to status zdarzenia MS-BN1 i RF-BN1 jako zdarzeń elitarnych.
Jak stosowano w zastrzeżeniach, z wyjątkiem sytuacji gdzie jasno określono inne znaczenie, termin „roślina jest zamierzony aby obejmował tkanki roślinne w różnym stadium dojrzałości jak również jakiekolwiek komórki, tkanki lub organy pobrane z, lub pochodzące od jakiejkolwiek takiej rośliny, obejmując bez ograniczeń jakiekolwiek nasiona, liście, łodygi, kwiaty, korzenie, pojedyncze komórki, gamety, hodowle komórek, hodowle tkankowe lub protoplasty.
Nasiona zawierające elitarne zdarzenia MS-BN1 i elitarne zdarzenie RF-BN1 lub samo elitarne zdarzenie RF-BN1 złożono w American Tissue Culture Collection pod numerem dostępu: PTA-730.
PL 205 071 B1
Lista sekwencji <110> AVENTIS CROPSCIENCB N.V.
<120> Hybryd OBl„y rzepak oleisty i spoBoby Jeso ^twaraanla <130» EE-BN1 <140» <141» <160» 43 ' <170» Patentin Ver. 2.0 <210» 1 .
<211» 4946 <212» DNA <213» Sztuczna sekwencja <220» <223» Opis Sztucznej sekwencji: Γ-DNA z plazmidu pTHW107 <220» <221» cecha złożona <222» (964)..(4906) <223» fragment Hind III <400» 1 aatfcacaacg gtatatatcc tgecagtact cggccgtcga actcggc-cgt cgagtacatg 60 gtegataaga aaaggcaatt tgtagatgtt aattcccatc ttgaaagaaa tatagtttaa 120 atatttattg ataaaataac aagteaggta ttatagtcca agcaaaaaca taaatttatt 180gatgcaagtt taaattcaga aatatttcaa taaetgatta tatcagctgg tacattgccg 240 tagatgaaag actgagtgcg atattatgtg taatacataa attgatgata tagctagctt 300 agcteatcgg gggatcctag acgcgtgaga tcagatctcg gtgacgggca ggaccggacg 360 gggcggtacc ggcaggctga agtecagctg ccagaaaccc acgfecatgcc agttcccgtg 420 cttgaagceg gccgcccgca gcatgccgcg gggggcatat ccgagcgcct cgtgcatgcg 480 cacgctcggg tpgttgggca gcccgatgac agcgaccacg ctcttgaagc cctgtgcctc 540 cagggacttc agcaggtggg tgtagagcgt ggagcccagt cccgtccgct ggtggcgggg 600 ggagacgtac acggtcgact cggccgtcca gtcgtaggcg ttgcgtgcct tccaggggcc 660 cgcgtaggcg atgccggcga cctcgccgtc caectcggcg aegagccagg gatagcgctc 720 ccgcagacgg acgaggtcgt ccgtccactc ctgcggttcc tgcggctcgg tacggaagtt 780 gaccgtgctt gtetcgatgt agtggttgac gatggtgcag accgccggca tgtccgcctc 840 ggtggcacgg cggatgtcgg ccgggcgtcg ttctgggtcc attgttcttc tttactcttt 900 gtgtgactga ggtttggtct agtgctttgg tcatctatat ataatgataa caacaatgag 960 aacaagcttt ggagfcgatcg gagggtctag gatacatgag attcaagtgg actaggatct 1020
PL 205 071 B1 acaccgttgg attttgagtg tggatatgtg aaggcctaag gaga'ggtgtt gagaccctta ggaagataat tccatgaatc ttatcgttat gtgcttgctc attttacttg cctggtggac ttacttacta tagagctttc ataccttttt tatgattcat gaataaaaat gggaaatttt ggtgaaactg tggaatatat atttttttca ttataaatat agaaaaatat ataacattca acagaactat gtttaatgtg taaagattag tacaacaagt cataagccca acaaagttag aatattacaa atcataagcc caacaaagtt gctaaacaaa gtccaaaaaa aacttctcaa ctatacacaa aacaagtcag ataaatctct cacttcccta tcggattgaa tgttttactt tatgtttgtg aaaactaata gggttaacaa gattttccga gagctttcta gtagaaagcc caccaattag gtttcttatt atgtgccaaa gaaaacgtat gaatgttatt agtaaatggt gatattcaac tttaaaaatt cgatcagtgt atatatataa tgctttacaa cacttggatt atatttgttt tggccatgca ccaactcatt atatgtgttc gtgtatattt gtataagaat atatatatat atatattata tatcatgcac tagtgcattt tttctaacaa ccatatatgt taatgaaaaa tataatctat tgctgaaatt attctttcaa attttagcta aaagtcttgt cacggaaaaa aaacacataa taaatttgaa ggtacccggg gatcttcccg atctagtaac tagtttgcgc gctatatttt gttttctatc atcataaaaa cccatctcat aaataaogtc acgtaattca acagaaatta tatgataatc aagaaacttt attgccaaat gtttgaacga gaaattgacc gatcagagtt tgaagaaaaa aaacggcctc cgcaggaagc cgtttttttc ggtccgttgt tttgtaaatc agccagtcgc agcctgatgt atagttaata tccgcttcac tgccttccct gtttgagaag atgtctccgc ggttcccttt tgatgccacc cagccgaggg caggtagctt atgatatgtc tgaagataat gtaccatggt agctaatttc tttaagtaaa ttacacttgc accacaaggg catatataga taacttttgt tggagcattt cgaggaaaat ttaaggtttc atgtattaat ttgttgcaaa aattttgtct caccctgatt tcagttatgg atgtttattc tagtccagcc acccacctta ctgatttaat ttacattgct aaatgtgcat aggatgtata tattagtaca taaaaaatca tcaattgtcc cttcttgttt ggcactatat tgaggttaat tttacttggt aacggccaca 1080 tcggcttgaa ccgctggaat aatgccacgt 1140 ctatgagtga aattgtgtga tggtggagtg 1200 ttggcccttt ccttatgggg aatttatatt 1260 tttaccttgg atttagttaa tatataatgg 1320 tgaatttgta ctgctaaatg cataagatta 1380 tttaaaagca aaatttgcct tttactagaa 1440 aataaaaatg aaaataagaa ctttcaaaaa 1500 tcgcacatca agtcatctgt tacaatatgt 1560 cacgtctaaa taaactaaag agtccacgaa 1620 attgatcaaa aaaaaaaaac gcccaacaaa 1680 gtctccatct tcctttatga acattgaaaa 1740 ttctgggcct gtcttcccaa cctcctacat 1800 gtaccttttc cgttgcaatg atattgatag 1860 tcgaagtcat ggaatatgga tttggtccaa 1920 catcaccaga aatttactag taaaataaat 1980 ttcaatataa ttatagagga tatttcaaat 2040 caggtaagac attaaaaaaa tcctacgtca 2100 ggaattgtac aaaaatttgg gatctactat 2160 tttttttgga ggctggaatt tttaatctac 2220 gtttagtgta atactttgat tttgtcaaat 2280 ttctttgacc atatacacac acacatatat 2340 ttttaattga aaaaataata tatatatata 2400 tgcgattgat ctgcaaaaat actgctagag 2460 atctcagatg ttaagatttt cttaaagtaa 2520 aataactaaa gaataataca caatctcgac 2580 tttcgaccgc ggtacccgga attcgagctc 2640 atagatgaca ccgcgcgcga taatttatcc 2700 gcgtattaaa tgtataattg cgggactcta 2760 atgcattaca tgttaattat tacatgctta 2820 atcgcaagac cggcaacagg attcaatctt 2880 tctgcttcgg atcctctaga gccggaaagt 2940 tttattacac actttatgta aagctgaaaa 3000 gttatctgat ttttgtaaag gtctgataat 3060 ttgagtaaag aatccggtct gaatttctga 3120 gccatgttcg tccgcttttg cccgggagtt 3180 cgatgctttt ccccggagcg acgtctgcaa 3240 cttgtgcttc tgattttgta atgtaattat 3300 ccgcaacccc gtcaaacgtg ttgataaccg 3360 aactttgatt tgagtgatga tgttgtactg 3420 gcacaagaca tacacaacaa cttgcaaaac 3480 ggggagtagc aggctaatct gagggtaaca 3540 catggactta gtgtgaggaa aaagtaccaa 3600 aaattacatt atgaagctgt gctagagaag 3660 tgcaagtctg cttttagctt gattcaaaaa 3720 acttcgagcc tatgtcgctt taattcgagt 3780 tgtttgaatc atctttcata aagtgacaag 3840 tcaatctgtt aatgcaaatt atccagttat 3900
PL 205 071 B1 acttagctag atatccaatt ttgaataaaa atagctcttg attagtaaac cggatagtga 3960 caaagtcaca tatcćatcaa acttctggtg ctcgtggcta agttctgatc gacatggggt 4020 taaaatttaa attgggacac ataaatagcc tattfegtgca aatctcccca tcgaaaatga 4080 cagattgtta catggaaaao aaaaagtcct ctgatagaag tcgćaaagta tcacaatttt 4140 ctatcgagag atagattgaa agaagtgcag ggaagcggtt aactggaaca taacacaatg 4200 tctaaattaa ttgcattcgc taaccasaaa gtgtattact ctctccggtc cacaataagt 4260 tattttttgg cccttttttt atggtccaaa ataagtgagt tttttagatt tcaaaaatga 4320 tttaattatt tttttactac agtgcccttg gagtaaatgg tgttggagta tgtgttagaa 4380 atgtttatgt gaagaaatag taaaggttaa tatgatcaat ttcattgcta tttaatgtta 4440 aaafegtgaat ttcttaatct gtgtgaaaac aaccaaaaaa tcacttattg tggaccggag 4500 aaagtatata aatatatatt tggaagcgac taaaaataaa cttfctctcat attatacgaa 4560 cctaaaaaca gcatatggta gtttctaggg aatctaaatc actaaaatta ataaaagaag 4620 caacaagtat caatacatat gatttacacc gtcaaacacg aaattcgtaa atatttaata 4680 taataaagaa ttaatccaaa tagcctccca ccctataact taaactaaaa ataaccagcg 4740 aatgtatatt atatgcataa tttatatatt aaatgtgtat aatcatgtat aatcaatgta 4800 taatctatgt atatggttag aaaaagtaaa caattaatat agccggctat ttgtgtaaaa 4860 atccctaata taatcgcgac ggatccccgg gaattceggg gaagcttaga tccatggagc 4920 catttacaat tgaatatatc ctgccg 4946 <210> 2 <211> 4832 <212 > DBA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Opis sztucznej sekwencji; T-DNA plazmidu pTHWllS <220>
<221> cecha złożona <222> (1883).-(4065) <223> fragment restrykcyjny Upal <4 00> 2 aattacaacg gtatatatcc tgccagtact cggccgtcga actcggccgt cgagtacatg 60 gtcgataaga aaaggcaatt tgtagatgtt aatteccatc ttgaaagaaa tatagtttaa 120 atatttattg ataaaataac aagtcaggta ttatagtcca agcaaaaaca taaatttatt 180 gatgcaagtt taaattcaga aatatttcaa taactgatta tatcagctgg tacattgccg 240 tagatgaaag actgagtgcg atattatgtg taatacataa attgatgata tagctagctt 300 agctcatcgg gggatcctag acgcgtgaga tcagatctcg gtgacgggca ggaccggacg 360 gggcggtacc ggcaggctga agtccagctg ccagaaaccc acgtcatgcc agtteccgtg 420 cttgaagccg gccgcccgca gcatgccgcg gggggcatat ccgagcgcct cgtgcatgcg 480 cacgctcggg tcgttgggca gcecgatgac agcgaccacg ctcttgaagc cctgtgcctc 540 cagggacttc ageaggtggg tgtagagegt ggagcccagt cccgtccgct ggtggcgggg 600 ggagacgtac acggtcgaet cggccgtcca gtcgtaggcg ttgcgtgcct tccaggggcc 660 cgcgtaggcg atgccggcga cctcgccgtc cacctcggcg acgagccagg gatagcgctc 720 ccgcagacgg acgaggtcgt ccgtccactc ctgcggttcc tgeggctcgg tacggaagtt 780 gaccgtgctt gtctcgatgt agtggctgac gatggtgcag accgccggca tgtccgcetc 840
PL 205 071 B1 ggtggcacgg cggatgtcgg ccgggcgtcg ttctgggtcc attgttcttc tttactcttt 900 gtgtgactga ggtttggtct agtgctttgg tcatctatat ataatgataa caacaatgag 960 aacaagcttt ggagtgatcg gagggtctag gatacatgag attcaagtgg actaggatct 1020 acaccgttgg attttgagtg tggatatgtg aaggcctaag gagaggtgtt gagaccctta ggaagataat tccatgaatc ttatcgttat gtgcttgctc attttacttg cctggtggac ttacttacta tagagctttc ataccttttt tatgattcat gaataaaaat gggaaatttt ggtgaaactg tggaatatat atttttttca ttataaatat agaaaaatat ataacattca acagaactat gtttaatgtg taaagattag tacaacaagt cataagccca acaaagttag aatattacaa atcataagcc caacaaagtt gctaaacaaa gtccaaaaaa aacttctcaa ctatacacaa aacaagtcag ataaatctct cacttcccta tcggattgaa tgttttactt tatgtttgtg aaaactaata gggttaacaa gattttccga gagctttcta gtagaaagcc caccaattag gtttcttatt atgtgccaaa gaaaacgtat gaatgttatt agtaaatggt gatattcaac tttaaaaatt cgateagtgt atatatataa tgctttacaa cacttggatt atatttgttt tggccatgca ccaactcatt atatgtgttc gtgtatattt gtataagaat atatatatat atatattata tateatgcac tagtgcattt tttctaacaa ccatatatgt taatgaaaaa tataatctat tgctgaaatt attctttcaa attttagcta aaagtcttgt cacggaaaaa aaacacataa taaatttgaa ggtacccggg gatcttcccg atctagtaac tagtttgcgc gctatatttt gttttctatc atcataaaaa cccatctcat aaataacgtc acgtaattca acagaaatta tatgataatc aagaaacttt attgccaaat gtttgaacga gggtttgtgt ttccatattg ttcatctccc tgtcgcagcc ttccgctttc gcttcacgga cagtcagctg cttgctttgt tcaaactgcc atccggtcag acaatcccat aaagcgtcca gctccttttt caatgtctgg tggaggtcgc ctgctttttt catcggtagc taatttcttt tgtactgtta cacttgcacc acaagggcat gcaaaactaa cttttgttgg agcatttcga ggtaacatta aggtttcatg tattaatttg gtaccaaaat fcttgtctcac cctgatttca agagaagatg tttattctag tccagccacc tcaaaaactg atttaattta cattgctaaa ttcgagtagg atgtatatat tagtacataa tgaggttaat tttacttggt aacggccaca 1000 tcggcttgaa ccgctggaat aatgccacgt 1140 ctatgagtga aattgtgtga tggtggagtg 1200 ttggcccttt ccttatgggg aatttatatt 1260 tttaccttgg atttagttaa tatataatgg 1320 tgaatttgta ctgctaaatg cataagatta 1380 tttaaaagca aaatttgcct tttactagaa 1440 aataaaaatg aaaataagaa ctttcaaaaa 1500 tcgcacatca agtcatctgt tacaatatgt 1560 cacgtctaaa taaactaaag agtccacgaa 1620 attgatcaaa aaaaaaaaac gcccaacaaa 1680 gtctccatct tcctttatga acattgaaaa 1740 ttctgggcct gtcttcccaa cctcctacat 1800 gtaccttttc cgttgcaatg atattgatag 1860 tcgaagtcat ggaatatgga tttggtccaa 1920 catcaccaga aatttactag taaaataaat 1980 ttcaatataa ttatagagga tatttcaaat 2040 caggtaagac attaaaaaaa tcctacgtca 2100 ggaattgtac aaaaatttgg gatctactat 2160 tttttttgga ggctggaatt tttaatctac 2220 gtttagtgta atactttgat tttgtcaaat 2280 ttctttgacc atatacacac acacatatat 2340 ttttaattga aaaaataata tatatatata 2400 tgcgattgat ctgcaaaaat actgetagag 2460 atctcagatg ttaagatttt cttaaagtaa 2520 aataactaaa gaataataca caatctcgac 2580 tttcgaccgc ggtacccgga attcgagctc 2640 atagatgaca ccgcgcgcga taatfctatcc 2700 gcgtattaaa tgtataattg cgggactcta 2760 atgcattaca tgttaattat tacatgctta 2820 atcgcaagac cggcaacagg attoaatctt 2880 tctgcttcgg atcctctaga ccaagcttgc 2940 attgatcgta tjtaagaaagt atgatggtga 3000 aaacctgaag cacactctcg gcgccatttt 3060 tccattccaa aacgagcggg tactccaccc 3120 ggttttcacc gtagtattcc ggaagggcaa 3180 tgatacttct gatttgttcc ccgttaatga 3240 aagtaaaaac tttgatttga gtgatgatgt 3300 atatagagca caagacatac acaacaactt 3360 ggaaaatggg gagtagcagg ctaatctgag 3420 ttgcaaacat ggacttagtg tgaggaaaaa 3480 gttatggaaa ttacattatg aagctgtgct 3540 caccttatgc aagtctgctt ttagcttgat 3600 tgtgcatact tcgagcctat gtcgctttaa 3660 aaaatcatgt ttgaatcatc tttcataaag 3720
PL 205 071 B1 tgacaagtca attgtccctt cttgtttggc cagttatact tagctagata tccaattttg atagtgacaa agtcacatat ccatcaaact atggggttaa aatttaaatt gggacacata aaaatgacag attgttacat ggaaaacaaa caattttcta tcgagagata gattgaaaga cacaatgtct aaattaattg cattcgctaa aataagttat tttttggccc tttttttatg aaaatgattt aattattttt ttactacagt gttagaaatg tttatgtgaa gaaatagtaa aatgttaaaa tgtgaatttc ttaatctgtg ccggagaaag tatataaata tatatttgga tacgaaccta aaaacagcat atggtagttt aagaagcaac aagtatcaat acatatgatt ttaatataat aaagaattaa tccaaatagc ccagcgaatg tatattatat gcataattta aatgtataat ctatgtatat ggttagaaaa gtaaaaatcc ctaatataat cgcgacggat tggagccatt tacaattgaa tatatcctgc <210> 3 <211> 60 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> opis sztucznej sekwencji: starter 248 <400> 3 catgccctga cccaggctaa gtattttaac <21O> 4 <211> 60 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> opis sztucznej sekwencji: starter 249 <400> 4 caatgggact gtcggaggac tgagggccaa <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
actatattca atctgttaat gcaaattatc 3780 aataaaaata gctcttgatt agtaaaccgg 3840 tctggtgctc gtggctaagt tctgatcgac 3900 aatagcctat ttgtgcaaat ctccccatcg 3960 aagtcctctg atagaagtcg caaagtatca 4020 agtgcaggga agcggttaac tggaacataa 4080 ccaaaaagtg tattactctc tccggtccac 4140 gtccaaaata agtgagtttt ttagatttca 4200 gcccttggag taaatggtgt tggagtatgt 4260 aggttaatat gatcaatttc attgctattt 4320 tgaaaacacc aaaaaatcac ttattgtgga 4380 agcgactaaa aataaacttt tctcatatta 4440 ctagggaatc taaatcacta aaattaataa 4500 tacaccgtca aacacgaaat tcgtaaatat 4560 ctcccaccct atkacttaaa ctaaaaataa 4620 tatattaaat gtgtataatc atgtataatc 4680 agtaaacaat taatatagcc ggctatttgt 4740 ccccgggaat tccggggaag cttagatcca 4800 ca 4832 tttaaccact ttgctccgac agtcccattg 60 agcttggctc ttagcctggg tcagggcatg 60
PL 205 071 B1 <223> opis sztucznej sekwencji: starter 247 <4 00> 5 ccgtcaccga gatctgatct cacgcg <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> opis sztucznej sekwencji: starter 250 <400> 6 gcactgaggg ccaaagcttg gctc <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> opis sztucznej sekwencji: starter 251 <400> 7 ggatcccccg atgagctaag ctagc <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> opis sztucznej sekwencji: starter 254 <400> 8 cttagcctgg gtcagggcat g <210> 9 <211> 20 <212> DNA < 213 > sztuczna sekwencja <220>
<223> opis sztucznej sekwencji: starter 258 <400> 9 ctacggcaat gtaccagctg
PL 205 071 B1 <210> 10 <211> 23 <212> DNA ' <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> opis sztucznej sekwencji: starter SP6 <400> 10 taatacgact cactataggg ega <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220> _ <223> opis sztucznej sekwencji: starter T7 <400> 11 tttaggtgac actatagaat ac <210> 12 <211> 21 <212> DNA < 213 > sztuczna sekwencja <220>
<22 3> opis sztucznej sekwencji: starter 201 <400> 12 gcttggacta taatacctga c <210> 13 <211> 953' <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> Opis sztucznej sekwencji: sekwencja obejmująca region flankujący 5' MS-BN1 <220>
<221> cecha złożona <222> (1). - (24) <223> wektor pGEM-T
PL 205 071 B1 <400> 13 .
cccngccgcc atggccgcgg gattęttagc ctgggtcagg gcatgcatgg tgtgatccaa 60 agactttctc ggcccaaata ctaatcatca caagtcatgc atgatctgct cgggatggcc 120 aagaaaaatc gaacccatga caatattcac agttgtaagt tttttaccag tagacaaata 180 ccacttggtt taacatattg taaacttaat atatagaaga tgttectatt cagaaaataa 240 tatatgtata tatataaaat tttattggcg actcgaggat gcacagaaat ataaaatgtt 300 ggtcgcttag accatctcca atgtatttct ctatttttac ctctaaaata aaggagctct 360 ataatagagg tgggttttgc tccaatgtat ttctttaaaa tagagatctc tacatataga 420 gcaaaatata gaggaatgtt atttcttcct ctataaatag aggagaaaat agcaatctct 480 attttagagg caaaaataga gatbsgttgg agtgattttg cctctaaatg ctattataga 540 ggtagaaata gaggtgggtt ggagatgctc ttactatttt catagtaggt gaaaacttga 600 aactagaaag ctttggagtg tacgagtgga aaacctctct ttgtagaaac atacacatgc 660 catttagtta actagttgac atagattttt gagtcagata actttaagaa tatatatgtt 720 tggatgagag tttgacactt tgagccactc gaaggacaaa ttttaaaaac ttgtgggatg 780 ctgtggccat aaacctfegag gacvstttga tcatattcta ttaactacag tacgaatatg 840 attcgacctt tgcaattttc tcttcag/gta ctcggccgtc gaactcggcc gtcgagtaca 900 tggtcgataa gaaaaggcaa tttgtagatg ttaattccca tcttgaaaga aat 953 <210> 14 <211> 16 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<22 3> opis sztucznej sekwencji: starter 611 <400> 14 ngtcgaswgt ntwcaa 16 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> opis sztucznej sekwencji: starter 259 <400> 15 gtgcagggaa gcggttaact gg 22 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> opis sztucznej sekwencji: starter 260
PL 205 071 B1 <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> opis sztucznej sekwencji: starter 48 <400> 20 ggagggtgtt tttggttatc 20 <210> 21 <211> 178 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> θΡ« sztucznej sekwencji: sekwencja zawierająca docelowe miejsce delecji MS-BN1 <400> 21 gacactttga gccactcgaa ggacaaattt taaaaacttg tgggatgctg tggccataaa 60 ccttgaggac gctttgatca tattctatta actacagtac gaatatgatt cgacctttgc 120 aattttctct tgttttctaa ttcatatgga tttgttatga taaccaaaaa caccctcc 178 <210> 22 .
<211> 1198 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> opis sztucznej sekwencji: miejsce insercji MS-BN1 <400> 22 catggtgtga tccaaagact ttctcggccc aaatactaat catcacaagt catgcatgat 60 ctgctcggga tggccaagaa aaatcgaacc catgacaata ttcacagttg taagtttttt 120 accagtagac aaataccact tggtttaaca tattgtaaac ttaatatata gaagatgttc 180 ctattcagaa aataatatat gtatatatat aaaattttat tggcgactcg aggatgcaca 240 gaaatataaa atgttggtcg cttagaccat ctccaatgta tttctctatt tttacctcta 300 aaataaagga gctctataat agaggtgggt tttgctccaa tgtatttctt taaaatagag 360 atctctacat atagagcaaa atatagagga atgttatttc ttcctctata aatagaggag 420 aaaatagcaa tctctatttt agaggcaaaa atagagatbs gttggagtga ttttgcctct 480 aaatgctatt atagaggtag aaatagaggt gggttggaga tgctcttact attttcatag 540 taggtgaaaa cttgaaacta gaaagctttg gagtgtacga gtggaaaacc tctctttgta 600 gaaacataca catgccattt agttaactag ttgacataga tttttgagtc agataacttt 660 aagaatatat atgtttggat gagagtttga cactttgagc cactcgaagg acaaatttta 720 aaaacttgtg ggatgctgtg gccataaacc ttgaggacvs tttgatcata ttctattaac 780 tacagtacga atatgattcg acctttgcaa ttttctcttc aggttttcta attcatatgg 840 atttgttatg ataaccaaaa acaccctcct ttttattata aaggtaggga tagctaatct 900 gttattcggt tttgattaga gatattaatc ccgttttatc aagtacagtt tgatgtattt 960
PL 205 071 B1 ttttgttcgt tttcattaca atccaagaca agttaggttt attacatttt accaaaaaaa 1020 aaggtttggt ttattgtgaa cattgctgcg gtttatttaa atttgattct attcaaaggt 1080 caatccgtat ttaacaagta aactagtctt tatataatct taaatctaac gatctttgat 1140 ttttaaattg catttancta tgtcctctct ggcgtatatg gtctctttga aaacactc 1198 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> °pis sztucznej sekwencji: starter 193 <400> 23 tcatctacgg caatgtacca gc 22 <210> 24 <211> 1077 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> Opis sztucznej sekwencji: sekwencja obejmująca region flankujący 5' RF-BN1 <220>
<221> Cecha złożona <222> (1)..(45) <223> pGEM®-T wektor <22Q>
<221> Cecha złożona <222> (1061)..(1077) <22 3> pGEM®-T wektor <400> 24 gagctctccc atatggtcga cctgcaggcg gccgcactag tgattcttag cctgggtcag 60 ggcatggcat gtctgatggt acatgctaaa tgctatattt cctgtttaaa gtgttaaaat 120 cattttctga tggaactaaa tccagtttta agagtaactg acaagtacaa ttaagcacaa 180 caatataata gtagtaattg gcatctttga ttgttaaata tcaaaacagt aaagttacaa 240 aaaaaaatac caaaccaata atgaagactt ggcggagaca gtgccgtgcg aaggttttcg 300 gaggtccgag acgagttcaa aaatacattt tacataatat atttttcata tatatatata 360 tataacattc aaaagtttga attattacat aaacgttttc taaattttct tcaccaaaat 420 tttataaact aaatttttaa atcatgaaca aaaagtatga atttgtaata taaatacaaa 480 gatacaaatt tttgattgaa atattggtag ctgtcaaaaa agtaaatctt agaatttaaa 540 ttaactatag taaactatat attgaaaata ttataaattt ttatcaaatt ctcataaata 600 tataaaataa atctaactca tagcatataa aaagaagact aatgtggatc aaaatattta 660 cagtttttta gaagtagaat ctttatagtt ttatttaaaa tatagcaaaa atgatcacaa 720
PL 205 071 B1 acctagttay ttaaggagaa gtccaattca aaatcaaata aaaataaaat ctatctaaaa 780 aaatatgtta actaccatgc aaaagtattt tttttgtaat tagaaaccct gaaatttgta 840 caaaacttgg acccctaggt aaatgccttt ttcatctcgc gataagaaaa ggcaatttgt 900 agatgttaat tcccatcttg aaagaaatat agtttaaata tttattgata aaataacaag 960 tcaggtatta tagtccaagc aaaaacataa atttattgat gcaagtttaa attcagaaat 1020 atttcaataa ctgattatat cagctggtac atcgccgtag aatcccgcgc catggcg ' 1077 <210> 25 <211> 16 <212> DNA <2i 3> sztuczna sekwencja <220>
<223> opis sztuczneJ sekwencji: starter 286 <400> 25 ntgcgaswga nawgaa 16 <210> 26 <211> 19 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> opis sztucznej sekwencji: starter 314 <400> 26 gtaggaggtt gggaagacc 19 <210> 27 <211> 25 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> opis sztucznej sekwencji: starter 315 <400> 27 gggctttcta ctagaaagct ctcgg 25 <210> 28 <211> 24 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> opis sztucznej sekwencji: starter 316
PL 205 071 B1 <400> 28 ccgataggga agtgatgtag gagg 24 <210> 29 <211> 21 <212> DNA < 213 > sztuczna sekwencja <220>
<223> opis sztucznej sekwencji: starter 288 <400> 29 atgcagcaag aagcttggag g 21 <210> 30 * <211».....1501 <212> DNA < 213 > sztuczna sekwencja <220>
<?23> . .
Opis sztucznej sekwencji: sekwencja obejmująca region flankujący 3' RF-BN1 <220>
<221> cecha łożona <222> (!)..(16) <223> pGEM®-T wektor <220>
<221> cecha 2łożona <222> (1458)..(1501) <223> pGEM®-T wektor <400> 30 ccatggccgc gggattgtag gaggttggga agacaggccc agaaagagąt ttatctgact 60 cgttttgtgt atagttttca atgttcataa aggaagatgg agacttgaga agtttttttt 120 ggactttgtt tagctttgtt gggcgttttt tttttttgat caataacttt gttgggctta 180 tggtcgataa gcgtgcgcat gtctgatggt acatgctaaa tgctatattt ctgtttaaag 240 tgttaaaatc attttctgat ggaactaaat ccagttttaa gagtaactga caagtacaat 300 taagcacaac aataaaatag tagtaattgg catctttgat tgttaaatat caaaacaata 360 aagttacaaa aaaaaatacc aaaccaataa tgaagacttg gcggagacag tgccgtgcga 420 aggttttcgg aggtccgaga cgagttcaaa aatacatttt acataatata tttttcatat 480 atatatatat atataacatt caaaagtttg aattattaca taaacgtttt ctaaattttc 540 ttcaccaaaa ttttataaac taaaattttt maatcatgaa caaaaagtat gaatttgtaa 600 tataaatacm aagatacaaa tttttgattg aaatattggt agctgtcaaa aaagtaaatc 660 ttagaattta aattaactat agtaaactat atatggaaaa tattataaat ttttatcaaa 720 ttctcataaa tatataaaat aaatctaact catagcatat aaaaagaaga ctaatgtgga 780 tcaaratatt tacagttttt tagaagtaga atctctatag ttttatttaa aatatagcaa 840
PL 205 071 B1 aaatgatcac aaacctagtt actttaacca gaagtccaat tcaaaatcaa ataaaaataa 900 aaatctatct aaaaaaatat gttaactacc atgcaaaagt attttttttt gtaattagaa 960 accctgaaat ttgtacaaaa cttggacccc taggtaaatt ccctagaaag tatcctatta 1020 gcgtcgacaa actgttgctc atatttttct ctccttactt tatatcatac actaatatan 1080 gnagatgatc taattaatta ttcatttcca tgctagctaa ttcaagaaaa agaaaaaaaa 1140 ctattatcta aacttatatt cgagcaacac ctcggagata acaggatata tgtcattaat 1200 gaatgcttga actcatctcg cgaactcatc tcgcatcgct tatagccaca aagatccaac 1260 ccctctcttc aatcatatat cagtagtaca atacaaatag atattgtgag cacatatgcc 1320 gtctagtact gatgtgtaca tgtagaggag ccgcaaatgt ttagtcactc caacaaatga 1380 gcatgaccac gcatcttctg atgatgtaca gccgtccctt ttgctctctc aaatatcctc 1440 caagcttctt gctgcataaa tcactagtgc ggccgcctgc aggtcgacca tatgggagag 1500 c 1501 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> °pis sztucznej sekwencji: starter 269 <400> 31 ggttttcgga ggtccgagac g 21 <210> 32 <211> 21 <212> nMa <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> opis sztuczneJ sekwencji: starter 283 <400> 32 cttggacccc taggtaaatg c <210> 33 <211> 22 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> °Pis sztuczneJ sekwencji: starter 284 <400> 33 gtacaaaact tggaccccta gg 22 <210> 34 <211> 1068
PL 205 071 B1 <212> DNA < 213 > sztuczna sekwencja <220>
<223> opis sztucznej sekwencji: sekwencja zawierająca docelowe miejsce delecji RF-BN1 <400> 34 cgcgttggga gctctcccat atggtcgacc tgcaggcggc cgcactagtg attcttggac 60 ccctaggtaa atgccttttt caaaagcctc taagcacggt tctgggcggg gagtcagcga 120 gaaaaaaaga tatttcccta gaaagtatcc tattagcgtc gacaaactgt tgctcatatt 180 tttctctcct tactttatat catacactaa tataaaaaga tgatctaatt aattattcat 240 ttccatgcta gctaattcaa gaaaaagaaa aaaactatta tctaaactta tattcgagca 300 acacctcgga gataacagga tatatgttat taatgaatgc ttgaactcat ctcgcgaact 360 catctcgcat cgcttatagc cacaaagatc caacccctct cttcaatcat atatcagtag 420 tacaatacaa atagatattg tgagcacata tgccgtctag tactgatgtg tatatgtaga 480 gganngcaaa tgtttagtca ctccaacaaa tgagcatgac nacgcatctt ctgatgatgt 540 acagccgtcc cttttgctct ctcaaatatc ctccaagctt cttgctgcat ggaatcttct 600 tcttggtgtc tttcatgata acaaaatcta acgagagaga aacccttagt caagaaaaaa 660 caaataaaac tctaacgaga gtgtgtgaga aagtagagag tatgtgtgag tgacggagag 720 aaagtgagac cataaagatg ttgtgcaaag agagcaagac ttaacctata tatactcaca 780 tacacgtaca catcataccc attanagata ataaaaagga aaaaggaaca actaacaagg 840 gaactgtatc ccatacttta tctcatcata catgatgcat aatatattct ttcgtatatc 900 aagaaaaatg agcctgatat ttttttattt cgaaactaaa agagtgtcta tttctctctc 960 ttagagatag tgccatgtca aatttctaag aagtagcaag atttacaaag gaatctaaag 1020 caaccccacg cgcattgtgt tcatttctct cgaccatccc gcggccat 1068 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> opis sztucznej sekwencji: starter 57 <400> 35 gcatgatctg ctcgggatgg c 21 <210> 36 <211> 909 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> °pis sztucznej sekwencji: sekwencja obejmująca region flankujący 5' MS-BN1 w WOSR
PL 205 071 B1 <400> 36 tgcatgatct gctcgggatg gccaagaaaa atcgaaccca tgacaatatt cacagttgta 60 agttttttac cagtagacaa ataccacttg gtttaacata ttgtaaactt aatatataga 120 agatgttcct attcagaaaa taatatatgt atatatataa aattttattg gcgactcgag 180 gatgeacaga aatataaaat gttggtcgct tagaccatct ccaatgtatt tctctatttt 240 tacctctaaa ataaaggaac tctataatag aggtgggttt tactccaatg tatttcttta 300 aaatagagat ctctacatat agagcaaaat atagaggaat gttatttctt cctctataaa 360 tagaggagaa aatagcaatc tctattttag aggcaaaaat agagatgggt tggagtgatt 420 ttgcctctaa atgctattat agaggtagaa atagaggtgg gttggagatg ctcttactat 480 tttcatagta ggtgaaaact tgaaactaga aagctttgga gtgtacgagt ggaaaacctc 540 tctttgtaga aacatacaca tgccatttag ttaactagtt gacatagatt tttgagtcag 600 ataactttaa gaatatatat gtttggatga gagtttgaca ctttgagcca ctcgaaggac 660 aaattttaaa aacttgtggg atgctgtggc ccataaacct tgaggacgct ttgatcatat 720 tctattaact acagtacgaa tatgattcga cctttgcaat tttctcttca gtactcggcc 780 gtcgaactcg gccgtcgagt acatggtcga taagaaaagg caatttgtag atgttaattc 840 ccatcttgaa agaaatatag tttaaatatt tattggataa aataacaagt caggtattat 900 agtccaagc 909 <210> 37 <211> 20 <212> DNA < 213 > sztuczna sekwencja <220>
<22 3> opis sztucznej sekwencji: starter 68 <400> 37 ccatatacgc cagagaggac 20 <210> 38 ' <211> 522 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> Opis sztucznej sekwencji: sekwencja obejmująca region flankujący 3' MS-BN1 w WOSR <400> 38 gcgaatgtat attatatgca taatttatat attaaatgtg tataatcatg tataatcaat 60 gtataatcta tgtatatggt tagaaaaagt aaacaattaa tatagccggc tatttgtgta 120 aaaatcccta atataatcga cggatccccg ggaattccgg gggaagctta gatccatgga 180 tttgttatga taaccaaaaa caccctcctt tttattataa aggtagggat agctaatctg 240 ttattcggtt ttgattagag atattaatcc cgttttatca agtacagttt gatgtatttt 300 tttgttcgtt ttcattacaa tccaagacaa gttaggttta ttacatttta ccaaaaaaaa 360 aggtttggtt tattgtgaac attgctgcgg ttttatttaa atttgattct attcaaaggt 420 caatccgtat ttaacaagta aactagtctt tatataatct taaatctaac gatacttgga 480
PL 205 071 B1 tttttaaatt gcatttagct atgtcctctc tggcgtatat gg 522 <210> 39 <211> 694 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220 <223> opis sztucznej sekwencji: sekwencja obejmująca region flankujący 5' RF-BN1 w WOSR <400> 39 ggttttcgga ggtccgagac gagttcaaaa atacatttta cataatatat ttttcatata 60 tatatatata tataacattc aaaagtttga attattacat aaacgttttc taaattttct 120 tcaccaaaat tttataaact aaaattttta aatcatgaac aaaaagtatg aatttgtaat 180 ataaatacaa agatacaaat ttttgattga aatattggta gctgtcaaaa aagtaaatct 240 tagaatttaa attaactata gtaaactata tattgaaaat attataaatt tttatcaaat 300 tctcataaat atataaaata aatctaactc atagcatata aaaagaagac taatgtggat 360 caaaatattt acagtttttt agaagtagaa tctttatagt tttatttaaa atatagcaaa 420 aatgatcaca aacctagtta ctttaaccag aagtccaatt caaaatcaaa taaaaataaa 480 aatctatcta aaaaaatatg ttaactacca tgcaaaagta tttttttttg taattagaaa 540 ccctgaaatt tgtacaaaac ttggacccct aggtaaatgc ctttttcatc tcgcgataag 600 aaaaggcaat ttgtagatgt taattcccat cttgaaagaa atatagttta aatatttatt 660 gataaaataa caagtcaggt attatagtcc aagc 694 <210> 40 <211> 1279 <212> nM& <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> °Pis sztucznej sekwencji: sekwencja obejmująca region flankujący 3' RF-BN1 w WOSR <400 40 gggggttttt ttttttgatc aataactttg ttgggcttat ggtcgataag cgtgcgcatg 60 tctgatggta catgctaaat gctatatttc tgtttaaagt gttaaaatca ttttctgatg 120 gaactaaatc cagttttaag agtaactgac aagtacaatt aagcacaaca ataaaatagt 180 agtąattggc atctttgatt gttaaatatc aaacaataaa gttcaaaaaa aaataccaac 240 ccaataatga agacttggcg gagacagtgc cgtgcgaagg ttttcggagg tccgagacga 300 gttcaaaaat acattttaca taatatattt ttcatatata tatatatata taacattcaa 360 aagtttgaat tattacataa acgttttcta aattttcttc accaaaattt tataaactaa 420 aatttttaaa tcatgaacaa aaagtatgaa tttgtaatat aaatacaaag atacaaattt 480 ttgattgaaa tattggtagc tgtcaaaaaa gtaaatctta gaatttaaat taactatagt 540 aaactatata ttgaaaatat tataaatttt tatcaaattc tcataaatat ataaaataaa 600 tctaactcat agcatataaa aagaagacta atgtggatca aaatatttac agttttttag 660
PL 205 071 B1 aagtagaatc tttatagttt tatttaaaat atagcaaaaa tgatcacaaa cctagttact 720 ttaaccagaa gtccaattca aaatcaaata aaaataaaaa tctatctaaa aaaatatgtt 780 aactaccatg caaaagtatt tttttttgta attagaaacc ctgaaatttg tacaaaactt 840 ggacccctag gtaaattccc tagaaagtat cctattagcg tcgacaaact gttgctcata 900 tttttctctc cttactttat atcatacact aatataaaaa gatgatctaa ttaattattc 960 atttccatgc tagctaattc aagaaaaaga aaaaaaactt attatctaaa cttatattcg 1020 agcaacacct cggagataac aggatatatg tcattaatga atgcttgaac tcatctcgcg 1080 aactcatctc gcatcgctta tagccacaaa gatccaaccc ctctcttcaa tcatatatca 1140 gtagtacaat acaaatagat attgtgagca catatgccgt ctagtactga tgtgtatatg 1200 tagaggagcc gcaaatgttt agtcactcca acaaatgagc atgaccacgc atcttctgat 1260 gatgtacagc cgtcccttt 1279 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> opis sztucznej sekwencji: starter 268 (BNA04) <400> 41 tggaccccta ggtaaatgcc 20 <210> 42 <211> 22 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<22 3> opis sztucznej sekwencji: starter BNA05 <400 42 aacgagtgtc agctagacca gc 22 <210 43 <211> 22 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> opis sztucznej sekwencji: starter BNA06 <400 43 cgcagttctg tgaacatcga cc 22
Claims (39)
- Zastrzeżenia patentowe1. Roś lina ozimego rzepaku oleistego, znamienna tym, ż e obejmuje elitarne wydarzenie RF-BN1, które charakteryzuje się tym, że genomowy DNA może być zastosowany do amplifikacji fragmentu DNA o długości pomiędzy 195 a 235 par zasad w reakcji łańcuchowej polimerazy z dwoma starterami o sekwencji nukleotydowej z SEK NR ID: 23 i SEK NR ID: 41 odpowiednio, przy czym roślinę można uzyskać z nasion zdeponowanych zgodnie z ATCC pod numerem dostępu PTA-730.
- 2. Roś lina wedł ug zastrz. 1, znamienna tym, ż e genomowy DNA moż e być uż yty do amplifikacji fragmentu DNA o długości około 215 par zasad w reakcji łańcuchowej polimerazy z dwoma starterami o sekwencji nukleotydowej z SEK NR ID: 23 i SEK NR ID: 41 odpowiednio.
- 3. Roś lina według zastrz. 1, znamienna tym, ż e ponadto obejmuje elitarne wydarzenie MS-BN1, które charakteryzuje się tym, że genomowy DNA może być zastosowany do amplifikacji fragmentu DNA o długości pomiędzy 260 a 300 par zasad w reakcji łańcuchowej polimerazy z dwoma starterami o sekwencji nukleotydowej z SEK NR ID: 12 i SEK NR ID: 19 odpowiednio.
- 4. Roś lina według zastrz. 3, znamienna tym, że genomowy DNA może być zastosowany do amplifikacji fragmentu DNA o długości około 280 par zasad w reakcji łańcuchowej polimerazy z dwoma starterami o sekwencji nukleotydowej z SEK NR ID: 12 i SEK NR ID: 19 odpowiednio.
- 5. Roślina według zastrz. 1 do 4, znamienna tym, że może być otrzymana przez skrzyżowanie rośliny z rośliną ozimego rzepaku oleistego uzyskaną z nasion złożonych w ATCC pod numerem dostępu PTA-730.
- 6. Roś lina wedł ug jednego z zastrz. 1 do 5, znamienna tym, ż e jest roś liną hybrydow ą .
- 7. Roś lina ozimego rzepaku oleistego, znamienna tym, ż e obejmuje elitarne wydarzenie MS-BN1, które charakteryzuje się tym, że genomowy DNA może być zastosowany do amplifikacji fragmentu DNA o długości pomiędzy 260 a 300 par zasad w reakcji łańcuchowej polimerazy z dwoma starterami o sekwencji nukleotydowej z SEK NR ID: 12 i SEK NR ID: 19 odpowiednio, przy czym roślinę można uzyskać z nasion zdeponowanych zgodnie z ATCC pod numerem dostępu PTA-730.
- 8. Roś lina według zastrz. 7, znamienna tym, ż e genomowy DNA moż e być zastosowany do amplifikacji fragmentu DNA o długości około 280 par zasad w reakcji łańcuchowej polimerazy z dwoma starterami o sekwencji nukleotydowej z SEK NR ID: 12 i SEK NR ID: 19, odpowiednio.
- 9. Nasiono ozimego rzepaku oleistego, znamienne tym, ż e obejmuje elitarne wydarzenie RFBN1, które charakteryzuje się tym, że genomowy DNA może być zastosowany do amplifikacji fragmentu DNA o długości pomiędzy 195 a 235 par zasad w reakcji łańcuchowej polimerazy z dwoma starterami o sekwencji nukleotydowej z SEK NR ID: 23 i SEK NR ID: 41 odpowiednio, przy czym nasiono można uzyskać z nasion zdeponowanych zgodnie w ATCC pod numerem dostępu PTA-730.
- 10. Nasiono według zastrz. 9, znamienne tym, że ponadto obejmuje elitarne wydarzenie MSBN1, które charakteryzuje się tym, że genomowy DNA może być zastosowany do amplifikacji fragmentu DNA o długości pomiędzy 260 a 300 par zasad w reakcji łańcuchowej polimerazy z dwoma starterami o sekwencji nukleotydowej z SEK NR ID: 12 i SEK NR ID: 19 odpowiednio.
- 11. Nasiono według zastrz. 9 albo 10, znamienne tym, że jest nasionem hybrydowym.
- 12. Nasiono ozimego rzepaku oleistego, znamienne tym, że obejmuje elitarne wydarzenie MSBN1, które charakteryzuje się tym, że genomowy DNA może być zastosowany do amplifikacji fragmentu DNA o długości pomiędzy 260 a 300 par zasad w reakcji łańcuchowej polimerazy z dwoma starterami o sekwencji nukleotydowej z SEK NR ID: 12 i SEK NR ID: 19 odpowiednio, przy czym nasiono można uzyskać z nasion zdeponowanych zgodnie z ATCC pod numerem dostępu PTA-730.
- 13. Nasiono według zastrz. 12, znamienne tym, że jest nasionem hybrydowym.
- 14. Sposób wytwarzania nasion hybrydowych, znamienny tym, że obejmuje etapya) identyfikowania transgenicznej, sterylnej względem gamet męskich rośliny ozimego rzepaku oleistego, obejmującego elitarne wydarzenie MS-BN1, które charakteryzuje się tym, że genomowy DNA może być zastosowany do amplifikacji fragmentu DNA o długości pomiędzy 260 a 300 par zasad w reakcji łańcuchowej polimerazy z dwoma starterami o sekwencji nukleotydowej z SEK NR ID: 12 i SEK NR ID: 19 odpowiednio, przy czym transgeniczną sterylną względem gamet męskich roślinę ozimego rzepaku oleistego można uzyskać z nasion zdeponowanych zgodnie z ATCC pod numerem dostępu PTA-730,b) krzyżowania transgenicznej sterylnej względem gamet męskich rośliny ozimego rzepaku oleistego zidentyfikowanej w etapie a) z rośliną ozimego rzepaku oleistego odtwarzającą płodność, zawierającą stabilnie wbudowany do genomu gen odtwarzający płodność obejmujący:PL 205 071 B1DNA kodujący inhibitor rybonukleazy pod kontrolą promotora odpowiedzialnego za ekspresję tego DNA co najmniej w komórkach, w których wyrażany jest gen sterylności względem gamet męskich z elitarnego wydarzenia MS-BN1; ic) zbierania nasion hybrydowych z sterylnych względem gamet męskich roślin ozimego rzepaku oleistego.
- 15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że roślina odtwarzająca płodność obejmuje elitarne wydarzenie RF-BN1 które charakteryzuje tym, że genomowy DNA może być zastosowany do amplifikacji fragmentu DNA o długości około 215 par zasad przy pomocy reakcji łańcuchowej polimerazy i dwóch starterów o sekwencji nukleotydowej z SEK NR ID: 23 i SEK NR ID: 41 odpowiednio, przy czym odtwarzającą płodność roślinę ozimego rzepaku oleistego można uzyskać z nasion zdeponowanych zgodnie z ATCC pod numerem dostępu PTA-730.
- 16. Sposób identyfikacji transgenicznej rośliny albo jej komórek albo tkanek obejmujących elitarne zdarzenie MS-BN1, znamienny tym, że obejmuje ustalenie czy genomowy DNA może być zastosowany do amplifikacji fragmentu DNA o długości pomiędzy 260 a 300 par zasad w reakcji łańcuchowej polimerazy z dwoma starterami o sekwencji nukleotydowej z SEK NR ID: 12 i SEK NR ID: 19 odpowiednio.
- 17. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że obejmuje ustalenie czy genomowy DNA rośliny transgenicznej albo jej komórek albo tkanek może być zastosowany do amplifikacji fragmentu DNA o długości 280 par zasad w reakcji łańcuchowej polimerazy z dwoma starterami o sekwencji nukleotydowej z SEK NR ID: 12 i SEK NR ID: 19 odpowiednio.
- 18. Zestaw do identyfikacji rośliny transgenicznej, jej komórek albo tkanek obejmujących elitarne zdarzenie MS-BN1, znamienny tym, że obejmuje startery do PCR, z których jeden rozpoznaje obce DNA sekwencji MS-BN1 w obrębie sekwencji z SEK NR ID: 1, a drugi rozpoznaje 5' flankujący DNA sekwencji MS-BN1 w obrębie sekwencji z SEK NR ID: 13 albo 3' flankujący DNA sekwencji MS-BN1 w obrębie sekwencji z SEK NR ID: 18, do zastosowania w protokole identyfikacji przez PCR.
- 19. Zestaw według zastrz. 18, znamienny tym, że starter rozpoznający obcy DNA z sekwencji MS-BN1 rozpoznaje obcy DNA sekwencji MS-BN1 w obrębie sekwencji przedstawionej na SEK NR ID: 13 albo SEK NR ID: 18.
- 20. Zestaw według zastrz. 18, znamienny tym, że startery do PCR obejmują sekwencję nukleotydową z SEK NR ID:. 12 i SEK NR ID: 19 odpowiednio.
- 21. Sposób identyfikacji rośliny transgenicznej, jej komórek albo tkanek obejmujących elitarne zdarzenie RF-BN1, znamienny tym, że obejmuje ustalenie czy genomowy DNA może być wykorzystany do amplifikacji fragmentu DNA o długości pomiędzy 195 a 235 par zasad w reakcji łańcuchowej polimerazy z dwoma starterami o sekwencji nukleotydowej z SEK NR ID: 23 i SEK NR ID: 41 odpowiednio.
- 22. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że obejmuje ustalenie czy genomowy DNA transgenicznej rośliny albo jej komórek albo tkanek może być wykorzystany do amplifikacji fragmentu DNA o długości około 215 par zasad w reakcji łańcuchowej polimerazy z dwoma starterami o sekwencji nukleotydowej z SEK NR ID: 23 i SEK NR ID: 41 odpowiednio.
- 23. Zestaw do identyfikacji rośliny transgenicznej, jej komórek albo tkanek obejmujących elitarne zdarzenie RF-BN1, znamienny tym, że obejmuje startery PCR, z których jeden rozpoznaje obcy DNA sekwencji RF-BN1 w obrębie sekwencji z SEK NR ID: 2, a drugi rozpoznaje 5' flankujący DNA sekwencji RF-BN1 w obrębie sekwencji z SEK NR ID: 24 albo 3' flankujący DNA sekwencji RF-BN1 w obrę bie sekwencji z SEK NR ID: 30, do zastosowania w protokole identyfikacji przez PCR.
- 24. Zestaw według zastrz. 23, znamienny tym, że starter rozpoznający obcy DNA z sekwencji RF-BN1 rozpoznaje obcy DNA sekwencji RF-BN1 w obrębie sekwencji przedstawionej na SEK NR ID: 24 albo SEK NR ID: 30.
- 25. Zestaw według zastrz. 23, znamienny tym, że startery do PCR obejmują sekwencję nukleotydową z SEK NR ID: 23 i SEK NR ID: 41, odpowiednio.
- 26. Zestaw do identyfikacji elitarnego zdarzenia MS-BN1 w próbkach biologicznych, znamienny tym, że obejmuje przynajmniej jeden starter dla PCR albo sondę rozpoznające 5' flankujący DNA sekwencji MS-BN1 w obrębie sekwencji przedstawionej na SEK NR ID: 13 albo 3' flankujący DNA sekwencji MS-BN1 w obrębie sekwencji z SEK NR ID: 18.
- 27. Zestaw według zastrz. 26, znamienny tym, że starter dla PCR lub sonda rozpoznaje 5' flankującą sekwencję MS-BN1 obejmującą sekwencję SEK NR ID: 19.PL 205 071 B1
- 28. Zestaw według zastrz. 26 albo 27, znamienny tym, że ponadto obejmuje przynajmniej drugi starter do PCR albo sondę rozpoznającą sekwencję obcego DNA MS-BN1 w obrębie sekwencji przedstawionej na SEK NR ID: 1.
- 29. Zestaw według zastrz. 28, znamienny tym, że drugi starter do PCR lub sonda rozpoznaje obcy DNA sekwencji MS-BN1 w obrębie sekwencji przedstawionej na SEK NR ID: 13 lub na SEK NR ID: 18.
- 30. Zestaw według zastrz. 28, znamienny tym, że drugi starter do PCR lub sonda obejmuje sekwencję SEK NR ID: 12.
- 31. Sposób potwierdzania czystości nasion, znamienny tym, że obejmuje wykrycie w próbkach nasion sekwencji DNA specyficznej dla MS-BN1 przy użyciu specyficznego startera albo sondy specyficznie rozpoznającej 5' flankującą sekwencję MS-BN1 w obrębie sekwencji przedstawionej na SEK NR ID: 13 lub 3' flankującą sekwencję MS-BN1 w obrębie sekwencji przedstawionej na SEK NR ID: 18.
- 32. Sposób przesiewowego badania nasion pod kątem występowania MS-BN1, znamienny tym, że obejmuje wykrycie w próbce z partii nasion sekwencji DNA specyficznej dla MS-BN1 przy użyciu specyficznego startera albo sondy specyficznie rozpoznającej 5' flankującą sekwencję MS-BN1 w obrębie sekwencji przedstawionej na SEK NR ID: 13 lub 3' flankującą sekwencję MS-BN1 w obrębie sekwencji przedstawionej na SEK NR ID: 18.
- 33. Zestaw do identyfikacji zdarzenia elitarnego RF-BN1 w próbkach biologicznych, znamienny tym, że zawiera przynajmniej jeden starter do PCR albo sondę rozpoznającą 5' flankującą sekwencję RF-BN1 w obrębie sekwencji z SEK NR ID: 24 albo 3' flankującą sekwencję RF-BN1 w obrębie sekwencji z SEK NR ID: 30.
- 34. Zestaw według zastrz. 33, znamienny tym, że starter do PCR lub sonda rozpoznaje 5' flankującą sekwencję RF-BN1 zawierającą sekwencję przedstawioną na SEK NR ID: 41.
- 35. Zestaw według zastrz. 33 albo 34, znamienny tym, że ponadto zawiera przynajmniej drugi starter do PCR albo sondę rozpoznającą obce DNA sekwencji RF-BN1 w obrębie sekwencji przedstawionej na SEK NR ID: 2.
- 36. Zestaw według zastrz. 35, znamienny tym, że drugi starter do PCR albo sonda rozpoznaje sekwencję obcego DNA RF-BN1 w obrębie sekwencji przedstawionej na SEK NR ID: 24 albo na SEK NR ID: 30.
- 37. Zestaw według zastrz. 35, znamienny tym, że drugi starter do PCR albo sonda obejmuje sekwencję przedstawioną na SEK NR ID: 23.
- 38. Sposób potwierdzenia czystości nasion, znamienny tym, że obejmuje wykrywanie w próbkach nasion specyficznej dla RF-BN1 sekwencji DNA przy użyciu specyficznego startera albo sondy specyficznie rozpoznającej region flankujący 5' dla RF-BN1 w obrębie sekwencji przedstawionej na SEK NR ID: 24 albo region flankujący 3' dla RF-BN1 w obrębie sekwencji przedstawionej na SEK NR ID: 30.
- 39. Sposób przesiewowego badania nasion pod kątem występowania RF-BN1, znamienny tym, że obejmuje wykrywanie w próbce z partii nasion specyficznej dla RF-BN1 sekwencji DNA, przy użyciu specyficznego startera albo sondy specyficznie rozpoznającej region flankujący 5' dla RF-BN1, w obrębie sekwencji przedstawionej na SEK NR ID: 24 albo region flankujący 3' dla RF-BN1 w obrębie sekwencji przedstawionej na SEK NR ID: 30.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US09/457,037 US6506963B1 (en) | 1999-12-08 | 1999-12-08 | Hybrid winter oilseed rape and methods for producing same |
| PCT/EP2000/012872 WO2001041558A1 (en) | 1999-12-08 | 2000-12-06 | Hybrid winter oilseed rape and methods for producing same |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL356533A1 PL356533A1 (pl) | 2004-06-28 |
| PL205071B1 true PL205071B1 (pl) | 2010-03-31 |
Family
ID=23815191
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL356533A PL205071B1 (pl) | 1999-12-08 | 2000-12-06 | Roślina ozimego rzepaku oleistego, nasiono, sposób wytwarzania nasion hybrydowych, sposób identyfikacji transgenicznej rośliny albo jej komórek albo tkanek, zestaw do identyfikacji rośliny transgenicznej, jej komórek albo tkanek, zestaw do identyfikacji elitarnego zdarzenia MS-BN1 lub RF-BN1 w próbkach biologicznych, sposób potwierdzania czystości nasion, sposób przesiewowego badania nasion pod kątem występowania MS-BN1 i RF-BN1 |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (5) | US6506963B1 (pl) |
| EP (1) | EP1244348B1 (pl) |
| CN (2) | CN1690211B (pl) |
| AT (1) | ATE323404T1 (pl) |
| AU (1) | AU783406B2 (pl) |
| CZ (1) | CZ306357B6 (pl) |
| DE (1) | DE60027469T2 (pl) |
| DK (1) | DK1244348T3 (pl) |
| HK (2) | HK1051295A1 (pl) |
| HU (1) | HU225433B1 (pl) |
| PL (1) | PL205071B1 (pl) |
| UA (1) | UA88861C2 (pl) |
| WO (1) | WO2001041558A1 (pl) |
Families Citing this family (289)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6506963B1 (en) * | 1999-12-08 | 2003-01-14 | Plant Genetic Systems, N.V. | Hybrid winter oilseed rape and methods for producing same |
| CA2525916C (en) * | 2003-05-16 | 2012-01-03 | House Foods Corporation | Quantitative pcr method of detecting specific plant genus in food or food ingredient |
| US8293503B2 (en) | 2003-10-03 | 2012-10-23 | Promega Corporation | Vectors for directional cloning |
| CA2603944C (en) * | 2005-04-08 | 2015-06-23 | Bayer Bioscience N.V. | Elite event a2704-12 comprising the integration of the phosphinothricin acetyltransferase (pat) gene into soybeans, and methods and kits for identifying such event in biological samples |
| CN101278053A (zh) | 2005-07-29 | 2008-10-01 | 孟山都技术有限公司 | 利用来自转基因杂交体的分离子来开发新的种质 |
| BRPI0720219A2 (pt) | 2006-12-08 | 2013-12-24 | Univ Iowa State Res Found Inc | Genes de planta envolvidos em absorção e metabolismo de nitrato |
| EP2016821A1 (en) * | 2007-06-13 | 2009-01-21 | Syngeta Participations AG | New hybrid system for Brassica napus |
| JP2011507506A (ja) | 2007-12-21 | 2011-03-10 | ケイヘーネ・エヌ・ブイ | トリコーム特異的なプロモーター |
| US9051580B2 (en) | 2008-05-08 | 2015-06-09 | Monsanto Do Brasil Ltda. | Genes and methods for increasing disease resistance in plants |
| CN102459615B (zh) | 2009-06-08 | 2017-05-03 | 纽海姆有限公司 | 耐旱植物 |
| MA33933B1 (fr) | 2010-01-22 | 2013-01-02 | Bayer Ip Gmbh | Combinaisons de principes actifs acaricides et/ou insecticides |
| WO2011147968A1 (en) | 2010-05-28 | 2011-12-01 | Nunhems B.V. | Plants with increased fruit size |
| BR112012031323A2 (pt) | 2010-06-09 | 2015-09-08 | Bayer Cropscience Nv | métodos e meios para modificação de genoma vegetal em uma sequência de nucleotídeos comumente usada na engenahria genética de plantas |
| AU2011264074B2 (en) | 2010-06-09 | 2015-01-22 | Bayer Cropscience Nv | Methods and means to modify a plant genome at a nucleotide sequence commonly used in plant genome engineering |
| WO2012065944A1 (en) | 2010-11-15 | 2012-05-24 | Bayer Cropscience Ag | N-aryl pyrazole(thio)carboxamides |
| SG190295A1 (en) | 2010-11-29 | 2013-06-28 | Bayer Ip Gmbh | Alpha,beta-unsaturated imines |
| AU2011334989A1 (en) | 2010-12-01 | 2013-06-13 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Use of fluopyram for controlling nematodes in crops and for increasing yield |
| EP2460407A1 (de) | 2010-12-01 | 2012-06-06 | Bayer CropScience AG | Wirkstoffkombinationen umfassend Pyridylethylbenzamide und weitere Wirkstoffe |
| US20130345058A1 (en) | 2011-03-10 | 2013-12-26 | Wolfram Andersch | Use of lipochito-oligosaccharide compounds for safeguarding seed safety of treated seeds |
| CN103491785A (zh) | 2011-03-23 | 2014-01-01 | 拜耳知识产权有限责任公司 | 活性化合物组合 |
| EP2694494A1 (en) | 2011-04-08 | 2014-02-12 | Bayer Intellectual Property GmbH | Fungicide hydroximoyl-tetrazole derivatives |
| DK2699093T3 (en) | 2011-04-22 | 2016-02-01 | Bayer Ip Gmbh | Combination of active compounds comprising a carboximidderivat and a fungicide compound |
| WO2012165961A1 (en) | 2011-05-31 | 2012-12-06 | Keygene N.V. | Pest resistant plants |
| US9241493B2 (en) | 2011-06-14 | 2016-01-26 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Use of an enaminocarbonyl compound in combination with a biological control agent |
| AU2012293636B2 (en) | 2011-08-10 | 2015-12-03 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Active compound combinations comprising specific tetramic acid derivatives |
| EP2748323B1 (en) | 2011-08-22 | 2019-05-01 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Methods and means to modify a plant genome |
| EP2561759A1 (en) | 2011-08-26 | 2013-02-27 | Bayer Cropscience AG | Fluoroalkyl-substituted 2-amidobenzimidazoles and their effect on plant growth |
| BR112014005471A2 (pt) | 2011-09-12 | 2017-03-28 | Bayer Ip Gmbh | compostos de fórmula (i), (v), (vii), composição fungicida, método para o controle dos fungos fitopatogênicos das culturas, utilização dos compostos de fórmula (i) e processo para a produção das composições para o controle de fungos nocivos fitopatogênicos |
| EP2755484A1 (en) | 2011-09-16 | 2014-07-23 | Bayer Intellectual Property GmbH | Use of 5-phenyl- or 5-benzyl-2 isoxazoline-3 carboxylates for improving plant yield |
| JP6138797B2 (ja) | 2011-09-16 | 2017-05-31 | バイエル・インテレクチュアル・プロパティ・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツングＢａｙｅｒ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ ＧｍｂＨ | 植物収量を向上させるためのアシルスルホンアミド類の使用 |
| CA2848625A1 (en) | 2011-09-16 | 2013-03-21 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Use of mefenpyr-diethyl in combination with prothioconazole and tebuconazole for improving plant yield |
| ES2628436T3 (es) | 2011-10-04 | 2017-08-02 | Bayer Intellectual Property Gmbh | ARNi para el control de hongos y oomicetos por la inhibición del gen de sacaropina deshidrogenasa |
| CN104039957A (zh) | 2011-10-19 | 2014-09-10 | 凯金公司 | 用于产生补身醇的方法和组合物 |
| CA2856361A1 (en) | 2011-11-21 | 2013-05-30 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Fungicide n-[(trisubstitutedsilyl)methyl]-carboxamide derivatives |
| KR20140096391A (ko) | 2011-11-30 | 2014-08-05 | 바이엘 인텔렉쳐 프로퍼티 게엠베하 | 살진균성 ｎ-바이시클로알킬 및 ｎ-트리시클로알킬 피라졸-４-(티오)카르복사미드 유도체 |
| AU2012357896B9 (en) | 2011-12-19 | 2016-12-15 | Bayer Cropscience Ag | Use of anthranilic acid diamide derivatives for pest control in transgenic crops |
| TWI558701B (zh) | 2011-12-29 | 2016-11-21 | 拜耳知識產權公司 | 殺真菌之３－［（１，３－噻唑－４－基甲氧基亞胺）（苯基）甲基］－２－經取代之－１，２，４－二唑－５（２ｈ）－酮衍生物 |
| JP6002242B2 (ja) | 2011-12-29 | 2016-10-05 | バイエル・インテレクチュアル・プロパティ・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツングＢａｙｅｒ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ ＧｍｂＨ | 殺菌性３−［（ピリジン−２−イルメトキシイミノ）（フェニル）メチル］−２−置換−１，２，４−オキサジアゾール−５（２ｈ）−オン誘導体 |
| US20150011389A1 (en) | 2012-01-25 | 2015-01-08 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Active Compound Combinations Containing Fluopyram and Biological Control Agent |
| CN104507314B (zh) | 2012-01-25 | 2018-01-09 | 拜耳知识产权有限责任公司 | 含有氟吡菌酰胺芽孢杆菌和生物防治剂的活性化合物结合物 |
| PE20190344A1 (es) | 2012-02-27 | 2019-03-07 | Bayer Ip Gmbh | Combinaciones de compuestos activos |
| WO2013139949A1 (en) | 2012-03-23 | 2013-09-26 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Compositions comprising a strigolactame compound for enhanced plant growth and yield |
| CN104245687B (zh) | 2012-04-12 | 2016-12-14 | 拜尔农科股份公司 | 作为杀真菌剂的n-酰基-2-(环)烷基吡咯烷和哌啶 |
| CN104244717A (zh) | 2012-04-20 | 2014-12-24 | 拜尔农科股份公司 | N-环烷基-n-[(三取代的甲硅烷基苯基)亚甲基]-(硫代)羧酰胺衍生物 |
| CA2865599C (en) | 2012-04-20 | 2020-10-27 | Bayer Cropscience Ag | N-cycloalkyl-n-[(heterocyclylphenyl)methylene]-(thio)carboxamide derivatives |
| EP2662362A1 (en) | 2012-05-09 | 2013-11-13 | Bayer CropScience AG | Pyrazole indanyl carboxamides |
| MX2014013497A (es) | 2012-05-09 | 2015-02-10 | Bayer Cropscience Ag | Pirazol indanil carboxamidas. |
| EP2662364A1 (en) | 2012-05-09 | 2013-11-13 | Bayer CropScience AG | Pyrazole tetrahydronaphthyl carboxamides |
| WO2013167544A1 (en) | 2012-05-09 | 2013-11-14 | Bayer Cropscience Ag | 5-halogenopyrazole indanyl carboxamides |
| EP2662363A1 (en) | 2012-05-09 | 2013-11-13 | Bayer CropScience AG | 5-Halogenopyrazole biphenylcarboxamides |
| EP2662360A1 (en) | 2012-05-09 | 2013-11-13 | Bayer CropScience AG | 5-Halogenopyrazole indanyl carboxamides |
| EP2662370A1 (en) | 2012-05-09 | 2013-11-13 | Bayer CropScience AG | 5-Halogenopyrazole benzofuranyl carboxamides |
| EP2662361A1 (en) | 2012-05-09 | 2013-11-13 | Bayer CropScience AG | Pyrazol indanyl carboxamides |
| AR091104A1 (es) | 2012-05-22 | 2015-01-14 | Bayer Cropscience Ag | Combinaciones de compuestos activos que comprenden un derivado lipo-quitooligosacarido y un compuesto nematicida, insecticida o fungicida |
| EP3360418A1 (en) | 2012-05-30 | 2018-08-15 | Bayer CropScience Aktiengesellschaft | Composition comprising a biological control agent and a fungicide |
| WO2013178662A1 (en) | 2012-05-30 | 2013-12-05 | Bayer Cropscience Ag | Compositions comprising a biological control agent and an insecticide |
| JP6285423B2 (ja) | 2012-05-30 | 2018-02-28 | バイエル・クロップサイエンス・アクチェンゲゼルシャフト | 生物農薬および殺虫剤を含む組成物 |
| WO2013178655A1 (en) | 2012-05-30 | 2013-12-05 | Bayer Cropscience Ag | Composition comprising a biological control agent and a fungicide selected from inhibitors of the lipid membrane synthesis, the melanine biosynthesis, the nucleic acid synthesis or the signal transduction |
| EP2854550B1 (en) | 2012-05-30 | 2018-07-04 | Bayer Cropscience AG | Composition comprising a biological control agent and a fungicide |
| AR091197A1 (es) | 2012-05-30 | 2015-01-21 | Bayer Cropscience Ag | Composicion que comprende un agente de control biologico y un fungicida |
| MX356529B (es) | 2012-05-30 | 2018-06-01 | Bayer Cropscience Ag | Una composicion que comprende un agente de control biologico y un fungicida seleccionado de inhibidores de la mitosis y la division celular y compuestos capaces de tener una accion en multiples sitios. |
| EP2854551A1 (en) | 2012-05-30 | 2015-04-08 | Bayer Cropscience AG | Compositions comprising a biological control agent and a fungicide from the group consisting of inhibitors of the respiratory chain at complex i or ii. |
| CN104602520A (zh) | 2012-07-31 | 2015-05-06 | 拜尔农作物科学股份公司 | 包括杀虫萜烯混合物和杀虫剂的组合物 |
| WO2014043435A1 (en) | 2012-09-14 | 2014-03-20 | Bayer Cropscience Lp | Hppd variants and methods of use |
| EP2719280A1 (en) | 2012-10-11 | 2014-04-16 | Bayer CropScience AG | Use of N-phenylethylpyrazole carboxamide derivatives or salts thereof for resistance management of phytopathogenic fungi |
| CN105357968A (zh) | 2012-10-19 | 2016-02-24 | 拜尔农科股份公司 | 包含羧酰胺衍生物的活性化合物复配物 |
| EA025862B1 (ru) | 2012-10-19 | 2017-02-28 | Байер Кропсайенс Аг | Способ повышения устойчивости к абиотическому стрессу в растениях с использованием производных карбоксамида или тиокарбоксамида |
| PL2908640T3 (pl) | 2012-10-19 | 2020-06-29 | Bayer Cropscience Ag | Sposób stymulowania wzrostu roślin przy pomocy pochodnych karboksamidu |
| US9668480B2 (en) | 2012-10-19 | 2017-06-06 | Bayer Cropscience Ag | Method for treating plants against fungi resistant to fungicides using carboxamide or thiocarboxamide derivatives |
| EP2735231A1 (en) | 2012-11-23 | 2014-05-28 | Bayer CropScience AG | Active compound combinations |
| EP2925137A1 (en) | 2012-11-30 | 2015-10-07 | Bayer CropScience AG | Binary fungicidal or pesticidal mixture |
| BR112015012519A2 (pt) | 2012-11-30 | 2017-07-11 | Bayer Cropscience Ag | misturas ternárias fungicidas e pesticidas |
| CN104994736B (zh) | 2012-11-30 | 2018-02-06 | 拜耳作物科学股份公司 | 二元农药和杀真菌混合物 |
| CN104981162B (zh) | 2012-11-30 | 2017-11-28 | 拜耳作物科学股份公司 | 三元杀真菌混合物 |
| CA3082683A1 (en) | 2012-11-30 | 2014-06-05 | Bayer Cropscience Ag | Binary fungicidal mixtures |
| US9867377B2 (en) | 2012-12-03 | 2018-01-16 | Bayer Cropscience Ag | Composition comprising a biological control agent and an insecticide |
| US20150289518A1 (en) | 2012-12-03 | 2015-10-15 | Bayer Cropscience Ag | Composition comprising a biological control agent and an insecticide |
| EP2925141A2 (en) | 2012-12-03 | 2015-10-07 | Bayer CropScience AG | Composition comprising a biological control agent and a fungicide |
| CA2893083A1 (en) | 2012-12-03 | 2014-06-12 | Bayer Cropscience Ag | Composition comprising a biological control agent and an insecticide |
| EP2925146A2 (en) | 2012-12-03 | 2015-10-07 | Bayer CropScience AG | Composition comprising a biological control agent and a fungicide |
| WO2014086753A2 (en) | 2012-12-03 | 2014-06-12 | Bayer Cropscience Ag | Composition comprising biological control agents |
| BR112015012702A2 (pt) | 2012-12-03 | 2017-07-11 | Bayer Cropscience Ag | composição que compreende um agente de controle biológico e um fungicida |
| EP2925145A2 (en) | 2012-12-03 | 2015-10-07 | Bayer CropScience AG | Composition comprising biological control agents |
| WO2014090765A1 (en) | 2012-12-12 | 2014-06-19 | Bayer Cropscience Ag | Use of 1-[2-fluoro-4-methyl-5-(2,2,2-trifluoroethylsulfinyl)phenyl]-5-amino-3-trifluoromethyl)-1 h-1,2,4 tfia zole for controlling nematodes in nematode-resistant crops |
| AR093996A1 (es) | 2012-12-18 | 2015-07-01 | Bayer Cropscience Ag | Combinaciones bactericidas y fungicidas binarias |
| BR112015014307A2 (pt) | 2012-12-19 | 2017-07-11 | Bayer Cropscience Ag | difluorometil-nicotínico- tetrahidronaftil carboxamidas |
| US20150366199A1 (en) | 2013-02-11 | 2015-12-24 | Bayer Cropscience Lp | Compositions comprising gougerotin and an insecticide |
| BR112015018676A2 (pt) | 2013-02-11 | 2017-07-18 | Bayer Cropscience Lp | composições que compreendem gougerotina e um agente de controle biológico |
| WO2014124368A1 (en) | 2013-02-11 | 2014-08-14 | Bayer Cropscience Lp | Compositions comprising gougerotin and a fungicide |
| UA122046C2 (uk) | 2013-03-07 | 2020-09-10 | Атенікс Корп. | Рекомбінантний поліпептид із інсектицидною активністю |
| EP2986117A1 (en) | 2013-04-19 | 2016-02-24 | Bayer CropScience Aktiengesellschaft | Binary insecticidal or pesticidal mixture |
| WO2014170387A1 (en) * | 2013-04-19 | 2014-10-23 | Bayer Cropscience Nv | Hybrid brassica plants and methods for producing same |
| MX358633B (es) | 2013-04-19 | 2018-08-28 | Bayer Cropscience Ag | Metodo de uso mejorado del potencial de produccion de plantas transgenicas. |
| WO2014177514A1 (en) | 2013-04-30 | 2014-11-06 | Bayer Cropscience Ag | Nematicidal n-substituted phenethylcarboxamides |
| TW201507722A (zh) | 2013-04-30 | 2015-03-01 | Bayer Cropscience Ag | 做為殺線蟲劑及殺體內寄生蟲劑的ｎ－（２－鹵素－２－苯乙基）－羧醯胺類 |
| US9770022B2 (en) | 2013-06-26 | 2017-09-26 | Bayer Cropscience Ag | N-cycloalkyl-N-[(bicyclylphenyl)methylene]-(thio)carboxamide derivatives |
| EP3077378B1 (en) | 2013-12-05 | 2018-11-07 | Bayer CropScience Aktiengesellschaft | N-cyclopropyl-n-{[2-(1-substitutedcyclopropyl)phenyl]methylene}-(thio)carboxamide derivatives |
| CN105873907B (zh) | 2013-12-05 | 2019-03-12 | 拜耳作物科学股份公司 | N-环烷基-n-{[2-(1-取代的环烷基)苯基]亚甲基}-(硫代)甲酰胺衍生物 |
| EP2885970A1 (en) | 2013-12-21 | 2015-06-24 | Bayer CropScience AG | Fungicide compositions comprising compound I, at least one succinate dehydrogenase (SDH) inhibitor and at least one triazole fungicide |
| BR112016020889B1 (pt) | 2014-03-11 | 2022-10-04 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Molécula de ácido nucleico recombinante, célula hospedeira bacteriana, proteína hppd recombinante, uso do ácido nucleico recombinante e produto de base |
| WO2015160620A1 (en) | 2014-04-16 | 2015-10-22 | Bayer Cropscience Lp | Compositions comprising ningnanmycin and an insecticide |
| WO2015160618A1 (en) | 2014-04-16 | 2015-10-22 | Bayer Cropscience Lp | Compositions comprising ningnanmycin and a biological control agent |
| WO2015160619A1 (en) | 2014-04-16 | 2015-10-22 | Bayer Cropscience Lp | Compositions comprising ningnanmycin and a fungicide |
| EP3283476B1 (en) | 2015-04-13 | 2019-08-14 | Bayer Cropscience AG | N-cycloalkyl-n-(biheterocyclyethylene)-(thio)carboxamide derivatives |
| EP3097782A1 (en) | 2015-05-29 | 2016-11-30 | Bayer CropScience Aktiengesellschaft | Methods for controlling phytopathogenic nematodes by combination of fluopyram and biological control agents |
| WO2017039452A1 (en) | 2015-09-04 | 2017-03-09 | Keygene N.V. | Diplospory gene |
| MX2018003044A (es) | 2015-09-11 | 2018-04-11 | Bayer Cropscience Ag | Variantes de hppd y metodos de uso. |
| WO2017049379A1 (en) | 2015-09-22 | 2017-03-30 | Bayer Cropscience Inc. | Method for enhancing crop performance in brassica |
| AU2017230275B2 (en) | 2016-03-08 | 2021-02-18 | Bayer Cropscience Aktiengesellschaft | Herbicidal compositions comprising carfentrazone-ethyl and bromoxynil |
| BR112019001764A2 (pt) | 2016-07-29 | 2019-05-07 | Bayer Cropscience Ag | combinações de compostos ativos e métodos para proteção de material de propagação de plantas |
| EP3544991A1 (en) | 2016-11-23 | 2019-10-02 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Axmi669 and axmi991 toxin genes and methods for their use |
| US20190322631A1 (en) | 2016-12-19 | 2019-10-24 | Basf Se | Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi |
| US11286498B2 (en) | 2017-01-18 | 2022-03-29 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Use of BP005 for the control of plant pathogens |
| UY37571A (es) | 2017-01-18 | 2018-08-31 | Bayer Cropscience Lp | Gen de toxina bp005 y procedimientos para su uso |
| EP3585773B1 (en) | 2017-02-21 | 2021-04-07 | Basf Se | Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi |
| US11708565B2 (en) | 2017-03-07 | 2023-07-25 | BASF Agricultural Solutions Seesi US LLC | HPPD variants and methods of use |
| WO2018184970A1 (en) | 2017-04-07 | 2018-10-11 | Basf Se | Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi |
| WO2018188962A1 (en) | 2017-04-11 | 2018-10-18 | Basf Se | Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi |
| MX2019012543A (es) | 2017-04-21 | 2019-12-02 | Bayer Cropscience Lp | Metodo para mejorar la seguridad de los cultivos. |
| CN110621669A (zh) | 2017-05-04 | 2019-12-27 | 巴斯夫欧洲公司 | 防除植物病原性真菌的取代5-卤代烷基-5-羟基异噁唑类 |
| WO2018202491A1 (en) | 2017-05-04 | 2018-11-08 | Basf Se | Substituted trifluoromethyloxadiazoles for combating phytopathogenic fungi |
| WO2018219797A1 (en) | 2017-06-02 | 2018-12-06 | Basf Se | Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi |
| EP3642187A1 (en) | 2017-06-19 | 2020-04-29 | Basf Se | 2-[[5-(trifluoromethyl)-1,2,4-oxadiazol-3-yl]aryloxy](thio)acetamides for combating phytopathogenic fungi |
| US20210127681A1 (en) | 2017-07-27 | 2021-05-06 | Basf Se | Use of herbicidal compositions based on l-glufosinate in tolerant field crops |
| WO2019025250A1 (en) | 2017-08-04 | 2019-02-07 | Basf Se | SUBSTITUTED TRIFLUOROMETHYLOXADIAZOLES FOR COMBATING PHYTOPATHOGENIC FUNGI |
| WO2019038042A1 (en) | 2017-08-21 | 2019-02-28 | Basf Se | SUBSTITUTED TRIFLUOROMETHYLOXADIAZOLES FOR THE CONTROL OF PHYTOPATHOGENIC FUNGI |
| US11076596B2 (en) | 2017-09-18 | 2021-08-03 | Basf Se | Substituted trifluoromethyloxadiazoles for combating phytopathogenic fungi |
| WO2019068811A1 (en) | 2017-10-06 | 2019-04-11 | Bayer Aktiengesellschaft | COMPOSITIONS COMPRISING FLUOPYRAM AND TIOXAZAFENE |
| BR112020008096A2 (pt) | 2017-10-24 | 2020-11-03 | Basf Se | método para conferir tolerância a um herbicida e planta de soja transgênica |
| BR112020008092A2 (pt) | 2017-10-24 | 2020-09-15 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | método para conferir tolerância a um herbicida e planta de soja transgênica |
| EP3713936B1 (en) | 2017-11-23 | 2021-10-20 | Basf Se | Substituted trifluoromethyloxadiazoles for combating phytopathogenic fungi |
| WO2019121143A1 (en) | 2017-12-20 | 2019-06-27 | Basf Se | Substituted cyclopropyl derivatives |
| WO2019137995A1 (en) | 2018-01-11 | 2019-07-18 | Basf Se | Novel pyridazine compounds for controlling invertebrate pests |
| CN111669972A (zh) | 2018-01-29 | 2020-09-15 | 巴斯夫农业公司 | 新农业化学制剂 |
| KR20200118091A (ko) | 2018-02-07 | 2020-10-14 | 바스프 에스이 | 신규의 피리딘 카르복스아미드 |
| WO2019154665A1 (en) | 2018-02-07 | 2019-08-15 | Basf Se | New pyridine carboxamides |
| CN111801014B (zh) | 2018-03-01 | 2022-05-27 | 巴斯夫农业公司 | 氯氟醚菌唑的杀真菌组合物 |
| WO2019219464A1 (en) | 2018-05-15 | 2019-11-21 | Basf Se | Substituted trifluoromethyloxadiazoles for combating phytopathogenic fungi |
| WO2019224092A1 (en) | 2018-05-22 | 2019-11-28 | Basf Se | Pesticidally active c15-derivatives of ginkgolides |
| EP3802521A1 (de) | 2018-06-04 | 2021-04-14 | Bayer Aktiengesellschaft | Herbizid wirksame bizyklische benzoylpyrazole |
| CN112689457A (zh) | 2018-07-26 | 2021-04-20 | 拜耳公司 | 琥珀酸脱氢酶抑制剂氟吡菌酰胺用于防治十字花科物种中由立枯丝核菌、镰刀菌属种和腐霉菌属种引起的根腐病复合症和/或苗期病害复合症的用途 |
| EP3613736A1 (en) | 2018-08-22 | 2020-02-26 | Basf Se | Substituted glutarimide derivatives |
| EP3628158A1 (en) | 2018-09-28 | 2020-04-01 | Basf Se | Pesticidal mixture comprising a mesoionic compound and a biopesticide |
| US20210347777A1 (en) | 2018-10-23 | 2021-11-11 | Basf Se | Tricyclic pesticidal compounds |
| EP3643705A1 (en) | 2018-10-24 | 2020-04-29 | Basf Se | Pesticidal compounds |
| EP3670501A1 (en) | 2018-12-17 | 2020-06-24 | Basf Se | Substituted [1,2,4]triazole compounds as fungicides |
| SI3908584T1 (sl) | 2019-01-11 | 2023-07-31 | Basf Se | Kristalne oblike 1-(1,2-dimetilpropil)-n-etil-5-metil-n-piridazin-4-il -pirazol-4-karboksamida |
| EP3696177A1 (en) | 2019-02-12 | 2020-08-19 | Basf Se | Heterocyclic compounds for the control of invertebrate pests |
| CA3139524A1 (en) | 2019-05-10 | 2020-11-19 | Bayer Cropscience Lp | Active compound combinations |
| EP3769623A1 (en) | 2019-07-22 | 2021-01-27 | Basf Se | Mesoionic imidazolium compounds and derivatives for combating animal pests |
| EP3975718A1 (en) | 2019-05-29 | 2022-04-06 | Basf Se | Mesoionic imidazolium compounds and derivatives for combating animal pests |
| WO2020239984A1 (en) | 2019-05-29 | 2020-12-03 | Keygene N.V. | Gene for parthenogenesis |
| WO2020244969A1 (en) | 2019-06-06 | 2020-12-10 | Basf Se | Pyridine derivatives and their use as fungicides |
| BR112021021028A2 (pt) | 2019-06-06 | 2021-12-14 | Basf Se | Uso dos compostos de fórmula i, compostos da fórmula i, composição e método para combater fungos fitopatogênicos |
| WO2020244970A1 (en) | 2019-06-06 | 2020-12-10 | Basf Se | New carbocyclic pyridine carboxamides |
| EP3766879A1 (en) | 2019-07-19 | 2021-01-20 | Basf Se | Pesticidal pyrazole derivatives |
| KR20220035939A (ko) | 2019-07-22 | 2022-03-22 | 바이엘 악티엔게젤샤프트 | 살충제로서의 5-아미노-치환된 피라졸 및 트리아졸 |
| CA3148209A1 (en) | 2019-07-23 | 2021-01-28 | Bayer Aktiengesellschaft | Novel heteroaryl-triazole compounds as pesticides |
| BR112022000915A2 (pt) | 2019-07-23 | 2022-05-17 | Bayer Ag | Compostos de heteroaril-triazol como pesticidas |
| WO2021022069A1 (en) | 2019-08-01 | 2021-02-04 | Bayer Cropscience Lp | Method of improving cold stress tolerance and crop safety |
| EP3701796A1 (en) | 2019-08-08 | 2020-09-02 | Bayer AG | Active compound combinations |
| US20220403410A1 (en) | 2019-09-26 | 2022-12-22 | Bayer Aktiengesellschaft | Rnai-mediated pest control |
| JP2022550564A (ja) | 2019-10-02 | 2022-12-02 | バイエル・アクチエンゲゼルシヤフト | 脂肪酸を含んでいる活性化合物組み合わせ |
| WO2021063735A1 (en) | 2019-10-02 | 2021-04-08 | Basf Se | New bicyclic pyridine derivatives |
| WO2021063736A1 (en) | 2019-10-02 | 2021-04-08 | Basf Se | Bicyclic pyridine derivatives |
| EP4041721B1 (en) | 2019-10-09 | 2024-03-06 | Bayer Aktiengesellschaft | Novel heteroaryl-triazole compounds as pesticides |
| KR20220081359A (ko) | 2019-10-09 | 2022-06-15 | 바이엘 악티엔게젤샤프트 | 살충제로서의 신규 헤테로아릴-트리아졸 화합물 |
| JP2023501978A (ja) | 2019-11-07 | 2023-01-20 | バイエル・アクチエンゲゼルシヤフト | 動物害虫駆除用の置換スルホニルアミド |
| WO2021097162A1 (en) | 2019-11-13 | 2021-05-20 | Bayer Cropscience Lp | Beneficial combinations with paenibacillus |
| TW202134226A (zh) | 2019-11-18 | 2021-09-16 | 德商拜耳廠股份有限公司 | 作為殺蟲劑之新穎雜芳基-三唑化合物 |
| WO2021099271A1 (en) | 2019-11-18 | 2021-05-27 | Bayer Aktiengesellschaft | Active compound combinations comprising fatty acids |
| TW202136248A (zh) | 2019-11-25 | 2021-10-01 | 德商拜耳廠股份有限公司 | 作為殺蟲劑之新穎雜芳基-三唑化合物 |
| UY39058A (es) | 2020-01-31 | 2021-08-31 | Pairwise Plants Services Inc | Suppresión de la respuesta de evasión a la sombra en plantas |
| MX2022010059A (es) | 2020-02-18 | 2022-08-25 | Bayer Ag | Nuevos compuestos de heteroaril-triazol como pesticidas. |
| EP3708565A1 (en) | 2020-03-04 | 2020-09-16 | Bayer AG | Pyrimidinyloxyphenylamidines and the use thereof as fungicides |
| CA3180157A1 (en) | 2020-04-16 | 2021-10-21 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods for controlling meristem size for crop improvement |
| WO2021209490A1 (en) | 2020-04-16 | 2021-10-21 | Bayer Aktiengesellschaft | Cyclaminephenylaminoquinolines as fungicides |
| BR112022021264A2 (pt) | 2020-04-21 | 2023-02-14 | Bayer Ag | Derivados heterocíclicos fundidos substituídos por 2-(het)aril como pesticidas |
| WO2021219513A1 (en) | 2020-04-28 | 2021-11-04 | Basf Se | Pesticidal compounds |
| EP3903583A1 (en) | 2020-04-28 | 2021-11-03 | Basf Se | Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors iii |
| EP3903581A1 (en) | 2020-04-28 | 2021-11-03 | Basf Se | Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors i |
| EP3903582A1 (en) | 2020-04-28 | 2021-11-03 | Basf Se | Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors ii |
| EP3903584A1 (en) | 2020-04-28 | 2021-11-03 | Basf Se | Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors iv |
| CN115915941A (zh) | 2020-05-06 | 2023-04-04 | 拜耳公司 | 作为杀真菌化合物的吡啶（硫代）酰胺 |
| TW202208347A (zh) | 2020-05-06 | 2022-03-01 | 德商拜耳廠股份有限公司 | 作為殺蟲劑之新穎雜芳基三唑化合物 |
| BR112022023012A2 (pt) | 2020-05-12 | 2022-12-20 | Bayer Ag | (tio)amidas de triazina e pirimidina como compostos fungicidas |
| EP3909950A1 (en) | 2020-05-13 | 2021-11-17 | Basf Se | Heterocyclic compounds for the control of invertebrate pests |
| JP2023529294A (ja) | 2020-05-19 | 2023-07-10 | バイエル、アクチエンゲゼルシャフト、（ディビジョン、クロップサイエンス） | 殺真菌性化合物としてのアザ二環式（チオ）アミド |
| BR112022024489A2 (pt) | 2020-06-02 | 2023-01-31 | Pairwise Plants Services Inc | Métodos para o controle do tamanho do meristema para melhora da cultura agrícola |
| EP4161906A1 (en) | 2020-06-04 | 2023-04-12 | Bayer Aktiengesellschaft | Heterocyclyl pyrimidines and triazines as novel fungicides |
| WO2021249800A1 (en) | 2020-06-10 | 2021-12-16 | Basf Se | Substituted [1,2,4]triazole compounds as fungicides |
| JP2023529475A (ja) | 2020-06-10 | 2023-07-10 | バイエル、アクチエンゲゼルシャフト | 新規殺菌剤としてのアザビシクリル置換複素環 |
| EP3945089A1 (en) | 2020-07-31 | 2022-02-02 | Basf Se | Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors v |
| MX2022015896A (es) | 2020-06-17 | 2023-02-22 | Pairwise Plants Services Inc | Métodos para el control del tamaño del meristemo para la mejora de cultivos. |
| CA3187291A1 (en) | 2020-06-18 | 2021-12-23 | Bayer Aktiengesellschaft | Composition for use in agriculture |
| BR112022025941A2 (pt) | 2020-06-18 | 2023-01-10 | Bayer Ag | Derivados de 3-(piridazin-4-il)-5,6-di-hidro-4h-1,2,4-oxadiazina como fungicidas para proteção de cultura |
| BR112022025710A2 (pt) | 2020-06-19 | 2023-03-07 | Bayer Ag | 1,3,4-oxadiazol pirimidinas e 1,3,4-oxadiazol piridinas como fungicidas |
| UY39276A (es) | 2020-06-19 | 2022-01-31 | Bayer Ag | Uso de compuestos de 1,3,4–oxadiazol–2–ilpirimidina para controlar microorganismos fitopatógenos, métodos de uso y composiciones. |
| WO2021255091A1 (en) | 2020-06-19 | 2021-12-23 | Bayer Aktiengesellschaft | 1,3,4-oxadiazoles and their derivatives as fungicides |
| UY39275A (es) | 2020-06-19 | 2022-01-31 | Bayer Ag | 1,3,4-oxadiazol pirimidinas como fungicidas, procesos e intermediarios para su preparación, métodos de uso y usos de los mismos |
| EP3929189A1 (en) | 2020-06-25 | 2021-12-29 | Bayer Animal Health GmbH | Novel heteroaryl-substituted pyrazine derivatives as pesticides |
| BR112022026904A2 (pt) | 2020-07-02 | 2023-01-24 | Bayer Ag | Derivados de heterocicleno como agentes de controle de pragas |
| EP3939961A1 (en) | 2020-07-16 | 2022-01-19 | Basf Se | Strobilurin type compounds and their use for combating phytopathogenic fungi |
| WO2022017836A1 (en) | 2020-07-20 | 2022-01-27 | BASF Agro B.V. | Fungicidal compositions comprising (r)-2-[4-(4-chlorophenoxy)-2-(trifluoromethyl)phenyl]-1- (1,2,4-triazol-1-yl)propan-2-ol |
| EP3970494A1 (en) | 2020-09-21 | 2022-03-23 | Basf Se | Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors viii |
| WO2022033991A1 (de) | 2020-08-13 | 2022-02-17 | Bayer Aktiengesellschaft | 5-amino substituierte triazole als schädlingsbekämpfungsmittel |
| WO2022053453A1 (de) | 2020-09-09 | 2022-03-17 | Bayer Aktiengesellschaft | Azolcarboxamide als schädlingsbekämpfungsmittel |
| WO2022058327A1 (en) | 2020-09-15 | 2022-03-24 | Bayer Aktiengesellschaft | Substituted ureas and derivatives as new antifungal agents |
| EP3974414A1 (de) | 2020-09-25 | 2022-03-30 | Bayer AG | 5-amino substituierte pyrazole und triazole als schädlingsbekämpfungsmittel |
| IL301700A (en) | 2020-10-13 | 2023-05-01 | Keygene Nv | Adapted promoter of parthenogenesis gene |
| US20230397607A1 (en) | 2020-10-27 | 2023-12-14 | BASF Agro B.V. | Compositions comprising mefentrifluconazole |
| WO2022090069A1 (en) | 2020-11-02 | 2022-05-05 | Basf Se | Compositions comprising mefenpyr-diethyl |
| WO2022090071A1 (en) | 2020-11-02 | 2022-05-05 | Basf Se | Use of mefenpyr-diethyl for controlling phytopathogenic fungi |
| WO2022106304A1 (en) | 2020-11-23 | 2022-05-27 | BASF Agro B.V. | Compositions comprising mefentrifluconazole |
| AU2021403544A1 (en) | 2020-12-14 | 2023-06-29 | Basf Se | Sulfoximine pesticides |
| EP3915971A1 (en) | 2020-12-16 | 2021-12-01 | Bayer Aktiengesellschaft | Phenyl-s(o)n-phenylamidines and the use thereof as fungicides |
| WO2022129196A1 (en) | 2020-12-18 | 2022-06-23 | Bayer Aktiengesellschaft | Heterobicycle substituted 1,2,4-oxadiazoles as fungicides |
| KR20230121792A (ko) | 2020-12-18 | 2023-08-21 | 바이엘 악티엔게젤샤프트 | 작물에서 저항성 식물병원성 진균을 방제하기 위한dhodh 억제제의 용도 |
| WO2022129190A1 (en) | 2020-12-18 | 2022-06-23 | Bayer Aktiengesellschaft | (hetero)aryl substituted 1,2,4-oxadiazoles as fungicides |
| WO2022129188A1 (en) | 2020-12-18 | 2022-06-23 | Bayer Aktiengesellschaft | 1,2,4-oxadiazol-3-yl pyrimidines as fungicides |
| WO2022140762A1 (en) | 2020-12-21 | 2022-06-30 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Brassica napus plants comprising an improved fertility restorer |
| EP4036083A1 (de) | 2021-02-02 | 2022-08-03 | Bayer Aktiengesellschaft | 5-oxy substituierte hetereozyklen, als schädlingsbekämpfungsmittel |
| WO2022173885A1 (en) | 2021-02-11 | 2022-08-18 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for modifying cytokinin oxidase levels in plants |
| EP4043444A1 (en) | 2021-02-11 | 2022-08-17 | Basf Se | Substituted isoxazoline derivatives |
| US20220380792A1 (en) | 2021-02-25 | 2022-12-01 | Pairwise Plants Services, Inc | Methods and compositions for modifying root architecture in plants |
| BR112023019788A2 (pt) | 2021-03-30 | 2023-11-07 | Bayer Ag | 3-(hetero)aril-5-clorodifluorometil-1,2,4-oxadiazol como fungicida |
| BR112023019400A2 (pt) | 2021-03-30 | 2023-12-05 | Bayer Ag | 3-(hetero)aril-5-clorodifluorometil-1,2,4-oxadiazol como fungicida |
| EP4333616A1 (en) | 2021-05-03 | 2024-03-13 | Basf Se | Additives for enhancing the pesticidal effectiveness of pesticidal microorganisms |
| CN117597344A (zh) | 2021-05-06 | 2024-02-23 | 拜耳公司 | 烷基酰胺取代的环状咪唑及其作为杀虫剂的用途 |
| JP2024517305A (ja) | 2021-05-12 | 2024-04-19 | バイエル・アクチエンゲゼルシヤフト | 有害生物防除剤としての２－（ヘテロ）アリール置換縮合複素環誘導体 |
| EP4091451A1 (en) | 2021-05-17 | 2022-11-23 | BASF Agro B.V. | Compositions comprising mefentrifluconazole |
| BR112023023989A2 (pt) | 2021-05-18 | 2024-01-30 | Basf Se | Compostos, composição, método para combater fungos fitopatogênicos e semente |
| CN117355519A (zh) | 2021-05-18 | 2024-01-05 | 巴斯夫欧洲公司 | 用作杀真菌剂的新型取代吡啶类 |
| WO2022243107A1 (en) | 2021-05-18 | 2022-11-24 | Basf Se | New substituted pyridines as fungicides |
| CA3223995A1 (en) | 2021-06-17 | 2022-12-22 | Pairwise Plants Services, Inc. | Modification of growth regulating factor family transcription factors in soybean |
| UY39827A (es) | 2021-06-24 | 2023-01-31 | Pairwise Plants Services Inc | Modificación de genes de ubiquitina ligasa e3 hect para mejorar los rasgos de rendimiento |
| WO2023278651A1 (en) | 2021-07-01 | 2023-01-05 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for enhancing root system development |
| EP4119547A1 (en) | 2021-07-12 | 2023-01-18 | Basf Se | Triazole compounds for the control of invertebrate pests |
| AU2022321882A1 (en) | 2021-08-02 | 2024-02-15 | Basf Se | (3-pirydyl)-quinazoline |
| AU2022323668A1 (en) | 2021-08-02 | 2024-02-15 | Basf Se | (3-quinolyl)-quinazoline |
| US20230078990A1 (en) | 2021-08-12 | 2023-03-16 | Pairwise Plants Services, Inc. | Modification of brassinosteroid receptor genes to improve yield traits |
| WO2023017120A1 (en) | 2021-08-13 | 2023-02-16 | Bayer Aktiengesellschaft | Active compound combinations and fungicide compositions comprising those |
| AR126798A1 (es) | 2021-08-17 | 2023-11-15 | Pairwise Plants Services Inc | Métodos y composiciones para modificar genes de histidina quinasa receptores de citoquinina en plantas |
| EP4140986A1 (en) | 2021-08-23 | 2023-03-01 | Basf Se | Pyrazine compounds for the control of invertebrate pests |
| KR20240051198A (ko) | 2021-08-25 | 2024-04-19 | 바이엘 악티엔게젤샤프트 | 농약제로서 신규 피라지닐-트리아졸 화합물 |
| EP4140995A1 (en) | 2021-08-27 | 2023-03-01 | Basf Se | Pyrazine compounds for the control of invertebrate pests |
| US20230074699A1 (en) | 2021-08-30 | 2023-03-09 | Pairwise Plants Services, Inc. | Modification of ubiquitin binding peptidase genes in plants for yield trait improvement |
| AR126938A1 (es) | 2021-09-02 | 2023-11-29 | Pairwise Plants Services Inc | Métodos y composiciones para mejorar la arquitectura de las plantas y los rasgos de rendimiento |
| EP4144739A1 (de) | 2021-09-02 | 2023-03-08 | Bayer Aktiengesellschaft | Anellierte pyrazole als schädlingsbekämpfungsmittel |
| EP4151631A1 (en) | 2021-09-20 | 2023-03-22 | Basf Se | Heterocyclic compounds for the control of invertebrate pests |
| CA3232804A1 (en) | 2021-09-21 | 2023-03-30 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for reducing pod shatter in canola |
| US20230108968A1 (en) | 2021-10-04 | 2023-04-06 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods for improving floret fertility and seed yield |
| US20230116819A1 (en) | 2021-10-07 | 2023-04-13 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods for improving floret fertility and seed yield |
| WO2023072671A1 (en) | 2021-10-28 | 2023-05-04 | Basf Se | Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors ix |
| WO2023072670A1 (en) | 2021-10-28 | 2023-05-04 | Basf Se | Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors x |
| WO2023078915A1 (en) | 2021-11-03 | 2023-05-11 | Bayer Aktiengesellschaft | Bis(hetero)aryl thioether (thio)amides as fungicidal compounds |
| WO2023099445A1 (en) | 2021-11-30 | 2023-06-08 | Bayer Aktiengesellschaft | Bis(hetero)aryl thioether oxadiazines as fungicidal compounds |
| EP4194453A1 (en) | 2021-12-08 | 2023-06-14 | Basf Se | Pyrazine compounds for the control of invertebrate pests |
| AR127904A1 (es) | 2021-12-09 | 2024-03-06 | Pairwise Plants Services Inc | Métodos para mejorar la fertilidad de floretes y el rendimiento de semillas |
| EP4198033A1 (en) | 2021-12-14 | 2023-06-21 | Basf Se | Heterocyclic compounds for the control of invertebrate pests |
| EP4198023A1 (en) | 2021-12-16 | 2023-06-21 | Basf Se | Pesticidally active thiosemicarbazone compounds |
| AR128372A1 (es) | 2022-01-31 | 2024-04-24 | Pairwise Plants Services Inc | Supresión de la respuesta de evitación de la sombra en las plantas |
| WO2023148028A1 (en) | 2022-02-01 | 2023-08-10 | Globachem Nv | Methods and compositions for controlling pests |
| WO2023148033A1 (en) | 2022-02-01 | 2023-08-10 | Globachem Nv | Methods and compositions for controlling pests in oilseed rape |
| WO2023156402A1 (en) | 2022-02-17 | 2023-08-24 | Basf Se | Pesticidally active thiosemicarbazone compounds |
| TW202342744A (zh) | 2022-03-01 | 2023-11-01 | 美商巴斯夫農業解決方案種子美國有限責任公司 | Ｃａｓ１２ａ切口酶 |
| EP4238971A1 (en) | 2022-03-02 | 2023-09-06 | Basf Se | Substituted isoxazoline derivatives |
| WO2023168217A1 (en) | 2022-03-02 | 2023-09-07 | Pairwise Plants Services, Inc. | Modification of brassinosteroid receptor genes to improve yield traits |
| WO2023192838A1 (en) | 2022-03-31 | 2023-10-05 | Pairwise Plants Services, Inc. | Early flowering rosaceae plants with improved characteristics |
| WO2023196886A1 (en) | 2022-04-07 | 2023-10-12 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for improving resistance to fusarium head blight |
| US20230383305A1 (en) | 2022-04-21 | 2023-11-30 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for improving yield traits |
| US20230348922A1 (en) | 2022-05-02 | 2023-11-02 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for enhancing yield and disease resistance |
| WO2023213670A1 (en) | 2022-05-03 | 2023-11-09 | Bayer Aktiengesellschaft | Crystalline forms of (5s)-3-[3-(3-chloro-2-fluorophenoxy)-6-methylpyridazin-4-yl]-5-(2-chloro-4-methylbenzyl)-5,6-dihydro-4h-1,2,4-oxadiazine |
| WO2023213626A1 (en) | 2022-05-03 | 2023-11-09 | Bayer Aktiengesellschaft | Use of (5s)-3-[3-(3-chloro-2-fluorophenoxy)-6-methylpyridazin-4-yl]-5-(2-chloro-4-methylbenzyl)-5,6-dihydro-4h-1,2,4-oxadiazine for controlling unwanted microorganisms |
| WO2023215809A1 (en) | 2022-05-05 | 2023-11-09 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for modifying root architecture and/or improving plant yield traits |
| US20230416771A1 (en) | 2022-06-27 | 2023-12-28 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for modifying shade avoidance in plants |
| US20240002873A1 (en) | 2022-06-29 | 2024-01-04 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for controlling meristem size for crop improvement |
| US20240000031A1 (en) | 2022-06-29 | 2024-01-04 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for controlling meristem size for crop improvement |
| WO2024028243A1 (en) | 2022-08-02 | 2024-02-08 | Basf Se | Pyrazolo pesticidal compounds |
| US20240043857A1 (en) | 2022-08-04 | 2024-02-08 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for improving yield traits |
| WO2024036240A1 (en) | 2022-08-11 | 2024-02-15 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for controlling meristem size for crop improvement |
| WO2024054880A1 (en) | 2022-09-08 | 2024-03-14 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for improving yield characteristics in plants |
| EP4342885A1 (en) | 2022-09-20 | 2024-03-27 | Basf Se | N-(3-(aminomethyl)-phenyl)-5-(4-phenyl)-5-(trifluoromethyl)-4,5-dihydroisoxazol-3-amine derivatives and similar compounds as pesticides |
| WO2024068518A1 (en) | 2022-09-28 | 2024-04-04 | Bayer Aktiengesellschaft | 3-heteroaryl-5-chlorodifluoromethyl-1,2,4-oxadiazole as fungicide |
| WO2024068519A1 (en) | 2022-09-28 | 2024-04-04 | Bayer Aktiengesellschaft | 3-(hetero)aryl-5-chlorodifluoromethyl-1,2,4-oxadiazole as fungicide |
| WO2024068517A1 (en) | 2022-09-28 | 2024-04-04 | Bayer Aktiengesellschaft | 3-(hetero)aryl-5-chlorodifluoromethyl-1,2,4-oxadiazole as fungicide |
| WO2024068520A1 (en) | 2022-09-28 | 2024-04-04 | Bayer Aktiengesellschaft | 3-(hetero)aryl-5-chlorodifluoromethyl-1,2,4-oxadiazole as fungicide |
| EP4295688A1 (en) | 2022-09-28 | 2023-12-27 | Bayer Aktiengesellschaft | Active compound combination |
| EP4361126A1 (en) | 2022-10-24 | 2024-05-01 | Basf Se | Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors xv |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0290799B9 (en) | 1983-01-13 | 2004-09-01 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Transgenic dicotyledonous plant cells and plants |
| DE3786898T2 (de) | 1986-05-29 | 1994-02-10 | Calgene Inc | TRANSFORMATION UND EXPRESSION EINES FREMDEN GENS IN -i(BRASSICA) SPEZIES. |
| GB8810120D0 (en) | 1988-04-28 | 1988-06-02 | Plant Genetic Systems Nv | Transgenic nuclear male sterile plants |
| DE69034268D1 (de) | 1989-08-10 | 2011-03-03 | Bayer Bioscience Nv | Pflanzen mit modifizierten Blüten |
| US5689041A (en) * | 1989-08-10 | 1997-11-18 | Plant Gentic Systems N.V. | Plants modified with barstar for fertility restoration |
| WO1996026283A1 (en) | 1995-02-21 | 1996-08-29 | Plant Genetic Systems, N.V. | Method to obtain male-sterile plants |
| EP0757102A1 (en) | 1995-08-04 | 1997-02-05 | Plant Genetic Systems N.V. | Genetic transformation using a PARP inhibitor |
| US6506963B1 (en) * | 1999-12-08 | 2003-01-14 | Plant Genetic Systems, N.V. | Hybrid winter oilseed rape and methods for producing same |
-
1999
- 1999-12-08 US US09/457,037 patent/US6506963B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2000
- 2000-12-06 CZ CZ2002-2367A patent/CZ306357B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2000-12-06 CN CN2005100719970A patent/CN1690211B/zh not_active Expired - Lifetime
- 2000-12-06 HU HU0203347A patent/HU225433B1/hu unknown
- 2000-12-06 WO PCT/EP2000/012872 patent/WO2001041558A1/en active IP Right Grant
- 2000-12-06 PL PL356533A patent/PL205071B1/pl unknown
- 2000-12-06 AU AU30133/01A patent/AU783406B2/en not_active Expired
- 2000-12-06 AT AT00990782T patent/ATE323404T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-12-06 UA UA2002075562A patent/UA88861C2/ru unknown
- 2000-12-06 DE DE60027469T patent/DE60027469T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-12-06 EP EP00990782A patent/EP1244348B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-12-06 CN CNB008168806A patent/CN1219065C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2000-12-06 DK DK00990782T patent/DK1244348T3/da active
- 2000-12-08 US US09/733,151 patent/US6563026B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2003
- 2003-02-27 US US10/375,332 patent/US7659095B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-05-26 HK HK03103700A patent/HK1051295A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-04-18 HK HK06104583.9A patent/HK1084415A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2009
- 2009-12-10 US US12/635,215 patent/US8026352B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2011
- 2011-08-17 US US13/211,373 patent/US8309699B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE60027469T2 (de) | 2006-12-14 |
| CN1690211A (zh) | 2005-11-02 |
| EP1244348A1 (en) | 2002-10-02 |
| HUP0203347A2 (hu) | 2003-01-28 |
| WO2001041558A1 (en) | 2001-06-14 |
| US20010029620A1 (en) | 2001-10-11 |
| UA88861C2 (ru) | 2009-12-10 |
| CN1219065C (zh) | 2005-09-14 |
| CN1690211B (zh) | 2010-05-12 |
| DE60027469D1 (de) | 2006-05-24 |
| US6563026B2 (en) | 2003-05-13 |
| ATE323404T1 (de) | 2006-05-15 |
| AU3013301A (en) | 2001-06-18 |
| CZ306357B6 (cs) | 2016-12-21 |
| PL356533A1 (pl) | 2004-06-28 |
| US8026352B2 (en) | 2011-09-27 |
| AU783406B2 (en) | 2005-10-27 |
| EP1244348B1 (en) | 2006-04-19 |
| DK1244348T3 (da) | 2006-08-21 |
| US20110294133A1 (en) | 2011-12-01 |
| US20100248232A1 (en) | 2010-09-30 |
| US20030188347A1 (en) | 2003-10-02 |
| HK1051295A1 (en) | 2003-08-01 |
| CN1409594A (zh) | 2003-04-09 |
| HUP0203347A3 (en) | 2004-10-28 |
| CZ20022367A3 (cs) | 2003-01-15 |
| HU225433B1 (en) | 2006-11-28 |
| HK1084415A1 (en) | 2006-07-28 |
| US6506963B1 (en) | 2003-01-14 |
| US8309699B2 (en) | 2012-11-13 |
| US7659095B2 (en) | 2010-02-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6506963B1 (en) | Hybrid winter oilseed rape and methods for producing same | |
| US6509516B1 (en) | Male-sterile brassica plants and methods for producing same | |
| CN102119216B (zh) | Spt事件侧翼的植物基因组dna及用于鉴定spt事件的方法 | |
| EP2322632B1 (en) | Glufosinate tolerant rice | |
| EP3089577A1 (en) | Maize cytoplasmic male sterility (cms) s-type restorer rf3 gene, molecular markers and their use | |
| DK2986727T3 (en) | HYBRID BRASSICA PLANTS AND METHODS OF PRODUCING THEREOF | |
| WO1998056948A1 (en) | USE OF MOLECULAR MARKERS FOR GENOTYPE DETERMINATION OF THE OGURA Rf GENE IN BRASSICA NAPUS | |
| US6933111B1 (en) | Glufosinate tolerant rice | |
| Lee et al. | Chloroplast DNA evidence for non-random selection of females in an outcrossed population of soybeans [Glycine max (L.)] |